JP3936418B2 - β−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体 - Google Patents
β−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＬ−グルタミン酸取込阻害剤に関し、さらに詳細にはＬ−グルタミン酸トランスポーターのグルタミン酸取込活性の抑制作用を有するβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体に関する。
【０００２】
本化合物の開発は、Ｌ−グルタミン酸トランスポーターのグルタミン酸取込阻害剤の開発への糸口を提供するものであり、てんかん、ハンチントン氏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病等の神経障害、神経変異症等の治療への展開が期待できる。
【０００３】
【従来の技術】
Ｌ−グルタミン酸は哺乳動物の中枢神経系における興奮性神経刺激の伝達物質であり、シナプス間での素早い神経伝達を引き起こすだけではなく、高次で複雑な生理的過程である記憶や学習にも関与していることが知られている。シナプス間での興奮性の神経伝達は、プレシナプスからのグルタミン酸の放出に始まり、プレシナプスやグリア細胞に存在する高親和性のグルタミン酸トランスポーターによるシナプス間隙からの素早いグルタミン酸の取込により終焉する（Ａｔｔｗａｅｌｌ，Ｄ．ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｄ．，ＴＩＰＳ ６８−７４，１９９１）。
【０００４】
いくつかの遺伝的な神経変性疾患においては、患者の脳の一部にナトリウム依存性グルタミン酸取込活性の低下が報告されている（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１４６４−１４６８，１９９２．）。このため、グルタミン酸トランスポーターの機能の発現と阻害がこれらの疾患との関連で注目されている。
【０００５】
これまでに、グルタミン酸トランスポーターの研究は主に脳から調製したシナプトゾームや、腎や小腸から得た膜標本を用いて行われてきた。１９９２年にナトリウム依存性高親和性グルタミン酸トランスポーターのｃＤＮＡがクローニングされてからは、分子生物学的にも研究がなされるようになってきた（Ｐｉｎｅｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６０，４６４−４６７，１９９２；Ｓｔｏｒｃｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０９５５−１０９５９，１９９２；Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６０，４６７−４７１，１９９２）。さらに最近ではヒトのグルタミン酸トランスポーター遺伝子もクローニングされ、ＥＡＡＴ１〜４のサブタイプに分類されている（Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，５５５９−５５６９，１９９４； Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７５．５９９−６０３，１９９５）。
【０００６】
従来のシナプトゾームを用いるグルタミン酸取込阻害物質の検索から、現在までに、スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸およびＣＣＧ−ＩＩＩ〔（２Ｓ，１’Ｓ，２’Ｒ）−２−（カルボキシシクロプロピル）グリシン〕等の化合物がグルタミン酸取込阻害物質として知られているが、これらは自らも基質としてトランスポーターに取り込まれることにより、競合的にグルタミン酸の取込を抑制する阻害物質であった。
【０００７】
また、グルタミン酸取込阻害物質の一種であるカイニン酸およびジヒドロカイニン酸は、それ自身は取り込まれずにグルタミン酸の取込を阻害するブロッカーであることが、電気生理学的研究により示された。さらに、これらの化合物は、４つのＥＡＡＴサブタイプのうちのＥＡＡＴ２（ＧＬＴ−１タイプ）にのみ作用することも示された（Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，５５５９−５５６９，１９９４）。しかしながら、これらの化合物は、イオンチャンネル型グルタミン酸受容体に作用して強い神経興奮を引き起こす作用も合わせ持つ化合物であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この様な状況に鑑み、グルタミン酸トランスポーターとてんかん、ハンチントン氏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病等の神経障害などの神経変性疾患との関連性の究明のためには、種々のグルタミン酸トランスポーター阻害剤、とりわけブロッカーとして作用する阻害剤の開発が要望されている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ウシまたはヒトのグルタミン酸トランスポーター遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入してこれを発現させ、これらのトランスポーターによるグルタミン酸取込阻害を評価する系を開発した。そしてこの系を用いてグルタミン酸取込阻害物質を鋭意研究したところ、次の化学式（１）
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、Ｒは環上に置換されていても良い芳香族アシル基、直鎖または分岐鎖の低級脂肪族アシル基、環上に置換されていても良いアリール基、環上に置換されていても良いアラルキル基または、直鎖もしくは分岐鎖の低級アルキル基を示す。）で示されるβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体が、これらのトランスポーターによるグルタミン酸の取込を阻害すること、およびトランスポーター発現卵母細胞を用いて取込に伴う電流量を調べる系において、それ自身では電流を惹起せず、グルタミン酸と同時に加えた場合にはグルタミン酸由来の電流を減少させることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、化学式（１）で示される、β−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体およびその塩を、グルタミン酸取込ブロッカーとして提供することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
式（１）において、Ｒで示される芳香族アシル基の例としては、例えばベンゾイル基、ナフトイル基等が例示され、これらは環上の水素原子の一つ以上が、ハロゲン原子、水酸基、メトキシ基等で置換されていても良い。また、Ｒで示される直鎖または分岐鎖の低級脂肪族アシル基の例としては、アセチル基、プロパノイル基、ｎ−ブタノイル基、ｓｅｃ−ブタノイル基、ｎ−ペンタノイル基、ｓｅｃ−ペンタノイル基等が例示される。
【００１３】
さらに、式（１）において、Ｒで示されるアリール基の例としては、例えばフェニル基、ナフチル基等が例示され、これらは環上の水素原子の一つ以上が、ハロゲン原子、水酸基、メトキシ基等で置換されていても良い。また、Ｒで示されるアラルキル基の例としては、例えばベンジル基、フェネチル基等が例示され、これらは環上の水素原子の一つ以上が、ハロゲン原子、水酸基、メトキシ基等で置換されていても良い。また、Ｒで示される直鎖または分岐低級アルキル基の例としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が例示される。
【００１４】
本発明の化合物は通常の方法によって塩とすることができる。このような塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が例示できるが、これらはいずれも本発明に含まれる。また、本発明の化合物は２位および３位に不斉炭素を有するため（２Ｓ，３Ｓ）体，（２Ｒ，３Ｒ）体，（２Ｓ，３Ｒ）体，（２Ｒ，３Ｓ）体の４種類の異性体が存在するが、いずれも本発明に含まれる。
【００１５】
また、化合物の構造活性相関の検討から、本発明の化合物が強い活性を示すためには、置換基Ｒが嵩高いことおよび２位および３位の相対配置がｔｈｒｅｏであることが重要であることが判明した。このＲについては、次に示す合成スキームに従って、慣用技術を用いて所望の置換基を導入することができる。また、これら４種類の異性体については、いずれも対応する立体配置を有するβ−ヒドロキシアスパラギン酸を出発原料として合成することができる。
【００１６】
本発明の化合物は、以下のようにして合成することができる。例えば、Ｒがアシル基の化合物は、次のスキームに従い、通常の方法に従ってアミノ基およびカルボキシル基を保護した後、水酸基に所望のアシル基を導入したのち、脱保護することにより合成することができる。
【００１７】
【化３】
【００１８】
（スキーム中、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−Ｂｕはｔｅｒｔ−ブチル基，Ｒは所望のアシル基を示す。）本スキームに従ってＲに所望のアシル基を有する化合物は、化合物（３）と無水酢酸（Ｒがアセチル基の場合）または所望のＲに対応する酸塩化物とを反応させて得られる。例えばＲがアセチル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−アセトキシアスパラギン酸（９）は化合物（３）と無水酢酸とを、Ｒがプロパノイル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸（１０）は化合物（３）と塩化プロピオニルとを、Ｒがベンゾイル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（１−ベンゾイル）オキシアスパラギン酸（１１）は、化合物（３）と塩化ベンゾイルとを反応させて得られる。
〔ここで（２Ｓ＊，３Ｓ＊）とは（２Ｓ，３Ｓ）と（２Ｒ，３Ｒ）の立体配置を持つスレオ体の混合物であることを示す〕。
【００１９】
また、Ｒがアリール基、アラルキル基またはアルキル基であるエーテル型の化合物は、通常の方法に従ってアミノ基およびカルボキシル基を保護した後、水酸基に所望の置換基を導入したのち、脱保護することにより合成することができる。例えば、Ｒがベンジル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５）は、先の合成中間体（３）を出発原料として、次のスキームに従って合成することができる。
【００２０】
【化４】
【００２１】
（スキーム中、Ｂｚ１はベンジル基、ｔ−Ｂｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）このスキーム中、臭化ベンジルに代えて、所望の臭化アリール、臭化アラルキルまたは臭化アルキルを用いれば、対応する所望の置換基Ｒが導入された化合物を得ることができる。
【００２２】
【作用】
本発明の化合物は、ウシＢＧＬＡＳＴおよびヒトＥＡＡＴ１，ＥＡＡＴ２のｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞に導入して発現させた系において、グルタミン酸の卵母細胞への取込を阻害する。また、同じ卵母細胞において、本化合物はグルタミン酸の取込により惹起される電流を減少させるが、これらの化合物自身は電流を惹起しない。このことは、本化合物がブロッカーとして働いていることを示す。従って本発明の化合物が神経変性疾患におけるグルタミン酸トランスポーターの機構解明に繋がり、構造活性相関などの研究を通して、これらの神経疾患治療に結びつく有用な化合物であることを示している。
【００２３】
【実施例】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−アセトキシアスパラギン酸（９）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−ヒドロキシアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（３）の合成
既知化合物（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−ヒドロキシアスパラギン酸（２）１．３７ｇ（５．５ｍｍｏｌ）に、窒素気流下にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジ−ｔ−ブチルアセタール１０．５ｍｌ（４４ｍｍｏｌ）を室温で加えた。その後、撹拌下に６０℃で２時間加温した。エーテルで抽出し、有機層を水、ついで飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／９）で精製した。得られた油状生成物をヘキサンから結晶化し、標題化合物（３）を１．６８ｇ得た（収率８５％）。
【００２５】
性状：無色プリズム晶
融点：１０６〜１０７℃
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．４０（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，１８Ｈ），３．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，２．０Ｈｚ），４．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ）
【００２６】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−アセトキシ−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（４）の合成
ステップ１で得られた化合物（３）５００ｍｇ（１．３８ｍｍｏｌ）のピリジン（３ｍｌ）溶液に無水酢酸１ｍｌを加えた後、室温で２０時間撹拌した。エーテルで抽出し、有機層を水、ついで飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／９）で精製し、標題化合物（４）を５５０ｍｇ得た（収率９９％）。
【００２７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．４０（ｓ，９Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），４．９０（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．１８（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．５０（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００２８】
ステップ３．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−アセトキシアスパラギン酸（９）の合成
ステップ２で得られた化合物（４）２０２ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２ｍｌ）溶液にトリフルオロ酢酸２ｍｌを加え、室温で２０時間撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣をＣ１８シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＲＰ−Ｃ１８、蒸留水）で精製し、標題化合物（９）を４３ｍｇ得た（収率４５％）。
【００２９】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δｐｐｍ）：２．０５（ｓ，３Ｈ），４．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）
【００３０】
実施例２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸（１０）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（５）の合成
化合物（３）３００ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化プロピオニルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により標題化合物（５）を３０３ｍｇ得た（収率８７％）。
【００３１】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．１２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），２．４０（ｍ，２Ｈ），４．８８（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），５．１５（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），５．４８（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００３２】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸（１０）の合成
化合物（５）１９５ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）から、実施例１ステップ３と同様の方法により標題化合物（１０）を９２．５ｍｇ得た（収率９６％）。
【００３３】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，δｐｐｍ）：１．１２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），２．４５（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）
【００３４】
実施例３．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンゾイルオキシ−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（６）の合成
化合物（３）３００ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化ベンゾイルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により標題化合物（６）を２９１ｍｇ得た（収率７５％）。
【００３５】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．３０（ｓ，９Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），４．９５（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．２３（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），７．５０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）
【００３６】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１）の合成
化合物（６）１５２ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）から実施例１ステップ３と同様の方法により標題化合物（１１）を６６ｍｇ得た（収率８０％）。
【００３７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，δｐｐｍ）：４．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），７．５０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．６８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），８．１５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）。
（但しＤＭＳＯ−ｄ６はすべての水素が重水素化されたジメチルスルホキシドを示す。）
【００３８】
実施例４．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−（１−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１２）の合成
化合物（３）１００ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化−１−ナフトイルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により、（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルオキシ−３−（１−ナフトイル）アスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（７）を得た。これを精製することなく実施例１ステップ３と同様に処理して標題化合物（１２）を８２．５ｍｇ得た（収率２段階 ７０％）。
【００３９】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，δｐｐｍ）：４．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ），５．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ），７．６３（ｍ，３Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）
【００４０】
実施例５．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（８）の合成
化合物（３）３００ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化−２−ナフトイルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により、標題化合物（８）を９５．５ｍｇ得た（収率２２％）。
【００４１】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．３５（ｓ，９Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），５．０５（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．３７（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．７２（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｍ，２Ｈ），７．８３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），７．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），８．６０（ｓ，１Ｈ）
【００４２】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）の合成
化合物（８）８２ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）から実施例１ステップ３と同様の方法により標題化合物（１３）を４６ｍｇ得た（収率９５％）。
【００４３】
1ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，δｐｐｍ）：４．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），７．６３（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｍ，４Ｈ），８．８３（ｓ，１Ｈ）
【００４４】
実施例６．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンジルオキシ−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（１４）の合成
化合物（３）７８ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に−２０℃で水素化ナトリウム１３ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ），ヨウ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム１６ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した後、臭化ベンジル３８μｌ（０．３２ｍｍｏｌ）を加えて０℃で１時間撹拌した。エーテルで抽出し、有機層を水、ついで飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（エーテル／ヘキサン＝１／９）で精製し、標題化合物（１４）を６５ｍｇ得た（収率６５％）。
【００４５】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．４０（ｓ，１８Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ），４．７３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３，１０．５Ｈｚ），４．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），５．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），７．３２（ｍ，５Ｈ）．
【００４６】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５） の合成
化合物（１４）６５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２ｍｌ）溶液にトリフルオロ酢酸２ｍｌを加えた後、室温で２０時間撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣をイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ×４）のカラムクロマトグラフィーに付し、水で洗浄した後１Ｎアンモニア水で溶出して、標題化合物（１５）を２３ｍｇ得た（収率６５％）。
【００４７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δｐｐｍ）：４．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），４．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），４．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），７．４２（ｍ，５Ｈ）．
【００４８】
評価例１．ウシのグルタミン酸トランスポーター遺伝子（ＢＧＬＡＳＴ）を注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるグルタミン酸取込阻害の測定
本発明者らによる先の特許出願（特開平７−１２６２５０号公報参照）の方法に従い、ウシのグルタミン酸トランスポーター遺伝子ＢＧＬＡＳＴを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞を得た。グルタミン酸取込活性は、１μＭのＬ−〔１４Ｃ〕グルタミン酸（１１ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）と１００μＭの試料を加えて２０分間インキュベートした後、卵母細胞を完全に溶解して、卵母細胞に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションにより測定した。
【００４９】
本発明の化合物はグルタミン酸取込阻害活性を示し、例えば、（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１）は７９％，（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（１−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１２）は６３％，（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）は６３％のグルタミン酸取込阻害作用を示した。
【００５０】
評価例２．ヒトのグルタミン酸トランスポーター遺伝子（ＥＡＡＴ１または２）を注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるグルタミン酸取込阻害の測定
先と同様の方法で調整したヒトＥＡＡＴ１またはＥＡＡＴ２のｃＲＮＡを発現させた卵母細胞を用いて、（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５）のグルタミン酸取込活性を評価例１と同様に測定した。その結果、化合物（１５）は１００μＭの濃度で、ＥＡＡＴ１に対しては７４％，ＥＡＡＴ２に対しては９９％阻害した。
【００５１】
評価例３．ウシのグルタミン酸トランスポーター遺伝子（ＢＧＬＡＳＴ）を注入したアフリカツメガエル卵母細胞における電気生理学的評価
先の方法で調整したウシＢＧＬＡＳＴのｃＲＮＡを発現させた卵母細胞において、１００μＭのグルタミン酸は約１２５ｎＡの内向き電流を惹起した。これに対して、本発明の化合物である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１），（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（１−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１２），（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）は１００μＭではいずれも取込に伴う内向き電流を惹起しなかった。次いでグルタミン酸１００μＭとこれらの化合物１００μＭを同時に加えたところ、グルタミン酸取込に伴う内向き電流は顕著に減少した。その阻害率は化合物（１１）は５０％，化合物（１２）は４０％，化合物（１３）は２０％であった。
【００５２】
これらの結果から、本発明の化合物はグルタミン酸トランスポーターの阻害剤として有用であることが明らかになった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明に依れば、グルタミン酸トランスポーターの阻害剤であるβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体およびその塩が提供される。これらの化合物はグルタミン酸取込活性を阻害する新規化合物群であり、グルタミン酸トランスポーターの機能の解明に有用な生化学試薬であるばかりか、これらの研究を通して、種々の神経変性疾患の治療に繋がるものである。
【発明の属する技術分野】
本発明はＬ−グルタミン酸取込阻害剤に関し、さらに詳細にはＬ−グルタミン酸トランスポーターのグルタミン酸取込活性の抑制作用を有するβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体に関する。
【０００２】
本化合物の開発は、Ｌ−グルタミン酸トランスポーターのグルタミン酸取込阻害剤の開発への糸口を提供するものであり、てんかん、ハンチントン氏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病等の神経障害、神経変異症等の治療への展開が期待できる。
【０００３】
【従来の技術】
Ｌ−グルタミン酸は哺乳動物の中枢神経系における興奮性神経刺激の伝達物質であり、シナプス間での素早い神経伝達を引き起こすだけではなく、高次で複雑な生理的過程である記憶や学習にも関与していることが知られている。シナプス間での興奮性の神経伝達は、プレシナプスからのグルタミン酸の放出に始まり、プレシナプスやグリア細胞に存在する高親和性のグルタミン酸トランスポーターによるシナプス間隙からの素早いグルタミン酸の取込により終焉する（Ａｔｔｗａｅｌｌ，Ｄ．ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｄ．，ＴＩＰＳ ６８−７４，１９９１）。
【０００４】
いくつかの遺伝的な神経変性疾患においては、患者の脳の一部にナトリウム依存性グルタミン酸取込活性の低下が報告されている（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１４６４−１４６８，１９９２．）。このため、グルタミン酸トランスポーターの機能の発現と阻害がこれらの疾患との関連で注目されている。
【０００５】
これまでに、グルタミン酸トランスポーターの研究は主に脳から調製したシナプトゾームや、腎や小腸から得た膜標本を用いて行われてきた。１９９２年にナトリウム依存性高親和性グルタミン酸トランスポーターのｃＤＮＡがクローニングされてからは、分子生物学的にも研究がなされるようになってきた（Ｐｉｎｅｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６０，４６４−４６７，１９９２；Ｓｔｏｒｃｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０９５５−１０９５９，１９９２；Ｋａｎａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６０，４６７−４７１，１９９２）。さらに最近ではヒトのグルタミン酸トランスポーター遺伝子もクローニングされ、ＥＡＡＴ１〜４のサブタイプに分類されている（Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，５５５９−５５６９，１９９４； Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７５．５９９−６０３，１９９５）。
【０００６】
従来のシナプトゾームを用いるグルタミン酸取込阻害物質の検索から、現在までに、スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸およびＣＣＧ−ＩＩＩ〔（２Ｓ，１’Ｓ，２’Ｒ）−２−（カルボキシシクロプロピル）グリシン〕等の化合物がグルタミン酸取込阻害物質として知られているが、これらは自らも基質としてトランスポーターに取り込まれることにより、競合的にグルタミン酸の取込を抑制する阻害物質であった。
【０００７】
また、グルタミン酸取込阻害物質の一種であるカイニン酸およびジヒドロカイニン酸は、それ自身は取り込まれずにグルタミン酸の取込を阻害するブロッカーであることが、電気生理学的研究により示された。さらに、これらの化合物は、４つのＥＡＡＴサブタイプのうちのＥＡＡＴ２（ＧＬＴ−１タイプ）にのみ作用することも示された（Ａｒｒｉｚａ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，５５５９−５５６９，１９９４）。しかしながら、これらの化合物は、イオンチャンネル型グルタミン酸受容体に作用して強い神経興奮を引き起こす作用も合わせ持つ化合物であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この様な状況に鑑み、グルタミン酸トランスポーターとてんかん、ハンチントン氏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病等の神経障害などの神経変性疾患との関連性の究明のためには、種々のグルタミン酸トランスポーター阻害剤、とりわけブロッカーとして作用する阻害剤の開発が要望されている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ウシまたはヒトのグルタミン酸トランスポーター遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入してこれを発現させ、これらのトランスポーターによるグルタミン酸取込阻害を評価する系を開発した。そしてこの系を用いてグルタミン酸取込阻害物質を鋭意研究したところ、次の化学式（１）
【００１０】
【化２】
（式中、Ｒは環上に置換されていても良い芳香族アシル基、直鎖または分岐鎖の低級脂肪族アシル基、環上に置換されていても良いアリール基、環上に置換されていても良いアラルキル基または、直鎖もしくは分岐鎖の低級アルキル基を示す。）で示されるβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体が、これらのトランスポーターによるグルタミン酸の取込を阻害すること、およびトランスポーター発現卵母細胞を用いて取込に伴う電流量を調べる系において、それ自身では電流を惹起せず、グルタミン酸と同時に加えた場合にはグルタミン酸由来の電流を減少させることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、化学式（１）で示される、β−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体およびその塩を、グルタミン酸取込ブロッカーとして提供することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
式（１）において、Ｒで示される芳香族アシル基の例としては、例えばベンゾイル基、ナフトイル基等が例示され、これらは環上の水素原子の一つ以上が、ハロゲン原子、水酸基、メトキシ基等で置換されていても良い。また、Ｒで示される直鎖または分岐鎖の低級脂肪族アシル基の例としては、アセチル基、プロパノイル基、ｎ−ブタノイル基、ｓｅｃ−ブタノイル基、ｎ−ペンタノイル基、ｓｅｃ−ペンタノイル基等が例示される。
【００１３】
さらに、式（１）において、Ｒで示されるアリール基の例としては、例えばフェニル基、ナフチル基等が例示され、これらは環上の水素原子の一つ以上が、ハロゲン原子、水酸基、メトキシ基等で置換されていても良い。また、Ｒで示されるアラルキル基の例としては、例えばベンジル基、フェネチル基等が例示され、これらは環上の水素原子の一つ以上が、ハロゲン原子、水酸基、メトキシ基等で置換されていても良い。また、Ｒで示される直鎖または分岐低級アルキル基の例としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が例示される。
【００１４】
本発明の化合物は通常の方法によって塩とすることができる。このような塩としては、ナトリウム塩およびカリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が例示できるが、これらはいずれも本発明に含まれる。また、本発明の化合物は２位および３位に不斉炭素を有するため（２Ｓ，３Ｓ）体，（２Ｒ，３Ｒ）体，（２Ｓ，３Ｒ）体，（２Ｒ，３Ｓ）体の４種類の異性体が存在するが、いずれも本発明に含まれる。
【００１５】
また、化合物の構造活性相関の検討から、本発明の化合物が強い活性を示すためには、置換基Ｒが嵩高いことおよび２位および３位の相対配置がｔｈｒｅｏであることが重要であることが判明した。このＲについては、次に示す合成スキームに従って、慣用技術を用いて所望の置換基を導入することができる。また、これら４種類の異性体については、いずれも対応する立体配置を有するβ−ヒドロキシアスパラギン酸を出発原料として合成することができる。
【００１６】
本発明の化合物は、以下のようにして合成することができる。例えば、Ｒがアシル基の化合物は、次のスキームに従い、通常の方法に従ってアミノ基およびカルボキシル基を保護した後、水酸基に所望のアシル基を導入したのち、脱保護することにより合成することができる。
【００１７】
【化３】
（スキーム中、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−Ｂｕはｔｅｒｔ−ブチル基，Ｒは所望のアシル基を示す。）本スキームに従ってＲに所望のアシル基を有する化合物は、化合物（３）と無水酢酸（Ｒがアセチル基の場合）または所望のＲに対応する酸塩化物とを反応させて得られる。例えばＲがアセチル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−アセトキシアスパラギン酸（９）は化合物（３）と無水酢酸とを、Ｒがプロパノイル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸（１０）は化合物（３）と塩化プロピオニルとを、Ｒがベンゾイル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（１−ベンゾイル）オキシアスパラギン酸（１１）は、化合物（３）と塩化ベンゾイルとを反応させて得られる。
〔ここで（２Ｓ＊，３Ｓ＊）とは（２Ｓ，３Ｓ）と（２Ｒ，３Ｒ）の立体配置を持つスレオ体の混合物であることを示す〕。
【００１９】
また、Ｒがアリール基、アラルキル基またはアルキル基であるエーテル型の化合物は、通常の方法に従ってアミノ基およびカルボキシル基を保護した後、水酸基に所望の置換基を導入したのち、脱保護することにより合成することができる。例えば、Ｒがベンジル基である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５）は、先の合成中間体（３）を出発原料として、次のスキームに従って合成することができる。
【００２０】
【化４】
（スキーム中、Ｂｚ１はベンジル基、ｔ−Ｂｕはｔｅｒｔ−ブチル基を示す）このスキーム中、臭化ベンジルに代えて、所望の臭化アリール、臭化アラルキルまたは臭化アルキルを用いれば、対応する所望の置換基Ｒが導入された化合物を得ることができる。
【００２２】
【作用】
本発明の化合物は、ウシＢＧＬＡＳＴおよびヒトＥＡＡＴ１，ＥＡＡＴ２のｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞に導入して発現させた系において、グルタミン酸の卵母細胞への取込を阻害する。また、同じ卵母細胞において、本化合物はグルタミン酸の取込により惹起される電流を減少させるが、これらの化合物自身は電流を惹起しない。このことは、本化合物がブロッカーとして働いていることを示す。従って本発明の化合物が神経変性疾患におけるグルタミン酸トランスポーターの機構解明に繋がり、構造活性相関などの研究を通して、これらの神経疾患治療に結びつく有用な化合物であることを示している。
【００２３】
【実施例】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
【００２４】
実施例１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−アセトキシアスパラギン酸（９）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−ヒドロキシアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（３）の合成
既知化合物（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−ヒドロキシアスパラギン酸（２）１．３７ｇ（５．５ｍｍｏｌ）に、窒素気流下にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジ−ｔ−ブチルアセタール１０．５ｍｌ（４４ｍｍｏｌ）を室温で加えた。その後、撹拌下に６０℃で２時間加温した。エーテルで抽出し、有機層を水、ついで飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／９）で精製した。得られた油状生成物をヘキサンから結晶化し、標題化合物（３）を１．６８ｇ得た（収率８５％）。
【００２５】
性状：無色プリズム晶
融点：１０６〜１０７℃
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．４０（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，１８Ｈ），３．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），４．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，２．０Ｈｚ），４．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ）
【００２６】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−アセトキシ−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（４）の合成
ステップ１で得られた化合物（３）５００ｍｇ（１．３８ｍｍｏｌ）のピリジン（３ｍｌ）溶液に無水酢酸１ｍｌを加えた後、室温で２０時間撹拌した。エーテルで抽出し、有機層を水、ついで飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／９）で精製し、標題化合物（４）を５５０ｍｇ得た（収率９９％）。
【００２７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．４０（ｓ，９Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），４．９０（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．１８（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．５０（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００２８】
ステップ３．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−アセトキシアスパラギン酸（９）の合成
ステップ２で得られた化合物（４）２０２ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２ｍｌ）溶液にトリフルオロ酢酸２ｍｌを加え、室温で２０時間撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣をＣ１８シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＲＰ−Ｃ１８、蒸留水）で精製し、標題化合物（９）を４３ｍｇ得た（収率４５％）。
【００２９】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δｐｐｍ）：２．０５（ｓ，３Ｈ），４．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）
【００３０】
実施例２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸（１０）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（５）の合成
化合物（３）３００ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化プロピオニルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により標題化合物（５）を３０３ｍｇ得た（収率８７％）。
【００３１】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．１２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），２．４０（ｍ，２Ｈ），４．８８（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），５．１５（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），５．４８（ｂｒｓ，１Ｈ）
【００３２】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸（１０）の合成
化合物（５）１９５ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）から、実施例１ステップ３と同様の方法により標題化合物（１０）を９２．５ｍｇ得た（収率９６％）。
【００３３】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ，δｐｐｍ）：１．１２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），２．４５（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）
【００３４】
実施例３．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンゾイルオキシ−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（６）の合成
化合物（３）３００ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化ベンゾイルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により標題化合物（６）を２９１ｍｇ得た（収率７５％）。
【００３５】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．３０（ｓ，９Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ），４．９５（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．２３（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４Ｈｚ），７．３５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），７．５０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）
【００３６】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１）の合成
化合物（６）１５２ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）から実施例１ステップ３と同様の方法により標題化合物（１１）を６６ｍｇ得た（収率８０％）。
【００３７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，δｐｐｍ）：４．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），７．５０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．６８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），８．１５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ）。
（但しＤＭＳＯ−ｄ６はすべての水素が重水素化されたジメチルスルホキシドを示す。）
【００３８】
実施例４．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−（１−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１２）の合成
化合物（３）１００ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化−１−ナフトイルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により、（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルオキシ−３−（１−ナフトイル）アスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（７）を得た。これを精製することなく実施例１ステップ３と同様に処理して標題化合物（１２）を８２．５ｍｇ得た（収率２段階 ７０％）。
【００３９】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，δｐｐｍ）：４．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ），５．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ），７．６３（ｍ，３Ｈ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），８．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ）
【００４０】
実施例５．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（８）の合成
化合物（３）３００ｍｇ（０．８３ｍｍｏｌ）から、無水酢酸に代えて塩化−２−ナフトイルを用いて、実施例１ステップ２と同様の方法により、標題化合物（８）を９５．５ｍｇ得た（収率２２％）。
【００４１】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．３５（ｓ，９Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），５．０５（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．３７（ｂｒｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．７２（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｍ，２Ｈ），７．８３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），７．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），８．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），８．６０（ｓ，１Ｈ）
【００４２】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）の合成
化合物（８）８２ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）から実施例１ステップ３と同様の方法により標題化合物（１３）を４６ｍｇ得た（収率９５％）。
【００４３】
1ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，δｐｐｍ）：４．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），５．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０Ｈｚ），７．６３（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｍ，４Ｈ），８．８３（ｓ，１Ｈ）
【００４４】
実施例６．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５）の合成
ステップ１．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンジルオキシ−Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルアスパラギン酸 ジ−ｔ−ブチルエステル（１４）の合成
化合物（３）７８ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍｌ）溶液に−２０℃で水素化ナトリウム１３ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ），ヨウ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム１６ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）を加えて１０分撹拌した後、臭化ベンジル３８μｌ（０．３２ｍｍｏｌ）を加えて０℃で１時間撹拌した。エーテルで抽出し、有機層を水、ついで飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（エーテル／ヘキサン＝１／９）で精製し、標題化合物（１４）を６５ｍｇ得た（収率６５％）。
【００４５】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ）：１．４０（ｓ，１８Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ），４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３Ｈｚ），４．７３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３，１０．５Ｈｚ），４．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），５．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），７．３２（ｍ，５Ｈ）．
【００４６】
ステップ２．（２Ｓ ＊ ，３Ｓ ＊ ）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５） の合成
化合物（１４）６５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２ｍｌ）溶液にトリフルオロ酢酸２ｍｌを加えた後、室温で２０時間撹拌した。溶媒を留去して得られた残渣をイオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ×４）のカラムクロマトグラフィーに付し、水で洗浄した後１Ｎアンモニア水で溶出して、標題化合物（１５）を２３ｍｇ得た（収率６５％）。
【００４７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，δｐｐｍ）：４．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），４．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），４．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），４．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），７．４２（ｍ，５Ｈ）．
【００４８】
評価例１．ウシのグルタミン酸トランスポーター遺伝子（ＢＧＬＡＳＴ）を注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるグルタミン酸取込阻害の測定
本発明者らによる先の特許出願（特開平７−１２６２５０号公報参照）の方法に従い、ウシのグルタミン酸トランスポーター遺伝子ＢＧＬＡＳＴを発現させたアフリカツメガエル卵母細胞を得た。グルタミン酸取込活性は、１μＭのＬ−〔１４Ｃ〕グルタミン酸（１１ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）と１００μＭの試料を加えて２０分間インキュベートした後、卵母細胞を完全に溶解して、卵母細胞に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションにより測定した。
【００４９】
本発明の化合物はグルタミン酸取込阻害活性を示し、例えば、（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１）は７９％，（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（１−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１２）は６３％，（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）は６３％のグルタミン酸取込阻害作用を示した。
【００５０】
評価例２．ヒトのグルタミン酸トランスポーター遺伝子（ＥＡＡＴ１または２）を注入したアフリカツメガエル卵母細胞におけるグルタミン酸取込阻害の測定
先と同様の方法で調整したヒトＥＡＡＴ１またはＥＡＡＴ２のｃＲＮＡを発現させた卵母細胞を用いて、（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸（１５）のグルタミン酸取込活性を評価例１と同様に測定した。その結果、化合物（１５）は１００μＭの濃度で、ＥＡＡＴ１に対しては７４％，ＥＡＡＴ２に対しては９９％阻害した。
【００５１】
評価例３．ウシのグルタミン酸トランスポーター遺伝子（ＢＧＬＡＳＴ）を注入したアフリカツメガエル卵母細胞における電気生理学的評価
先の方法で調整したウシＢＧＬＡＳＴのｃＲＮＡを発現させた卵母細胞において、１００μＭのグルタミン酸は約１２５ｎＡの内向き電流を惹起した。これに対して、本発明の化合物である（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−ベンゾイルオキシアスパラギン酸（１１），（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（１−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１２），（２Ｓ＊，３Ｓ＊）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸（１３）は１００μＭではいずれも取込に伴う内向き電流を惹起しなかった。次いでグルタミン酸１００μＭとこれらの化合物１００μＭを同時に加えたところ、グルタミン酸取込に伴う内向き電流は顕著に減少した。その阻害率は化合物（１１）は５０％，化合物（１２）は４０％，化合物（１３）は２０％であった。
【００５２】
これらの結果から、本発明の化合物はグルタミン酸トランスポーターの阻害剤として有用であることが明らかになった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明に依れば、グルタミン酸トランスポーターの阻害剤であるβ−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体およびその塩が提供される。これらの化合物はグルタミン酸取込活性を阻害する新規化合物群であり、グルタミン酸トランスポーターの機能の解明に有用な生化学試薬であるばかりか、これらの研究を通して、種々の神経変性疾患の治療に繋がるものである。
Claims (8)
- 次の化学式（１）
- ２位および３位の相対配置がスレオである請求項１記載の化合物、ｔｈｒｅｏ−β−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体またはその塩。
- （２Ｓ ＊ , ３Ｓ ＊ ）−３−アセトキシアスパラギン酸；
（２Ｓ ＊ , ３Ｓ ＊ ）−３−プロパノイルオキシアスパラギン酸；
（２Ｓ ＊ , ３Ｓ ＊ ）−３−（１−ナフトイル）オキシアスパラギン酸；
（２Ｓ ＊ , ３Ｓ ＊ ）−３−（２−ナフトイル）オキシアスパラギン酸；もしくは
（２Ｓ＊, ３Ｓ＊）−３−ベンジルオキシアスパラギン酸
またはその塩である、請求項２に記載のｔｈｒｅｏ−β−ヒドロキシアスパラギン酸誘導体またはその塩。 - 次の化学式（１）
- 次の化学式（１）
- 次の化学式（１）
- 次の化学式（１）
- 次の化学式（１）
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