JP2014513663A

JP2014513663A - 効率的なペプチドカップリングおよびシクロペンタ［ｇ］キナゾリン３ナトリウム塩の合成および単離でのそれらの使用

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Publication number: JP2014513663A
Application number: JP2013546276A
Authority: JP
Inventors: ジェームズアランケルシェン; アレクサンダージェームズブリッジズ; ミリンドディー．チョウバル; ショーンマークダルジール; トーマスエリオットジャックス; アンドリューエス．トンプソン; ジェームズロバートゼラー
Original assignee: オニックスファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2014-06-05
Also published as: EP2655398A2; CA2819510A1; US9458188B2; CN103748106A; DK2655398T3; KR20130132481A; CO6721028A2; SG191269A1; WO2012087888A3; ZA201303821B; EA201390635A1; MX2013007006A; AU2011349551A1; HUE028918T2; EP2655398B1; EP2655398A4; US20130345423A1; BR112013015600A2; IL226452A0; WO2012087888A2

Abstract

Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸の新規合成方法および（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸（１）の合成でのその使用が提供される。また、長期の保存および非経口投与形態での使用に好適な形態で上述の酸の３ナトリウム塩（２）の効率的な単離および精製方法も提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、（Ｒ）−２−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）グルタール酸（Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ）の合成、および合成、特に（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の合成でのその使用、当該酸の３ナトリウム塩としての単離および精製に関する。

いくつかの特許および刊行物は、本発明および本発明の属する分野の従来技術をより完全に説明および開示するために本明細書に引用される。これらの参照のそれぞれは、まるで、個々の参照が、明確に、および個々に、参照により組み込まれていると示されているように、同じ程度に、その全体を本開示に参照により本明細書に援用されたものとする。

本明細書の全体にわたって、文脈が他のことを必要としない限り、用語「含む」および「含んでいる」などの変形は、整数または工程または整数もしくは工程の群のいずれも排除することなく、規定された整数または工程または整数もしくは工程の群を包含することを示唆すると理解されるだろう。

本明細書および添付された請求項で使用される場合、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて、単数形は、複数の指示対象を包含する。この場合、例えば、「医薬担体」との言及は、そのような担体などの２以上の混合物を包含する。

範囲は、本明細書においてよく、「約」１つの特定の値から／または「約」別の特定の値として表現されている。そのような範囲が表現されるとき、別の実施形態は、１つの特定の値から／または他の特定の値を包含する。同様に、値が、先の記載の「約」の使用により、近似値として表現されたとき、当該特定の値は別の実施形態を形成するとして理解されるだろう。

方法またはプロセスが本明細書で、リストまたは一続きの工程（数字、文字、または箇条書きを含む）として表現された場合、これらの工程が示している順番は、特定の順番が必要とされないまたは明示的に述べられていない限り、任意の特定の順番または方法での工程のタイミングを暗示することを意図していない。それゆえ、特別の定めのない限り、開示された方法の各工程は、任意の賢明な順番で実施され得、当業者に明らかなように、すなわち、表明された目的の達成またはその方法の生成物を得るのに好適な順番で実施される。また、明確に述べられていない限り、その方法で、追加工程の存在は排除されない。

新規なチミジル酸シンターゼ阻害薬（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸（１）は、その３ナトリウム塩（２）（ＣＢ３００９４５、ＢＣＧ９４５、またはＯＮＸ−０８０１としても知られる）がチミジル酸シンターゼの非常に有望な阻害剤であり、当該酵素３ｎＭのＩＣ_５０を有する。

大多数のチミジル酸シンターゼ阻害薬（メトトレキサートおよびペメトレキセド）と異なり、（２）は、その活性化、または細胞保持のためにポリグルタモイル化を必要とせず、そして、ポリグルタモイル化シンターゼ酵素の基質でない。

さらに、（２）は、Ｋ_ｉ＞２５０μΜを有する一般的な発現還元型葉酸キャリアータンパク質（ＲＦＣＰ）の基質ではなく、そして、通常の細胞膜を簡単に通り抜けない。しかしながら、（２）は、とても高いｎＭ以下の親和性（Ｋ_ｉ０．５ｎＭ）を有し、葉酸（塩）受容体α（ＦＲα）と結合し、（２）の血清の濃度がとても低い場合でさえ、その受容体を経て穏やかな速度で、細胞に輸送されうる。

（２）は、細胞内で一端チミジル酸シンターゼを阻害すると、そのまま分解され、細胞からゆっくり排除されるので、チミジル酸シンターゼを長く阻害する。これは、ＤＮＡでの処理のエラーを結果として起こり、修復サイクルが始まり、ＤＮＡに組み込むチミジン三リン酸の不足のせいで、その修復サイクルは最終的に効果がなくなる。このことは、アポトーシスのＤＮＡの損傷応答および細胞死をもたらす。

このことは、チミジル酸シンターゼ阻害薬の作用の一般的な型であり、臨床試験は、チミジル酸シンターゼ阻害薬はヒト腫瘍で強い細胞傷害効果を有しているが、チミジル酸シンターゼ阻害薬の使用は、対象組織、とりわけ骨髄が、主に、チミジル酸シンターゼ阻害薬の細胞毒性によりかなり影響を受け、それらのやや広域範囲の毒性により妨げられている。

遍在的に発現ＲＦＣＰにとって良好な基質であるチミジル酸シンターゼ阻害薬の最新の世代はほとんどの組織に広く分布されるのに対して、（２）は、ＦＲαを発現または、好ましくは、過剰に発現させる組織に効果的に分配される。少量の濃度でさえ、相対的に少量の組織は、内因的にＦＲαを発現する。発現するほとんどの組織は、細胞の遠位面に極性化する形態（ｐｏｌａｒｉｚｅｄｆａｓｈｉｏｎ）でそのように寄与し、細胞の循環性の内皮に面する細胞の輸送体がないことを意味する。このことは、これらの組織でさえ、（２）の浸透はあまり効率的でない傾向にあるという結果である。このことは、血漿中の（２）の高い血中濃度がより低い全身性毒性をもたらすことを意味する。

同じことが腫瘍についても当てはまる場合、抗腫瘍性の有効性を低くすることも予想される。しかしながら、ＦＲαを過剰に発現させる傾向にある腫瘍組織に特定の種がある。腫瘍細胞である場合、それらは、極性を損失し、心尖部および遠位面の両方でＦＲαを発現する。このようにして、これらの腫瘍組織は、極めて高く、細胞毒性のある、それらの細胞中の（２）の用量を、十分に低い血漿薬物の量から濃縮して、ほとんど毒性効果を有しないようにし得る独特の傾向を有する。このことは、腫瘍の型を過剰発現する点で（２）の増強された治療指数をもたらす。

ＦＲαを過剰に発現する様々な腫瘍の型があり、もっとも有名な腫瘍の型は、卵巣癌であり、最も一般的な腫瘍の型の９０％を占め、癌の粘液性の型であり、ＦＲαを過剰発現する。（２）は、ＦＲαを過剰発現する割合の高い他のなかで、子宮癌、中皮腫および腎癌を伴った１つの腫瘍の型に限定されないが、ＦＲαを過剰発現する癌、とりわけ卵巣癌の処理のためとても魅力的な化学療法剤である。

化合物（１）および（２）は、いくつかの近似同族体と同様に、６位でのジアステレオ異性体の１：１の混合物であるが、特許文献１に開示されている。

特許文献１も、６位でジアステレオ異性体の混合物としてまたしても、化合物（１）の合成方法を示している。

スキーム１に示されるように、シクロペンタキナゾリニルアミノ安息香酸（３）は、室温で、ＤＭＦ中、ジエチルホスホノニトリルおよびトリエチルアミンを用いて、トリ−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸（４）と縮合され、トリ−Ｏ−ｔ−ブチルＮ−｛Ｎ−｛４−［Ｎ−（（６ＲＳ）−２−（２，２−ジメチルプロピロニロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ］ベンゾイル｝−Ｌ−γ−グルタミル｝−Ｄ−グルタミン酸（５）を低ミリグラムスケール、６２％の収率で与えた。その後、その３つのｔ−ブチルエステルを１時間、室温でＴＦＡを用いて処理して除去し、溶媒を室温以下で揮散し、溶媒交換を行い、メタノール：水＝１：１とした。水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１２まで上げ、ピバロイルエステルを室温で水素化した。その後、当該溶液を塩酸（１Ｍ）でｐＨ４まで酸性にし、０℃で沈殿させ、濾過および乾燥後、酸（１）（６ＲＳの混合物）を収率４７％で与えた。

特許文献２に、化合物（１）の同じ合成が開示されたが、スキーム２に示されるように、化合物（６）のより有用な多様体が示されている。化合物（６）は単に化合物（１）のＤ−ＧｌｕのアミンでＮ−メチル化されているものである。この場合、脱ピバロイル化されたコア酸（７）は（８）（ジペプチドトリエステル（４）のＮ−メチル化類似体）と（３）および（４）の結合で記載されている同じ条件下で結合され、保護された化合物（９）を収率４０％で与える。３つのｔ−ブチルエステルは、その後、室温で１時間ＴＦＡでの処理により除去され、溶媒は、その後室温以下で揮散され、残査が水中に集められ、希薄な水酸化ナトリウムでｐＨ１０まで塩基性にされ、最後の酸が１Ｍ塩酸で沈殿され、上記されたように濾過および乾燥して酸（６）（６ＲＳ混合物）を収率７７％で与える。

一般式（Ｉ）の化合物を溶解する方法は、より活性でありそれ故により所望の（６Ｓ）−鏡像異性体を得るために特許文献３に示されている。この方法は、式（Ｉ）のラセミ酸を得ることおよび、それをキラルアミノ酸、好ましくはＬ−グルタミン酸または（Ｓ）−２−アミノアジピン酸、と縮合させ、ジアステレオ異性体の１：１の混合物として式（ＩＩ）のアミドを形成することを含む。

適切なプロテアーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＧ_２）の使用は、６Ｒ−ジアステレオ異性体を選択的に加水分解し、６Ｒ−（Ｉ）から６Ｓ−（ＩＩ）を直接的な分離を可能とする。６Ｓ−（ＩＩ）は、その後、酵素により６Ｓ−（Ｉ）を＞９８％鏡像体過剰率に加水分解される。このプロセスは、特許文献４が、化合物（１）の純粋な６Ｓジアステレオ異性体の異性体の作成方法を開示していないが、化合物（１）の純粋な６Ｓジアステレオ異性体の生物学的データを示しているので、酸（３）、ひょっとしたら酸（７）で実施されたことが推測される。

トリ−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸（４）は、安定であるＮ−ベンジルオキシカルボニル保護された前駆体（１０）として市場で購入でき、使用に先立って短時間で、接触水素化により遊離アミン（４）に便宜上脱保護される。しかしながら、ジペプチド（４）の２つの出発物質（Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌ−Ｇｌｕ（１１）とＤ−Ｇｌｕ（１２））はあまり高価ではないが、（１１）から１段階の調製で唯一収率３３％で得られるＮ−Ｃｂｚ−Ｇｌｕ−α−Ｏ−ｔ−Ｂｕ（１３）とジ−Ｏ−ｔ−ブチル−Ｄ−グルタミン酸（１４）の２つのｔ−ブチルエステルは高価であり、その結果、スキーム３で製造されている化合物（１０）はとても高価である。

（１３）の調製の収率は高いが、この反応は多工程のプロセスであり、化合物の費用を減少しない。それゆえ、大規模で行っても、ジペプチド（１０）はとても高価である。そして、（１０）の改善された合成、またはカップリング反応での、より安価な形態の（Ｒ）−２−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）グルタール酸ジペプチド（以下、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−ＧｌｕまたはＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸のどちらかで言及される）の使用は、化合物（１）の製造費用でとても有益な効果であり得る。

国際公開２００３／０２０７４８号米国特許第７，２５０，５１１号明細書国際公開９４／１１３５４号米国特許第７，５２８，１４１号明細書

上記で説明されたように、化合物（１）のジペプチド単位の複素環式コア（すなわち分子（３）および（７））へ添加する先行技術の方法は、最終生成物を単離する前に、カップリング工程および１つまたは２つの脱保護工程を含む。この化学は、その高い費用に加えて、いくつかの欠点を有し、薬物を市販用に製造するのに全く適さない。

上記報告された化学は、とても少量で、生成物（１）の純度プロファイルの詳細な分析なく行われた。化合物（１）のこれまでに説明されていない適切な分析技法である、酸性条件下での化合物（１）の実験は、水溶液中、ｐＨ５以下で限定的に安定性を有することを示す。（１）の単純なモノトリフルオロ酢酸塩は、固体形態とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液の両方で限定された安定性を有する。

（５）またはその２−脱ピバロイル化等価体からｔ−ブチルエステルの除去は、強い酸性条件を必要とするので、これは、脱保護に必要とされる実際の設定を非常に強制している。トリフルオロ酢酸は反応混合物から除去されうる。しかしながら、ＴＦＡ溶液中での安定性の問題は、量が増加したとき、トリフルオロ酢酸の除去が低温で相対的に迅速にされなければならないことを必要とする。とても特別な装置なしで、この任意の量に大規模化するのは容易にはし得ない。この化学は、ＡＰＩ（医薬品有効成分）を０．５〜１ｋｇの量で製造するとき、総合的に実現不可能となるだろう。

さらに、この化合物が非経口的に使用されるとき、不溶性の遊離酸（１）は、製剤であり得ず、上記言及される特許出願は、最終的な製剤での形態であるナトリウム塩（２）の効率的な調製および適切な精製を示唆しない。（２）の有効な抗癌活性に起因して、（２）のより優れた合成方法は大きな利益と有用性を有する。

本発明は、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸ジペプチドの新規な合成方法、および（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸（１）の合成でのその使用方法を提供する。有利なことに、本発明の方法は、容易に入手できかつ安価な前駆体から、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸ジペプチド、好ましくは、保護されていないＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸ジペプチドの合成を可能としてよい。非経口投与形態で長期の保存および使用に好適な形態にある、上述の酸の３ナトリウム塩（２）の効率的な単離および精製方法も提供される。

第１の態様で、本発明は、ａ）Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体のγ−カルボン酸を活性化する工程；ｂ）Ｄ−グルタミン酸をシリル化する工程；およびｃ）工程ａ）で製造した活性カルボン酸誘導体と工程ｂ）のシリル化生成物とを反応させて、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を与える工程；を含むＬ−ＧＩｕ−γ−Ｄ−ＧＩｕの合成方法を提供する。

いくつかの実施形態では、当該方法は、ｄ）上記保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を脱保護する工程；をさらに含む。

第２の態様で、本発明は、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸、もしくはそれらの薬学的に許容できる塩またはそれらの溶媒和物の合成方法であって、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸を、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種とカップリングする工程を含む合成方法を提供する。

好ましくは、上記保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、本発明の第１の態様に従う方法により製造され、または、当該種から調製される。

さらなる態様では、本発明は、以下の工程を含む（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の３ナトリウム塩（ＯＮＸ−０８０１）の調製方法および精製方法を提供する：
（ｉ）ナトリウム塩基水溶液中、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩を溶解する工程；
（ｉｉ）必要に応じて、ｐＨを調整する工程；
（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィーをする工程；
（ｉｖ）任意に、工程（ｉｉｉ）で溶出された生成物を濃縮する工程；および
（ｖ）凍結乾燥する工程。

好ましくは、工程（ｉ）で使用されている（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸は、本発明の第１の態様および／または第２の態様に記載されている工程を含む方法により調製される。

追加の態様で、本発明は、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸およびその３ナトリウム塩の合成に有用な化合物ならびに中間体を提供する；例えば、
（Ｒ）−ビス（トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタンアミド）グルタール酸；
（Ｒ）−２−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタンアミド）グルタール酸；
（Ｓ）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イル４−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸；
（Ｒ）−ビス（トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−４−（４−（（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）−５−オキソ−５−（トリメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）グルタール酸；
（Ｓ）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イル４−（（２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸；
（Ｒ）−ビス（トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−４−（４−（（（Ｓ）−２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）−５−オキソ−５−（トリメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）グルタール酸。

（Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕの合成）
本発明は、ａ）Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体のγ−カルボン酸を活性化する工程；ｂ）Ｄ−グルタミン酸をシリル化する工程；およびｃ）工程ａ）で製造された活性カルボン酸誘導体と工程ｂ）のシリル化生成物とを反応させて、完全に保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を与える工程；を含む、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕの合成方法を提供する。

（工程ａ）−Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体の活性化）
工程ａ）は、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体のγ−カルボン酸を活性化を含む。

いくつかの実施形態では、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体は、一般式のジプロテクトされた誘導体である：

式中、Ｐ^Ｃは、カルボン酸保護基であり、Ｐ^Ｎは、アミン保護基である。

好適なカルボン酸保護基は、当該技術分野で公知であり、例えば、それらは、ＴＷ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰＧＭＷｕｔｓ，“ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”第３版．ＷｉｌｅｙＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９年．ｐ．３８７−４３１に記載されており、それは参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、Ｌ−グルタミン酸誘導体のα−カルボン酸の保護基（Ｐ^Ｃ）は、ベンジルまたは任意に置換されたベンジルエステル；アリルエステル；ｔ−ブチルエステル；または２−トリメチルシリルエチルエステルから選択される。

好適なアミン保護基も、当該技術分野で公知であり、例えば、それらは、ＴＷ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰＧＭＷｕｔｓ，”ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”第３版．ＷｉｌｅｙＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９年．ｐ．５０３−５７２に記載されており、それは参照により本明細書に援用する。

いくつかの実施形態では、Ｌ−グルタミン酸誘導体のアミン保護基（Ｐ^Ｎ）は、カルバメート；ベンジルまたは任意に置換されたベンジルカルバメートから選択され、これらに限定されないが、４−メトキシベンジルカルバメート；アリルカルバメート；ｔ−ブチルカルバメート；９−フルオレニルメチルカルバメート；または２−トリメチルシリルエチルカルバメートを含む。

いくつかの好ましい実施形態では、Ｌ−グルタミン酸のアミンおよびα−カルボン酸の両方は、基（Ｐ^Ｎ、Ｐ^Ｃ）により保護され、それらは、同じ化学的工程で除去されうる。

例えば、ベンジルエステルに同じまたは異なる任意の置換基を有する（任意に置換された）ベンジルカルバメートの使用は、両方の基の水素化分解により除去されることを可能とする。アリルエステルを有するアリルカルバメートを使用すること、両方の基が触媒的パラジウムおよびギ酸塩を用いて除去されうることを可能とする。ｔ−ブチルエステルを有するｔ−ブチルカルバメートの使用は、両方の基を酸性条件下で除去されることを可能とする。

好ましい実施形態では、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルまたは別の好適なＮ−αＯ−ジプロテクトＬ−Ｇｌｕ誘導体である。

いくつかの実施形態では、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルである。

いくつかの実施形態では、活性化は、上記Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体のγ−カルボン酸の活性化誘導体への変換を含む。

いくつかの実施形態では、活性化は、γ−カルボン酸、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−αベンジルエステルの活性化誘導体への変換を含む。

種々の活性カルボン酸誘導体およびそれらを生成方法は、当該技術分野で公知である。具体例は、酸塩化物、酸フッ化物、酸無水物、対称および非対称の両方のＯ−アシルウレア、チオエステル、活性化エステル（例えば、ｐ−ニトロフェニル、および１，Ｏ−オキシベンゾトリアゾールエステル）、活性化アミド（例えば、Ｎ−アシルイミダゾール）、混合無水物（例えば、Ｏ−アシルホスホン酸エステルおよびＯ−アシルスルホン酸エステルならびにアシルアジドを含む。これらの多くのおよび”ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＨａｎｄｂｏｏｋ”Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙＳｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ１９９３年に例示されている他の活性化カルボン酸は、ペプチド合成反応での使用に好適である。

いくつかの実施形態では、活性化誘導体は無水物である。

いくつかの実施形態では、無水物は混合無水物である。

いくつかの実施形態では、活性化は、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体の活性化誘導体（例えば、無水物）への変換を含む。例えば、下記式無水物である：

式中、Ｒ^１はＣ_１〜４アルキル基であり、ならびにＰ^ＣおよびＰ^Ｎは、これまでに定義されたとおりである。

いくつかの実施形態では、活性化は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルの活性化誘導体（例えば、下記式の無水物）への変換を含む：

式中、Ｒ^１は、Ｃ_１−４アルキル基である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^１はイソブチルである。

いくつかの実施形態では、活性化は、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体、好ましくは、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルとアルキルクロロギ酸（例えば、Ｒ１ＯＣ（＝０）Ｃｌ）との処理を含む。

いくつかの実施形態では、活性化は、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体、好ましくは、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルとアルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基との処理を含む。

いくつかの実施形態では、クロロギ酸はイソブチルクロロギ酸である。

いくつかの実施形態では、第三級アミン塩基はＮ−メチルモルホリンである（ＮＭＭ）。

いくつかの実施形態では、活性化は、低温で、アルキルクロロギ酸の溶液に、トリアルキルアンモニウム塩として、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体の溶液、好ましくは、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルの逆添加を含む。

いくつかの実施形態では、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体は、アルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基の低温溶液にゆっくり添加される。

いくつかの実施形態では、低温溶液は、約−１０℃〜−５０℃の温度であり、好ましくは約−３０℃の温度である。

いくつかの実施形態では、追加温度は、−２５〜−４０℃の範囲である。

いくつかの実施形態では、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体（例えば、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステル）：第三級アミン塩基：クロロギ酸の割合は、約１：１．２：１．１である。

いくつかの実施形態では、反応は、溶媒としてＴＨＦ中で実施される。

（工程ｂ）−Ｄ−グルタミン酸のシリル化）
工程ｂ）は、Ｄ−グルタミン酸のシリル化を含む。

いくつかの実施形態では、シリル化がＤ−グルタミン酸とシリル化剤との処理を含む。

いくつかの実施形態では、シリル化がＤ−グルタミン酸とシリル化剤との処理を含み、以下の式のシリル化Ｄ−Ｇｌｕ種を製造する。

式中、各Ｒ^ＳｉおよびＲ^Ｓｉ’は、独立に以下に定義されているシリル保護基であり、同じであってよいし異なっていてよい。

いくつかの実施形態では、すべてのＲ^Ｓｉ基およびＲ^Ｓｉ’基は、同じシリル保護基である。

種々のシリル保護基、およびシリル保護基の導入のために好適なシリル化剤は、当該技術分野で公知である（例えば、ＴＷ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰＧＭＷｕｔｓ，”ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”第３版．ＷｉｌｅｙＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９年参照）。

いくつかの実施形態では、Ｒ^ＳｉおよびＲ^Ｓｉ’は、それぞれ独立に、トリメチルシリル（−ＳｉＭｅ_３）、トリエチルシリル（−ＳｉＥｔ_３）、ｔ−ブチルジメチルシリル（−Ｓｉ^ｔＢｕＭｅ_２）、フェニルジメチルシリル（−ＳｉＰｈＭｅ_２）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（−Ｓｉ^ｔＢｕＰｈ_２）またはトリイソプロピルシリル（−Ｓｉ^ｉＰｒ_３）から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｓｉは、トリメチルシリル（−ＳｉＭｅ_３）である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^Ｓｉ’は、トリメチルシリル（−ＳｉＭｅ_３）である。

いくつかの実施形態では、Ｒ^ＳｉおよびＲ^Ｓｉ’は、両方トリメチルシリル（−ＳｉＭｅ_３）である。

いくつかの実施形態では、シリル化剤は、Ｏ，Ｎ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）である。いくつかの実施形態では、当該シリル化剤は、Ｄ−グルタミン酸に対して少なくとも３当量の量で使用される。

いくつかの実施形態では、シリル基は、トリメチルシリルより加水分解およびアルコール分解条件にはるかに高い安定性を有するシリルエステルを形成するために選択される。完全に保護された種を単離することが意図されている場合および／または連続工程までシリル化種を有していることが望まれる場合、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェニルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはトリイソプロピルシリルエステルが好ましいかもしれない。

（工程ｃ）−工程ａ）およびｂ）の生成物の反応）
工程ｃ）は、工程ａ）で製造した活性化カルボン酸誘導体と工程ｂ）のシリル化生成物とを反応させて、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を与えることを含む。

いくつかの実施形態では、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は完全に保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種である。

いくつかの実施形態では、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、以下の式の化合物である：

式中Ｒは、シリル保護基である。

いくつかの実施形態では、工程ｂ）由来のシリル化Ｄ−Ｇｌｕ種の溶液は、工程ａ）由来の活性化カルボン酸誘導体の冷溶液に添加される。

いくつかの実施形態では、シリル化Ｄ−Ｇｌｕ種の溶液は、工程ｂ）の反応混合物から直接添加される。

いくつかの実施形態では、工程ｂ）で、Ｄ−グルタミン酸は、シリル化剤の数等量で溶解され；その後、工程ｃ）で、その溶液は、工程ａ）由来のカルボン酸誘導体の冷溶液に添加され、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸のシリルエステル化された溶液を形成する。

いくつかの実施形態では、溶媒はＴＨＦである。

いくつかの実施形態では、工程ｂ）で、Ｄ−グルタミン酸は、約１．１当量の量で使用され、工程ｃ）で、シリル化剤は、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体の量に対して、約３．５等量の量で使用される。

いくつかの実施形態では、方法は、カップリング工程の後に後処理を含む。

いくつかの実施形態では、後処理は、シリルエステルを開裂しない。

いくつかの実施形態では、後処理は、脱シリル化水溶液の後処理を含む。

いくつかの実施形態では、反応後、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸ジシリルエステル、好ましくは、Ｏ．Ｏ−ビス（トリメチルシリル）エステルを含むシリルエステル化された溶液は、脱シリル化水溶液の後処理を受け、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸を良収率および良純度で製造する。

従って、いくつかの実施形態では、工程（ｃ）から得られる保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は下記式の化合物である：

いくつかの実施形態では、脱シリル化処理は、水−有機分離、すなわち水と有機溶媒との溶液の分離を含む。

いくつかの実施形態では、有機溶媒は酢酸エチルである。

いくつかの実施形態では、脱シリル化処理は、酸の添加を含む。

いくつかの実施形態では、酸の溶液のｐＨを約ｐＨ２に調整するために添加される。

いくつかの実施形態では、水−有機分離後、酸は水部分を酸性にするために添加される。

いくつかの実施形態では、酸は、塩酸である。

いくつかの実施形態では、後処理は、溶媒交換を含む。

いくつかの実施形態では、溶媒交換は、最初の溶媒と新しい溶媒とを置換する溶媒交換を含む。

いくつかの実施形態では、溶媒交換は、第１溶媒の除去、例えば、エバポレーションおよび／または共沸混合物の除去の溶媒交換を含む。

いくつかの実施形態では、最初の溶媒は酢酸エチルである。

いくつかの実施形態では、新しい溶媒は、アセトニトリルである。

いくつかの実施形態では、得られた保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、新しい溶媒から再結晶され、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸を良収率および良純度で提供する。

（工程ｄ）−Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種の脱保護）
いくつかの実施形態では、上記の方法は、さらに以下の工程を包含する：
ｄ）上記保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を脱保護する工程。

いくつかの実施形態では、脱保護は、完全な脱保護、すなわち保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種からすべての保護基の除去を含む。

いくつかの実施形態では、脱保護は、部分的な脱保護、すなわち保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種からいくつかの保護基だけの除去を含む。

例えば、脱保護は、Ｌ−Ｇｌｕ部分の保護基の除去を含み、一方、除去されていないＤ−Ｇｌｕ部分に、任意のシリル保護基を残すことを含む。

いくつかの実施形態では、脱保護は、（任意に置換された）ベンジルおよび／またはベンジルオキシカルボニル保護基の除去を含み、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸またはそれらのジシリルエステルを製造する。

いくつかの実施形態では、脱保護は、ｔ−ブチルおよび／またはｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を含み、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸を製造する。

いくつかの実施形態では、脱保護は、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸からベンジルおよびベンジルオキシカルボニル保護基の除去を含み、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸を製造する。

いくつかの実施形態では、脱保護は、アリルおよび／またはアリルオキシカルボニル保護基の除去を含み、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸またはそれらのジシリルエステルを製造する。

いくつかの実施形態では、脱保護は、脱シリル化を含む。

いくつかの実施形態では、脱保護は、２−トリメチルシリルエチルおよび／または２−トリメチルシリルエチルおよび／または２−トリメチルシリルエトキシカルボニル保護基の除去を含み、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸を製造する。

脱保護工程で選択される条件は、除去される保護基に依存する。種々のアミンおよびカルボン酸保護基の除去の条件は、当該技術分野で公知である（ＴＷ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰＧＭＷｕｔｓ、”ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ”第３版．ＷｉｌｅｙＮｅｗＹｏｒｋ、１９９９年参照）。複数の種の保護基が除去される場合、複数の脱保護工程を用いてよい。

いくつかの実施形態では、脱保護は、酸性条件下の保護基の除去（例えば、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）中での分解）を含む。

いくつかの実施形態では、脱保護は、フッ化物イオンを用いた保護基の除去（例えば、ＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）またはピリジン、ＨＦ錯体を用いた処理）を含む。

いくつかの実施形態では、脱保護は、水素化分解を含む。

いくつかの実施形態では、脱保護は、ギ酸塩および適切な遷移金属触媒を用いた水素化分解を含む。

いくつかの実施形態では、脱保護は、水性エタノール中、適切な遷移金属触媒を用いた水素化分解を含む。

いくつかの実施形態では、遷移金属触媒は、パラジウム炭素触媒含む。

いくつかの実施形態では、水素化分解は、１５〜５０ｐｓｉで水素の使用を含む。

いくつかの実施形態では、水素化分解は、室温で実施される。

いくつかの実施形態では、水素化分解は、室温で実施され、次いで、６０℃に温められる。いくつかの実施形態では、６０℃に暖め、次いで熱濾過される。

いくつかの実施形態では、脱保護は、水性エタノール中、適切な遷移金属触媒を用いた水素化分解を含み、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸：エタノール：水の最初の比は、約１グラム：１０ｍＬ：２ｍＬである。

いくつかの実施形態では、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸：エタノール：水の最初の比は、約１グラム：７．９グラム：７グラムである。

いくつかの実施形態では、水素化分解は、化合物が結晶性の固体として良収率で単離されることを可能とする後処理を続けて行われる。

いくつかの実施形態では、後処理は、Ｐｄ／Ｃを除く最初の濾過を含む。

いくつかの実施形態では、最初の濾過の後、残査は、出発物質のグラムにつき、約１０ｍＬのエタノールおよび約１ｍＬの水で洗浄される。

いくつかの実施形態では、後処理は、加熱を含む。

いくつかの実施形態では、後処理は、濾過を含む。

いくつかの実施形態では、後処理は、チオシリカを用いて処理、好ましくは６０℃で処理し、次いで再濾過を含む。

いくつかの実施形態では、後処理は、材料を冷却して晶出を可能とすることを含む。

いくつかの実施形態では、後処理は、濾過を含み、最初の濾過の残査は、出発物質のグラムあたり約５−６グラムのエタノールで洗浄される。

いくつかの実施形態では、後処理は、濾過を含み、最初の濾液および洗浄は、チオシリカ（好ましくは、出発物質に基づき約２ｗｔ％）を用いて、好ましくは４時間、好ましくは６０℃で処理されることを含む。いくつかの実施形態では、混合物は、その後、熱濾過される。その後、当該濾過の残査は、さらなるエタノール（例えば、約２グラム／出発物質１グラム）で洗浄される。その後、濾液は、好ましくは、常温にゆっくり冷却され、その後５〜１０℃に冷却される。

いくつかの実施形態では、生成物は、約５〜１５ｗｔ％の水を含む結晶性固体として単離される。

いくつかの実施形態では、生成物は、約１０ｐｐｍ未満のパラジウムを含む。

（（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の合成）
本発明は、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸、もしくはそれらの薬学的に許容できる塩またはそれらの溶媒和物の合成方法であって、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸と保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種とカップリングする工程を含む合成方法を提供する。

いくつかの実施形態では、カップリングは、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸のカルボン酸部分の活性化し、次いで、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を用いた処理を含む。

いくつかの実施形態では、活性化は、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸の活性化カルボン酸誘導体、好ましくは活性化エステル誘導体への変換を含む。

種々の活性化カルボン酸誘導体およびそれらの作製方法は、前もって上記されているように当該技術分野で公知である。

いくつかの実施形態では、活性化は、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸を活性化ＨＯＢＴエステルへの変換（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）およびカップリング剤との処理による）を含む。

いくつかの実施形態では、カップリング剤は、ジイミドカップリング剤である。

いくつかの実施形態では、カップリング剤は、ＥＤＣＩ（Ｎ−（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩）である。

いくつかの実施形態では、変換は、ＴＨＦ中で実施される。

いくつかの実施形態では、変換は、アセトニトリル（ＡＣＮ）中で実施される。

いくつかの実施形態では、変換は、約０℃〜約２５℃の温度で実施される。

いくつかの実施形態では、活性化カルボン酸誘導体は、Ｏ−（１，Ｎ−ベンゾトリアジル）（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸である。

いくつかの実施形態では、変換は、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物およびＮ−（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩の１．０：１．１〜１．３：１．１〜１．５の範囲のモル比での反応を含む。

いくつかの実施形態では、シクロペンタ［ｇ］キナゾリニル酸の充填は、約２０〜約４０グラム／リットルの範囲である。

いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣシステムは、カップリング反応中の活性化カルボン酸誘導体の製造過程の形態を観測するために使用される。

いくつかの実施形態では、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、シリル保護されたＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸である。

いくつかの実施形態では、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、以下の化学式である：

式中、各Ｒ^ＳｉおよびＲ^Ｓｉ’は、上記のシリル保護基であり、同じであってよいし異なっていてよい。

いくつかの実施形態では、シリル保護基は、トリメチルシリル（−ＳｉＭｅ_３）である。

他の実施形態では、Ｒ^ＳｉおよびＲ^Ｓｉ’は、異なるシリル保護基である。

いくつかの実施形態では、各Ｒ^Ｓｉは、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェニルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはトリイソプロピルシリルから選択され、各Ｒ^Ｓｉ’は、トリメチルシリルである。

シリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、好ましくはＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸のシリル化により製造される。

別の実施形態では、シリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸ジシリルエステルのさらなるシリル化により製造される。

いくつかの実施形態では、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸、またはそれらのジシリルエステルは、上で論じたように本発明の方法により製造される。

いくつかの実施形態では、シリル化は、シリル化剤を用いた処理を含む。

いくつかの実施形態では、シリル化剤は、Ｏ，Ｎ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミドである。

いくつかの実施形態では、シリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種は、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸またはそれらのジシリルエステルのシリル化および可溶化によりインシチュで生成され、その活性化カルボン酸誘導体は得られた溶液に直接添加される。

いくつかの実施形態では、シリル化剤は、保護されていないジペプチド、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸を溶液とするために使用されてよく、従って、反応を起こさせる。シリル化剤は、一般的な穏和な乾燥剤としても作用し、加水分解の副反応を抑制するかもしれない。

いくつかの実施形態では、シリル化剤は、反応混合物中、活性化カルボン酸誘導体の第一級アルコールを追加的にシリル化してよく（すなわち、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸の活性化エステルの２−ヒドロキシメチル基をシリル化し、２−シロキシメチル基、好ましくは２−トリメチルシリルオキシ基を製造してよく）、しかし、当該シリル化剤は、その後のカップリング反応に影響を及ぼさない。

反応混合物は、それゆえ、例えば、（Ｓ）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イルー４−（（２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸のようなシリル化活性化エステルを含んでよい。カップリング反応の生成物は、それゆえ、例えば、（Ｒ）−ビス（Ｏ−トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−４−（４−（（（Ｓ）−２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）−５−オキソ−５（トリメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）グルタール酸のような完全にシリル化されたカップリング生成物を含んでよい。

いくつかの実施形態では、固体のＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸は、あらかじめ形成された活性化カルボン酸誘導体の溶液に直接添加され、その後にシリル化剤が添加される。

いくつかの実施形態では、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸のスラリーを含む反応混合物は、シリル化剤の添加前に約−５〜−１０℃に冷却される。好ましくは、添加中、および添加後の任意の期間、混合物の反応温度は、１０℃超上昇させない。

いくつかの実施形態では、シリル化剤は、徐々に添加される。好ましくは、添加の上で気になる発熱は注意深く制御される。

いくつかの実施形態では、シリル化剤は、約７〜１０モル当量の量で使用される。

いくつかの実施形態では、このプロセスの溶媒は、アセトニトリルである。

いくつかの実施形態では、固体のＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸は、シリル化剤の添加後、活性化カルボン酸誘導体の前もって形成された溶液に直接添加される。

いくつかの実施形態では、シリル化剤およびＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸は、前もって形成された活性化カルボン酸誘導体の溶液に添加する前に、分離反応気で一緒に反応させられる。

いくつかの実施形態では、シリル化剤およびＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸の反応は、２０〜２５℃で、２〜２４時間の間、ＴＨＦ中で行われる。

いくつかの実施形態では、カップリング反応は、工程中のＨＰＬＣで観測される。

好ましくは、後処理は、中間体のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸が≧９９％消費された時点で開始される。

いくつかの実施形態では、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸とＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸のモル比は、１：１．２〜１．５の範囲である。

いくつかの実施形態では、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸の水分含量は、０〜４重量％の範囲である。

いくつかの実施形態では、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸の水分含量は、５〜１５重量％の範囲である。

いくつかの実施形態では、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸の水分含量は、９〜１２重量％の範囲である。

いくつかの実施形態では、活性化カルボン酸誘導体の前もって形成された溶液は、インシチュで生成されたＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸ポリシリル化エステルに添加される。

シリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種への活性化カルボン酸誘導体のカップリングは、シリル化（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸を製造する。

いくつかの実施形態では、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の粗製溶液は、物理的な相に基づく方法（例えば、沈殿または液−液抽出技術）を使用して、最初に精製される。

いくつかの実施形態では、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の最初の精製は、反応溶媒の交換、好ましくは減圧下で反応混合物の除去、代替溶媒での再構成を含む。

いくつかの実施形態では、反応溶媒はＴＨＦである。

いくつかの実施形態では、代替溶媒は、ナトリウム塩基水溶液（例えば、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウム）である。

いくつかの実施形態では、このようにして製造された水溶性の弱アルカリ溶液（ｐＨ７〜０）は、有機不純物の多くを除くため、水混和性の低い溶媒で数回洗浄される。いくつかの実施形態では、当該洗浄溶媒は、酢酸エチルである。

いくつかの実施形態では、このようにして製造された水溶性の弱アルカリ溶液（ｐＨ７−１０）は、水混和正の低い有機溶媒（例えば、酢酸エチル）で最初に洗浄され、その後、さらに限外濾過により精製される。

いくつかの実施形態では、上記洗浄および／または限外濾過に続けて、例えば、窒素または他の不活性ガスを散布され、または制限されたエバポレーションの減圧下で、有機溶媒の存在している量を減少させる。

いくつかの実施形態では、上記のプロセスで得られた純粋な水溶液は、例えば、第３の態様に後述するように、生成物をクロマトグラフィーカラムに乗せるために使用されてよい。

いくつかの実施形態では、上記のプロセスで製造される水溶液は、酸性にされ、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸が沈殿され、回収および乾燥される。含水ギ酸は、沈殿物に包含される傾向がとても低いので、この沈殿のために好ましい酸であるかもしれない。従って、この生成物は、例えば、第３の態様で後述するように希ナトリウム塩基水溶液に再溶解され、クロマトグラフされてよい。

いくつかの実施形態では、代替溶媒はアセトニトリルである。

いくつかの実施形態では、反応溶媒は、アセトニトリルであり、その場合、溶媒交換は必要とされないかもしれない。

いくつかの実施形態では、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の初期精製は、アセトニトリル中、反応混合物を濾過することを含む。

いくつかの実施形態では、精製は、従って、濾液を０〜５℃にさらに冷却することを含み、好ましくは、アセトニトリルでさらに希釈しながらである。

いくつかの実施形態では、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸に対するアセトニトリルの最終の割合は、８０〜１２０Ｌ／ｋｇである。

いくつかの実施形態では、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の精製は、さらに沈殿を含む。

いくつかの実施形態では、沈殿は、計量された少量の水相の添加を含む。この水相は、単なる水であってよく、または、ｐＨの高い水相（例えば、ナトリウム塩基水溶液（例えば、飽和炭酸水素ナトリウム溶液））、または、ｐＨの低い水相（例えば、２Ｍギ酸溶液）であってよい。好ましくは、これらの水相は、低温の撹拌反応混合物にゆっくり添加される。好ましくは、添加の後にその温度で数時間撹拌される。いくつかの実施形態では、その後、減圧濾過され、好ましくは、窒素下で、低温のまま行われる。

いくつかの実施形態では、粗製の（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸、またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩は、自由流動固体として単離される。いくつかの実施形態では、使用される水、含水ギ酸溶液またはナトリウム塩基水溶液の量は、カップリング反応で使用される（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸の約０．８〜１．０グラム／グラムの範囲である。

例えば、脱シリル化し、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸がかなり精製された形態で単離する方法は、以下を含んでよい：反応混合物の濾過、さらにアセトニトリルを用いて、初めの酸（（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸）１０グラム毎にアセトニトリルを約１リットルである溶液を製造するための希釈、その後の限定された量の水、含水ギ酸のゆっくりの添加、好ましくは２Ｍ、または水溶性炭酸水素ナトリウム溶液、好ましくは、飽和、約１０ｍＬ／アセトニトリル１リットルを添加し、冷却、撹拌された反応溶液、その後、窒素雰囲気下で生成した沈殿物の回収し、次いで、真空オーブン中、室温で乾燥工程を含む。

いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＢＳＡの添加から固体沈殿物の回収まで、または反応混合物の水溶性クエンチのプロセスの全体にわたって、１０℃以下に維持される。

（ＯＮＸ−０８０１の３ナトリウム塩の調製）
本発明は、以下の工程を含む（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩（ＯＮＸ−０８０１）の調製方法および精製方法をさらに提供する：
（ｉ）ナトリウム塩基水溶液中、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩の溶液を提供する工程；
（ｉｉ）必要に応じて、ｐＨを調整する工程；
（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィーをする工程；
（ｉｖ）任意に、工程（ｉｉｉ）で溶出された生成物を濃縮する工程；および
（ｖ）凍結乾燥する工程。

（工程（ｉ）−３ナトリウム塩の形成）
３ナトリウム塩は、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸と適切なナトリウム塩基の処理により形成される。いくつかの実施形態では、ナトリウム塩基は、ナトリウム塩基水溶液である。

工程（ｉ）は、それゆえ、ナトリウム塩基水溶液中に（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の溶液の提供を含む。

いくつかの実施形態では、３ナトリウム塩は、酸の溶解またはナトリウム塩基水溶液（例えば、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムの水溶液）中でのそれらの準化学量論的なナトリウム塩の溶解により形成される。

いくつかの実施形態では、３ナトリウム塩は、固体の（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸、またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩、好ましくは、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩の粗製固体の溶解により形成される。

いくつかの実施形態では、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸は、ナトリウム塩基水溶液中で溶液として調製されていてよく、そして、それゆえ、直接工程（ｉ）〜（ｖ）で使用されうる。

好ましくは、工程（ｉ）で使用される（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの溶液は、本発明の第１の態様および／または第２の態様に記載されている工程を含む方法により調製される。

例えば、固体の（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩は、上記のとおり、第２の態様のカップリング反応から沈殿されてよい。あるいは、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の水溶液は、上記のとおり、ナトリウム塩基水溶液との溶媒交換後、第２の態様のカップリング反応で得られてよい。

いくつかの実施形態では、工程（ｉ）で、ナトリウム塩基水溶液は、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の生成後、直接反応混合物に添加され、例えば、反応をクエンチする。当該溶液は、上記のとおり種々の方法で、洗浄されてよい。

いくつかの実施形態では、工程（ｉ）で、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩の粗製沈殿は、希薄な炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの撹拌されている低温の水溶液に添加され、好ましくはすべての固体が溶解するまで撹拌される。

（工程（ｉｉ）−ｐＨの調製）
いくつかの実施形態では、工程（ｉ）で製造された溶液のｐＨは、ｐＨ７．５〜９．０の範囲にあるように調整される。

いくつかの実施形態では、ｐＨは、ｐＨ８〜９に調整される。

いくつかの実施形態では、ｐＨは、水酸化ナトリウムの添加により調整される。

（工程（ｉｉｉ）−カラムクロマトグラフィー）
（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩の水溶液は、好適な樹脂クロマトグラフィーシステムで、カラムクロマトグラフィーにより精製される。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、樹脂カラムを含む。

いくつかの実施形態では、樹脂は、修飾されたポリスチレン樹脂である。

いくつかの実施形態では、樹脂は、例えばＳＰ２０７ＳＳおよびＨＰ２０ＳＳから選択される。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、水または１〜１０％の水混和性溶媒を含む水で溶出することを含む。

いくつかの実施形態では、水混和性溶媒は、ＴＨＦまたはアセトニトリルである。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、初め水で溶出し、次いで、必要であれば、水中で２％〜１０％未満の段階上の勾配のあるアセトニトリルにより溶出することを含む。

いくつかの実施形態では、名目どおりの約４０〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、３ナトリウム塩含む水溶液を、カラムに乗せる。

いくつかの実施形態では、工程（ｉ）または（ｉｉ）で製造された３ナトリウム塩を含む水溶液は、直接カラムに乗せられる。

いくつかの実施形態では、樹脂に３ナトリウム塩の名目の乗せる量は、１：４０〜１：１００ｗｔ：ｗｔの間である。

いくつかの実施形態では、樹脂に３ナトリウム塩の名目の乗せる量は、約１：５０〜約１：６０ｗｔ：ｗｔの間の量である。いくつかの実施形態では、乗せた後のカラムは水で溶出される。

いくつかの実施形態では、乗せた後のカラムは、２％のアセトニトリル水溶液で溶出する前に、１０回のカラム体積の水で溶出される。

いくつかの実施形態では、乗せた後のカラムは、水でのみ溶出される。

いくつかの実施形態では、十分な純度のすべての分画は、９９．０〜９９．７％の間の純度の最終生成物を製造するために混合される。

いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは、例えば、溶液がｐＨ７以下であることがわかったら、この段階で、調整されて上げられる。

いくつかの実施形態では、ｐＨの調整は、炭酸ナトリウムまたは水酸化ナトリウムの水溶液の添加により行われる。

いくつかの実施形態では、カラム分画および／または貯蔵されたカラム分画は、０〜１０℃の間の温度で貯蔵されている。

（工程（ｉｖ）−クロマトグラフィー生成物の濃縮）
いくつかの実施形態では、工程（ｉｖ）は、工程（ｉｉｉ）のロマトグラフィで溶出された生成物の濃縮を含む。

クロマトグラフィーの後、集めた分画は、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩の希薄水溶液を含む。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの後、集めた分画は、溶液を濃縮する技術を使用して濃縮され、材料の最小量のロスと最小量の分解を確認した。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーの後、集めた分画は、例えば、連続エバポレーション技術（例えば、ワイプドフィルムエバポレーション）を使用して；または、膜に基づいた濃縮プロセス（例えば、限外濾過、透析濾過、ナノ濾過、または逆浸透）を使用して；またはキャッチアンドリリース型の親和性カラム；またはカラム充填および除去を使用して濃縮される。

いくつかの実施形態では、この濃縮は、限外濾過装置であり、好ましくは、５ＰａｌｌＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ０．６５Ｋｄカットフィルター膜のような膜を使用して実施される。

いくつかの実施形態では、限外濾過装置の温度は、１０℃未満に維持される。

いくつかの実施形態では、貯蔵されたカラム分画は、凍結乾燥工程の前に３倍〜１５倍に濃縮される。

いくつかの実施形態では、貯蔵されたカラム分画は、凍結乾燥工程の前に８倍〜１２倍に濃縮される。

いくつかの実施形態では、限外濾過の後に濃縮された溶液は、限外濾過装置中、様々な体積の水で透析濾過された。つまり、溶液は、例えば、２倍〜３倍の倍数に水で再希釈され、次いで、水溶液中の溶媒または他の水溶液の低分子量不純物の量を減らすために、再濃縮して最初の量に戻される。この処理は、一回以上繰り返されてよい。この処理は、０〜１０℃の濃度で行われてよい。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥の前に、濃縮された溶液は、内毒素を除去するために濾過される。いくつかの実施形態では、この濾過は、分子量５０００カットフィルター（例えば、ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）２マキシカセット分子量５０００カットフィルター）を通して行われる。

（工程（ｖ）−凍結乾燥）
最後の工程で、（任意に濃縮された）溶液の凍結乾燥は、頑丈だが、潮解性がある凍結乾燥ケーキとして、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩を与える。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、棚状の凍結乾燥機を使用して実施される。

いくつかの実施形態では、約３〜５０ｍｇ／ｍＬの（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩を含む溶液は、凍結乾燥の工程に使用される。

いくつかの実施形態では、溶液は、−３０〜−６５℃の範囲に凍結され、そして、−１５〜−２５℃の温度の棚を有する２０〜２００ｍｔｏｒｒの真空に、１０〜３０時間さらされる。

いくつかの実施形態では、その後、棚の温度は、約−１５℃に上げられ、スケールに応じて、真空は、１〜１０日間、約２０〜８０ｍｔｏｒｒに調整された。いくつかの実施形態では、その後、棚の温度は、少なくとも１日の間−５℃に上昇される。いくつかの実施形態では、中間体の乾燥は、０℃の棚温度で実施される。

いくつかの実施形態では、最後の乾燥は、＋２０℃の棚温度で実施され、真空は、１０〜２５ｍｔｏｒｒに調整される。

いくつかの実施形態では、乾燥は、カールフィッシャー水分計が、プロセスが完了したことを示すまで継続される。

いくつかの実施形態では、最後の凍結乾燥工程は、１〜５ｗｔ％の水を含む安定な凍結乾燥のケーキを生成する。

いくつかの実施形態では、凍結乾燥のケーキは、１０重量％以下の水を含む。

（化合物）
（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸およびその３ナトリウム塩の合成に有用な以下の化合物および中間体が提供される；

（Ｒ）−ビス（トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタンアミド）グルタール酸；

（Ｒ）−２−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタンアミド）グルタール酸；

（Ｓ）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イル−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸；

（Ｒ）−ビス（トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−４−（４−（（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）−５−オキソ−５−（トリメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）グルタール酸；

（Ｓ）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イル４−（（２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸（２４）；

（Ｒ）−ビス（トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−４−（４−（（（Ｓ）−２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）−５−オキソ−５−（トリメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）グルタール酸（２５）。

（議論および実施例）
本発明者らは、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸（７Ｓ）およびＤ−Ｇｌｕ（１２）と比較的安価な保護されたＬ−Ｇｌｕ誘導体（例えば、Ｃｂｚ−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステル（１６））から２工程で製造された単純なジペプチドＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ（１５）から（２）の調製、単離、ならびに精製の費用効率が高いならびに効率的な合成方法論を提供する。

例えば、以下のスキーム４に示される化学は、本発明の好ましい実施形態を表し、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸（１５）の効率的かつ拡張可能な作製方法を提供し、化合物（１）および（２）のペプチド部分の費用を大きく減少させる。その後、それは、非経口薬物の形態に好適な形態で、ジペプチド（１５）と（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸（７Ｓ）を（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩（１２）に変換させる。

この後のカップリングおよび単離で記載される化学は、最適化されたとき実施する直接的であり、マルチキロスケールで行うことがとても困難または不可能である工程を避け、（２）の前もっての調製での収率でのかなりの増加（＞２倍）をもたらし、同時に、クロマトグラフィーならびに余分な単離および反応を行う必要性を排除する。また、全体の順序を、以前のプロセスより、より簡単に観測および制御し、同時にこれらお工程の全体の費用を大きく低下させる。

当該プロセスは、２つのペプチドのカップリングを含み、両方、Ｏ，Ｎ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）または他の適切なシリル化剤の使用、単離および精製の間のシリルエステルのインシチュでの脱保護、水素化分解の脱ベンジル化、および単純なクロマトグラフィー（例えば、修飾されたポリスチレン樹脂を用いて）、次いで凍結乾燥し、化合物（２）を貯蔵に安定な凍結乾燥ケーキとして種々の製剤形態での直接の使用に好適なものによって促進される、として与える。

Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステル（１６）のγ−カルボン酸は、たとえば、混合無水物（例えば、（１７））に変換することにより、好ましくはイソブチルクロロギ酸を使用して活性化される。分離したベッセルのＤ−グルタミン酸（１２）は、ＢＳＡまたは他の適切なシリル化剤を用いた拡張された処理により、シリルエステル（例えば、ビス−トリメチルシリルエステル（１８））（およびＮ−トリメチルシリル化も可能）に変換される。２つの溶液が混合され、反応が完了するとき、完全に保護されたジペプチド（１９）の中間体は、脱シリル化水溶液の後処理を受け、所望のジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ誘導体（２０）を与え、反応混合物から直接単離され、高純度に再結晶化され、都合よく貯蔵される。

化合物（２０）は、接触水素化により簡易に脱保護され、親ジペプチドのＬ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸（１５）になり、化合物（１５）は、所望に応じて貯蔵もされうる。カルボン酸を活性化して、好ましくは、その１−オキシベンゾトリアゾールエステル（２１）に変換することにより、Ｎ−シクロペンタキナゾリン−６−イルアミノ安息香酸（７Ｓ）を完了させ、その後これを（２２）（別のベッセルで作製され、単離されなくてもよいまたはインシチュで生成されてもよい（１５）のトリストリメチルシリルエステル）と反応させる。この反応が完了したとき、（おそらくは）トリス−シリル化中間体（２３）を単離することがなされる必要性を試みる必要性はなく、しかし、遊離酸、それらの準化学量論的なナトリウム塩のどちらかがいわば後処理され得、または３ナトリウム塩（２）が後処理で直接単離される。当該化合物の最後の精製は、水系媒体中、３ナトリウム塩（２）、および精製された塩（２）を、できる限り、最初の濃縮工程の後、例えば、逆浸盪を使用することにより、凍結乾燥して単離する。

本発明の方法の好ましい実施形態の限定を意図しない実施例は、以下でより詳細に議論される。

乾燥ＴＨＦ中、Ｄ−グルタミン酸の懸濁液は、室温で、窒素下で撹拌され、３．５当量のシリル化剤（例えば、ＢＳＡ）が５〜１５分間超滴下して加えられてよい。固体は、徐々に溶解し、ビス−トリメチルシリルエステル（１８）を形成し、できる限り、アミン窒素もシリル化する。撹拌は、室温で、２４〜２８時間続けられる。第２のベッセルで、乾燥ＴＨＦ中、（Ｄ−Ｇｌｕに基づき）０．９当量のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルは、固体のすべてが溶解し、その上で、得られた溶液が約−２５℃に冷却され、約１．２当量の第三級アミン塩基（例えば、Ｎ−メチルモルホリン）が添加され塩を形成する。

従って、この冷たい塩の溶液は、カップリング剤の−３０℃の溶液、好ましくはイソブチルクロロギ酸のＴＨＦ溶液も逆にゆっくり添加されてよく、窒素下で撹拌されてよい。逆添加は、この反応で形成されるＮ−ベンジルオキシカルボニルＬ−グルタモイル−α−ベンジルエステル無水物を減少させるかもしれない。理論に結び付けられることは望まないが、イソブチルクロロギ酸との酸（１６）の反応は、不斉無水物を大量に生成し、反応の量が増加するように増加するかもしれない。この不斉無水物は、次の工程で所望の化合物を形成するが、（１６）の分子は、不斉の無水アシルＤ−Ｇｌｕが結局未反応の出発物質となり、全反応の収率を低下させ、その条件（例えば、逆添加）は、好ましくは選択され、これを減少させる。

酸（１６）が完全に混合無水物（１７）に変換されたとき、Ｄ−Ｇｌｕ（１８）のビス−シリルエステルは、十分ゆっくり反応混合物に添加され、かなりの温度上昇を避ける。低温での任意の追加時間の後、反応混合物は、室温までゆっくり加温され、その後、数時間その温度で撹拌され、反応を完結させる。

ジシリルエステルジペプチド（１９）の溶液を、その後、水と酢酸エチルとの間で分配し、この水相を酸性化し、例えば、約ｐＨ２にする。存在するシリルエステルを完全に分解し、製造された（２０）は、遊離酸形態にあり、有機相に溶解しているであろう一方で、残存しているＤ−Ｇｌｕは、水相に分画されている。相を分離し、有機相を２、３回洗浄してよい。有機相は、主に所望の生成物（２０）および少量の未反応の原料のＮ−Ｃｂｚ−Ｌ−ＧｌｕＯ−ベンジルエステル（１６）を含んでいる。溶媒のほとんどを、その後除去し得、その残りの溶媒をアセトニトリルで共沸除去してよい。極性がより低い原料のエステル（１６）は、溶解性が高くないので、最終的なスラリーを、その後、アセトニトリルから再結晶してよい。再結晶されたジプロテクトジグルタミン酸（２０）を、この１つのシークエンスで、収率８０〜８５％かつ純度９９％で得ることができ、最も安価に購入できるＤ−グルタミン酸の原料、すなわちその酸そのものを使用して（１６）の極めて効率的なワンステップのグルタモイル化をすることができる。

Ｎ−ベンジルオキシカルボニルＯ−ベンジルエステル（２０）の２つの水素化分解をして、保護されていないＬ−グルタモイル−Ｙ−Ｄ−グルタミン酸（１６）を与えることは、直接的であり、高度に先例のある化学反応である。しかしながら、出発物質と生成物の間に大きく異なる物理特性があり、水不溶性の（２０）から２つの親油性のベンジル基がないことは、きわめて水溶性であるがほとんどの有機溶媒に良好な溶解性を有しない、高極性かつ酸性のジペプチド（１６）をもたらす。

水素化分解は、不均一系触媒を使用するので、基質は、反応媒体に理想的な溶解性を有し、反応を起こすのに好ましい。生成物が触媒上に沈殿すると、反応が停止するかもしれないので、好ましくは、生成物は、触媒上に沈殿しない。

さらに、生成物から触媒を分離する最も実用的な方法は、濾過であり、好ましくは、すべての生成物（１６）は、溶液中にある。この化合物は最終ＡＰＩにとても似ているので、高純度が確保される。不要なエステル化を抑制し、生成物を穏和な過熱により完全に溶解させるので、水性エタノールの使用は好ましく、触媒を濾過により除去することを可能とする。水素化のためエタノールへの水の好ましい割合は、出発物質のすべてを溶解させないが、十分な出発物質が、水素化が理想的な速度で進行するために溶液中にあることを可能とする。それらはは、反応混合物に生成物の十分な溶解を可能とし、触媒を不活性にする触媒上へ沈殿し、反応を停止しない。

さらに、選択された水性エタノール混合物は、エチルエステル副生成物の不要な形成を抑制する。

濾過後、混合物にエタノールのさらに添加および結晶化が起こることを可能とする溶液を再生するために加熱することは、ジペプチド（１６）を高純度かつ高収率で直接回収する。

さらに、暖め、前もって結晶化し、２％のチオシリカゲルを含む溶液を処理し、磨き濾過の前に残留するパラジウムを捕捉除去することは、許容可能な低いパラジウム量（＜５ｐｐｍ）を有するジペプチド（１６）を製造する。

沈殿後、ジペプチド（１６）は、かなりの量の水を含み、次の反応（以下参照）で有害であり得る。しかしながら、比較的温和な乾燥条件（４５℃、窒素を放出する真空オーブン）を使用してでも、低い水分含量（約８％未満）としようとすることは、質量分析で測定したとき、Ｍ−１８＋イオンが示され、脱水生成物の形成がもたらされてよい。存在する場合、これらの生成物は、次の反応でカップリングされてよく、その時、固有のＭ−１８＋イオンは、最終カップリング生成物で現れ、所望の生成物からの分離は困難であってよい。

それゆえ、乾燥は、好ましくは注意して実施され、高温を避け、９〜１４ｗｔ％の水の水分含量が、検出可能な量のこれらの脱水生成物を生成することなく、次の工程で任意の使用を可能とすることが見出された。

この反応シーケンスの最後の工程の第一の部分で、ＥＤＣＩ（１．１〜１．２５モル当量）のようなカップリング剤は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ．Ｈ_２０）（１．２５−１．５モル当量）のスラリーを含むＴＨＦまたはアセトニトリルのような溶媒中で、２０〜２５℃で反応器中撹拌されている、６（Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸（７Ｓ）（好ましくは、０．５〜５重量％の水を含む）の溶液に添加される。

１２〜１８時間の時間を越えて、ＨＰＬＣ分析は、酸（７Ｓ）のＨＯＢＴエステル（２１）への完全な変換が起こることを示す。驚くべきことに、この反応は、驚くべきことに、この反応は、いかなる外因性の塩基が添加されることおよび慣用的な第三級アミンの除去は必要とされてなく、またはこのプロセス由来の他の弱塩基は、最終生成物の純度をかなり増加させることが示されている。

この最後の反応シークエンスの第２の工程で、現在進行中ＨＰＬＣが酸（７Ｓ）のＨＯＢＴエステル（２１）への＞９９％の変換を示すと同時に、固体のＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ（１６）（１．５〜２．０モル当量）の一部は、スラリーの多い反応混合物に直接添加されてよい。ジペプチドは、アセトニトリルに完全に不溶性であり、多くの白いスラリーを形成し、ＨＰＬＣ分析は反応が起こらないことを示す。このスラリーは、その後、−５〜−１０℃に冷却され、Ｏ，Ｎ−ビストリメチルシリルアセトアミド（ＢＳＡ）（８〜１０モル当量）は、１０〜３０分超の時間をかけて（おそらく、量に依存して、より長くなる）、反応温度は、１０℃を超過しないことを保障する速度で、流しこまれる。穏和な発熱が見られ、ほとんどの固体は徐々に溶解する。ＨＰＬＣ分析は、ＨＯＢＴエステル（２１）の消失を示し、１つの大きな新しいピークが現れることを示す。

理論に結び付けられることは望まないが、反応種は、全体的にまたは部分的に、溶解性の低い（１６）のシリルエステル、またはトリス−エステル（２２）のＮ−シリル誘導体でさえありうるが、ＢＳＡは、トリストリメチルシリルエステル（２２）のようなジペプチド（１６）を溶解することが推測される。あるいは、トリス−シリルエステル（２２）は、アセトニトリル中、ＢＳＡ（８〜１０モル当量）とジペプチド（１６）の反応により、別の反応器で形成されてよい。すべての固体が溶液になったとき、（２２）の溶液は、（２１）の溶液に投入される。このプロセスは、第１の記載されたプロセスより多い溶媒および装置を使用する。

ＢＳＡの添加の完結後直ぐに、反応混合物は、１０℃またはわずかに低い温度で現在進行中のＨＰＬＣが、エステル（２１）の消滅により、反応が≧９９％完了していることを示すまで保持され、その時、添加後およそ３〜５時間、現在薄い懸濁液である反応混合物は、メカニカルスターラーおよび窒素注入口を備え固定された反応器へ濾過される。これは、透明な淡黄色の溶液であり、この時点で存在する主な種は、ビス−Ｏ−（トリメチルシリル（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−（トリメチルシロキシカルボニル）−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸（２３）、またはおそらくその２−トリメチルシロキシ相同体（２５）であると考えられている。化合物（２３）（（２５））は、この段階で、ポリトリメチルシリル種として単離されていない。

ジペプチド（１６）が結晶化して得られるとき、ジペプチド（１６）は、水分含量（＞１５ｗｔ％）を伴った高い水和固体として得られる。（１６）の水分含量が約１３％超である場合、反応がきれいに進み完結させるため、過剰のＢＳＡを添加するのが好ましい。他方、ジペプチド（３）を乾燥させ強すぎるようにする場合（上記参照）に増加する少量の未同定の脱水生成物は、ＨＯＢＴエステル（２１）とカップリングして、酸（１）に極めて類似し、最後のＡＰＩから除去するのが難しい不純物を生成しうる。それゆえ、予想に反して、この反応は、５〜１５ｗｔ％の水、好ましくは９〜１３ｗｔ％の水を含むジペプチド（１６）を伴って最良に進行し、少量の外因性の水が反応の初めに添加される場合、全反応を援助するかもしれないことが見出された。同様に、酸（７Ｓ）は、水性の沈殿を経て最後の反応工程から最も都合よく単離され、最初に＞１０ｗｔ％の水を含んで得られてよい。この水のほとんどは、真空下、６０℃で乾燥して除去され得、最後のカップリング工程は、水分含量が（２１）の形成をゆっくりにする上であるけれども、最大５ｗｔ％の水を含む（７Ｓ）を、大きな効果はなく許容することがわかった。予想に反した方法で、最後のカップリング反応は、両方の前駆体化合物が最適な量の水を含む場合、実際に洗浄性生物を与え、酸（７Ｓ）が３％ｗｔ／ｗｔ未満の水を有する場合、少量の水を最初の活性化工程に添加するのに都合がよいかもしれないことが見出された。

前に述べられたように、本発明のこの例となるプロセスで反応混合物中に存在する主な種は、少量の低級トリメチルシリルエステルも存在するけども、ビス−Ｏ−（トリメチルシリル（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−（トリメチルシロキシカルボニル）−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸（２３）またはより高いシリル化体（２５）であると推測される。これらのエステルは、比較的少量の水、含水ギ酸，または飽和炭酸水素ナトリウム溶液の添加により、今加水分解されてよい。

シリルエステルは、水の添加後、自然に加水分解し、溶液からゆっくり沈殿する。実際には、加水分解／沈殿は速く、添加された水溶液のｐＨが中性に近くなければより満足した固体を与えることが見出され、２Ｍギ酸と飽和炭酸水素ナトリウム溶液の両方は、飽和炭酸水素ナトリウム溶液が好ましいけれど、使用される。この沈殿は、２５〜１００ｍｏｌ％炭酸水素ナトリウムが添加されて満足のいく働きをするので、沈殿される主な種は、遊離塩基（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸（１），または部分的にモノ−ナトリウム塩のいずれかであるとわかる。溶液は、数時間０〜５℃で撹拌しながら沈殿され、次いで、混合物は、冷却して濾過され、固体は、窒素雰囲気下で、フィルター上に減圧濾過により集められ、アセトニトリルで洗浄される。

うまく行えば、この沈殿は、ほとんどのＨＯＢＴおよび過剰に存在するＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ（１６）をＢＳＡ（アセトアミド、Ｎ−トリメチルシリルアセトアミドおよびヘキサメチルジシロキサン）から副生成物のほとんどを取り除くと同時に上手く取り除き、吸湿性の固体ではあるが、自由流動性を与える。この精製工程は、次の樹脂クロマトグラフィーの精製をよりよく働かせもするかもしれない。最後のＡＰＩのアセトアミドの含有量は、弱発がん性のせいで密接に一般化されており、この沈殿の組み合わせは、最後のＡＰＩ中のアセトアミドのより低い量を可能とするので、その工程でのほとんどのアセトアミドの除去も有益である。

粗製固体の三酸（またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩）は、直ちに冷たい希薄な炭酸水素ナトリウム溶液に溶解し、最後のＡＰＩ、３ナトリウム塩（２）のおよそ２５ｍｇ／ｍＬの溶液を与える。ｐＨは、必要であれば、ｐＨ８〜９の範囲、好ましくはｐＨ８．５〜９．０に水酸化ナトリウムで調製されてよく、その溶液は、プレウォッシュ加工され、かつ（例えば、メタノール、その後水で）平衡とされたクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＰ２０ＳＳ樹脂クロマトグラフィーカラム）に、約５０ｇの樹脂／最終生成物１ｇの名目上の割合で乗せられる。カラムは、その後、大量の水、もし要請があれば、続いて１〜５％のアセトニトリルの水勾配で溶出される。分画は、ＨＰＬＣにより観測され、より純粋な分画は集められ、所望の純度（通常９９．０〜９９．７面積％）の（２）の希薄な溶液（２〜３ｇ／Ｌ）を与える。

少量で、この物質は直接凍結乾燥され、最終のＡＰＩ（２）を全収率４５〜６５％かつ純度＞９９％で与えられてよい。凍結乾燥で、より濃縮された溶液の使用は、より短くかつより経済的な凍結乾燥を可能とし、精製された凍結乾燥ケーキは、連続して操作し、貯蔵するより良好な物理特性を有するかもしれない。従って、大量で、最後の凍結乾燥の前の濃縮工程におかれるのは、有用であるかもしれない。

連続エバポレーション技術（例えば、ワイプドフィルムエバポレーション）の使用により、ＡＰＩを含む溶液は、装置を通過することにあたり、数秒間、穏和な加熱（〜４５℃）にさらされるだけで、ＡＰＩの損失またはＡＰＩの純度の損失はなく、通過して少なくとも３倍に溶液が濃縮されることを示した。

あるいは、ＡＰＩ溶液は、ＡＰＩ溶液がＨＰ２０ＳＳに結合するよりしっかりと結合する樹脂に乗せられ濃縮され、次いで適切な溶媒の使用によりはるかに濃縮された形態で除去されうる。例えば、ＡＰＩ（１）の低濃度の溶液は、ＨＰ２０ＳＳクロマトグラフィーによって得られ、適切な分画の貯蔵は、それが吸着するＳＰ２０７ＳＳ樹脂カラムに乗せられうる。２５％アセトニトリルの水ですばやくカラムをすることは、得られる濃度で少なくとも１０倍の増加を伴ってＡＰＩをカラムを流す。

あるいは、ＡＰＩ溶液は、限外濾過の使用により濃縮されうる。カラムの溶離液を、少なくとも４倍、できる限り１６倍の程度に＜１０℃に冷却した５ＰａｌｌＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ０．６５Ｋｄカットフィルター膜を備えた限外濾過装置を使用して、濃縮することは有利であることはわかった。水の様々な量で（例えば、およそ当量）、限外濾過装置中の残余分のダイアフィルトレーション（透析濾過）は、アセトニトリルおよびアセトアミドのようなより小さい分子量の不純物を減らす点で有利であることが示された。

トリストリメチルシリルエステル（２３）を所望のＡＰＩ（２）へ加水分解する代替の方法は、ＴＨＦまたはアセトニトリル反応溶液を炭酸ナトリウム水溶液に単に入れてクエンチすることであり、好ましくは最後の混合物のｐＨは７超であることを好ましくは保障する。この溶液は、原則として、直接樹脂カラム（例えば、ＨＰ２０ＳＳ）に直接乗せられ、精製される。ＡＰＩおよび不純物を追跡しながら物質損失を減少するため、クロマトグラフィーの前に酢酸エチルで数回水溶液を前洗浄するのが好ましくてよい。ＨＰＬＣの研究は、クロマトグラフィーの前に、ＨＯＢＴの半分超、およびかなりの量のアセトアミドならびにＴＨＦまたはアセトニトリルを除去することを示すが、ＯＮＸ−０８０１は、評価しうる量で酢酸エチルに分配しない。このような水溶液によるクエンチ、および酢酸エチルを用いた洗浄は、沈殿させる代替となり、このプロトコルは、沈殿よりかなり多くの耐性がある。これらの（２）の基本的な水溶液に希釈および濃縮の限外濾過サイクルを繰り返することは、全体のクロマトグラフィーによる精製でさらに改善をもたらすクロマトグラフィーの前に低分子量不純物も除去するだろう。しかし、全体のよりよい結果は、適切に実行されたとき、沈殿で得られるかも知れない。

（２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸（２０））
２５０ｍＬのフラスコ（マグネチックスターラー、滴下ロートおよびＮ_２注入口）に、Ｄ−グルタミン酸（１０．９ｇ、７４．１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（１１０ｍＬ）を充填した。Ν，Ο−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（５３．１ｇ、２６１ｍｍｏｌ）を５分超、撹拌を開始し、滴下ロートを使用して滴下した。このスラリーを２８時間常温で撹拌した。

Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステル（２５．０ｇ、６７．３ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（８０ｍＬ）を、第２の２５０ｍＬのフラスコ（マグネチックスターラー、熱電対、充電ポートおよびＮ_２注入口）に充填し、撹拌して均一な溶液を得た。当該溶液を−２５±５℃に冷却し、Ｎ−メチルモルホリン（８．２８ｇ、８１．８ｍｍｏｌ）をシリンジにより添加し、当該溶液を約３０分間、その温度で撹拌した。１Ｌの主反応フラスコ（メカニカルスターラー、熱電対、充電ポートおよびＮ_２注入口）に、ＴＨＦ（１７０ｍＬ）を充填し、−３０±５℃に冷却した。この時点で、イソブチルクロロギ酸（１０．０ｇ、７３．２ｍｍｏｌ）にＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルＮ−メチルモルホリン塩を充填し、−３０±５℃に反応混合物の温度を保持しながら、約２．０ｍＬ／ｍｉｎの速度で、ピストンポンプおよびテフロン（登録商標）チューブを使用して、主反応フラスコに移送した。４５分後に移し終えた。当該反応混合物（混合無水物／不斉無水物の割合が９５．５／０．２８）を、約４０分間、−３０±５℃で撹拌し、次いで、ペルシリル化したＤ−グルタミン酸エステル溶液を、移送中、−３０±５℃の温度に維持しながら、３５分間超、ポンプを使用して混合無水物溶液に移送した。当該反応混合物を、１時間、この温度で撹拌し、その後、ゆっくり常温に加温し、一晩撹拌した。

当該反応を、注意して、水（７５ｍＬ）を添加してクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、その後、３７％ＨＣＬ（１．６ｇ）でｐＨ１〜２まで酸性にした。有機相を水（２×５０ｍＬ）、２０％ブライン（２×５０ｍＬ）で洗浄し、有機相を１１２ｍの体積まで、真空中で減らした。生成物の溶液を、ＭｅＣＮ（２８５ｍＬ）で希釈し、反応フラスコに移送し、溶液を大気圧で蒸留し、３１０ｍＬの留出分を集めた。残渣を０．２％「含水」ＭｅＣＮ（４５６ｍＬ）で希釈し、加熱して還流させて均一な溶液を得た。当該溶液をゆっくり、常温に冷却し、得られた密度の高いスラリーを一晩撹拌した。固体を濾過して集め、ケーキをＭｅＣＮ（４５ｍＬ）で洗浄し、濾液を真空下で除いた。その後、ケーキを、窒素気流下、一定の重量に乾燥した。収量：２９．２ｇ（８６．８％）純度：９９．１Ａ％．Ｃ，Ｈ，Ｎ分析：理論：Ｃ，５９．９９％；Ｈ，５．６４％；Ｎ，５．６０％．実測：Ｃ，５９．９６％；Ｈ，５．４８％；Ｎ，５．５１％

（Ｌ−グルタモイル−γ−Ｄ−グルタミン酸（１６））
水素化容器に、２Ｓ−（Ｎ−（Ｒ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸（１．９０ｋｇ、３．７９６ｍｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ（１０％、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）タイプＥ１０１−Ｎｅｗ、１００ｇ）、ＥｔＯＨ（１５Ｌ）、および水（１３．３Ｌ）を充填した。結果として得られる混合物を、窒素下で、３回、真空脱気し、常温で４時間Ｈ_２（４０ｐｓｉ）下で撹拌し、次いで、ＬＣ−ＭＳとＨＰＬＣで測定した。

未反応の出発物質または部分的に脱保護された中間体を観測されなかった。その後、水素雰囲気を除去し、当該混合物に、３回、窒素ガスで４０ｐｓｉに加圧し、次いで、圧力を放出した。反応混合物を６０℃に加熱し、０．２ミクロンのフィルターで濾過し、さらに６０℃でのＥｔＯＨ（１０．５１ｋｇ）で洗浄した。混合した濾液をすべての固体が溶解するまで、６０℃で撹拌し、２％のチオシリカ（４０ｇ）を添加し、さらに９時間その温度で撹拌し続けた。反応混合物を０．２ミクロンのフィルターで熱濾過し、さらに熱ＥｔＯＨ（３．８ｋｇ）で洗浄した。混合した濾液を、１２時間超で２２℃に冷却し、次いで、さらに１２時間超で２℃に冷却し、その後、固体をＧＦ濾紙を通して濾過して集め、冷エタノール（３℃、７．５ｋｇ）で洗浄し、２０時間、微量の窒素パージの下４５℃の真空オーブン中、乾燥して、Ｌ−グルタモイル−γ−Ｄ−グルタミン酸（１６）（９００ｇ、８５．７％）を９９．１Ａ％の純度で白色固体として得た。カールフィッシャー水分計は、１０．９ｗｔ／ｗｔ％の水を示し、Ｐｄ分析は、１ｐｐｍ未満のＰｄを示した。^１ＨＮＭＲ（Ｄ_２０）δ：１．９６−２．０２（１Ｈ，ｍ），２．１２−２．２３（３Ｈ，ｍ），２．４８（４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），３．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），４．３６，（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．８，５Ｈｚ）．

（（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸（１））
アセトニトリル（１．５Ｌ）を、メカニカルスターラー、窒素注入口およびＪ−ＫＥＭ温度計を備えた５Ｌの三つ口フラスコに加え、２０±２℃で撹拌した。（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸（７Ｓ）（５０．０ｇ、０．１２８４ｍｏｌ）およびＵＳＰ−ＰＷ水（１２．０ｇ）を添加し、当該混合物を３０分間撹拌した。Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２６．２ｇ、０．１７１１ｍｏｌ）を添加し、温度が〜１℃低下した。混合物を２０℃で２時間激しく撹拌し、次いで、Ｎ−（３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩（２７．３０ｇ０．１４１９ｍｏｌ）を、スラリーに加え、反応を、２０±２℃で、１５時間撹拌し、密度の高いスラリーを形成した。この時点で、一定分量を、反応から取り、ＨＰＬＣによって分析した。当該ＨＰＬＣにより、中間体のヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（２１）の形成が完了していることが明らかとなった。Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸（５３．２０ｇ、０．１９２６ｍｏｌ）を添加して、反応混合物を撹拌し、当該反応混合物を２℃に冷却し、その温度で１時間維持し、次いで、当該反応混合物を、さらに−６℃冷却した。その後、Ｏ，Ｎ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）（４５０ｍＬ、３７４．４ｇ、１．８４ｍｏｌ）を滴下ロートにより１５分超、添加した。添加の間の発熱は、ＢＳＡの添加速度により制御され、反応温度は添加中に７℃上がった。当該添加直後、反応混合物を、氷浴中、１０分間撹拌し、次いで、徐々に１０℃加温した。当該添加の完結後、反応の完結後、２時間と３．５時間に一定分量を、当該反応から取り、ＨＰＬＣで分析した。３．５時間のサンプルのＨＰＬＣは反応が完了していることを明らかにした。３．５時間後、１０℃懸濁液を濾過して、メカニカルスターラーおよび窒素注入口を備えた１２Ｌフラスコに入れた。当該濾過残査をさらにアセトニトリル（２００ｍＬ）で洗浄し、フラスコの内容物をさらにアセトニトリル（３．５Ｌ）で希釈した。溶液を２℃で撹拌し、次いで、４６ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液（〜１．２Ｍ）で作製された新たな溶液を１５分間超滴下し、淡黄褐色の沈殿物を形成した。窒素雰囲気で、当該沈殿物を２〜３℃で２時間形成し、次いで、当該混合物をブフナー濾過し、アセトニトリル（１Ｌ）で洗浄し、３０分間、吸引して乾燥した。固体の環が、反応フラスコに残り、これは取り出され、３０分間アセトニトリル（５００ｍＬ）を用いてスラリー化された。この固体を既に述べたとおり、窒素下でブフナー濾過により集め、アセトニトリル（１００ｍＬ）で洗浄し、主サンプルを乾燥した。２つの取得物を１５時間、室温、高真空下で乾燥し、１０４．１ｇおよび１０．５ｇのベージュ色の自由流動性固体をそれぞれ得た。ＨＰＬＣ分析は、両方の取得物が実質的に同じ物質であることを示し、それらを混合し、粗製（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸または準化学量論的なそのナトリウム塩の１１４．６ｇ（＞１００％、ＨＰＬＣ分析で、不要の（２Ｒ，４Ｒ）ジアステレオ異性体を含んでいた）を得た。

（（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩（２））
ガラスクロマトグラフィーカラムに、メタノール（１５Ｌ）にスラリーであるＨＰ−２０ＳＳ樹脂（５ｋｇ）を充填し、水（全体で４０Ｌ）で洗浄することにより平衡にした。
撹拌機およびＪ−ＫＥＭ温度計を備えた１２Ｌの３つ口フラスコに、新たに調製された飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１．１Ｌ）と水（１．１Ｌ）を入れ、２℃に冷却した。
粗製（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩（１１４．６ｇ）を添加し、わずか１℃の発熱が測定され、そして１０分以内に固体を溶解した。１時間後、ｐＨをチェックし、水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ，４４０ｍＬ）をこの溶液にゆっくり添加し、２℃発熱し、溶液のｐＨを約７．４５に上げた。さらに、水酸化ナトリウム溶液（〜１０ｍＬ）を加え、ｐＨを８．０超９．０未満に上げた。この溶液を樹脂カラムに充填し、水（８９Ｌ）で溶離し、同じ大きさではないが、２０分画を集めた。
９９Ａ％超の純度にある所望の物質を含むことをＨＰＬＣ分析が示す分画（７〜１８）を混合し、１０℃未満に保持して、５ＰａｌｌＣｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ０．６５Ｋｄカットフィルター膜を使用して限外濾過装置中、−５６Ｌ〜約１２Ｌに濃縮した。残余分を水で２回希釈し（１０、２０Ｌ）、それぞれ、〜１２Ｌに再濃縮した。これは、その後、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２ｍａｘｉカセットｗ／５０００ＭＷカットフィルターを通して濾過し、内毒素を除去し、棚状の凍結乾燥機に置いた。得られた生成物を−５９℃に冷凍し、その後、４０ｍｔｏｒｒの圧力で−２０℃の棚温度で凍結乾燥した。２０時間後、棚温度を４０時間かけて−１５℃まで上げ、次いで２７時間かけて−５℃に上げた。最後の乾燥は、２０℃の棚温度かつ１０ｍｔｏｒｒ未満に落とされている圧力で数日をかけてなされ、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩（２）をふわふわした白色の凍結乾燥物として生成した。（８．９％のＫＦ水分析で補正して、４４．６ｇ、収率４４．３５％）。分析データ．ＦＴＩＲ ν：３２８３，１５９８，１５０３，１３９７，１０８８，８３０，７６６ｃｍ^−１． ^１ＨＮＭＲ（９：１Ｄ_２０：ＣＤ_３ＯＤ）δ：１．６３−１．７１（１Ｈ，ｍ），１．８２−２．１６（２Ｈ，ｍ）２．２２−２．４１（４Ｈ，ｍ），２．４２−２．４６（４Ｈ，ｍ），２．７２−２．８４（１Ｈ，ｍ），２．８７−２．９８（１Ｈ，ｍ），３．５６，３．７０（１Ｈ，１Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１８．６Ｈｚ），３．９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，８．４Ｈｚ），４．２７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０，７．８Ｈｚ），４．４４（２Ｈ，ｓ），５．２３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．２３（１Ｈ，ｓ），７．５３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｓ）．^１３ＣＮＭＲ（９：１Ｄ_２０：ＣＤ_３ＯＤ）δ：２９．４９，２９．８３，３０．３４，３１．２６．３３．９８，３５．３６，３６．９５，５６．７１，５６．７７，６２．０２，６４．９２，７４．０５，８２．６０，１１４．４１，１１９．９９，１２２．２８，１２２．８３，１２３．００，１３０．０１，１４２．６４，１４８．１９，１５２．０７，１５３．７７，１５７．９７，１６５．３４，１７０．２７，１７６．４８，１７９．８４，１８０．２０，１８３．２０．化学純度（ＨＰＬＣ）９９．８Ａ％．ジアステレオマー過剰率（ＨＰＬＣ）９９．７５Ａ％．ＣＨＮ：Ｃ，４５．４１；Ｈ，５．０１；Ｎ，８．２３，Ｎａ９．８５％．

Claims

ａ）Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体のγ−カルボン酸を活性化する工程；
ｂ）Ｄ−グルタミン酸をシリル化する工程；および
ｃ）工程ａ）で製造された活性化カルボン酸誘導体と工程ｂ）のシリル化生成物とを反応させて、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を与える工程；
を含む、Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチドの合成方法。
工程ａ）で、活性化が、前記Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体の活性化誘導体、例えば、混合無水物への変更を含む、請求項１に記載の方法。
活性化が、Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体とアルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基との処理を含む、請求項２に記載の方法。
クロロギ酸がイソブチルクロロギ酸である、請求項３に記載の方法。
前記Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体が、アルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基の低温溶液にゆっくり添加される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
アルキルクロロギ酸および第三級アミン塩基の溶液が−１０℃〜−５０℃の温度、好ましくは約−３０℃である、請求項５に記載の方法。
第三級アミン塩基がＮ−メチルモルホリンである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体が、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
工程ｂ）において、シリル化がＤ−グルタミン酸とシリル化剤との処理を含む、請求項１〜８に記載の方法。
前記シリル化剤が、Ｏ，Ｎ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）である、請求項９に記載の方法。
工程ｂ）において、Ｄ−グルタミン酸がシリル化剤の数等量と溶解され、工程ｃ）において、当該溶液が工程ａ）由来のカルボン酸誘導体の冷溶液に添加され、保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種のシリルエステル化された溶液を形成する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｎ−αＯ−ジプロテクト−Ｌ−Ｇｌｕ誘導体がＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸−α−ベンジルエステルであり、生成物が２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸のシリルエステル化された溶液である、請求項１１に記載の方法。
反応後、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸のシリルエステル化された溶液が脱シリル化の水処理を受け、２Ｒ−（Ｎ−（Ｓ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）−４−ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１−オキソブチル）アミノ）グルタール酸を良収率および良純度で製造する、請求項１２に記載の方法。
脱シリル化処理が、水と有機溶媒との溶液の分離を含む、請求項１３に記載の方法。
ｄ）前記保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を脱保護する工程；
をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
脱保護が、ベンジルおよび／またはベンジルオキシカルボニル保護基の除去を含み、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸を生成する、請求項１５に記載の方法。
脱保護が水素化分解を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
水素化分解が、適切な遷移金属触媒を用いた、水溶性エタノール中での水素化分解を含む、請求項１７に記載の方法。
触媒がパラジウム炭素触媒を含む、請求項１８に記載の方法。
脱保護後、＜１０ｐｐｍのパラジウムを含む生成物を得るために、生成物がチオシリカゲルで処理される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
シリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種と（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸とをカップリングする工程を含む、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物の合成方法。
カップリングが、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸のカルボン酸部分の活性化とシリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種を用いた処理を含む、請求項２１に記載の方法。
活性化が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物とカップリング剤との処理による、（６Ｓ）−４，Ｎ−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸の活性化ＨＯＢＴエステルへの変換を含むシ絵急行２２に記載の方法。．
前記カップリング剤がジイミドである、請求項２３に記載の方法。
前記シリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種が、Ｌ−グルタミル−γ−Ｄ−グルタミン酸ジペプチドのシリル化により製造される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
前記シリル保護されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕ種が、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法で製造されたＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチドから調製される、請求項２５に記載の方法。
シリル化がシリル化剤を用いた処理を含む、請求項２６に記載の方法。
前記シリル化剤がＯ，Ｎ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）である、請求項２７に記載の方法。
カップリング反応がアセトニトリル中で実施される、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の方法
シリル化剤の存在下での任意の操作が、−１０℃〜＋１０℃の範囲の温度で実施される、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
塩基水溶液（好ましくは、飽和炭酸水素ナトリウム）または酸水溶液（好ましくは、ギ酸）の注意深く限定された量の添加による濾過、希釈、および沈殿を含む精製プロセスをさらに含む、請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
以下の工程を含む（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の３ナトリウム塩（ＯＮＸ−０８０１）の調製方法：
（ｉ）ナトリウム塩基水溶液中、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらの準化学量論的なナトリウム塩基性の溶液の提供工程；
（ｉｉ）必要に応じて、ｐＨの調整工程；
（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィーをする工程；
（ｉｖ）任意に、工程（ｉｉｉ）で溶出された生成物の濃縮工程；および
（ｖ）凍結乾燥工程。
工程（ｉ）で使用される（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸またはそれらのナトリウム準化学量論的な塩が、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法により調製される、請求項３２に記載の方法。
工程（ｉ）で、前記ナトリウム塩基水溶液が炭酸水素ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの溶液である、請求項３２または３３に記載の方法。
工程（ｉｉ）で、前記ｐＨがｐＨ７．５−９．０の範囲に調整される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｉｉｉ）で、クロマトグラフィーが、改善されたポリスチレン樹脂カラム上、水または１〜１０％の水混和性溶媒を含む水で溶出するカラムクロマトグラフィーによる精製を含む、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｉｖ）で、連続エバポレーション技術（例えば、ワイプされた膜エバポレーション）；膜ベース濃度プロセス（例えば、限外濾過）；またはカラム充填および除去を用いて、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸３ナトリウム塩の希薄水溶液を含む、回収されたクロマトグラフィーの分画の濃縮を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
カラム溶離後０℃〜１０℃で限外濾過を用いて４倍〜１６倍に濃縮することを含む、請求項３７に記載の方法。
水溶液の低分子量不純物の量を少なくするため、０℃〜１０℃での限外濾過装置中、残余分の透析濾過をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
工程（ｖ）で生成された凍結乾燥ケーキが水を１０質量％以下含む、請求項３２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
（Ｒ）−ビス（Ｏ−トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタンアミド）グルタール酸；
（Ｒ）−２−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタンアミド）グルタール酸；
（Ｓ）−Ｏ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イル−４−（（２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸；
（Ｒ）−ビス（Ｏ−トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−４−（４−（（（Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）−５−オキソ−５−（トリメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）グルタール酸；
（Ｓ）−Ｏ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−１−イル−４−（（２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）安息香酸；
（Ｒ）−ビス（Ｏ−トリメチルシリル）２−（（Ｓ）−４−（４−（（（Ｓ）−２−（トリメチルシロキシメチル）−４−オキソ−４，６，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）−５−オキソ−５−（トリメチルシリルオキシ）ペンタンアミド）グルタール酸；
から選択される、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸およびその３ナトリウム塩の合成で有用な化合物。
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によるＬ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチドの合成；
請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の方法による、前記Ｌ−Ｇｌｕ−γ−Ｄ−Ｇｌｕジペプチドから、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の合成；および
請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の方法による、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸から（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の３ナトリウム塩（ＯＮＸ−０８０１）の調製および精製
を含む、（２，Ｒ）−（（４，Ｓ）−カルボキシ−４−（４，Ｎ−（（（６Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−４−オキソ−３，４，７，８−テトラヒドロ−３Ｈ−シクロペンタ［ｇ］キナゾリン−６−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イニル）アミノ）ベンズアミド）ブタンアミド）グルタール酸の３ナトリウム塩（ＯＮＸ−０８０１）（２）の調製方法。