CN103748106A - 有效的肽偶联及其在环戊二烯并[g]喹唑啉三钠盐的合成和分离中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种合成L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的新方法及其在合成(2R)-((4S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1中的用途。还提供了一种有效的分离和纯化上述酸的三钠盐2的方法，该三钠盐2呈适合长期储存和用于肠胃外剂型的形式。

Description

有效的肽偶联及其在环戊二烯并[G]喹唑啉三钠盐的合成和分离中的用途
技术领域
本发明涉及(R)-2-((S)-4-氨基-4-羧基丁酰胺基)戊二酸(L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸，L-Glu-γ-D-Glu)的合成，及其在合成中的用途，尤其是在合成(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)-戊二酸中的用途，以及上述酸的三钠盐的分离和纯化。
背景技术
为更充分地描述和公开本发明以及其所属的技术领域，此处引用了多篇专利和公开。这些参考文献中的每一篇均在此整体引入作为本文内容的参考，如同每一篇单独的引文均具体地、单独地指出引入作为参考。
在整个本说明书中，包括其后的权利要求，除非上下文另有所指，“包含”及其变型“包括”和“含有”，应当理解为意味着包括所述的整数或步骤或者整数组或步骤组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数组或步骤组。
必须指出，如本说明书和所附权利要求使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文明确的另有指定。因此，例如，提及“一种药用载体”包括两种或多种该载体的混合物，等。
此处范围经常表示为从“约”某一具体值，和/或至“约”另一具体值。当范围如此表达时，另一实施方案包括从一个具体值和/或至另一具体值。类似地，数值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解为该具体值形成另一实施方案。
当方法或过程在本文表示为步骤的列表或顺序(包括数字编号、字母编号，或项目符号编号的步骤的列表)时，列表中步骤呈现的顺序并不意味着该方法中这些步骤有任何特殊的顺序或时限，除非特殊顺序是要求的或明确说明的。因此，除非另有规定，每种公开方法的步骤可以任何合理的顺序进行，如本领域技术人员所明确的，即任何适合达到该方法所陈述的目的和产物的顺序。而且，除非明确的说明，本方法中不排除存在附加的步骤。
该新的胸苷酸合成酶抑制剂(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1，作为其三钠盐2(也称为CB300945、BCG945或ONX-0801)是胸苷酸合成酶很有效的抑制剂，对该酶的IC50为3nM。
不像大多数胸苷酸合成酶抑制剂如甲氨蝶(呤和培美曲塞)，2的活化或细胞滞留不需要聚谷氨酰化(polyglutamoylation)，而且它并不是聚谷氨酰化合成酶的底物。
此外，2不是普遍表达的Ki>250μM的还原性叶酸载体蛋白(reduced folatecarrier protein，RFCP)的底物，并且不能轻易地穿过正常的细胞膜。然而，它以很高的亚纳摩尔级亲和力(Ki0.5nM)与叶酸受体α(FRα)结合，并且可通过该受体以适当的速率转运至细胞中，即使2的血清水平非常低。
一旦进入细胞，2抑制胸苷酸合成酶并且随着其慢慢地降解和从细胞中排出，它对胸苷酸合成酶产生长效的抑制作用。这造成DNA加工错误，而启动了修复周期，而由于缺乏三磷酸胸苷掺入到DNA中，该修复最终是无效的。这导致了凋亡DNA损伤反应和细胞死亡。
这是胸苷酸合成酶抑制剂通常的作用方式，临床经验表明胸苷酸合成酶抑制剂对人类肿瘤有强烈的细胞毒作用，但是由于相当广谱的毒性，其使用受到了限制；靶组织，特别是骨髓，受到该药物细胞毒性的严重影响。
目前这代胸苷酸合成酶抑制剂是普遍表达的RFCP的良好底物，可很好的分布到大多数组织，而2仅仅有效地分布到表达或优选过表达FRα的组织中。相对地很少有组织内源性表达FRα，即使在适中水平。大多数组织在细胞远极面以极化方式表达FRα，意味着细胞面向循环内皮一面没有运载体。这样的结果是，即使在这些组织中，2的穿透也往往是非常无效的。这意味着血浆中高循环水平的2导致相当低的全身毒性。
如果对于肿瘤同样如此，也可以预期其产生低抗肿瘤疗效。然而，有些种类的肿瘤组织倾向于过表达FRα。作为肿瘤细胞，它们已经失去极性并在近极面和远极面均表达FRα。因此，这些肿瘤组织有着异常的倾向，能够在细胞中聚集非常大量的、细胞毒性的2的剂量，而血浆药物水平足够低，只有非常小的毒性作用。这导致在过表达肿瘤类型中，2的治疗指数提高。
有些肿瘤类型过表达FRα，最显著的是卵巢癌，其中90%最常见的肿瘤类型，粘液型卵巢癌，过表达FRα。因此，2是一种非常有吸引力的化疗药物，用于治疗FRα过表达的癌症，特别是卵巢癌，然而并不限于那一种肿瘤类型，其中子宫癌、间皮瘤和肾癌均有高百分比的FRα过表达。
化合物1和2，以及若干相似同源物，在WO2003/020748中被公开，尽管是作为在6位的非对映异构体1:1的混合物。
Figure BDA00003631669600031
反应方案1.作为一对6-非对映异构体的化合物1的原始合成
WO2003/020748也显示了如何合成化合物1，再一次作为6-位的非对映异构体的混合物。
如反应方案1所示，在室温使用氰基磷酸二乙酯(diethylphosphononitrile)和三乙胺的DMF溶液，将环戊二烯并喹唑啉基氨基苯甲酸3与L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸三-O-叔丁酯4缩合，生成N-{N-{4-[N-((6RS)-2-(2,2-二甲基丙酰氧基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基]苯甲酰基}-L-γ-谷氨酰基}-D-谷氨酸三-O-叔丁酯5，收率为62%，在低毫克级。经TFA室温处理1h后，脱除三叔丁酯，在室温或更低的温度除去溶剂，并进行甲醇:水1:1的溶剂交换。用氢氧化钠溶液将pH升高到12，新戊酰酯在室温水解。该溶液随后用1M的盐酸酸化到pH为4，并在0℃沉淀以生成酸1(6RS混合物)，过滤和干燥后收率为47%。
Figure BDA00003631669600041
反应方案2.从羟酸7合成酸1的N-甲基类似物
在美国专利7,250,511中，公开了化合物1同样的合成方法，但公开了化合物6更有用的变体，如反应方案2所示。化合物6仅仅是化合物1在D-Glu胺上的N-甲基化产物。在本例中，去新戊酰化的核心酸(core acid)7与二肽三酯4的N-甲基化类似物8偶联，在所述的3和4偶联的同样条件下，生成被保护的化合物9，收率为40%。经TFA在室温处理1h后，脱除三叔丁酯，在室温或更低的温度除去溶剂，并将残渣溶于水中，用稀氢氧化钠溶液碱化pH到10，最终的酸用1M盐酸沉淀，如前进行过滤干燥以生成酸6(6RS混合物)，收率77%。
拆分通式(I)的化合物的方法在WO94/11354中被公开，以得到更有活性而更想得到的(6S)-对映异构体。该方法包括取得式(I)的外消旋酸并将其与手性氨基酸(优选L-谷氨酸或(S)-2-氨基己二酸)缩合，以形成式(II)的酰胺，为非对映异构体的1:1混合物。
Figure BDA00003631669600042
使用一种合适的蛋白酶(如羧肽酶G2)，选择性水解6R-非对映异构体，以直接将6S-(II)与6R-(I)分离。然后6S-(II)被酶促水解成6S-(I)(大于98%对映体过量)。假定该过程在酸3，或可能地酸7上进行，因为美国专利7,528,141公开了化合物1的纯6S非对映异构体的生物学数据，但却没有公开如何制备的此异构体。
L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸三-O-叔丁酯4，可以以其N-苄氧羰基保护的稳定前体10从市场上买到，它可以在使用前通过催化氢化方便地游离胺4。然而，尽管二肽4的两种原材料，N-Cbz-L-Glu11和D-Glu12并不十分昂贵，但二个叔丁酯(从11一步制备生成的收率仅为33%的N-Cbz-Glu-α-O-t-Bu13和D-谷氨酸二-O-叔丁酯14)的费用昂贵，导致如反应方案3中产生的化合物10十分昂贵。
Figure BDA00003631669600051
反应方案3.L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸三-O-叔丁酯4最短的合成路线
尽管有更高收率制备13的方法，但那些方法都是多步骤的，并未减少化合物的成本。所以二肽10十分昂贵，即使在大的规模。因此改进10的合成方法，或在偶联反应中使用(R)-2-((S)-4-氨基-4-羧基丁酰胺基)戊二酸二肽(此处称为L-Glu-γ-D-Glu或L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸)较便宜的形式，会对化合物1的生产成本产生非常有益的影响。
如上文所示，将化合物1的二肽单元加成到杂环核(即分子3和7)的现有工艺包括偶联步骤和终产物分离前的一或两步脱保护步骤。该化学方法，除其高昂的成本外，还有若干缺陷，这使得其非常不适合商业化生产药物。
该报告的化学方法在非常小规模上进行，且并未详细分析产物1的纯度。化合物1的检查在酸性条件下，使用先前并未描述的适合于化合物1的分析技术，结果表明化合物1在pH低于5的水溶液中稳定性有限。还发现化合物1的简单的单三氟乙酸盐无论在固态还是三氟乙酸(TFA)溶液中，稳定性都有限。
因为除去5或其2-去新戊酰化等价物的叔丁酯，需要强酸条件，这极大的限制了实际脱保护所要求的装置。三氟乙酸可从反应混合液中除去。然而，由于1在TFA溶液中的稳定性问题，随着规模的增大，除去三氟乙酸必须在低温并且相对迅速地进行。没有非常专业的仪器，就不能轻易地扩大规模到任何大的程度。有建议称当在0.5至1kg规模生产API(活性药用成分)时，该化学方法会变得完全不切实际。
而且，由于该化合物经肠胃外使用，不溶性的游离酸1不能作为药物产品，上述参考的专利申请并未教导钠盐2的有效的制备方法和足够的纯化方法，即该钠盐2是最终药物产品的形式。由于2有效的抗癌活性，较好的合成2的方法具有极大的价值和应用性。
发明概述
本发明提供了合成L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸二肽的新方法，及其在合成(2R)-((4S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1中的用途。有利地，本发明的方法可允许从容易得到且便宜的前体合成L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸二肽，优选未保护的L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸二肽。本发明还提供了上述酸的三钠盐2的分离和纯化的有效方法，该三钠盐2的形式适合长期储存和用于肠胃外剂型。
Figure BDA00003631669600061
一方面，本发明提供了L-Glu-γ-D-Glu的合成方法，其包括以下步骤：
a)活化N-αO-双保护的L-Glu衍生物的γ-羧酸；
b)甲硅烷基化D-谷氨酸；和
c)将步骤a)产生的活化羧酸衍生物与步骤b)的甲硅烷基化产物反应，以生成被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质。
在一些实施方案中，该方法还包括：
d)脱保护该被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质。
第二个方面，本发明提供了合成(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)-戊二酸或者其可药用盐或溶剂合物的方法，其包括将被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质与(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸偶联的步骤。
优选地，该被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是根据本发明第一方面的方法制备的L-Glu-γ-D-Glu物质或由该物质制得。
再一方面，本发明提供了制备和纯化(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐(ONX-0801)的方法，包括以下步骤：
(i)将(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸，或其亚化学计量的钠盐溶解在钠碱的水溶液中。
(ii)如有必要，调节pH；
(iii)柱色谱分离；
(iv)任选地，浓缩步骤(iii)洗脱的产物；和
(v)冻干。
优选地，步骤(i)中使用的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸，通过包括本发明第一和/或第二方面描述的步骤的方法制得。
另一方面，本发明提供了对(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸及其三钠盐合成有用的化合物和中间产物，如：
(R)-二(三甲基甲硅烷基)2-((S)-5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸酯；
(R)-2-((S)-5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸；
(S)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基4-((2-(羟基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；
(R)-二(三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5-氧代-5-(三甲基甲硅烷基氧基)戊酰胺基)戊二酸酯；
(S)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基4-((2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；
(R)-二(三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5-氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯。
L-Glu-γ-D-Glu的合成
本发明提供了合成L-Glu-γ-D-Glu的方法，其包括以下步骤：
a)活化N-αO-双保护的L-Glu衍生物的γ-羧酸；
b)甲硅烷基化D-谷氨酸；和
c)将步骤a)产生的活化羧酸衍生物与步骤b)的甲硅烷基化产物反应，以生成完全保护的L-Glu-γ-D-Glu物质。
步骤a)：活化N-αO-双保护的L-Glu衍生物
步骤a)包括活化N-αO-双保护的L-Glu衍生物的γ-羧酸。
在一些实施方案中，N-αO-双保护的L-Glu衍生物是下面通式的双保护衍生物：
其中PC是羧酸保护基和PN是胺保护基。
合适的羧基保护基是本领域所熟知的，例如那些在“Protective Groups inOrganic Synthesis”3rd Edn.TW.Greene and PGM Wuts Wiley New York,1999.Pp387-431描述的，此处整体引入作为参考。
在一些实施方案中，L-谷氨酸衍生物的α-羧酸保护基(PC)选自：苄酯或任选取代的苄酯；烯丙酯；叔丁酯；或2-三甲基甲硅烷基乙酯。
合适的胺保护基也是本领域所熟知的，例如那些在“Protective Groups inOrganic Synthesis”3rd Edn.TW.Greene and PGM Wuts Wiley New York,1999.Pp503-572中描述的，此处整体引入作为参考。
在一些实施方案中，L-谷氨酸衍生物的胺保护基(PN)选自：氨基甲酸酯；苄基氨基甲酸酯或任选取代的苄基氨基甲酸酯，包括但不限于4-甲氧苄基氨基甲酸酯；烯丙基氨基甲酸酯；叔丁基氨基甲酸酯；9-芴基甲基氨基甲酸酯；或2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯。
在一些优选实施方案中，L-谷氨酸的胺和α-羧酸均被基团(PN，PC)保护，这些基团可以同样的化学步骤除去。
例如，使用在苄酯上有相同或不同的任选的取代基的(任选取代的)苄基氨基甲酸酯，允许通过氢解将两个基团都除去。使用具有烯丙酯的烯丙基氨基甲酸酯允许用催化钯和甲酸盐将两个基团都除去。使用具有叔丁酯的叔丁基氨基甲酸酯允许在酸性条件下将两个基团除去。
在优选实施方案中，N-αO-双保护的L-Glu衍生物是N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯或另一种合适的N-αO-双保护的L-Glu衍生物。
在一些实施方案中，N-αO-双保护的L-Glu衍生物是N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯。
在一些实施方案中，活化包括将所述N-αO-双保护的L-Glu衍生物的γ-羧酸转变成活化的衍生物。
在一些实施方案中，活化包括将N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯的γ-羧酸转变成活化的衍生物。
各种活化羧酸衍生物和制备它们的方法是本领域所熟知的。实例包括酰基氯、酰基氟、酸酐，对称的和非对称的，O-酰基脲、硫酯、活化酯(如对-硝基苯酯和1,O-氧基苯并三唑酯)，活化酰胺(如N-酰基咪唑)、混合酸酐(如O-酰基膦酸酯和O-酰基磺酸酯)及酰基叠氮化物。很多这样那样的活化羧酸，如“Peptide Synthesis；A Practical Handbook”M.Bodanszky Springer-Verlag1993所举例说明的，适合用于肽合成反应。
在一些实施方案中，该活化的衍生物是酸酐。
在一些实施方案中，该酸酐是混合酸酐。
在一些实施方案中，活化包括将N-αO-双保护的L-Glu衍生物转变成活化的衍生物，如酸酐。例如，下式中的酸酐：
其中，R1是C1-4烷基以及PC和PN如先前所定义。
在一些实施方案中，活化包括将N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯转变成活化的衍生物，例如下式中的酸酐：
Figure BDA00003631669600102
其中，R1是C1-4烷基。
在一些实施方案中，R1是异丁基。
在一些实施方案中，活化包括用烷基氯甲酸酯(例如R1OC(=O)Cl)处理N-αO-双保护的L-Glu衍生物，优选N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯。
在一些实施方案中，活化包括用烷基氯甲酸酯和叔胺碱处理N-αO-双保护的L-Glu衍生物，优选N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯。
在一些实施方案中，氯甲酸酯是氯甲酸异丁酯。
在一些实施方案中，叔胺碱是N-甲基吗啉(NMM)。
在一些实施方案中，活化包括将N-αO-双保护的L-Glu衍生物(优选N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯，作为三烷基铵盐)的溶液，在低温反向加入到烷基氯甲酸酯溶液中。
在一些实施方案中，缓慢加入N-αO-双保护的L-Glu衍生物至烷基氯甲酸酯和叔胺碱的低温溶液中。
在一些实施方案中，该低温溶液的温度为约-10℃至-50℃，优选温度为约-30℃。
在一些实施方案中，加入温度的范围是-25至-40℃.
在一些实施方案中，N-αO-双保护的L-Glu衍生物(例如N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯)与叔胺碱和氯甲酸酯的比例是约1:1.2:1.1。
在一些实施方案中，该反应在THF溶剂中进行。
步骤b)：D-谷氨酸的甲硅烷基化
步骤b)包括甲硅烷基化D-谷氨酸。
在一些实施方案中，甲硅烷基化包括用甲硅烷基化剂处理D-谷氨酸。
在一些实施方案中，甲硅烷基化包括用甲硅烷基化剂处理D-谷氨酸以生成如下式的甲硅烷基化的D-Glu物质：
Figure BDA00003631669600111
其中每个RSi和RSi’独立地为甲硅烷基保护基，如下面所定义，且可能是相同的或不同的。
在一些实施方案中，所有的RSi和RSi’基团是相同的甲硅烷基保护基。
各种甲硅烷基保护基和适合引入的甲硅烷基化剂是本领域所熟知的(见，例如“Protective Groups in Organic Synthesis”3rd Edn.TW.Greene and PGMWuts Wiley New York,1999)。
在一些实施方案中，RSi和RSi’各自独立地选自三甲基甲硅烷基(-SiMe3)、三乙基甲硅烷基(-SiEt3)、叔丁基二甲基甲硅烷基(-SitBuMe2)、苯基二甲基甲硅烷基(-SiPhMe2)、叔丁基二苯基甲硅烷基(-SitBuPh2)或三异丙基甲硅烷基(-SiiPr3)。
在一些实施方案中，RSi是三甲基甲硅烷基(-SiMe3)。
在一些实施方案中，RSi’是三甲基甲硅烷基(-SiMe3)。
在一些实施方案中，RSi和RSi’均是三甲基甲硅烷基(-SiMe3)。
在一些实施方案中，甲硅烷基化剂是O,N-二-(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
在一些实施方案中，甲硅烷基化剂的用量相对于D-谷氨酸至少是3摩尔当量。
在一些实施方案中，选择甲硅烷基以形成在水解和醇解条件下比三甲基甲硅烷基酯更高度稳定的甲硅烷基酯。例如如果为了分离充分保护的物质和/或希望带着甲硅烷基化物质至任何后续步骤，叔丁基二甲基甲硅烷基酯、苯基二甲基甲硅烷基酯、叔丁基二苯基甲硅烷基酯或三异丙基甲硅烷基酯可能是优选的。
步骤c)：步骤a)和b)产物的反应
步骤c)包括将步骤a)产生的活化羧酸衍生物与步骤b)的甲硅烷基化产物反应，以生成被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质.
在一些实施方案中，该被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是完全被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质。
在一些实施方案中，被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是下式的化合物：
Figure BDA00003631669600121
其中RSi是甲硅烷基保护基。
在一些实施方案中，将步骤b)得到的甲硅烷基化的D-Glu物质的溶液加入到步骤a)得到的活化羧酸衍生物的冷溶液中。
在一些实施方案中，甲硅烷基化的D-Glu物质的溶液直接从步骤b)的反应混合物中加入。
在一些实施方案中，在步骤b)中，D-谷氨酸被若干当量的甲硅烷基化试剂溶解；然后在步骤c)中，将该溶液加入到步骤a)得到的羧酸衍生物的冷溶液中，以形成2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化的溶液。
在一些实施方案中，溶剂是THF。
在一些实施方案中，相较于N-αO-双保护的L-Glu衍生物的用量，在步骤b)中，D-谷氨酸的用量为约1.1当量，而在步骤c)中，甲硅烷基化试剂的用量为约3.5当量。
在一些实施方案中，该方法包括偶联步骤后的后处理。
在一些实施方案中，该后处理不分解甲硅烷基酯。
在一些实施方案中，该后处理包括去甲硅烷基化水溶液后处理。
在一些实施方案中，反应后，甲硅烷基酯化的溶液包含2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧基羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸二甲硅烷基酯，优选O.O-二(三甲基甲硅烷基)酯，将该溶液经去甲硅烷基化水溶液后处理，以很好的收率和纯度产生2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸。
因此，在一些实施方案中，由步骤c)得到的被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是如下式的化合物：
在一些实施方案中，去甲硅烷基后处理包括水-有机分配，即在水和有机溶剂间分配溶液。
在一些实施方案中，该有机溶剂是乙酸乙酯。
在一些实施方案中，去甲硅烷基后处理包括加入酸。
在一些实施方案中，加入酸调节溶液的pH到约pH2。
在一些实施方案中，水-有机分配后，加入酸以酸化水性部分。
在一些实施方案中，该酸为盐酸。
在一些实施方案中，该后处理包括溶剂交换。
在一些实施方案中，溶剂交换包括以一种新溶剂替代初始溶剂的溶剂交换。
在一些实施方案中，溶剂交换包括除去第一种溶剂，例如通过蒸发和/或共沸。
在一些实施方案中，初始溶剂是乙酸乙酯。
在一些实施方案中，新溶剂是乙腈。
在一些实施方案中，所得被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质从新溶剂中重结晶，以很好的收率和纯度生成2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸。
步骤d)：L-Glu-γ-D-Glu物质的脱保护
在一些实施方案中，该方法包括进一步的步骤：
d)脱保护所述被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质。
在一些实施方案中，脱保护包括完全脱保护，即除去被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质的所有保护基。
在一些实施方案中，脱保护包括部分脱保护，即只除去被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质的一些保护基。
例如，脱保护可能包括除去L-Glu部分上的保护基，而保持D-Glu部分上的任何甲硅烷基保护基完整，如果存在的话。
在一些实施方案中，脱保护包括除去(任选取代的)苄基和/或苄氧基羰基保护基，以产生L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸或其二甲硅烷基酯。
在一些实施方案中，脱保护包括除去叔丁基和/或叔丁氧羰基保护基，以产生L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸。
在一些实施方案中，脱保护包括除去2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸的苄基和苄氧基羰基保护基，以产生L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸。
在一些实施方案中，脱保护包括除去烯丙基和/或烯丙氧羰基保护基以产生L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸或其二甲硅烷基酯。
在一些实施方案中，脱保护包括去甲硅烷基化。
在一些实施方案中，脱保护包括除去2-三甲基甲硅烷基乙基和/或2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基保护基，以产生L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸。
脱保护步骤选择的条件取决于要除去的保护基。除去各种胺和羧酸的保护基的条件是本领域已知的(见“Protective Groups in Organic Synthesis”3rdEdn.TW Greene and PGM Wuts Wiley New York,1999，如上)。如果有超过一种类型的保护基待除去，可能有超过一步脱保护步骤。
在一些实施方案中，脱保护包括在酸性条件下除去保护基，如溶解在TFA(三氟乙酸)中。
在一些实施方案中，脱保护包括在氟离子条件下除去保护基，如经TBAF(四丁基氟化铵)或吡啶.HF复合物处理。
在一些实施方案中，脱保护包括氢解。
在一些实施方案中，脱保护包括用甲酸盐和合适的过渡金属催化剂氢解。
在一些实施方案中，脱保护包括在乙醇的水溶液中用合适的过渡金属催化剂氢解。
在一些实施方案中，该过渡金属催化剂包括钯碳催化剂。
在一些实施方案中，氢解包括在15-50psi使用氢气。
在一些实施方案中，氢解是在室温进行的。
在一些实施方案中，氢解是在室温进行的，而后加热到60℃。在一些实施方案中，加热到60℃后进行热过滤。
在一些实施方案中，脱保护包括在乙醇的水溶液中用合适的过渡金属催化剂氢解，并且2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸:乙醇:水的初始比例是约1g:10mL:2mL。
在一些实施方案中，2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸:乙醇:水的初始比例是约1g:7.9g:7g。
在一些实施方案中，氢解后进行后处理以使得化合物以很好的收率作为晶状固体被分离。
在一些实施方案中，后处理包括初始过滤以除去Pd/C。
在一些实施方案中，初始过滤后，每克原料用约10mL乙醇和约1mL水冲洗残余物。
在一些实施方案中，后处理包括加热。
在一些实施方案中，后处理包括过滤。
在一些实施方案中，后处理包括用硫代二氧化硅(thiosilica)处理，优选在60℃，而后重过滤。
在一些实施方案中，后处理包括允许物质在冷却时结晶。
在一些实施方案中，后处理包括过滤，且每克原料约用5-6克乙醇冲洗初始过滤的残余物。
在一些实施方案中，后处理包括过滤，且用硫代二氧化硅(优选基于原料约2%重量)处理初始滤液和冲洗物，优选持续4小时，优选在60℃。在一些实施方案中，该混合物然后趁热再过滤。滤出残余物优选地进一步用乙醇(例如，约2g/g原料)冲洗。过滤的溶液然后优选地慢慢冷却到室温，然后冷却到5-10℃。
在一些实施方案中，该产物以含有约5-15%重量水的结晶固体分离。
在一些实施方案中，该产物含有低于约10ppm的钯。
(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环 戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-丁酰胺基)戊二酸 的合成
本发明提供了(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或者其可药用盐或溶剂合物的合成方法，该方法包括将被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质与(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸偶联的步骤。
在一些实施方案中，偶联包括活化(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的羧酸部分，然后用被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质处理。
在一些实施方案中，活化包括将(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸转变成活化羧酸衍生物，优选活化的酯衍生物。
各种活化羧酸衍生物及其制备方法是本领域已知的，如上文之前所讨论。
在一些实施方案中，活化包括将(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸转化成活化的HOBT酯，例如用1-羟基苯并三唑水合物(HOBT)和偶联试剂的处理。
在一些实施方案中，该偶联剂是二酰亚胺(diimide)偶联剂。
在一些实施方案中，该偶联剂是EDCI(N-(3-(N,N-二甲基氨基)丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐)
在一些实施方案中，转化是在THF中进行的。
在一些实施方案中，转化是在乙腈(ACN)中进行的。
在一些实施方案中，转化是在温度从约0℃至约25℃进行的。
在一些实施方案中，活化羧酸衍生物是O-(1,N-苯并三唑基)(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯。
在一些实施方案中，转化包括(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸、羟基苯并三唑水合物和N-(3-(N,N-二甲基氨基)丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐的反应，其摩尔比范围为1.0:1.1-1.3:1.1-1.5。
在一些实施方案中，该环戊二烯并[g]喹唑啉基酸的加入量范围是约20至约40g/L。
在一些实施方案中，HPLC系统用来监测偶联反应中活化羧酸衍生物的过程中形成。
在一些实施方案中，被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是甲硅烷基保护的L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸。
在一些实施方案中，被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是下式化合物：
Figure BDA00003631669600171
其中每个RSi和RSi’是甲硅烷基保护基，如前所定义，且可能是相同的或不同的。
在一些实施方案中，所有的RSi基团和RSi’基团是相同的甲硅烷基保护基。
在一些实施方案中，该甲硅烷基保护基是三甲基甲硅烷基(-SiMe3)。
在其它实施方案中，RSi和RSi’是不同的甲硅烷基保护基。
在一些实施方案中，每个RSi选自叔丁基二甲基甲硅烷基、苯基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三异丙基甲硅烷基，且每个RSi’是三甲基甲硅烷基。
甲硅烷基保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是优选由L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的甲硅烷基化产生的。
在一个可选的实施方案中，甲硅烷基保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸二甲硅烷基酯进一步甲硅烷基化产生的。
在一些实施方案中，L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸或其二甲硅烷基酯，是根据上文讨论的本发明的方法制备的。
在一些实施方案中，甲硅烷基化包括用甲硅烷基化剂处理。
在一些实施方案中，甲硅烷基化试剂是O,N-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺。
在一些实施方案中，甲硅烷基保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是通过L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸或其二甲硅烷基酯的甲硅烷基化和溶解而原位生成的，且活化羧酸衍生物被直接加入到生成的溶液中。
在一些实施方案中，甲硅烷基化剂可能用来将未保护的二肽L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸引入溶液，从而允许反应发生。它还可作为普遍的温和干燥剂以抑制水解副反应。
在一些实施方案中，反应混合物中存在的甲硅烷基化剂可能会额外地将活化羧酸衍生物上的伯醇甲硅烷基化(即(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的活化酯的2-羟基甲基可能被甲硅烷基化，以产生2-甲硅烷氧基甲基，优选2-三甲基甲硅烷氧基)，尽管这并不影响后续的偶联反应。
因而，反应混合物可能包含甲硅烷基化的活化酯，例如(S)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基4-((2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯。因此偶联反应的产物可能包含完全甲硅烷基化的偶联产物，例如(R)-二(O-三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5-氧代-5-(三甲基甲硅烷基氧基)戊酰胺基)戊二酸酯。
在一些实施方案中，固体L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸被直接加入到活化羧酸衍生物预形成的溶液中，然后加入甲硅烷基化剂。
在一些实施方案中，含有L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸浆液的反应混合物，在加入甲硅烷基化剂前被冷却到约-5至-10℃。优选地，在加入过程中和加入后的一段时间，反应混合物的温度不允许升高到高于10℃。
在一些实施方案中，甲硅烷基化剂是逐渐被加入的。优选地，任何在加入时观察到的放热均应谨慎的控制。
在一些实施方案中，甲硅烷基化剂用量为约7-10摩尔当量。
在一些实施方案中，该过程的溶剂是乙腈。
在一些实施方案中，在甲硅烷基化剂加入后，固体L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸被直接加入到活化羧酸衍生物预形成的溶液中。
在一些实施方案中，在加入到活化羧酸衍生物预形成的溶液中前，甲硅烷基化剂和L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸是在单独的反应器中一起反应的。
在一些实施方案中，甲硅烷基化剂和L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的反应是在20-25℃在THF中进行2-24小时。
在一些实施方案中，偶联反应是由过程中HPLC监测的。
优选地，一旦中间体O-苯并三唑-1-基(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯消耗≥99%，便开始后处理。
在一些实施方案中，(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸和L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的摩尔比范围是1:1.2-1.5。
在一些实施方案中，(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的含水量范围是0-4%重量。
在一些实施方案中，L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的含水量范围是5-15%重量。
在一些实施方案中，L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的含水量范围是9-12%重量。
在一些实施方案中，将活化羧酸衍生物预形成的溶液加入原位生成的L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸多甲硅烷基化酯中。
活化羧酸衍生物和甲硅烷基保护的L-Glu-γ-D-Glu物质偶联生成甲硅烷基化的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸。
在一些实施方案中，(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的粗溶液使用物理的、基于相的方法，如沉淀或液-液提取技术，进行初次提纯。
在一些实施方案中，(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的初次纯化包括交换反应溶剂，优选地通过减压除去反应混合物并用替代溶剂重溶。
在一些实施方案中，反应溶剂是THF。
在一些实施方案中，替代溶剂是钠碱的水溶液，如碳酸氢钠、碳酸钠或氢氧化钠。
在一些实施方案中，由此产生的含水弱碱性(pH7-10)溶液使用低水混溶性的溶剂多次冲洗以除去很多有机杂质。在一些实施方案中，该冲洗溶剂是乙酸乙酯。
在一些实施方案中，由此产生的含水弱碱溶液(pH7-10)首先用低水混溶性的有机溶剂(如乙酸乙酯)冲洗，然后通过超滤进一步提纯。
在一些实施方案中，所述冲洗和/或超滤之后通过氮气或其它惰性气体鼓泡，或减压下有限蒸发，以减少存在的有机溶剂的量。
在一些实施方案中，从上述过程获得的提纯的水溶液可能用来将产物上样到色谱柱上，例如下文描述的第三个方面。
在一些实施方案中，酸化从上述过程生成的水溶液，以沉淀(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸，收集并干燥该产物。甲酸水溶液可能是该沉淀过程优选的酸，因为它有很低的倾向在沉淀中被带走。然后该产物可能被再溶解到钠碱的稀水溶液中并被色谱法处理，例如下文所述的第三方面。
在一些实施方案中，替代溶剂是乙腈。
在一些实施方案中，该反应溶剂是乙腈，在此情况下不要求溶剂交换。
在一些实施方案中，(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的初次纯化包括在乙腈中过滤该反应混合物。
在一些实施方案中，纯化包括进一步冷却该滤液至0至5℃，优选地用乙腈将其进一步稀释。
在一些实施方案中，乙腈与(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的最终比例是80-120L/kg。
在一些实施方案中，(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的纯化包括沉淀。
在一些实施方案中，沉淀包括加入测量的小量水相。该水相可能只是水，或者它可能有更高的pH，例如钠碱的水溶液(如饱和碳酸氢钠溶液)，或者它可能有更低的pH(例如2M甲酸溶液)。优选地，缓慢加入这些水相至搅拌的冷反应液中。优选地，加入后在该温度搅拌若干小时。在一些实施方案中，接着进行真空过滤，优选地，在反应液仍然冷时在氮气下进行。
在一些实施方案中，粗制的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐，是作为自由流动的固体被分离的。在一些实施方案中，水、甲酸水溶液或钠碱水溶液的用量范围是约0.8-1.0g/g偶联反应中使用的(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸。
例如，去甲硅烷基化和分离极度纯化形式的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的方法可能包括：过滤反应混合物，用乙腈进一步稀释以产生溶液，其中约1L乙腈/10g初始的酸((6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸)，然后慢慢将有限量的水、甲酸水溶液(优选2M)，或碳酸氢钠水溶液(优选饱和的，约每L乙腈10ml)，加入到冷冻的、搅拌的反应溶液中，然后在氮气环境下收集生成的沉淀，并在室温真空烘箱中干燥。
在一些实施方案中，反应混合物在整个过程中，从BSA的加入到固体沉淀的收集，或反应混合物的水性淬灭，都保持在低于10℃。
ONX-0801三钠盐的制备
本发明还提供了制备和纯化(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三钠盐(ONX-0801)的方法，其包括以下步骤：
(i)提供(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐在水性钠碱中的溶液；
(ii)如有必要，调节pH；
(iii)柱色谱分离；
(iv)任选地，浓缩步骤(iii)洗脱的产物；和
(v)冻干。
步骤(i)：三钠盐的形成
三钠盐是用合适的钠碱处理(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸形成的。在一些实施方案中，该钠碱是水性钠碱。
因而，步骤(i)包括提供(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸在水性钠碱中的溶液。
在一些实施方案中，三钠盐是通过将酸或其亚化学计量的钠盐溶解在水性钠碱(例如碳酸钠或碳酸氢钠水溶液)中形成的。
在一些实施方案中，三钠盐是通过溶解固体(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐形成的，优选粗制固体(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐。
在一些实施方案中，(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸可能已作为在水性钠碱中的溶液被制备，因此可直接在步骤(i)至(v)中使用。
优选地，步骤(i)中使用的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其溶液，是通过包括本发明第一和/或第二方面所描述的步骤的方法制备的。
例如，固体(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐，可能是从上述第二方面的偶联反应中沉淀得来的。或者，(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的水溶液可能是在与水性钠碱溶液发生溶剂交换后，从第二方面的偶联反应中获得的，如上所述。
在一些实施方案中，在步骤(i)中，在产生(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸后，水性钠碱溶液被直接加入到反应混合物中，例如用于淬灭反应。该溶液可以如上所述的多种方式冲洗。
在一些实施方案中，在步骤(i)中，粗沉淀的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐，被加入到碳酸氢钠或碳酸钠的搅拌的冷稀水溶液中，并且优选地搅拌至所有的固体溶解。
步骤(ii)：调节pH
在一些实施方案中，步骤(i)产生的溶液的pH被调节到pH7.5-9.0范围。
在一些实施方案中，pH被调节到pH8-9。
在一些实施方案中，pH是通过加入氢氧化钠调节的。
步骤(iii)：柱色谱法
(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐的水溶液是通过合适的树脂色谱系统的柱色谱提纯的。
在一些实施方案中，该色谱系统包含树脂柱。
在一些实施方案中，该树脂是改良的聚苯乙烯树脂。
在一些实施方案中，该树脂选自例如SP207SS和HP20SS。
在一些实施方案中，该色谱法包括用水，或含1-10%的水混溶性溶剂的水洗脱。
在一些实施方案中，该水混溶性溶剂是THF或乙腈。
在一些实施方案中，该色谱法包括用水初始洗脱，而后如果需要，用逐步梯度的从2%至不超过10%的乙腈水溶液洗脱。
在一些实施方案中，含有标定浓度为约40-50mg/mL的三钠盐的水溶液被上样入柱。
在一些实施方案中，该含有在步骤(i)或(ii)中产生的三钠盐的水溶液被直接上样入柱。
在一些实施方案中，三钠盐在树脂上的标称负载为1:40至1:100重量：重量。
在一些实施方案中，三钠盐在树脂上的标称负载为约1:50至约1:60重量:重量。
在一些实施方案中，上样后的柱子用水洗脱。
在一些实施方案中，上样后的柱子在用2%的乙腈水溶液洗脱前，至少用10倍柱体积的水洗脱。
在一些实施方案中，上样后的柱子仅用水洗脱。
在一些实施方案中，所有具有足够纯度的级分组合生成最终的产物，纯度为99.0至99.7%。
在一些实施方案中，在此阶段，溶液的pH被调高，例如如果发现其pH低于pH7。
在一些实施方案中，pH的调节是通过加入碳酸钠或氢氧化钠的水溶液进行的。
在一些实施方案中，柱级分和/或汇集的柱级分保存在0至10℃。
步骤(iv)：浓缩色谱法产物
在一些实施方案中，步骤(iv)包括浓缩从步骤(iii)色谱法洗脱得到的产物。
色谱法后，收集的部分包含(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐的稀水溶液。`
在一些实施方案中，色谱法后，收集的级分通过既浓缩溶液又确保物质最少丢失和最少降解的技术浓缩。
在一些实施方案中，色谱法后，浓缩收集的级分，例如通过连续的蒸发技术，如刮膜式蒸发器(wiped film evaporator)；或通过基于膜的浓缩过程，如超滤、透滤、纳米过滤，或反向渗透；或抓取-释放型亲和层析柱；或柱填充和洗脱。
在一些实施方案中，该浓缩是在超滤仪器中进行的，优选地使用膜，如5Pall Centrasette0.65Kd截止滤膜。
在一些实施方案中，超滤仪器的温度保持在低于10℃。
在一些实施方案中，汇集的柱级分在冻干步骤前被浓缩三倍至十五倍。
在一些实施方案中，汇集的柱级分在冻干步骤前被浓缩八倍至十二倍。
在一些实施方案中，该超滤后的浓缩溶液在超滤仪器中用不同体积的水透滤。也就是，溶液用水再次稀释，例如稀释两倍至三倍，然后重新浓缩回初始体积，以减少水溶液中溶剂或其它水溶性低分子量杂质的量。该处理可能重复多于1次。该处理可能在0至10℃温度进行。
在一些实施方案中，冻干前，过滤该浓缩溶液以除去内毒素。在一些实施方案中，该过滤通过5000MW截止滤器进行的，例如Pellicon2maxi cassette5000MW截止滤膜。
步骤(v)：冻干
在最后一步中，将(任选浓缩的)溶液冻干以生成结实的但易潮解的冻干饼状物形式的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐。
在一些实施方案中，冻干是使用搁板冻干器进行的。
在一些实施方案中，含有约3-50mg/mL的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐溶液用于冻干步骤。
在一些实施方案中，该溶液被冷冻到-30至-65℃范围，暴露于20-200毫托的真空下10-30小时，搁板温度为-15至-25℃。
在一些实施方案中，然后搁板被允许升到约-15℃，而取决于量级，真空被调节到约20-80毫托1-10天。
在一些实施方案中，搁板被升高到-5℃至少一天。
在一些实施方案中，中间体干燥是在搁板温度为0℃进行的。
在一些实施方案中，最终干燥是在搁板温度为+20℃进行的，且真空调节到10-25毫托。
在一些实施方案中，干燥继续进行直至卡尔费歇尔水分测定法显示该过程已完成。
在一些实施方案中，最终的冻干步骤产生了稳定的冻干饼状物，含有1-5wt%的水分。
在一些实施方案中，该冻干饼状物包含不超过10%重量的水分。
化合物
提供了下列化合物和中间体，其对(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸及其三钠盐的合成是有用的：
Figure BDA00003631669600251
(R)-二(三甲基甲硅烷基)2-((S)-5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸酯；
Figure BDA00003631669600252
(R)-2-((S)-5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸；
Figure BDA00003631669600261
(S)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；
Figure BDA00003631669600262
(R)-二(三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5-氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯；
Figure BDA00003631669600263
(S)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基4-((2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯24；
(R)-二(三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5-氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯25。
讨论与实施例
本发明者已提供了具有成本效益及有效的合成方法，用于从(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸7(S)和简单的二肽L-Glu-γ-D-Glu15制备、分离和提纯2，其中简单的二肽L-Glu-γ-D-Glu15由D-Glu12和相对便宜的被保护的L-Glu衍生物(如Cbz-L-谷氨酸-α-苄酯16)两步生成。
例如，反应方案4所描述的化学方法，如下，代表了本发明的一个优选实施方案，且提供了一种有效的且可大规模用于制备L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸15的方法，其极大的减少化合物1和2的肽部分的成本。其然后将二肽15和(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸7S转化成(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐12，呈适合配制为肠胃外药物的形式。
Figure BDA00003631669600281
反应方案4.本发明的有效合成化合物2的方法
(i)NMM IBCF THF-30℃;(ii)BSA THF;(iii)将18加入17-30至20℃;(iv)EtOAc水pH2reX CAN;(v)H2Pd/C EtOH/H2O;(vi)/(viii)将15、BSA先后加入预形成的21中;(vii)EDCI HOBT CAN;(ix)H2O NaHCO3;(x)NaHCO3水HP20SS树脂#此中间体也可能是N-三甲基甲硅烷基化的
较后的偶联和分离的化学反应在优化后直接进行，避免了很难或不可能进行几千克规模的步骤，且导致较之前2的制备收率显著增加(>2倍)，而且去除了色谱分离及进行一次额外分离和反应的必要。该方法也可使整个顺序相较于之前的过程更加易于监测和可控，也极大的减少了这些步骤的总成本。
该过程由以下组成：两个肽偶联(都通过使用O,N-二-(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)或其它合适的甲硅烷基化试剂促进)、分离和纯化步骤中的甲硅烷基酯原位脱保护、氢解脱苄基反应和单个色谱分离，例如在改良的聚苯乙烯树脂上，然后冻干以生成化合物2，作为保存稳定的冻干饼状物，适合直接用于各种药物产品制剂。
活化N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯16的γ-羧酸，例如通过转化成混合酸酐如17，优选使用氯甲酸异丁酯。在单独的容器中，将D-谷氨酸12转化成甲硅烷基酯，例如其二-三甲基甲硅烷基酯18(也可能是N-三甲基甲硅烷基化的)，其通过用BSA或其它合适的甲硅烷基化试剂延长处理。混合两种溶液，并且当反应结束后，中间体完全保护的二肽19经去甲硅烷基水溶液后处理，以生成所需的二-保护的L-Glu-γ-D-Glu衍生物20，其直接从反应混合物中分离并重结晶到高纯度，而且可以方便地保存。
化合物20可方便地通过催化氢化脱保护为母体二肽L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸15，而且如果需要化合物15也可以保存。为完成该顺序，N-环戊二烯并喹唑啉-6-基氨基苯甲酸7S在羧酸上活化，优选的通过转化成其1-氧基苯并三唑酯21，然后与22(15的三-三甲基甲硅烷基酯)反应，其中22可能已在另一个容器中制得而未分离，或者可能是原位产生的。当反应结束后，不需要尝试分离(可能有的)三-甲硅烷基化的中间体23，它可以一种方法进行处理，通过该方法游离酸1、其亚化学计量的钠盐或三钠盐2直接从处理中分离。化合物最终的纯化是在水性介质中纯化三钠盐2，而提纯的盐2可能在初始浓缩步骤(例如使用反向渗透)后，通过冻干被分离。
Figure BDA00003631669600291
反应方案4a.(i)NMM IBCF THF-30℃;(ii)BSA THF20℃;(iii)将18加入到17中-30至20℃;(iv)EtOAc水pH2reX ACN #此中间体也可能是N-三甲基甲硅烷基化的
本发明方法的优选实施方案的非限制性实施例在下文更详细地讨论。
D-谷氨酸在无水THF中的混悬液可在室温氮气下搅拌，而3.5当量的甲硅烷基化试剂(如BSA)经5-15分钟滴加。固体逐渐溶解，形成二-三甲基甲硅烷基酯18，并且也可能将胺氮甲硅烷基化。该搅拌在室温继续24-48小时。在第二个容器中，0.9当量(基于D-Glu)的N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯在无水THF中，在室温氮气下搅拌直至所有的固体溶解，然后该溶液被冷却到约-25℃，并加入约1.2当量的叔胺碱(如N-甲基吗啉)以形成盐。
然后，该低温盐溶液可被慢慢地反向加入-30℃的偶联剂溶液，优选氯甲酸异丁酯，也在THF中，在氮气下搅拌。反向加入能减少该反应中形成的N-苄氧基羰基-L-谷氨酰基-α-苄酯酸酐的量。不希望被理论所约束，酸16和氯甲酸异丁酯的反应可能产生更大量的对称酸酐，其可能随反应规模的增加而增加。尽管该对称酸酐在下一步中形成所需的化合物，但当对称酸酐酰化D-Glu时，释放的16分子会以未反应的原材料存留，减少了总反应的收率，所以优选选择这样的条件(例如，反向添加)以减少上述情况的发生。
一旦酸16已经完全转化成混合酸酐17，将D-Glu的二-甲硅烷基酯18足够慢地加入到反应混合物中，以避免任何可察觉的温度升高。再在低温一段时间后，使反应混合物慢慢加热到室温，然后在此温度搅拌若干小时，以允许反应进行直到结束。
二甲硅烷基酯二肽19的溶液再在水和乙酸乙酯中分配，而水相是酸化的，例如酸化到约pH2。这完全地分解任何存在的甲硅烷基酯，并且确保生成的20为可溶解在有机相中的游离酸的形式，而其它剩余的D-Glu被分配到水相。两相分离，且有机相可能冲洗几次。有机相应该主要包含所需的产物20和少量的未反应的初始N-Cbz-L-Glu-O-苄酯16。大多数溶剂可随后被除去，而剩下的可能用乙腈共沸除去。生成的浆液可能再从乙腈中重结晶，而在乙腈中极性较小的初始酯16具有中等的溶解性。该重结晶的双保护的二谷氨酸酯20可再此单独顺序中获得，收率为80-85%，纯度为99%，通过使用最便宜可用的D-谷氨酸原料，即D-谷氨酸本身，构成16的非常有效的一步谷氨酰基化反应。
Figure BDA00003631669600311
N-苄氧基羰基-O-苄酯20的双氢解生成未保护的L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸16，是直接的并且不乏先例的化学反应。然而，原料与产物的物理性质有非常大地差别，水不溶性20的两个亲脂性苄基的脱除导致高度极性和酸性的二肽16，该二肽16是水极易溶的但在多数有机溶剂中溶解性不好。
由于氢解使用非均相催化剂，优选底物在反应介质中有合理的溶解性以便于反应发生。优选地，产物不沉淀在催化剂上，因为那可能使反应停止。此外，从产物中分离催化剂最实用的方法是过滤，因此，优选地，所有产物16均在溶液中。应当确保高纯度，因为该化合物非常接近最终的API。优选使用乙醇水溶液，因为它抑制了不必要的酯化作用并允许适度加热时产物完全溶解，这使得催化剂可通过过滤除去。用于氢解的优选比例的水和乙醇，并未溶解所有的原料，但允许足够的原料在溶液中使得氢解以合理的速率进行。它们还允许产物在反应混合物中有足够的溶解度，从而该产物不会沉淀在催化剂上(其会使催化剂失活并使反应停止)。此外，所选的水乙醇混合物抑制了不希望的乙酯副产物的形成。
还发现，过滤后，再向混合物中加入乙醇并加热重新形成溶液可发生结晶作用，其直接以很好的纯度和收率回收二肽16。
此外，用2%的硫代硅胶(thiosilica gel)处理热的、预结晶的溶液以在精过滤(polishing filtration)前清除剩余的钯，产生的二肽16有可接受的低钯水平(<5ppm)。
沉淀后，二肽16含有相当大量的水，这对下一步反应(见下文)是有害的。然而，尝试降低其含水量低于约8%，即使使用相对温和的干燥条件(45℃，氮吹真空干燥箱)，也可能导致脱水产物的形成，该过程通过质谱测量，其中M-18+离子出现。如果存在，这些产物在下一步反应中可能偶联，而独特的M-18+离子会随后在最终的偶联产物中出现，并且可能难以将其与所需的产物分离。因此，优选地，干燥应谨慎进行，避免升高温度，而且已发现含水量9-14%重量最适用于下一步，同时未生成可检测量的这些脱水产物。
Figure BDA00003631669600321
在该反应顺序的最后一步的第一部分，将偶联剂(如EDCI)(1.1-1.25摩尔当量)加入到6(S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸7S(优选地，含有0.5-5%重量的水)在溶剂(如THF或乙腈)的溶液中，且其含有1-羟基苯并三唑水合物(HOBT.H2O)(1.25-1.5摩尔当量)的浆液，在20-25℃反应器中搅拌。
经过12-18小时的HPLC分析证明酸7S到HOBT酯21的完全转化已经发生。令人惊讶地，该反应不要求任何外源性的碱加入，而且从该过程除去常用的叔胺或其它弱碱已显示显著的增加最终产物的纯度。
Figure BDA00003631669600322
反应方案4b.#此中间体也可能是三甲基甲硅烷基化的
在该最终反应顺序的第二步，一旦过程中HPLC已显示>99%酸7S转化为HOBT酯21，固体L-Glu-γ-D-Glu16(1.5-2.0摩尔当量)可以一份直接加入浓厚粘稠的反应混合物中。该二肽在乙腈中是完全不溶的，形成稠的白色浆液，并且HPLC分析显示无反应发生。该浆液然后被冷却到-5至-10℃，O,N-二-三甲基甲硅烷基乙酰胺(BSA)(8-10摩尔当量)以确保反应温度不超过10℃的速率在10-30分钟内(或许更长，取决于规模)加入。注意到有中等程度的放热，而且大部分固体逐渐溶解。HPLC分析显示HOBT酯21消失，并且一个单独的主要的新峰出现。
不希望被理论所束缚，认为BSA将二肽16溶解为其三-三甲基甲硅烷基酯22，尽管反应物质可能整个或部分是16的可溶性的低级甲硅烷基酯，或者可能甚至是三-酯22的N-甲硅烷基衍生物。或者，三-甲硅烷基酯22可能在另一个反应器中进行，通过二肽16与BSA(8-10摩尔当量)在乙腈中反应。一旦所有的固体进入溶液，将22的溶液泵入21的溶液中。该过程比所描述的第一个过程使用更多的溶剂和仪器。
完成BSA的加入后，反应混合物立即保持在10℃或略低，直至过程中HPLC根据酯21的消失显示该反应≥99%完成，在那时，可能加入BSA3-5小时后，反应混合物(此时为稀的混悬液)被过滤到装备有机械搅拌器和氮气进气孔的反应器中。该溶液为澄清的淡黄色溶液，此时存在的主要物质应当是二-O-(三甲基甲硅烷基(2,R)-((4,S)-(三甲基甲硅烷氧基羰基)-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸酯23，或可能的其2-三甲基甲硅烷氧基同源物25。化合物23(25)在此阶段未作为多三甲基甲硅烷基物质分离。
当二肽16通过结晶作用获得，其是作为高度水合的固体获得的，含水量>15%重量。如果16的含水量高于约13%，可优选地加入额外的BSA，以供反应利落地进行至结束。另一方面，小量的未鉴别的脱水产物(如果干燥二肽3过度则会出现(见上文))，可与HOBT酯21偶合，生成杂质，该杂质与酸1非常相似而且难以从最终API中除去。因此，违反直觉地，已发现该反应使用含有5-15%重量水，优选9-13%重量水的二肽16效果最好，而且在反应开始时如果加入小量的外源性的水有助于整个反应。类似地，酸7S通过水性沉淀最方便从其终反应步骤分离，并且可能初始获得含有>10wt%水。大部分的水可以通过60℃真空干燥除去，而且已发现最终的偶联步骤容许7S含有最高达5%重量的水而无明显影响，尽管高于该含水量可能减慢21的形成。违反直觉地，已发现如果两个前体化合物均含最佳量的水，最终的偶联反应实际上生成更纯净的产物，如果酸7S有低于3%w/w的水，加入小量的水可能对初始的活化步骤是有利地。
Figure BDA00003631669600341
如前所述，本发明的示例方法中反应混合物存在的主要物质应当是二-O-(三甲基甲硅烷基(2,R)-((4,S)-(三甲基甲硅烷氧基羰基)-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸酯23或更高级的甲硅烷基类似物(silylogue)25，尽管也可能存在少量的低级三甲基甲硅烷基酯。这些酯通过加入相对少量的水、甲酸水溶液或饱和碳酸氢钠溶液可能被水解。
甲硅烷基酯在加入水后会自发水解并慢慢从溶液中沉淀。实际上，已发现如果加入的水溶液的pH不接近中性，水解/沉淀则更快，而且生成更令人满意的固体，2M的甲酸和饱和碳酸氢钠溶液均被使用过，但饱和碳酸氢钠溶液是更优选的。因为加入25-100mol%碳酸氢钠时沉淀效果令人满意，可以看到沉淀出的主要物质是游离碱(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1，或部分是单钠盐。溶液在0至5℃搅拌下沉淀若干小时，然后冷过滤混合物，通过氮气下真空过滤收集固体，并用乙腈冲洗。
当适宜的处理后，该沉淀成功的除去了存在的大部分HOBT和过量的L-Glu-γ-D-Glu16以及大部分源自BSA的副产物，(乙酰胺、N-三甲基甲硅烷基乙酰胺和六甲基二硅氧烷)并生成自由流动但易吸湿的固体。该纯化步骤也可能让后续的树脂色谱纯化更好进行。本步除去大部分的乙酰胺也是有用的，因为最终API中乙酰胺的含量是严格规定的，由于其弱致癌性，此沉淀过程的加入使得最终API中的乙酰胺含量更低。
Figure BDA00003631669600351
将粗制的固体三元酸1(或其亚化学计量的钠盐)目前溶解于冷的碳酸氢钠稀溶液中，以生成大约25mg/mL的最终API(三钠盐2)的溶液。如果需要，pH可能用氢氧化钠调节到pH8-9的范围，优选pH8.5-9.0，且将该溶液上样到预冲洗和平衡(例如，先甲醇然后水)的色谱柱上，如HP20SS树脂色谱柱，标称比例为约50g树脂/1g终产物。然后用大体积的水洗脱柱子，如果要求再用1-5%乙腈水溶液梯度洗脱。级分通过HPLC监测，且合并更纯的级分以得到所需纯度(通常99.0-99.7面积%)的2(2-3g/L)的稀溶液。
小规模时，可能直接冻干该物质以生成最终的API2，总收率为45-65%，纯度>99%。在冻干过程中使用更加浓缩的溶液导致更短且更经济的冻干过程，而且生成的冻干饼状物可能有更好的物理性质以进行后续处理和保存。因此，更大规模时，在最终冻干前加入一步浓缩是可能有用的。
连续蒸发技术的使用，如刮膜式蒸发器(其中含有API的溶液只在每次通过仪器时暴露在适度加热(～45℃)条件下几秒钟)，已经显示每次通过将溶液浓缩为至少3倍，而无可检测到的纯度或API的损失。
或者，API溶液可通过将其装填入比HP20SS结合更紧的树脂来浓缩，然后通过使用合适的溶剂以更浓缩的形式被洗脱(stripped)。例如，通过HP20SS色谱法并汇集合适的级分获得的API1的低浓度溶液可被装填到SP207SS树脂柱上，并附着在上面。使用25%的乙腈水溶液洗脱柱子，将API从柱子迅速冲洗，获得至少10倍的浓度增加。
或者，API溶液可通过使用超滤浓缩。已发现其有利地浓缩柱洗脱液至少4倍，且可通过使用冰冷的≤10℃的配备有5Pall Centrasette0.65Kd截止滤膜的超滤仪器而达到16倍。用可变体积的水(如约等体积的)将超滤仪器中的保留物透滤，显示有利地减少更小分子量的杂质，如乙腈和乙酰胺。
将三-三甲基甲硅烷基酯23水解成所需的API2的替代方法只需将THF或乙腈反应溶液在碳酸钠水溶液中淬灭，优选地确保最终混合物的pH大于7。该溶液原则上能直接装填到树脂柱上，如HP20SS，并提纯。为了减少物质损失、API拖尾和杂质，在色谱法前用乙酸乙酯预冲洗水溶液若干次可能是优选的。HPLC研究显示这种做法在色谱法前除去了超过半数的HOBT以及相当量的乙酰胺和THF或乙腈，但是ONX-0801并未以任何可感知的量分配到乙酸乙酯中。因而，水性淬灭和乙酸乙酯冲洗给沉淀提供了一种可选方案，而且本方案相比沉淀有更好的耐受性。2的碱性水溶液的重复稀释和浓缩超滤循环也将在色谱法前除去低分子量的杂质，导致进一步改善整体的色谱纯化。然而，当恰当地执行时，沉淀可能获得更好地整体结果。
实验部分
2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸20
向250mL烧瓶(磁力搅拌器，加料漏斗和N2进气孔)加入D-谷氨酸(10.9g，74.1mmol)和THF(110mL)。开始搅拌且通过加料漏斗经5分钟加入N,O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(53.1g，261mmol)。该浆液在室温搅拌28小时。
向第二个250mL烧瓶(磁力搅拌器、热电偶、加入孔和N2进气孔)加入N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯(25.0g，67.3mmol)和THF(80mL)并搅拌以获得均质溶液。溶液冷却到-25±5℃，通过注射器加入N-甲基吗啉(8.28g，81.8mmol)，并将溶液在该温度搅拌约30分钟。向1L的主反应烧瓶(磁力搅拌器、热电偶、加入孔和N2进气孔)加入THF(170mL)并且该THF冷却到-30±5℃。此时加入氯甲酸异丁酯(10.0g，73.2mmol)，然后通过活塞泵和Teflon管道以约2.0mL/min的速率将N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯N-甲基吗啉盐转移到主反应烧瓶中，保持反应混合物的温度为-30±5℃。45分钟后转移结束。反应混合物在-30±5℃搅拌约40分钟(混合酸酐/对称酸酐比为95.5/0.28)，然后全甲硅烷基化(persilylated)的D-谷氨酸酯溶液通过泵经35分钟转移到混合酸酐溶液中，在转移过程中保持温度为-30±5℃。反应混合物在该温度范围搅拌1小时，而后允许慢慢地加热到室温并搅拌过夜。
反应通过加入水(75ml)、EtOAc(200mL)稀释、然后用37%HCl(1.6g)酸化到pH为1-2小心地淬灭。有机相用水(2x50mL)、20%盐水(2x50mL)冲洗，而有机相的体积在真空中减少到112mL。产物溶液用MeCN(285mL)稀释，转移到反应烧瓶中，并且该溶液在大气压下蒸馏，收集到310ml馏出物。残余物用0.2%“水湿”的MeCN(456mL)稀释并加热回流以获得均质溶液。该溶液慢慢冷却到室温，生成的稠浆液搅拌过夜。固体经过滤收集，饼状物用MeCN(45mL)冲洗，在真空下抽取滤液。然后该饼状物在氮气流下干燥至恒重。收率：29.2g(86.8%)，纯度:99.1A%，C,H,N分析:理论上:C,59.99%；H,5.64%；N,5.60%。实际上:C,59.96%；H,5.48%；N,5.51%。
L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸16
氢化容器中加入2S-(N-(R)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸(1.90kg，3.796mol)、Pd/C(10%，Degussa type E101-New，100g)、EtOH(15L)，和水(13.3L)。生成的混合物在氮气下真空除气三次，并在室温H2(40psi)下搅拌4h，然后经LC-MS和HPLC检查。未检测到原料或部分脱保护的中间体。然后除去氢气气氛，混合物通过用氮气增压至40psi而净化三次，然后释放压力。加热该反应混合物至60℃且通过0.2微米滤器过滤，然后进一步用EtOH(10.51kg)在60℃冲洗。合并的滤液在60℃搅拌直至所有固体溶解，加入2%的硫代二氧化硅(40g)并在该温度继续搅拌9小时。反应混合物通过0.2μm滤器热过滤，并用热乙醇(3.8kg)冲洗。混合滤液经12小时冷却到22℃，然后经下一个12小时冷却到2℃，然后固体通过GF滤纸过滤收集、用冷(3℃)乙醇(7.5kg)冲洗并在45℃轻微氮气吹送下真空干燥箱中干燥20小时以生成L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸16(900g，85.7%)，为纯度99.1A%的白色固体。卡尔费歇尔水分测定显示10.9%w/w的水，而Pd分析显示少于1ppm的Pd。1H NMR(D2O)δ:1.96-2.02(1H,m),2.12-2.23(3H,m),2.48(4H,t,J=7Hz),3.82(1H,t,J=6Hz),4.36(1H,dd,J=8.8,5Hz)。
(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊 二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1
将乙腈(1.5L)加入到配备有机械搅拌器、氮气进气孔和J-KEM温度计的5L三颈烧瓶中，在20±2℃搅拌。加入(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸7S(50.0g，0.1284mol)和USP-PW水(12.0g)，并搅拌混合物30分钟。加入N-羟基苯并三唑水合物(26.2g，0.1711mol)，注意到温度降～1℃。混合物在20℃剧烈搅拌2小时，然后加入N-(3-(N,N-二甲基氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(27.30g，0.1419mol)至浆液中，并且使反应在20±2℃搅拌15小时以形成稠浆液。此时，一部分从反应中移出并用HPLC分析。HPLC显示中间体羟基苯并三唑酯21的形成已经结束。向搅拌的反应混合物中加入L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸(53.20g，0.1926mol)，该反应混合物被冷却到2℃，并保持在该温度1小时，然后反应混合物被进一步冷却到-6℃。然后，通过加料漏斗经15分钟加入O,N-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)(450mL，374.4g，1.84mol)。注意到在添加过程中有放热现象，其通过BSA加样速率控制，在加样过程中反应温度升高到7℃。在完成加样后，该反应混合物立即在冰浴上搅拌10分钟，然后允许逐渐加热到10℃。加样结束后2小时和3.5小时，部分样品从反应移出并通过HPLC分析。3.5小时样品的HPLC显示反应已经结束。3.5小时后，10℃的混悬液被过滤到装备有机械搅拌器和氮气进气孔的12L烧瓶中。滤渣进一步用乙腈(200mL)冲洗，烧瓶内含物进一步用乙腈(3.5L)稀释。该溶液在2℃搅拌然后经15分钟滴加46mL新配制的饱和的碳酸氢钠溶液(～1.2M)，引起淡褐色的沉淀形成。使该沉淀在2-3℃形成2小时然后混合物经瓷漏斗过滤(buchner filtered)、乙腈冲洗(1L)及抽吸干燥30分钟，所有过程均在氮气环境下进行。固体环被留在反应烧品中，然后用乙腈(500mL)松散和浆化30分钟。如前主样品的处理，固体经氮气下瓷漏斗过滤、乙腈冲洗(100mL)及干燥收集。两批样品均在室温高真空下干燥15小时，以分别生成104.1g和10.5g浅褐色自由流动的固体。HPLC分析显示两批样品基本上是同样的物质，它们一共生成114.6g(>100%)粗制的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸，或其亚化学计量的钠盐，经HPLC分析其含有少于1%的不希望的(2R，4R)非对映异构体。
(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊 二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠 盐2
玻璃色谱柱中加入在甲醇(15L)中浆化的HP-20SS树脂(5kg)，并通过水(总量40L)冲洗进行平衡。向带有搅拌器和J-KEM温度计的12L三颈烧瓶中加入新配制的饱和碳酸氢钠溶液(1.1L)和水(1.1L)，并冷却到2℃。加入粗制的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸，或其亚化学计量的钠盐(114.6g)，注意到有1℃的轻微放热，固体在10分钟内溶解。1小时后检查pH，将氢氧化钠溶液(1M，440mL)缓慢地加入该溶液中，引起2℃的放热并升高溶液的pH至约7.45。进一步加入氢氧化钠溶液(～10mL)以升高pH高于8.0但低于9.0。该溶液被装到树脂柱上，并用水(89L)洗脱，收集20份级分，但不是相同体积。合并HPLC分析显示含有所需物质在大于99A%纯度的那些级分(7-18)，且通过在超滤仪器中使用5Pall Centrasette0.65Kd截止滤膜从～56L浓缩到约12L，保持在低于10℃。保留物用水(10，20L)稀释两次并每次重新浓缩到～12L。其再次通过Pellicon2maxi cassette w/5000MW截止滤器过滤以除去内毒素，并放置在搁板冷冻干燥器中。产物被冷到至-59℃，然后在搁板温度为-20℃在压力为40毫托下冻干。20小时后，搁板温度被升高到-15℃维持40小时，然后升高到-5℃维持27小时。最终的干燥在搁板温度20℃进行若干天，并且压力降到低于10毫托，生成(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐2(44.6g，44.35%收率，校正8.9%的KF水分分析)，作为蓬松的白色冻干物。分析数据。FTIRν:3283,1598,1503,1397,1088,830,766cm-1。1H NMR(9:1D2O:CD3OD)δ:1.63-1.71(1H,m),1.82-2.16(2H,m)2.22-2.41(4H,m),2.42-2.46(4H,m),2.72-2.84(1H,m),2.87-2.98(1H,m),3.56,3.70(1H,1H,ABq,J=18.6Hz),3.93(1H,dd,J=4.8,8.4Hz),4.27(1H,dd,J=5.0,7.8Hz),4.44(2H,s),5.23(1H,t,J=7.8Hz),6.79(2H,d,J=8.8Hz),7.23(1H,s),7.53(2H,d,J=8.8Hz),7.61(1H,s)。13C NMR(9:1D2O:CD3OD)δ:29.49,29.83,30.34,31.26.33.98,35.36,36.95,56.71,56.77,62.02,64.92,74.05,82.60,114.41,119.99,122.28,122.83,123.00,130.01,142.64,148.19,152.07,153.77,157.97,165.34,170.27,176.48,179.84,180.20,183.20。化学纯度(HPLC)99.8A%。非对映异构体纯度(HPLC)99.75A%。CHN:C,45.41；H,5.01；N,8.23,Na9.85%。

Claims (42)

1.一种合成L-Glu-γ-D-Glu二肽的方法，其包括以下步骤：
a)活化N-αO-双保护的L-Glu衍生物的γ-羧酸；
b)甲硅烷基化D-谷氨酸；和
c)将步骤a)产生的活化的羧酸衍生物与步骤b)的甲硅烷基化产物反应以生成被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质。
2.根据权利要求1的方法，其中在步骤a)中，活化包括将N-αO-双保护的L-Glu衍生物转化成活化的衍生物，例如混合酸酐。
3.根据权利要求2的方法，其中活化包括用氯甲酸烷基酯和叔胺碱处理N-αO-双保护的L-Glu衍生物。
4.根据权利要求3的方法，其中氯甲酸酯是氯甲酸异丁酯。
5.根据权利要求2至4的方法，其中缓慢加入N-αO-双保护的L-Glu衍生物至氯甲酸烷基酯和叔胺碱的低温溶液中。
6.根据权利要求5的方法，其中氯甲酸烷基酯和叔胺碱的溶液的温度为-10℃至-50℃，优选约-30℃。
7.根据权利要求3至6任一项的方法，其中叔胺碱为N-甲基吗啉。
8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中N-αO-双保护的L-Glu衍生物为N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯。
9.根据上述权利要求任一项的方法，其中在步骤b)中，甲硅烷基化包括用甲硅烷基化剂处理D-谷氨酸。
10.根据权利要求9的方法，其中甲硅烷基化剂为O,N-二-(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
11.根据上述权利要求任一项的方法，其中在步骤b)中，D-谷氨酸被若干当量的甲硅烷基化剂溶解；和步骤c)中，将该溶液加入来自步骤a)的羧酸衍生物的冷溶液，以形成被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质的甲硅烷基酯化溶液。
12.根据权利要求11的方法，其中N-αO-双保护的L-Glu衍生物为N-苄氧基羰基-L-谷氨酸-α-苄酯且产物为2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液。
13.根据权利要求12的方法，其中反应后，将2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液进行去甲硅烷基化水溶液后处理，从而以良好的收率和纯度产生2R-(N-(S)-4-(苄氧基羰基)-4-苄氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸。
14.根据权利要求13的方法，其中去甲硅烷基后处理包括在水和有机溶剂之间分配溶液。
15.根据权利要求1至14任一项的方法，其还包括：
d)脱保护该被保护的L-Glu-γ-D-Glu物质。
16.根据权利要求15的方法，其中脱保护包括除去苄基和/或苄氧基羰基保护基以产生L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸。
17.根据权利要求15或16的方法，其中脱保护包括氢解。
18.根据权利要求17的方法，其中氢解包括在乙醇水溶液中，使用合适的过渡金属催化剂氢解。
19.根据权利要求18的方法，其中催化剂包括钯碳催化剂。
20.根据权利要求15至19任一项的方法，其中脱保护后，该产物经硫代硅胶处理以获得含<10ppm钯的产物。
21.合成(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其可药用盐或溶剂合物的方法，其包括将甲硅烷基-保护的L-Glu-γ-D-Glu物质与(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸偶联的步骤。
22.根据权利要求21的方法，其中偶联包括活化(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的羧酸部分和用甲硅烷基-保护的L-Glu-γ-D-Glu物质处理。
23.根据权利要求22的方法，其中活化包括通过用1-羟基苯并三唑水合物和偶联剂处理将(6S)-4,N-((2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸转化成活化的HOBT酯。
24.根据权利要求23的方法，其中偶联剂为二酰亚胺偶联剂。
25.根据权利要求21至24任一项的方法，其中甲硅烷基保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是由L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸二肽的甲硅烷基化产生的。
26.根据权利要求25的方法，其中甲硅烷基-保护的L-Glu-γ-D-Glu物质是从根据权利要求1至19任一项的方法产生的L-Glu-γ-D-Glu二肽制备的。
27.根据权利要求26的方法，其中甲硅烷基化包括用甲硅烷基化剂处理。
28.根据权利要求27的方法，其中甲硅烷基化剂为O,N-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
29.根据权利要求21至28任一项的方法，其中偶联反应是在乙腈中进行的。
30.根据权利要求21至29任一项的方法，其中任何涉及存在甲硅烷基化剂的操作都是在温度范围-10℃至+10℃进行的。
31.根据权利要求21至30任一项的方法，其还包括纯化步骤，包括过滤、稀释和沉淀，其通过加入谨慎限定量的碱水溶液，优选饱和碳酸氢钠溶液，或酸水溶液，优选甲酸。
32.制备(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三钠盐(ONX-0801)的方法，其包括以下步骤：
(i)提供(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐在水性钠碱中的溶液；
(ii)如有必要，调节pH；
(iii)柱色谱分离；
(iv)任选地，浓缩从步骤(iii)洗脱的产物；和
(v)冻干。
33.根据权利要求32的方法，其中用于步骤(i)的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亚化学计量的钠盐是根据权利要求1至30任一项的方法制备的。
34.根据权利要求32或33的方法，其中在步骤(i)中，水性钠碱溶液是碳酸氢钠或碳酸钠溶液。
35.根据权利要求32至34任一项的方法，其中在步骤(ii)中，将pH调节到范围pH7.5-9.0。
36.根据权利要求32至35任一项的方法，其中在步骤(iii)中，色谱分离包括在改良的聚苯乙烯树脂柱上通过柱色谱纯化，用水或含1-10%的水混溶性溶剂的水洗脱。
37.根据权利要求32至36任一项的方法，其中步骤(iv)包括浓缩收集的色谱级分，该级分包含(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐的稀水溶液，所述浓缩使用连续蒸发技术如刮膜式蒸发；基于膜的浓缩方法如超滤；或柱装载和洗脱。
38.根据权利要求37的方法，其包括在0℃至10℃使用超滤将柱洗脱液浓缩4倍至16倍。
39.根据权利要求38的方法，其还包括在0℃至10℃将超滤仪器中的保留物透滤，以减少水溶性低分子量杂质的量。
40.根据权利要求32至39任一项的方法，其中步骤(v)产生的冻干饼状物含有不超过10%重量的水。
41.化合物，其用于合成(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸及其三钠盐，其选自：
(R)-二(O-三甲基甲硅烷基)2-((S)-5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸酯；
(R)-2-((S)-5-(苄氧基)-4-(苄氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸；
(S)-O-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基4-((2-(羟基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；
(R)-二(O-三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5-氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯；
(S)-O-1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基4-((2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；
(R)-二(O-三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5-氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯。
42.制备(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三钠盐2的方法，包括：
根据权利要求1至19任一项的方法合成L-Glu-γ-D-Glu二肽；
根据权利要求25至30任一项的方法从所述的L-Glu-γ-D-Glu二肽合成(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸；和
根据权利要求31至39任一项的方法，从所述的(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸制备和纯化(2,R)-((4,S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羟基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氢-3H-环戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三钠盐(ONX-0801)。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104151398A (zh) * 2014-08-06 2014-11-19 四川同晟氨基酸有限公司 一种合成以谷氨酸为首个氨基酸残基二肽的方法
CN107236021A (zh) * 2017-06-12 2017-10-10 湖北泓肽生物科技有限公司 一种多肽衍生物的合成方法
CN110603042A (zh) * 2017-05-16 2019-12-20 Btg国际有限公司 铂类抗药性癌症治疗
CN111164092A (zh) * 2017-10-03 2020-05-15 日产化学株式会社 肽化合物的制造方法
CN113614061A (zh) * 2019-03-15 2021-11-05 日产化学株式会社 肽化合物的制造方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747499A (en) * 1994-05-05 1998-05-05 British Technology Group Limited Anti-cancer compounds
WO2003020706A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Btg International Limited PROCESS FOR THE PREPARATION OF CYCLOPENTA[g]QUINAZOLINE DERIVATIVES
US20070066607A1 (en) * 2003-04-04 2007-03-22 Fairhurst Robin A Quinoline-2-one derivatives for the treatment of airways diseases
WO2009115776A1 (en) * 2008-03-18 2009-09-24 Btg International Limited Cyclopenta[g]quinazoline derivatives for the treatment of rheumatoid arthritis or acute myeloid leukaemia

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8827083D0 (en) * 1988-11-19 1988-12-21 Porton Prod Ltd Trialkylsilyl esters of amino acids & their use in synthesis of peptides
GB9223352D0 (en) * 1992-11-06 1992-12-23 Ici Plc Tricyclic compounds
ATE483722T1 (de) * 2001-08-31 2010-10-15 Btg Int Ltd Antikrebs-cyclopentaag chinazoline-derivate
ES2373644T3 (es) * 2001-08-31 2012-02-07 Btg International Limited Uso de derivados de ciclopenta[g]quinazolina para el tratamiento del c�?ncer.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747499A (en) * 1994-05-05 1998-05-05 British Technology Group Limited Anti-cancer compounds
WO2003020706A1 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Btg International Limited PROCESS FOR THE PREPARATION OF CYCLOPENTA[g]QUINAZOLINE DERIVATIVES
US20070066607A1 (en) * 2003-04-04 2007-03-22 Fairhurst Robin A Quinoline-2-one derivatives for the treatment of airways diseases
WO2009115776A1 (en) * 2008-03-18 2009-09-24 Btg International Limited Cyclopenta[g]quinazoline derivatives for the treatment of rheumatoid arthritis or acute myeloid leukaemia

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104151398A (zh) * 2014-08-06 2014-11-19 四川同晟氨基酸有限公司 一种合成以谷氨酸为首个氨基酸残基二肽的方法
CN110603042A (zh) * 2017-05-16 2019-12-20 Btg国际有限公司 铂类抗药性癌症治疗
CN107236021A (zh) * 2017-06-12 2017-10-10 湖北泓肽生物科技有限公司 一种多肽衍生物的合成方法
CN107236021B (zh) * 2017-06-12 2020-12-01 湖北泓肽生物科技有限公司 一种多肽衍生物的合成方法
CN111164092A (zh) * 2017-10-03 2020-05-15 日产化学株式会社 肽化合物的制造方法
CN111164092B (zh) * 2017-10-03 2023-12-26 日产化学株式会社 肽化合物的制造方法
CN113614061A (zh) * 2019-03-15 2021-11-05 日产化学株式会社 肽化合物的制造方法

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