JP4422485B2 - 免疫サイトカイン含有凍結乾燥製剤 - Google Patents

Description

本発明は、免疫サイトカインを含んでなる安定な凍結乾燥医薬製剤、ならびに該凍結乾燥医薬製剤の調製に関する。

免疫サイトカインは、抗体とサイトカインとからなる結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）であり、そこでは、該抗体の２本の免疫グロブリン重鎖それぞれのカルボキシ末端は、サイトカインのＮ末端に連結されている。

抗体は、抗原による免疫感作の結果、血液、リンパおよび体分泌物中に生じ、かつ、それと抗原抗体反応を起こす、防御作用を有するある種の糖タンパク質である。抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）に属し、５つのクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類することができ、その一部はさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２に細区分することができる。免疫サイトカインには、すべてのＩｇＧ抗体が含まれる。それらは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ならびに、例えば二特異性抗体などの多特異性抗体を包含している。

サイトカインは、細胞によって、内分泌またはパラ分泌で、すなわち、血液中または周囲組織内へと分泌され、そして、特異的な受容体と結合した後、他の細胞の機能（通常、分裂や増殖、また、例えば、移動）に影響を与えるポリペプチドである。ある場合。サイトカイン産生細胞自体が。この制御の対象となることもある（その際には、自己分泌と呼ばれる）。サイトカインは、特に、免疫システムの細胞間の複雑な相互作用を制御する。

サイトカインの例には、リンホカイン、モノカイン、および一般的なポリペプチド・ホルモンがある。サイトカインには、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、ヒトＮ−メチオニル成長ホルモンやウシ成長ホルモンなど、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）やルトロピン（ＬＨ）など、肝成長因子、線維芽成長因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、マウス・ゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子、例えば、ＮＧＦβなど、血小板増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αやＴＧＦ−βなど、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβやＩＦＮγなど、造血増殖因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなど、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えば、ＴＮＦαやＴＮＦβなどが含まれる。

上記の抗体およびサイトカインと同様に、免疫サイトカインは、ペプチド性活性成分であり、したがって、腸から吸収することはできない。すなわち、治療目的の適用には、一般に、溶液の形態で非経口投与しなければならない。

ペプチド性活性成分を含有する溶液の処方における、１つの問題は、凝集体形成、ならびにタンパク質マルチマーの形成を起こし易いその性質である。しかし、この問題は、対象とする特定の活性成分の物理化学的な特性に依存して、その深刻さは異なる。親水性を有するタンパク質は、水溶液中における凝集物形成に対して、起こし易さは比較的に低いが、疎水性を有するタンパク質は、凝集体形成をより起こし易い。

抗体は、互いにサンドイッチ様の形態に配置されている、２枚の逆平行に折り畳まれたシート（保存ドメイン）で構成されている。この折り畳まれたシート中には、疎水性と親水性アミノ酸が互違いになっており、２枚の折り畳まれたシートの疎水性側鎖は、それぞれ、互いに向かい合っており、従って、サンドイッチ構造の内側を向いており、また、親水性側鎖は、それぞれ、外側を向いている（Ｊ．Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅ［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ］、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９１）。外側を向いている親水性アミノ酸は、水溶液中における、該抗体の可溶化をもたらし、そのため、異なる抗体間における相互作用を抑制している。従って、抗体は、極く低い表面の疎水性ならびに凝集性を有するのみである。

上記の特性により、抗体の溶液は、比較的に簡単にして、安定な形態で製剤化がなされている。市販製品の一例は、モノクローナル抗体 リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、無機バッファおよびポリソルベートを含んでなる水性製剤である、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）である。凍結乾燥による水分の除去は、既にそれ自体でも比較的安定である、該水性抗体溶液の安定性をなお一層増すことができる。そして、投与に先立ち、得られた凍結乾燥物は、水の添加によって、水性溶液へと再生する。この種の製品の一例は、モノクローナル抗体 インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、無機バッファおよびポリソルベートの他に、さらに、凍結保護剤または賦形剤として、糖を含有している、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）である。

ＷＯ９８／２２１３６Ａ２は、抗体、糖またはアミノ糖、アミノ酸および界面活性剤を含んでなる凍結乾燥製剤を開示している。抗体一般に対する製剤について、特許請求されているものの、Ｂ型肝炎ウイルスに対するモノクローナル抗体（ＡＫ ＨＢＶ）を含む製剤、ならびに、それぞれ、それぞれ、Ｌ−セレクチンに対する抗体（抗Ｌ−セレクチン）および抗Ｌ神経成長因子受容体（抗Ｌ−ＮＧＦＲ）を含む製剤のみを、実用例として開示している。

サイトカインは、抗体の場合のような、良好な水溶性を提供できる保存ドメインを含んでいない。従って、それらは、水溶液中における、高い凝集体形成の傾向を有している。これは、特に、共通する構造的な特徴として、４本のα−へリックスのバンドルを含み（所謂、４ α−へリックス・バンドル・サイトカイン）、また、この構造的な特徴によって、際立った疎水性を有しているサイトカインに当てはまる。疎水性に付随する、疎水性相互作用は、一方、しばしば、凝集の原因／機構ともなる（Ｈｏｒａ−ＭＳおよびＣｈｅｎ−Ｂ、（１９９９）、Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｉｎｄ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．、２１７−２４８）。共通する構造的な特徴として、４本のα−へリックスのバンドルを含んでいるサイトカインは、多くのインターロイキン、特には、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１およびＩＬ−１２、インターフェロン、特には、ＩＦＮβおよびＩＦＮγ、造血増殖因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなど、エリスロポエチン（ＥＰＯ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）である。明確に疎水性であると、文献中に記載されているサイトカインは、例えば、ＩＬ−２（Ｒｏｂｂ−ＲＪ他、（１９８３）ＰＮＡＳ ８０：５９９０−４；ＵＳ５，５８０，８５６）、ＩＬ−４（Ｓｈａｒｍａ−Ｓ他、（１９８７）２３５：１４８９−９２）、ＩＬ−５（Ｔａｋａｔｓｕ−Ｋ他、（１９８５）ＪＩ １３４：３８２−９）、Ｇ−ＣＳＦ（ＵＳ５，１０４，６５）である。

サイトカイン、特には、４ α−へリックス・バンドル・サイトカインのかかる強い傾向性は、それらの安定化には特別な処置を要求する。例えば、活性成分のインターロイキン２を含有する凍結乾燥物である、製品 Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）は、助剤として、糖、無機バッファならびにアニオン性洗浄剤（ラウリル硫酸ナトリウム）を含んでいる。しかし、アニオン性洗浄剤は、特に、該医薬品が、非経口投与を目的としている場合には、毒性学的観点からは、極めて疑問視されるものである。

サイトカイン含有製剤の安定化における、特異的な困難さを示唆する別の例は、インターフェロンβを含有する市販製品（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ（登録商標）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標））である。これらの製品はいずれも、アルブミンによって安定化されているが、これも、同様に、毒性学的観点から、特には、望ましくない免疫反応に関して、極めて議論のあるものと位置付けるべきものである。

サイトカインと抗体との間の上記の相違により、それぞれ、１つの抗体と２つのサイトカインとで構成されている、免疫サイトカインも、その物理化学的な特性は、抗体のものとは、顕著に異なる。特に、４ α−へリックス・バンドルを有するサイトカインを含んでいる免疫サイトカインは、付随している、際立った疎水性のため、水溶液中における集塊形成の強い傾向を有しており、そして、安定化が困難である。

本発明の目的は、免疫サイトカインのための安定化した製剤を提供することにある。かかる製剤は、なんらかの毒性学的に許容されない助剤を含有すべきではなく、高い温度および大気湿度など、過酷な条件下でも長期間にわたり安定であるべきであり、かつ、高い活性成分含量を有する、そのまま投与可能な溶液を提供するため、水性溶媒で再生可能であるべきである。

驚くべきことに、免疫サイトカインの他に、糖またはアミノ糖、アミノ酸および界面活性剤を含んでなる、水性緩衝溶液を凍結乾燥することによって、これらの要件を満たす製剤を提供することができる。従って、本発明は、免疫サイトカイン、糖またはアミノ糖、アミノ酸および界面活性剤を含んでなる、安定な凍結乾燥製剤に関する。

該製剤は、好ましくは、サイトカイン要素として、４本のα−へリックスのバンドルを共通とする構造的な特徴として有しているサイトカインからなる群から選択されるサイトカイン、特に、インターロイキン、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１および／またはＩＬ−１２、インターフェロン、好ましくは、ＩＦＮβおよび／またはＩＦＮγ、および／または、造血増殖因子、好ましくは、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯまたはＳＣＦを含む免疫サイトカインを含有している。該組成物は、特に好ましくは、インターロイキン２（ＩＬ−２）を含む免疫サイトカインを含有している。

本発明にかかる製剤は、生理学的に良好な耐容性とされており、容易に調製でき、正確に処方でき、かつ、保存期間中、たとえ、繰り返し凍結と溶解の過程を経た後でさえ、純度、分解産物、凝集物に関して安定である。冷蔵庫温度（２〜８℃）、あるいは室温（２３〜２７℃）、相対大気湿度（ｒ．ｈ．）６０％下、少なくとも３カ月の期間から２年の期間に達する間保存した際、安定である。驚くべきことに、本発明にかかる製剤は、高温およびより高い大気湿度レベル、例えば、温度４０℃および７５％ｒ．ｈ．下でも、前記の期間の保存でも、なお安定である。

該凍結乾燥製剤は、水性溶媒、例えば、注射用の水または等張水溶液を加えることにより、簡単な方法で再生すると、そのまま投与可能な、粒子を含まない溶液を与える。再生された溶液は、約５日間の期間にわたり安定である、しかし、２４時間以内に投与することが特に好ましい。

水性溶媒を用いて、本発明にかかる製剤を再生すると、有利なことに、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ５．６〜７．４、特に好ましくはｐＨ６〜７と、２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有する免疫サイトカイン含有溶液の調製を可能とする。すなわち、再生した製剤は、実質的になんらの不安もなく、直接、静脈内、動脈内、また皮下投与することができる。加えて、該製剤は、他の活性成分も含んでいてよい、点滴溶液、例えば、グルコース溶液、等張食塩水またはリンゲル液中に加えることもでき、従って、投与する活性成分の量を比較的大量にすることを可能とする。

本発明の好ましい実施形態においては、該凍結乾燥製剤は、本質的に、免疫サイトカイン、糖またはアミノ糖、アミノ酸、バッファおよび界面活性剤からなる。

本発明にかかる製剤は、その濃度は、臨床上の要請に適合している免疫サイトカイン溶液の調製を可能にする。約０．１〜２５ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、なお一層好ましくは、１〜５ｍｇ／ｍｌの免疫サイトカイン濃度を有する免疫サイトカイン溶液であることが好ましい。

本発明にかかる製剤において用いる糖は、単糖、二糖または三糖類とすることができる。これらの糖は、単独で、あるいは、糖アルコール（例えば、マンニトール）との混合物として、使用することもできる。単糖類の例としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトースおよびソルボースを挙げることができ、二糖類の例としては、スクロース、ラクトース、マルトースまたはトレハロースを挙げることができ、また、三糖類の例としては、ラフィノースを挙げることができる。スクロース、ラクトース、マルトースまたはトレハロースが好適であり、スクロースおよびマルトースが特に好ましい。

アミノ糖類、すなわち、ヒドロキシル基の代わりに、第１、第２または第３アミノ基、ないしはアシル化アミノ基（−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ）を含んでいる単糖が存在してもよい。本発明の目的には、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミンおよびノイラミン酸が特に好ましい。

存在している該糖／アミノ糖は、本発明にかかる製剤中に、目的とする容積の溶媒で再生する結果得られる溶液中において、約１〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するような量で存在する。該糖は、好ましくは、再生される溶液中に１５〜３０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。

本発明においては、利用される好適なアミノ酸は、塩基性、酸性または中性アミノ酸、例えば、特には、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、リシン、グリシンである。該アミノ酸は、好ましくは、その無機塩の形態（好適には、塩酸塩、すなわち、アミノ酸塩酸塩の形態）で使用する。遊離アミノ酸を使用する場合には、生理学的に耐容性のあるバッファ物質、例えば、有機または無機酸、例えば、クエン酸およびリン酸、硫酸、酢酸、ギ酸またはその塩など、を添加することによって、所望のｐＨに設定する。クエン酸塩およびリン酸塩が好ましく、これらを用いて、特に安定な凍結乾燥物が得られる。

好ましいアミノ酸は、アルギニン、リジンおよびオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、例えば、グルタミン酸やアスパラギン酸など、あるいは、中性アミノ酸、例えば、イソロイシン、ロイシンやアラニンなど、または芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンなどを使用することもできる。本発明にかかる製剤中における、該アミノ酸含量は、（それぞれの場合、再生される溶液に基づいて）１〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは４０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは４０〜８０ｍｍｏｌ／ｌである。

使用可能な界面活性剤は、医薬製剤で通常に使用されている界面活性剤全てであり、好ましくは、非イオン界面活性剤、特には、ポリソルベートおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマーである。特に好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、特に、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノラウレートおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエートである。本発明においては、該製剤は、（それぞれの場合、再生される溶液に基づいて）０．００１〜１質量％、好ましくは０．００５〜０．５質量％、特に好ましくは、０．０１〜０．１５質量％を含む。

本発明にかかる製剤がバッファを含む際には、原則として、それらは、所望のｐＨを設定する上で好適な、任意の生理学的に耐容性のある物質であることができる。該バッファ物質の量は、例えば、注射用の水で該凍結乾燥製剤を再生した結果、得られる該水性溶液が、５ｍｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０〜２０ｍｍｏｌ／ｌのバッファ濃度を有するように選択する。好ましいバッファは、クエン酸バッファまたはリン酸バッファである。適合するなリン酸バッファは、リン酸の一および／または二ナトリウムおよびカリウム塩、例えば、リン酸水素二ナトリウムまたはリン酸二水素カリウム、ならびに該ナトリウム塩とカリウム塩の混合物、例えば、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムの混合物などの溶液である。

再生される、該溶液が、該免疫サイトカインの浸透特性ならびに安定化のために使用する助剤によっても、なお等張とはなっていない場合には、等張剤、好ましくは生理学的に耐容性の塩、例えば、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムなど、あるいは、生理学的に耐容性のポリオールまたは糖、例えば、グルコース、グリセロールまたはマンニトールなどが、さらに、等張性を確立する上で必要な量存在していてもよい。

加えて、本発明にかかる凍結乾燥物は、さらに、生理学的に耐容性の助剤、例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸またはグルタチオンなど、保存剤、例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルまたはプロピルパラベン、クロロブタノール、チオメルサールまたはベンザルコニウムクロリドなど、あるいは、その他の安定化剤、賦形剤および可溶化剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ３０００、３３５０、４０００または６０００、またはシクロデキストリン類、例えば、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエチル−β−シクロデキストリンもしくはγ−シクロデキストリン、またはデキトラン類を含むこともできる。

本発明にかかる製剤は、活性成分としての免疫サイトカイン、糖またはアミノ糖、アミノ酸および界面活性剤、ならびに必要に応じて、さらに医薬助剤を含んでなる水性製剤を調製し、次いで、該溶液を凍結乾燥させることにより調製することができる。

該水性製剤は、前記助剤を、免疫サイトカインを含む溶液に添加することにより調製することができる。この目的では、所定濃度の前記追加の助剤を含有している原液の所定量を、望ましくは、その評品から得られる、所定の濃度の免疫サイトカインを有する溶液中に加え、そして、該混合物を、必要に応じて、予め計算した濃度に水で希釈する。あるいは、該免疫サイトカインを含んでなる原料溶液中に、該助剤を固体として添加することもできる。該免疫サイトカインが固体形態、例えば、凍結乾燥物の形態である場合、本発明にかかる製剤は、最初に、水または１種または複数の追加の助剤を含んでいる水性溶液中に各免疫サイトカインを溶解し、そして、引き続いて、追加の助剤を含む原液、固体形態の追加の助剤および／または水のそれぞれついて、その必要とされる量を添加することにより調製することができる。該免疫サイトカインは、有利には、他の助剤全てを含む溶液に直接溶解することもできる。本発明にかかる製剤中に存在する１種または複数の助剤は、特定の免疫サイトカインの調製プロセスの間に、またはその終了時に予め添加しておくことも有利である。これは、その調製後に実施される精製の最終工程において、その他の助剤の１種、１種以上、または全てを含んでなる水性溶液中に免疫サイトカインを直接溶解すること、あるいは、好適な手段、例えば、タンジェンシャル・フロー濾過法などによって、バッファ置換することにより、実施するのが好ましい。該製剤を調製するためには、次いで、各追加の成分を、場合によって、より少量を添加することが必要か、あるいは、全く添加する必要がないかのみである。調製後に実施する精製の最終ステップにおいて、追加の助剤全てを含む水性溶液中に当該活性成分を直接溶解することが特に好ましく、そのまま、凍結乾燥に供する溶液となる。

当該免疫サイトカインおよび助剤を含んでなる溶液は、ｐＨを５〜８に設定し、滅菌濾過し、凍結乾燥される。

得られる凍結乾燥製剤は、水性溶媒を加えることで再生でき、特に、非経口的に、直接投与することが可能な水性製剤を与える。従って、本発明は、本発明にかかる凍結乾燥物を水性溶媒で再生することによって得られる、免疫サイトカインの水性医薬製剤にも関する。

再生される水性医薬製剤は、５〜８、好ましくは、５．６〜７．４、特に好ましくは、６．０〜７．０のｐＨを有することが好ましい。

該実施例は、本発明を説明するが、それに限定されるものではない。

実施例１ （バッチ８０２０）
０．７ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／１のアルギニン・ＨＣｌ
１．５質量％のスクロース
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物
各助剤を所定の濃度で含んでなる水性溶液の所定体積を混合することにより、調製を実施した。下記の溶液が使用された。

下記成分を含んでなる溶液Ａ（活性成分溶液）：
５ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
溶液Ｂ（助剤溶液）：
１．７４４質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
本発明にかかる製剤を調製するために、１００ｍｌの溶液Ａと６１４ｍｌの溶液Ｂを混合した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌濾過した。６ｍｌのバイアルに、溶液４ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

実施例２（バッチ８０２１）
０．７ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／１のアルギニン・ＨＣｌ
１．５質量％のマルトース
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物
各助剤を所定の濃度で含んでなる水性溶液の所定体積を混合することにより、調製を実施した。下記の溶液が使用された。

下記成分を含んでなる溶液Ａ（活性成分溶液）：
５ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
溶液Ｂ（助剤溶液）：
１．７４４質量％のマルトース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
本発明にかかる製剤を調製するために、１００ｍｌの溶液Ａと６１４ｍｌの溶液Ｂを混合した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌濾過した。６ｍｌのバイアルに、溶液４ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

実施例３（バッチ８４３１）
１ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
１．５質量％のスクロース
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物
各助剤を所定の濃度で含んでなる水性溶液の所定体積を混合することにより、調製を実施した。下記の溶液が使用された。

下記成分を含んでなる溶液Ａ（活性成分溶液）：
１．４５ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／Ｉのクエン酸
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
溶液Ｂ（助剤溶液）：
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
２８７ｍｍｏｌ／Ｉのアルギニン・ＨＣｌ
０．０２８３質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
本発明にかかる製剤を調製するために、４６．９ｍｌの溶液Ａと２５．１ｍｌの溶液Ｂを混合した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌濾過した。６ｍｌのバイアルに、溶液２ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

実施例４（バッチ８５９１）
４ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
１２．５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
８０ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
１．８質量％のスクロース
０．００８質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物
各助剤を所定の濃度で含んでなる水性溶液の所定体積を混合することにより、調製を実施した。下記の溶液が使用された。

下記成分を含んでなる溶液Ａ（活性成分溶液）：
５ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨ ｐＨ６．０とするに要する量
溶液Ｂ（助剤溶液）：
８．７質量％のスクロース
４１ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
２８７ｍｍｏｌ／Ｉのアルギニン・ＨＣｌ
ＮａＯＨ ｐＨ６．０とするに要する量
本発明にかかる製剤を調製するために、４ｍｌの溶液Ａと１５．５ｍｌの溶液Ｂを混合した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌濾過した。２ｍｌのバイアルに、溶液１ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

実施例５（スクロースの代わりにマンニトールを使用する対比製剤１、バッチ８００８）
０．７ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／１のアルギニン・ＨＣｌ
４質量％のマンニトール
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節
を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物

上記組成を有する活性成分溶液を直接凍結乾燥させて調製を実施した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌フィルターを用いて濾過した。６ｍｌのバイアルに、溶液４ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

実施例６（対比製剤２、バッチ８４３４、組成はバッチ８４３１に対応するが、アルギニンの添加はない）
１ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１．５質量％のスクロース
０．０１質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物
各助剤を所定の濃度で含んでなる水性溶液の所定体積を混合することにより、調製を実施した。下記の溶液が使用された。

下記成分を含んでなる溶液Ａ（活性成分溶液）：
１．４５ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
ＮａＯＨ ｐＨ ７．０とするに要する量
溶液Ｂ（助剤溶液）：
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
０．０２８３質量％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）
ＮａＯＨ ｐＨ ７．０とするに要する量
本発明にかかる製剤を調製するために、４６．９ｍｌの溶液Ａと２５．１ｍｌの溶液Ｂを混合した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌濾過した。６ｍｌのバイアルに、溶液２ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

実施例７（対比製剤３、バッチ８４３０、組成はバッチ８４３１に対応するが、Ｔｗｅｅｎ ８０の添加はない）
１ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１００ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
１．５質量％のスクロース
を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物
各助剤を所定の濃度で含んでなる水性溶液の所定体積を混合することにより、調製を実施した。下記の溶液が使用された。

下記成分を含んでなる溶液Ａ（活性成分溶液）：
１．４５ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
溶液Ｂ（助剤溶液）：
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
２８７ｍｍｏｌ／ｌのアルギニン・ＨＣｌ
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
本発明にかかる製剤を調製するために、４６．９ｍｌの溶液Ａと２５．１ｍｌの溶液Ｂを混合した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌濾過した。６ｍｌのバイアルに、溶液２ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

実施例８（対比製剤４、バッチ８４２９、組成はバッチ８４３１に対応するが、Ｔｗｅｅｎ ８０の添加はなく、また、アルギニンの添加もない）
１ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
１．５質量％のスクロース
を含んでなる水性溶液からの凍結乾燥物
各助剤を所定の濃度で含んでなる水性溶液の所定体積を混合することにより、調製を実施した。下記の溶液が使用された。

下記成分を含んでなる溶液Ａ（活性成分溶液）：
１．４５ｍｇ／ｍｌのＥＭＤ ２７３０６６
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／Ｉのクエン酸
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
溶液Ｂ（助剤溶液）：
１．５質量％のスクロース
５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸
ＮａＯＨ ｐＨ７．０とするに要する量
本発明にかかる製剤を調製するために、４６．９ｍｌの溶液Ａと２５．１ｍｌの溶液Ｂを混合した。

調製された溶液は、小分けに先立ち、滅菌濾過した。６ｍｌのバイアルに、溶液２ｍｌをそれぞれ充填した。続いて、バイアルをストッパで予備密封し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、バイアルに封をし、クリンプ（かしめ）処理を施した。

製剤の安定性の検証
安定性試験おいて、本発明にかかる製剤の安定性を評価した。この目的で、調製済みの該凍結乾燥物を様々な温度で、ある期間保存し、好適な分析手法を用いて調査した。４０℃、相対大気湿度（ｒ．ｈ．）７５％の気候条件を、様々な処方における、安定性の差を迅速に得るための過負荷条件として選択した。免疫サイトカインにおいては、可能性のある不安定性は、主として凝集物の形成ならびに分解産物の形成から明らかになる。分解産物および可溶性の凝集体は、好ましくは、限外クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）で検出され、可視的な凝集体の検出には、目視検査および濁度測定が利用される。同様に、製剤の評価のため使用するＥＬＩＳＡ試験は、完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）と受容体結合能の検査に利用される。波長２８０ｎｍでのＵＶ光度計測と共に、それは、含量の決定にも使用される。

分析試験法：
外観
調製した製剤は、紫外光（ｃｏｌｄ−ｌｉｇｈｔ）光源を利用して、粒子あるいは可能性のある濁り発生に関して、可視化して検査した。

タンパク質濃度：Ａ_280nm
得られたタンパク質溶液の波長２８０ｎｍにおける吸収は、調製された製剤の濃度を決定するために使用された。活性成分ｈｕＫＳ−ＩＬ２（ＥＭＤ ２７３０６６）の吸光係数１．４１は、定量的アミノ酸分析により決定した。実際の測定では、試験溶液の吸光度が０．１〜１．０（タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌに相当する）吸光度単位となるまで、３倍希釈系列で該タンパク質溶液を希釈した。活性成分を含有する試験溶液の吸光度を、活性成分を含有してない対応の参照溶液を基準として測定した。

純度：限外クロマトグラフィー、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
限外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、調製した製剤の純度ならびにモノマー／凝集体の比率の決定に利用可能な分析法である。試験溶液の成分は、特殊な多孔性ＨＰＬＣカラムを介して、その分子サイズに基づいて分離される。比較的大きな分子は、排出液分（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）と共に流出され、比較的小さな分子は、様々な程度で固定相の孔内へと浸透し、その結果、強さに大小はあるものの保持される。従って、ｈｕＫＳ−ＩＬ２の分解産物などの比較的小さな分子は、ｈｕＫＳ−ＩＬ２モノマー類、特には、カラムから最初に溶出されるｈｕＫＳ−ＩＬ２凝集物よりも、遅い滞留時間に出現する。

活性成分分子の濃度および完全性：ＫＳＡ−ＥＬＩＳＡ
この分析法（ＥＬＩＳＡ、酵素結合免疫吸着アッセイ）では、マイクロタイター・プレートを、ｈｕＫＳ−ＩＬ２の特異抗原（ＥＰＣＡＭまたはＫＳＡ抗原）でコーティングする。測定すべき試験溶液中のｈｕＫＳ−ＩＬ２分子は、その抗体成分を介して、該抗原と結合し、したがって、マイクロタイターへ固着される。ビオチン化抗ＩＬ２抗血清を添加すると、固着されたｈｕＫＳ−ＩＬ２分子のＩＬ２部分と、該抗ＩＬ２抗体は反応する。マイクロタイタープレートを洗浄することにより、過剰の抗ＩＬ２分子を除去する。添加されるストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体は、ビオチンを介して結合し、後のステップにおいて、添加されるロイコ形（ｌｅｕｋｏ ｆｏｒｍ）の色素テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）を酸化して、青色の色素を与える。所定の時間経過後、リン酸の添加により酸化反応を停止する。溶液は、黄色を呈すし、これを波長４５０ｎｍで定量することができる。その際、タンパク質試験溶液の濃度は、この波長で測定される吸光度と比例する。

結果：
表１および表２（バッチ８０２０および８０２１）中の結果は、調製された製剤の品質および安定性を明確に検証している。４０℃、相対大気湿度（ｒ．ｈ．）７５％の気候条件を、様々な処方における、安定性の差を迅速に得るための過負荷条件として選択した。驚くべきことに、上記の製剤は、高い保存温度および高い大気湿度（４０℃／７５％ｒ．ｈ．）下においても、＞６カ月の期間にわたり安定であった。対応する対比製剤１（表３、バッチ８００８、実施例５）では、二糖類（スクロースまたはマルトース）の代わりに、賦形剤として、糖アルコールである、マンニトールを使用しているが、対応する過負荷条件下では、４週間経過後には、既に凝集していた。室温（２５℃、６０％ｒ．ｈ．）において、２６週間保管した後、対応する気候パターンと同様に、可視的な凝集体が拡がっていた。すなわち、対比製剤１は、本発明にかかる製剤とは対照的に、冷却しつつ、保存することしかできない。

実施例４の製剤（バッチ８５９１）は、本発明にかかる製剤の優れた安定性を示す別な例であり、また、該製剤は、高いタンパク質濃度にも適用可能であることを示している（表４を参照）。この製剤は、４０℃（７５％ｒ．ｈ．）の温度で、１４週間の期間にわたり保存された。

別の一連の実験では、本発明にかかる製剤中の助剤の全てが、実際に、安定化に必要であるかを試験した。実験バッチ８４３１は、本発明にかかる製剤の全ての構成成分を含んでいるが、対比製剤では、個々の成分を欠いていた。
−実施例３の製剤（バッチ８４３１）：全ての成分が存在する
−対比製剤２（実施例６、バッチ８４３４）：アルギニンは添加されていない
−対比製剤３（実施例７、バッチ８４３０）：Ｔｗｅｅｎ ８０は添加されていない
−対比製剤４（実施例８、バッチ８４２９）：Ｔｗｅｅｎ ８０ならびにアルギニンは添加されていない
図１に示す結果は、該アミノ酸の添加は、本発明にかかる製剤の安定性には絶対に必要であることを明確に検証している。この図によると、一見、Ｔｗｅｅｎ ８０の添加は、必要ではないようであるが、このことは、事実と完全には一致してはいない。特に、可視的な凝集体の形成を防止するためには、活性成分溶液の調製に際し、タンパク質精製の間という早い段階で、Ｔｗｅｅｎ ８０が添加される。ここで使用するＴｗｅｅｎ ８０の濃度は、臨界ミセル濃度（Ｔｗｅｅｎ ８０のＣＭＣは０．００１％）よりも高い。該一連の実験の場合、所謂、タンジェンシャル・フロー濾過法によりアルギニンおよびＴｗｅｅｎの両者を除くことを試みた。ここでは、５０ｋＤのメンブレンによる透析濾過を利用して、バッファ交換が行われた。しかし、Ｔｗｅｅｎ ８０のミセルは、ある場合には、膜の除去範囲を超えており、従って、完全には除去されてはない。

本発明にかかる製剤へのＴｗｅｅｎ ８０の添加は、別の研究により確認されているように、該凍結乾燥物の再溶解および再生の結果得られる溶液の安定性のためには、絶対に必要である。ここでは、Ｔｗｅｅｎ ８０を含んでいるＥＭＤ ２７３０６６（ｈｕＫＳ−ＩＬ２）活性成分溶液から出発して、タンパク質Ａカラムによるアフィニティ・クロマトグラフィーにより助剤Ｔｗｅｅｎ ８０を分離・除去した。得られるＴｗｅｅｎ ８０を含まない溶液に、Ｔｗｅｅｎ ８０を漸増量で添加した。得られる製剤は、２ｍｌのバイアル中で、実験室用シェーカを用いて、２５℃で２１日間の負荷を荷した。該負荷を荷した製剤は、毎日目視的にチェックされ、また、ある時点におけるタンパク質含量について、光学的に分析された。この試験の結果を図２に示す。Ｔｗｅｅｎ ８０を添加していない製剤の場合、僅か１日後ですら軽度の濁度が認められ、時間経過と共にそれは目に見えて増加していった。図に示すように、２１日後に、含量の少なからずの低下が認められた。

実施例３の本発明にかかる製剤（バッチ８４３１）および対応する対比製剤の４０℃／７５％ｒ．ｈ．における安定性の評価結果を示すグラフである。 本発明にかかる製剤の安定性に対するＴｗｅｅｎ８０の影響を検証する結果を示すグラフである。

Claims (15)

1. 免疫サイトカイン、糖、アミノ酸、緩衝剤および界面活性剤を含んでなる、免疫サイトカインの凍結乾燥医薬製剤であって、
   該免疫サイトカインは、サイトカイン要素として、インターロイキン２（ＩＬ−２）を含んでいる免疫サイトカインであり；
   該緩衝剤は、該凍結乾燥物を水によって再溶解することによって得られる水性溶液に対して、６〜７のｐＨを付与するように、調整されている緩衝剤の群から選択され；
   該糖は、スクロース、ラクトース、マルトースおよびトレハロースからなる群から選択され；
   該アミノ酸は、アルギニン、リシン、オルニチンからなる群から選択され；
   該界面活性剤は、ポリソルベート類からなる群から選択される
   ことを特徴とする、凍結乾燥医薬製剤。
2. さらに等張剤が、再生される溶液中において、等張性を確立するのに必要な量で存在しており；
   該等張剤は、生理学的に耐容性の塩からなる群から選択される
   ことを特徴とする、請求項１に記載の凍結乾燥医薬製剤。
3. 該凍結乾燥医薬製剤は、免疫サイトカイン、糖、アミノ酸、緩衝剤、界面活性剤および等張剤からなり、
   該等張剤は、生理学的に耐容性の塩からなる群から選択され；
   該等張剤が、再生される溶液中において、等張性を確立するのに必要な量で存在している
   ことを特徴とする、請求項１に記載の凍結乾燥医薬製剤。
4. 該糖は、スクロースおよびマルトースからなる群から選択される
   ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
5. 該アミノ酸は、その無機塩の形態で含有されている
   ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
6. 該界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートまたはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートである
   ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
7. 該界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートである
   ことを特徴とする、請求項６に記載の凍結乾燥医薬製剤。
8. 該製剤中に含有されている、該界面活性剤の量は、再生される溶液に基づいて、０．００５〜０．５質量％の範囲に選択されている
   ことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
9. 該等張剤は、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムである
   ことを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
10. 含有されている該免疫サイトカインの濃度は、再生される溶液に基づいて、１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲に選択される
    ことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
11. 含有されている該糖の濃度は、再生される溶液に基づいて、１５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲に選択される
    ことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
12. 含有されている該アミノ酸の濃度は、再生される溶液に基づいて、４０〜１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲に選択される
    ことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥医薬製剤。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の凍結乾燥物を水性溶媒によって再溶解することによって得られる免疫サイトカインの水性医薬製剤。
14. 該溶液は、６〜７のｐＨを有する
    ことを特徴とする、請求項１３に記載の水性医薬製剤。
15. 請求項１に記載の凍結乾燥医薬製剤を調製する方法であって、
    前記免疫サイトカイン、糖、アミノ酸、緩衝剤、界面活性剤ならびに、必要に応じて、さらなる医薬助剤をも含んでなる水性製剤を調製し、そして、該溶液を凍結乾燥させる
    ことを特徴とする、凍結乾燥医薬製剤の調製方法。

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