JP4406286B2 - 油料種子蛋白質単離物の連続製造方法 - Google Patents

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この出願は、３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づいて、２００１年１１月２０日出願の米国特許暫定出願番号６０／３３１，６４６及び２００２年５月３０日出願の６０／３８３，８０９からの優先権を主張する。

本発明は油料種子蛋白質単離物を製造するための改良方法に関する。

本譲り受け人に譲渡され、その開示がここに参考文献として組み込まれている米国特許番号５，８４４，０８６及び６，００５，０７６（“Ｍｕｒｒａｙ II”）に、相当量の脂肪分を有するオイルシードミール（油料種子粕）、そのような脂肪含量を有するカノーラ油料種子粕を含む、から蛋白質単離物の単離のための方法が記載されている。この方法に含まれる工程には、粕中の脂肪も可溶化する油料種子粕からの蛋白質物質の可溶化と、得られた蛋白質水溶液からの脂肪の除去を含む。蛋白質水溶液は、脂肪除去工程の前又は後に残渣油料種子粕と分離できる。脱脂蛋白質溶液は次いで、イオン強度を事実上一定に維持しながら濃縮されて蛋白質濃度が増加し、その後濃縮された蛋白質溶液はさらに脱脂工程にかけられる。次いで濃縮された蛋白質溶液はばらばらの蛋白質滴がミセル状に高度に凝集した蛋白質分子の雲のような集塊物が形成されるように稀釈される。この蛋白質ミセルは沈澱して凝集し、合体した、高密度無定形の、粘結性グルテン様の蛋白質単離物密集体、蛋白質ミセル集塊物又はＰＭＭと呼ばれる、を形成し、残留水溶相と分離されて乾燥される。

蛋白質単離物は、乾燥重量基準で、（ケルダールＮ×６．２５によって測定して）少くとも約９０重量％の蛋白質含量を有し、実質的に未変性であり（走査式示差熱量計で測定して）、残留脂肪分が少ない。ここで使用する蛋白質含量という用語は、乾燥物重量基準で表わされた蛋白質単離物中の蛋白質の量に関する。この方法を使用して得られる蛋白質単離物の収率は、乾燥した蛋白質単離物として回収される油料種子粕から抽出された蛋白質の割合で、一般に４０重量％未満、通常２０重量％程度であった。

前述の特許に記載の方法は、米国特許４，２０８，３２３（Ｍｕｒｒａｙ ＩＢ）に説明されているように、油料種子を含む多種類の蛋白質原料物質から蛋白質単離物を生成させる方法に対する変形と改良の方法として開発された。米国特許４，２０８，３２３が公告された１９８０年に利用可能な油料種子粕にはカノーラ油料種子粕のレベルの油脂含量のコンタミされたものがなかったので、米国特許４，２０８，３２３の方法は、Ｍｕｒｒａｙ IIの方法にしたがって処理される現行の油料種子粕から９０％を超える蛋白質含量を有する蛋白物質を製造することはできない。出発原料として菜種（カノーラ）粕を使用して行った特別な実験についての記述は米国特許４，２０８，３０３にはない。

米国特許４，２０８，３２３それ自体、ＰＭＭを生成させるための稀釈前に濃縮工程を導入することによって、米国特許４，１６９，０９０及び４，２８５，８６２（Ｍｕｒｒａｙ ＩＡ）に記載の方法の改良を企図したものであった。この濃縮工程はＭｕｒｒａｙ ＩＡ法の蛋白質単離物の収率を約２０重量％から改善させるのに役立った。

米国特許同時係属出願番号６０／２８８，４１５（２００１年５月４日出願）、６０／３２６，９８７（２００１年１０月５日出願）、６０／３３１，０６６（２００１年１１月７日出願）、６０／３３３，４９４（２００１年１１月２６日出願）、６０／３７４，８０１（２００２年４月２４日出願）、及び１０／１３３，３９１（２００２年５月３日出願）（これらは皆本譲受人に譲渡され、その開示は本明細書に組み込まれる）には、これらが、蛋白質分離物として回収される、油料種子から抽出された蛋白質の割合という観点で乾燥分離製品蛋白質の収量を改善するためと、通常ケルダール窒素（Ｎ）の転換率Ｎ×６．２５で少くとも約１００重量％の高純度蛋白質分離物を得るために油料種子に使用されるので、従来技術の蛋白質分離方法へのさらなる改善が記載されている。ここで用いられるように、蛋白質含有量は乾燥物基準で決められる。この操作はカノーラ蛋白質単離物の製造に特に適用される。

前述の米国特許出願番号６０／２８８，４１５、６０／３２６，９８７、６０／３３１，０６６、６０／３３３，４９４、６０／３７４，８０１及び１０／１３７，３９１に記載の方法では、油料種子粕は食品級の塩水溶液で抽出される。得られた蛋白質抽出溶液は、最初に、もし望ましければ着色吸着剤で処理後、蛋白質含量が約２００ｇ／Ｌを超える濃縮蛋白質溶液を得るよう、限外濾過膜を使用して量が減らされる。この濃縮蛋白質溶液は次いで冷水中に稀釈されて白い雲状の蛋白質ミセルを生じ、このものは分離することができる。上澄液を除去後、沈澱物した粘着性の集塊物（ＰＭＭ）が乾燥される。

上述方法の一実施態様及び出願番号６０／３２６，９８７、６０／３３１，０６６，６０／３３３，４９４、６０／３７４，８０１及び１０／１３７，３９１に特に説明されているように、ＰＭＭ沈降工程からの上澄液は、湿潤ＰＭＭと上澄液から乾燥蛋白質を含む蛋白質単離物を分離するために処理される。この方法は、最初に限外濾過膜を使用して上澄液を濃縮し、濃縮した上澄液を湿潤ＰＭＭと混合後、この混合物を乾燥することによって実施される。得られるカノーラ蛋白質単離物は少くとも約９０重量％、好ましくは少くとも約１００重量％の高純度蛋白質（Ｎ×６．２５）を有する。

上述方法の他の実施態様及び特に出願番号６０／３３１，０６６，６０／３３３，４９４、６０／３７４，８０１及び１０／１３７，３９１に記載されているように、ＰＭＭ沈降工程からの上澄液は、上澄液から蛋白質を回収するため処理される。この方法は最初に限外濾過膜を使用して上澄液を濃縮し、次いで濃縮物を乾燥することによって実施できる。得られるカノーラ蛋白質単離物は少くとも約９０重量％、好ましくは約１００重量％の高純度蛋白質（Ｎ×６．２５）を有する。

米国特許同時係属出願番号６０／３３９，３５０（２００１年１２月１３日出願）、及び６０／３９１，０４６（２００２年６月２５日出願）（これらは本譲受人に譲渡され、その開示が本明細書に組み込まれる）には、約１００℃又は１００℃未満の温度で脱溶媒した粕を使用することによってカノーラ油料種子粕から多量の蛋白質が得られる方法が記載されている。そのような粕はこの発明方法の出発原料とすることができる。

米国特許係属出願番号６０／４０１，７８２（２００２年８月８日出願）（本譲受人に譲渡され、開示が引用文献として本明細書に組み込まれる）に、残渣量の油を除去するためのカノーラ油料種子溶媒抽出からの残渣粕（一般に“ホワイトフレーク”又はあまり一般的ではないが“マルク”粕として知られる）からカノーラ蛋白質単離物の回収について記載されている。上記のような粕は本発明方法の出発原料として使用できる。

さて油料種子蛋白質単離物の生成方法が連続法で実施されると、著しく有利であることがわかった。抽出工程が上述の特許や特許出願で記述されたバッチ方法ではなく連続式で実施される場合は、同じかあるいはより高レベルの蛋白質抽出に対しても当初の蛋白質抽出時間を著しく減少させることができ、抽出工程でより高い温度が使用できる。さらに、連続運転では汚染の機会が少なく、高い製品品質が得られ、この方法がよりコンパクトな装置で実施できる。

ここに開示する連続操作法はＭｕｒｒａｙＩ及びIIの特許に記載の濃度及び稀釈条件を使用して用いることができるが、好ましくは、上記記載のために、ここに記載の連続運転は上述の米国特許出願番号６０／２８８，４１５、６０／３２６，９８７、６０／３３１，０６６、６０／３３３，４９４、６０／３７４，８０１及び１０／１３７，３９１に説明されている濃度と稀釈条件の下で実施される。

本発明にしたがって、以下の（ａ）〜（ｇ）を含む蛋白質単離物の製造方法が提供される：
（ａ）油料種子粕中の蛋白質の可溶化を起させるためと、ｐＨが約５〜約６．８の蛋白質水溶液を生成させるため、少くとも約５℃の温度で油料種子粕を連続的に抽出し、
（ｂ）残渣油料種子粕から蛋白質水溶液を連続的に分離し、
（ｃ）蛋白質水溶液を、選択性膜操作に連続的に通過させて、濃縮蛋白水溶液を得るためイオン強度を実質的に一定に保ちながら蛋白質水溶液の蛋白質濃度を少くとも約５０ｇ／Ｌに増加させ、
（ｄ）濃縮した蛋白質溶液を約１５℃未満の温度の冷水と連続的に混合して水相中に蛋白質ミセルを形成させ、
（ｅ）得られた混合物を上澄液を沈降槽を溢流させながら該槽中に連続的に流入させ、
（ｆ）沈降槽から上澄液の溢流を続けながら、所望量の無定形の、粘着性のある、ゼラチン状の、グルテン様のミセル集塊物が沈降槽中に蓄積するまで蛋白質ミセルを連続的に沈降させ、
（ｇ）蛋白質ミセル集塊物蛋白質ミセル集塊物はケルダール窒素×６．２５として測定して少くとも約９０重量％、好ましくは少くとも約１００重量％の蛋白質含量を有する、を沈降槽から回収する。

蛋白質ミセル集塊物の形の蛋白質単離物製品は本明細書ではグルテン様として記載されている。この記載は単離物の外観と感触が小麦グルテンのそれに類似していることを示そうとするものであり、グルテンに対する化学的同一性を示そうとするものではない。

この方法の一実施態様では、沈降工程からの上澄液はバッチ、セミ連続的又は連続式で濃縮され、さらに得られた濃縮上澄液が乾燥されて蛋白質含量が乾燥重量基準で少くとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）の蛋白質単離物を提供する。

この方法の他の実施態様では、沈降工程からの上澄液がバッチ式、セミ連続式、又は連続式で濃縮され、得られた濃縮上澄液が乾燥前に蛋白質ミセル集塊物と混合され、さらに得られた混合物が乾燥されて、乾燥重量基準で蛋白質含量が少くとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）を有する蛋白質単離物を提供する。

本発明のさらに別の実施態様では、上記工程からの上澄液はバッチ式、セミ連続式、又は連続式で濃縮され、得られた濃縮上澄液の一部分のみが蛋白質ミセル集塊物の少くとも一部分と乾燥前に混合され、蛋白質含量が乾燥重量基準で少くとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）の本発明にしたがう別の新規な蛋白質単離物が提供される。

本明細書の方法にしたがって製造された蛋白質単離物は、加工食品の蛋白質強化、油脂の乳化、焼いた食品中の本体形成材及びガスを閉じ込める製品中の発泡剤など、蛋白質単離物の通常の応用分野で使用できる。さらに、蛋白質単離物を肉類似物に使用できる蛋白繊維に形成し、卵白をバインダーとして使用する食料製品中に卵白代用物又は増量剤として使用できる。カノーラ蛋白質単離物は営養補助食品としても使用できる。カノーラ蛋白質単離物の他の用途は、ペットフード、動物の飼料、産業及び化粧用途、及びパーソナルケア製品にある。

この発明方法の最初の工程は、大豆、従来の菜種、従来の亜麻、リノーラ、ひまわりやマスタード油料種子粕など他の油料種子粕にも適用できるが、油料種子粕、特にカノーラ粕から蛋白性物質を可溶化することを含む。本発明は本明細書中で、低温脱溶媒粕であるカノーラ種子粕についてより詳しく説明される。

カノーラ種子粕から回収される蛋白性物質はカノーラシード又は他の油料種子中に天然に存在する蛋白質でもよく、又は、その蛋白質性物質が遺伝子操作で改変されているが天然の蛋白質に特有な疎水性と極性の性質を有する蛋白質でもよい。カノーラ粕は、例えば、高温ヘキサン抽出又は低温油押出し法で得られる、さまざまなレベルの非変性蛋白質を有するカノーラシードからカノーラ油を除去して得られる任意のカノーラ粕でよい。カノーラ油料種子はまた、菜種又は油料種子菜種として知られている。

蛋白質可溶化には塩溶液が用いられる。塩は通常塩化ナトリウムであるけれども、塩化カリのような蛋白質抽出に適する他の塩も使用できる。塩溶液は、蛋白質の相当量の可溶化を可能にするため、少くとも約０．１０、好ましくは少くとも約０．１５のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加すると原料物質中の蛋白質の可溶化度は最初最高値に達するまでは増大する。その後続いてイオン強度を増加させても可溶化される蛋白質の総量は増加しない。蛋白質可溶化を最大にする食品級塩溶液のイオン強度は、関係する塩及び選択する蛋白質のソースによって異なる。

イオン強度が増加するにつれて蛋白質の沈澱に必要な稀釈度が大きくなることを考慮して、通常、イオン強度の値が約０．８未満、より好ましくは約０．１５〜約０．６の値が利用される。

塩可溶化工程は、一般に約１０分までの時間で速やかに実施され、好ましくは高い総括製品収率を得るため、原料物質から可能な限り多くの蛋白質を抽出する可溶化を実施する。可溶化は高温、好ましくは約３５℃を超え、一般に約６５℃までの温度で実施される。

塩水溶液及び油料種子粕は、以下に詳しく説明するように蛋白質単離物がミセル経路で形成可能にするため約５〜約６．８のナチュラルｐＨを有する。蛋白質単離物の最大収率のための最適ｐＨ値は選択したソース物質によって左右される。

ｐＨ範囲の限界点及びその付近では、蛋白質単離物の形成は、ミセルルートにより部分的にのみ、かつ、ｐＨ範囲内の他点で達成できるよりも低収率で起る。これらの理由により、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。

塩溶液のｐＨは抽出工程で使用するため、必要に応じて、任意の好都合な酸、通常は塩酸、又はアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを用いて、約５〜約６．８の範囲内の任意の所望値に調節できる。

可溶化工程中の塩溶液中の蛋白質ソース物質の濃度は広範に変えることができる。典型的な濃度の値は約５〜約１５％ｗ／ｖ（重量／容積）である。

塩水溶液による蛋白質抽出工程はカノーラ粕中に存在しうる脂肪を可溶化する付加的効果を有し、その結果脂肪分が水溶相中に存在するに至る。

抽出工程から得られる蛋白質溶液は、一般に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌの蛋白質濃度を有する。

油料種子粕から蛋白質の抽出は、油料種子粕と食品級の塩溶液との混合物を、ある一定長さの導管中を上述のパラメータにしたがって望ましい抽出を実施するのに十分な滞留時間を与える流速で通過させる、などの油料種子粕から蛋白質の連続抽出を実施するのに適する任意の便利な方法によって実行される。

別の方法として、油料種子粕と塩溶液の混合物を攪拌槽中に連続的に供給し、蛋白質水溶液を連続的に除去する攪拌槽中で抽出を行うこともできる。さらにこの方法は、油料種子粕と塩溶液の混合物を第１の攪拌容器中に供給し、この容器中で抽出が行われて蛋白質水溶液が生成し、一方蛋白質水溶液は第２の攪拌容器から以下に記載の残渣粕分離工程に連続的に供給される、連続法に相当するセミ−連続式で実施できる。第１の容器中で蛋白質水溶液が生成し、第２の容器で蛋白質水溶液が枯渇したら、次には第１の容器が第１の容器となり、逆も同じである。

抽出工程から得られる水溶相は、次いで、真空濾過を採用するなど、都合のよい任意の方法で、残渣カノーラ粕から分離し、続いて遠心分離、及び／又は濾過によって残渣粕と分離される。分離された残渣粕は廃棄するため乾燥されることもある。

最終の蛋白質単離物の色は、粉末活性炭又は他の色素吸着剤と分離した蛋白質水溶液とを混合後、好都合には濾過によって吸着剤を除去して蛋白質溶液を得ることによって明るい色ではあるがあまり強くない黄色に改善できる。分離された蛋白質水溶液のダイアフィルトレーションもまた色素の除去に使用できる。

そのような色素除去工程は、一般に分離蛋白質溶液の大気温度で、任意の適切な色素吸着剤を用いて、任意の好都合な条件の下で行うことができる。粉末活性炭では、約０．０２５〜約５ｗ／ｖ、好ましくは０．０５〜約２ｗ／ｖの量が用いられる。

本譲受人に譲渡され、開示が本明細書に取り込まれる、米国特許５，８４４，００６及び６，００５，０７６に記載されているように、カノーラ種子粕が相当量の脂肪を含んでいる場合は、分離した蛋白質水溶液及び濃縮した蛋白質水溶液について上記特許に記載された脱脂肪工程が実施される。色の改善工程が実施される場合はこの工程は最初の脱脂工程後に行われる。

油料種子粕を塩水溶液で抽出するに代りに、水のみを使用して抽出することもできる。ただし、水のみ使用の場合は塩水溶液使用の場合よりも蛋白質の抽出量が少ない傾向がある。このような代替法が用いられる場合は、濃縮工程の間蛋白質を溶液中に保持するため、上に議論した濃度の塩が残渣油料種子粕から分離後の蛋白質溶液に加えられる。色の除去工程及び／又は最初の脱脂工程が行われる場合は、塩は一般にそのような操作の完了後に加えられる。

他の代替法は、ｐＨ約６．８を越え、一般に約９．９までの比較的高いｐＨ値の塩水溶液で油料種子粕を抽出する方法である。塩水溶液のｐＨは、任意に好都合なアルカリ、例えば水酸化ナトリウム水溶液の使用によりアルカリ性のｐＨに調節することができる。別法として、油料種子粕は、ｐＨが約５未満、一般にｐＨが約３までの比較的低いｐＨ値の塩溶液で抽出することができる。塩溶液のｐＨは、塩酸などの任意に好都合な酸の使用によって酸性の値に調節することができる。そのような代替法が使用される場合は、油料種子粕抽出工程からの水溶相が、次いで、真空濾過を使用するなど、好都合な任意の方法で残渣カノーラ粕から分離され、続いて遠心分離及び／又は濾過によって残渣粕が分離される。分離された残渣粕は廃棄するために乾燥することができる。

高ｐＨ又は低ｐＨ抽出工程からの蛋白質水溶液は、次いで以下に述べるようにさらに処理する前に、上に検討したように約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２の範囲のｐＨに調節される。このようなｐＨ調節は、塩酸などの任意の好都合な酸、又は水酸化ナトリウムなどのアルカリを使用して行うことができる。

蛋白質水溶液は次いでそのイオン強度を実質的一定に維持しながら濃縮されてその蛋白質濃度を増加させる。そのような濃縮は、蛋白質濃度が少くとも約５０ｇ／Ｌの濃厚蛋白質溶液を提供するように実施される。前述の米国特許出願番号６０／２８８，４１５、６０／３２６，９８７、６０／３３１，０６６、６０／３３３，４９４、６０／３７４，８０１及び１０／１３７，３９１に記載のように、蛋白質単離物を向上した収率で得るため、上記濃縮は、好ましくは蛋白質濃度が少くとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少くとも２５０ｇ／Ｌの濃厚蛋白質溶液を提供するように実施される。

濃縮工程は、種々の膜材料及び構造を考慮し、蛋白質水溶液が膜を通過する際所望の濃縮度が得られるようなジメンションにした、約３，０００〜約５，０００ダルトンなど、適当な分子量カットオフを有する、中空繊維膜又はスパイラル膜などの膜類を使用する限外濾過など、任意の好都合な選択性膜技術を使用するなどの、連続操作に適する任意の好都合な方法で実施できる。

濃縮工程は、任意の好都合な温度、一般に約２０〜約６０℃で、所望の濃縮度が得られる時間の間実施される。使用する温度及び他の条件は、ある程度、濃縮を実施するのに使用される膜装置及び溶液の所望蛋白質濃度に左右される。

周知のように、限外濾過及び類似の選択性膜技術は、低分子量の種は膜を通して通過させるが、高分子量種のものは通過させない。低分子量の種にはイオン性の食品級塩のみならず、炭水化物、色素、及び抗栄養因子などの原料物質から抽出された低分子量物質ならびに任意の低分子量型の蛋白質が含まれる。膜の分子量カットオフは、通常、汚染物を通過させる一方、溶液中の蛋白質のかなりの部分を保持できるように、さまざまな膜材料及び構造を考慮して選択される。

濃縮が実施されて蛋白質含量が少くとも約２００ｇ／Ｌ、好ましくは少くとも約２５０ｇ／Ｌの濃厚蛋白質水溶液が得られたなら、濃縮工程に使用した温度によって、濃厚蛋白質溶液の粘度を低下させて後続の稀釈工程とミセル形成を容易にするため、蛋白質溶液は約２０°〜約６０℃、好ましくは約２５°〜約３５℃の温度に加温される。この濃縮蛋白質溶液は、冷水中に稀釈の際にその温度を超えるとミセルの形成が可能でなくなる温度を超えて加熱されてはならない。

濃縮された蛋白質溶液は、必要なら、前述の米国特許５，８４４，００６及び６，００５，０７６に記載されているように、さらに脱脂操作にかけてもよい。

濃縮工程とオプションの脱脂工程から得られる濃厚蛋白質溶液は、次いでこの蛋白質溶液を所望の稀釈を達成するのに必要な容量を有する冷水と混合することによって稀釈され、ミセルが形成される。ミセルルートによって得られるのが望ましい蛋白質の比率と上澄液からの比率によって稀釈度が変る。高レベルの稀釈では、一般にカノーラ蛋白質の大部分が水溶相中に残留する。蛋白質の大部分をミセルルートで得ることが望ましい場合は、濃縮蛋白質溶液は約１５倍未満、より好ましくは約１０倍以下に稀釈される。

稀釈操作は、パイプ中で混合を可能にするＴ−型パイプの一方の入口に濃縮蛋白質溶液を連続的に通過させ、一方稀釈水はＴ−型パイプの他方の入口に連続的に供給することによって実施される。稀釈水は所望の稀釈度を達成するのに十分な割合でＴ−型パイプに供給される。蛋白質ミセルの形の蛋白質単離物の収率改善が、使用する稀釈要因でこれらのより冷たい温度で達せられるので、稀釈水の温度は約１５℃未満、一般には約３°〜約１５℃まで、好ましくは約１０℃未満である。

濃縮蛋白質溶液と稀釈水のパイプ中での混合により蛋白質ミセルの生成が始まり、次いで混合物はＴ−型パイプの出口から連続的に沈降容器中に供給され、この容器が満杯になると上澄液がオーバーフローする。この沈降槽は最初冷水が一杯に入れられ、パイプの出口から流入する前記混合物によって徐々に置換される。

混合物は液本体内の乱れを最小にするような方法で沈降槽の液本体中に供給され、ミセルの適切な沈降を可能にする。この結果を実現するため、混合物は通常沈降槽中の液本体表面下部にあるＴ−型のパイプの出口から供給される。さらに、この出口は、液がパイプから沈降槽の上部で半径方向に流出するような形に構成される。

蛋白質ミセルは沈降槽中で沈降して凝集、合体した高密度の無定形グルテン様蛋白質ミセル集塊物（ＰＭＭ）を形成するが、この進行は沈降槽の底部に希望量のＰＭＭが蓄積するまで続けられ、その後蓄積ＰＭＭが沈降槽から分離される。蓄積したＰＭＭを沈降槽から分離する前に、この蛋白質ミセル集塊物を遠心分離にかけて集塊物の液含量を減らすことができる。遠心分離は、蛋白質ミセル集塊物の湿分を約７０〜約９５重量％から一般に約５０〜約８０重量％（ミセル集塊物の総量をベースとして）の値に減らすことができる。この方法による蛋白質ミセル集塊物の水分を減少させることは、蛋白質ミセル集塊物の吸蔵した塩含量、したがって乾燥分離物の塩含量をも減少させる。代案として、沈降工程を連続遠心分離下で実施することができる。

回収されたＰＭＭは水分を含む状態で使用されるか、あるいは噴霧乾燥、凍結乾燥又は真空ドラム乾燥などの任意の便利な方法によって乾燥形態に乾燥することができる。乾燥ＰＭＭは少くとも約９０重量％、通常約１００重量％超の蛋白質（ケルダールＮ×６．２５として計算して）の高蛋白質含量を有する（示差走査熱量測定法で測定して）。脂肪油種子粕から単離される乾燥ＰＭＭも、前述した米国特許５，８４４，０８６及び６，００５，０２６の方法を使用するときは、約１重量％より少ない低い残留脂肪含量を有する。

前述の米国特許出願番号６０／３３１，０６６、６０／３３３，４９４、６０／３７４，８０１、及び１０／１３７，３９１に詳しく記載されているように、ＰＭＭ生成工程からの上澄液はさらに蛋白質を回収するために処理される。この方法は最初に上澄液を濃縮することを含む。そのような濃縮は、限外濾過などの任意で好都合の選択性膜技術を使用して溶液中のカノーラ蛋白質を保持しながら、塩、及び蛋白質原料物質から抽出される非蛋白質性低分子量物質を含む低分子量種が膜を通過できる、適切な分子量カットオフ膜を使用して、実施される。さまざまな膜材料と構造を考慮し、約３，０００〜約１０，０００の分子量カットを有する限外濾過膜を使用できる。濃縮は、希望するならオーバーフローする上澄液を集めた量についてバッチ処理法を用いることができるが、好ましくは連続的にオーバーフローする上澄液について連続的に実施される。このような連続操作では、膜は、上澄液が膜を通過の際上澄液の所望の濃縮度が得られるように寸法が決められる。

この方法での上澄液の濃縮はまた、蛋白質単離物を回収するため乾燥する必要のある液量、したがって乾燥に必要なエネルギーを減少させる。乾燥に先立って、上澄液は一般に蛋白質濃度が約１００〜約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌになるまで濃縮される。

濃縮された上澄液は、噴霧乾燥、凍結乾燥、又は真空ドラム乾燥などの任意の好便な方法で乾燥物に乾燥されて、蛋白質濃度が少くとも９０重量％、好ましくは少くとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）で、実質的に変性されていない（示差走査熱量測定法で測定して）カノーラ蛋白質単離物をさらに提供することができる。

あるいはまた、前述の米国特許出願番号６０／３２６，９８７、６０／３３１，０６６、６０／３３３，４９４、６０／３７４，８０１及び１０／１３７，３９１に記載のように、濃縮された上澄液が湿潤ＰＭＭと混合され、得られた混合物が乾燥されて、蛋白質含量が約９０重量％以上、好ましくは約１００重量％以上（Ｎ×６．２５）であって実質的に変性されていない（走査式示差熱量測定法で測定して）カノーラ蛋白質単離物をさらに提供することができる。

濃縮上澄液の一部分のみがＰＭＭの一部のみと混合され、得られた混合物が乾燥される別の代替法では、濃縮上澄液の残留物は任意のＰＭＭ残留物と同様にして乾燥される。さらに、乾燥されたＰＭＭと乾燥された上澄液も、前に検討したように、任意の所望比率で乾式混合できる。

図１を参照すると、本発明の一実施態様のフローシートが概略説明されている。カノーラ油料種子粕と水性抽出媒体がそれぞれライン１０及び１２によってブレンダー１４に供給され、ここで油料種子粕と水性抽出媒体が混合され、混合物はライン１６によってミキシングパイプ１８に通される。この混合パイプ１８で、油料種子粕が抽出されて蛋白質水溶液が生成する。蛋白質水溶液と残渣油料種子粕とのスラリーが、ライン２０によって残渣油料種子粕分離用の真空濾過ベルト２２に通され、残渣粕はライン２４によって除去される。蛋白質水溶液は次いでライン２６によって清澄化操作部２８に通され、ここで蛋白質水溶液が遠心分離され濾過されて微細物が除去され、微細物はライン３０によって回収される。

清澄化された蛋白質水溶液は、透過液がライン３８によって回収されているとともに、ライン３６中の濃縮物としての濃縮蛋白質溶液を生成させるため、蛋白質水溶液の所望濃縮度を与える大きさにした限外濾過膜３４にライン３２によってポンプで送られる。濃縮蛋白質水溶液はミキシングティー４０の入口に通され、一方、冷水は所望の稀釈度を達成するのに十分な量でライン４２によってミキシングティーに供給されている。得られた溶液はライン４４によって沈降タンク４６に供給され、蛋白質ミセル集塊物が沈降する。沈降容器４６に沈降した蛋白質ミセル集塊物は時々ライン４８によって除去され、噴霧乾燥機５０を通って乾燥カノーラ蛋白質単離物５２が得られる。

沈降タンクからの上澄液はライン５４によって移動され、限外濾過膜５６にポンプで送られて濃縮物としての濃縮蛋白液が製造され（ライン５８）、一方透過液はライン６０によって除去されている。この濃縮蛋白質溶液は噴霧乾燥機６２に通され、乾燥カノーラ蛋白質単離物６４がさらに提供される。

別法として、ライン５８の濃縮蛋白質溶液をライン６６を通して蛋白質ミセル集塊物と混合後、噴霧乾燥機５０で乾燥することができる。

実 施 例
実施例１：
この実施例は本発明の一実施態様にしたがってカノーラ蛋白質単離物製造のための連続方法を説明する。

２００ｇのカノーラ粕を５０℃で０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液１３５０ｍｌ（１５％ｗ／ｖ）に加えた。得られた混合物を、管中で混合物の全滞留時間５分を与えるに十分な長さの管に通した。管を去る抽出物の分析は２０．５ｇ／Ｌの蛋白質含量を示した。対照の目的で、バッチ方式では、カノーラ粕の１５ｗ／ｖ％溶液の塩可溶化（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）により、２４℃で３０分間の混合後の蛋白質含量は１８．３ｇ／Ｌとなった（ランＢＷ−ＡＨ０１４−Ｈ２９−０１Ａ）。

実施例２に説明したようにして蛋白質含量が２９６ｇ／Ｌの濃縮物８リットルがバッチ方式で製造された（ＢＷ−ＡＨ０１４−Ｈ２９−０１Ａ参照）。３０℃の温度の濃縮物がＴ−型連結パイプの一方の入口に６４ｍＬ／分の速度でポンプで送られ、１：１０の稀釈比にする流速でＴ−型連結パイプの他方の入口にポンプで送られた４℃の水と混合された。Ｔ−型コネクタは前記２つの流れを混合して蛋白質ミセルの白い雲状物生成させる装置として役立った。次いでこの混合物はＴ−型連結パイプの出口から４℃の水で満たされた５０リットル容量の沈降槽中に通され、ここで混合物は、沈降容器内の乱れを最小にするように設計された出口を通ってパイプを出た。上澄液は沈降槽内の量を一定に保ちながら沈降槽の頂部から除かれた。このシステムを２時間運転した。

濃縮物／水混合物が沈降槽に流入すると、ミセルと上澄液の間に境界層が形成し始めた。この層は最初の時間槽中で上方に移動し、その後沈降し始めた。同時に、沈澱した、粘着性の集塊物（ＰＭＭ）の層が沈降槽の底部に見られた。運転が進行するにつれ、ＰＭＭ層の嵩が着実に生成した。沈降するミセルと上澄液間の境界層は濃縮物／水の出口と概略同じレベルに落着いた。沈降槽を去る上澄液は透明であり、除去されている上澄液中にミセルは全く見えなかった。

沈降期間後に沈降槽底部から分離したＰＭＭは、固体含量が２９．８重量％であり、濃縮物中４９重量％の蛋白質を示した。

対照の目的で、バッチ方式により、蛋白質含量が２８３ｇ／Ｌの３０℃の温度の濃縮濃縮物４０リットルを４℃の水道水中に１：１０の比で稀釈し、ミセルを１時間の間沈澱させた。槽の底部から回収されたＰＭＭは３６．２重量％の固体含量を有し、そして濃縮物中の蛋白質は４２重量％を示した（ランＢＷ−ＡＨ０１４−Ｉ０５−０１Ａ）（実施例２参照）。
実施例２：
この実施例は実施例１に説明したバッチ方法の詳細を提供する。

“ａ”ｋｇの濃縮カノーラ粕を大気温度で“ｂ”Ｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液に加え、“ｃ”分間攪拌して蛋白質含量が“ｄ”ｇ／Ｌの蛋白質水溶液を得た。残渣カノーラ粕を真空濾過ベルト上で分離洗浄した。得られた蛋白質溶液を遠心分離によって清澄化して蛋白質含量が“ｅ”ｇ／Ｌの澄明な蛋白質溶液を製造した。

蛋白質抽出物溶液は、３０００ダルトンの分子量カットオフ膜を使用する限外濾過系で容量を減らした。得られた濃縮蛋白質溶液は“ｆ”ｇ／Ｌの蛋白質含量であった。“ｇ”℃の濃縮溶液を４℃の水道水中に１：１０で稀釈した。白い雲（沈澱）が直ちに生成したので自然に沈降させた。上方の稀釈水を除去し、沈澱した、粘着性の集塊物を乾燥させた。生成物には“ｈ”という名称を与えた。

蛋白質生成物の異なるサンプルに対して特定のパラメータ“ａ”〜“ｈ”が次の表Ｉに示されている：

実施例３：
この実施例は、本連続方法の連続抽出工程をマスタード、非−ＧＭＯカノーラ、高ｅｕｒｉｃｉｃ ａｃｉｄ菜種（Ｈ．Ｅ．Ａ．Ｒ）、白色フレークのカノーラ粕及び冷圧縮カノーラ粕に対して適用することについて説明する。

次の濃度を有する混合物を得るため、５５℃、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液のそれぞれ５００ｍｌアリコートに油料種子粕を加えた：
− マスタード、Ｈｉｇｈ ｅｕｒｉｃｉｃ ａｃｉｄ ｒａｐｅｓｅｅｄ及び非−ＧＭＯカノーラ：１５％ｗ／ｖ
− 白色フレーク及び冷圧縮カノーラ粕：１０％ｗ／ｖ
この混合物は、パイプ中で５分間の抽出時間（滞留時間）を与える長さのパイプにポンプで送られる。サンプルがパイプを出るとすぐに蛋白質含量を分析した。

得られた結果が次の表IIに示されている：

実施例４：
この実施例は、マスタード、非−ＧＭＯカノーラ、ｈｉｇｈ ｅｕｒｉｃｉｃ ａｃｉｄ菜種、白色フレークカノーラ粕及び冷圧縮カノーラ粕に対する本連続方法の連続稀釈工程の適用について説明する。

油料種子粕の抽出が、各油料種子粕に対して室温の０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中で３０分間の混合時間で実施された。シードの濃度は、白色フレークと冷圧縮カノーラ粕については１０％ｗ／ｖで、Ｈ．Ｅ．Ａ．Ｒ．、非−ＧＭＯカノーラ粕及びマスタード粕については１５％ｗ／ｖであった。３０分の混合時間の後、１０，０００ｘｇで１０分間遠心分離によって固形物を抽出蛋白質溶液から分離した。真空濾過装置のワットマン ＃４濾紙を通して濾過することによって蛋白質溶液をさらに清澄化した。

水及び含まれている小分子量物質を透過物として通過させながら、溶解蛋白質を十分に保持可能なＭＷＣＯ膜を使用するアミコンミニ攪拌−セル濃縮システム（Ａｍｉｃｏｎ ｍｉｎｉ ｓｔｉｒｒｅｄ−ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で各清澄液を濃縮した。各蛋白質溶液は２００ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上に濃縮された。

濃縮に続いて、２台のぜん動ポンプとＴ−型コネクタを用いて連続的に濃縮物を稀釈した。ポンプのスピードは、濃縮物と水の稀釈比が１：１０となるよう、第１のポンプが第１のポンプよりも１０倍速く流体を移動可能のように調節された。２台のポンプは同時にスタートし、濃縮物と水はポンプでＴ−型コネクタを通って共通ラインに送られ、そこで両者が混合してミセルの形成が開始された。

得られた溶液は次いで沈降槽に通され、ここで沈殿物が沈降する。沈降したＰＭＭのペレットを集めて凍結乾燥し、生成したそれぞれのＰＭＭの収率と蛋白質含量を計算した。各種子について得られた結果が下記の表III及びIVに示されている：

この開示を要約すると、本発明は油料種子蛋白質単離物の連続的製造方法を提供する。本発明の範囲内で変更修正が可能である。

Claims (34)

1. 以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を含む、蛋白質単離物の製造方法：
   （ａ）油料種子粕中の蛋白質を可溶化させてｐＨが５〜６．８の蛋白質水溶液を生成させるため、少なくとも３５℃より高い温度で前記油料種子粕を連続的に抽出し、
   （ｂ）前記蛋白質水溶液を残渣油料種子粕から連続的に分離し、
   （ｃ）濃縮された蛋白質溶液を得るため、イオン強度を実質的に一定に保ちながら、前記蛋白質溶液の蛋白質濃度を少くとも５０ｇ／Ｌに増加させるため、前記蛋白質溶液を選択性膜操作部に連続的に通液し、
   （ｄ）前記濃縮蛋白質溶液を１５℃より低い温度の冷水と連続的に混合して水相中に蛋白質ミセルを形成させ、
   （ｅ）得られた混合物を沈降槽中に連続的に流入させ、その間上澄液を沈降槽から溢流させ、
   （ｆ）沈降槽から上澄液の溢流を続けながら、所望量の無定形で、粘着性のある、ゼラチン状の、グルテン様の蛋白質ミセル集塊物が前記沈降槽に蓄積するまで前記蛋白質ミセルを連続的に沈降させ、
   （ｇ）蛋白質含量が、乾燥重量ベースで、ケルダール窒素×６．２５で測定して少くとも１００重量％を有する蛋白質ミセル集塊物を沈降槽から回収する。
2. 前記工程（ｃ）において、増加させる前記蛋白質溶液の蛋白質濃度が、少くとも２００ｇ／Ｌである、請求項１記載の方法。
3. 前記工程（ｃ）において、増加させる前記蛋白質溶液の蛋白質濃度が、少くとも２５０ｇ／Ｌである、請求項１記載の方法。
4. 前記工程（ｄ）において、前記濃縮蛋白質溶液と混合する冷水の温度が１０℃より低い温度である、請求項１記載の方法。
5. 前記工程（ａ）の油料種子粕を連続的に抽出する工程が次の（ｉ）及び（ｉｉ）の工程によって実施される請求項１記載の方法：
   （ｉ）油料種子粕をイオン強度が少くとも０．１０で、ｐＨが５〜６．８の塩水溶液と３５℃より高く６５℃以下の温度で連続的に混合し、
   （ｉｉ）前記混合物をパイプ中を連続的に通過させ、その間に１０分までの時間で油料種子粕から蛋白質を抽出して５〜４０ｇ／Ｌの蛋白質含量の蛋白質水溶液を生成させる。
6. 前記工程（ｉ）における塩水溶液のイオン強度が０．１５〜０．８である、請求項５に記載の方法。
7. 前記工程（ｉ）における塩水溶液のｐＨが５．３〜６．２である、請求項５に記載の方法。
8. 前記工程（ｉ）における前記塩水溶液中の油料種子粕の濃度が５〜１５ｗ／ｖ％である、請求項５に記載の方法。
9. 前記工程（ｉｉ）において生成させる蛋白質水溶液の蛋白質含量が１０〜３０ｇ／Ｌである、請求項５に記載の方法。
10. 前記工程（ａ）の油料種子粕を連続的に抽出する工程が、少くとも０．１０のイオン強度及び３〜５又は６．８〜９．９のｐＨを有する塩水溶液を使用して実施され、前記蛋白質水溶液と残渣油料種子粕との分離後、蛋白質水溶液のｐＨが５〜６．８に調節される、請求項１記載の方法。
11. 前記塩水溶液のイオン強度が０．１５〜０．８である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記蛋白質水溶液のｐＨが５．３〜６．２に調節される、請求項１０に記載の方法。
13. 前記油料種子粕がカノーラ油料種子粕であり、前記工程（ｂ）における前記蛋白質水溶液と残渣カノーラ種子粕との分離後、蛋白質水溶液の連続的な色素除去工程が実施される、請求項１に記載の方法。
14. 前記色素除去工程が、蛋白質水溶液のダイアフィルトレーションによって実施される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記色素除去工程が、色素吸着剤と蛋白質水溶液を連続的に混合し、次いで色素吸着剤を蛋白質単離物水溶液から連続的に除去することによって実施される、請求項１３に記載の方法。
16. 前記色素吸着剤が粉末活性炭である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記工程（ａ）の油料種子粕を連続的に抽出する工程において、前記油料種子粕が水で連続的に抽出され、続いて、イオン強度が少くとも０．１０の蛋白質水溶液を得るため、抽出された蛋白質水溶液に塩が連続的に加えられる、請求項１記載の方法。
18. 前記蛋白質水溶液のイオン強度が０．１５〜０．８である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記工程（ｃ）において形成される濃縮蛋白質溶液が、溶液の粘度を低下させるため少くとも２０℃の温度に熱せられるが、該溶液の温度がミセル生成を不可能にする温度を超えては加熱されない、請求項１ないし１８のいずれか一つに記載の方法。
20. 前記濃縮蛋白質溶液の熱せられる温度が２５℃〜４０℃である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記工程（ｄ）において、前記濃縮蛋白質溶液を約１５倍又はそれ未満に稀釈するため該溶液が前記冷水と連続的に混合される、請求項１ないし２０のいずれか一つに記載の方法。
22. 前記濃縮蛋白質溶液の稀釈が１０倍又はそれ未満である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記工程（ｇ）において、前記回収蛋白質ミセル集塊物が蛋白質粉末に乾燥される、請求項１ないし２２のいずれか一つに記載の方法。
24. 前記工程（ｆ）において沈降槽から溢流させる上澄液から付加的量の蛋白質単離物を回収するため、該上澄液がバッチ、セミ連続又は連続法で処理される、請求項１ないし２３のいずれか一つに記載の方法。
25. 前記付加的量の蛋白質溶液の溢流上澄液からの回収が、
    （ａ）蛋白質含量が少くとも９０重量％（Ｎ×６．２５）である蛋白質単離物を生成させるため、上澄液を１００〜４００ｇ／Ｌの蛋白質濃度に濃縮し、その濃縮上澄液を乾燥することによるか、
    前記追加量の蛋白質単離物が、
    （ｂ）蛋白質含量が少くとも９０重量％（Ｎ×６．２５）である蛋白質単離体を得るため、上澄液を１００〜４００ｇ／Ｌの蛋白質濃度に濃縮し、濃縮した上澄液を回収した蛋白質ミセル集塊物と混合し、その混合物を乾燥することによるか、または、
    （ｃ）蛋白質含量が少くとも９０重量％（Ｎ×６．２５）である蛋白質単離体を得るため、溢流する上澄液を１００〜４００ｇ／Ｌの蛋白質濃度に濃縮し、濃縮した上澄液の一部を、回収した蛋白質ミセル集塊物の少くとも一部と混合し、次いで得られた混合物を乾燥することによる、請求項２４記載の方法。
26. 前記（ａ）における蛋白質単離物の蛋白質含量が、少くとも１００重量％である、請求項２５に記載の方法。
27. 前記（ａ）における濃縮する上澄液の蛋白質濃度が、２００〜３００ｇ／Ｌである、請求項２５に記載の方法。
28. 前記（ｂ）における蛋白質単離物の蛋白質含量が、少くとも１００重量％である、請求項２５に記載の方法。
29. 前記（ｂ）における濃縮する上澄液の蛋白質濃度が、２００〜３００ｇ／Ｌである、請求項２５に記載の方法。
30. 前記（ｃ）における蛋白質単離物の蛋白質含量が、少くとも１００重量％である、請求項２５に記載の方法。
31. 前記（ｃ）における濃縮する上澄液の蛋白質濃度が、２００〜３００ｇ／Ｌである、請求項２５に記載の方法。
32. 前記（ｃ）において、前記付加的量の蛋白質溶液の溢流上澄液からの回収が、更に濃縮上澄液の残部と回収蛋白質ミセル集塊物の残部を乾燥させることによる、請求項２５に記載の方法。
33. 前記油料種子粕がカノーラ油料種子粕である、請求項１ないし３２のいずれか一つに記載の方法。
34. 前記カノーラ油料種子粕が、冷圧縮カノーラ油料種子粕、非遺伝子的に改変されたカノーラ油料種子由来の白色フレーク、低温脱溶媒カノーラ油料種子粕の形状のもの；菜種粕、またはカラシナ種子粕である、請求項３３に記載の方法。