JP4343153B2 - 抗腫瘍組成物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、腫瘍細胞由来の物質からブドウ球菌により合成される抗腫瘍組成物の製造方法に関する。
従来の抗腫瘍性物質は、化学合成されたものであるか若しくは非腫瘍生物からの抽出物である。腫瘍細胞由来の物質をブドウ球菌によって分解し、抗腫瘍性物質を合成した例は今のところ報告されていない。なお、抗腫瘍性物質に関する発明として下記の特許文献１乃至特許文献３に示したものが知られている。
したがって、上述の通り腫瘍細胞由来の物質をブドウ球菌によって分解し抗腫瘍組成物を合成する発明が切望されていた。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、腫瘍細胞由来の物質をブドウ球菌により分解し、抗腫瘍組成物を合成することにある。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、腫瘍細胞由来の物質をブドウ球菌により分解し、抗腫瘍組成物を合成することにある。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、腫瘍細胞由来の物質をブドウ球菌により分解し、抗腫瘍性物質を合成すると共に、この物質の分子構造を見出した。その具体的内容は以下の通りである。
すなわち、本発明は、下記構造式[Ｉ]で表わされる抗腫瘍性物質を含有する抗腫瘍組成物の製造方法において、エールリッヒ腫瘍細胞の培養液にブドウ球菌を移植して、培養液中の腫瘍細胞由来の物質から抗腫瘍性物質を合成したのち、培養液から抗腫瘍組成物を分取することを特徴とする。
すなわち、本発明は、下記構造式[Ｉ]で表わされる抗腫瘍性物質を含有する抗腫瘍組成物の製造方法において、エールリッヒ腫瘍細胞の培養液にブドウ球菌を移植して、培養液中の腫瘍細胞由来の物質から抗腫瘍性物質を合成したのち、培養液から抗腫瘍組成物を分取することを特徴とする。
本発明は上述した手段をとることにより、次の効果を得ることができる。
すなわち、本発明によれば、腫瘍細胞由来の物質をブドウ球菌により分解し、上述の構造式に示す抗腫瘍性物質を含有する抗腫瘍組成物を得ることができる。また、この抗腫瘍組成物を人に適用することで癌看者の病状を軽減させることが期待できる。
すなわち、本発明によれば、腫瘍細胞由来の物質をブドウ球菌により分解し、上述の構造式に示す抗腫瘍性物質を含有する抗腫瘍組成物を得ることができる。また、この抗腫瘍組成物を人に適用することで癌看者の病状を軽減させることが期待できる。
本発明に係る抗腫瘍組成物は、特に癌腫や肉腫等の悪性腫瘍に対して抗腫瘍性の効果を示す。
以下、本発明の最良の実施形態について詳細に説明する。
[合成方法]
まず、ＤＤＹ系マウスの腹腔内でエールリッヒ腫瘍細胞（マウス腹水がん細胞と言われることもある）を培養し、その腹腔内の腹水を取り出した。この腹水を遠心操作（３０００回転、１０分間）によりエールリッヒ腫瘍細胞を取り除き、いわゆるCell Freeの状態で腹水５００ｍｌ中においてブドウ球菌（Staphylococcus Lentus）を１週間３５．５℃の環境下で培養した。つまり、本実施形態に係る抗腫瘍性物質は、生物体（細菌酵素）を利用して「生合成」されるものである。
また、ブドウ球菌は、菌としての成長力が大きいため、抗腫瘍性物質の合成能力が高いものと思われる。さらに、今回の試験からブドウ球菌は、耐熱性、耐圧性、室温で放置しても酸化等の影響を受けにくいなど環境に対して順応性が高いため、菌としての取扱いが容易であることも確認された。
なお、本実施形態では、腫瘍細胞由来の物質としてエールリッヒ腫瘍細胞を用いたが、その他、ヒーラ腫瘍細胞、ＨＥＰ−２腫瘍細胞、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０腫瘍細胞などを用いることができる可能性がある。
以下、本発明の最良の実施形態について詳細に説明する。
[合成方法]
まず、ＤＤＹ系マウスの腹腔内でエールリッヒ腫瘍細胞（マウス腹水がん細胞と言われることもある）を培養し、その腹腔内の腹水を取り出した。この腹水を遠心操作（３０００回転、１０分間）によりエールリッヒ腫瘍細胞を取り除き、いわゆるCell Freeの状態で腹水５００ｍｌ中においてブドウ球菌（Staphylococcus Lentus）を１週間３５．５℃の環境下で培養した。つまり、本実施形態に係る抗腫瘍性物質は、生物体（細菌酵素）を利用して「生合成」されるものである。
また、ブドウ球菌は、菌としての成長力が大きいため、抗腫瘍性物質の合成能力が高いものと思われる。さらに、今回の試験からブドウ球菌は、耐熱性、耐圧性、室温で放置しても酸化等の影響を受けにくいなど環境に対して順応性が高いため、菌としての取扱いが容易であることも確認された。
なお、本実施形態では、腫瘍細胞由来の物質としてエールリッヒ腫瘍細胞を用いたが、その他、ヒーラ腫瘍細胞、ＨＥＰ−２腫瘍細胞、Ｓａｒｃｏｍａ−１８０腫瘍細胞などを用いることができる可能性がある。
[抽出方法]
上述の１週間培養した培養液（腹水）をオートクレイブにて滅菌し、滅菌後の培養液にエタノールを添加してエタノール濃度８０％（例えば、培養液２０ｍｌにエタノール８０ｍｌを加える）となるように調製した。
次いで、エタノールを添加したことにより培養液中に形成された凝固物を濾紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）で濾過操作を行った。そして、濾液中のエタノールを加熱により除去し、この除去により析出した析出物に蒸留水を加えた水溶液とした。次に、この水溶液にアセトンを添加してアセトン濃度８０％（例えば、培養液２０ｍｌにアセトン８０ｍｌを加える）となるように調製した。次に、アセトンを添加したことにより調製液中に形成された凝固物を濾紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）で濾過操作を行った。そして、濾液中のアセトンを加熱により除去し、この除去により析出した析出物に蒸留水を加えた水溶液とする。次に、この水溶液にクロロホルムを添加して振とう操作を行い、クロロホルム層（有機層）と水層とに完全に分離させた。
上述の１週間培養した培養液（腹水）をオートクレイブにて滅菌し、滅菌後の培養液にエタノールを添加してエタノール濃度８０％（例えば、培養液２０ｍｌにエタノール８０ｍｌを加える）となるように調製した。
次いで、エタノールを添加したことにより培養液中に形成された凝固物を濾紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）で濾過操作を行った。そして、濾液中のエタノールを加熱により除去し、この除去により析出した析出物に蒸留水を加えた水溶液とした。次に、この水溶液にアセトンを添加してアセトン濃度８０％（例えば、培養液２０ｍｌにアセトン８０ｍｌを加える）となるように調製した。次に、アセトンを添加したことにより調製液中に形成された凝固物を濾紙（東洋濾紙Ｎｏ．２）で濾過操作を行った。そして、濾液中のアセトンを加熱により除去し、この除去により析出した析出物に蒸留水を加えた水溶液とする。次に、この水溶液にクロロホルムを添加して振とう操作を行い、クロロホルム層（有機層）と水層とに完全に分離させた。
[精製方法その１]
上述の抽出方法で得られた有機層中のクロロホルムを加熱により除去し、この除去により析出した析出物に蒸留水を加えた水溶液を作製した。この水溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、濾液をペーパークロマト法（降下法を用いた。展開溶液は、ブタノール：酢酸：精製水＝４：１：２の溶液を使用した。）により分画させた。次いで、Ｒｆ＝０．０２〜Ｒｆ＝０．１２の範囲の分画を採取し、この分画に蒸留水を適量加えて抽出し加熱により１０ｍｌの濃縮液とした（この条件においては、Ｒｆ値が比較的大きかったため採取操作を簡単に行うことができた）。そして、濃縮液１０ｍｌにメタノール９０ｍｌを加え（メタノール濃度９０％）、攪拌し冷蔵庫（１℃〜５℃）に約２４時間保存した。この保存液を遠心操作（３０００回転、１０分間）により遠心させ、メタノールを加熱により除去し、残存した析出物質を本実施形態に係る抗腫瘍組成物とした。
上述の抽出方法で得られた有機層中のクロロホルムを加熱により除去し、この除去により析出した析出物に蒸留水を加えた水溶液を作製した。この水溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、濾液をペーパークロマト法（降下法を用いた。展開溶液は、ブタノール：酢酸：精製水＝４：１：２の溶液を使用した。）により分画させた。次いで、Ｒｆ＝０．０２〜Ｒｆ＝０．１２の範囲の分画を採取し、この分画に蒸留水を適量加えて抽出し加熱により１０ｍｌの濃縮液とした（この条件においては、Ｒｆ値が比較的大きかったため採取操作を簡単に行うことができた）。そして、濃縮液１０ｍｌにメタノール９０ｍｌを加え（メタノール濃度９０％）、攪拌し冷蔵庫（１℃〜５℃）に約２４時間保存した。この保存液を遠心操作（３０００回転、１０分間）により遠心させ、メタノールを加熱により除去し、残存した析出物質を本実施形態に係る抗腫瘍組成物とした。
[精製方法その２]
上述の[精製方法その１]で得られた「Ｒｆ＝０．０２〜Ｒｆ＝０．１２の範囲の分画」を液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）により精製した。そのＨＰＬＣ法の測定条件は下記の通りである。
（ＨＰＬＣの測定条件）
移動層：３０％メタノール
測定波長：２１０ｎｍ（λ＝２１０）
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ｖＣ１８（２０ＩＤｍｍ×２５０ｍｍ）
装置：Ｓｈｉｍａｚｕ ＬＣ−１０Ａ
このＨＰＬＣ法による試験結果を図１に示す。図１に示すように領域Ｐの部分が本実施形態に係る抗腫瘍性物質を含む領域（抗腫瘍組成物の領域）であることが推定された。この領域Ｐの部分を取り出して一般的な精製方法（例えば、抽出）により本実施形態に係る抗腫瘍組成物中の抗腫瘍性物質を精製することができる。
上述の[精製方法その１]で得られた「Ｒｆ＝０．０２〜Ｒｆ＝０．１２の範囲の分画」を液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）により精製した。そのＨＰＬＣ法の測定条件は下記の通りである。
（ＨＰＬＣの測定条件）
移動層：３０％メタノール
測定波長：２１０ｎｍ（λ＝２１０）
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ｖＣ１８（２０ＩＤｍｍ×２５０ｍｍ）
装置：Ｓｈｉｍａｚｕ ＬＣ−１０Ａ
このＨＰＬＣ法による試験結果を図１に示す。図１に示すように領域Ｐの部分が本実施形態に係る抗腫瘍性物質を含む領域（抗腫瘍組成物の領域）であることが推定された。この領域Ｐの部分を取り出して一般的な精製方法（例えば、抽出）により本実施形態に係る抗腫瘍組成物中の抗腫瘍性物質を精製することができる。
[抗腫瘍性物質の分子量及び分子構造の決定方法]
次に、ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析計）により上述の[精製方法その１]で得られた「Ｒｆ＝０．０２〜Ｒｆ＝０．１２の範囲の分画」を解析し、分子量及び分子構造を推定した。そのＬＣＭＳの測定条件は下記の通りである。
（ＬＣＭＳの測定条件）
（１）ＨＰＬＣ
移動層：３０％メタノール
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ（カラムの後にＭＳへスプリット導入）
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−１０１Ｈ（４．６ＩＤｍｍ×２５０ｍｍ）
装置：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０
（２）ＭＳ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）
カラム温度：３０℃
試料濃度：３ｍｇ／ｍｌ
注入量：１０マイクロリッター
イオン化：ＥＳＩポジティブ
測定質量範囲：４０〜１０００ａｍｕ（ａｔｏｍｉｃ ｍａｓｓ ｕｎｉｔ）
キャピラリー電圧：３０００Ｖ
コーン電圧：３０Ｖ
イオン源温度：８０℃
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ温度：３５０℃
取り込み時間：２秒
マス検出器：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ
このＬＣＭＳ法による試験結果を図２に示す。図２の試験結果から、本実施形態に係る抗腫瘍性物質は下記の分子構造（構造式[Ｉ]）であることが推定された。また、この抗腫瘍性物質の分子量は３９２．５２であると考えられる。
次に、ＬＣＭＳ（液体クロマトグラフ質量分析計）により上述の[精製方法その１]で得られた「Ｒｆ＝０．０２〜Ｒｆ＝０．１２の範囲の分画」を解析し、分子量及び分子構造を推定した。そのＬＣＭＳの測定条件は下記の通りである。
（ＬＣＭＳの測定条件）
（１）ＨＰＬＣ
移動層：３０％メタノール
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ（カラムの後にＭＳへスプリット導入）
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−１０１Ｈ（４．６ＩＤｍｍ×２５０ｍｍ）
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（２）ＭＳ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）
カラム温度：３０℃
試料濃度：３ｍｇ／ｍｌ
注入量：１０マイクロリッター
イオン化：ＥＳＩポジティブ
測定質量範囲：４０〜１０００ａｍｕ（ａｔｏｍｉｃ ｍａｓｓ ｕｎｉｔ）
キャピラリー電圧：３０００Ｖ
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イオン源温度：８０℃
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取り込み時間：２秒
マス検出器：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑ−Ｔｏｆ
このＬＣＭＳ法による試験結果を図２に示す。図２の試験結果から、本実施形態に係る抗腫瘍性物質は下記の分子構造（構造式[Ｉ]）であることが推定された。また、この抗腫瘍性物質の分子量は３９２．５２であると考えられる。
[ｉｎ ｖｉｖｏ試験]
ＤＤＹ系マウス２０匹の腹腔にエールリッヒ腹水がん細胞（約１０６個）を接種し、２４時間経過後１群１０匹として試験群及び対照群に振り分けた。次に、[精製方法その１]で単離した本実施形態に係る抗腫瘍組成物に蒸留水を加え、その濃度が１０ｍｇ／１０ｍｌとなるように調製した試験液を試験群の腹腔に約０．５ｍｌ投与した。一方、対照群の腹腔には生理食塩水約０．５ｍｌを投与した。そして、試験液及び生理食塩水を投与してから２時間後、５時間後、１５時間後における各群の腹水を採取し、ギムザ染色を行って腫瘍細胞の変性の様子を顕微鏡で観察した。
ＤＤＹ系マウス２０匹の腹腔にエールリッヒ腹水がん細胞（約１０６個）を接種し、２４時間経過後１群１０匹として試験群及び対照群に振り分けた。次に、[精製方法その１]で単離した本実施形態に係る抗腫瘍組成物に蒸留水を加え、その濃度が１０ｍｇ／１０ｍｌとなるように調製した試験液を試験群の腹腔に約０．５ｍｌ投与した。一方、対照群の腹腔には生理食塩水約０．５ｍｌを投与した。そして、試験液及び生理食塩水を投与してから２時間後、５時間後、１５時間後における各群の腹水を採取し、ギムザ染色を行って腫瘍細胞の変性の様子を顕微鏡で観察した。
図３は、対照群のある１匹の投与直後の顕微鏡写真を示す図である。図４は、試験群のある１匹の投与２時間後の顕微鏡写真を示す図である。図５は、試験群のある１匹の投与５時間後の顕微鏡写真を示す図である。図６は、試験群のある１匹の投与１５時間後の顕微鏡写真を示す図である。
図３は、対照群の投与直後の顕微鏡写真を示したものであるが、生理食塩水を投与してから２時間後、５時間後、１５時間後における顕微鏡写真も大差のないものであった。つまり、対照群では、いずれのマウスにおいても腫瘍細胞の変性の様子は観察されなかった。一方、図４〜図６に示すように、試験群では、いずれのマウスにおいても腫瘍細胞の変性の様子が確認された（時間の経過とともに染色された細胞の数が徐々に減っていく様子が確認された）。これは、試験群においては、本実施形態に係る抗腫瘍組成物が腫瘍細胞に変性をもたらして腫瘍細胞の核分裂を促しているものであると考えられる。この試験結果より、本実施形態に係る抗腫瘍組成物は、いわゆる悪性腫瘍に対して有用であることが示唆された。また、この抗腫瘍組成物を人に使用することで癌看者の病状が低減され得ることが示唆された。
また、試験期間中及び試験終了後において、予測される副作用についても詳細に検討を行ったが試験群のいずれのマウスにも副作用と思われる症状は観測されなかった。このことから、生物体（細菌酵素）から合成されることで極めて副作用の少ない抗腫瘍組成物が得られることが確認された。
図３は、対照群の投与直後の顕微鏡写真を示したものであるが、生理食塩水を投与してから２時間後、５時間後、１５時間後における顕微鏡写真も大差のないものであった。つまり、対照群では、いずれのマウスにおいても腫瘍細胞の変性の様子は観察されなかった。一方、図４〜図６に示すように、試験群では、いずれのマウスにおいても腫瘍細胞の変性の様子が確認された（時間の経過とともに染色された細胞の数が徐々に減っていく様子が確認された）。これは、試験群においては、本実施形態に係る抗腫瘍組成物が腫瘍細胞に変性をもたらして腫瘍細胞の核分裂を促しているものであると考えられる。この試験結果より、本実施形態に係る抗腫瘍組成物は、いわゆる悪性腫瘍に対して有用であることが示唆された。また、この抗腫瘍組成物を人に使用することで癌看者の病状が低減され得ることが示唆された。
また、試験期間中及び試験終了後において、予測される副作用についても詳細に検討を行ったが試験群のいずれのマウスにも副作用と思われる症状は観測されなかった。このことから、生物体（細菌酵素）から合成されることで極めて副作用の少ない抗腫瘍組成物が得られることが確認された。
また、対照群の生存期間は７〜１２日間であったのに対し、試験群の生存期間はいずれも２１日間であった。このことから、本実施形態に係る抗腫瘍組成物には延命効果があることが示唆された。
この結果から別途、ＤＤＹ系マウス数十匹の腹腔内でエールリッヒ腫瘍細胞約５００００万個を定期的に５回移植培養を行ったところ、２年間生存した群が確認された。この群のマウスの腸内細菌を調べたところ、ブドウ球菌（Staphylococcus Lentus）の存在が確認されたが、他の菌は確認されなかった。このことから、ブドウ球菌（StaphylococcusLentus）から合成される抗腫瘍組成物には、延命効果があることが示唆された。
この結果から別途、ＤＤＹ系マウス数十匹の腹腔内でエールリッヒ腫瘍細胞約５００００万個を定期的に５回移植培養を行ったところ、２年間生存した群が確認された。この群のマウスの腸内細菌を調べたところ、ブドウ球菌（Staphylococcus Lentus）の存在が確認されたが、他の菌は確認されなかった。このことから、ブドウ球菌（StaphylococcusLentus）から合成される抗腫瘍組成物には、延命効果があることが示唆された。
また、本実施形態に係る抗腫瘍組成物は、腹水がんだけでなく、固形がんや各組織の腺がん、扁平上皮がん、未分化がん、肉腫など広範囲にわたり有用性を示すことが期待できる。
また、本実施形態に係る抗腫瘍組成物は、経口投与剤のほか、顆粒剤、徐放性埋没カプセル、坐剤、ネブライザーとしても製剤化することもできる。
また、本実施形態に係る抗腫瘍組成物は、静脈内、皮下注射、点滴などの非経口投与剤として用いるだけでなく、カプセルなどの経口投与剤として用いることもできる。
また、本実施形態に係る抗腫瘍組成物は、経口投与剤のほか、顆粒剤、徐放性埋没カプセル、坐剤、ネブライザーとしても製剤化することもできる。
また、本実施形態に係る抗腫瘍組成物は、静脈内、皮下注射、点滴などの非経口投与剤として用いるだけでなく、カプセルなどの経口投与剤として用いることもできる。
Claims (1)
- 下記構造式[Ｉ]で表わされる抗腫瘍性物質を含有する抗腫瘍組成物の製造方法において、
エールリッヒ腫瘍細胞の培養液にブドウ球菌を移植して、前記培養液中の腫瘍細胞由来の物質から前記抗腫瘍性物質を合成したのち、前記培養液から前記抗腫瘍組成物を分取することを特徴とする抗腫瘍組成物の製造方法。
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