JP4191447B2 - 置換された脂肪酸又はそれの誘導体を含むブレンド - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コンボナット油中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体を含むブレンド、それらの使用及び製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンボナット（ｋｏｍｂｏ ｎｕｔ）種子脂肪は、ピクナンサス・アンゴレンシス（Ｐｙｃｎａｎｔｈｕｓ ａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ）の種子から得ることができる公知の生成物である（例えば、特許文献１参照。この脂肪中に存在する成分は異なる複数のグループによって分析され、そしてかなりの数のテルペノイド酸型の成分が確認された。これらの成分の１つは、コンビン酸（ｋｏｍｂｉｃ ａｃｉｄ）と命名された新規なポリプレニル化ヒドロキノン置換されたカルボン酸として識別され、これは、非特許文献１中に記載されている構造を有するとして識別された。（即ち、１６−（２^１，５^１−ジヒドロキシ−３^１ メチルフェニル）−２，６，１０，１４ テトラメチル−２，６，１０，１４ ヘキサデカテトラエン酸）（非特許文献１参照）。そのテルペノイド酸型成分を含むコンボナット油は有用なものとして開示され、そして、低血糖活性、真菌皮膚感染症に対する活性；帯状疱疹の治療に対する活性；又は癩菌に対する活性；頭痛、体の痛み対する活性；胸痛に対する活性；又は女性用の抗不妊剤として；又は駆虫剤として；又は解毒剤として；又は抗歯痛剤として；又は抗出血剤として；その他のとしてのような多数の健康上の利益を有するものとして開示されているが（例えば、特許文献１参照）、特定の成分の存在と特定の健康上の効果の発生との間の関係は与えられていない。
【０００３】
トリミリスチンに富んだ油及びその他の油から製造されたブレンドが開示されている（例えば、特許文献２参照）。使用されるトリミリスチンはコンボナット油から得ることができる。
【０００４】
【特許文献１】
国際公開第９６／３９１３０号パンフレット
【特許文献２】
米国特許第３６１５５８８号明細書
【非特許文献１】
ロック・シー・エス（Lok c.s.）著，「フィトケミストリー（Phytochemistry）」，２２巻，１９８３年，ｐ．１９７３
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、多くの有用な健康上の効果を示す脂肪酸を含むブレンドを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはコンボナット脂肪をさらに分析し、そしてこの脂肪が、質量分光分析及び^１３Ｃ−ＮＭＲによって、サルガヒドロキノン酸（ｓａｒｇａｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（＝ＳＨＱＡ）［ＣＡ名称：１２−（２^１，５^１−ジヒドロキシ−３^１−メチルフェニル）−６，１０−ジメチル−２−（４^１−メチル−３^１−ペンテニル）−２Ｅ，６Ｅ，１０Ｅ ドデカトリエン（ｄｏｄｅｃａｔｒｉｅｎｏｉｃ）酸］」として識別された成分を含むこと、及びこの化合物及びかなりの数のその誘導体が有用な健康上の利益を示すことを発見した。この化合物ＳＨＱＡは通常グリセリドと組み合わせて適用される。これらのグリセリドはコンボナット油中に存在するトリグリセリドでよいが、その他のグリセリドもＳＨＱＡと組み合わせて使用できる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
従って、第１の場合において本発明は、置換された有機酸、又はそれの誘導体及びグリセリドを含むブレンドであって、当該ブレンドが、
（ｉ）０．１乃至９９．９重量％、好ましくは２乃至９５重量％、より好ましくは１０乃至８０重量％の、コンボナット油中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸、特に、サルガヒドロキノン酸（＝ＳＨＱＡ）又は、１乃至３２個の炭素原子を有するアルコールとのこれらの脂肪酸のエステル、又は食品として許容可能なそれらの塩のような、それらの誘導体、
（ｉｉ）０乃至９９．８重量％、好ましくは４乃至９７重量％、より好ましくは１０乃至８０重量％のコンボバター（ｋｏｍｂｏ ｂｕｔｔｅｒ）グリセリド、及び
（ｉｉｉ）０．１乃至９９．９重量％、好ましくは１乃至９４重量％、より好ましくは１０乃至８０重量％のその他のトリグリセリド、
を含む、ブレンドに関する。
【０００８】
置換された脂肪酸の誘導体は、好ましくは、ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸と２乃至２０個の炭素原子、好ましくは１４乃至１８個の炭素原子を有する直鎖の飽和及び／又は不飽和アルコールとのエステルから選択される。その他の好ましい誘導体は、ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸のＮａ又はＫ又はＣａ塩である。これらの生成物は、それぞれよく知られている条件下での必要なアルコールとのエステル化によって、必要な塩基との酸の中和によって、遊離の酸から容易に製造することができる。
【０００９】
ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸と２乃至３２個の炭素原子を有する脂肪酸とから、置換された酸のヒドロキシル基の少なくとも１つをエステル化することによって製造されたエステルを使用することもできる。
【００１０】
その他のグリセリドは広範囲の天然グリセリド、例えば、パーム油；カカオ脂；ココナッツ油；パーム核油；大豆油；オリーブ油；ヒマワリ油；菜種油；サフラワー油；コーン油；綿実油；カカオ脂同等物又はカカオ脂代替物；魚油；ボーリッジ（ｂｏｒａｇｅ）油、松の実油；コリアンダー油；真菌油（ｆｕｎｇａｌｏｉｌｓ）、又はそれらの高オレイン品種、又はそれらの画分、又はそれらの硬化された品種、又は硬化された品種の画分又はこれらの油脂の１種以上の混合物から成る群から選択されるトリグリセリド、から選択することができ、又は誘導することができる。
【００１１】
しかしながら、食品に対しては、ＮＭＲパルス技術によって測定して適切な非安定化Ｎ値を有するブレンドを提供するトリグリセリドを使用するのが好ましい。なぜならば、これはこれらのブレンドの食品中での適用をずっと容易にするからである。非安定化とは、ブレンドを初めに８０℃より高温で溶融させ、その後溶融物を０℃まで冷却し、そして０℃で３０分間維持し、その後ブレンドを測定温度まで加熱し、そしてその温度で３０分間維持し、その後Ｎ値を測定することを意味する。ブレンドに対して好ましいＮ値は、Ｎ_５＝５乃至８０、好ましくは１０乃至７０、そしてＮ_３５＝２０未満、好ましくは１乃至５である。
【００１２】
置換された酸をグリセリドとブレンドする代わりに、本発明者らは、また、それらを、共役リノール酸（＝ＣＬＡ）、リノール酸（アルファとガンマの両方）、魚油脂肪酸、又は（プニカ酸、エレオステアリン酸、パリナリン酸、その他のような）その他の多不飽和脂肪酸のような遊離脂肪酸とブレンドすることもできる。
【００１３】
ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸成分は、適する材料から出発する合成ルートを含む異なるルートによって得ることができるが、これらの成分は天然の源から単離するのが好ましい。この酸をかなりの量で含む好ましい天然の源は、ピクナンサス・アンゴレンシス（Ｐｙｃｎａｎｔｈｕｓ ａｎｇｏｌｅｎｓｉｓ）の堅果からの油である。もう１つの天然の源は褐藻類（ｂｒｏｗｎ ａｌｇａｅ）である。（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８７、 １３６５〜１３６６）。
【００１４】
本発明による酸は多不飽和であるため、これらの酸は酸化による劣化にさらされる。従って、これらの酸を酸化防止剤と組み合わせて使用することが適切である。適する酸化防止剤は、天然又は合成のトコフェロール、ＢＨＴ、ＴＢＨＱ、ＢＨＡ、没食子酸プロピル；ラジカル掃去剤、酸化防止特性を有する酵素及び脂肪酸のアスコルビルエステルから成る群から選択することができる。酸化防止剤が適用される量は有効量として示すことができ、実際の量は、酸化防止剤の種類、存在する多不飽和酸の種類；食品の種類；その他の成分の存在、その他のような要因によって異なる。しかしながら、各々の特定の状況に対する有効量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００１５】
本発明のもう１つの態様によれば、本発明は、また、有効量の健康成分を含む食品生成物であって、当該健康成分がコンボナット油又はそれの抽出物中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸又はそれの誘導体、特に、サルガヒドロキノン酸（＝ＳＨＱＡ）又はその誘導体、である食品生成物に関する。置換された酸は好ましくはコンボナット油から得られる酸である。
【００１６】
原則的には、食品生成物は、置換された酸又はそれらの誘導体と組合すことができる任意の食品生成物でよい。しかしながら、本発明者らは、マーガリン；脂肪連続又は水連続又は双連続（ｂｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）スプレッド、低脂肪スプレッド；チョコレート又はチョコレートコーティング又はチョコレートフィリング又はベーカリーフィリング（ｂａｋｅｒｙ ｆｉｌｌｉｎｇｓ）のような菓子生成物、アイスクリーム、アイスクリームコーティング、アイスクリーム封入物（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）、ドレッシング、マヨネーズ、チーズ、クリーム代替物、乾燥スープ、ドリンク、シリアルバー（ｃｅｒｅａｌ ｂａｒｓ）、ソース、ベーカリー製品及びスナックバーから成る群から選択される食品生成物中においてこの成分を使用することを好む。
【００１７】
置換された酸を食品生成物中において使用する代わりに、本発明者らは、それらを食品栄養補完物中において使用することもできる。従って、本発明の一部は、封入材料中の又は顆粒中の又は粉末形態の、有効量の、コンボナット油又は抽出物中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸又はそれの誘導体、特に、サルガヒドロキノン酸（＝ＳＨＱＡ）又はそれの誘導体、を含む食品栄養補完物である。栄養補完物用の封入材料は、好ましくは、ゼラチン；澱粉、改質澱粉、穀粉、改質穀粉、糖、特にスクロース、ラクトース、グルコース、及びフルクトース、から成る群から選択される。
【００１８】
本発明者らは、本発明の新たに識別された酸成分が多数の有用な健康上の利益を有することを発見した。従って、本発明は、また、コンボナット油又はそれの抽出物中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸又はそれの誘導体を含む組成物の、健康上の効果を有する食品組成物又は食品栄養補完物の調製のための有効成分としての使用であって、当該健康上の効果が、リパーゼ阻害剤としての作用、特に膵臓リパーゼ又は胃リパーゼに対する阻害剤としての作用及び／又はペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター亜類型アルファ又はガンマに対する配位子としての作用及び／又は老化、特に皮膚の老化の軽減及び／又は予防及び／又は光で損傷を受けた皮膚上での作用；及び／又は皮膚の真皮中のデコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）の形成の促進及び／又はにきびの治療及び／又は予防及び／又はセリュライト（ｃｅｌｌｕｌｉｔｅ）の治療及び／又は予防及び／又は体又は口の爽快さの増強を含む、使用に関する。あるいは、組成物は、また、化粧品用の局所塗布組成物中においても使用することができる。
【００１９】
本発明者らが発見したその他の健康上の効果は以下の通りである：
ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸は、トコフェロールのようなその他の公知の抗酸化剤よりもさらに高い予期されなかった良好な酸化防止活性を有する。この酸化防止活性は、油脂の酸化の遅延をもたらし、そしてさらにラジカルの存在に関連する疾病の発生を防ぐか又は遅らせるために使用することができた。
【００２０】
従って、本発明は、また、コンボナット油中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸、特にサルガヒドロキノン酸（＝ＳＨＱＡ）又は、１乃至３２個の炭素原子を有する脂肪酸のエステル、又は食品として許容可能なその塩のような、その誘導体の使用であって、当該ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸又はその誘導体が、ラジカルの形成を防ぐか及び／又は油脂の酸化を遅らせるか及び／又はラジカルの存在に関連する哺乳類の病気の発生の予防するか又は遅らせるのを助けるために使用される、使用に関する。特に、ＳＨＱＡ又はその誘導体は、ガン及び／又はアルツハイマー病及び／又は関節炎及び／又は心循環器疾患の発生を予防するか又は遅らせるために使用される。
【００２１】
このために使用される好ましい誘導体は、ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸と６乃至２０個の炭素原子、好ましくは１４乃至１８個の炭素原子、を有する直鎖の飽和及び／又は不飽和アルコールとのエステルである。その他の好ましい誘導体は、Ｎａ又はＫ又はＣａのヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸塩である。なぜならば、これらの誘導体はより良好に溶解し、そしてさらに使用時にミネラルも提供するからである。
【００２２】
適用することができるその他の好ましい誘導体は、ＳＨＱＡのようなヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸のエステルであって、ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸の１つ又は複数のヒドロキシル基が６乃至２０個の炭素原子を有する直鎖の飽和及び／又は不飽和脂肪酸でエステル化されているものである。
【００２３】
これらの新規な成分は酸化防止剤として非常に有効であるが、本発明者らは、その他の公知の酸化防止剤とそれらの混合物を使用することによって相乗効果を達成できることも発見した。従って、本発明のＳＨＱＡ誘導体と有効量の１種以上のその他の酸化防止剤、好ましくは、天然又は合成のトコフェロール、トコトリエノール、ＢＨＴ、ＴＢＨＱ，ＢＨＡ、没食子酸プロピル、ラジカル掃去剤、酸化防止特性を有する酵素、及び脂肪酸のアスコルビルエステルから成る群から選択されるもの、との混合物を使用するのが好ましい。
【００２４】
本発明者らは、さらに、これらの置換された酸が有益なアセチルコリンエステラーゼ活性も有することを発見した。従って、これらの化合物は、また、認識機能、重症筋無力症、緑内障を改善するため、そして学習及び記憶を強化するためにアルツハイマー病においても使用することができる。ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ）（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）のような膵臓リパーゼ阻害剤は、胃腸管内における脂肪の加水分解及び脂肪の吸収を減少させて生体の体重を減少させることが知られている。従って、本発明の組成物は、体脂肪の蓄積を予防するか及び／又は減少させる能力を有し、そして肥満を防止するか及び／又は治療するのを助ける。さらに、これらの置換された酸は、痩身の促進に対する効果を有し、そして穏やかに便通をよくする効果を有する。
【００２５】
その他の健康上の効果は、亜類型アルファ又はガンマのようなペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター用の配位子として作用する本発明の置換された酸の作用を含む。これらの転写調節因子は、脂質とグルコースの両方の代謝の重要な調節剤であり、そして本発明の置換された酸はこれらの最適化を助ける。ＰＰＡＲアルファに帰するものとすることができた本発明の置換された酸の効果は、脂質の代謝の改善、高脂血症の抑制、及びガンの予防と治療の両方における補助を含む。
【００２６】
インシュリンは、血液のグルコース濃度を正常で健康な限度内に維持するのに必須のホルモンである。インシュリンの作用が損なわれると、インシュリン抵抗性の人の状態において見られるように、これは多くの健康上の問題をもたらす可能性がある。短期間では、インシュリン抵抗性に関連する問題のタイプは、認識障害（劣った記憶力）、慢性疲労（活力の欠乏）及び気分変動を含む。より長い期間では、心循環器疾患、成人病タイプの糖尿病、及び多のう胞性卵巣症候群のような疾病の発生が一般的である。
【００２７】
ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲガンマ）は、転写調節因子のＰＰＡＲグループの一部を形成する核ホルモンレセプターである。これらは、ヘテロ二量体錯体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）中のＤＮＡを第２の核ホルモンレセプターＲＸＲと結合する、配位子活性化された転写調節因子である。ＰＰＡＲガンマは、炎症、ガン、認識及び細胞分化を含むその他の生物学的効果と共に、インシュリン感受性、血糖濃度の調節において役割を果たしていると考えられる。ＰＰＡＲガンマは、また、脂質の代謝の重要な調節剤であることも知られている。ＰＰＡＲガンマとのその相互作用のために、本発明の置換された脂肪酸は、インシュリン抵抗性及び、多のう胞性卵巣症候群、成人病タイプの糖尿病、妊娠性糖尿病、シンドロームＸ、高血圧症、脳卒中、グルコース代謝のような、関連する疾患に対して有益な効果を示す。効果は、血液のグルコース濃度の低減及び認識能力を含む。これらの置換された酸は、また、抗炎症性活性及び心循環器疾患、関節疾患、関節炎、ペクチン潰瘍疾患（ｐｅｃｔｉｃ ｕｌｃｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、炎症性腸疾患、炎症性皮膚疾患、神経変性疾患、及びアレルギーの予防又は治療に対する活性も有する。
【００２８】
皮膚の老化防止特性は、皮膚のしわ、たるみ、線（ｌｉｎｉｎｇ）を減少させることにおいて利益を有する真皮の蛋白質のコラーゲン又はデコリンの水準を増やすのに非常に有用である。加齢斑点の減少、組織修復の増強、炎症を起こした、赤い又は敏感な皮膚の鎮静、及びきめの改善における利益に加えて、皮膚の滑らかさと堅さが本発明の組成物の使用によって得られる。さらに、本発明の新規な組成物は、例えば、苦味のある飲料又はほろ苦いチョコレート中において、苦味を達成するための風味剤として使用することもできる。
【００２９】
本発明の最後の態様として、本発明は、また、グリセリド周囲環境中において、コンボナット油中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸、特にＳＨＱＡ、又はそれの誘導体を富化する方法であって、
（ｉ）十分量の所望の酸又はそれの酸誘導体を含むコンボナット油が選択され、
（ｉｉ）４０乃至６０℃、好ましくは４５乃至５０℃、の温度で塩基を添加することによる中和によって、この油が精製され、
（ｉｉｉ）粗反応生成物が有機相と水相とに分離され、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の水相が０乃至４、好ましくは０．５乃至１．５、のｐＨまで酸性化され、そして油質の相のみが汲み出され、
（ｖ）２０重量％より多くの量でヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸を含む生成物が回収される、
方法に関する。
【００３０】
【実施例】
実施例１
サルガヒドロキノン酸の膵臓リパーゼに対する効果
リパーゼ阻害アッセイ方法論
このアッセイは、５５０ｎｍにおける血清中の膵臓リパーゼ活性の定量的動的決定のための比色シグマ（Ｓｉｇｍａ）アッセイ（Ｌｉｐａｓｅ−ＰＳ^ＴＭ）から作成される。
【００３１】
反応：血清膵臓リパーゼは、モノグリセリドと脂肪酸を形成する天然の１，２−ジグリセリドの加水分解を触媒する。このモノグリセリドはモノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰ）によって加水分解されてグリセロールと脂肪酸を形成する。グリセロールは、その後、ＡＴＰの存在下にグリセロールキナーゼ（ＧＫ）によってホスホリル化されてグリセロール−３−ホスフェートを形成し、これはグリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼ（ＧＰＯ）によって酸化されてジヒドキシアセトンホスフェート（ＤＡＰ）と過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を形成する。その後、Ｈ_２Ｏ_２は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下に、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）及びナトリウムＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイド（ＴＯＯＳ）と反応してキノンジイミン色素を形成する。この色素は５５０ｎｍで光を吸収する。５５０ｎｍにおける吸収の増加の率は、サンプル中の膵臓リパーゼ活性に正比例する。
【００３２】
反応体：
シグマ診断用リパーゼ−ＰＳ反応体は、指示書に従ってもどされる。５μｌの水（ブランクウェル）又はリパーゼ−ＰＳ標準サンプル、及び２０μｌのブランク溶媒（エタノール／ＴＨＦ／アセトン；６０：２０：２０）又は溶媒中のサンプル（サルガヒドロキノン酸）と共に、基質溶液反応体（１４５μｌ）を３つずつ各々のウェルに添加する。プレートを攪拌しながら８分間室温でインキュベートする。リパーゼ−ＰＳ活性剤（５０μｌ）を全てのウェルに添加し、５５０ｎｍにおける吸収をマイクロタイター読み取り機上で、６０秒ごとに読み取りながらそして各々の読み取りの前に振盪を行って、動的に０〜３０分間測定する。６〜２４分の直線範囲における読みの傾きを計算し、ブランクの平均の傾きを引く。結果は、＋ｖｅ対照例より小さいか又は大きい、ｍＯＤ／分として表される。対照サンプルの阻害％として表される最終結果が図１中に示されている。
【００３３】
実施例２ − 老化防止効果
ヒトの真皮の繊維芽細胞中におけるプロコラーゲン−Ｉ及びデコリン合成の測定のための手順
真皮の繊維芽細胞の状態調節された媒体の調製
パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）２（Ｐ２）における一次（ｐｒｉｍａｒｙ）ヒト包皮繊維芽細胞を１２のウェルを有するプレートに１００００細胞／ｃｍ^２の割合で播種し、そして１０％の胎児の状態の子牛の血清で栄養補給されたダルベッコス改質イーグルス媒体（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中において５％の二酸化炭素と４％の酸素の雰囲気中において２４時間維持した。この時間の後、細胞を、血清を含まないＤＭＥＭで洗浄し、そしてその後新しい血清を含まないＤＭＥＭ中でさらに６０時間インキュベートした。繊維芽細胞の単層をその後再び血清を含まないＤＭＥＭで洗浄した。試験反応体（レチノイン酸又はサルガヒドロキノン酸）及びビヒクル対照例（ＤＭＳＯ中）を、０．４ｍｌ／ウェルの新しい血清を含まないＤＭＥＭの最終体積中の３つずつの細胞サンプルに添加し、そしてさらに２４時間インキュベートした。この繊維芽細胞の状態調節された媒体を直ちに分析するか又は将来の分析のために液体窒素中でスナップ冷凍（ｓｎａｐ ｆｒｏｚｅｎ）し、−７０℃で貯蔵した。細胞の数をその後数え、ドット−ブロット分析からのデータがその後細胞の数を標準化した。
【００３４】
真皮の繊維芽細胞の状態調節された媒体中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリン蛋白質に対するドットプロットアッセイ
（対照例としての）ビヒクル又は試験反応体で処理された真皮の繊維芽細胞からの状態調節された媒体のサンプルを２０ｍＭのジチオスレイトール（２００ｍＭ原料の溶液の１：１０の希釈物）及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（１０％原料溶液の１：１００の希釈物）で補完し、十分に混合し、そしてその後７５℃で２分間インキュベートした。このアッセイのための標準サンプルを、１７５ｃｍ^２のフラスコ中１００００細胞／ｃｍ^２の割合で播種された繊維芽細胞からの生の繊維芽細胞の状態調節された媒体の連続的な希釈によって生成し、上述した血清を含まないＤＭＥＭ中で維持した。
【００３５】
アッセイサンプルを、その後、製造業者のガイドラインに記載されているようにバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）からの９６のウェルのバイオ−ドット（Ｂｉｏ−Ｄｏｔ）装置を使用してインモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ移動膜（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の予め濡らされたシートの上に３つずつ塗布した。約２００μｌの媒体がウェル１個当たりに適用された。媒体を重力下に膜を通して濾過し（３０分間）、その後膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗浄液を重力下に膜を通して濾過した（２×１５分間）。バイオ−ドット装置をその後真空マニホールドに取り付け、そして３回目と最後のＰＢＳ洗浄を吸引下に行った。装置を分解し、膜を取り出し、そして必要に応じて速やかに切断し、その後遮断緩衝液中に４℃で一晩入れた。
【００３６】
デコリン分析用に調製された膜は、ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で遮断された。次の日に、膜を、ヒトのデコリンに対する一次抗体（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ウサギのポリクローナル生物発生）の１：１００００希釈物を使用して室温で２時間精査した。これらの膜をその後ＴＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で洗浄し（３×５分間）、そしてその後室温で１時間の間必要に応じて^１２５Ｉ−結合された抗ネズミ又は抗ウサギＦ（ａｂ’）２断片（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の１：１０００希釈物を使用してインキュベートした。
【００３７】
これに続いて、インモビロンの細長い片をＴＢＳ／トゥイーン２０で再び洗浄し（３×５分間）、その後室温の空気中で乾燥させた。乾燥した膜をセロファンで包み、そしてモレキュラーダイナミクス貯蔵燐光スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｓｃｒｅｅｎ）に１６〜１８時間さらした。この時間の終わりに、さらされたスクリーンを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^ＴＭソフトウェアを使用する燐光造影機（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（モレキュラー・ダイナミクス・ホスファーイメージャー・ＳＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ＳＦ））によってスキャンした。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^ＴＭ中の定量化ツールを使用するコンピューターによる像の分析によってドット強度を評価し、細胞の数に対して標準化し、そしてＳＨＱＡのような活性成分のデコリンの合成に対する効果を、任意の単位の１００のビヒクルで処理された対照例の値に比較して、決定した。レチノイン酸対サルガヒドロキノン酸の効果の比較を図２に示す。
【００３８】
皮膚中のデコリンの水準は皮膚の改善された状態と外観に関係する。皮膚中のデコリンの水準の増加は、皮膚中のコラーゲンの制御された正しい付着にとって重要であり、これはしわの消失及び光で損傷を受けた皮膚の真皮の修復のような多くの皮膚の利益に関係する。サルガヒドロキノン酸はデコリンの生産を増強し、この効果はレチノイン酸について観察されたものと同様である。
【００３９】
実施例３ − サルガヒドロキノン酸のＰＰＡＲαに対する効果（レポーター遺伝子アッセイ）
細胞培養液及びレポーター遺伝子アッセイ
Ｃｏｓ−７細胞（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ． ８７０２１３０２）を１０％ＦＣＳ（胎児の状態の子牛の血清）を有するＤＭＥＭ中において３７℃、５％ＣＯ_２で８０％の融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで通常通りに成長させた。一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）は製造業者（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）によって記載されたように行った。簡単に述べると、細胞を２４のウェルのプレート中にウェル１個当たり５０，０００細胞の割合でプレートアウトし、そして１０％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ中において３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。細胞をその後リポフェクト（Ｌｉｐｏｆｅｃｔ）ＡＭＩＮＥ反応体を使用してトランスフェクトした。各々のウェルに対して、２５μｌのＤＭＥＭ中の０．５μｇのＤＮＡミックス（「対照例」細胞に対してはｐＰＰＲＥ_３ＴＫ−ｌｕｃ ０．４０μｇ；ｐＲＬ−ＴＫ ０．０４μｇ；ｐｃＤＮＡ３．１（−） ０．０３μｇ；ｐＲＳＶ ０．０３μｇ；「プラスＲＸＲ」細胞に対してはｐＰＰＲＥ_３ＴＫ−ｌｕｃ ０．４０μｇ；ｐＲＬ−ＴＫ ０．０４αｇ；ｐｃＤＮＡ３．１（−） ０．０３μｇ；ｐＲＳＶ／ＲＸＲα ０．０３μｇ；「プラスＰＰＡＲα」細胞に対してはｐＰＰＲＥ_３ＴＫ−ｌｕｃ ０．４０μｇ；ｐＲＬ−ＴＫ ０．０４μｇ；ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ＰＰＡＲα ０．０３μｇ；ｐＲＳＶ ０．０３μｇ）を１μｌのリポフェクトＡＭＩＮＥを使用して、そしてまた２５μｌのＤＭＥＭ中において４５分間インキュベートした。混合物をその後ウェル１個当たり２５０μｌまで補い、そして細胞に添加したが、細胞は１ｍｌのＤＭＥＭで洗浄されていたものであった。細胞をその後３７℃、５％ＣＯ_２で５時間インキュベートし、そして２０％のＳＢＣＳ（チャコールでストリッピングされた子牛の血清；Ｓｉｇｍａ）を含む２５０μｌのＤＭＥＭを添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で１８時間回復させ、その後処理した。トランスフェクションミックスを細胞から取り除き、そして処理ミックス（ＤＭＳＯ又は１０μＭのサルガヒドロキノン酸）で置換し、そして３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。サルガヒドロキノン酸はＤＭＳＯ中の１０ｍＭの原料として作製し、そして１０％のＳＢＣＳを含むＤＭＥＭ中に１０００倍まで希釈し（ウェル１個当たり５００μｌ）、その後直ちに細胞に添加した。各々の処理は３つずつ行われた。細胞をその後１ｍｌのＰＢＳ（カルシウムもマグネシウムも含まない）で洗浄し、そしてウェル１個当たり１００μｌの１ｘパッシブリシス緩衝液（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（プロメガ・デュアル・ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）アッセイキットと共に供給されたもの）で溶解させた。溶解を１５分間継続させ、そしてその後溶解物をプロメガ・デュアル・ルシフェラーゼアッセイキットを使用してホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）とレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のルシフェラーゼ活性に関して検査した。この検査のために、２０μｌの溶解物を採取し、そしてＭＬＸマイクロタイタープレート照度計（Ｄｙｎｅｘ）を使用してキットの指示書に記載されているように検査した。
【００４０】
図３に示されているように、ＳＨＱＡはＲＸＲ配位子であるよりもむしろＰＰＡＲアルファである。ＰＰＡＲアルファ活性化に関連する健康上の効果は、脂質代謝の最適化、ガンの予防と治療、抗炎症効果を含む。
【００４１】
実施例４ − サルガヒドロキノン酸のＰＰＡＲγに対する効果（レポーター遺伝子アッセイ）
レポーター遺伝子アッセイ
このアッセイはＫｌｉｅｗｅｒらによって記載されたものに基づく（Ｎａｔｕｒｅ ３５８ ７７１−７７４ １９９２）。簡単に述べると、ｃｏｓ−７細胞（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ． ８７０２１３０２）を２４のウェルのプレート中に０．３２５×１０^５細胞／ウェルの密度で播種した。細胞を、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｉｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中において３７℃／５％ＣＯ_２で一晩成長させた。細胞をトランスフェクション媒体（２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ）で洗浄し、その後以下の４つのプラスミドで一時的にトランスフェクトした：ＰＰＡＲ−応答性のホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＰＰＲＥ３ＴＫ−ｌｕｃ）；ヒトのＰＰＡＲγ１及びＲＸＲα ｃＤＮＡｓをそれぞれ含む哺乳類の発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３／ｈＰＰＡＲγ１及びｐＲＳＶ／ｈＲＸＲα）及びレニラルシフェラーゼ遺伝子を構造的に発現する対照例プラスミド（ｐＲＬＴＫ、プロメガ）。トランスフェクションは、製造業者によって指示されたように、リポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ Ｂｒｌ）を使用して行った。トランスフェクトされた細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で６時間インキュベートし、そしてその後配位子の存在下又は不存在下にさらに４６時間インキュベートした。４６時間後、細胞の溶解物を調製し、そしてホタル及びレニラルシフェラーゼの水準をデュアル・ルシフェラーゼアッセイ系（プロメガ）及びＭＬＸマイクロタイタープレート照度計（Ｄｙｎｅｘ）を使用して決定した。ホタルルシフェラーゼの水準（レニラルシフェラーゼ対照例に対して規格化されたもの）は、レポーター遺伝子活性の目安を提供する。これは次にＰＰＡＲγ活性化の水準を反映する。
【００４２】
図４は、サルガヒドロキノン酸がＰＰＡＲγの良好な活性化を与えることを示す。ＳＨＱＡは、短期間においては、慢性疲労、認識障害（記憶）及び気分変動を含む、状態の範囲内において利益を有する。長期的な利益は、心循環器疾患（脂質の低下）、成人病タイプ糖尿病（高齢者に一般的）及び多のう胞性卵巣症候群に焦点が合わされるだろう。
【００４３】
実施例５ − サルガヒドロキノン酸の微生物数及び生体内変化に対する効果体上又は口中の微生物相の減少及び脂肪酸の揮発性脂肪酸への生体内変化の抑制は、体又は口中の悪臭の低減において有益である。
【００４４】
防臭剤活性成分としてのサルガヒドロキノン酸の生体外評価
セオリネバクテリア（ｃｅｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）Ａによる脂肪酸異化を再現する生体外モデル系は、２５０ｍｌの邪魔板付振盪フラスコから成り、これに脂肪酸基質（２．０ｍｇ／ｍｌのペンタデカン酸）及び非脂肪酸基質（０．５ｍｇ／ｍｌのグルコース）で栄養補完された３０ｍｌの半合成媒体（以下を参照のこと）を添加した。この系を潜在的防臭剤活性成分としてのサルガヒドロキノン酸を評価するために使用した；（対照例以外の）各々フラスコに、（１分の間に２４０００ｒｐｍのウルトラ均質化によって形成された）５．０ｍｇ／ｍｌのアラビアガムで栄養補完された半合成媒体中の２５ｇ／ｌの原料エマルジョンから、サルガヒドロキノン酸の特定投与量を添加した。フラスコを新しいバクテリアのバイオマス（コリネバクテリアＡ ＮＣＩＭＢ ４０９２８）で接種し、ＴＳＢＴ（以下を参照のこと）中で２４時間予め成長させて、約１．０の開始光学濃度（Ａ_５９０）を与えた。接種に続いて、フラスコを攪拌しながら（１３０ｒｐｍ）３５℃で好気的にインキュベートし、そして２４時間後に分析した。培養液の生存可能性は、４分の１濃度のリンガー液中への連続的希釈に続くＴＳＡＴプレート（以下を参照のこと）上での全生存可能カウント（ｔｏｔａｌ ｖｉａｂｌｅ ｃｏｕｎｔ）（ＴＶＣ）分析によって決定した。脂肪酸濃度はキャピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ）（以下を参照のこと）によって決定したが、一方、残留グルコース濃度は、レフロフラックス（Ｒｅｆｌｏｆｌｕｘ）Ｓグルコースメーター（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と組み合わせて使用される血液グルコース試験ストリップ（ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐｓ）（ＢＭ−試験 １−４４；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で測定された。「亜致死（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌ）」効果は、付随するコリネバクテリアＡの生存可能性の減少（≦１ ｌｏｇ_１０ ＣＦＵ／ｍｌの減少）又はグルコースの利用の減少（≦１０％の減少）を伴わない、脂肪酸異化の有意の抑制、典型的にはペンタデカン酸利用の５０％より大きい抑制、として定義される。これらの定義された境界の一方又は両方の外側においては、効果は「抗菌」として定義することができ、ここで、「抗菌」は静菌効果と殺菌効果の両方を含む。
【００４５】
腋窩のバクテリアの成長及び維持に使用されたトゥイーンで栄養補完されたトリプトン大豆ブイヨン及び寒天（ＴＳＢＴ及びＴＳＡＴ）の組成（ｇ／ｌ）：トリプトン大豆ブイヨン（３０．０）；イーストエキス（Ｂｅｔａ Ｌａｂ）（１０．０）；トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０^ＴＭ（１．０）；±寒天（２０．０）。コリネバクテリアＡによる脂肪酸の異化をシミュレートする生体外系において使用された半合成媒体の組成（ｇ／ｌ）：ＫＨ_２ＰＯ_４（１．６）；（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４（５．０）；Ｎａ_２ＳＯ_４（０．３８）；イースト窒素ベース（Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ）（Ｄｉｆｃｏ）（３．３５）；イーストエキス（Ｂｅｔａ Ｌａｂ）（０．５）；トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０^ＴＭ（０．２）；トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００^ＴＭ（０．２）；ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（０．５）。
【００４６】
フラスコ中の脂肪酸濃度をキャピラリーＧＣ分析によって決定した。初めに、各々のフラスコからの５．０ｍｌのアリコートをユニバーサルチューブに移し；内部標準（ラウリン酸、１．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度）を各々のチューブに添加し、そして培養媒体を塩酸の添加によって酸性化した（ｐＨ約２）。その後、２体積（１０ｍｌ）の酢酸エチルを使用して液−液抽出を行い；有機相と水性相を遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分間）によって分離させた。１５ｍ×０．３２ｍｍ（内径）のＦＦＡＰ（ニトロテレファリン酸（ｎｉｔｒｏｔｅｒｅｐｈａｌｉｃ ａｃｉｄ）改質ＰＥＧ／シロキサンコポリマー）石英ガラスキャピラリーカラム（フィルム厚 ０．２５ｍｍ）（Ｑｕａｄｒｅｘ）を備えたパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）８０００（シリーズ２）上での分析の前に、各々の有機（上）相の約０．７５ｍｌをその後サンプリングバイアルに移した。このカラムをＧＣの分割−非分割（ｓｐｌｉｔ−ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ）インジェクター及び水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）に接続したが、インジェクターと検出器の温度は各々３００℃であった。カラム用のキャリヤーガスはヘリウム（６ｐｓｉ（４１．３７ｋＰａ））であり、一方、水素（１７ｐｓｉ（１１７．２１５ｋＰａ））及び空気（２３ｐｓｉ（１５８．５８５ｋＰａ））がＦＩＤに供給された。脂肪酸分析のための温度プログラムは、８０℃（２分）；８０〜２５０℃（２０℃／分）；２５０℃（５分）であった。注入用のサンプルの量は０．５〜１．０μｌであった。フラスコ中の脂肪酸濃度は、内部（ラウリン酸）標準及び外部で試験された（ペンタデカン酸）標準の両方の既知濃度とのピーク面積の比較によって定量化された。
【００４７】
結果
【表１】

【００４８】
ペンタデカン酸の利用の明確に示される亜致死的抑制における効果：その他の効果は抗菌（静菌又は殺菌）的抑制によるものであるか、又は、括弧内にある場合、有意ではない。
【００４９】
実施例６
コンボナットからのサルガヒドロキノン酸（ＳＨＱＡ）含有抽出物の酸化防止活性
分析の方法：ランシマット（Ｒａｎｃｉｍａｔ）
全ての油脂は、飽和の程度、天然又は添加された酸化防止剤及び酸化促進剤によって異なる酸化に対する抵抗を有する。酸化はこの抵抗が克服されるまではゆっくりであるが、その克服された時点で酸化は加速し、非常に速くなる。酸化のこの急速な加速の前までの時間の長さは酸化に対する抵抗の目安であり、そして一般的に「誘導期間」と呼ばれる。
【００５０】
動物性及び植物性の油脂の酸化安定性の決定方法。
【００５１】
この方法は、スウィフト（Ｓｗｉｆｔ）誘導期間試験による油脂の酸化安定性の決定を説明する。きれいな空気の流れを、９０℃と１４０℃の間に加熱されているサンプルに通す。酸化によって形成した放出ガスは、空気の流れによって水を含む測定容器中に通される。水の導電性がメトローム・ランシマット（Ｍｅｔｒｏｈｍ ｒａｎｃｉｍａｔ）によって測定され、登録される。分解成分による導電性の増加は、誘導期間の終わりを意味する。スウィフト誘導期間は時間単位で測定される。
【００５２】
反応体及び装置
アセトン
モレキュラーシーブ
ガソリン（ｐｅｔｒｏｌ）エーテル
メトローム・ランシマット（Ｍｅｔｒｏｈｍ ｒａｎｃｉｍａｔ）７４３
法律的にスタンプされた（ｌｅｇａｌｌｙ ｓｔａｍｐｅｄ）温度計。
【００５３】
サンプルの調製
ヒマワリ油に、異なる濃度のトコミックス（ｔｏｃｏｍｉｘ）及びＳＨＱＡ含有抽出物を添加した（表を参照のこと）。サンプルの量：約３ｇ。
【００５４】
サンプルの貯蔵
調製とランシマットの測定の間、サンプルはガラス又はコルク製の栓を使用して直ちに密封され、そして冷蔵庫中に貯蔵されなければならない。ランシマットはできるだけ速やかに測定される。
【００５５】
【表２】

【００５６】
結論
ＳＨＱＡ抽出物を含むヒマワリ油についての全ての場合において、トコミックスを含むヒマワリ油と比較して、より長いスウィフト誘導期間が測定された。従って、ＳＨＱＡ含有抽出物については、トコミックスよりも高い酸化防止剤活性が示された。
【００５７】
実施例７： コレステロールエステラーゼ阻害剤としてのサルガヒドロキノン酸（ＳＨＱＡ）
方法論
全てのアッセイ材料は、バイオザイム・ラボラトリーズ・リミテッド（Ｂｉｏｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）から得られたコレステロールエステラーゼを除いて、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た。サルガヒドロキノン酸（ＳＡＱＡ、約９０％の純度）はコンボナットのヘキサン抽出とそれに続くシリカクロマトグラフィーによって得た。
【００５８】
脂肪相の調製
コレステロール、オレイン酸、及びＳＨＱＡを、この混合物を溶解するのに十分なジエチルエーテルと共に、秤量して８ｍｌのバイアルに入れた（６ｍｌのジエチルエーテル中０．０１８ｇのコレステロール、０．００９ｇと０．０３６ｇの間のＳＨＱＡ、及び０．０９ｇのオレイン酸）。乾燥窒素の流れを使用して、エーテルを乾燥するまで蒸発させた。
【００５９】
アッセイ緩衝液の調製
タウロコール酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン、及び塩化アンモニウムをｐＨ６．２の０．１５４ｍＭ燐酸塩緩衝液中に溶解した（典型的には０．５２ｇのタウロコール酸ナトリウム、０．２３ｇのウシ血清アルブミン、及び０．１８ｇの塩化アンモニウムを５０ｍｌの緩衝液中に溶解した）。
【００６０】
エステラーゼ溶液の調製
コレステロールエステラーゼ（バイオザイム製、源ブタの膵臓）をｐＨ６．２の０．１５４Ｍ燐酸塩緩衝液中に溶解した。
【００６１】
検定方法
アッセイ緩衝液（６ｍｌ）を、回転混合機を使用して混合された乾燥脂質混合物に添加し、その後超音波浴中に６０℃で３０分間入れた。バイアルを密封し、そして３７℃の振盪水浴（２００振盪／分）に１５分間移した。６ｍｌのエステラーゼ溶液を添加し、そしてバイアルを再び密封して３７℃で振盪した。エステラーゼの添加の直後と１時間の振盪後に、１ｍｌのサンプルを採取し、これらを３ｍｌのイソプロパノールに添加し、８０℃で３０分間加熱して、エステラーゼ活性を破壊し、そして蛋白質物質を沈殿させた。これらのサンプルを濃塩酸で酸性化し、４ｍｌの水を添加し、そして暖かいジエチルエーテルの２つのアリコートで抽出された脂質を、その後硫酸ナトリウムで脱水した。ジエチルエーテルを除去し、そして抽出された脂質を２００μｌのビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＦＴＡ）及び１００μｌのピリジンと共に３０分間加熱することによってシリル化し、その後炭素数ＧＣによって分析した。
【００６２】
図５中に示されているように、ＳＨＱＡの存在はコレステロールのオレイン酸コレステロールへの転化を阻害した。これはコレステロールエステラーゼの阻害を反映する。
【００６３】
ＳＨＱＡの添加のアセチルコリンエステラーゼの活性に対する効果
アセチルコリンエステラーゼ活性をエルマンの方法（Ｅｌｌｍａｎｓ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｇ．Ｉ Ｅｌｌｍａｎ， Ｄ． Ｃｏｕｒｔｎｅｙ， Ｖ． Ａｎｄｒｅｓ Ｊｒ．， Ｒ．Ｍ． Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ７ （１９６１） ８８．）に基づいて９６のウェルのマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【００６４】
ＳＨＱＡ（シリカクロマトグラフによって精製されたもの）をエタノール／テトラヒドロフラン／アセトンの６０／２０／２０の混合物に１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。連続的な希釈をその後必要に応じて行った。これらの溶液をｐＨ８の５０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝液を使用してさらに１０分の１に希釈した。
【００６５】
ＳＨＱＡ溶液（２０μｌ）、沃化アセチルチオコリン（ＡＣＴＩ；２５μｌ 水中１５ｍＭ）、ジチオビスニトロ安息香酸（ＤＮＴＢ；１２５μｌ ０．１ＭのＮａＣｌ及び０．０２ＭのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを含むｐＨ８の５０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝液中３ｍＭ）、トリス−ＨＣＬ緩衝液（５０μｌ；０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭ ｐＨ８）を電気ウナギからのアセチルコリンエステラーゼ（シグマＶＩ−ｓ型 凍結乾燥粉末）（２０μｌ ０．１％のウシ血清アルブミンを含むｐＨ８の５０ｍＭトリス−ＨＣＬ中１．５μｇ／ｍｌ）と共にウェルに入れた。
【００６６】
吸収を４１０ｎｍにおいて１３秒ごとに８回測定した。試験材料のＯＤの変化の割合をブランク溶液と比較した。
【００６７】
図６に示されているように、ＳＨＱＡがアセチルコリンエステラーゼ活性を阻害することが示された。
【００６８】
実施例８
コンボナット油の抗炎症効果
ヒトの皮膚の繊維芽細胞によって製造されるプロスタグランジンＥ２（＝ＰＧＥ２）の生産が炎症モジュラス（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍｏｄｕｌｕｓ）ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）によって誘引された後測定される生体外試験によって、抗炎症効果が決定された。ＰＧＥ２の水準の低下は抗炎症効果を示す。
【００６９】
パッセージ２（Ｐ２）の一次（ｐｒｉｍａｒｙ）ヒト包皮繊維芽細胞を９６のウェルのプレート中に１００００細胞／ウェルの割合で播種し、そして１０％の胎児状態の子牛の血清で栄養補完されたダルベッコス改質イーグルス媒体（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中において５％の二酸化炭素の雰囲気中において２４時間維持した。（ＳＨＱＡを含む）コンボナット油鹸化可能物を３つのエタノール中の新しい細胞媒体（最終濃度１％）に添加し、そしてさらに２４時間インキュベートした。エタノール／細胞媒体中のＰＭＡをこの媒体に添加し、そして細胞をさらに２４時間インキュベートした。ＰＭＡは、細胞中において酸化的ストレスと炎症反応を引き起こす外部ストレッサーとして作用する。繊維芽細胞／媒体をその後直ちに以下に記載したように分析するか、又は将来の分析のために液体窒素中でスナップ冷凍し−７０℃で貯蔵した。
【００７０】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイ 培養プレートを穏やかに振盪した後、５０μｌの体積の培養媒体をＰＧＥ２アッセイのために採取した。媒体中のＰＧＥ２濃度はバイオトラク（Ｂｉｏｔｒａｋ）ＰＧＥ２免疫学的検定キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＵＫ）を使用して決定した。この検定は、限定された量の固定されたＰＧＥ２特異性抗体に対するサンプル中の標識付けされていないＰＧＥ２と西洋ワサビペルオキシダーゼで標識付けされたＰＧＥ２の固定された量との間の競合に基づく。標識付けされていないサンプルＰＧＥ２の濃度は、同時に得られた標準曲線に従って決定される。
【００７１】
ＰＧＥ２濃度に対するコンボナット油鹸化可能物の効果を図７に示す。
【００７２】
グラフ（図７）は、ＰＭＡのような炎症刺激による繊維芽細胞への挑戦がＰＧＥ２の生産によって測定される炎症反応の増加を生じさせることを示す。サルガヒドロキノン酸を含むコンボナット油鹸化可能物（ｓａｐｓ）は、０．１ｎｇ／ｍｌの水準においてさえ、ＰＧＥ２の生産によって測定される炎症反応を劇的に減少させる。−良好な抗炎症活性。
【００７３】
実施例９ 食品用途について
材料及び方法
ＳＨＱＡの製造
ＳＨＱＡの製造を以下のように行った：
− コンボナットの殻剥き
− 油を抽出するための殻剥きされたコンボナットの圧搾、
− 油の濾過、
− ＳＨＱＡ塩を得るための濾過された油の中和、
− 酸性化によるＳＨＱＡの回収。
【００７４】
ＳＨＱＡの純度は約７５％であった。残りの２５％は、グリセリド、遊離脂肪酸（ｆｆａ）、及び水から主に成った。
【００７５】
◆ パネリング
ＳＨＱＡの富化された食品生成物を、ＳＨＱＡが存在しない参照例で製造されたものと比較した。
【００７６】
Ａ：ミューズリバー（Ｍｕｅｓｌｉ ｂａｒｓ）
◆ 結合混合物の調製
【表３】

【００７７】
脂肪の約８９％を、スキムミルク粉末、氷砂糖、クリームバニリン、及びレシチンとボールミル中において４０分間混合した。残りの脂肪との攪拌によってＳＨＱＡを均一に混合し、そしてその後結合混合物に添加した。ＳＨＱＡを含まない結合混合物を参照例として使用した。
【００７８】
◆ ミューズリバーの調製
５５％の結合混合物を２５％のミューズリ混合物（スーパーマーケットタイプ）、１０％のビスケット再生物（ｒｅｗｏｒｋ）、及び１０％のライス・クリスプ（ｒｉｃｅ ｃｒｉｓｐｓ）と混合することによってバーを製造した。混合物をその後型中でプレスして成型し、冷却し、型から外し、コーティングし、そして冷却した。
【００７９】
以下の属性が評価された：
● ミューズリバーのバリバリ感（ｃｒｕｎｃｈｉｎｅｓｓ）
● 全体的外観
● 全体的きめ。
【００８０】
結論
パネリングの結果から以下の結論を引き出すことができた：
◆ バーの全体的きめ、バリバリ感、及び全体的外観は、ＳＨＱＡの富化された結合混合物を含むバー及び参照例のバーにおいて同等であった；
◆ 結合混合物へのＳＨＱＡの添加は混合物をわずかに粘着性にし、そして従ってそれは型外し工程に対して小さい負の影響を有した。しかしながら、より大きい粘着性はバーの品質に悪影響しなかった。
【００８１】
Ｂ： パンの調製
【表４】

【００８２】
予め８５％の水中に分散させられたイーストを小麦粉及び塩と混合した。ＳＨＱＡエキス及び残りの水を添加し、そしてドウが形成されるまで混合を続けた。
【００８３】
４０分間の発酵と再加工（３回行われた）の後、パンを２７０℃で３５分間焼いた。ＳＨＱＡを含まないパンを参照例として使用した。
【００８４】
パネリング
以下の属性をパンにおいて評価した：
◆ ドウのコンシステンシー
◆ 構造
◆ 全体的外観
◆ 風味
◆ 柔らかさ及び体積
◆ 噛み心地（ｃｈｅｗｉｎｅｓｓ）。
【００８５】
結論
試験の結果から、以下の結論を引き出すことができた：
◆ ドウのコンシステンシー、構造、柔らかさ、体積及び噛み心地は、ＳＨＱＡの富化されたパン及び参照例のパンにおいて同等であった。
◆ ＳＨＱＡの富化されたパンの色の小さい相違が検知されたが、パンの品質に影響することはなかった。
◆ ＳＨＱＡのパンでの添加は、製造中及び焼成中のドウの特性に影響しなかった。
【００８６】
Ｃ：ミューズリバー用のコーティング
◆ コーティングの調製
【表５】

【００８７】
脂肪、ＳＨＱＡ及びレシチンを除く全ての成分をホバート（Ｈｏｂａｒｔ）ミキサー中で混合した。できるだけ少ない脂肪を混合物に非常にゆっくりと、ドウが形成されるまで、添加した。ドウをその後レファイニングしそしてコンチングし、全脂肪の６％を除いて残りの脂肪をコンチに添加した。コンチングプロセスの終わりの１５分前にレシチンを最後に添加した。残された脂肪と攪拌することによってＳＨＱＡを均一に混合し、そしてその後コーティング混合物に添加した。ＳＨＱＡを含まないコーティングを参照例として使用した。
【００８８】
◆ ミューズリバーの調製
ミューズリバーをコーティングし、そして冷却トンネル中で冷却した。
【００８９】
◆ パネリング
ＳＨＱＡの富化されたコーティングでコーティングされたバーを標準的コーティングでコーティングされたバーと比較した。
【００９０】
以下の属性をコーティング中において評価した：
● 全体的外観
● 全体的きめ。
【００９１】
結論
パネリングの結果から、以下の結論を引き出すことができた：
◆ ＳＨＱＡのコーティング混合物への添加は製造及びコーティング工程中のコーティング混合物の特性に影響しなかった。
◆ ＳＨＱＡの富化されたバーの全体的なきめは参照例のバーのものと同等であった。
◆ ＳＨＱＡの富化されたバーのコーティングの色は、参照例のバーのものよりもわずかに暗かった。しかしながら、色の相違は否定的に見られなかった。
【００９２】
Ｄ：アイスクリーム
アイスクリームの調製
【表６】

【００９３】
砂糖、ミルク粉末、及びデキストロースを混合し、そして水に添加した。混合物を７０℃まで加熱し、シロップを添加した。脂肪／ＳＨＱＡブレンド及び乳化剤をその後添加した。エマルジョンをウルトラ−ターラックス（ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ）で攪拌し、２０℃まで冷却し、そしてウルトラ−ターラックスで再び攪拌した。エマルジョンを７℃の冷蔵庫中で一晩放置した。エマルジョンをその後、予め−２０℃で２４時間冷却されたアイスクリーム機械中で４０分間攪拌した。ＳＨＱＡを含まないアイスクリームを参照例として使用した。
【００９４】
◆ パネリング
ＳＨＱＡの富化されたアイスクリームを参照例のアイスクリームと比較した。
【００９５】
以下の属性がアイスクリームにおいて評価された：
● 全体的外観
● 融解
● 全体的きめ。
【００９６】
結論
試験の結果から、以下の結論を引き出すことができた：
◆ ＳＨＱＡの富化されたアイスクリームの融解は、参照例のアイスクリームのものと同等であった。
◆ 参照例のアイスクリームと比較した場合、ＳＨＱＡの富化されたアイスクリームの色ときめにおいて小さい相違が検知された。しかしながら、そのような相違は、アイスクリームの全体的品質を損なわなかった。
◆ ＳＨＱＡのアイスクリームへの添加は、加工中のアイスクリーム混合物の特性に影響しなかった。
【００９７】
Ｅ：脂肪に基づくスプレッド
脂肪に基づくミントスプレッドの調製
【表７】

【００９８】
脂肪の約９３％を全クリームミルク粉末、スキムミルク粉末、氷砂糖、クリームバニリン、及びレシチンとボールミル中において４０分間混合した。ＳＨＱＡを攪拌によって残りの脂肪に均一に混合し、そしてその後スプレッド混合物に添加した。ＳＨＱＡを含まないスプレッドを参照例として使用した。
【００９９】
◆ パネリング
ＳＨＱＡを含むスプレッドを参照例のスプレッドと比較した。
【０１００】
以下の属性をスプレッドにおいて評価した：
● 全体的きめ
● 全体的外観
● 延展性（ｓｐｒｅａｄａｂｉｌｉｔｙ）。
【０１０１】
結論
パネリングの結果から、以下の結論を引き出すことができた：
◆ ＳＨＱＡで富化された脂肪に基づくミントスプレッドの全体的きめ、延展性、及び全体的外観は、参照例のものと同等であった。
◆ 小さい色の相違が参照例と富化されたスプレッドの間で検知されたが、スプレッドの品質に悪影響することはなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】サルガヒドロキノン酸の膵臓リパーゼに対する効果を示すグラフである（実施例１）。
【図２】サルガヒドロキノン酸のデコリンの生産に対する効果を示すグラフである（実施例２）。
【図３】サルガヒドロキノン酸のＰＰＡＲα及びＲＸＲに対する効果を示すグラフである（実施例３）。
【図４】サルガヒドロキノン酸がＰＰＡＲγの良好な活性化を与えることを示すグラフである（実施例４）。
【図５】サルガヒドロキノン酸のコレステロールエステラーゼに対する効果を示すグラフである（実施例７）。
【図６】サルガヒドロキノン酸のアセチルコリンエステラーゼの活性に対する効果を示すグラフである（実施例７）。
【図７】コンボナット油鹸化可能物のＰＧＥ２濃度に対する効果を示すグラフである（実施例８）。

Claims (18)

1. 置換された有機酸、又はそのエステル又は塩、及びグリセリドを含むブレンドであって、当該ブレンドが、
   （ｉ）０．１乃至９９．９重量％のコンボナット油中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸、又は該不飽和脂肪酸と１乃至３２個の炭素原子を有するアルコールとのエステル、又は食品として許容可能なそれらの塩、
   （ｉｉ）０乃至９９．８重量％のコンボバターグリセリド、及び
   （ｉｉｉ）０．１乃至９９．９重量％のその他のトリグリセリド、
   を含む、ブレンド。
2. ２乃至９５重量％のヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸、又はそれらのエステル又は塩を含む、請求項１のブレンド。
3. ４乃至９７重量％のコンボバターグリセリドを含む、請求項１又は２のブレンド。
4. １乃至９４重量％のその他のトリグリセリドを含む、請求項１乃至３のいずれか１請求項のブレンド。
5. コンボナット油中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸がサルガヒドロキノン酸（＝ＳＨＱＡ）である、請求項１乃至４のいずれか１請求項のブレンド。
6. 前記エステルが、ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸と２乃至２０個の炭素原子を有する直鎖の飽和及び／又は不飽和アルコールとのエステルである、請求項１乃至５のいずれか１請求項のブレンド。
7. 直鎖の飽和及び／又は不飽和アルコールが、１４乃至１８個の炭素原子を有する、請求項６のブレンド。
8. 前記ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸の食品として許容可能な塩が、Ｎａ又はＫ又はＣａ塩である、請求項１のブレンド。
9. その他のグリセリドが、パーム油；カカオ脂；ココナッツ油；パーム核油；大豆油；オリーブ油；ヒマワリ油；菜種油；サフラワー油；コーン油；綿実油；カカオ脂同等物又はカカオ脂代替物；魚油；ボーリッジ油、松の実油；コリアンダー油；真菌油、又はそれらの高オレイン品種、又はそれらの画分、又はそれらの硬化された品種、又は硬化された品種の画分又はこれらの油脂の１種以上の混合物から成る群から選択される、請求項１乃至８のいずれか１請求項のブレンド。
10. ブレンドが、Ｎ_５＝５乃至８０、そしてＮ_３５＝２０未満の、示された温度における非安定化ブレンドについてのＮＭＲパルスによって測定される、固体脂肪含有質を示す、請求項９のブレンド。
11. ブレンドが、Ｎ _５ ＝１０乃至７０、そしてＮ _３５ ＝１乃至５の、固体脂肪含有質を示す、請求項１０のブレンド。
12. ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸がピクナンサス・アンゴレンシスナット油から単離される、請求項１乃至１１のいずれか１請求項のブレンド。
13. ブレンドが酸化安定剤の有効量を含む、請求項１乃至１２のいずれか１請求項のブレンド。
14. 前記酸化安定剤が、天然又は合成のトコフェロール、ＢＨＴ、ＴＢＨＱ、ＢＨＡ、没食子酸プロピル；フリーラジカル掃去剤、酸化防止特性を有する酵素及び脂肪酸のアスコルビルエステルから成る群から選択される、請求項１３のブレンド。
15. グリセリド周囲環境中において、コンボナット油中に存在するヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸、又は該不飽和脂肪酸と１乃至３２個の炭素原子を有するアルコールとのエステル、又は食品として許容可能なそれらの塩を富化する方法であって、
    （ｉ）十分量の所望の酸又はそれらのエステル又は塩を含むコンボナット油が選択され、
    （ｉｉ）４０乃至６０℃の温度で塩基を添加することによる中和によって、この油が精製され、
    （ｉｉｉ）粗反応生成物が有機相と水性相とに分離され、
    （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の水相が０乃至４のｐＨまで酸性化され、そして有機相が汲み出され、
    （ｖ）２０重量％より多くの量でヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸を含む生成物が回収される、
    方法。
16. ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸がサルガヒドロキノン酸（＝ＳＨＱＡ）である、請求項１５の方法。
17. 工程（ｉｉ）の油が４５乃至５０℃の温度で塩基を添加することにより精製される、請求項１５又は１６の方法。
18. ヒドロキノン置換された多不飽和脂肪酸の食品として許容可能な塩がＮａ又はＫ又はＣａ塩である、請求項１５乃至１７のいずれか１請求項の方法。

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