DE60210382T2

DE60210382T2 - Zusammensetzung enthaltend eine substituirte Fettsäure oder ein substituirtes Fettsäurederivat

Info

Publication number: DE60210382T2
Application number: DE60210382T
Authority: DE
Inventors: Scott Sinclair Sharnbrook Bedford Barclay; John Anthony Sharnbrook Bedford Bosley; Frederick William Cain; Claudia Koenen; Julia Sarah Sharnbrook Rogers; Ulrike Schmid
Original assignee: Loders Croklaan BV
Current assignee: Loders Croklaan BV
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: DE60210382D1; EP1287825B1; JP2003119493A; DK1287825T3; EP1287825A1; ATE322256T1; JP2007044046A; ES2264463T3; US20100029766A1; JP4444935B2; JP4191447B2; PT1287825E; US7582317B2; US20030129294A1

Description

Kombonusskernöl ist ein bekanntes Produkt, das von den Kernen von Pycnanthus angolensis erhalten werden kann (s. z. B. WO 96/39130). Die Komponenten, die bei diesem Fett vorliegen, wurden durch unterschiedliche Gruppen analysiert, und eine Anzahl von Inhaltsstoffen vom Terpenoidsäuretyp wurde identifiziert. Einer dieser Inhaltsstoffe wurde als neue mit polyprenyliertem Hydroquinon substituierte Carbonsäure genannt Kombosäure identifiziert, von der festgestellt wurde, dass sie eine Struktur aufweist, die bei Lok c.s. Phytochemistry 22, S. 1973 aus 1983 erwähnt wird (d. h. 16-(2¹,5¹-Dihydroxy-3¹-methylphenyl)-2,6,10,14-tetramethyl-2,6,10,14-hexadecatetraensäure). Obwohl Kombonussöl, das diesen Inhaltsstoff vom Terpenoidsäuretyp enthält, als nützlich und eine Anzahl von Gesundheitsvorteilen, wie beispielsweise hypoglykämische Aktivität, Aktivität gegen Hautpilzinfektionen; Aktivität für die Behandlung von Gürtelrose oder gegen Lepra; Kopfschmerzen, Körperschmerzen, Brustschmerzen oder als Antisterilitätsmittel für Frauen oder als Anthelminthikum oder als Antigift oder als Zahnschmerzmittel oder als blutungsstillendes Mittel usw. aufweisend offenbart wurde (s. z. B. WO 96/39130), wurde keine Beziehung zwischen der Anwesenheit einer bestimmten Komponente und dem Auftreten eines bestimmten Gesundheitseffekts angegeben.
Die US 3,615,588 offenbart Mischungen aus Ölen, die reich an Trimyristin sind, und anderen Ölen. Das verwendete Trimyristin kann von Kombonussöl erhalten werden.
Wir analysierten das Kombonussfett weiter und fanden heraus, dass dieses Fett einen Inhaltsstoff enthält, der durch Massenspektroskopie und ¹³C-NMR als Sargahydroquinonsäure (=SHQS) [(CA-Name: 12-(2¹,5¹-Dihydroxy-3¹-methxlphenyl)-6,10-dimethyl-2-(4¹-methyl-3¹-pentenyl)-2E,6E,10E-dodecatriensäure)] identifiziert wurde, und dass diese Verbindung und eine Anzahl ihrer Derivate nützliche Gesundheitsvorteile zeigen. Diese Verbindung SHQS wird normalerweise in Kombination mit Glyceriden angewandt. Diese Glyceride können die Triglyceride sein, die in Kombonussöl vorliegen, aber auch andere Glyceride können in Kombination mit SHQS verwendet werden.
Deshalb betrifft unsere Erfindung im ersten Fall Mischungen, die eine substituierte organische Säure oder ein Derivat davon und ein Glycerid aufweisen, wobei die Mischungen aufweisen

(i) 0,1 bis 99,9 Gewichts-%, vorzugsweise 2 bis 95 Gewichts-%, mehr bevorzugt 10 bis 80 Gewichts-% einer Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, wie sie in Kombonussöl vorliegt, bei der es sich insbesondere um Sargahydroquinonsäure (= SHQS) handelt, oder eines Derivats davon, wie beispielsweise Ester dieser Fettsäuren mit Alkoholen mit 1 bis 32 Kohlenstoffatomen oder Nahrungsmittel-akzeptable Salze davon.
(ii) 0 bis 99,8 Gewichts-%, vorzugsweise 4 bis 97 Gewichts-%, mehr bevorzugt 10 bis 80 Gewichts-% Kombobutterglycerid und
(iii) 0,1 bis 99,9 Gewichts-%, vorzugsweise 1 bis 94 Gewichts-%, mehr bevorzugt 10 bis 80 Gewichts-% andere Glyceride.

Die Derivate der substituierten Fettsäure werden vorzugsweise ausgewählt aus Estern der Hydroquinonsubstituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure und einem geradkettigen gesättigten und/oder ungesättigten Alkohol mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen. Andere bevorzugte Derivate sind die Na- oder K- oder Ca-Salze der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure. Diese Produkte werden durch Veresterung mit dem erforderlichen Alkohol unter wohlbekannten Bedingungen bzw. durch Neutralisation der Säuren mit der erforderlichen Base leicht aus der freien Säure hergestellt.
Es ist auch möglich, Ester zu verwenden, die aus der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure und einer Fettsäure mit 2 bis 32 Kohlenstoffatomen hergestellt wurden, indem mindestens eine der Hydroxygruppen der substituierten Säure verestert wurde.
Die anderen Glyceride können ausgewählt werden aus oder erhalten werden von einem großen Bereich an natürlichen Glyceriden, z. B. den Triglyceriden, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Palmöl, Kakaobutter, Kokosnussöl, Palmkernöl, Sojaöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, Rapsöl, Färberdistelöl, Maisöl, Baumwollkernöl, Kakaobutteräquivalenten oder Kakaobutterersatzstoffen, Fischöl, Borretschöl, Pinienkernöl, Korianderöl, Pilzölen oder hoch oleinsäurehaltigen Varianten davon oder Fraktionen davon oder gehärteten Varianten davon oder Fraktionen von gehärteten Varianten oder Mischungen von einem oder mehreren dieser Öle und Fette.
Für Nahrungsmittel ist es jedoch bevorzugt, ein Triglycerid zu verwenden, das eine Mischung mit einem geeigneten und stabilisierten N-Wert bereitstellt, wie er durch NMR-Pulstechniken gemessen wird, weil dies die Anwendung dieser Mischungen in Nahrungsmittelprodukten viel einfacher macht. Unstabilisiert bedeutet, dass der N-Wert gemessen wird, nachdem die Mischung zuerst oberhalb 80 °C geschmolzen wird, woraufhin die Schmelze auf 0 °C abgekühlt und für 30 min bei 0 °C gehalten wird, dann die Mischung auf die Messtemperatur aufgewärmt wird und bei dieser Temperatur für 30 min gehalten wird, woraufhin der N-Wert gemessen wird. Bevorzugte N-Werte für die Mischung sind ein N₅ = 5 bis 80, vorzugsweise 10 bis 70, und N₃₅ = weniger als 20, vorzugsweise 1 bis 5.
Anstelle des Mischens der substituierten Säure mit Glyceriden können wir sie mit freien Fettsäuren, wie beispielsweise konjugierter Linolsäure (= KLS), Linolsäure (sowohl alpha- als auch gamma-), Fischölfett säuren oder anderen mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie beispielsweise Punikinsäure, Eleostearinsäure, Parinarinsäure usw., mischen.
Obwohl die Hydroquinon-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäurekomponente entlang unterschiedlicher Routen erhalten werden kann, die synthetische Routen ausgehend von geeigneten Materialien umfassen, ist es bevorzugt, diese Komponenten aus natürlichen Quellen zu isolieren. Eine bevorzugte natürliche Quelle, die diese Säure in wesentlichen Mengen enthält, ist das Öl von den Nüssen von Pycnanthus angolensis. Eine andere natürliche Quelle ist Braunalge (Chemistry Letters 1987, 1365–1366).
Da die Säuren gemäß der Erfindung mehrfach ungesättigt sind, unterliegen diese Säuren Zerstörung durch Oxidation. Deshalb ist es anzuraten, diese Säuren in Kombination mit einem Antioxidationsmittel zu verwenden. Geeignete Antioxidationsmittel können aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus natürlichen oder synthetischen Tocopherolen, BHT, TBHQ, BHS, Propylgallat, freie Radikale abfangenden Mitteln, Enzymen mit antioxidativen Eigenschaften und Ascorbylestern von Fettsäuren. Die Mengen, in denen die Antioxidationsmittel angewandt werden, können als effektive Mengen angegeben werden, wobei die tatsächliche Menge von Faktoren, wie dem Typ des Antioxidationsmittels, dem Typ der vorliegenden mehrfach ungesättigten Fettsäure, dem Typ des Nahrungsmittels, der Anwesenheit anderer Komponenten usw. abhängen. Jedoch kann die effektive Menge für jede spezielle Situation durch den Fachmann leicht bestimmt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform unserer Erfindung betrifft unsere Erfindung auch Nahrungsmittelprodukte, die eine effektive Menge einer Gesundheitskomponente aufweisen, wobei die Gesundheitskomponente eine Hydroquinon-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure ist, wie sie in Kombonussöl oder Extrakten oder Derivaten davon vorliegt, wobei es sich insbesondere um Sargahydroquinonsäure (=SHQS) oder ein Derivat davon handelt. Die substituierte Säure ist vorzugsweise die Säure, wie sie von Kombonussöl erhalten wird.
Im Prinzip kann das Nahrungsmittel jegliches Nahrungsmittelprodukt sein, das mit den substituierten Säuren oder deren Derivaten kombiniert werden kann. Wir bevorzugen es jedoch, diese Komponente in Nahrungsmittelprodukten zu verwenden, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche besteht aus Margarine, fettkontinuierlichen oder wasserkontinuierlichen oder doppeltkontinuierlichen Aufstrichen, fettreduzierten Aufstrichen, Konfektprodukten, so wie Schokolade oder Schokoladebeschichtungen oder Schokoladefüllungen oder Backwarenfüllungen, Eiscremes, Eiscremebeschichtungen, Eiscremeeinlagen, Dressings, Majonäsen, Käse, Sahnealternativen, Trockensuppen, Getränken, Müsliriegeln, Saucen und Zwischenmahlzeitriegeln.
Anstelle, die substituierten Säuren in Nahrungsmittelprodukten zu verwenden, können wir sie auch in Nahrungsergänzungsmitteln verwenden. Deshalb sind auch Nahrungsergänzungsmittel, die eine effektive Menge einer Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, wie sie in Kombonussöl oder Extrakten vorliegt, oder ein Derivat davon, wobei es sich insbesondere um Sargahydroquinonsäure (_ SHQS) oder ein Derivat davon handelt, in einem einkapselnden Material oder als Granulat oder in Pulverform aufweisen, Teil unserer Erfindung. Das einkapselnde Material für die Ergänzungsmittel ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Gelatine, Stärke, modifizierter Stärke, Mehl, modifiziertem Mehl, Zuckern, insbesondere Saccharose, Lactose, Glukose und Fructose, besteht.
Wir haben herausgefunden, dass unsere neu identifizierten Säurekomponenten eine Anzahl von nützlichen Gesundheitsvorteilen aufweisen. Deshalb betrifft unsere Erfindung auch die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Hydroquinon-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure, wie sie in Kombonussöl vorliegt, oder Extrakte oder ein Derivat davon als einen aktiven Inhaltsstoff aufweist, für die Zubereitung von Nahrungsmittelzusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmitteln mit einem Gesundheitseffekt, wobei der Gesundheitseffekt das Wirken als Lipaseinhibitor, insbesondere als Inhibitor von Pankreaslipase oder gastritischer Lipase, und/oder die Wirkung als Ligand für Subtypen Alpha oder Gamma von Rezeptoren, die durch Peroxisomprofilator aktiviert werden, und/oder die Reduzierung und/oder Verhinderung des Alterns, insbesondere des Altern der Haut, und/oder die Wirkung auf lichtgeschädigte Haut und/oder die Förderung der Bildung von Dekorin in der Dermis der Haut und/oder die Behandlung/Verhinderung von Akne und/oder die Behandlung/Verhinderung von Cellulite und/oder die Förderung von Körper- oder Mundfrische umfassen. Alternativ können die Zusammensetzungen auch in äußerlichen Zusammensetzungen für Kosmetika verwendet werden.
Andere Gesundheitseffekte, die wir herausgefunden haben, sind die Folgenden: Die Hydroquinonsubstituierten mehrfach ungesättigten Fettsäuren haben unerwartet gute Antioxidationsmittelaktivität, die selbst höher sein kann als jene anderer wohlbekannter Antioxidationsmittel, wie beispielsweise Tocopherole. Diese Antioxidationsmittelaktivität resultierte in die Verzögerung der Oxidation von Fetten und Ölen und könnte weiterhin verwendet werden, um die Entwicklung von Krankheiten zu verhindern oder zu verzögern, die mit der Anwesenheit von freien Radikalen zusammenhängen.
Deshalb betrifft unsere Erfindung auch die Verwendung einer Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, wie sie in Kombonussöl vorliegt, wobei es sich insbesondere um Sargahydroquinonsäure (= SHQS) handelt, oder eines Derivats davon, wie beispielsweise Estern von Fettsäuren mit 1 bis 32 Kohlenstoffatomen oder von Nahrungsmittel akzeptablen Salzen davon, wobei die Hydroquinon-substiuierte mehrfach ungesättigte Fettsäure oder das Derivat davon verwendet wird, um die Bildung von freien Radikalen zu verhindern und/oder die Oxidation von Fetten und Ölen zu verzögern und/oder dabei zu helfen, die Entwicklung von Krankheiten bei Säugetieren zu verhindern oder zu verzögern, die mit der Anwesenheit von freien Radikalen verbunden sind. Insbesondere werden die SHQS oder ihre Derivate verwendet, um die Entwicklung von Krebs und/oder Alzheimer-Krankheit und/oder Arthritis und/oder Herz-Kreislauf-Krankheiten zu verhindern oder zu verzögern.
Bevorzugte Derivate, die hierfür verwendet werden, sind Ester der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure und eines geradkettigen gesättigten und/oder ungesättigten Alkohols mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen. Andere bevorzugte Derivate sind die Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäuresalze von Na oder K oder Ca, weil diese Derivate sich besser auflösen und darüber hinaus bei ihrer Verwendung auch Mineralien bereitstellen.
Andere bevorzugte Derivate, die angewendet werden können, sind Ester der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, wie beispielsweise SHQS, wobei die Hydroxygruppe oder -gruppen der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure mit einer geradkettigen gesättigten und/oder ungesättigten Fettsäure mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen verestert ist (sind).
Obwohl die neuen Inhaltsstoffe sehr wirksam als Antioxidationsmittel sind, haben wir auch herausgefunden, dass Synergien erreicht werden können, indem Mischungen davon mit anderen bekannten Antioxidationsmitteln verwendet werden. Deshalb bevorzugen wir es, eine Mischung unseres SHQS-Derivats mit einer effektiven Menge einer oder mehrerer anderer Antioxidationsmittel anzuwenden, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus natürlichen oder synthetischen Tocopherolen, Tocotrienolen, BHT, TBHQ, BHS, Propylgallat, freie Radikale abfangenden Mitteln, Enzymen mit Antioxidationseigenschaften und Ascorbylestern von Fettsäuren.
Wir haben weiter herausgefunden, dass diese substituierten Säuren auch nützliche Azethylcholinesteraseaktivität aufweisen. Deshalb können diese Verbindungen auch bei Alzheimer-Krankheit zum Verbessern der Kognitiven Funktion, Myasthenia gravis, Glaukom und zum Fördern des Lernens und des Gedächtnisses verwendet werden.
Von Inhibitoren von Pankreaslipase, wie beispielsweise Xenical (Orlistat), ist es bekannt, dass sie die Fetthydrolyse im Magen-Darm-Trakt und die Fettabsorption reduzieren, wodurch das Körpergewicht in vivo reduziert wird. Deshalb haben unsere Zusammensetzungen die Fähigkeit, die Anhäufung von Körperfett zu verhindern/reduzieren, und helfen dabei, Übergewicht zu verhindern/behandeln. Weiterhin werden die substituierten Fettsäuren Effekte beim Fördern von Schlankheit und leicht abführende Wirkungen haben.
Andere Gesundheitseffekte umfassen die Wirkung unserer substituierten Säuren, indem sie als Liganden für durch Peroxisomproliferator aktivierte Rezeptoren, wie beispielsweise vom Subtyp Alpha oder Gamma wirken. Diese Transkriptionsfaktoren sind Schlüsselregulatoren sowohl des Lipid- als auch des Glukosestoffwechsels, und unsere substituierten Säuren werden helfen, diese zu optimieren. Effekte unserer substituierten Säuren, die PPAR (Peroxisomproliferator-aktivierter Rezeptor) Alpha zugeordnet werden könnten, werden die Verbesserung des Lipidstoffwechsels, die Steuerung von Hyperlipidämie und das Unterstützen sowohl bei der Verhinderung als auch der Behandlung von Krebs umfassen.
Insulin ist ein Hormon, das für die Aufrechterhaltung von Blutzuckerspiegeln innerhalb normaler und gesunder Grenzen essentiell ist. Wenn die Insulinwirkung beeinträchtigt ist, wie dies beim Zustand von Menschen mit Insulinresistenz gefunden wird, kann dies zu einer Anzahl von Gesundheitsproblemen führen. Die kurzzeitigen Typen von Problemen, die mit Insulinresistenz verbunden sind, weisen kognitive Schwächen (schlechtes Gedächtnis), chronische Müdigkeit (Energiemangel) und Stimmungsschwankungen auf. Langfristiger tritt häufig das Einsetzen von Krankheiten, wie Herz-Kreislauf-Erkrankung, Typ-2-Diabetis und polyzystischem Eierstocksyndrom, auf.
Peroxisomproliferator-aktivierter Rezeptor Gamma (PPAR Gamma) ist ein Kernhormonrezeptor, der einen Teil der PPAR-Gruppe von Transkritptionsfaktoren ausbildet. Diese sind Liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren, die DNS mit einem zweiten Kernhormonrezeptor RXR in einem heterodimeren Komplex binden. Von PPAR Gamma wird angenommen, dass er eine Rolle bei der Steuerung der Insulin-Empfindlichkeit, den Blutzuckerspiegeln zusammen mit anderen biologischen Effekten einschließlich Entzündung, Krebs, Gedächtnis und Zelldifferenzierung spielt. Von PPAR Gamma ist es auch bekannt, dass er ein wichtiger Regulator des Lipid-Stoffwechsels ist. Aufgrund Ihrer Wechselwirkung mit PPAR Gamma werden unsere substituierten Fettsäuren nützliche Effekte auf Insulinresistenz und verwandte Störungen, wie polyzystisches Eierstocksyndrom, Typ-2-Diabetis, Schwangerschaftsdiabetis, Syndrom X, Bluthochdruck, Schlaganfall, Glukosestoffwechsel, zeigen. Die Effekte werden ein Reduzieren des Blutzuckerspiegels und kognitive Leistungsfähigkeit umfassen. Die substituierten Säuren haben auch entzündungshemmende Aktivitäten und Aktivitäten für die Verhinderung oder Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Gelenkkrankheiten, Arthritis, Magen- und Zwölffingerdarmgeschwürerkrankungen, entzündlicher Darmerkrankung, entzündlichen Hautzuständen, neurodegenerativen Krankheiten und Allergien.
Die Antihautalterungseigenschafen sind sehr nützlich, um die Niveaus an Hautproteinenkollagen oder Decorin zu erhöhen, die Vorteile beim Reduzieren des Faltenwerfens, Sackens oder Linienbildens der Haut haben. Zusätzlich können durch die Verwendung unserer Zusammensetzungen Vorteile beim Reduzieren von Altersflecken, Steigerung von Gewebeheilung, Beruhigung von irritierter, geröteter oder empfindlicher Haut und Verbesserungen der Textur, Glätte und Festigkeit der Haut erreicht werden. Weiterhin können unsere neuen Zusammensetzungen auch als Geschmacksstoffe verwendet werden, um einen bitteren Geschmack zu erreichen, z. B. in bitteren Getränken oder in Zartbitterschokolade.
Als eine letzte Ausführungsform unserer Erfindung betrifft unsere Erfindung auch einen Prozess für die Anreicherung einer Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, insbesondere von SHQS, wie sie in Kombonussöl vorliegt, oder von Derivaten davon in einer Glyceridumgebung, wobei:

(i) ein Kombonussöl ausgewählt wird, das eine ausreichende Menge der gewünschten Säure oder des Säurederivats davon aufweist
(ii) das Öl durch Neutralisation raffiniert wird, indem eine Base bei einer Temperatur von 40 bis 60 °C, vorzugsweise 45–50 °C zugegeben wird,
(iii) das Reaktionsrohprodukt in eine organische Phase und eine Wasserphase aufgetrennt wird,
(iv) die Wasserphase von Schritt (iii) auf einen pH-Wert von 0 bis 4, vorzugsweise 0,5 bis 1,5, angesäuert wird, und die ölige Schicht abgelassen wird,
(v) ein Produkt geborgen wird, das die Hydroquinon-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure in Mengen von mehr als 20 Gewichts-% enthält.

Beispiele
BEISPIEL 1
Effekte von Sargahydroquinonsäure auf Pankreaslipase
Lipaseinhibierungstestmethodik
Dieser Test ist aus dem colorimetrischen Sigma-Test (Lipase-PS^TM) bei 550 nm für die quantitative kinetische Bestimmung von Aktivität von Pankreaslipase in Serum entwickelt.
Reaktionen: Serumpankreaslipase katalysiert die Hydrolyse eines natürlichen 1,2-Diglycerids, um Monoglycerid und Fettsäure zu bilden. Das Monoglycerid wird durch Monoglyceridlipase (MGLP) hydrolysiert, um Glycerol und Fettsäure zu bilden. Glycerol wird dann durch Glycerolkinase (GK) in der Anwesenheit von ATP phosphoryliert, um Glycerol-3-phosphat zu bilden, das dann durch Glycerol-3-phosphatoxidase (GPO) oxidiert wird, um Dihydroxyazetonphosphat (DAP) und Wasserstoffperoxyd (H₂O₂) zu bilden. Nachfolgend reagiert H₂O₂ mit 4-Aminoantipyrin (4-AAP) und Natrium-N-ethyl-N-(2)-hydroxy-3-sulphopropyl)-n-toloid (TOOS) in der Anwesenheit von Peroxidase (POD), um einen Quinondiiminfarbstoff zu bilden. Dieser Farbstoff absorbiert Licht bei 550 nm. Die Rate des Anstiegs bei der Absorption bei 550 nm ist der Pankreaslipaseaktivität in der Probe direkt proportional.
Reagenzien:
Die Sigma Diagnostics Liapse-PS Reagenzien werden gemäß den Instruktionen wiederhergestellt. Substratlösungsreagenz (145 μl) zusammen mit 5 μl Wasser (leere Löcher) oder Lipase-PS-Standard und 5 μl schieres Lösungsmittel (Ethanol/THF/Azeton 60:20:20) oder dreifache Proben in Lösungsmittel (Sargahydroquinonsäure) werden in jedes der Löcher gegeben. Die Platten werden bei Raumtemperatur für 8 min unter Schütteln inkubiert. Lipase-PS-Aktivator (50 μl) wird zu allen Löchern zugegeben, und die Absorption bei 550 nm wird kinetisch an der Mikrotiteranzeige für 0 bis 30 min gemessen, mit Ablesungen alle 60 s und Schütteln vor jeder Ablesung. Die Steigung der Messwerte in dem linearen Bereich von 6 bis 24 min wird berechnet, minus der mittleren Steigung der Leerproben. Die Resultate werden als mOD/min, kleiner oder größer als der +ve-Wert der Kontrolle ausgedrückt. Endergebnisse ausgedrückt als prozentuale Inhibierung der Kontrollprobe sind in 1 illustriert.
BEISPIEL 2 – Antialterungseffekte
Vorgehen zum Messen der Procollagen-I- und Decorinsynthese in humanen Hautfibroblasten
Zubereitung von konditioniertem Hautfibroblastenmedium
Primäre humane Vorhautfibroblasten von Passage 2 (P2) wurden mit 10000 Zellen/cm² in 12 Loch Platten geimpft und für 24 Stunden in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxyd und 4 % Sauerstoff in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), dem 10 % fötales Kalbsserum zugesetzt waren, gehalten. Nach dieser Zeit wurden die Zellen mit serumfreiem DMEM gewaschen und dann in frischem serumfreien DMEM für weitere 60 Stunden inkubiert. Die Fibroblasteneinzellagen wurden dann erneut mit serumfreiem DMEM gewaschen. Die Testreagenzien (Retinonsäure oder Sargahydroquinonsäure) und Vehikelkontrollen (in DMSO) wurden dreifach zu den Zellen in einem Endvolumen von 0,4 ml/Loch frisches serumfreies DMEM hinzu gegeben und für weitere 24 Stunden inkubiert. Dieses konditionierte Fibroblastenmedium wurde entweder sofort analysiert oder in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei –70 °C für die zukünftige Analyse gelagert. Die Zellen wurden dann gezahlt und die Daten von der Dot-Blot-Analyse wurden nachfolgend auf die Zellzahl standardisiert.
Dot-Blot-Test auf Procollagen-I- und Decorinprotein in konditioniertem Hautfibroblastenmedium
Proben von konditioniertem Hautfibroblastenmedium behandelt mit Vehikel (als Kontrolle) oder Testreagenzien wurden mit 20 mM Dithiothreitol (1:1o Verdünnung einer 200 mM Stammlösung) und 0,1 Natriumdodecylsulphat (1:100 Verdünnung einer 10 % Stammlösung) versetzt, gut gemischt und dann bei 75 °C für 2 min inkubiert. Ein Standard für den Test wurde durch Reihenverdünnung von reinem konditioniertem Fibroblastenmedium von Fibroblasten, die mit 10000 Zellen/cm² in einen 175 cm² Kolben geimpft und in serumfreiem DMEM wie oben beschrieben gehalten wurden, erzeugt.
Die Testproben wurden nachfolgend unter Verwendung des 96-Loch Bio-Dot-Apparats von Bio-Rad, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben ist, dreifach auf einen vorangefeuchteten Bogen aus Immobilon-P-Transfermembran aufgetragen. Pro Loch wurde ungefähr 200 μl Medium aufgetragen. Dem Medium wurde es erlaubt, unter Schwerkraft durch die Membran zu filtern (30 min), wonach die Membran zweimal mit PBS (200 μl) gewaschen wurde. Diesen PBS-Waschungen wurde es erlaubt, unter Schwerkraft durch die Membran zu filtern (2 × 15 min). Der Bio-Dot-Apparat wurde dann an eine Vakuumleitung angeschlossen, und eine dritte und letzte PBS-Waschung wurde unter Absaugung durchgeführt. Der Apparat wurde dann auseinandergebaut, die Membran wurde entfernt und schnell, wie es erforderlich war, zerschnitten, bevor sie über Nacht bei 4 °C in Blockierpuffer gegeben wurde.
Membranen, die für die Decorinanalyse präpariert wurden, wurden mit 3 % (Gewicht/Volumen) BSA/0,1% (Volumen/Volumen) Tween 20 in PBS blockiert. Am folgenden Tag wurden die Membranen mit 1:10000 Verdünnung von primären Antikörpern gegen humanes Decorin (Kaninchen, polyklonal, Biogenisis) für zwei Stunden bei Raumtemperatur getestet. Die Membranen wurden nachfolgend mit TBS/0,5 % Tween 20 (3 × 5 min) gewaschen und dann mit 1:1000 Verdünnung von ¹²⁵I-konjugiertem anti-Ratten- oder anti-Kaninchen-F(ab')2-Fragmenten (Amersham) wie gefordert für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurden die Immobilon-Streifen erneut mit TBS/Tween 20 (3 × 5 min) gewaschen, bevor es ihnen erlaubt wurde, in Luft bei Raumtemperatur zu trocknen. Die getrockneten Membranen wurden in Zellophan gewickelt, und mit ihnen wurde ein Molecular Dynamics Phosphorspeicherschirm für 16 bis 18 Stunden belichtet. Am Ende dieser Zeit wurde der belichtete Schirm mit einem Phosphorabbilder (Molecular Dynamics Phosphorimager SF) unter Verwendung von ImageQuant^TM-Software abgetastet. Die Punktintensität wurde durch Computer-unterstützte Bildanalyse unter Verwendung des Quantifizierungswerkzeugs bei ImageQuant^TM erfasst, standardisiert auf die Zellzahl, und die Effekte von Aktivitäten, wie beispielsweise SHQS auf Decorinsynthese, wurden relativ zu einem Vehikel-behandelten Kontrollwert von 100 Arbeitseinheiten bestimmt. Ein Vergleich der Effekte von Retinonsäure gegenüber Sargahydroquinonsäure ist in 2 gezeigt.
Das Dekorinniveau in der Haut ist mit einem verbesserten Zustand und einer verbesserten Erscheinung der Haut verbunden. Erhöhen des Dekorinniveaus in der Haut ist wichtig für eine kontrollierte und korrekte Einlagerung von Kollagen in die Haut, die mit vielen Hautvorteilen verbunden ist, wie beispielsweise Faltenbeseitigung und dermaler Reparatur von lichtgeschädigter Haut. Sargahydroquinonsäure fördert die Dekorinproduktion, und dieser Effekt ist ähnlich demjenigen, der für Retinonsäure beobachtet wird.
BEISPIEL 3 – Effekte von Sargahydroquinonsäure auf PPARα (Reportergentest)
Zellkultur und Reportergentest
Cos-7-Zellen (ECACC Nr. 87021302) wurden routinemäßig in DMEM mit 10 % FCS (fötales Kalbsserum) bei 37 °C, 5 % CO₂ auf 80 % Konfluenz gezogen. Transiente Transfektionen wurden durchgeführt, wie von den Herstellern (GibcoBRL) beschrieben wird. Kurz gesagt wurden die Zellen mit 50.000 Zellen pro Loch in 24 Loch Platten ausplattiert und über Nacht in DMEM mit 10 % FCS bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubiert. Die Zellen wurden dann unter Verwendung des LipofektAMINE-Reagenz transfiziert. Für jedes Loch wurde 0,5 μg DNS-Mischung (für "Kontroll"-Zellen pPPRE₃TK-luc 0,40 μg; pRL-TK 0,04 μg; pcDNS 3.1 (–) 0,03 μg; pRSV/RXRα 0,03 μg; für "+PPARα-Zellen pPPRE₃TK-luc 0,40 μg; pRL-TK 0,04 μg; pcDNS 3.1 (–)/PPARα 0,03 μg; p-RSV 0,03 μg) in 25 μl DMEM mit 1 μl LipofektAMINE und ebenso in 25 μl DMEM für 45 min inkubiert. Die Mischung wurde dann auf 250 μl pro Loch ergänzt und zu den Zellen zugegeben, die mit 1 ml DMEM gewaschen worden waren. Die Zellen wurden dann für 5 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ und 25 μl DMEM inkubiert, wobei 20 % SBCS (Aktivkohle gestripptes bovines Kalbsserum; Sigma) zugegeben wurden. Den Zellen wurde es erlaubt, sich für 18 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ zu erholen, bevor sie behandelt wurden. Die Transfektionsmischung wurde von den Zellen entfernt und durch Behandlungsmischung (DMSO oder 10 μM Sargahydroquinonsäure) ersetzt und für 24 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubiert. Sargahydroquinonsäure wurde als 10 mM Stamm in DMSO hergestellt und 1000-fach in DMEM verdünnt, das 10 % SBCS enthielt (500 μl pro Loch), direkt bevor sie zu den Zellen zugegeben wurde. Jede Behandlung wurde dreifach durchgeführt. Die Zellen wurden dann mit 1 ml PBS (ohne Kalizum oder Magnesium) gewaschen und mit 100 μl pro Loch an 1 × passivem Lysepuffer (wie er mit dem Promega Dual Luziferase-Testkit geliefert wird, lysiert. Der Lyse wurde es erlaubt, sich für 15 min vorzusetzen, und dann wurde das Lysat unter Verwendung des Promega Dual Luziferasetestkits auf Glühwürmchen- und Renillaluziferaseaktivität getestet. Für den Test wurden 20 μl Lysat genommen und so unter Verwendung eines MLX-Mikrotiterplattenluminometers (Dynex) getestet, wie in den Anleitungen des Kits beschrieben ist,.
Wie in 3 gezeigt ist, ist SHQS eher ein PPAR Alpha- als ein RXR-Ligand. Gesundheitseffekte, die mit PPAR Alpha-Aktivierung verbunden sind, umfassen ein Optimieren des Lipidstoffwechsels, die Verhinderung und Behandlung von Krebs und entzündungshemmende Effekte.
Beispiel 4 – Effekte von Sargahydroquiononsäure auf PPARγ (Reportergentest)
Reportergentest
Dieser Test basiert auf dem, der von Kliewer et al (Nature 358 771-774 1992) beschrieben wurde. Kurz gesagt wurden Cos-7-Zellen (ECACC Nr. 87021302) in einer Dichte von 0,325 × 10⁵ Zellen/Loch in 24 Loch Platten geimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37 °C/5 % CO₂ in DMEM gezogen, das 10 % FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 IU/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin enthielt. Die Zellen wurden mit Transfektionsmedium (DMEM, das 2 mM L-Glutamin enthielt) gewaschen, dann transient mit 4 Plasmiden transfiziert: einem auf PPAR-ansprechenden Glühwürmchenluziferasereportergen (pPPRE3TK-luc); Säugetierexpressionsplasmiden (pcDNS3/hPPARχ1 und pRSV/hRXRα), die humane PPARγ1- bzw. RXRα-cDNS enthielten, und einem Kontrollplasmid (pRLTK, Promega), das konstitutiv das Renillaluziferasegen expressiviert. Die Transfektion wurden wie von den Herstellern angeleitet unter Verwendung von Lipofectamin (Gibco BrI) durchgeführt. Die transfizierten Zellen wurden für 6 Stunden bei 37 °C/5 % CO₂ inkubiert und dann für weitere 46 Stunden in der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Liganden. Nach 46 Stunden wurden Zelllysate präpariert, und das Niveau der Glühwürmchen- und Renillaluziferase wurde unter Verwendung des Dual Luziferasetestsystems (Promega) und eines MLX- Mikrotiterplattenluminometers (Dynex) bestimmt. Das Niveau an Glühwürmchenluziferase (normalisiert gegenüber der Renillaluziferasekontrolle) stellt ein Maß der Reportergenaktivität bereit. Diese wiederum spiegelt das Niveau der PPARγ-Aktivierung wieder.
4 illustriert, dass Sargahydroquinonsäure eine gute Aktivierung von PPARγ ergibt. SHQS wird Vorteile in einem Bereich von Zuständen haben, einschl. bei den kurzfristigen: chronische Müdigkeit, kognitive Schwäche (Gedächtnis) und Stimmungsschwankungen. Langzeitnutzen würden sich auf Herz-Kreislauf-Erkrankung (Lipidabsenkung), Typ 2 Diabetes (üblich im höheren Alter) und polyzystisches Eierstocksyndrom konzentrieren.
BEISPIEL 5 – Effekte von Sargahydroquinonsäure auf Mikrobenzahl und Biotransformationen
Die Reduktion der Mikroflora auf dem Körper oder innerhalb des Munds und die Inhibierung der Biotransformation von Fettsäuren in volatile Fettsäuren haben Vorteile bei der Reduktion eines Körper- oder Mundgeruchs.
In vitro-Beurteilung von Sargahydroquinonsäure als aktives Deodorant
Das in vitro-Modellsystem, das Fettsäurekatabolismus durch Corynebakterium A reproduziert, bestand aus mit Preallflächen versehenen 250 ml Schüttelkolben, in die 30 ml semi-synthetisches Medium (siehe unten) angereichert mit Fettsäuresubstrat (2,0 mg/ml Pentadekansäure) und Nichttettsäuresubstrat (0,5 mg/ml Glukose) gegeben wurden. Dieses System wurde verwendet, um Sargahydroquinonsäure als potentielles aktives Deodorant zu beurteilen; zu jedem Kolben (außer der Kontrolle) wurde eine spezifische Dosis an Sargahydroquinonsäure von einer 25 g/l Stammemulsion in semi-synthetischem Medium angereichert mit 5,0 mg/ml Gummiarabikum (ausgebildet durch Ultra-Homogenisierung bei 24.000 Umdrehungen pro Minute für 1 min) zugegeben. Die Kolben wurden mit frischer bakterieller Biomasse (Corynbakterium A NCIMB 40928), vorgezogen für 24 Stunden in TSBT (siehe unten), beimpft, um optische Ausgangsdichten (Asso) von ~ 1,0 zu ergeben. Nach der Beimpfung wurden die Kolben aerob bei 35 °C unter Agitation (130 Umdrehungen pro Minute) inkubiert und nach 24 Stunden analysiert. Die Kulturlebensfähigkeit wurde durch Analyse der Gesamtlebensfähigenzählung (total viable count = TVC) auf TSAT-Platten (siehe unten) gefolgt von serieller Verdünnung in viertelstarker Ringers-Lösung bestimmt. Fettsäurekonzentrationen wurden durch kapillare Gaschromatographie (GC) (siehe unten) bestimmt, während die Restglukoseniveaus durch Blutzuckerteststreifen (BM-Test 1-44; Boehringer Mannheim) gemessen wurden, die in Verbindung mit einem ReflofluxS Glukosemeter (Boehringer Mannheim) verwendet wurden. Ein "sublethaler" Effekt wird als signifikante Inhibierung des Fettsäurestoffwechsels, typischerweise größer als 50 % Inhibierung von Pentadekansäureverwertung, ohne gleichzeitige Reduktionen bei Corynebakterium A-Lebensfähigkeit (≤ 1 log₁₀ CFU/ml-Reduktion) oder Glukoseverwertung (≤ 10 % Reduktion) definiert. Außerhalb einer oder beider dieser definierten Grenzen kann der Effekt als "antimikrobiell" bezeichnet werden, wobei "antimikrobiell" sowohl bakteriostatische als auch bakteriozide Effekte umfasst.
Zusammensetzung von Tween-angereicherter Tryptonsojabouillon & Agar (TSBT & TSAT) verwendet für das Ziehen und Halten von axillaren Bakterien (g/l): Tryptonsojabouillon (30,0); Hefeextrakt (Beta Lab) (10,0); Tween 80^TM (1,0); ± Agar (20,0). Zusammensetzung von semi-synthetischem Medium verwendet in dem in vitro-System, das den Fettsäurestoffwechsel durch Corynebakterien A simuliert, (g/I): KH₂PO₄ (1,6); (NH₄)₂HPO₄ (5,0); Na₂SO₄ (0,38); Hefestickstoffbasis (Difco) (3,35); Hefeextrakt (Beta Lab) (0,5); Tween 80^TM (0,2); Triton X-100^TM (0,2); MgCl₂·6H₂O (0,5).
Die Fettsäureniveaus in den Kolben wurden durch kapillare GC-Analyse bestimmt. Anfänglich wurden 5,0 ml Aliquots von jedem Kolben in Universalröhrchen überführt; ein interner Standard (Laurinsäure, 1,0 mg/ml Endkonzentration) wurde zu jedem Röhrchen hinzu gegeben, und das Kulturmedium wurde durch Zugabe von Salzsäure angesäuert (pH ~2). Flüssig-flüssig-Extraktion wurde dann unter Verwendung von 2 Volumen (10 ml) Ethylazetat durchgeführt; die organischen und wässrigen Phasen wurden durch Zentrifugieren (2000 Umdrehungen pro Minute, 3 min) getrennt. 0,75 ml jeder organischen (oberen) Phase wurden dann vor der Analyse auf einem Perkin Elmer 8000 (Series 2) GC, der mit einer 15 m × 0,32 mm (innerer Durchmesser) FFAP-(Nitroterephalsäure modifiziertes PEG/Siloxan-Copolymer)-fusionierten Silikakapillarsäule (Filmdicke 0,25 mm) (Quadrex) ausgestattet war, in eine Testphiole transferiert. Diese Säule wurde an dem Spalt-Spaltfrei-(Split-Splitless)-Injektor und dem Flammenionisationsdetektor (FID) des GC befestigt; die Injektor- und Detektortemperaturen waren jeweils 300 °C. Trägergas für die Säule waren Helium (6 psi), während Wasserstoff (17 psi) und Luft (23 psi) den FID versorgten. Das Temperaturprogramm für die Fettsäureanalyse war 80 °C (2 min); 80 bis 250 °C (20 °C/min); 250 °C (5 min). Die Probengröße für die Injektion war 0,5 bis 1,0 μl. Fettsäureniveaus in den Kolben wurden durch Vergleich der Peakflächen mit bekannten Niveaus von sowohl internen (Laurinsäure) als auch extern laufenden (Pentadekansäure) Standards quantifiziert.
Resultate
Die fett hervorgehobenen Effekte bezeichnen sub-lethale Inhibierung von Pentadekansäureverwertung; andere Effekte gehen auf antimikrobielle (bakteriostatische oder bakteriozide) Inhibierung zurück oder sind, wo sie in Klammern stehen, nicht signifikant.
BEISPIEL 6
Antioxidationsmittelaktivität von Kombonussextrakten, die Sargahydroquinonsäure (SHQS) enthalten
Analyseverfahren: Ranzimat
Alle Öle und Fette haben einen Widerstand gegenüber Oxidation, der von dem Grad der Sättigung, natürlichen oder zugegebenen Antioxidantien und Prooxidantien abhängt. Oxidation ist langsam, bis dieser Widerstand überwunden ist, an welchem Punkt sich die Oxidation beschleunigt und sehr schnell wird. Die Länge des Zeitraums vor dieser schnellen Beschleunigung der Oxidation ist das Maß des Widerstands gegenüber Oxidation und wird gemeinhin als der "Induktionszeitraum" bezeichnet.
Verfahren für die Bestimmung der Oxidationsstabilität von tierischen und pflanzlichen Ölen und Fetten. Das Verfahren beschreibt die Bestimmung der oxidativen Stabilität eines Öls oder eines Fetts mittels des Swift-Induktionszeitraum-Tests. Ein Strom von gereinigter Luft wird durch die Probe geführt, die auf zwischen 90 °C und 140 °C erwärmt ist. Die durch Oxidation gebildeten freigesetzten Gase werden mit einem Luftstrom durch einen Messbehälter mit Wasser geführt. Die Leitfähigkeit des Wassers wird durch Metrohm Ranzimat gemessen und registriert. Eine Erhöhung der Leitfähigkeit aufgrund der Abbaukomponenten bedeutet das Ende des Induktionszeitraums. Der Swift-Induktionszeitraum wird in Stunden gemessen.
Reagenzien und Ausrüstung

Azeton
Molekularsieb
Petrolether
Metrohm Ranzimat 743
geeichtes Thermometer

Probenpräparation
Zu Sonnenblumenöl werden unterschiedliche Konzentrationen an Tocomix und SHQS enthaltendes Extrakt zugegeben (s. Tabelle). Probengröße: ~ 3g.
Probenlagerung
Zwischen der Zubereitung und der Messung des Ranzimats mussten die Proben sofort unter Verwendung von Stöpseln aus Glas oder Kork verschlossen und im Kühlschrank gelagert werden. Das Ranzimat wird so schnell als möglich gemessen.
Schlussfolgerung
In allen Fällen des Sonnenblumenöls, das SHQS-Extrakt enthielt, wurde verglichen mit Sonnenblumenöl, das Tocomix enthielt, ein längerer Swift-Induktionszeitraum bemessen. Deshalb wurde für den SHQS-enthaltenden Extrakt eine höhere Antioxidationsmittelaktivität nachgewiesen als für Tocomix.
BEISPIEL 7: Sargahydroquinonsäure (SHQS) als Cholesterinesteraseinhibitor
Methodik
Alle Testmaterialien wurden von Sigma erhalten, außer Cholesterinesterase, die von Biozyme Laboratories Ltd. erhalten wurde. Sargahydroquinonsäure (SHQS, ~ 90 % Reinheit) wurde durch Hexanextraktion von Kombonüssen, gefolgt von Silikachromatographie erhalten.
Zubereitung von Fettphase
Cholesterin, Oleinsäure und SHQS wurden in eine 8 mm Phiole mit genügend Diethylether eingewogen, um die Mischung aufzulösen (0,018 g Cholesterin, zwischen 0,009 g und 0,036 g SHQS und 0,09 g Oleinsäure in 6 ml Diethylether). Der Ether wurde unter Verwendung eines Stroms von trockenem Stickstoff bis zur Trocknung verdampft.
Zubereitung von Testpuffer
Natriumtaurocholat, bovines Serumalbumin und Ammoniumchlorid wurden in einem 0,154 mM Phosphatpufter bei pH 6,2 aufgelöst (typischerweise wurden 0,52 g Natriumtaurocholat, 0,23 g bovines Serumalbumin und 0,18 g Ammoniumchlorid in 50 ml Puffer aufgelöst).
Zubereitung von Esteraselösung
Cholesterinesterase (von Biozyme, Quelle: Schweinepankreas) wurde bei pH 6,2 in 0,154 M Phosphatpuffer aufgelöst.
Testverfahren
Testpuffer (6 ml) wurde unter Verwendung eines Wirbelmischers zu der getrockneten Lipidmischung zugegeben und dann für 30 min in ein Ultraschallbad bei 60 °C gegeben. Die Phiolen wurden abgedichtet und für 15 min in ein Schüttelwasserbad (200 Bewegungen/min) bei 37 °C überführt. 60 ml Esteraselösung wurden zugegeben, und die Phiolen wurden wieder abgedichtet und bei 37 °C geschüttelt. 1 ml Proben wurden direkt nach der Zugabe der Esterase und nach Schütteln für eine Stunde genommen, die zu 3 ml Isopropanol zugegeben und für 30 min auf 80 °C erhitzt wurden, um die Esteraseaktivität zu zerstören und um Proteinmaterial zu präzipitieren. Die Proben wurden mit konzentrierter Salzsäure angesäuert, 4 ml Wasser wurden zugegeben, und Lipide, die mit zwei Aliquots warmem Diethylether extrahiert worden waren, wurden dann mit Natriumsulfat getrocknet. Der Diethylether wurde entfernt, und die extrahierten Lipide wurden durch Erwärmen mit 200 μl Bis- (trimethylsilyl)-trifluorazetamid (BSFTA) und 100 μl Pyridin für 30 min silyliert, dann durch Kohlenstoffzahl-GC analysiert.
Wie in 5 gezeigt ist, inhibierte die Anwesenheit von SHQS die Umwandlung von Cholesterin zu Cholesterinoleat. Dies spiegelt die Inhibierung von Cholesterinesterase wieder.
Effekt der Zugabe von SHQS auf die Aktivität von Azetylcholinesterase
Azetylcholinesteraseaktivität wurde unter Verwendung eines 96 Loch Mikroplattenlesers basierend auf dem Verfahren von Ellman (G.I. Ellman, D. Courtney, V. Andres Jr., R. M. Featherstone Biochem. Pharmacol. 7 (1961) 88) gemessen.
Die SHQS (gereinigt durch Silikachromatographie) wurde in einer Mischung von Ethanol/Tetrahydrofuran/Azeton 60/20/20 bei einer Konzentration von 100 mg/ml aufgelöst. Reihenverdünnungen wurden dann nach Bedarf durchgeführt. Diese Verdünnungen wurden unter Verwendung von 50 mM tris-HCl-Puffer, pH8, weiter 1:10 verdünnt.
SHQS-Lösungen (20 μl), Azetylthiocholinjodid (ACTI; 25 μl, 15 mM in Wasser), Dithiobisnitrobenzoesäure (DNTB; 125 μl, 3mM in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, 0,1 M NaCl und 0,02 M MgCl₂·6H₂O enthaltend), Tris-HCl-Puffer (50 μl; 50 mM, pH 8, 0,1 % bovines Serumalbumin enthaltend) wurden zusammen mit Azetylcholinesterase vom Zitteraal (Sigma Typ VI-s lyophilisiertes Pulver) (20 μl, 1,5 μg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 8, Puffer, 0,01 % bovines Serumalbumin enthaltend) in die Löcher gegeben.
Die Absorption wurde achtmal alle 13 s bei 410 nm gemessen. Die Rate der Änderung der OD des Testmaterials wurde mit den Leerlösungen verglichen.
Wie in 6 gezeigt ist, wurde von SHQS gezeigt, dass sie Azetylcholinesteraseaktivität inhibiert.
BEISPIEL 8
Die anti-entzündlichen Effekte von Kombonussöl
Die antientzündlichen Effekte wurden durch in vitro-Tests bestimmt, wobei die Produktion von Prostaglandin E2 (= PGE2) durch Fibroblasten der menschlichen Haut gemessen wird, nachdem sie durch den entzündlichen Modulus Phorbolmyristatazetat (PMA) induziert wurden. Eine Reduktion bei den Niveaus an PGE2 ist ein Hinweis auf den antientzündlichen Effekt.
Primäre humane Vorhautfibroblasten der Passage 2 (P2) wurden mit 10.000 Zellen/Loch in 96 Loch Platten gegeben und für 24 Stunden in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxyd in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) angereichert mit 10 % fötalem Kalbsserum gehalten. Verseifbare Formen von Kombonussöl (SHQS enthaltend) wurden dreifach zu dem frischen Zellmedium in Ethanol (Endkonzentration 1 %) hinzu gegeben und für weitere 24 Stunden inkubiert. PMA in Ethanol/Zellmedium wurde zu dem Medium zugegeben, und die Zellen wurden für weitere 24 h inkubiert. PMA stellt einen externen Reiz dar, der oxidativen Stress und entzündliche Antworten bei Zellen induziert. Die Fibroblasten/Medien wurden dann direkt analysiert, wie unten beschrieben ist, oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70 °C für zukünftige Analyse gelagert.
Prostaglandin E2 (PGE2)-Test
Volumen von 50 μl Kulturmedium wurden für den PGE2-Test nach sanftem Schütteln der Kulturplatte genommen. PGE2-Niveaus in dem Medium wurden mit einem Biotrak PGE2-Immuntestkit (Amersham, UK) bestimmt. Der Test basiert auf dem Wettbewerb zwischen unmarkiertem PGE2 in der Probe und einer festen Menge an mit Meerrettich-Peroxidase markiertem PGE2 für eine begrenzte Menge an fixiertem PGE2-spezifischem Antikörper. Konzentrationen an unmarkiertem Test-PGE2 werden gemäß einer Standardkurve bestimmt, die zur gleichen Zeit erhalten worden ist.
Die Effekte von verseifbaren Formen von Kombonussöl auf PGE2-Niveaus sind in 7 gezeigt.
Der Graph (7) zeigt, dass das Beanspruchen von Fibroblastenzellen mit einem entzündlichen Stimulus, wie beispielsweise PMA, einen Anstieg bei der entzündlichen Antwort verursacht, wie sie durch PGE2-Produktion gemessen wird. Verseifbare Formen (Sap) von Kombonussöl, die Sargahydroquinonsäure enthalten, reduzieren selbst auf den Niveaus von 0,1 ng/ml die entzündliche Antwort dramatisch, wie sie durch PGE2-Produktion gemessen wird. – Gute antientzündliche Aktivität.
BEISPIEL 9 FÜR NAHRUNGSMITTELANWENDUNGEN
Materialien und Verfahren
Produktion von SHQS
Die Produktion von SHQS wurde wie folgt durchgeführt:

– Schälen der Kombonüsse
– Pressen der geschälten Kombonüsse, um das Öl zu extrahieren
– Filtration des Öls
– Neutralisation des gefilterten Öls, um SHQS-Salze zu erhalten
– Bergen von SHQS durch Ansäuerung.

Die Reinheit der SHQS betrug ungefähr 75 %. Die verbleibenden 25 % bestanden primär aus Glyceriden, FFS und Wasser.
• Panelling
Nahrungsmittelprodukte angereichert mit SHQS wurden mit solchen vergleichen, die mit einer Referenz hergestellt wurden, bei der SHQS fehlte.
A: Müsliriegel
• Zubereitung der bindenden Mischung
Ungefähr 89 % des Fetts wurden mit dem entrahmten Milchpulver, dem Kristallzucker, der Vanillincreme und dem Lecithin für 40 min. in einer Kugelmühle gemischt. Die SHQS wurde durch Rühren homogen mit dem verbleibenden Fett gemischt und dann zu der bindenden Mischung zugegeben. Eine bindende Mischung ohne SHQS wurde als Referenz verwendet.
• Zubereitung der Müsliriegel
Riegel wurden durch Mischen von 55 % der bindenden Mischung mit 25 % der Müslimischung (Supermarkttyp), 10 % Keksabfall und 10 % Puffreis hergestellt. Die Mischung wurde dann in den Formen gepresst, abgekühlt, entformt, beschichtet und abgekühlt.
Die folgenden Merkmale wurden ausgewertet:

– Knusprigkeit der Müsliriegel
– Gesamteindruck
– Gesamttextur.

Schlussfolgerungen
Aus den Resultaten des Panelling konnten die folgenden Schlussfolgerungen gezogen werden:

• Die Gesamttextur, Knusprigkeit und Gesamterscheinung der Riegel waren bei den Riegeln, die die SHQS-angereicherte bindende Mischung enthielten, und bei den Referenzriegeln vergleichbar;
• Die Zugabe von SHQS zu der Bindungsmischung machte die Mischung etwas klebrig, und deshalb hatte sie einen kleineren negativen Effekt auf den Entformungsprozess. Die höhere Klebrigkeit beeinflusste die Qualität der Riegel jedoch nicht negativ.

B: Zubereitung des Brots
Die Hefe, zuvor in 85 % des Wassers dispergiert, wurde mit dem Mehl und dem Salz gemischt. Der SHQS-Extrakt und das verbleibende Wasser wurden zugegeben, und das Mischen wurde fortgesetzt bis ein Teig geformt war.
Nach Gehenlassen für 40 min und erneuter Nachbearbeitung, die dreimal durchgeführt wurden, wurde das Brot bei 270 °C für 35 min gebacken. Brot ohne SHQS wurde als Referenz verwendet.
Panelling
Die folgenden Attribute wurden bei dem Brot ausgewertet:

– Teigkonsistenz
– Struktur
– Gesamterscheingungsbild
– Geschmack
– Weichheit und Volumen
– Kauverhalten.

Schlussfolgerungen
Aus den Resultaten des Tests konnten die folgenden Schlussfolgerungen gezogen werden:

• Die Teigkonsistenz, Struktur, Weichheit, das Volumen und die Kaueigenschaften waren bei dem SHQS-angereichertem Brot und dem Referenzbrot vergleichbar.
• Kleinere Unterschiede bei der Farbe des SHQS-angereicherten Brots wurden festgestellt, jedoch ohne die Qualität des Brots zu beeinträchtigen.
• Die Zugabe der SHQS zu dem Brot beeinflusste nicht die Eigenschaften des Teigs während der Produktion und des Backens.

C: Beschichtung für Müsliriegel
• Zubereitung der Beschichtung
Alle Inhaltsstoffe bis auf das Fett, die SHQS und das Lecithin wurden in einem Hobart-Mischer gemischt.
So wenig wie möglich Fett wurde sehr langsam in die Mischung zugegeben, bis ein Teig gebildet war. Der Teig wurde dann weiterverarbeitet und geknetet, wobei das verbleibende Fett bis auf 6 % des Gesamtfetts in die Schüssel zugegeben wurde. Das Lecithin wurde letztlich 15 min vor dem Ende des Knetprozesses zugegeben. Die SHQS wurde durch Rühren homogen mit dem verbliebenen Fett gemischt und dann zu der Beschichtungsmischung zugegeben. Eine Mischung ohne SHQS wurde als Referenz verwendet.
• Zubereitung der Müsliriegel
Die Müsliriegel wurden beschichtet und in einem Kühltunnel gekühlt.
• Panelling
Riegel beschichtet mit der SHQS-angereicherten Beschichtung wurden mit den Riegeln verglichen, die mit einer Standardbeschichtung beschichtet waren.
Die folgenden Attribute wurden bei der Beschichtung ausgewertet:

– Gesamteindruck
– Gesamttextur.

• Die Zugabe der SHQS zu der Beschichtungsmischung beeinflusste nicht die Eigenschaften der Beschichtungsmischung während der Produktion und der Beschichtungsschritte.
• Die Gesamttextur der SHQS-angereicherten Riegel war mit derjenigen der Referenzriegel vergleichbar.
• Die Farbe der Beschichtung der SHQS-angereicherten Riegel war etwas dunkler als jene der Referenzriegel. Dennoch wurde die Farbdifferenz nicht als negativ angesehen.

D: Eiscreme
Zubereitung der Eiscreme
Der Zucker, das Milchpulver und die Dextrose wurden gemischt und zu dem Wasser zugegeben. Die Mischung wurde auf 70 °C erhitzt, und der Sirup wurde zugegeben. Dann wurden eine Fett-/SHQS-Mischung und der Emulgator zugegeben. Die Emulsion wurde mit einem Ultra Turrax gerührt, auf 20 °C abgekühlt und erneut mit dem Ultra Turrax gerührt. Die Emulsion wurde über Nacht bei 70 °C in dem Gefrierschrank gelassen. Die Emulsion wurde dann für 40 min in der Eiscrememaschine gerührt, die zuvor für 24 h auf –20 °C abgekühlt worden war. Die Eiscreme ohne SHQS wurde als Referenz verwendet.
• Panelling
Die SHQS-angereicherte Eiscreme wurde mit der Referenz Eiscreme verglichen.
Die folgenden Attribute wurden bei der Eiscreme ausgewertet:

– Gesamteindruck
– Schmelzverhalten
– Gesamttextur.

• Das Schmelzverhalten der SHQS-angereicherten Eiscreme war mit demjenigen der Referenzeiscreme vergleichbar.
• Kleinere Unterschiede bei der Farbe und der Textur der SHQS-angereicherten Eiscreme wurden festgestellt, wenn sie mit der Referenzeiscreme verglichen wurde. Dennoch beeinträchtigten solche Differenzen nicht die Gesamtqualität der Eiscreme.
• Die Zugabe der SHQS zu der Eiscreme beeinflusste nicht die Eigenschaften der Eiscrememischung während der Verarbeitung.

E: Fettbasierte Aufstriche
Zubereitung von fettbasiertem Minzaufstrich
Ungefähr 93 % des Fettes wurden mit dem Vollrahmmilchpulver, dem entrahmten Milchpulver, dem Kristallzucker, der Vanillincreme und dem Lecithin für 40 min in einer Kugelmühle gemischt. Die SHQS wurde durch Rühren homogen in das verbleibende Fett eingemischt und dann zu der Aufstrichmischung zugegeben. Ein Aufstrich ohne SHQS wurde als Referenz verwendet.
• Panelling
Der die SHQS enthaltende Aufstrich wurde mit dem Referenzaufstrich vergleichen.
Die folgenden Attribute wurden bei dem Aufstrich ausgewertet:

– Gesamttextur
– Gesamteindruck
– Verstreichbarkeit.

• Die Gesamttextur, Verstreichbarkeit und Gesamterscheinung des fettbasierten Minzeaufstrichs angereichert mit SHQS waren vergleichbar mit demjenigen der Referenz.
• Ein kleinerer Unterschied in der Farbe wurde zwischen der Referenz und dem angereicherten Aufstrich festgestellt, aber ohne dass hierdurch die Qualität des Aufstrichs negativ beeinträchtigt war.

Claims

Mischungen mit einer substituierten organischen Säure oder einem Derivat davon und einem Glycerid, wobei die Mischungen aufweisen: (i) 0,1 bis 99,9 Gewichts-%, vorzugsweise 2 bis 95 Gewichts-%, einer Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, wie sie in Kombonussöl vorliegt, bei der es sich insbesondere um Sargahydroquinonsäure (=SHQS) handelt, oder eines Derivats davon, wie beispielsweise Ester der Fettsäuren und von Alkoholen mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen, oder ein als Nahrungsmittel akzeptables Salz davon, (ii) 0 bis 99,8 Gewichts-%, vorzugsweise 4 bis 97 Gewichts-%, Kombobutterglyceride und (iii) 0,1 bis 99,9 Gewichts %, vorzugsweise 1 bis 94 Gewichts-%, andere Triglyceride.
Mischungen nach Anspruch 1, wobei das Säurederivat ein Ester der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure und eines gradkettigen gesättigten oder ungesättigten Alkohols mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen, ist.
Mischungen nach Anspruch 1, wobei das Derivat der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure ein Na- oder K- oder Ca-Salz ist.
Mischungen nach Anspruch 1 bis 3, wobei die anderen Glyceride aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Palmöl, Kakaobutter, Kokosnussöl, Palmkernöl, Sojaöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, Rapsöl, Färberdistelöl, Maisöl, Baumwollkernöl, Kakaobutteräquivalenten oder Kakaobutterersatzstoffen, Fischöl, Borretschöl, Pinienkernöl, Korianderöl, Pilzölen oder hoch oleinsäurehaltigen Varianten davon oder Fraktionen davon oder gehärteten Varianten davon oder Fraktionen von gehärteten Varianten oder Mischungen von einem oder mehreren dieser Öle und Fette.
Mischungen nach Anspruch 4, wobei die Mischungen einen Festfettgehalt, gemessen durch NMR-Pulse an einer nichtstabilisierten Mischung bei der angegebenen Temperatur, von N₅= 5 bis 80, vorzugsweise 10 bis 70, und N₃₅ = weniger als 20, vorzugsweise 1 bis 5, aufweisen.
Mischungen nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Hydroquinon-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure von Pycnanthus angolensis-Nussöl isoliert ist.
Mischungen nach Anspruch 1 bis 6, wobei die Mischungen eine effektive Menge eines Oxidationsstabilisators aufweisen, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus natürlichen oder synthetischen Tocopherolen, BHT, TBHQ, BHS, Propylgallat, freie Radikale abfangenden Mitteln, Enzymen mit antioxidativen Eigenschaften und Ascorbylestern von Fettsäuren.
Nahrungsmittelprodukt mit einer effektiven Menge einer Gesundheitskomponente, wobei die Gesundheitskomponente eine Hydroquinon-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure ist, wie sie in Kombonussölextrakten vorliegt, oder ein Derivat davon, wobei es sich insbesondere um Sargahydroquinonsäure (=SHQS) oder ein Derivat davon handelt.
Nahrungsmittelzusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Nahrungsmittelzusammensetzung, vorzugsweise eine fettbasierte Zusammensetzung, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Margarine, fettkontinuierlichen oder wasserkontinuierlichen oder doppeltkontinuierlichen Aufstrichen, fettreduzierten Aufstrichen, Konfektprodukten, so wie Schokolade oder Schokoladebeschichtungen oder Schokoladefüllungen oder Backwarenfüllungen, Eiscremes, Eiscremebeschichtungen, Eiscremeeinlagen, Dressings, Majonäsen, Käse, Sahnealternativen, Trockensuppen, Getränken, Müsliriegeln, Saucen und Zwischenmahlzeitriegeln besteht.
Nahrungsergänzungsmittel mit einer effektiven Menge einer Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, wie sie in Kombonussölextrakten vorliegt, oder ein Derivat davon, wobei es sich insbesondere um Sargahydroquinonsäure (SHQS) oder ein Derivat davon handelt, in einem einkapselnden Material oder als Granulat oder in Pulverform.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 10, wobei das einkapselnde Material aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gelatine, Stärke, modifizierter Stärke, Mehl, modifiziertem Mehl, Zuckern, insbesondere Saccharose, Laktose, Glukose und Fructose, besteht.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Hydroquionen-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure oder ein Derivat davon als aktiven Inhaltsstoff aufweist, für die Herstellung einer Nahrungsmittelzusammensetzung oder eines Nahrungsergänzungsmittels mit einem Gesundheitseffekt, wobei die Hydroquinon-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure, wie sie in Kombonussöl oder Extrakten davon vorliegt, oder ihre Derivate für die Herstellung von Nahrungsmittelzusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmitteln mit mindestens einem der folgenden Effekte verwendet werden: (i) Wirkung als Lipaseinhibitor, insbesondere als Inhibitor von Pankreaslipase (ii) Wirkung als Ligand für Subtypen alpha oder gamma von Rezeptoren, die durch Peroxisomprofilator aktiviert werden (iii) Reduzierung oder Hilfe beim Verhindern von Altern, insbesondere von Altern oder Photoschädigung der Haut (iv) Förderung der Bildung von Decorin in der Haut. (v) Reduzierung/Hilfe beim Verhindern von Akne (vi) Reduzierung/Hilfe bei der Verhinderung von Cellulitis (vii) Verbesserung der Körper- und Mundfrische (viii) Verhinderung der Bildung von freien Radikalen und/oder Verzögerung der Oxidation von Fetten und Ölen und/oder Hilfe beim Verhindern oder Verzögern bei der Entwicklung von Krankheiten bei Säugetieren, die mit der Anwesenheit von freien Radikalen verbunden sind (ix) Optimierung des Glukosestoffwechsels und/oder Kontrolle des Blutzuckerspiegels (x) nützliche Effekte in Bezug auf Insulinresistenz (xi) nützliche Effekte in Bezug auf Typ2-Diabetes (xii) nützliche Effekte in Bezug auf Syndrom X (xiii) nützliche Effekte in Bezug auf Schlaganfall (xiv) nützliche Effekte in Bezug auf Bluthochdruck.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Hydroquinol-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure Sargahydroquinonsäure (SHQS) ist.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel für die Optimierung des Glukosestoffwechsels und/oder für die Kontrolle des Blutzuckerspiegels vorgesehen sind oder einen nützlichen Effekt in Bezug auf die Insulinresistenz aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel einen nützlichen Effekt in Bezug auf Typ2-Diabets aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel einen nützlichen Effekt in Bezug auf Syndrom X aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel einen nützlichen Effekt in Bezug auf Schlaganfall aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel einen nützlichen Effekt in Bezug auf Bluthochdruck aufweisen.
Verwendung von SHQS oder von Derivaten davon gemäß Anspruch 12, wobei die SHQS oder ihre Derivate verwendet werden, um die Entwicklung von Krebs und/oder von Alzheimerkrankheit und/oder von Herz-Kreislauf-Störungen zu verhindern oder zu verzögern.
Verwendung von SHQS-Derivaten nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei das SHQS-Derivat ein Ester der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure und eines geradkettigen gesättigten und/oder ungesättigten Alkohols mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 14 bis 18 Kohlenstoffatomen, ist.
Verwendung von SHQS-Derivaten nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei das SHQS-Derivat ein Ester der Hydroxy-Gruppe oder -Gruppen bei der Hydroquionon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure und einer geradkettigen gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung von SHQS-Derivaten nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei das Derivat der Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure ein Na- oder K- oder Ca-Salz ist.
Verwendung von SHQS-Derivaten nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei die Derivate als Mischung mit einer effektiven Menge von einem oder mehreren anderen Antioxidationsmitteln verwendet werden, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus natürlichem oder synthetischen Tocopherolen, BHT, TBHQ, BHS, Propylgallat, freie Radikale abfangenden Mitteln, Enzymen mit Antioxidationseigenschaften und Ascorbylestern von Fettsäuren.
Prozess für die Anreicherung einer Hydroquinon-substituierten mehrfach ungesättigten Fettsäure, insbesondere von SHQS, wie sie in Kombonussöl vorliegt, oder von Derivaten davon in einer Glyceridumgebung, wobei: (i) ein Kombonussöl ausgewählt wird, das eine ausreichende Menge der gewünschten Säure oder des gewünschten Säurederivats aufweist, (ii) das Öl durch Neutralisation durch Zugeben einer Base bei einer Temperatur von 40 bis 60 °C, vorzugsweise 45 bis 50 °C, raffiniert wird, (iii) das Reaktionsrohprodukt in eine organische Phase und eine wässrige Phase aufgetrennt wird, (iv) die Wasserphase des Schritts (iii) auf einen pH-Wert von 0 bis 7 angesäuert wird und die organische Phase abgelassen wird, (v) ein Produkt geborgen wird, das die Hydroquinol-substituierte mehrfach ungesättigte Fettsäure in Mengen von mehr als 20 Gewichts-% enthält.