JP4167296B2 - 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 - Google Patents
電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4167296B2 JP4167296B2 JP2007529167A JP2007529167A JP4167296B2 JP 4167296 B2 JP4167296 B2 JP 4167296B2 JP 2007529167 A JP2007529167 A JP 2007529167A JP 2007529167 A JP2007529167 A JP 2007529167A JP 4167296 B2 JP4167296 B2 JP 4167296B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrophoresis
- gel
- polyacrylamide gel
- compound
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 title claims description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- -1 acrylamide compound Chemical class 0.000 title claims description 25
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 title claims description 22
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 title claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 26
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 10
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 5
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 75
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 9
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 5
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- IJJDPBVDJXYHMJ-UHFFFAOYSA-N methyl 6-[[[3-[bis(pyridin-2-ylmethyl)amino]-2-hydroxypropyl]-(pyridin-2-ylmethyl)amino]methyl]pyridine-3-carboxylate Chemical compound N1=CC(C(=O)OC)=CC=C1CN(CC=1N=CC=CC=1)CC(O)CN(CC=1N=CC=CC=1)CC1=CC=CC=N1 IJJDPBVDJXYHMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 125000003161 (C1-C6) alkylene group Chemical group 0.000 description 3
- CHFRGTMFJHHWDE-UHFFFAOYSA-N 1-[bis(pyridin-2-ylmethyl)amino]-3-(pyridin-2-ylmethylamino)propan-2-ol Chemical compound C=1C=CC=NC=1CN(CC=1N=CC=CC=1)CC(O)CNCC1=CC=CC=N1 CHFRGTMFJHHWDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 150000003623 transition metal compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 3
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 3
- UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 1,3-diaminopropan-2-ol Chemical compound NCC(O)CN UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000006479 2-pyridyl methyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C(=N1)C([H])([H])* 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000006367 bivalent amino carbonyl group Chemical group [H]N([*:1])C([*:2])=O 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- IRQSKJQDKUAART-UHFFFAOYSA-N methyl 6-(bromomethyl)pyridine-3-carboxylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(CBr)N=C1 IRQSKJQDKUAART-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea group Chemical group NC(=S)N UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CIAMOALLBVRDDK-UHFFFAOYSA-N 1,1-diaminopropan-2-ol Chemical compound CC(O)C(N)N CIAMOALLBVRDDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFIFHOWQEJADPH-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-4-(2-oxo-4-phenylpyrrolidin-1-yl)benzenesulfonamide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC=C1N1C(=O)CC(C=2C=CC=CC=2)C1 WFIFHOWQEJADPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSDSSGBPEUDDEE-UHFFFAOYSA-N 2-formylpyridine Chemical compound O=CC1=CC=CC=N1 CSDSSGBPEUDDEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 239000004342 Benzoyl peroxide Substances 0.000 description 1
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical group [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 0 COC(c1cnc(*)cc1)=O Chemical compound COC(c1cnc(*)cc1)=O 0.000 description 1
- FTHCZYMFYCBWMW-UHFFFAOYSA-N Cl.CNCO.CNCO.CNCO Chemical compound Cl.CNCO.CNCO.CNCO FTHCZYMFYCBWMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010693 amine synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- DLGYNVMUCSTYDQ-UHFFFAOYSA-N azane;pyridine Chemical compound N.C1=CC=NC=C1 DLGYNVMUCSTYDQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000019400 benzoyl peroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 150000002366 halogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N isopropyl alcohol Natural products CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000004492 methyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N p-methoxyphenol Chemical compound COC1=CC=C(O)C=C1 NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000003799 water insoluble solvent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D213/79—Acids; Esters
- C07D213/80—Acids; Esters in position 3
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
- C07D213/78—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D213/81—Amides; Imides
- C07D213/82—Amides; Imides in position 3
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F230/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal
- C08F230/04—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal containing a metal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
- C08F220/52—Amides or imides
- C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
- C08F220/60—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen
- C08F220/603—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing nitrogen in addition to the carbonamido nitrogen and containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen and nitrogen
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pyridine Compounds (AREA)
Description
この様なリン酸化−脱リン酸化により調節されている代謝系としては、グリコーゲンの合成とその分解系がよく知られている。この代謝系は、主としてリン酸化−脱リン酸化によりカスケード制御され、調節されている。
そして近年、このリン酸化−脱リン酸化が、疾病に関係する代謝系において重要な役割を有していることが明らかとなってきている。例えば細胞のガン化は、リン酸化−脱リン酸化の異常が一因であるといわれている。つまり、細胞周期の進行や停止は様々な酵素(タンパク質)のリン酸化(または脱リン酸化)により制御されており、このリン酸化(または脱リン酸化)にはサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ(CDK)が関与しているが、斯かるメカニズムが損傷するとリン酸化(または脱リン酸化)に乱れが生じ、その結果、細胞の異常増殖が引発されることになる。
その他にも、プロテインキナーゼCが、アトピー性皮膚炎や花粉症などのアレルギー疾患の原因となる肥満細胞の脱顆粒に関与することや、アルツハイマー病患者の脳で発生する神経原繊維変化は、リン酸化されたタウタンパク質によることが明らかにされている。
従って、タンパク質のリン酸化−脱リン酸化状況を把握することは、生体組織細胞の遺伝子発現の探索や酵素活性評価のみならず、疾病の診断や治療にも役立つ可能性がある。
ところが、従来より用いられてきたリン酸化タンパク質(または脱リン酸化タンパク質)の特定方法には様々な欠点がある。例えば酵素免疫法は、対象となるタンパク質試料が微量であっても分析可能という利点があるが、必要な抗体を充分量得ることが困難であり、また、対象タンパク質が数kDa以下である場合には、タンパク質中のリン酸化部位に結合する抗体を調製することができない。
また、放射性同位元素32Pで標識されたリン酸を使用することによって、タンパク質への特異的結合を検出する方法も考えられるが、放射性同位元素の取扱いには当然に注意が必要であり、廃液の管理や処理まで要求される。
更に、リン酸化タンパク質と脱リン酸化タンパク質とでは電荷が異なることから、二次元電気泳動法の応用も考えられる。しかし、タンパク質を構成する20種のアミノ酸のうちアスパラギン酸やリシンなど側鎖に電荷を有するものは5種もあるため、タンパク質自体の電荷に対し、リン酸化或いは脱リン酸化されることによる電荷の変化が小さいことが考えられる。この様な場合、電荷に依存する電気泳動法では、リン酸化または脱リン酸化を検出することが困難になる。特に生体試料を分析する場合には、試料に多種類のタンパク質が含まれていることから、わずかなバンド位置変化のみでは検出できない。それに加え、スポット特定のために放射性同位元素を用いるとすれば、前述した問題が生じてくる。
ところで、国際公開第03/053932号公報には、リン酸基に特異的で且つ高い配位能を有する化合物と、それを試料に添加してリン酸化ペプチドの電荷を変化させた上で電気泳動を行なうことによって、リン酸化ペプチドを特定する方法が開示されている。しかし、アクリルアミド構造が含まれる側鎖を有する化合物は記載されておらず、また、より鋭敏なリン酸化ペプチドの検出方法が求められている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、SDS−PAGEにおいて、リン酸化ペプチドを他のペプチドから分離同定できる方法について鋭意研究を進めた。その結果、リン酸イオン或いはリン酸モノエステル中の2つの水酸基に対する配位結合能が極めて高い構造を有する本発明化合物を用いれば、多数のペプチドを含む被検試料の中からでもリン酸化ペプチドを特異的に検出できることを見出して、本発明を完成した。
即ち、本発明に係る電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、その構造中の少なくとも一部に下記式(I)で表される構造を有することを特徴とする。
[式中、M2+は遷移金属イオンを示し、Xはリンカー基を示す。]
本発明のポリアクリルアミドゲル電気泳動方法は、上記電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを分離ゲルとして用いることを特徴とする。
また、本発明に係る電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造方法は、下記式(II)で表されるアクリルアミド化合物および/またはその遷移金属錯体をモノマーとして含むアクリルアミド混合溶液を重合させることを特徴とし、このアクリルアミド化合物(II)は、当該製造方法で用いる合成中間体化合物として重要である。
[式中、Xはリンカー基を示す。]
SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)で用いられる分離ゲルは、通常、アクリルアミドとN,N’−メチレンビスアクリルアミドからなるアクリルアミド混合物の水溶液と、SDSおよび過硫酸アンモニウムの水溶液、およびTris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)−HCl緩衝液を混合した後、更にN,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)の水溶液を加え、気泡が入らないよう静かに混ぜたものをガラスプレート間に流し込み、静置して重合させることにより製造される。そして、本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、その構造中の少なくとも一部に下記式(I)で表される構造を有する点に要旨を有する。
[式中、M2+は遷移金属イオンを示し、Xはリンカー基を示す。]
上記式(I)において、M2+の遷移金属イオンとしては、第4周期に属する遷移金属の2価陽イオンが好適である。例えば、Mn2+、Co2+、Ni2+およびZn2+から適宜選択して用いることができる。より具体的には、Mn2+またはZn2+が好ましい。アクリルアミド構造(I)中、これら遷移金属イオンが配位した錯体部分は、リン酸化タンパク質のリン酸基(リン酸モノエステル基)への配位能が極めて高いことによる。
「リンカー基」は、リン酸化ペプチドと相互作用する主要部分(以下、「フォスタグ」ということがある)とアクリルアミド部分とを結合する基であり、ポリアクリルアミド化合物の前駆体(モノマー)の製造を容易にしたり、また、フォスタグ部分の自由度を増すことによって、リン酸化ペプチドとの配位を容易にする作用を有する。
「リンカー基」としては、前述した作用を有するものであれば特に限定されないが、例えばC1−C6アルキレン基、アミノ基(−NH−)、エーテル基(−O−)、チオエーテル基(−S−)、カルボニル基(−C(=O)−)、チオニル基(−C(=S)−)、エステル基、アミド基、ウレア基(−NHC(=O)NH−)、チオウレア基(−NHC(=S)NH−);および、アミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、ウレア基、チオウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するC1−C6アルキレン基を挙げることができる。
ここで「C1−C6アルキレン基」とは、炭素数1〜6の直鎖状または分枝鎖状の2価脂肪族炭化水素基をいい、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、テトラメチレン、ヘキサメチレン、メチルエチレン、メチルプロピレン、ジメチルプロピレン等を挙げることができ、C1−C4アルキレン基が好ましく、C1−C2アルキレン基がより好ましい。
なお、アクリルアミド構造(I)では、本発明と同一の作用効果を享有するものとしてピリジン環にメチル基等の一般的な置換基を導入することも可能であるが、この様な均等物も本発明の範囲内に含まれるものとする。
また、本発明に係るアクリルアミド構造(I)におけるリンカー基の置換位置も特に限定されず、下記構造(I’)に示す位置に存在する場合もある。
この構造(I’)と構造(I)は全く等価であり、いかなる位置に側鎖が存在するかは必ずしも明らかではないが、実際には両者の混合物であると考えられ、勿論、構造(I’)も本発明の範囲内に含まれる。
本発明では、ポリアクリルアミドゲルの少なくとも一部に構造(I)を存在せしめる必要があることから、分離ゲルを製造するに当たって、下記式(II)で表されるアクリルアミド化合物および/またはその遷移金属錯体を、モノマーとしてアクリルアミド混合溶液に添加する。
[式中、Xは前述したリンカー基を示す。]
このアクリルアミド混合溶液に含まれるアクリルアミド化合物は、全てアクリルアミド化合物(II)であってもよいが、好適には、従来より用いられているアクリルアミドとN,N’−メチレンビスアクリルアミドとの混合物に、化合物(II)および/またはその遷移金属錯体を添加することが好ましい。N,N’−メチレンビスアクリルアミドには架橋作用があるからであり、また、化合物(II)のみでは、嵩高いフォスタグ部分が重合を阻害することによりゲルが形成され難くなる場合があるからである。その一方で、ゲル中における構造(I)の割合が高いほどリン酸化ペプチドの移動距離は短くなり、その分離同定は容易になる。化合物(II)の添加量は、用いる被験試料等に応じて、予備実験により最適なものを採用すればよく特に制限されないが、一般的には、アクリルアミドに対するモル比で1×10−7〜1×10−3程度(より好適には、1×10−6〜1×10−4程度)とすることが好ましい。
また、1個のフォスタグ部分には2個の遷移金属または遷移金属イオンが配位するため、遷移金属塩等の遷移金属化合物は、化合物(II)に対して2倍モル当量以上添加する。遷移金属化合物の添加は、少なくともモノマーが重合してゲルが形成される前に行なう。重合した後では、遷移金属または遷移金属イオンが配位し難いからである。なお、遷移金属または遷移金属イオンが化合物(II)に配位してから重合が起こるのか、重合した後に配位するかは明らかでないが、おそらく両方が同時に起こっていると考えられる。
遷移金属または遷移金属イオンを配位させるための遷移金属化合物としては、硝酸塩や酢酸塩などの遷移金属塩を好適に用いることができる。例えばZn2+を配位させる場合には硝酸亜鉛や酢酸亜鉛を使用すればよいが、酢酸亜鉛を添加する場合には、一旦、フォスタグ部分に酢酸が以下の様に配位した化合物が得られと考えられる。
この構造は、構造(I)よりも安定であるが、構造(I)と等価なものであり、構造(I)と同様に用いることができる。即ち、電気泳動時には、リン酸モノエステル基が酢酸と交換的に配位して相互作用するため、リン酸化ペプチドを検出することができる。
本発明の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルは、その構造中の少なくとも一部に構造(I)を有し、複数の構造(I)が隣接することも考えられるが、アクリルアミド或いはN,N’−メチレンビスアクリルアミドと隣り合って重合している可能性が高い。いかなる構造をとるかはアクリルアミド化合物(II)の添加量などに依存するが、本発明では、その構造中の少なくとも一部に構造(I)を有すれば、その厳密な構造は特に問わないものとする。
本発明のアクリルアミド化合物(II)は、スキーム1を含むことを特徴とする方法によって容易に製造することができるが、製造方法は、以下に示すものに制限されない。
[スキーム1]
[式中、Xは前述したリンカー基を示す。]
上記スキーム1においては、カルボン酸とアミンとの一般的なアミド化反応を採用することができる。例えば、化合物(III)とアクリル酸とをカルボジイミド化合物等の縮合剤の存在下で反応させるなど、公知方法を採用することができる。
スキーム1の反応で用いられる溶媒は、化合物(III)等を適度に溶解できるものであれば特に制限されないが、例えば、塩化メチレンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素を使用できる。また、縮合剤も特に制限されないが、水溶性のカルボジイミドが後処理も容易であり便利である。
反応は、好ましくは室温で30分から6時間程度行なえばよい。反応終了後は、例えば水と水に不溶性の有機溶媒との間で分配し、有機層を乾燥濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなど公知方法により精製すればよい。
上記スキーム1において、化合物(III)は、以下のスキーム2により製造することができる。
[スキーム2]
[式中、Rは−X−NH2基またはX−NH2基へ容易に変換可能な置換基を示す。また、“Hal”はハロゲン原子を示し、好適には臭素原子を示す。]
原料化合物である化合物(IV)(1,3−ジアミノ−2−プロパノール)は、市販のものを使用することができる。また、化合物(V)と化合物(VII)は比較的簡単な構造を有しているので、市販のものを用いるか、或いは当業者公知の方法により合成することができる。
スキーム2では、先ず、触媒の存在下に化合物(IV)と(V)を縮合反応させて化合物(VI)を得る。本反応は一段階ずつ化合物(V)を導入していってもよいが、3当量以上の化合物(V)を使用することによって一段階反応で化合物(VI)を得ることもできる。
スキーム2では、縮合反応として還元的アミノ化反応を行なっている。その場合に使用される溶媒は、化合物(IV)と(V)とを実質的に溶解でき、反応を阻害しないものであれば特に制限なく使用することができるが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類;ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類;水;又はこれらの混合溶媒を使用することができる。
還元的アミノ化反応では、先ず化合物(IV)と(V)を触媒としての濃塩酸存在下に縮合した後、一般的な還元試薬により還元することができる。
反応温度と反応時間は、原料化合物の種類等によって好適な条件を採用すればよいが、例えば20〜80℃で12〜100時間反応させる。反応終了後は、溶媒等を減圧留去した後に水を加え、非水溶性溶媒で抽出し、油相を無水硫酸マグネシウム等で乾燥した後に溶媒を減圧留去する。次いで、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知方法により精製して、化合物(IV)を得ることができる。
なお、化合物(VI)を得る方法はスキーム2で示した方法に限られず、例えば化合物(IV)とハロゲン化合物から合成してもよい。
次に、化合物(VII)を反応させることにより、化合物(III’)を得ることができる。この反応は、一般的な三級アミンの合成反応を採用することができる。例えば、溶媒中塩基の存在下で縮合させる。また、当該ステップにおいては、Rの種類に応じて、適宜保護基の導入と脱保護を行なってもよい。或いは、化合物(VII)中Rの代わりに不活性置換基を有する化合物を用いて当該ステップを行なった後、官能基変換により当該不活性置換基をR2へ変換することにより化合物(III’)を合成してもよい。例えば、不活性置換基としてニトロ基を有する化合物を使用し、当該ステップ後にニトロ基を反応性基であるアミノ基に変換してもよい。更に、例えばX基のフォスタグ側末端がアミド基やエステル基である場合には、R基としてメチルエステル基を有する化合物(VII)を用いて反応を行なった後、エステル交換反応を行なうことによりアクリルアミド化合物(II)としてもよい。
本発明に係る方法に使用できるフォスタグ部分としては、下の構造を用いることもできる。
[式中、M2+とXは前述したものと同義を示す。また、R1〜R3は、ピリジン環上の4または6位における電子供与性置換基を示す。]
上記フォスタグ部分においては、適切な置換位置に導入された電子供与性置換基によってピリジン窒素が電子リッチとなっているため、M2+に対する配位性に優れており、結果的に製造が容易であり、また、安定性を有すると考えられる。
本発明の電気泳動方法の他のステップ等は、従来のものをそのまま利用できる。例えば、濃縮ゲルや電流のかけ方等は、一般的な方法を用いればよい。
従来のSDS−PAGEにおいては、試料中のペプチドの電荷はSDSにより打ち消されるため、各ペプチドの移動距離は分子量にのみ依存する。そして、ペプチド(タンパク質)の分子量は一般的な化合物に比してはるかに大きいことから、リン酸化されたのみでは電気泳動で検出できるほどに分子量の差は生じない。一方、本発明の電気泳動方法においては、試料中のリン酸化ペプチドは分離ゲル中のフォスタグ部分と相互作用しながら移動するため、その移動距離は明らかに小さくなる。従って、本発明の電気泳動方法による結果と従来のSDS−PAGEによる結果を比較すれば、リン酸化されているペプチドを容易に特定することが可能になる。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
6−メチルニコチン酸メチル(50g、331ミリモル)の四塩化炭素(625mL)溶液にN−ブロモコハク酸イミド(59g、331ミリモル)を加えた。更に過酸化ベンゾイル(1.0g)を添加後、投光器で光を照射しながら40〜50℃で24時間反応させた。反応液を冷却後、析出した結晶を濾別し、濾液を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、37gの目的物を得た。
1H−NMR(CDCl3,300MHz):δ3.96(3H,s,OCH3),4.58(2H,s,CH2Br),7.54(1H,d,Py),8.30(1H,dd,Py),9.17(1H,d,Py)
製造例1−2 N,N,N’−トリ(2−ピリジルメチル)−1,3−ジアミノプロパン−2−オール
1,3−ジアミノプロパン−2−オール(32.6g、362ミリモル)のメタノール(2400mL)溶液に濃塩酸(60mL)を加え、更に2−ピリジンアルデヒド(116.3g、1.09ミリモル)を滴下した後、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム(50.16g、798ミリモル)を添加した。添加終了後、室温で3日間反応させた。反応液に濃塩酸を加えてpH6に調整した後、ある程度濃縮し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液を加えてpH7に調整し、クロロホルムで抽出した。当該クロロホルム層を集め、乾燥した後に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、34gの目的物を得た。
1H−NMR(CDCl3,300MHz):δ2.59−2.83(4H,m,CH2),3.86−4.01(7H,m,NCH2Py,CH),7.15(3H,dd,Py),7.23−7.32(3H,m,Py),7.56−7.65(3H,m,Py),8.53(3H,dd,Py)
製造例1−3 N,N,N’−トリ(2−ピリジルメチル)−N’−(5−メトキシカルボニル−2−ピリジルメチル)−1,3−ジアミノプロパン−2−オール
製造例1−2で得たN,N,N’−トリ(2−ピリジルメチル)−1,3−ジアミノプロパン−2−オール(18.2g、50ミリモル)の乾燥ジメチルホルムアミド(150mL)溶液に炭酸カリウム(13.8g、100ミリモル)を加え、製造例1−1で得た6−ブロモメチルニコチン酸メチル(11.5g、50ミリモル)の乾燥ジメチルホルムアミド(75mL)溶液を滴下し、滴下後、50℃で1時間反応させた。反応後、溶液を冷却した後、750mLの水に投入して1N塩酸でpH8に調整した。酢酸エチルで抽出後、酢酸エチル層を集め、水,飽和食塩水で洗浄した後に濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、21.5gの目的物を得た。
1H−NMR(CDCl3,300MHz):δ2.58−2.73(4H,m,CH2),3.83−3.95(12H,m,OCH3,NCH2Py,CH),7.10−7.14(3H,m,Py),7.34(3H,d,Py),7.50−4.60(4H,m,Py),8.17(1H,dd,Py),8.50(3H,d,Py),9.09(1H,d,Py)
製造例1−4 N,N,N’−トリ(2−ピリジルメチル)−N’−[5−N’’−(2−アミノエチル)カルバモイル−2−ピリジルメチル]−1,3−ジアミノプロパン−2−オール
製造例1−3で得たN,N,N’−トリ(2−ピリジルメチル)−N’−(5−メトキシカルボニル−2−ピリジルメチル)−1,3−ジアミノプロパン−2−オール(9.7g、18.9ミリモル)のメタノール(100mL)溶液にエチレンジアミン(22.7g、378ミリモル)を滴下し、滴下後、室温で3日間反応させた。反応後、溶液を濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して9.72gの目的物を得た。
1H−NMR(CDCl3,300MHz):δ2.54−2.71(4H,m,CH2),2.94(2H,t,CH2N),3.49(2H,dt,CH2N),3.80−3.99(9H,m,NCH2Py,CH),7.12(3H,ddd,Py),7.35(3H,d,Py),7.45(1H,d,Py),7.58(3H,ddd,Py),8.02(1H,dd,Py),8.49(3H,ddd,Py),8.89(1H,d,Py)
製造例1−5 アクリルアミド化合物
製造例1−4で得たN,N,N’−トリ(2−ピリジルメチル)−N’−[5−N’’−(2−アミノエチル)カルバモイル−2−ピリジルメチル]−1,3−ジアミノプロパン−2−オール(220mg、0.37ミリモル)とヒドロキノンモノメチルエーテル(0.35mg)との塩化メチレン(20mL)溶液に、アクリル酸(35.3mg、49ミリモル)を添加し、次いで1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(93.5mg、49ミリモル)を添加し、室温で75分間反応させた。反応終了後、反応液に水を加え、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を合わせて濃縮して得られた粗製品をカラムクロマトグラフィーで精製し、237mgの目的物を得た(収率98%)。
1H−NMR(CDCl3,300MHz):δ2.60−2.66(4H,m,CH2),3.62(4H,bs,NCH2CH2N),3.78−3.91(9H,m,NCH2Py,CH),5.65(1H,dd,CH=CH2),6.11(1H,dd,CH=CH2),6.30(1H,dd,CH=CH2),6.72(1H,bs,NHCO),7.12(3H,ddd,Py),7.35(3H,dd,Py),7.45(1H,d,Py),7.58(3H,ddd,Py),7.82(1H,bs,NHCO),8.00(1H,dd,Py),8.49(3H,dd,Py),8.90(1H,d,Py)
製造例1−6 電気泳動用ゲルの作成
上記製造例1−5で得たアクリルアミド化合物を用い、表1の組成に従って、分離ゲルを作成した。また、表1の組成で濃縮ゲルを作成した。なお、各溶液の溶媒は、蒸留水または再蒸留水である。
別途、アトー社製のゲル作製キット(AE−6401型ミニスラブゲル作製キット)を用いて、ミニスラブゲルプレート(内部厚さ:1mm,内部幅:90mm)を組み立てた。このゲルプレートへ、上記分離ゲルを、気泡が入らないように高さ70mmまで注ぎ入れた。この際、実験台にゲルプレートを立てて、分離ゲル上面が水平になっていることを確認した。
次に、マイクロピペッターを用いて、蒸留水を分離ゲル上面に静かに重層した。重層する蒸留水の量は、分離ゲル上面から約1cmの高さを目安にした。そのまま室温で1時間静置して、分離ゲルを硬化させた。以下、この分離ゲルを「分離ゲルA」という。分離ゲルの硬化を確認し、重層した蒸留水を除去した後、濃縮ゲルの準備をした。
表1の組成に従って、分離ゲル溶液の調製と同様の方法により濃縮ゲル溶液を調製し、上記分離ゲルの上に注ぎ入れた。次いで、サンプル充填用のウェルを形成するためのミニコウムを差込み、そのまま室温で1時間静置することによって、濃縮ゲルを硬化させた。
濃縮ゲルの硬化を確認した後、ミニコウムをゆっくり抜き取った。その結果できたサンプル充填用のウェルに、表2の組成を有する泳動用バッファーを、マイクロピペッターで満たした。この泳動用バッファーを除去し、再度同様の処理を行なってウェルを洗浄した。ウェル洗浄後、ミニスラブゲルプレートからシールガスケットを取り外して、ゲルプレートを完成させた。
試験例1
表3の組成で、サンプル調製用バッファーを調製した。
電気泳動後、ゲルを外し、染色液(3.0mMクマジーブリリアントブルーR−250+45%(v/v)メタノール+1.2%(v/v)酢酸)に室温で一晩浸漬して染色した。次いで、脱色液(25%(v/v)メタノール+10%(v/v)酢酸)に室温で5時間浸漬し、脱色した。得られたゲルの写真を、図1として示す。
当該結果によれば、従来ゲル(分離ゲルB)を用いた場合には、同一のタンパク質においてはリン酸化型のものと脱リン酸化型のもののバンドは、同じ位置にある。一方、本発明のゲル(分離ゲルA)を用いて電気泳動を行なった場合には、リン酸化されたタンパク質(サンプルNo.1、3、5)は、脱リン酸化された同一のタンパク質(サンプルNo.2、4、6)に対して、明らかにバンド移動距離が小さくなっている。従って、本発明に係る電気泳動用ゲルを用いれば、リン酸化或いは脱リン酸化されたタンパク質を容易に特定できることが実証された。
製造例2 電気泳動用ゲルの作成
上記製造例1−5で得たアクリルアミド化合物を用い、表5の組成とする以外は上記製造例1−6と同様にして分離ゲルを作成した。なお、MnCl2の添加量はアクリルアミド化合物に対して2当量である。
表7の組成で、サンプル調製用バッファーを調製した。
当該結果の通り、脱リン酸化型タンパク質を電気泳動した場合であっても、ゲルにおける本発明のアクリルアミド化合物濃度が高くなるにつれRf値は小さくなる。しかし、リン酸化型タンパク質のRf値は脱リン酸化型タンパク質のRf値よりも明らかに小さくなっている。従って、本発明に係る電気泳動用ゲルを用いれば、遷移金属イオンとしてZn2+を用いる場合のみならずMn2+を用いても、リン酸化或いは脱リン酸化されたタンパク質を容易に特定できることが実証された。
また、本発明の製造方法とその合成中間体であるアクリルアミド化合物は、この様な電気泳動用ポリアクリルアミドゲルの製造に用いることができるものとして有用である。
Claims (5)
- M2+が第4周期に属する遷移金属の2価陽イオン(ただし、Zn 2+ を除く)である請求項1に記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
- M2+がMn 2+ である請求項1に記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲル。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを分離ゲルとして用いることを特徴とするポリアクリルアミドゲル電気泳動方法。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/JP2005/014469 WO2007015312A1 (ja) | 2005-08-01 | 2005-08-01 | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP4167296B2 true JP4167296B2 (ja) | 2008-10-15 |
JPWO2007015312A1 JPWO2007015312A1 (ja) | 2009-02-19 |
Family
ID=37708595
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007529167A Active JP4167296B2 (ja) | 2005-08-01 | 2005-08-01 | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7901559B2 (ja) |
EP (1) | EP1911776B1 (ja) |
JP (1) | JP4167296B2 (ja) |
AU (1) | AU2005335179B2 (ja) |
CA (1) | CA2617680C (ja) |
DE (1) | DE602005018689D1 (ja) |
WO (1) | WO2007015312A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011028535A2 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Life Technologies Corporation | System for rapid high-resolution gel electrophoresis |
WO2011087766A2 (en) * | 2009-12-22 | 2011-07-21 | Cornell University | Methods for assessing er stress |
JP5967751B2 (ja) * | 2011-12-16 | 2016-08-10 | ハイモ株式会社 | 電気泳動用プレキャストゲル、その製造方法および使用方法 |
CN114791458A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-07-26 | 大连博格林生物科技有限公司 | 一种通过电泳分离蛋白的凝胶、配合使用的缓冲液及其试剂盒 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5237016A (en) * | 1989-01-05 | 1993-08-17 | Siska Diagnostics, Inc. | End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids |
US5264101A (en) * | 1989-11-06 | 1993-11-23 | Applied Biosystems, Inc. | Capillary electrophoresis molecular weight separation of biomolecules using a polymer-containing solution |
WO1995016910A1 (en) * | 1993-12-17 | 1995-06-22 | Perkin-Elmer Corporation | Uncharged polymers for separation of biomolecules by capillary electrophoresis |
JP2003523499A (ja) * | 1999-01-12 | 2003-08-05 | スペクトラメディックス コーポレイション | キャピラリーゲル電気泳動のためのコポリマー |
JP4969760B2 (ja) * | 2000-08-21 | 2012-07-04 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ポリマー |
WO2003053932A1 (fr) * | 2001-12-21 | 2003-07-03 | Tohru Koike | Complexes de zinc capables de pieger des substances portant des substituants anioniques |
WO2004078724A1 (ja) * | 2003-03-03 | 2004-09-16 | Kabushiki Kaisha Nard Kenkyusho | リン酸化ペプチドの標識方法および選択的吸着方法、該方法に使用される錯体化合物、該錯体化合物の製造方法、および該錯体化合物の原料化合物 |
WO2004078342A1 (ja) * | 2003-03-04 | 2004-09-16 | Manac Inc. | アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤 |
JP4109621B2 (ja) | 2003-03-07 | 2008-07-02 | 株式会社ナード研究所 | リン酸モノエステル化合物の分子量を求める方法、およびマススペクトル測定用添加剤 |
JP2004305024A (ja) | 2003-04-02 | 2004-11-04 | Toyobo Co Ltd | 酵素活性の調節方法および試薬 |
CA2542742C (en) * | 2003-10-16 | 2015-04-21 | Kabushiki Kaisha Nard Kenkyusho | Method for measuring a surface plasmon resonance and noble metal compound used for the same |
JP4403020B2 (ja) | 2004-06-10 | 2010-01-20 | 株式会社ナード研究所 | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 |
-
2005
- 2005-08-01 AU AU2005335179A patent/AU2005335179B2/en active Active
- 2005-08-01 US US11/988,968 patent/US7901559B2/en active Active
- 2005-08-01 CA CA2617680A patent/CA2617680C/en active Active
- 2005-08-01 WO PCT/JP2005/014469 patent/WO2007015312A1/ja active Application Filing
- 2005-08-01 EP EP05768592A patent/EP1911776B1/en active Active
- 2005-08-01 JP JP2007529167A patent/JP4167296B2/ja active Active
- 2005-08-01 DE DE602005018689T patent/DE602005018689D1/de active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2007015312A1 (ja) | 2007-02-08 |
CA2617680C (en) | 2012-11-20 |
EP1911776A4 (en) | 2009-04-22 |
EP1911776A1 (en) | 2008-04-16 |
US7901559B2 (en) | 2011-03-08 |
AU2005335179A1 (en) | 2007-02-08 |
AU2005335179B2 (en) | 2011-03-17 |
US20100108515A1 (en) | 2010-05-06 |
EP1911776B1 (en) | 2009-12-30 |
DE602005018689D1 (de) | 2010-02-11 |
JPWO2007015312A1 (ja) | 2009-02-19 |
CA2617680A1 (en) | 2007-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6852819B2 (en) | Stimuli-responsive polymer utilizing keto-enol tautomerization and stimuli-responsive separating material and chemical-releasing capsule comprising the same | |
Higashi et al. | Thermo-responsive amino acid-based vinyl polymers showing widely tunable LCST/UCST behavior in water | |
JP4167296B2 (ja) | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 | |
JP2000212144A (ja) | アクリルアミド誘導体および該誘導体を含む重合体 | |
JP5654786B2 (ja) | アクリルアミド誘導体および該誘導体を含む重合体 | |
WO2004078724A1 (ja) | リン酸化ペプチドの標識方法および選択的吸着方法、該方法に使用される錯体化合物、該錯体化合物の製造方法、および該錯体化合物の原料化合物 | |
JP4403020B2 (ja) | 電気泳動用ポリアクリルアミドゲル、それを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動方法、その製造方法、およびアクリルアミド化合物 | |
CN110143893B (zh) | 一种能强结合α-突触核蛋白聚集体的化合物、其制备方法及其用途 | |
JP2008291207A (ja) | 塩基性アミノ酸を有するらせん状ポリマー | |
JP6852671B2 (ja) | アルキルアミン誘導体の製造方法及びその製造中間体 | |
JP5057782B2 (ja) | アクリルアミド誘導体の合成方法 | |
CN106459108B (zh) | 包含磷酰胆碱衍生物的分离材料 | |
JP4008446B2 (ja) | ベンゼン環上に二置換基を有するβ−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体 | |
EP0706520A1 (en) | Novel cross-linking agents and use thereof | |
JP2835478B2 (ja) | 新規アクリレート化合物 | |
US20220325072A1 (en) | Zwitterionic crosslinkers, hydrogels comprising zwitterionic crosslinkers, and methods for making and using | |
US11666655B2 (en) | Formulation for stabilizing bio-therapeutics | |
RU2617409C1 (ru) | Амиды акриловой и метакриловой кислот с n-алкилпиперазино-пиперидинами и способ их получения | |
JP4565236B2 (ja) | サイトカラシン誘導体およびその製造方法 | |
RU2617694C1 (ru) | Амиды акриловой и метакриловой кислот с олигопиперидинами и способ их получения | |
JP2022134369A (ja) | 重合体、水不溶性樹脂粒子、医療用素材、生化学実験用素材及び固定化生理活性物質 | |
JPH11171928A (ja) | ケトエノール互変異性を利用した刺激応答性高分子及びそれを用いた刺激応答型分離材料 | |
RU2440361C1 (ru) | Физиологически активные бис-(диалкиламиды) фосфорилзамещенных 1,4-дикарбоновых кислот и способ их получения | |
SU1728224A1 (ru) | Способ получени пентафторфениловых эфиров N-замещенных @ -аминокислот | |
JP2020171872A (ja) | 抗体の精製方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080729 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080731 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4167296 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110808 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110808 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120808 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120808 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130808 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |