JP4088341B2 - 合成架橋を用いる組織接着剤 - Google Patents
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Description
本発明の分野は、組織接着剤及びシーラントとして使用する生理的許容し得る組成物に関するものである。
発明の背景
多くの状況で、分離された組織を結合する必要がある。縫合術及びホッチキスは効果的であり、かつ十分に確立された傷を閉じる装置である。しかし、古典的な修繕処置に満足できない場合、組織又は臓器の脆弱性、接近困難(例えば、内視鏡処置)又は毛細血管"滲出性"を含む体液損失に起因して、高度に訓練されたスペシャリスト(例えば、顕微鏡下手術)に限定されるか、又は適用できない外科的処置がある。これらの必要に応じて、組織接着剤及びシーラントが開発されてきた。これらを使用して、縫合され又はホッチキスで閉じられた傷を密閉したり又は補強することができ、かつ独立に使用できると認められる。これらの先駆的市販製品はフィブリン接着剤及びシアノアクリレートである。しかし、この両製品は広範囲の使用を妨げる重大な制限があった。
シアノアクリレートは、主に顔面及び再建的な手術において、皮膚の傷を閉じるために使用されている。シアノアクリレートの魅力は、ほとんど直ちにといえる、結合の速さ及びその大きな結合強度である。しかし、所望の形態に再成形するために、結合した組織を再度切らなければならないので、その結合の速度は欠点にもなり得る。加えて、それは乾いた支持体の上でのみ使用することができる。その理由は、その作用機序が機械的連結を介して、シーラントとしてのその使用を制限するので、かつその周辺組織と比べ相対的に柔軟ではないからである。また、シアノアクリレートは幾つかの組織に対し毒性があることが知られており、生物分解性ではないとみなされているが、潜在的な分解生成物は発癌性があると疑われている。
血液由来フィブリノーゲン、ファクターXIII及びトロンビンを含むフィブリン接着剤は、最初にシーラント及び止血剤として機能し、身体における多くの異なる外科的処置に使用されてきた。これらは、非毒性、生体適合性で、かつ生物分解性であることを示してきた。これらは過剰な出血を制御し、かつ繊維形成を減少させることができる。しかし、フィブリンを用いて結合した組織は、平面的な中程度の引張り応力をかけると、この結合が破断してしまう。最初の結合が発揮されるまで約3〜10分かかるが、完全な強度が発揮されるようになるまで約30分〜数時間必要となる。その用途によるが、また該製品はあまりに速やかに再吸収することがある。再度組換えて製造されたフィブリノーゲン、ファクターXIII、トロンビン及び関連成分(例えば、フィブリン、活性化されたファクターXIII)は、フィブリン接着剤の設定時間又は強度の改善を示さない。異種のヒト及び動物、血清由来のフィブリン接着剤は望ましくない免疫応答を誘導することがあり、かつ患者がウイルス感染の潜在的危険に晒される。自家組織フィブリン接着剤は、入手及び使用は実際的ではないであろうし、患者の安全を損なうことがある。
したがって、フィブリン接着剤の生体適合性を有するが、速やかに硬化し、かつ強度が増した製品の開発に多くの関心が寄せられている。これらの製品は、望ましくは天然の供給源以外から、容易に得られるものでなければならず、容易に投与でき、かつ所定時間で再吸収され得るものでなければならない。
関連文献
組織接着剤は次の文献に記載されている:「Tissue Adhesives in Surgery, Matsumoto, T.の論文,MediCal Examination Publishing Co., InC. 1972年、及びSierra, D.H.の論文,J. Biomat. App. 7:309-352頁,1993年」である。繰り返し単位を有するタンパク質ポリマーの製造方法が、米国特許第5,243,038号及び欧州特許出願公開第89.913054.3号に開示されている。
発明の要約
重合体組成物及びその使用方法を提供する。この重合体は本来の場所で化学的に架橋し、新規な架橋した重合体生成物を提供することができ、該生成物は組織との強力な付着結合で例示されるような、良好な機械的及び生物学的特性を有している。該組成物は物理的、化学的及び生物学的特性に関連する様々な用途で使用し、分離した組織を結合することができ、そこに安定で、柔軟な、再吸収性結合特性の少なくとも1つを提供することができる。
具体的な実施態様の記載
対象となる組成物は、天然の構造タンパク質に関連する繰り返し単位を1個又は組合わせて有する高分子量組換えポリマーを含むものである。特に関心を持たれているのは、フィブロイン、エラスチン、コラーゲン及びケラチン、特に、コラーゲン、及びフィブロイン及びエラスチンとの組合わせの繰り返し単位である。該ポリマーは生理学的に許容し得る架橋剤により、様々な支持体に対し強い付着特性を有する組成物を形成するように、生理的な条件の下で化学的に架橋することができる官能基を有し、支持体相互間の結合を維持する強い機械的特性を有し、かつ良好な再吸収特性を有するように調製することができる。
特に興味が持たれるのは、対象となる組成物が組織に強力な付着結合を与え、近接する空間的関係に分離された組織を維持することである。また、該対象となる組成物が組織で欠けた空隙を満たすのに有用である場合、該組成物はシーラントとしても用いて、組織の量を増やすか、又は組織に合成物質を結合させることができる。また、組織結合の接着剤として使用できるか、又は薬剤の緩慢な放出源として他のものと結合するか又は単独で使用できるかいずれかの場合、対象となる組成物は、薬剤組成物に混ぜることによりインビボにおける貯蔵部として役立つ。
架橋に関連する官能基は、すべて同じ官能基又は組合わせとすることができ、この官能基には天然のアミノ基の官能基、例えば、アミノ基(例えばリジン)、カルボキシル(例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸)、グアニジン(例えばアルギニン)、ヒドロキシル(例えば、セリン及びスレオニン)及びチオール(例えばシステイン)がある。この官能基では、アミノ基(グアニジンを含む。)が好ましい。
該ポリマーは、分子量が少なくとも約15kD、一般には少なくとも約30kD、好ましくは少なくとも約50kD及び通常は250kD以下であり、より一般的には約150kD以下である。該ポリマーは少なくとも2個の官能基、より一般には少なくとも約4個の官能基を有し、一般的には官能基当たりの当量が、約1kD〜40kD、より一般的には約3kD〜20kD、好ましくは約3kD〜10kDの範囲であり、架橋し得る官能基が、少なくとも3個、通常少なくとも6個ある。所望ならば、ポリマーが官能基の組合わせを有する場合、又は例えば、カルボキシル及びアミノ基、チオール及びアルデヒド、ヒドロキシル及びアミノ基などの異なる官能基を有する場合、ポリマーの混合物を使用することができる。したがって、官能基及び架橋剤に依存して、アミド、イミン、尿素、エステル、エーテル、ウレタン、チオエーテル、ジスルフィドなどを形成することができる。
ポリマーにおける個々の単位を、フィブロイン、GAGAGS(配列番号:01);エラスチン、GVGVP(配列番号:02);及びコラーゲンGXXから選択することができる。なお、このXは同じでも異なっていてもよく、かつXの少なくとも10%(数)が、かつ60%(数)以下がプロリン、AKLK/ELAE(配列番号:3)である。所望の官能基は、個々の単位のアミノ酸の1個と置換することができ、又は約30アミノ酸以下、通常約16アミノ酸以下の介在性の基の個々のアミノ酸として、又は一部として存在してもよい。前者の場合、繰り返しのブロック内において、1以上の繰り返しが改質され、他では通常存在しないであろう架橋性官能基が導入される。したがって、バリンをリジンで、グリシンをアルギニンで、アラニンをセリンで置き換えることができる。後者の場合、介在性官能基の数が先に示した範囲に基づくようなときは、繰り返し単位のブロック間に介在性官能基があるであろう。
特に関心が持たれるのは、ブロック又はランダムのいずれか、好ましくはブロックのコポリマーであり、エラスチン及びフィブロインの場合には、エラスチン単位とフィブロイン単位の割合は16〜1:1,好ましくは8〜1:1であり、その場合ブロックは異なる割合であってもよい。通常、ブッロクコポリマーにおいて、各ブロックは少なくとも2単位を有し、かつ約32単位以下であり、通常約24単位以下である。適当な官能基を有するアミノ酸により該単位中のアミノ酸を置換することにより、該ポリマー中に適当な数の官能基を提供するか、又はブロック間で介在性の基を用いることができる。
個別のアミノ酸繰り返し単位は約3〜30アミノ酸、通常3〜25アミノ酸、より普通には3〜15アミノ酸、特に3〜12アミノ酸、より特別には約3〜9アミノ酸を有する。タンパク質ポリマーの少なくとも40重量%、通常少なくとも50重量%、より通常は少なくとも70重量%が、少なくとも2個の同一な、近接する繰り返し単位を含む、繰り返し単位のセグメントで構成されることになる。コポリマーを用いる場合で、架橋性官能基で改質された単位をその単位として考える場合、一般に繰り返しブロックを少なくとも2、4、7又は8単位及びその組合わせを含む。
大抵の場合は、本発明のポリマーは、該ポリマー鎖に天然のアミノ酸の活性官能基を有し、所望ならば、ペンダント基を採用して、該所望の官能基を提供することができる。例えば、カルボキシル基に、単一のアミノ基又は複数のアミノ基についてカルボキシル官能基と交換するように、ポリアミンを反応させることができる。アミノ基をポリカルボン酸で置換することができ、その結果、該アミノ基が複数のカルボキシル基で置き換わる。アルデヒドオレフィン(例えば、アクロレイン)と反応させることにより、アルデヒド官能基を提供するように、チオールをアルデヒドで置き換えることができる。導入できる他の官能基には、所望ならば、リン酸エステル、活性化オレフィン、マレイミド、チオイソシアナート:などがある。該官能基は天然のものから著しく変化し、架橋の機会を提供することができる。幾つかの例において、該鎖に沿って官能基の数が増加しないが、これに単位分子量当たりの官能基の数が増加するのが好ましいことがある。その理由は、例えば、チオールがアルデヒドというように、1官能基を他の官能基で置き換え、架橋剤の選択において多くのバリエーションを可能にするからである。
官能基が同じか又は異なっていてもよい場合、通常官能基4個を超えなくとも、より高い官能基が存在し得るが、通常、架橋剤は二官能性であろう。通常、架橋剤は少なくとも炭素原子約3個であり、炭素原子が約50個以下であり、一般に炭素原子は約3〜30個、より通常には炭素原子約3〜16個であろう。該原子が炭素、酸素、窒素、硫黄、リンであり得る場合、2個の官能基を結び付ける鎖は少なくとも原子1個であり、原子は約100以下であり、通常原子は約60個以下であり、好ましくは約40個以下であり、特に約20個以下である。架橋基は、脂肪族で飽和され又は未飽和であってよく、好ましくは脂肪族であり、このような官能基として、オキソ、エステル、アミド、チオエーテル、アミノ及び亜リン酸エステルを含んでいてもよい。該架橋基は疎水性又は親水性であってもよい。
各種反応性官能基、例えばアルデヒド、イソシアナート:シアネート、例えばエトキシカルボニル無水物のような混合カルボン酸無水物、活性化オレフィン、活性化ハロ、アミノなどを用いることができる。タンパク質ポリマー上の官能基、及び架橋剤を適当に選択することにより、反応速度及び架橋度を制御することができる。様々な架橋剤を、特に以前から用いられ、かつ生理学的に許容され得ると認められているものを用いることができる。本発明で用いることができる架橋剤を挙げると、グルタルアルデヒドのようなジアルデヒト、活性化ジオレフィン、テトラメチレンジジイソシアナート:、ヘキサメチレンジイソシアナート:及びオクタメチレンジイソシアナート:のようなジイソシアナート、コハク酸ニ無水物、エチレンジアミン四酢酸二無水物のような酸無水物、ヘキサメチレンジアミンのようなジアミン、シクロ(L-リシル-L-リジン)などがある。また、該架橋剤は非対称性官能基、例えば、例えばアクロレイン及びキノイドアルデヒトのような活性化オレフィンアルデヒト、活性化ハロカルボン酸無水物などでもよい。該架橋剤は、通常商業的に入手でき、また該接着剤に適用する前に、又はその場での合成のいずれかにより、常法に従い容易に合成することができる。
幾つかの例において、多官能性(通常は二官能性化合物)により改質単位として役立つ、生理的に許容し得る第2化合物を反応させて、架橋する性質を変えることができる。該第2化合物の添加により架橋速度を増加させ、架橋剤の溶解性を変え、架橋したポリマーの強度を増加又は低下させ、再吸収速度を増加又は低下させ、又は関心が持たれる他の物理的、化学的又は生物学的特性を付与することができる。該多官能性第2化合物を、該タンパク質との反応前に、又は該タンパク質との反応と同時に、架橋性化合物と反応させることができる。該反応が先である場合、得られる架橋性生成物は生理学的に許容し得るものであり、同時に行う場合、該多官能性第2化合物、該架橋性化合物及び得られる架橋性生成物は、インビボで使用する場合、生理学的に許容し得るものである。多官能性化合物と架橋性化合物との割合は、該多官能性第2化合物及び架橋剤を一緒に用いる場合、多官能性第2化合物の反応性、最終的なタンパク質組成物で望まれる架橋の数、及びタンパク質分子間の架橋の大きさなどに依存するが、一般に約0.1〜2:1,より一般的には約0.1〜1:1である。
多官能性第2化合物の性質を広い範囲にわたり変えることができる。存在する官能基は、該ポリマー上にある官能基と同じでも、異なっていてもよい。例えば、該タンパク質がアミノ又はヒドロキシル官能基を有する場合、該多官能性第2化合物はアミノ基及び/又はヒドロキシ基を有していてもよい。ジイソシアナートをジオールとを用いることにより、ジウレタンが生成する。したがって、該該タンパク質を架橋する鎖は2以上のウレタンを有することになる。
多くの例において、該多官能性第2化合物は、前記反応には参加しない内部官能基を有するが、前記架橋剤又は架橋されたタンパク質生成物に様々な他の特性を付与する。関心が持たれる特性には、親水性、加水分解非安定性、酵素的劣化に対する感受性、生体適合性、剪断強度などがある。ほとんどの場合、内部官能基は、ウレタン、アミノ基、アミド、ケトン、ジチオールなどを含む、エーテル、カルボン酸エステルなど、酸素、硫黄及び窒素原子を含む。再吸収の速度を増すために、エステル基に関心が持たれており、一方、親水性を増すが、おそらく同じ基をポリオキシアルキレン基のようなエーテル同様に採用することができる。
一般に、該多官能性第2化合物は少なくとも2個かつ50個以下の炭素原子、通常約30個以上の炭素原子を有し、望ましくはヘテロ原子1個あたり炭素原子約16個以上を有する。天然の又は合成二官能性化合物を用いることができる。例示的に化合物を挙げると、リジン、アルギニン、ジ-(2’-アミノエチル)マロン酸エステル、クエン酸エステル、リシルリジン,2’-アミノエチルグリシネート、O,N-ジグリシニルエタノールアミン、ジエチレングリコールジグリシネート、シスチンなどである。末端アミノ基を付与するために、各種の低分子量アミノ酸、特にエチレングリコール、ジエチレングリコール及びテトラグリコール、プロパンジオール、1,4-ブチン-2-ジオール、アスコルビン酸などのような介在性二官能性化合物と結合したグリシン及びアラニンを使用することができる。
該対象となる組成物を、一方又は双方が増量剤を含む場合、接着剤の使用前にタンパク質ポリマー及び前記架橋剤を組合わせて調製することができる。該2種の組成物は常法により簡単に混合することができる。例えば、該成分を中央反応器に注入することができるシリンジを使用する、及び該混合物を前記シリンジ中に引き込み混合した混合物を使用し、及び該混合物を前後に動かすことである。それに代わり、該2種の組成物を適用部位に同時に施すことができる。幾つかの例において、前記架橋剤を、多官能性第2化合物を加える前に、タンパク質と部分的に反応させることが好ましいであろう。それに代わり、前記多官能性第2化合物を、架橋剤と混合する前に、タンパク質と混合することができる。
通常、前記ポリマーは、特に水性の、分散液又は溶液として入手することができ、一般にタンパク質ポリマーの濃度は、約50mg〜1g/ml、より一般的には約100〜800mg/mlである。該溶液は架橋速度を速める又は遅らせるpHに緩衝することができる。通常、該pHは約2〜12、より一般的には8〜11であろう。例えばリン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩などの各種の緩衝液を使用することができる。該カチオンは前記生成物の性質に関し及びその程度に影響を有することができ、該アルカリ金属、カリウム及びナトリウムが好ましい。前記タンパク質組成物を、一般に約5〜40、より一般的には約5〜20、好ましくは約10〜20重量%とすることで、容易に扱うことができ、所望の時間内に固まる組成物を提供する。前記緩衝液の濃度は、一般に約50〜500mMとする。安定剤、界面活性剤などの薬剤がタンパク質溶液中にあってもよい。多官能性第2化合物がある場合、その濃度は架橋剤とポリマーの割合により決まる。
架橋剤、ポリマー上にある官能基の数、硬化させる所望の速度などに依存して、架橋剤とポリマーの割合は広い範囲で変化する。一般的にポリマーと架橋剤の重量比は、少なくとも約1:1で、かつ約100:1以下であり、通常約50:1以下で、一般的にその範囲は約2〜50:1であるが、若干の例では30:1よりも高くなってはならない。タンパク質と架橋剤の当量比は、一般に約0.1〜1:3、より一般的には約0.5〜2:2の範囲である。該タンパク質−架橋剤当量比の選択における考察では、硬化速度、架橋剤の反応性、混合物における架橋剤の相対的溶解性、架橋剤の生理学的特性、架橋された生成物の安定性の所望程度を考慮する。
所望ならば、各種エクステンダー又は増量剤、特に天然のタンパク質を使用することができる。通常、このようなエクステンダーは、前記組成物の50重量%を超えるものではなく、一般的には約20重量%を超えることはなく、より一般的には約10重量%を超えるものではない。本発明で用いることができるエクステンダー(増量剤)を挙げると(これらに限定されるものではない。)、合成ポリマー、付加及び縮合ポリマーの双方、タンパク質及び非タンパク質の双方、例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリビニル化合物、ポリオレフィン、ポリアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリエステル、ポリビニルアルコール、ポリエーテル、コポリマー及びその誘導体、並びにタンパク質及び非タンパク質のような天然のポリマー、例えば、コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、キトサン、ヘパリン、デキストラン、アルギネート、セルロース、グリコソアミノグリカン、ヒアルロン酸、多糖類、これらの誘導体などである。このエクステンダーは、硬化時間を調節し、接着剤の所望の物理的又は生理学的特性を付与することができる。
実験の章に記載した重なり剪断張力強度試験によると、30分以内、通常15分以内、より一般的には5分以内で、該重なり剪断張力強度は少なくとも100、好ましくは約250、より好ましくは約300となり、通常約4000を超えることはなく、より一般的には約3000g/cm2を超えることはない。
該対象となる組成物を組織に従来の方法で適用することができる。例えば、シリンジ、カテーテル、カニューレを使用する方法、該組成物の手作業での適用、及び噴霧法などである。この対象となる組成物は、組織片を近接する関係にする前に又は近接する関係にある間に適用することができる。該対象となる組成物は、近接する組織を維持するように、かなりの剪断強度を急速に発揮する。若干の状況において、通常少なくとも1週間、一般的には約4週間以下の妥当な期間が経過した後に、該組成物が分解される点に関心が持たれるであろう。
関心が持たれる組織には、動脈、静脈又は毛細血管のような血管、静脈、神経、肝臓、脾臓などの臓器、肺、硬膜、結腸などがある。
これらの接着剤としての使用に加えて、対象となる組成物は、組織における例えば空隙や孔といった欠陥の密封又は充填に使用でき、したがって、シーラントとして使用できると考えられる。したがって、該組成物は、例えば動脈、静脈、毛細血管などの破断した血管から出る血液など液体の流れを止め又は妨げるのに役立てることができる。シーラントとして対象となる組成物を使用する場合、該組成物を欠陥のある部位に前記のように適用し、それにより該欠陥を整えかつ密閉することができる。該組成物を通常の又は異常な組織に注入し、例えば真皮などの組織量を増やすことができる。
また、該対象となる組成物が、それ自身で又は他の物質と組合わせて量産する製品の形成に使用できると認められる。一つの応用例において、生体適合性、再吸収速度、血管新生の能力、組織接着及び/又は結合能力などに関心が持たれている場合、製品を哺乳動物ホストに対し内部的に使用することを目的に製造することができる。各種の製品を製造することができる。例えば、ピン及びネジのような対象に形成されるゲル、フィルム、糸、被膜、又は注射用組成物として組織を整えかつ結合し又は密閉することができる場合、薬剤の貯蔵部を形成し、組織を増やし又は賦形剤、被覆などになる場合、流動性の注射用組成物とすることができる。形成される対象物は、鋳型成形、押出成形、溶媒からの沈殿、溶媒蒸発などの常法により製造できる。前記流動性貯蔵部を、分子分散液の使用、ポリマーで飽和した媒質の微粒子の使用、また溶解温度を生理学的許容し得る添加剤などを加えることにより達成できる場合、溶融物を使用して、得ることができる。
該製品を哺乳動物ホストに埋め込むこと、又は例えば、傷の治療、火傷包帯などの哺乳動物ホストの表面に該製品を応用することを伴う様々な状況で、該製品が使用できると認められる。製品の性能が予め定めた時間維持され、自然のプロセスを通して自然の物質と置き換えられる場合、これらの状況において、自然のプロセスが自然の構造を再構築するまで、これらの機能の維持において、その機能を満たした後、吸収される物質を使用することが望ましい。したがって、該組成物は、細胞が進入し、かつ該組成物が自然の組成物(例えば、骨、軟組織など)と置き変わることができる限り、組織をともに保持すること、組織を覆うこと、臓器のために細胞を包むことに使用できると認められる。
ポリマー組成物の硬化速度を増すために、該組成物を部分的に予備重合させてもよい。予備重合させた場合、該ポリマーは、架橋反応の完結と比較して、通常、架橋の総数の少なくとも約3%、かつ架橋総数の約75%以下を有する。架橋数は得られる生成物が作業可能なものでなければならず、かつ取り扱いかつ使用されるために、硬化前に十分な時間を与えるものでなければならない。これに代わり、官能基を過剰な架橋性試薬と反応させることができ、その効果はタンパク質の官能基が架橋剤の官能基と置換することである。次いで、置換された官能基を有するタンパク質を使用して、本来の官能基を有する、又は多官能性第2化合物を伴うタンパク質を架橋することができる。
また、対象となる組成物は、例えば薬剤など生理学的に活性な製品の相対的に均一な放出を与える貯蔵部として使用することができる。該薬剤は架橋する前に適当な濃度で対象となる組成物と混合することができる。架橋されたポリマーが劣化するに伴い、該薬剤が、拡散並びに外面の浸食により放出される。該貯蔵部の形成又は成形、架橋の程度、薬剤の濃度などを制御することにより、薬剤の生理学的治療レベルを長時間に渡り維持することができる。吸収に必要となる時間は、具体的な組成物及びその用途により、短くて半日にでき、かつ4、6又は8週間を超えるようにすることもできる。
タンパク質ポリマー組成物を常法により製造することができる(例えば、引用により本明細書の記載内容として取り込まれている米国特許第5,243,038号を参照のこと。)。手短に言えば、相補的な配列によりオーバーハングを有するdsDNAが得られる場合、配列を合成して複数の繰り返し単位を含ませることができる。前記タンパク質に関する遺伝子を構築するために、一連のdsDNA分子を調製し、クローニングベクターに段階的に導入することができる。モノマーはこのようにして得ることができ、該配列に変化が無いことを確認するために配列決定を行うことができ、続いて該モノマーを多量体化し、クローニング及び発現を行う。さらに詳細を知るために、前記特許を参照されたい。
次の実施例は説明の為に提供するものであって、発明の範囲を限定するものではない。
実 験
実施例1
方法
合成DNAの構築及び大きなポリペプチド合成におけるその使用について、米国特許第5,243,038号;国際特許出願CT/US89/05016号及びPCT/US92/09485号に記載されている。その記載内容を引用により本明細書の内容とする。これらの方法の改良及び使用される付加的な方法を以下に記載する。
1.精製用フィルターとカラムの使用
A. UltrafreeR-Probindフィルターユニット(“Probind”, Millipore):DNAを含む溶液を該フィルターユニットにかけ、Sorvall MiCrospin 24Sにおいて、12,000RPMで30秒間回した。
B. MiCroCon-30フィルター(AmiCon):DNA含有溶液を該フィルターにかけて洗浄し、微量遠心管において12,000RPMで6分間回すことにより、H2Oで2回交換した。
C. Bio-Spin6カラム("Bio-Spin", BioRad):前もってTEAB(トリエチル重炭酸アンモニウム、pH7.0)で平衡にした前記カラムにかけ、次いでHB4ローターを用い、2,500RPMで4分間、Sorvall RC5B遠心機で回すことにより、該DNA溶液から塩類とグリセリンを除去した。
2.DNAのホスファターゼ処理
また、溶液(20mM Tris-HCl pH8.0, 10mM MgCl2)中の制限酵素消化物からエタノール沈殿DNAを再懸濁し、最終DNA濃度を20g/mlとすることにより、DNAのホスファターゼ処理を行った。エビアルカリホスファターゼ(SAP)をDNA 2U/gで加え、該混合物を37℃で1時間インキュベートし、65℃で20分間加熱して熱不活性化し、ついでProbindフィルター、引き続いてBio-Spinカラムを通した。
3.分離用アガロースゲル電気泳動
アガロースを連結するために、使用した緩衝液は、1x TAE(50mM Tris-アセテート,pH7.8)であった。
4.アガロースDNA連結
前記アガロースを65℃で溶かし、次いで温度を37℃にして、連結緩衝液(5x=100mM Tris-HCl, pH7.5, 50mM MgCl2, 50mM DTT, 1mM ATP)を加えた。次いで管を室温に置き、リガーゼ(1000単位T4 DNAリガーゼ(NEB))を加えた。その反応容量を通常50μlとした。該反応物を15℃で16〜18時間インキュベートした。
5.フィルターユニットを用いるアガロースDNA精製
この操作はサイズが400μlまでのアガローススライスに使用することができ、該DNAを臭化エチジウム染色により視覚化し、かつ関心が持たれる該DNAバンドを含むアガロースブロックを摘出する。次いで該アガロースを−20℃で1時間凍結し、次いで37℃で5分間かけ素早く解凍する。次いで該アガロースを完全に浸軟した。次いでこの部分をフィルターユニットの試料キャプに移し、標準的な微量遠心管で、5,000xgで20分間回した。次に該アガロースをTris-EDTA(あるいは他の緩衝液)200μlに再懸濁し、室温で30分間インキュベートして、該ゲルから付加的なDNAの溶出を行わせる。次に該混合物を、10,000RPMでさらに20分間遠心分離した。この時点で、該DNAは、前記アガロースから分離され濾液管中にあり、その後のDNA操作が容易になった。
6.人工合成ペプチドに対する抗体の調製
この操作を米国特許第5,243,038号、国際特許出願第PCT/US89/05016号及び第PCT/US92/09485号に記載されているように行った。
7.ゲル中のタンパク質の免疫ブロット
125I-タンパク質A検出法に代わる方法を使用した。この方法は、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)により活性化される化学発光シグナルに依存するものである。該化学発光試薬はAmersham及びDuPont NENのような幾つかの供給者から容易に入手できる。ウエスタンブロットを作成し、BLOTTOでブロックした。多くの方法を用いて、例えばハプテン/坑ハプテン−HRP、ビオチン標識した抗体/ストレプタビジン−HRPなどのHRPレポータ酵素、ヤギ又はマウス坑―ウサギIgG―ビオチン標識/ストレプタビジン−HRP、又はヤギ又はマウス坑ウサギIgG-HRPのような二次レポータを導入した。これらの試薬は、BioRad又はAmershamのような異なる供給源から購入することができ、時にビオチン標識抗体は、製品に添付された手順に従い、ビオチンNHS(供給者:Vector Laboratories, Burlingame, CA.(Cat.#SP-1200))を使用して我々の研究室において調製した。下記事項はタンパク質ポリマーの発現を検出するのに使用する手順の例である。
該ブロットを、BLOTTO(1:7500)で希釈したビオチン標識ヤギ坑ウサギIgG(BioRad)を含むBLOTTO溶液15ml中に入れた。次いで、該フィルターをTSA(50mM Tris-HCl pH7.4, 0.9% NaCl, 0.2%アジ化ナトリウム)を3回代えて、30分間洗浄し、次いで0.1% TWEENR 20を含むTBS中でそれぞれ5分間洗浄した。次に、該ブロットを、0.1% Tween 20を含むTBSで1:1000に希釈したTBS(100mM Tris Base, 150mM NaCl, pH7.5)HRP-ストレプタビジン(Amersham)中で、ゆっくりと回転させながら室温で20分間インキュベートした。該ブロットを、次に0.3% Tween 20を含むTBS中でそれぞれ5分間、3回洗浄し、0.1% Tween 20を含むTBS中でそれぞれ5分間、3回洗浄した。次に該ブロットを現像液#1及び#2(Amersham)の同量混合物12ml中で穏やかに攪拌しながら1分間インキュベートした。該ブロットを現像溶液から取り出し、放射能写真にした。
8.タンパク質発現分析
30℃で生育させた一夜越しの培養体を使用して、250mlフラスコのLB培地50mlに接種した。1ml当たりの最終濃度が50μgとなるようカナマイシンを加え、かつ該培養体を攪拌(200rpm)しながら30℃でインキュベートした。該培養体がOD6000.8となったときに、その40mlを42℃に温めた新しいフラスコに移し、同じ温度でほぼ2時間インキュベートした。該培養体(30°及び42°)を氷上で冷却し、OD600を測定した。細胞を遠心分離により集め、次いでOD6001.0の部分標本に分割し、適当な抗体を用いてウエスタン分析を実施した。
9.アミノ酸分析
アミノ酸誘導体をWaters 600Eシステムを用いて逆相HPLCにより分析した。、
10.ペプチド合成
また、合成ペプチドをRainin/Protein Technologies PS3 FMOCペプチド合成機で調製した。合成と切断の双方を、前記装置のマニュアルにある生産者が提供する方法を用いて達成した。
11.インビトロDNA合成
s-シアノエチルホスホルアミダイツ、制御された孔グラスカラム及び全ての合成試薬を、Applied Biosystems(Foster City, California)から入手した。合成オリゴヌクレオチドを、10倍過剰の保護ホスホルアミダイツ及び合成保持カラムに結合した0.2μモルのヌクレオチドを用いて、Applied Biosystemsモデル381A DNA合成機を使用し、亜リン酸トリエステル法により調製した。合成に用いた化学手順は合成機で用いるよう推奨されている標準プロトコルであり、既に開示されているものである(Matteuciらの論文,J. Amer. Chem. SoC., 103:3185-3319頁(1981年))。脱保護及び前記固形支持体からのオリゴマーの脱離をApplied Biosystemsにより提供された標準手順に従い実施した。Applied Biosystemsが推奨する除去された保護基の光学濃度による測定では、当該合成の平均反応収率は97.5%よりも高かった。
粗オリゴヌクレオチド混合物を、Applied Biosystemsプロトコルに記載されている分離用ゲル電気泳動法により精製した(Applied Biosystems protocols in Evaluating and Isolating Synthetic Oligonucleotides, 1992年(従前:User Bulletin 13, 1987年))。該アクリルアミドゲル濃度は、オリゴマーの長さによって、10%から20%まで変動する。もし必要ならば、該精製オリゴマーをUVシャドーイングによって同定し、該ゲルから取り出し、かつ破砕−浸漬法により抽出した(Smithの論文,Methods in Enzymology, 65:371-379頁(1980年))。
100塩基よりも長いオリゴヌクレオチドのDNA合成を行うために、該合成サイクルを381A DNA合成機のためにApplied Biosystemsにより推奨されている前記プロトコルから変更した。全使用試薬を新鮮なものにした。全ての試薬は、アセトニトリル(Burdick and Jackson Cat #017-4,水分含有量0.001%未満)及び2000オングストローム孔サイズカラム(Glen Research)を除き、Applied Biosystemsから供給されたものを用いた。該オリゴの長さのために、合成の過程で一時的な中断期間を入れて、合成中に空になった試薬ビンを交換しなければならなかった。この一時的な中断を該サイクルに入る工程で行い、かつ該中断を出来る限り短くした。各合成サイクルの開始期間を通して、TCAによる脱トリチル化後の洗浄を、約2〜3回から推奨される回数に増加させた。また、キャップ形成に割り当てる時間を増やし、切断された失敗作の配列を限定した。該合成を行った後、脱保護を55℃で6時間行った。脱塩を行った後、該合成DNAをPCRを用いて増幅した。
12. DNAの配列決定
データの保存及び分析に、DNA Striderから得たソフトウェア、アップルマッキントシュ用DNA Inspection IIe又はDNAidを用いた。
13.二本鎖のプラスミドDNAのジデオキシDNA配列決定
米国特許第5,243,038号に記載されている方法で、小規模にプラスミドDNAを調製した。DNA合成機を用いてプライマーを合成し、M13配列決定用に記載されている手順に従い、プラスミドDNAにアニールした。該配列決定反応をシークエナーゼ(United States Biochemicals)を用いて行い、その時の条件を供給者が推奨するように設定した。全ての配列決定をポリアクリルアミドゲル上で行った。
14.PCR増幅
薄壁遺伝子増幅反応管で、容量100μlで行った。各プライマーDNA約1μMを、1xPCR緩衝液(10倍溶液としてPerkin Elmerが供給)、各dNT200μM、AmpliTaq 5U及び数種の濃度の標的DNAに加えた。増幅を、95℃,62℃及び72℃の各温度で12分間行うサイクルを、Perkin E1mer DNA熱サイクラーモデル480により30サイクル実施することで行った。異なる反応から得られた部分標本を、0.5x TA緩衝液中の1.5%低融点アガロースを用いるアガロースゲル電気泳動により分析した。所望のバンドを提供する該反応混合物をプールし、ProbindフィルターにかけてAmpliTaq酵素を除去し、次いでMiCroCon-30フィルター及びBio-Spinカラムにかけた。次に真空中で該DNAを濃縮した。
15.ジアミン合成
2-アミノエチルグリシネート:
濃縮された硫酸(9.90g,0.101モル)を水10mLに希釈した。グリシン(7.50g,0.100モル),2-アミノエタノール(6.10g,0.100モル)及び希釈硫酸を、250mL,3-首丸底フラスコに入れた。該フラスコは、ストッパー、機械的スターラー、加熱マントル及びデーン−スターク水補足器を備えたものであった。該装置の内容物を窒素ブランケットを用いて環境中の湿気から保護した。トルエン(100mL)を加え、さらに水の放出がなくなるまで、装置の内容物を還流した。該装置を解体し、該フラスコを吸引ラインに繋いで反応物に捕らえられているトルエンを取り除く前に、該トルエンを注ぎ移した。該生成物をさらに精製することなく使用した。該反応生成物のFTIRスペクトラムは1736cm-1及び1672Cm-1で強いカルボニル吸収を示す。該反応生成物は、エチルグリシネート塩酸塩及びグリシル塩酸塩のスペクトルとの比較により、2-アミノエチルグリシネート及びN,O-ジグリシルエタノールアミンのほぼ4:1の混合物であると評価された。
コリニルリシネート:
濃硫酸(11.40g,0.120モル)を水(10mL)で希釈した。シリンモノヒドロクロライド(13.69g,0.075モル),塩酸コリン(10.47g,0.075モル)及び希釈した硫酸を、マグネットスターラー棒を入れた250mL 1-首丸底フラスコに入れ、温度調節された油浴で加熱し、かつ吸引ラインに繋いだ。液体窒素で冷却したトラップに揮発性物質を除去するために、該フラスコに対し吸引を徐々に行い、次いで加熱を徐々に強めた。前記浴の温度が110℃になり、かつ圧力が0.024mm-Hgに低下した時に、該反応を停止させた。該生成物は、薄層クロマトグラフィー(セルロース、酢酸/アセトニトリル/水5:65:30 v/v/v,ニンヒドリン噴霧で発色,Rf=0.25)によると均質である。該生成物を直接使用した。
1,3-プロパンジイル ジグリシネート:
濃硫酸(10.78g, 0.110モル)を水10mLに希釈した。1,3-プロパンジオール(7.61g,0.100モル),グリシン(15.0g,0.200モル)及び希釈した硫酸を250mL,3-首丸底フラスコに入れた。該フラスコは、ストッパー、機械式スターラー、熱調整油浴及びデーン−スターク水補足器を備えたものであった。該装置の内容物を窒素ブランケットを用いて環境中の湿気から保護した。トルエン(100mL)を加え、130℃に熱調節した油浴により、さらに水の放出がなくなるまで(約9時間)、装置の内容物を還流した。該装置を解体し、該トルエンを注ぎ移した。該生成物の固まりを、室温で攪拌することにより水(29mL)に溶かした。−20℃で18時間冷却することにより、該溶液で細かく白い結晶が沈殿し、これを濾過により除去した。口液を前もって3℃に冷却したメタノール(250mL)に注ぎ、半固体状ペーストを沈殿させた。上澄みを注ぎ移し、該ペーストを、幾つかに分け、メタノール(50ml)とともに乳鉢及び乳棒で摩砕した。固形サンプル(9.19g)をメタノール(18.4mL)と水(7.9mL)で煮沸し、白色加熱物を濾過し、4℃で18時間結晶化した。該沈殿物を濾過して白色冷却物を取り、障壁の下で漏斗に詰め、メタノール、アセトンですすぎ、空気乾燥を行うことにより、白色結晶固形物を得た(6.89g)。この物質をpHメータを用い、KOH水溶液で滴定した。アミン当たりの見かけ当量は201g/モルであり、また、601g/モルの見かけ当量の混合物が存在した。該FTIRは1744cm-1で単一のカルボニル吸収を示す。
16.発酵条件
タンパク質組成物の発現を行うために使用された発酵は、通常15 L MER, 10 L作業容量、又は13 L Braun Biostat E, 8.5 L作業容量とした。発酵槽及びそのサイズの選択は重要ではない。E. Coliの生育に用いるすべての培地を使用することができる。窒素源はNZAmineから無機塩まで、炭素源は一般的にグリセリン又はグルコースとした。全発酵を前記プラスミドにより課される適当な選択条件を用いて行った(例えば、カナマイシン、アンピシリンなど)。E. Coliでのタンパク質ポリマー発現に用いる発酵法は供給バッチ法とした。これは、他の方法が使用できる場合でも、組換え微生物の発酵に好ましい方法である。
微生物が対数期から静止期に移行する際に、供給バッチ法を細胞生育の場に利用する。この移行は、しばしば、必須栄養素の枯渇又は代謝副産物の蓄積の結果である。この移行が栄養素枯渇の結果である場合、系への栄養素の添加により継続して細胞の分裂が起きる。発酵プロセスの間に実際の容量が増加を伴っても、1種以上の必須栄養素を、作業中に発酵容器に増加するように加えることができる。この結果、生物量と発現レベルを最適化できる場合、制御した生育速度が得られる。培養中の細胞数が最大値に到達し、又は近づきつつある場合、タンパク質ポリマー産生が、使用する発現系に依存して、適当な物理的又は化学的シグナルを提供することにより起きる。次に、蓄積される生成物が最大レベルになるまで、手順を継続する(FiestChko, J.,及びRitch, T.の論文,Chem. Eng. Commun. 1986年,45:229-240頁;Seo, J. H.; Bailey, J.E.の論文,Biotechnol. Bioeng. 1986年,28:1590-1594頁)。
実施例2
SELP8K,SELP8E及びCLP6コポリマーの構築
これらのポリマーは、デザインされたSELP8K及びSELP8E、架橋用官能基を有することを特徴とするものである。これらのポリマーの構築を、先の遺伝子モノマーSELP0(参照:米国特許第5,243,038号pSY1298)から始めて、以下に記載する。
SELP8構築
プラスミドpSY1378(参照:米国特許第5,243,038号)をBanI RENで消化し、アガロースゲル電気泳動を用いて精製し、次いで該DNAを2.5M酢酸アンモニウム中でエタノール沈殿させ、かつ従前にFokI RENで消化したpPT0134(参照:国際特許出願PCT/US92/09485号)と連結し、フェノール/クロロフォルム抽出を行い、かつエタノール沈殿を行なった。
連結混合の生成物をE. Coli菌株HB101に移行した。形質転換体からプラスミドDNAを精製し、NruI及びXmnI RENsを使用して消化することにより分析した。所望の制限パターンを有するプラスミドpPT0255を得て、続く構築に使用した。
プラスミドDNA pPT0255を、Cfr10I RENで、続いてRNA分解酵素で処理した。該消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し、該DNAを切除し、自己連結させた。連結混合物の生成物をinto E. Coli菌株HB101に移行した。形質転換体からプラスミドDNAを精製し、NaeI及びStuI RENsを使用して消化することにより分析した。所望の欠失を有するプラスミドpPT0267を続く構築のために使用した。
表1に示されている2種のオリゴヌクレオチド鎖を、実施例1に記載されているように合成し、かつ精製した。
該2種のオリゴヌクレオチド鎖をアニールし、BanII及びScaI RENsで先に消化したプラスミドpPT0267を連結し、アガロースゲル電気泳動により、続いて、NACSカラムで精製した。
この連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。この形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、かつDraIで消化した。正確な消化パターンを与える2種のクローンから得たプラスミドDNAの配列決定を行なった。一のプラスミドDNA(消化されたpPT0287)は、さらに構築を行なうために適切で選択すべきものと認められた。
プラスミドDNA pSY1298(参照:米国特許第5,243,038号)をBanII RENで消化し、かつSELP0遺伝子フラグメントをアガロースゲル電気泳動、続いてNACSで精製し、続いてBanIIで消化したpPT0287に連結した。次いで、該酵素をフェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により除去した。
この連結混合の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。この形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、かつDraI RENで消化した。正確な消化パターンを示す該クローンから得たプラスミドDNAをさらにBanII,AhaII及びStuI RENで消化した。所望のSELP8モノマーを含むプラスミドpPT0289の塩基配列決定を行なった(参照:表2)。
SELP8K及びSELP8E遺伝子モノマーの構築
SELP8遺伝子モノマーの一部をコードするオリゴヌクレオチド鎖を、第90位の一塩基多形性を用いて合成した。この位置にあるアデニン及びグアニジン双方の使用で、アミノ酸リジン及びグルタミン酸をコードする単一合成からオリゴヌクレオチドを産生する。該合成をApplied Biosystems DNA合成機モデル381A及びGlen Researchから提供された2000オングストローム合成カラムを用いて行なった。合成を行なう間、ビン交換のために要求される一次中断を最小限にした。合成を行なった後、該202塩基DNAフラグメントを脱保護し、かつ30%水酸化アンモニウム中において、55℃で6時間処理することにより、カラム支持体から切り取った。
2種の付加DNA鎖をPCR増幅用プライマーとして使用した。
該2種の鎖は次の通りである:
実施例1に記載されたように、該PCR反応を行いかつ該反応物を精製した。
該DNAを再懸濁し、実施例1に記載したようにBanII RENで消化した。次いで消化したDNAを低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、従前にBanII RENにより消化したpPT0289で連結し、NACSカラムで精製した。該連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。単離された形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、ApaLI及びEcoNI RENsを用いて消化することにより分析した。正しい制限パターンを示すクローンから得たプラスミドDNAを、Asp700 RENで消化してさらに分析し、多形性位置でリジン又はグルタミン酸をコードするクローンを識別した。各多形性を有するクローンから得たプラスミドDNAを精製し、かつDNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0340は所望のSELP8Kモノマーを含んでおり(参照:表4)、pPT0350は所望のSELP8Eモノマー配列を含んでいた。
SELP8Kポリマー構築
pPT0340から得たプラスミドDNAをBanI RENで消化し、該消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP8K遺伝子フラグメント(192bp)を切り出し、NACSカラムで精製した。精製したフラグメントをBanI RENで消化したプラスミドpPT0317と連結し、Millipore Probind及びBio-Spin6カラムを通した。次いで該DNAを、実施例1に記載されているように、エビアルカリホスファターゼ(SAP)で処理した。
この連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。この形質転換体をカナマイシン抵抗性で選択した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、SELP8Kモノマー多重DNA挿入に起因するサイズの増加を分析した。200bpからほぼ7kbの範囲の挿入サイズを有する幾つかのクローンが得られた。繰り返し単位6〜32を有するクローンを、SELP8Kタンパク質ポリマーの発現に使用した(pPT0341,pPT0343,pPT0344,pPT0345及びpPT0347)。
SELP8K発現分析
30℃で生育させた一夜培養体を使用して、250mlフラスコ中のLB培地50mlに接種した。カナマイシンを最終濃度50μg/mlとなるように加え、該培養体を30℃で攪拌しながら(200rpm)インキュベートした。培養体がOD6000.8となった時に、40mlを42℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約2時間インキュベートした。該培養体(30°及び42°)を氷上で冷却し、OD600で測定した。細胞を遠心分離で集め、OD6001の部分標本を分離し、かつ坑SLP抗体を用いてウエスタン分析を行なった。
プラスミドpPT0341,pPT0343,pPT0344,pPT0345及びpPT0347を有するE.Coli菌株HB101を前記のように生育させた。これらの細胞により産生されたタンパク質を、SLP抗体に反応性があるタンパク質の検出を行なうためにウエスタンブロットにより分析を行なった。各クローンは強い反応バンドを産生した。該生成物の見かけ分子量はほぼ35kDから250kDを超える範囲であった。菌株pPT0345は、見かけ分子量80,000のSLP抗体反応性バンドを生成した。プラスミドpPT0345によりコードされるSELP8Kポリマーの予測されるアミノ酸配列を以下に示す。
SELP8K精製
SELP8Kを、E.Coli菌株pPT0345において発酵することにより製造した。該生成物を、細胞溶解、遠心分離による不溶性細片の除去、及びアフィニティークロマトグラフィーにより細胞バイオマスから精製した。該精製された生成物をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、シルク様ペプチドブロックに反応するポリクローナル坑血清(SLP抗体)を用いる免疫活性、及びアミノ酸分析により分析した。見かけ分子量80,000のタンパク質バンドが、SDS-PAGEの分離され、移行された試料のアミドブラック染色により観察され、同じバンドはウエスタンブロット上でSLP抗体と反応した。予測されたように、アミノ酸分析により表5参照)、該生成物が、前記アミノ酸;グリシン(43.7%),アラニン(12.3%),セリン(5.3%),プロリン(11.7%)及びバリン(21.2%)に富むものであった。また、該生成物はリジンを1.5%含んでいた。下記のアミノ酸組成表は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
CLP6調製
菌株pPT0246(CLP6,以下DCP6という。)を用い国際特許出願PCT/US92/09485号に記載されているようにしてCLP6を製造した。該タンパク質ポリマーを、標準的なタンパク質精製法、抽出及び分離法を用い多重グラム量で精製した。凍結乾燥された生成物は白色海綿状物質で、水に極めて良く溶けた。
実施例3.ポリマーの構築
ポリマーデザインエレメント
SELP8Kのコポリマー構造は、シルク様ブロック(SLPブロック)及びエラスチン様ブロック(ELPブロック)を下記配列[(SLPブロック)4(ELPブロック)8]のように含んでいる。その接着剤特性を維持しつつ、追加のポリマーを、シルク様とエラスチン様ブロックの長さを調節することにより、異なる再吸収及び溶解特性を有するようにデザインすることができる。SELP0Kは、エラスチン様セグメントの分散頻度を維持しつつ、SELP8Kより半分の長さの結晶性シルク様ブロックを含んでいる。
また、コラゲナーゼ(92kd)及びカテプシンによるタンパク質分解性切断を介してインビボ再吸収を促進する介在性配列を有するポリマーをデザインした。SELP0Kをこのデザインのバックボーンとして使用したが、これらの部位は多くの異なるポリマーバックボーン配列に使用できるものである。挿入位置を選択し、該プロテアーゼの触媒溝に対し該部位の接近を可能にする。ほとんどのプロテアーゼが切断部位から4個の上流アミノ酸まで結合することができる。したがって、該挿入配列は水素結合及び、例えばシルク様ブロックにあるような結晶性がない。
該SELP0Kのβ構造は、最初のエラスチン様ブロックのプロリンの後で壊れる。SELP0K-CS1は、6のアミノ酸挿入内のコラゲナーゼ(PLGP)(配列番号:17)について2個の近接切断部位を有する。該挿入部位を選択して、少なくとも1プロリンアミノ酸(GAGAGS GVGVP L G P L G P GVGVP)(配列番号:18)によりシルク様ブロックから除去した。8アミノ酸挿入内にカテプシンB(ARR),L(FF),S及びH(FVR)及びプラスミン(R)に関する多重切断部位を有する。該挿入部位を選択して、少なくとも1のプロリンアミノ酸(GAGAGS GVGVP G F F V R A R R GVGVP)(配列番号:19)によりシルク様ブロックから除去した。
プラスミドpPT0317の構築
プラスミドDNA pSY1262(参照:米国特許第5,243,038号)をPvuII RENを用いて直線化し、次いで、Probindフィルター及びBio-Spin6カラムを通した。次いで該DNAをエビアルカリホスファターゼ(SAP)で処理した。次に、前記直線化pSY1262 DNAを下記に記載したように調製したpQE-17(QIAGENカタログ#33173)から得たDNAフラグメントと連結した。プラスミドDNA pQE-17をBglII及びHindIII RENsで消化し、表6に示した36bpフラグメントをProbindフィルター及びBiospinカラムを用いて精製した。該DNAをMicrocon-30フィルターを用いてさらに精製し、該36bpフラグメントを含むロ液を保持した。次に該DNAをDNAポリメラーゼを用いて処理し、Probindフィルター及びBiospinカラムを用いて精製した(実施例1参照)。
連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。この形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、Bst11071及びEcoRV RENsを用いて消化することにより分析した。所望のDNAフラグメントを含むクローンをさらにBst11071及びBstYI RENsで消化し、挿入物の配向を調べた。正しい制限パターンを示すクローンから得られたプラスミドDNAを精製し、DNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0317は所望のDNA分析物を含み、さらにDNA構築に使用することができた。
SELP0Kポリマー構築
Applied Biosystems DNA合成機モデル381A及びGlen Researchから提供される2000オングストローム合成カラムを用いて、表7に示すオリゴヌクレオチド鎖を、合成した。合成を行なった後、該93塩基DNAフラグメントを脱保護し、水酸化アンモニウム中で、55℃で6時間処理してカラム支持体から切り離した。
該PCR反応を、SELP8K遺伝子モノマーの構築に関し記載したように、同じ2種のDNAプライマー鎖を用いて行い、該反応生成物を精製した。該DNAを再懸濁し、BanI RENで消化した。次に消化されたDNAを低融点アガロースゲルで分離し、従前にBanI RENで消化したpPT0285(参照:国際特許出願CT/US92/09485号)と連結した。該連結反応物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、EcoRI及びBanII RENsを用いて消化することにより分析した。正しい制限パターンを示すクローンから得たプラスミドDNAを、次に精製し、DNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0358は所望の配列を有し、続くDNA構築に使用することができた。
pPT0340から得たプラスミドDNAをBanII RENで消化し、消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP0K遺伝子フラグメント(156bp,(参照:表8))を切り出し、Ultrafree-MCフィルター、続いてBio-Spin6カラムを用いて精製した。
該精製フラグメントをBanII RENで消化しておいたプラスミドpPT0358と連結し、ProbindフィルターとMicrocon-30フィルターを通した。該消化フラグメントを次いでアガロースゲル電気泳動で分離した。該プラスミドDNAを切り出し、Ultrafree-MCフィルターと、続いてBio-Spin6カラムを通した(実施例1参照)。
該連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体をクロラムフェニコールに対する耐性で選択した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、SELP0K多重DNA挿入に起因するサイズの増加に関し分析した。数種のクローンを異なるサイズの挿入物により得た。それぞれSELP0K遺伝子モノマー繰り返しを18、2及び6個有するプラスミドpPT0359,pPT0360及びpPT0374を続く構築に使用した。
pPT0359及びpPT0374から得たプラスミドDNAをBanI RENで消化し、該消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP0K遺伝子フラグメント(約2800bp及び1000bp)を切り出し、NACSカラムで精製した。次に精製したフラグメントをBanI RENで消化してあったプラスミドpPT0317と連結し、次にProbindフィルター及びBio-Spin6カラムを通した。該DNAを、次いでエビアルカリホスファターゼ(SAP)で処理し、Probindフィルター及びBio-Spin6カラムを通した(実施例1参照)。
これらの連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体をカナマイシン耐性により選択した。ここの形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、SELP0K多重DNA挿入に起因するサイズの増加に関し分析した。数種のクローンを得た。プラスミドpPT0364及びpPT0375を、SELP0Kの発現に使用するため選択した。
SELP0K発現分析
プラスミドpPT0364及びpPT0375を含むE.Coli菌株HB101を実施例1に記載されているように生育させた。これらの細胞から産生されたタンパク質を、ELP抗体に対する反応性を検出するSDS-PAGEして分析した。すべての分析において、強力な反応性バンドが、それぞれ約95kD及び35kDの見かけ分子量について見られた。
SELP0K-CS1ポリマー構築
プラスミドpPT0360をBanI RENで消化し、消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP0K遺伝子フラグメント(約300bp)を切り出し、Ultrafree-MCフィルター、続いてBio-Spin6カラムを使用して精製した。該精製したフラグメントを、FokI RENで消化したプラスミドpPT0134(国際特許出願PCT/US92/09485号)と連結した。該酵素を65℃、20分間加熱して不活性化し、該連結混合物を次いでProbindフィルターに通した。次に該DNAをエビアルカリホスファターゼで処理し、Probindフィルター、次いでBio-Spin6カラムに通した。
この連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体をクロラムフェニコールに対する耐性で選択した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、DraI RENを使用し消化により分析した。プラスミド、pPT0363は正しい制限パターンを示し、続くDNA構築に使用した。
Applied Biosystems DNA合成機モデル381A及びGlen Researchから提供される2000オングストローム合成カラムを用いて、表9に示すオリゴヌクレオチド鎖を合成した。合成を行なった後、該141塩基DNAフラグメントを脱保護し、水酸化アンモニウム中で、55℃で6時間処理してカラム支持体から切り離した。
該PCR反応を、SELP8K遺伝子モノマーの構築に関し記載したように、同じ2種のDNAプライマー鎖を用いて行い、該反応生成物を精製した。該DNAを再懸濁し、BsrFI及びEcoNI RENsで消化した。該消化されたDNAをProbind及びMicrocon-30、Bio-Spin6カラムで処理し、次いで従前にBsrFI RENで消化したpPT0363と連結し、Probindフィルター及びBio-Spin6カラムで処理し、次いでさらにEcoNI RENで消化した。該消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。その大きなDNAバンド(約2000bp)を切り出し、Ultrafree-MCフィルター、続いてBio-Spin6カラムを使用して精製した(実施例1参照)。
この連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、Asp700I及びEcoO109I RENsを使用し消化により分析した。正しい制限パターンを示すクローンから得たプラスミドDNAを、次いで精製し、かつDNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0368(表10参照)は、所望の配列を含み、続くDNA構築に用いた。
プラスミドDNA pPT0368をBanII RENで消化し、該消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP0K-CS1遺伝子フラグメント(174bp)を切り出し、Ultrafree-MCフィルター、続いてBio-Spin6カラムを用いて精製した。精製したフラグメントをBanII RENで消化してあつたプラスミドpPT0358と連結し、次にProbindフィルター及びMicrocon-30カラムを通した。続いて消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離した。次いでプラスミドDNAを切り出し、Ultrafree-MCフィルター、続いてBio-Spin6カラムを用いて精製した(実施例1参照)。
この連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体をクロラムフェニコール耐性で選択した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、SELP0K-CS1多重DNA挿入に起因するサイズの増大について分析した。1000bp〜約3000bpの範囲の挿入サイズを有する数種のクローンを得た。SELP0K-CS1遺伝子モノマーの繰り返し16個を有するプラスミドpPT0369を続く構築に使用した。
pPT0369のプラスミドDNAをBanI RENで消化し、次いでProbindフィルターを通し、消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP0K-CS1遺伝子フラグメント(約2800bp)を切り出し、Ultrafree-MCフィルターで精製し、Bio-Spin6カラムを用いて脱塩した。該精製フラグメントを次いでBanI RENで消化されているプラスミドpPT0317と連結し、次いでProbindフィルター及びBio-Spin6カラムを通した。該DNAを、次にエビアルカリホスファターゼ(SAP)で処理し、Probindフィルター及び次いでBio-Spin6カラムに通した(実施例1参照)。
この連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体をカナマイシン耐性により選択した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、SELP0K-CS1多重DNA挿入によるサイズ増大に関し分析を行なった。数種のクローンを得た。プラスミドpPT0370選択しSELP0K-CS1の発現に使用した。
SELP0K-CS1発現分析
プラスミドpPT0370を含むE.Coli菌株HB101を実施例1記載したように生育させた。これらの細胞で産生されたタンパク質をELP抗体に対する反応性の検出に用いるSDS-PAGEにより分析した。すべての分析において、約90kDの見かけ分子量に強い反応性バンドが観察された。
SELP0K-CS2ポリマー構築
Applied Biosystems DNA合成機モデル381A及びGlen Researchから提供される2000オングストローム合成カラムを用いて、表11示すオリゴヌクレオチド鎖を合成した。合成を行なった後、該147塩基DNAフラグメントを脱保護し、水酸化アンモニウム中で、55℃で6時間処理してカラム支持体から切り離した。
PCR反応をSELP8K遺伝子モノマーの構築で記載したように、同じ2種のプライマー鎖を使用して実施し、反応生成物を精製した。次に該DNAを再懸濁し、BsrFI及びEcoNI RENsを用いて消化した。該消化されたDNAをProbindフィルター及びMicrocon-30で処理し、従前にBsrFI RENで消化されたpPT0363と連結し、Probindフィルター及びBio-Spin6カラムで処理し、次いでEcoNI RENで消化した。該消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。この大きなDNAバンド(約2000bp)を切り出し、Ultrafree-MCフィルター、次いでBio-Spin6カラムを用いて精製した。
該連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、Asp700I及びDraIII RENsを用いて消化することにより分解した。次に、正しい制限パターンを示すクローンから得たプラスミドDNAを精製し、DNA配列決定により分析した。プラスミドpPT0367(表12参照)所望の配列を含み、続くDNA構築に使用した。
プラスミドpPT0367をBanII RENで消化し、Probindフィルター及びBio-Spin6カラムで処理し、次いで消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP0K-CS2遺伝子フラグメント(180bp)を切り出し、Ultrafree-MCフィルター、続いてBio-Spin6カラムを用いて精製した。該精製したフラグメントを、従前にBanII RENで消化してあったプラスミドpPT0358と連結し、次いでProbindフィルター及びMicrocon-30フィルターに通した。引き続き、該消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。次に、該プラスミドDNAを切り出し、Ultrafree-MCフィルター、次いでBio-Spin6カラムで精製した(実施例1参照)。
連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体をクロラムフェニコール耐性で選択した。個々の形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、SELP0K-CS2多重DNA挿入に起因するサイズの増大に関し分析した。200bp〜約3000bpの範囲の挿入サイズを有する、数種のクローンを得た。SELP0K-CS2遺伝子モノマーの繰り返しをそれぞれ18及び15有するプラスミドpPT0371及びpPT0372を続く構築に使用した。
pPT0372から得たプラスミドDNAをBanI RENで消化し、次いでProbindフィルターを通し、次いで消化フラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離した。SELP0K-CS2遺伝子フラグメント(2800bp)を切り出し、Ultrafree-MCフィルターで精製し、かつBio-Spin6カラムで脱塩した。次に、該精製されたフラグメントをBanI RENで消化されているプラスミドpPT0317と連結し、Probindフィルター及びBio-Spin6カラムを通した。該DNAをエビアルカリホスファターゼ(SAP)で処理し、Probindフィルター、次にBio-Spin6カラムを通した(実施例1参照)。
これら連結反応の生成物をE.Coli菌株HB101に移行した。形質転換体をカナマイシン耐性で選択した。ここの形質転換体から得たプラスミドDNAを精製し、SELP0K-CS2多重DNA挿入に起因するサイズの増大に関し分析した。プラスミドpPT0373を選択し、SELP0K-CS2の発現に使用した。
SELP0K-CS2発現分析
プラスミドpPT0373を含むE.ColiHB101を実施例1に記載したように生育させた。これらの細胞により産生される生成物をELP抗体に対する反応性を検出するSDS-PAGEにより分析した。全ての分析において、約90kDの見かけ分子量において強い反応性バンドが観察された。
SELP0K及びSELP0K-CS1の精製
SELP0K及びSELP0K-CS1を、それぞれE.Coli菌株pPT0364及びpPT0370で製造した。該生成物を、細胞溶解、ポリエチレンイミン沈殿及び遠心分離による不溶性細片の除去、硫酸アンモニウム沈殿、及び陰イオン交換クロマトグラフィーにより細胞バイオマスから精製した。該精製された生成物をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)、エラスチン様ペプチドブロックに反応するポリクローナル坑血清(ELP抗体)を用いる免疫活性、及びアミノ酸分析により分析した。
SELP0Kni関し、見かけ分子量95,000のタンパク質バンドが、SDS-PAGEで分離され、移行された試料のアミドブラック染色により観察され、同じバンドはウエスタンブロット上でELP抗体と反応した。予測されたように、アミノ酸分析により(表13参照)該生成物が、前記アミノ酸;グリシン(41.0%),アラニン(8.0%),セリン(4.5%),プロリン(14.1%)及びバリン(26.8%)に富むものであった。また、該生成物はリジンを1.9%含んでいた。下記のアミノ酸組成表は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
SELP0K-CS1関し、見かけ分子量90,000のタンパク質バンドが、SDS-PAGEで分離され、移行された試料のアミドブラック染色により観察され、同じバンドはウエスタンブロット上でELP抗体と反応した。予測されたように、アミノ酸分析により(表14参照)、該生成物が、前記アミノ酸;グリシン(40.0%),アラニン(7.6%),セリン(5.2%),プロリン(16.3%)及びバリン(23.3%)に富むものであった。また、該生成物はリジンを1.5%含んでいた。下記のアミノ酸組成表は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
実施例4.CLP6及びSELP8K特性の評価
試験手順
Tiseel接着剤系 ラットの皮膚を水で洗浄し、拭き取り乾燥し、かつ約1cm×4cmの小片に切除した。TiseelキットVH(Osterreiches Institute Fur Haemoderivate, GmbH, A-1220, Vienna, Austria)から得た接着剤を、生産者の説明書に従って適用した。
ラットの皮膚の重なり剪断力強度アッセイ
接着剤配合物を、インビトロでラットの皮膚の重なり剪断力強度アッセイを用い、皮膚を相互に結合する能力に関し試験した。接着剤を集めたラットの皮膚小片の内面側に適用した。第2の皮膚小片を、結合表面をほぼ1cm2形成するように重ねた。100g重さを重なり結合部にかけ、通常、室温で2時間、接着剤を硬化させ、乾燥を防ぐためにプラスチックで包んだ。該重なり結合部をInstron張力テスター、又は同種の装置に取り付け、張力を掛けた。該Instronを用い、張力を定常引張り速度5.08cm(2インチ)/分で一般的に加えた。破損負荷を記録し、重複部分の測定領域を標準化した。
グルタルアルデヒドを用いた接着剤
ラットの皮膚を水で洗浄し、拭き取り乾燥し、かつ約1cm×4cmの小片に切除した。グルタルアルデヒドを希釈し、貯蔵し、凍結し、かつ使用直前に解凍した。牛血清アルブミンを、Goldmanの明細書(Goldmanの国際特許出願第WO94/01508号)に従って溶かした。CLP6を150mM HEPES + 30mM NaCl溶液中に600mg/mLとなるように溶解し、pHを7.5に調整した。SELP8Kを150mM HEPES + 45mM NaCl溶液中に表15に示す濃度で溶かした。グルタルアルデヒド溶液を加える前に、タンパク質の溶液の表示された一部試料を双方の皮膚に広げた。第2の皮膚を貼り、下の皮膚に擦り付けて成分を分配し、重複領域を約1cm2に調節した。プラスチックラップで覆って乾燥を防ぎ、圧縮力100g/cm2の下で25℃で2時間硬化させた。
1,6-(ジイソシアナート)ヘキサンを含む接着剤系
ラットの皮膚を水で洗浄し、拭き取り乾燥し、かつ約1cm×4cmの小片に切除した。SELP8Kの溶液を約50% w/wの濃度で特定の緩衝液で調製した。ヘキサメチレンジイソシアナート(HMDI)とPluronic L-61界面活性剤の1:1 v/v混合物を調製した。SELP8K溶液の20μl量を一方の皮膚に適用し、続いて希釈したHMDIを2μl適用した。第2の皮膚を貼り、下の皮膚に擦り付けて成分を混合し、重複領域を約1cm2に調節し、プラスチックラップで覆って乾燥を防ぎ、圧縮力100g/cm2の下で25℃で2時間硬化させた。
結果
続く接着剤の実験のベースラインを提供するために、エチルシアノアクリレート及びTiseelフィブリン接着剤を評価した。これらの結果を下記の表に示した。
記載された全てのデータは少なくとも3個の試験標本に基づくものである。対象となる組成物を、Goldmanにより開示された(国際特許出願WO94/01508号)、タンパク質接着剤系と比較した。前記濃度のグルタルアルデヒド溶液10μlを全ての場合に加えた。次の表はその結果を示すものである。
前記表のデータは、対象のポリマー類が、コラーゲン及びオボアルブミンと共通の条件下のグルタルアルデヒド硬化系において使用された場合に、より優れた接着能を提供することができることを示している。SELP8Kポリマーは、架橋に利用できるアミノ基の数が少ないにもかかわらず、ラット皮膚の重なり剪断に関する結果において、最も強力な引張り強度を提供している。前述の結果は、100μg/cm2に減少した低用量のグルタルアルデヒドであっても、著しい接着が得られることを明らかにしている。グルタルアルデヒドの品質及び純度が、良好な架橋を得るために重要であることが判っている(Rujigrok、DeWijn、Boonの論文、J. Matr. Sci. Matr. Med.、5:80-87頁(1994年);Whipple、Rutaの論文、J. Org. Chem.、39:1666-1668頁(1974年))。これらの実験において使用したグルタルアルデヒドは、蒸留し、希釈して2.5Nとし、かつ使用時まで-20℃で貯蔵した。
次の試験においては、ヘキサメチレンジイソシアネートを用いた。この硬化は、別の方法ではあまりにも迅速であるので、良好な接着を得るためには、等量の希釈剤を添加することが必要であることが判った。この結果を下記の表に示すが、ここにおいては、n=12であった。
実施例5:SELP0K(SE0K)及びSELP0K-CS1の特性の評価
この配合物用の様々な成分を用い、かつ重なり剪断引張り強度を測定するために、多くの配合物を調製した。更に、様々なプロトコルを用いて、接着をもたらすタンパク質ドープを調製した。これらのプロトコルは、以下の通りである:
タンパク質ドープの調製
前述の1:2の指定は、SE0K由来のアミノ基に対するリジン由来のアミノ基の呼称比を意味する。指定1:1は、SE0Kとリジンに由来するアミノ基に対する炭酸イオンの呼称比を意味する。指定13.1:1は、SE0Kとリジンに由来するアミノ基に対するイソシアナート基の呼称比を意味する。
緩衝液原液は、脱イオン水7.526mlに、リジン塩酸塩0.0157g、炭酸カリウム0.0710g、及びエバンスブルー色素0.00371gを溶解して調製した。緩衝液原液620.6μlを、エッペンドルフチューブ中のSE0K 127.1mgに添加した。この混合物を、ボルテックスミキサーで、完全に溶解するまで攪拌した。この溶液を約5000rpmで30〜60秒遠心分離し、気泡を分離した。次にこの溶液を、被験皮膚上に投与するために、1mlのシリンジに投入した。このタンパク質ドープ中に任意に含まれた色素は、被験皮膚上の該ドープの分布を、より容易に可視化するためのものである。
HMDI硬化剤の調製
HMDI硬化剤は、スダンレッド色素1.75mgを、ストレートの1,6-ジイソシアナトヘキサン1.00gに溶解し調製した。この硬化剤中に任意に含まれた色素は、被験皮膚上の該硬化剤の分布を、より容易に可視化するためのものである。
ラット皮膚の調製
新たに摘出したラットの皮は、-20℃で凍結保存した。これらの皮を使用直前に解凍し、かつ1cm×3cmの細片に切った。この皮膚細片から、カミソリ刃で、筋膜を全て除去した。幅及び厚さが均一である皮膚細片を、選択した。調製したラットの皮膚試料を、一時的に、PBSに浸したガーゼパッドの間に挟み、乾燥を防ぐためにプラスチックバッグに入れて、37℃で保存した。
接着剤の塗布
37℃の暖かい室内で、2ラット皮膚細片に、各々、タンパク質ドープ15μl、合計30μlを塗布し、かつステンレス製スパーテルで、各皮膚片の約1cm2の領域に積極的に作用させた。前述の皮膚に、HMDI硬化剤合計1.8μlを塗布し、HMDI細片の3本を平行に第一の皮膚に貼り、かつ2本の細片をX-型に第二の皮膚に貼るように配分した。これらの皮膚は、直ちに貼り合せ、重なり接着部を形成し、乾燥を防ぐためにプラスチックフィルム片で被覆し、かつ100gの重みを加え、圧縮した。この接着部を、37℃で、15分間硬化した。この重なり接着部の長さ及び幅を定規で1mmまで測定し、直ちにInstron Model 55試験機で、引張り強度を試験した。クロスヘッド速度を、毎分25mmに設定した。重なり剪断引張り強度は、g/cm2の単位で表した。少なくとも三回行った測定について、平均及び標準偏差を算出した。
タンパク質ドープからの気泡を、2段階法で除去した以外は、プロトコルAに従った。遠心分離後、このドープを、26in-Hgの減圧下に、30分間曝した。重なり接着部に塗布したHMDI硬化剤の量は、2.0μlであった。
HMDI硬化剤組成物を変更した以外は、プロトコルBの手順に従った。スダンレッド色素5.2mgを、ストレートのプルロニック界面活性剤L-31 10.735g中で、100℃で10分間加熱し、溶解した。室温まで冷却した後、この混合物に、等重量の1,6-ジイソシアナトヘキサンを添加した。この混合物は、使用直前に調製した。
SE0K 74.6mgに、プルロニック界面活性剤L-31 4.57mgを添加した以外は、プロトコルBの手順に従った。SE0Kのリジン緩衝液に対する比は、プロトコルBの記載に従った。
SE0K 74.7mgに、プルロニック界面活性剤L-31 1.07mgを添加した以外は、プロトコルBの手順に従った。SE0Kのリジン緩衝液に対する比は、プロトコルBの記載に従った。
SE0K 85.0mgに、プルロニック界面活性剤L-31 5.1mgを添加した以外は、プロトコルEの手順に従った。HMDI硬化剤組成物も変更した。スダンレッド色素5.2mgを、ストレートのプルロニック界面活性剤L-31 10.735g中で、100℃で10分間加熱し、溶解した。室温まで冷却した後、この混合物に、等重量の1,6-ジイソシアナトヘキサンを添加した。この混合物は、使用直前に調製した。
緩衝液原液を、脱イオン水92.2mlに、リジン塩酸塩0.46g、ホウ酸1.24gを溶解して調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。この溶液のpHを、2N水酸化ナトリウム溶液7.8mlを添加して、pH9.52に調節した。この緩衝液に、エバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し、この溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。緩衝液原液333.5μlを、エッペンドルフチューブ中のSE0K 68.3mgに添加した。この混合物を、ボルテックスミキサーで、完全に溶解するまで、攪拌した。
緩衝液原液を、脱イオン水99.1mlに、リジン塩酸塩0.46g、及びホウ酸1.24gを溶解して調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。この溶液のpHを、10N水酸化カリウム溶液0.9mlを添加して、pH9.52に調節した。この緩衝液に、エバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し、この溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。緩衝液原液367.2μlを、エッペンドルフチューブ中のSE0K 75.2mgに添加した。この混合物を、ボルテックスミキサーで、完全に溶解するまで、攪拌した。
緩衝液原液を、脱イオン水10.0mlに、リジン塩酸塩42.7mgを溶解し、及び炭酸リチウム14.3mgを添加してpH9.55にして調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。この緩衝液に、エバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し、かつこの溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。
緩衝液原液を、脱イオン水99.2mlに、炭酸ナトリウム1.06g、及びリジン塩酸塩0.46gを溶解して調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。この溶液に、濃塩酸溶液0.8mlを添加して、pH9.54に調節した。この緩衝液に、エバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し、この溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。
緩衝液原液を、脱イオン水99.1mlに、炭酸カリウム1.38g、及びリジン塩酸塩0.46gを溶解して調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。この溶液に、濃塩酸溶液0.9mlを添加して、pH9.53に調節した。この緩衝液に、エバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し、かつこの溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。
緩衝液原液を、脱イオン水10.0mlに、リジン塩酸塩42.7mgを溶解して調製し、炭酸セシウム55.2mgを添加して、pH9.52にして調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。この緩衝液に、エバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し、かつこの溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。
緩衝液原液を、脱イオン水10.0mlに、リジン塩酸塩20.8mgを溶解し、炭酸カルシウム68.6mgを添加して調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。この緩衝液に、エバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し、かつこの溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。
緩衝液原液を、脱イオン水50.0mlに、リジン塩酸塩103.9mgを溶解し、炭酸カリウム473.3mgを添加して調製した以外は、プロトコルBの手順に従った。濃塩酸を用いて、この緩衝液を、pH9.00に調節した。
緩衝液原液に、ヨウ化カリウム5.70mg/mlを添加した以外は、プロトコルBの手順に従った。このドープの呼称pHは、約11であった。
緩衝液原液に、ヨウ化カリウム5.70mg/mlを添加した以外は、プロトコルBの手順に従った。濃塩酸を用いて、この緩衝液をpH9.00に調節した。
緩衝液原液6.495mlに、グルコース1.2755gを添加した以外は、プロトコルBの手順に従った。この溶液のpHは、10.5であった。
緩衝液原液6.495mlに、グルコース1.2755gを添加した以外は、プロトコルBの手順に従った。濃塩酸を用いて、この緩衝液をpH9.0に調節した。
緩衝液原液5.807mlに、尿素0.5226gを添加し、呼称1.5Mとした以外は、プロトコルBの手順に従った。この溶液は、pH11であった。
緩衝液原液5.807mlに、尿素0.5226gを添加した以外は、プロトコルBの手順に従った。濃塩酸を用いて、この緩衝液をpH9.00に調節した。
HMDI硬化剤の量を1.0μlに減少した以外は、プロトコルBの手順に従った。
HMDI硬化剤を、トルエンで、1:1w/w、1:3w/w又は1:5w/wに希釈した以外は、プロトコルBの手順に従った。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、それぞれ、2μl、4μl、又は6μlであった。
HMDI硬化剤を、メチルシクロヘキサンで、1:1w/w、1:3w/w又は1:5w/wに希釈した以外は、プロトコルBの手順に従った。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、それぞれ、2μl、4μl、又は6μlであった。
HMDI硬化剤を、クロロホルムで、1:1w/w、1:3w/w又は1:5w/wに希釈した以外は、プロトコルBの手順に従った。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、それぞれ、2μl、4μl、又は6μlであった。
HMDI硬化剤を、塩化メチレンで、1:1w/w、1:3w/w又は1:5w/wに希釈した以外は、プロトコルBの手順に従った。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、それぞれ、2μl、4μl、又は6μlであった。
タンパク質ドープの調製
緩衝液原液を、脱イオン水に、リジン塩酸塩9.14mg/ml、炭酸カリウム41.6mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解し調製した。この混合物は、使用前に、グラスウール栓を通してろ過した。SE8K 113.9mg、及び緩衝液原液227.8mgを、エッペンドルフバイアルに入れ、溶解するまで、ボルテックスミキサーで攪拌した。5000rpmで、30秒間、遠心分離することによって、この溶液から気泡を除去した。次にこのタンパク質ドープ溶液を、1.00mlシリンジに投入し、かつ室温で20分間静置し、その後重なり接着試験標本に投与した。
HMDI硬化剤の調製
HMDI硬化剤は、プルロニック界面活性剤L-61中に、スダンレッド3.75mgを溶解し、等重量の1,6-ジイソシアナトヘキサンを添加することによって、調製した。
ラット皮膚の調製
新たに摘出したラットの皮は、-20℃で凍結保存した。これらの皮を使用直前に解凍し、1cm×3cmの細片に切った。均一の幅及び厚さで、筋膜及び筋組織の無い細片を、選択した。これらのラット皮膚試料は、一時的に、PBSに浸したガーゼパッドの間に挟み、使用前の乾燥を防ぐために、プラスチィックバッグに入れて、37℃で保存した。
接着剤の塗布
タンパク質ドープ35μlを、ラット皮膚の一端に塗布し、ステンレス製スパーテルを5〜10回往復させて、約1cm2に作用させた。過剰なタンパク質ドープを、ステンレス製スパーテルで、第二のラット皮細片に移し、同様に作用させた。前述の皮膚に、HMDI硬化剤合計3.8μlを塗布し、HMDI硬化剤細片の3本を平行に第一の皮膚に貼るように分配した。これらの皮膚は、直ちに貼り合せ、重なり接着部を形成し、HMDI硬化剤が分配するように互いにこすり、乾燥を防ぐためにプラスチックフィルム片で被覆し、かつ100gの重みをかけて圧縮した。この接着部を、37℃で、15分間硬化した。重なり接着部の長さ及び幅を、定規で1mmまで測定し、直ちにInstron Model 55試験機で、引張り力を試験した。クロスヘッド速度を、毎分25mmに設定した。重なり剪断引張り強度は、g/cm2の単位で表した。少なくとも三回行った測定について、平均及び標準偏差を算出した。
緩衝液原液を、脱イオン水中に、リジン塩酸塩4.59mg/ml、炭酸カリウム31.2mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解して調製した以外は、プロトコルV1の方法に従った。
緩衝液原液を、脱イオン水中に、炭酸カリウム13.38mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを溶解して調製した以外は、プロトコルV1の方法に従った。
緩衝液原液を、脱イオン水中、アルギニン2.4mg/ml、炭酸カリウム9.46mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを用いて調製した以外は、プロトコルAの方法に従った。重なり接着部に塗布したHMDI硬化剤の量は、2.0μlであった。アルギニンのα−アミノ基のみが、この硬化反応の化学量論に関与したと推測された。
緩衝液原液を、脱イオン水中、システイン1.38mg/ml、炭酸カリウム9.46mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを用いて調製した以外は、プロトコルAの方法に従った。重なり接着部に塗布したHMDI硬化剤の量は、2.0μlであった。
緩衝液原液を、脱イオン水中、チロシン2.07mg/ml、炭酸カリウム9.46mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを用いて調製した以外は、プロトコルAの方法に従った。重なり接着部に塗布したHMDI硬化剤の量は、2.0μlであった。
緩衝液原液を、脱イオン水中、1,3-ベンゼンジスルホン酸二ナトリウム塩一水和物(1,3-BDSA)3.79mg/ml、及び炭酸カリウム9.46mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを用いて調製した以外は、プロトコルAの方法に従った。重なり接着部に塗布したHMDI硬化剤の量は、2.0μlであった。
緩衝液原液を、脱イオン水中、合成ペプチドRGRGRGKGKGK(配列番号:35)4.4mg/ml、炭酸カリウム9.46mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを用いて調製した以外は、プロトコルAの方法に従った。重なり接着部に塗布したHMDI硬化剤の量は、2.0μlであった。
緩衝液原液を、脱イオン水13.09mlに、コリニルリジネート29.2mg、炭酸カリウム123.9mg、及びエバンスブルー色素6.0mgを溶解して調製した以外は、プロトコルBの方法に従った。緩衝液は、使用前に、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。タンパク質ドープは、緩衝液310.0μl中に、SE0K 63.5mgを溶解して調製した。
緩衝液原液を、2-アミノエチルグリシネート、AEGly(実施例1、ジアミン合成参照)を用いて調製する以外は、プロトコルBの方法に従った。水を溶媒とする2-アミノエチルグリシネート236mg/mlのアリコート28.9mg、及び炭酸カルシウム48.6mgを、水5.127mlに溶解した。エバンスブルー色素2.20mgを添加し、この溶液を、0.45ミクロンのシリンジフィルターを通してろ過した。
緩衝液原液を、脱イオン水中、リジン塩酸塩3.73mg/ml、炭酸カリウム11.33mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを用いて調製した以外は、プロトコルV1の方法に従った。プルロニック界面活性剤L-61は、HMDI硬化剤に添加しなかった。使用したタンパク質ポリマーは、SE8Kであった。接着部に塗布した硬化剤の量は、2.0μlであった。
緩衝液原液を、脱イオン水中、リジン塩酸塩1.84mg/ml、炭酸カリウム8.37mg/ml、及びエバンスブルー色素0.50mg/mlを用いて調製した以外は、プロトコルAの方法に従った。使用したタンパク質ポリマーは、SE0K-CS1であった。接着部に塗布した硬化剤の量は、2.0μlであった。
重なり接着部に塗布したHMDI硬化剤の量を、1.0μlにした以外は、プロトコルFの方法に従った。
HMDI硬化剤を、シクロヘキサンを用いて、1:1v/v、1:3v/v、又は1:5v/vに希釈した以外は、プロトコルFの手順に従った。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、それぞれ、2μl、4μl、又は6μlであった。
HMDI硬化剤を、1,1,1-トリクロロエタンを用いて、1:1v/v、1:3v/v、又は1:5v/vに希釈した以外は、プロトコルFの手順に従った。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、それぞれ、2μl、4μl、又は6μlであった。
HMDI硬化剤を、酢酸エチルを用いて、1:1v/v、1:3v/v、1:5v/v、又は1:9v/vに希釈した以外は、プロトコルFの手順に従った。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、それぞれ、2μl、4μl、6μl、又は10μlであった。
下記の変更以外は、プロトコルBの方法に従った。
タンパク質ドープの調製
タンパク質ポリマーSE0K-CS1 81.6mgを、エッペンドルフチューブの中の脱イオン水311μlに添加し、ボルテックスミキサーで溶解するまで攪拌した。この溶液に、水を溶媒とする1,3-プロパンジイルジグリシネート(1,3-PG)の10%w/w溶液を11.43μl;水を溶媒とする炭酸カリウムの10%w/w溶液を14.73μl;及び水を溶媒とする重炭酸カリウムの10%w/w溶液を9.43μl添加した。これらの内容物を、均一になるまで、再度ボルテックスミキサーで、攪拌した。この溶液を、約5000rpmで、30〜60秒遠心分離し、気泡を分離し、その後このドープを、26in-Hgの減圧に、30分間曝した。
HMDI硬化剤の調製
ストレートの1,6-ジイソシアナトヘキサン100mg、及びスダンレッド色素2.4mg、を、1-クロロ-2,2,2-トリフルオロエチルジフルオロメチルエーテル2.342gに溶解した。重なり接着部に塗布した希釈したHMDI硬化剤の量は、4μlであった。
タンパク質ドープの調製
タンパク質ドープは、10mM乳酸水溶液0.90mg/ml中に、タンパク質ポリマーSE0Kを17% w/w溶解することによって調製した。このタンパク質ドープは、広い範囲のpH試験紙で試験し、およそpH3.5であった。硬化を開始するための溶液を、脱イオン水10ml中に、炭酸カリウム1.66gを溶解して調製した。
HMDI硬化剤の調製
HMDI硬化剤は、クロロホルム2.24gに、1,6-ジイソシアナトヘキサン5.04g、プルロニック界面活性剤F-127 0.0033g、及びスダンレッド色素0.0020gを溶解して調製した。
ラット皮膚の調製
新たに摘出したラットの皮は、-20℃で凍結保存した。これらの皮を、使用直前に解凍し、かつ1cm×3cmの細片に切った。この皮膚細片から、カミソリ刃で、筋膜を全て除去した。幅及び厚さが均一である皮膚細片を、選択した。調製したラット皮膚試料を、一時的に、PBSで浸したガーゼパッドの間に挟み、乾燥を防ぐためにプラスチックバッグに入れて、37℃で保存した。
接着剤の塗布
皮膚細片は、37℃の暖かい室内で、ガラス板上に並べた。タンパク質ドープ15μlを、ステンレス製スパーテルを用いて、2ラット皮膚の各々の末端に、約1cm2の領域に、合計30μl作用させた。HMDI硬化剤1.0μlを、ステンレス製スパーテルを用いて、2ラット皮膚の各々の末端に、約1cm2の領域に、合計2.0μl作用させた。炭酸カリウム硬化液2.0μlを、6滴で添加し、3滴を、2ラット皮膚の各々に塗布し、これらの皮膚を直ちに貼り合せ、重なり接着部を形成した。この接着部には、100gの重みを加え、この接着剤を、37℃で、15分間硬化した。この重なり接着部は、ここに記載したInstron張力試験機での試験に失敗した。
界面活性剤プルロニックL-31を用いた最初の研究
次の試験では、様々な緩衝液を、多官能基としてのリジンと組合わせて用いた。
次の試験では、様々な化学的に非反応性及び反応性の添加剤を、この配合物に添加して、これらの添加剤の剪断強度に及ぼす影響を調べた。
次の試験においては、様々な有機溶媒を使用し、架橋剤を、緩衝したタンパク質水溶液と混合する以前に、これらの溶媒の中に溶解した。
次の試験においては、様々な多官能性薬剤を使用し、様々な官能性を用いて該ポリマーを架橋し、これらの官能性は、対称性又は非対称性の、及び介在性の鎖は、側鎖として異なる官能基を有する脂肪族又は芳香族であった。いくつかの例においては、架橋に使用された多官能性薬剤は、加水分解により不安定であり、その架橋鎖中に加水分解されやすい結合を有していた。
表24において、SELP8K、SELP0K、SELP0K-CS1のいずれかを含有する様々な配合について比較した。
前述の結果から、本発明は、迅速に硬化し、広範な特性を有する組成物を提供することができる組成物を提供することが明らかである。対象の組成物は、良好な剪断強度を有する強力な接着組成物を提供することができ、この剪断強度は、短期間に実現される。本発明は、組織の空隙又は孔に充填する、もしくは組織を増大することができる組成物も提供する。従って、対象のタンパク質性ポリマー類は、その他の使用の中で、シーラントのみではなく、吸収が可能な限りは、延長された期間、その強度を維持するような生理的に適合可能な組成物を提供する、組織接着剤として使用することができる。
本願明細書中において言及したあらゆる出版物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願について特別に及び個別に参照として引用されることを指示されたのと同じ範囲で、参照として引用される。
本発明は、ここで十分に説明されているが、当業者には、添付されたクレームの精神又は範囲を逸脱しない限りは、これに多くの変更及び修飾を加えることができることは明らかであろう。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:ステドロンスキー,エルウィンR.
カペロ,ジョセフ
(ii)発明の名称:合成架橋を用いる組織接着剤
(iii)配列数:35
(iv)宛て先:
(A)名宛人:フレル,ホバック,テスト,アルブリットン&ハーバート
(B)通り:フォーエンバカデロセンター,スイート200
(C)市:サンフランシスコ
(D)州:カルフォルニア
(E)国:米国
(F)郵便番号:94111
(v)コンピューターでの読み取り可能フォーム:
(A)媒体:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM PC互換機
(C)オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア:PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi)本願のデータ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(viii)弁護士/エージェント情報:
(A)名前:ローランド,バートラムI
(B)登録番号:20015
(C)参照/事件番号:A61127-1/BIR
(ix)通信番号:
(A)電話:415-781-1989
(B)ファクシミリ:415-398-3249
(2)配列番号1に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:6アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号1
(2)配列番号2に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:5アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号2
(2)配列番号3に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:7アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号3
(2)配列番号4に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:64アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号4
(2)配列番号5に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:64アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号5
(2)配列番号6に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:31塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号6
(2)配列番号7に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:35塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号7
(2)配列番号8に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:192塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号8
(2)配列番号9に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:65アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号9
(2)配列番号10に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:201塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号10
(2)配列番号11に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:35塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号11
(2)配列番号12に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:37塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:cDNA
(xi)配列の記載:配列番号12
(2)配列番号13に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:192塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:CDNA
(xi)配列の記載:配列番号13
(2)配列番号14に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:64アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号14
(2)配列番号15に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:884アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号15
(2)配列番号16に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1065アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号16
(2)配列番号17に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:4アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号17
(2)配列番号18に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:22アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号18
(2)配列番号19に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号19
(2)配列番号20に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:32塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号20
(2)配列番号21に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:32塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号21
(2)配列番号22に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:93塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号22
(2)配列番号23に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:162塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号23
(2)配列番号24に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:54アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号24
(2)配列番号25に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1002アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号25
(2)配列番号26に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:378アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号26
(2)配列番号27に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:141塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号27
(2)配列番号28に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:181塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号28
(2)配列番号29に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:60アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号29
(2)配列番号30に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:936アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号30
(2)配列番号31に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:147塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号31
(2)配列番号32に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:186塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:他の核酸
(A)記載:/デスク=”合成”
(xi)配列の記載:配列番号32
(2)配列番号33に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:62アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号33
(2)配列番号34に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:966アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:タンパク質
(xi)配列の記載:配列番号34
(2)配列番号35に関する情報
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:11アミノ酸
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)分子型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列番号35
Claims (7)
- アミノ基と反応性がある多官能性架橋剤、及びGAGAGS(配列番号:01)及びGVGVP(配列番号:02)の繰り返し単位を少なくとも70重量%含むタンパク質ブロックコポリマーを含む前駆体組成物を含む、分離された生存組織を近接関係に維持するのに有用な接着剤であって、少なくとも2個の単位において、アミノ酸がリジン又はアルギニンの少なくとも1種で置換されており、又は少なくとも2個の介在性基がリジン又はアルギニンの少なくとも1種を含み、これにより前記前駆体組成物が硬化して強力な付着性接着剤組成物となって前記分離された生存組織を近接関係に保持し、前記架橋剤が前記付着性接着剤組成物に取り込まれる接着剤。
- グルタルアルデヒド及びポリメチレンジイソシアナートから成る群から選択する多官能性架橋剤、及びGAGAGS(配列番号:01)及びGVGVP(配列番号:02)の繰り返し単位を少なくとも70重量%含む、少なくとも30kDのタンパク質ブロックコポリマーを含む前駆体組成物を含む、分離された生存組織を近接関係に維持するのに有用な接着剤であって、少なくとも2個の単位において、アミノ酸がリジン又はアルギニンの少なくとも1種で置換されており、前記コポリマーが3〜15kDのリジン又はアルギニン重量当量を有しており、これにより前記前駆体組成物が硬化して強力な付着性接着剤組成物となって前記分離された生存組織を近接関係に保持し、前記架橋剤が前記付着性接着剤組成物に取り込まれる接着剤。
- アミノ酸と反応性がある多官能性架橋剤、及びGAGAGS(配列番号:01)及びGVGVP(配列番号:02)の繰り返し単位を少なくとも70重量%含むタンパク質ブロックコポリマーを含むキットであって、該コポリマーの少なくとも2個の単位において、アミノ酸がリジン又はアルギニンの少なくとも1種で置換されており、又は少なくとも2個の介在性基がリジン又はアルギニンの少なくとも1種を含み、該リジン又はアルギニンが前記架橋剤と反応して、付着性接着剤組成物を形成するキット。
- 前記単位がGAGAGS(配列番号:01)及びGVGVP(配列番号:02)であり、該単位がブロックコポリマータンパク質を形成する、請求項3記載のキット。
- 前記架橋剤がアルデヒド、イソシアナート、チオイソシアナート及び活性カルボキシから成る群から選択する複数の反応基を有する、請求項3記載のキット。
- GAGAGS(配列番号:01)及びGVGVP(配列番号:02)の繰り返し単位を少なくとも70重量%含む、少なくとも30kDのタンパク質ブロックコポリマーであって、少なくとも2個の単位において、アミノ酸がリジン又はアルギニンの少なくとも1種で置換されており、前記コポリマーが1〜40kDのリジン及びアルギニン重量当量を有するコポリマー、並びにグルタルアルデヒド及び脂肪族ジイソシアナートから成る群から選択した架橋剤を含むキットであって、前記架橋剤が前記ブロックコポリマーと反応して付着性接着剤組成物を形成するキット。
- 架橋されたタンパク質組成物を含む接着剤であって、架橋前の前記タンパク質が、GAGAGS(配列番号:01)及びGVGVP(配列番号:02)の繰り返し単位を少なくとも70重量%含むタンパク質ブロックコポリマーであり、少なくとも2個の単位において、アミノ酸がリジン又はアルギニンの少なくとも1種で置換されており、前記コポリマーが1〜20kDのリジン及びアルギニン重量当量を有し、少なくとも2個の単位において、前記リジン又はアルギニンが多官能性架橋剤であるアルデヒド、イソシアナート、チオイソシアナート及び活性カルボキシの少なくとも1つと反応できるものであり、前記架橋剤が前記付着性接着剤組成物に取り込まれる、前記接着剤。
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