JP4038398B2 - 油及び脂肪の酵素的な分裂方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水の存在における、天然の油及び脂肪の、即ち油及び脂肪のトリグリセリドの、グリセロール及び脂肪酸への、酵素的な分裂（splitting）即ち開裂に関する。
【０００２】
【従来の技術】
この種の脂肪又は油の分裂は、長い間知られてきており、産業において主として実行される圧力分裂（pressure splitting）に反して、かなりの原理的な利点を提示する。酵素的な分裂を、室温でさえ、酵素及び油又は脂肪に依存して、通常の圧力で実行することができる。
【０００３】
また、脂肪の分裂のこの方法が最も温和なものであることは、長い間知られてきている。産業上のバイオテクノロジーの技術進歩は、また今日利用可能で脂肪の分裂に適切な酵素を提供した。このような利用可能な酵素は、例えば、多くの洗剤で使用される。しかしながら、主として非常に長い分裂時間の高い酵素消費及び酵素の脂肪の分裂における結果として生じる低い効率のために、酵素的な分裂は、産業で良好に確立されている大規模な圧力分裂に対する産業上の代替方法にはならなかった。酵素の消費を低下させる多数の試みの大部分に起こった主要な問題は、次の出版物、‘Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌｉｐａｓｅｓ ｉｎ Ｆａｔ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｙｓ’，Ｍ．
【０００４】
【外１】

ａｎｄ Ｃｈｒ．Ｗａｎｄｒｅｙ，Ｆａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８９／Ｄｅｃ．８７，５９８乃至６０５頁、‘Ｅｎｚｙｍａｔｉｓｃｈｅ Ｆｅｔｔｓｐａｌｔｕｎｇ’，Ｍ．
【０００５】
【外２】

ａｎｄ Ｃｈｒ．Ｗａｎｄｒｅｙ，Ｆａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８９／Ｎｒ．４／１９８７，１５６乃至１６４頁、‘Ｏｌｅｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｂｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ？’，Ｍ．
【０００６】
【外３】

ａｎｄ Ｃｈｒ．Ｗａｎｄｒｅｙ，Ｆａｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９４／Ｎｏ．３／１９９２，８２乃至９４頁に記載されている。
【０００７】
水／油の混合物に作用する生体触媒としての酵素（いわゆるリパーゼ）を使用する酵素の脂肪の分裂は、これらの出版物に記載されている。この分裂技術によって、油又は脂肪は、それぞれ、グリセロール及び遊離の脂肪酸へ分裂する。グリセロールは、水相へ移動するのに対して、有機相は、最終的に遊離の脂肪酸のみが有機相に残るまで、遊離の脂肪酸がますます濃縮する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、消耗した酵素の活性は、時間と共に大いに減少し、その減少は、触媒的に転化された製品の量からほとんど独立である。この減少を、酵素のさらなる添加によって補償することができるが、しかしながら、時間に依存して変動する酵素の消費を、回避することができない。分裂反応（splitting reaction）の過程では、反応速度又は分裂速度は、ますます減少し、酵素消費は、増加する。これは、酵素的に触媒された加水分解が平衡反応であるという事実による。水相におけるグリセロール及び有機相における脂肪酸の濃度が増加すると共に、反応速度は、遅くなり、最終的には漸近的に平衡濃度に接近する。従って、１００％近くの所望の分裂度（splitting degree）は、非常に長い反応時間の後にのみ達成することができる。この長い反応時間は、酵素活性の高い損失に不可避的に帰着する。反応時間を、水相中のグリセロール濃度を低下させることによって短くすることができるが、しかしながら、これは、分裂反応において得ることができるグリセロールの濃度が低いことを意味し、水相のより高い割合によって、水／グリセリン相は、水相と共に放出されると共に再び使用することができない、そこに溶解するより多くの酵素を有する。
【０００９】
酵素的な分裂反応は、有機及び水相間の相の境界で起こり、相の境界に存在する酵素及び相の境界に存在するトリグリセリドのみが、分裂反応に寄与するか又は関係する。分裂度を増加させると、グリセリドとしてまだ化学的に結合した脂肪酸の占有密度即ち濃度は、遊離の脂肪酸と比較して、相の境界で減少するので、反応は遅くなる。反応速度は、中間境界面を増加させることによって加速させることができる。しかしながら、これは、相の境界での酵素の占有密度又は濃度が変わらないままであるように酵素の量を増加させることを要求する。しかしながら、酵素の添加によって反応速度を増加させる効果は、限定される。最大の濃度では、酵素のどんなさらなる添加も、もはや反応を加速することに寄与しない。しかしながら、酵素の消費は、それによって顕著に増加するので、酵素の量及び相の境界の表面積の最適な調節は、必ずしも容易には得られない。
【００１０】
さらに、脂肪酸を含む有機相及びグリセロールを含む水相を分離するための分離ステップの間に、酵素の量は放出され、さらなる使用のために回収させることができない。添加された酵素の量と同様に有機及び水相を激しく混合することにより中間境界面を増加させることによって反応速度を増加させることができることは正しいが、酵素の相の分離、回収、及び再使用法は、それによってより困難になる。
【００１１】
上述の出版物において、酵素的な分裂反応は、分裂を受けることになる水と油の連続的な多段式向流系（continuous multistage counterflow system）で起こる。グリセロールを含む水相、及び分裂した遊離の脂肪酸を含む有機相を分離すると共に、中間即ち界面の層を生成する。この界面の層は、乳濁状（emulsion-like）であり、酵素の大部分を含む。その過程に対してこの酵素を回収し酵素の消費を減少させるために、前述の出版物“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｕｓｅ ｏｆＬｉｐａｓｅｓ ｉｎ Ｆａｔ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ”による過程を、次のように実施する。最初に、油を、混合反応器中で連続的に分裂させる。遊離の脂肪酸の他に、水、グリセロール、モノ及びジグリセリド、酵素だけでなくまだ分裂してない油を含む反応生成物を、固い壁のボウルの遠心分離機（solid wall bowl centrifuge）へ与える。遠心分離機は、グリセロールの水相と有機相との間の界面の層が有機相と一緒に放出されるように調節される。界面の層を含む有機相は、新鮮な水／酵素の混合物が供給される第二の混合反応器中に供給される。第二の反応器の反応生成物は、しかしながら界面の層がグリセロールを含む水相と一緒に放出されるような、及び放出された遊離の脂肪酸が界面の乳濁層にないような、様式で調節されるさらなる固い壁のボウルの遠心分離機中に供給される。水相は、第一の反応器（混合器）中へ再利用されるので、界面の乳濁層に含まれる酵素の量は、過程に再び供給される、即ち戻して加えられる。第二の反応器の中で達成される分裂度は、９８％までであるので、第二の反応器から得られる最終反応生成物の蒸留の後、遊離の脂肪酸の収率は、かなり高い。しかしながら、この種の反応スキームでさえ、確立された大規模な圧力分裂過程と比べて実際に競合する過程を提供しない。
【００１２】
本発明の目的は、有益な競合する大規模な過程を考慮に入れた酵素の油又は脂肪の分裂方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この目的は、独立請求項の各一つの特徴によって達成される。有利なさらなる実施例は、従属請求項で定義される。本発明の特徴は、短い反応時間及び減少した酵素の消費を提供する。
【００１４】
上記の目的の解決方法を見出すための、それらの多数の試みの間に、本出願の発明者は、いくつかの基礎的及び本質的な態様において上述の出版物に示される過程のスキームから外れることが必要だったことを評価した。
【００１５】
本発明における第一の解決方法の態様によって、発明者は、従来、高い程度の分裂又は転化まで実施されるような酵素的な分裂で、遊離の脂肪酸の所望の収率を得ることから既に外れた。代わりに、本発明のこの態様による酵素的な分裂は、単に、過程のかなりの減速が起こらない分裂度に一致する、比較的小さな分裂度に到達するまで実行する、即ち実施する。言い換えれば、反応速度が予め設定された値よりも落ちるとき、分裂反応は止められる。このような分裂度は、通常、約８０％から９０％までの間にあり、結果として商業的に適用可能な過程に必要と従来考えられた分裂度の値以下である。次に遊離の脂肪酸は、酵素から遊離した有機相から分離され、グリセリドとして化学的に結合した脂肪酸をまだ含む残留物を、フィードバックする即ち再利用して、分裂を受けることになる新鮮な油又は脂肪と混合する。この様式において、次に、再利用されたグリセリドは、さらなる酵素的な分裂過程を受ける。酵素の脂肪又は油の分裂を、約８０％の分裂度のみまで実行するとすれば、これは、非常に短い時間で可能である。後に遊離の脂肪酸が、このような様式で部分的に分裂する油又は脂肪から抽出されるとすれば、及び、化学的に結合した脂肪酸（トリグリセリド）が分裂の過程へ戻される即ちフィード・バックされるとすれば、油又は脂肪の最終的な完全な分裂に対して断念する必要なしに、酵素の消費を徹底的に減少させることができる。酵素的な分裂過程は、水及び有機相の間における相の境界でのグリセリドの不足によって反応速度が著しく遅くなる、上述の重大な過程の条件に入らない。
【００１６】
分裂度は、与えられた油又は脂肪に対して計算することができる理論的に可能な酸価で割った測定された酸価の比率として、決定される。好ましくは、酸価は、標準の共通の方法による滴定によって測定される。代わりに、グリセロールの水相の密度を、分裂度に対する測定値として得ることができる。
【００１７】
酵素的な分裂の部分的に分裂した開始の生成物から遊離の脂肪酸を分離するために、好ましくは、減圧蒸留法、即ち好ましくは、（時々、分子蒸留と呼ばれる）穏やかな短い経路の蒸留（short path distillation）が適用される。Ｃ１４乃至Ｃ２２の脂肪酸の鎖の長さの範囲をもつ脂肪及び油の場合には、あたかも最も自然な脂肪及び油に対して正しいことを保持するように、遊離の脂肪酸を、部分的に分裂した開始の生成物、即ち脂肪又は油から、問題なしに蒸留によって分離することができ、任意の適切な量のグリセリド、又は言い換えれば、グリセリドとしてまだ化学的に結合した任意の適切な量の脂肪酸から同時に蒸留することなく除去することができる。約８０及び９０％の間の分裂度の場合には、モノ及びジグリセリドとして化学的に結合した脂肪酸の量は、驚くほど小さい。主要な部分は、まだ分裂してないトリグリセリドから成る。さらに、残留物が分裂反応へ再利用されるので、蒸留ステップの残留物に残る脂肪酸の量は、損失に至らない。
【００１８】
代わりに、蒸留を適用することに対して、遊離の脂肪酸を、吸着の分離方法（例えば、カラムクロマトグラフィー）によって分離することができるかもしれない。都合良くは、減圧蒸留による遊離の脂肪酸の蒸留のために、流下薄膜（falling-film）若しくはダウンフロー（down-flow）蒸発器又は短い経路の蒸留装置のような減圧薄膜蒸発器（vacuum-thin film-evaporator）が、バブル蒸留（bubble distillation）技術と比較すればこれらの蒸留技術がより温和であると共にとりわけ連続的に実行することができるので、使用される。さらに、これらの蒸留技術は、本質的に約５％乃至１０％の液体の残留物を、そうでなければ蒸留フィルム（distillation film）が剥がれるか又は壊れるかもしれないので、要求する。従って、それは、本発明によって比較的小さな分裂度をまだ示す反応生成物が減圧蒸留装置に供給されるとき、かなりの利点を構成する。蒸留装置を残す底を再利用する前に、好ましくは脱ろう、防寒及び漂白のような化学物理的な既知の手段によって、ろう又は他の望まれない物質及び副産物は分離される。そうでなければ、これらの物質は、再利用する過程の中で濃縮されるかもしれない。
【００１９】
前述の手段によって、反応時間を、酵素的な分裂を連続的な分裂によってのみ９８％の分裂又は転化の程度に到達するようにこのように実施した過程と比較して、徹底的に短縮することができるかもしれない。これは、例えば高オレイン酸ヒマワリ油に対して証明された。さらに、本発明における酵素的な分裂の比較的初期の打ち切りは、時間の経過と共に酵素活性の上述の減少によって酵素の損失を強く減少させた。９８％程度の分裂度まで働くことに比較して、酵素活性が著しく減少する前に分裂反応が止められるので、これらの損失を著しく縮小させることができる。従って、過程は、酵素の脂肪の分裂を、圧力分裂より少ないコストで実施することができるようなものである。従って、最初に、発明の第一の態様による過程は、確立した産業の圧力分裂に対する有利な代替法として酵素的な分裂を使用する可能性を提示する。
【００２０】
本発明のさらなる第二の解決態様によって、過程の時間及び酵素の消費は、グリセロールを含む、より重い水相、及び脂肪酸を含む、より軽い有機相の分離に対して、自己洗浄性の遠心分離機（self-cleaning centrifugal separator）、いわゆる自己放出（self-discharge）をもつ分離機を使用することによって、かなり改善することができる。遠心分離機は、有機相も水相も、分離された水及び有機相の間の相の境界即ち界面で生成する乳剤相を構成すると共に実質的な量の酵素を含む適切な量の上述の界面の乳濁相を含まないように、調節される。遠心分離機は、この界面の乳濁相が、好ましくは分離機のディスク・スタック（disk stack）の領域にある分離機のボウルの内部の分離区域で蓄積するように調節される。ディスク・スタックは、自己洗浄性の遠心分離機の分離区域内にあり、前記の乳濁相を蓄積するのに適切である任意のディスク、リップ（rip）又は翼状の構造であり得る。
【００２１】
その調節は、分離機のリングダム（ring dam）の直径及び放出管（discharge pipe）の逆圧を選択し調節するような既知の手段によって達成される。両方の相、水相及び有機相は澄んでおり乳濁なしに放出されるとき、適切な調節を達成する。一般に、両方の相は、分離機の動作中に流れて、観察され得る。
【００２２】
これは、自己洗浄性の遠心分離機の場合には、通常、液／液相分離の間に分離機のディスク・スタックにおけるそのかなり量の中間即ち界面の層の蓄積を回避するので、主として遠心分離機のための普通でない調節を表わす。代わりに、分離される液体間のどんな中間の層もできるだけ小さく、その層が、主として生成される相でなく分離機に蓄積しない相と一緒に放出されることを一般に注意する。主として、これは、また前述の出版物の系に対して正しいことを保持し、ここで中間又は界面の乳濁層は、第二の連続的に操作される固い壁のボウルの遠心分離機の後で、水相と一緒に放出され、次に第一の混合反応器にフィードバックされた。
【００２３】
本発明によれば、乳濁状の中間又は界面の層は、遠心分離機に蓄積され、分離機のボウルの周期的な放出によって不連続的に放出され、酵素を含む放出され蓄積された中間の層は、再使用される。連続的に放出され流れ出る有機相及びグリセロールの水相が、中間の層の同時に放出される量によってどんな乳濁又は曇りを示し始めるときはいつでも、周期的なボウルの放出を達成することを推薦できる。この断続的なボウルの放出で、また水相及び有機相が完全に放出されるという事実は、すべての相が分裂の過程へ再利用されるので、不都合ではない。
【００２４】
この様式において、重い水相と一緒に又は軽い脂肪酸の有機相と一緒に任意の適切な酵素の量の放出は、回避されるので、事実、実際に、相当な酵素量が失われない。酵素の主要な部分は、分離機のディスク・スタックに蓄積し、不連続的に十分又は部分的なボウルの放出によって回収され再使用され得る。十分なボウルの放出の代わりに、部分的なボウルの放を適用してもよいが、しかしながら、それらを、中間の層を可能な限り完全に放出するように調節するべきである。
【００２５】
本発明のこの態様によれば、水相及び有機相と一緒に放出することによる酵素の損失は、徹底的に低下させることができる。避けられない酵素の経年変化による時間依存の酵素消費との比較で、本発明の過程の放出損失は、非常に小さい。
【００２６】
分離された有機相におけるさらにより低い酵素の損失を達成するための本発明のさらなる開発は、追加の自己洗浄性の洗浄（polishing）即ち浄化遠心分離機を使用することに存する。この追加の洗浄分離機は、単一の分裂の段階の分離機の後に、又は複数の分裂の段階の最終的な分離機の後に、直接提供されると共に、そこから放出された有機相を受け取る。好ましくは、追加の洗浄分離機は、ディスク・スタックをもつ自己洗浄性の遠心分離機の形態で提供される。この分離機は、沈降した固体、即ちこの場合には酵素、及び水相の分離可能な残りは、ボウルの壁に付着するように調節される。
【００２７】
このように遠心的に分離され付着する酵素の量は、不連続なボウルの放出によって再び得られ、分裂の過程へ再利用される。有機相の分離のために自己洗浄性の遠心分離機を使用することによって、本発明は、ループ反応器（loop rector）において、即ち言い換えれば、バッチで、分裂の過程を不連続的に実施する可能性を特に提示する。これは、上述の出版物に記載されたシステムと対照的である。不連続の過程の目的に関して、以下の過程を、本発明の第三の態様によって採用することができる。油は、第一のループ反応器に満たされ、油（又は脂肪）、水、及び酵素の反応器内容物を循環させるためのこの反応器の循環ループ（circulation loop）は、その時には活動中ではない。同時に、第二のループ反応器は、活動中の再循環ループをもつ分裂反応を実施し、第三のループ反応器は、その時間に自己洗浄性の遠心分離機によって放出され、それにより、分離機中の遠心過程によって、放出された反応混合物は、グリセロールを含む水相、脂肪酸を含む有機相、及び上記の中間の層を構成する、酵素を含む界面の乳濁相へ分離される。後者は、分離機から間隔的に不連続的に放出され、新鮮な酵素が補われ、反応器へ戻される。
【００２８】
循環ループ反応器を操作するために使用される循環ポンプ中で発生するそのような循環及びせん断力は、異常に大きな中間の境界面を生成するので、分裂反応を非常に高い酵素レベルで実施することができる。さらに本発明の第一の態様によって、８０％乃至９０％の分裂度のみが到達されるとき、供給された水の量を、相当に減少させることができ、以前には可能でなかった高度に増加したグリセロール濃度をもつ水相を得ることは可能である。反応時間は、３０％以上のグリセロール濃度でさえ必ずしも著しく延長されない。このような高いグリセロール濃度は、従来実行可能ではなかった。さらに、酵素中間の層の分離は、高いグリセロール濃度によって促進される。
【００２９】
既に許可された本発明における上記の第三の態様による操作モードは、上述の先行技術とは対照的に、わずか１時間の短い時間枠の中で９３％までの分裂度に到達する。この程度では、単一の段階の短い経路の蒸留を、本発明の第一の態様によって、問題なしに実行することができる。しかしながら、９５％以上の分裂度の場合には、これは、既に述べた理由により、むしろ非常に困難であるかもしれない。
【００３０】
本発明の第一の態様によって、蒸留の残留物が分裂の過程へ再利用されると、そうでなければ通常のように、複数の連続の蒸留段階又は脂肪酸を分離するための他の分離手段を提供する必要なしに、材料は、完全に転化される。
【００３１】
不連続の分裂反応は、多段式の、例えば二つのステップのループ反応器と共に、即ち二つの脂肪の分裂ステップ又は段階と共に、本発明によって特に有利に実行することができる。そうすることにおいて、好ましくは、最終分裂度の約三分の二は、第二の段階のグリセロールを含む水相が水相として使用される第一のステップ又は段階で、既に到達する。所望の分裂度の約三分の一は、水相として新鮮な水が供給される第二のステップ又は段階で達成される。この様式において、９０％以上の分裂度もまた、より著しく長い反応時間を受け入れる必要なしに得ることができる。両方の段階は、さらに上述されるように、バッチで及び間隔的に放出されるそれ自体の酵素の再循環を有する。新鮮な酵素は、主として酵素の経年変化を補償するために、各段階の循環した酵素に加えられる。しかしながら、水及び有機相と共に放出によって引き起こされる酵素の損失は、本発明によれば重要ではない。
【００３２】
本発明によって上述した三つの解決方法の態様における全て又は二つを組み合わせるとすれば、分裂の過程は特に有利である。しかしながら、それらの各々は、本発明の基礎となる問題も単独で解決することを認識しなければならない。完全な転化のための反応時間を、二つの時間のみの過程の時間に対するさらなる過程の最適化なしで、短縮することができるかもしれないと共に、酵素の消費は、過程に投入される油の０．０２重量％まで減少させることができるかもしれない。この値は、前述の追加の洗浄遠心分離機を使用することによって、さらに低下させることができるかもしれない。
【００３３】
最初に、酵素の脂肪／油の分裂の本発明による過程は、また大規模な高い圧力分裂と比較して優れている。酵素の消費のコストは、圧力分裂プラントに必要な相当な投資に対する償却コスト以下にあり、酵素の分裂は、定性的により高度の生成物を提供し、エネルギー消費は、明らかにより低く、過程は、安全に関して技術的に問題ではない。生成物は、低温及びより少ない副産物（分裂反応の副反応で生成された分解生成物及び望まれない生成物で、それらは、不飽和脂肪酸を有する油と共に生じる）のために、それらが示すように特に高く格付けされる。材料を、さらなる圧力分裂過程を受ける必要なしに、酵素的な分裂によって単独で完全に分裂させ転化することができる。
【００３４】
本発明によって、前述の出版物におけるように、酵素として非特異的なリパーゼ、又は非特異的及び特異的なリパーゼの混合物を使用することは好ましい。適切な酵素を、実施例に示す。
【００３５】
代わりに、解決方法の態様の各々による本発明による過程を特異的な酵素のみと共に実行することができ、このように、それは、例えば、モノグリセリノールアート（monoglycerinoleate）、又は他のモノ若しくはジグリセリドを生成することができる。この場合に、蒸留の残留物中のモノグリセリノールアートを最大にすることは都合が良く、それは、本発明の特徴と共に全く可能である。
【００３６】
さらに、上記の態様の各一つによる本発明による過程は、食用油のアルカリ精製過程からのいわゆる石鹸の原料（soap-stock）に含まれるモノ、ジ及びトリグリセリドを分裂させることにも適切である。この様式において、石鹸の原料は、中性油の先行するけん化なしで、定量的に脂肪酸に転化することができる。この目的のために、石鹸において化学的に結合した脂肪酸は、好ましくは分裂の前に、酸の添加を通じて放出される。好ましくは、緩衝溶液は、分裂の過程に関する水及び酵素に加えて使用される。可能な解決方法は、好適な実施例中に示される。
【００３７】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明を、好適な実施例及び添付した図面を参照して説明する。
【００３８】
技術的な実験において、生の精製してない高オレイン酸ヒマワリ油を使用した。多数の以前の研究所の試みが示してきたように、本発明の利点は、それは、実際には、すべての油及び脂肪に、特にオレイン酸の通常の含有量を有する従来のヒマワリ油にもまた適用可能であるということである。好ましくは、（酵素反応を阻害する材料がない）軟水の緩衝溶液及び酢酸ナトリウム／酢酸を水相として使用した。しかしながら、その酸とともにナトリウム又はカリウムの塩、炭酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩のような他の緩衝剤もまた酵素の活性を最適化するために、可能性がある。
【００３９】
図１は、説明した態様を実施するために適合する、本発明による二段階の脂肪の分裂の配置を示す。図１は、産業プラントに対する可能な処理能力容量に関する例を示す。各場合において対応する循環ループをもつ三つのループ反応器を含む、二つの脂肪の分裂ステップ即ち段階１及び２を提供する。反応器を、上述のように断続的に操作する。ある段階における三つの反応器の各々に提供される循環ループは、図面に示す渦巻きポンプによって、及びポンプに先行する熱交換器によって実施される。反応器は、例えば、攪拌機をもつガラス又はステンレス鋼からなる。さらに、遠心分離機は、各段階に対してディスク・スタックをもつ自己洗浄性の遠心分離機の形態で提供される。脂肪酸を有する有機相が放出される、第二の分裂の段階における分離機の出口は、短い経路の蒸留手段に接続され、そこで遊離の脂肪酸を分離するための減圧蒸留が達成される。蒸留の残留物又は底は、攪拌器手段を含む結晶器に供給され、そこでろうの結晶化が達成される。固体の物体として結晶してきた、ろうの結晶化手段から取り出された残油及び運搬ろう（carrying wax）及び他の高沸点の副産物は、ポンプによってフィルタ装置へ導入され、フィルター処理によりこれらの副産物から供給される。次に、精製された油は、分裂の過程における第一の段階へ戻して実施される。
【００４０】
反応器には、緩衝溶液、分裂するトリグリセリド及び酵素が供給される。さらに、酵素溶液は、自己洗浄性の遠心分離機のどの断続的なボウルの放出でも得られ、それぞれの放出される分離機がその時に接続される、満たされることになる同じ段階の反応器中へ戻される。このように、同時に放出される遊離の脂肪酸の分離された部分と一緒に酵素、まだ分裂してないトリグリセリドなどは、同じ段階又はステップの循環で残る。これによって、二つの段階の異なる質の開始の生成物が逆混合することは予防される。バック即ち逆反応の危険性は、このようにしてもまた減少する。最終的に、グリセロール水溶液が、分離されるより重い液相として第一の段階の分離機から取り出され、このようにさらなる処理に提供することを述べるべきである。
【００４１】
【実施例】
下記の中で、三つのすべての溶液の態様をもつ本発明による過程は、図によって説明される。
【００４２】
例１
操作相に到達するために、開始の相を、最初に実行しなければならないが、しかしながら、発明による過程の最適な限界値をまだ満たさない。
１Ａ 分裂
１）開始の相
第１の脂肪の分裂：（新鮮な酵素を伴う）
第一の段階の反応器には、３０．０ｋｇの、４の酸価をもつ（ＤＩＮ５３１６９及びＤＩＮ５３４０２による水酸化カリウム溶液に対する滴定によって確認された）Ｄｒ．Ｆｒｉｓｃｈｅ ＧｍｂＨ社の生の精製してない高オレイン酸ヒマワリ油９０プラス（登録商標）が、１２重量％のグリセロールを有するグリセリン／水の溶液からなり、３．０ｇの酢酸ナトリウムで緩衝された７．０ｋｇの緩衝溶液と一緒に投入される。油及び緩衝溶液の投入された混合物は、第一の段階の反応器に供給され、渦巻きポンプによる撹拌の下で循環され、３５乃至４０℃まで加熱される。その後、３０ｇの酵素‘ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ’ＯＦ３６０（Ｍｅｉｔｏ Ｓａｎｇｙｏ，Ｊａｐａｎからの粉末状固体の物体の形態にあるリパーゼ、３６００００Ｕ／ｇ（単位／ｇ））を加えた。
【００４３】
分裂の過程は、酸価の測定によりモニターされる。５０分後に、図２により、滴定によって決定された酸価は、総計１３５に達し、６８％の分裂度に対応する。分裂度は、滴定によって測定され、過程において投入される油に対して予測され得る遊離の脂肪酸及び副物質（side substance）又は副産物の混合物に対して計算される理論的な酸価（約１９９）で割られた、酸価（今の場合には１３５）から結果として生じる。ここで、その混合物は、もはや撹拌されず、もはや循環しない。攪拌器及び循環ポンプの両方のスイッチを切った後約５分で、安定した混合物は、分離された相、脂肪酸を含む有機相及びグリセロールを含む水相、を得るために第一の段階の遠心分離機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ社の分離機ＡＧのセルフクリーニング・ディスク・スタック遠心分離機ＳＡ１−０１）における遠心分離を受ける。この分離過程の間に、遠心分離機を通じたおよそ４０ｋｇ／時の反応器内容物の流れ、及び分離機のボウルは、１５分ごとに完全に水力学的に放出される。
【００４４】
およそ２ｋｇの酵素が濃縮された乳濁層は、ボウルの放出生成物として得られる。放出生成物は、有機相と水相の間の乳濁層で濃縮された酵素を含み、油、水、酵素及び緩衝溶液で満たされるか投入されようとしている第一の段階の反応器に供給される。水相は、約３６重量％まで分裂することによって生成するグリセロールが濃縮される。遊離のオレイン酸を有する液体の有機相は、ほとんど水相がなく、小さな残量の酵素のみを含む。遠心分離機を介して反応器の容器を放出し処理するとき、有機相の酸価は、相分離の間に起こるさらなる分裂によって１４２である。
【００４５】
２）開始の相
第二の脂肪の分裂:(新鮮な酵素を伴う)
第一のステップ又は段階のオレイン酸を含む有機相は、満たされようとしていると共に、次の反応の終了に混合した後、新たに１４８の酸価を有する（図３）、第二の脂肪の分裂段階における反応器に供給される。同じ反応器には、軟水から新鮮に調製された７．０ｋｇの緩衝溶液、３ｇの酢酸ナトリウム及び３０ｇの前述のリパーゼが供給される。６０分後に、酸価は、１９０以上であり、９５％以上の分裂度に対応する。ここで混合物は、もはや撹拌されず、もはや循環せず、第一の段階の場合におけるのと同じ条件下で第二の段階の分離機によって分離される。オレイン酸が濃縮された澄んだ有機相は、この分離ステップの間に、分離機のより軽い相の側から流れる。有機相から取り出されたこれは、短い経路の蒸留を受ける。
【００４６】
１２重量％のグリセロールをもつ水／緩衝溶液中のグリセロールは、重い相として遠心分離機から離れて流れて、満たされようとしている第一の段階の反応器へ戻される。酵素が濃縮された約２ｋｇの乳濁相は、ボウルの放出生成物として、結果として生じる。これは、第二の段階に満たされようとしている反応器に供給される。
【００４７】
３）操作中の相
第一の脂肪の分裂:（回収された酵素を伴う）
第一のステップの満たされる反応器は、第二の分離機段階（ここではまだ開始の相）の水／緩衝溶液の１２重量％のグリセロールと一緒に、３０．０ｋｇの前述の油が投入される。この混合物は、渦巻きポンプによって撹拌することにより循環され、３５乃至４０℃まで加熱される。その後、酵素及び前述のタイプの３ｇの新鮮なリパーゼが濃縮された乳濁に対応する‘開始の実験’の第一の分離機段階の２ｋｇのボウルの放出生成物もまた加える。
【００４８】
６０分後に、酸価は１３４（図４）であり、約６８％の分裂度に対応する。ここで、混合物は、開始の相におけるように分離され、重い相の側で、グリセロールの約３６重量％をもつ水溶液中のグリセロールは、流れ出て、過程から取り出される。
【００４９】
４）操作中の相
第二の脂肪の分裂:（回収された酵素を伴う）
供給される第二の段階の反応器は、オレイン酸を含む、第一の段階の有機相を得る。反応器の内容物を混合した後、この相は、１４２の酸価を有する。さらに、反応器には、‘開始の実験’における第二の分離機段階の２ｋｇのボウルの放出生成物、即ち、酵素及び補給用の５ｇの前述のタイプの新鮮なリパーゼが濃縮された乳濁も７．０ｋｇの上記の緩衝溶液も供給される。
【００５０】
６０分後に、酸価は、１８４であり（図５）、９３％の分裂度に対応する。反応生成物の放出は、開始の相におけるように達成され、流れ出るオレイン酸が濃縮された澄んだ有機相は、１８５の酸価を示す。１２重量％のグリセロール水／緩衝溶液は、分離され、分離機から流れ出る。約２ｋｇの酵素が濃縮された乳濁は、ボウルの放出によって得られる。
【００５１】
１Ｂ 短い経路の蒸留
５）短い経路の蒸留／脱ろう：
第二の段階におけるこのような様式で得られる生の脂肪酸（酸価１８４）は、可能性のある少量の湿気を分離するための前の脱ガス段階と共に、中間の容器として役立つ２００リットルの樽に集められ、ＵＩＣ，Ａｌｚｅｎａｕ−Ｈｏｒｓｔｅｉｎ社タイプＫＤ１０の減圧の短い経路の蒸留デバイスにおいて、短い経路の蒸留を受ける。例えば、蒸留を、０．０１４ｍｂａｒの全圧力で、及び１９１℃で実行する。次に、連続的に供給されてきた約重量８％の脂肪酸は、これらの条件下で沸騰することなく、残留物として蒸留手段の底に放出される。粗製の生成物における残りの９２重量％を、１９９乃至２００の酸価をもつオレイン酸、及びより低い蒸気圧をもつ脂肪酸の形態にある最も少量の副産物としてのみ蒸留する。この値は、測定精度の範囲内で、理論上計算された酸価に一致する。（値は、少量のより短い鎖の長さのより容易に揮発する脂肪酸によって、理論的な酸価よりわずかに高い。）
残留生成物は、脱ろうを受け、それによって、今のより高い脂肪酸（Ｃ２２及びより長い鎖の長さ）、ろう及び油の他のより高沸点の副産物は、固体の物体として結晶し、濾過によって分離される。
【００５２】
１Ｃ 分裂／蒸留残留物の再利用
６）油の残留物の再使用
油の残留物の再使用を、この過程の利点を実証するために研究所規模でアリコートとして実行した。これもまた、予備テストが、水による油の酵素的に触媒された転化と比較して非常によい条件を研究所規模で調節することができることを示したので、正当化された。
【００５３】
５００ｍｌの丸底フラスコ中で、Ｄｒ．Ｆｒｉｓｃｈｅ ＧｍｂＨによる９１．５ｇの生の精製してない高オレイン酸ヒマワリ油９０プラスと一緒の９１．５ｇのろ過された残留生成物、及び第二の分離機段階における４６．０ｇの前記緩衝された１２重量％の水中のグリセロール溶液を、調製して、１０００回転／分で磁石の攪拌器で混合した。混合物の酸価は、総計６４までになる。それをすると同時に、反応混合物を、湯浴で約４０℃まで加熱する。反応混合物を４０℃まで加熱した後、前述のテストに対して適切な量である１９ｇの量の前述のタイプのリパーゼを加えて、反応を、酸価によってモニターする（図６参照）。酸価の推移は、油の残留物の再利用が効率に関して過程を改善することを示す。
【００５４】
本実施例では、分裂反応器における温度を３５乃至４０℃に維持した。しかしながら、一般に、本発明による過程を、約２０℃及び９０℃の間で実行することができる。下限は、混合される液体の流動性によって決定されるのに対して、上限は、酵素の熱安定性及び液体混合物における最低の沸点によって決定される。
【００５５】
分裂の段階の数を増加させることができる、例えば、３つのステップで既に、グリセロール濃度を顕著に増加させることができる。
【００５６】
既に述べたように、本発明における第二及び第三の解決方法の態様によって、短時間の注目すべき高い分裂度を達成することができた後に、テスト実験の開始の相が示すように、それは９５％以上に到達することができる。しかしながら、この点において、第一の態様による手続き的アプローチは、より困難である。
【００５７】
単なる又は最後の分裂反応器で達成される分裂度は、広範囲に変動し得る。推薦可能なのは、８０％以下の値ではなく、過程の容量を十分に活用することができるように、好適な値は９０％以上である。
【００５８】
特異的な酵素をもつ特別の適用の場合には、それは、また６０％ほどの低い分裂度で働き得るかもしれない。
【００５９】
本発明による酵素の脂肪の分裂は、脂肪酸のエチルエステルに首尾良く適用されてきた。一般に、酵素的に分裂可能なエステルを、本発明の第二及び第三の態様による利点で分裂させることができる。第一の解決方法の態様によって過程を適用する可能性は、過程の中で生成されるアルコール及び脂肪酸の成分に依存する。
【００６０】
例２
しかしながら、６０ｇの上記の酵素ＯＦ３６０を使用して、１Ａで概説したように、さらなる実施例を実行した。二つの分裂の段階内における３０分の滞在時間の後のみ、例１において６０分後に達成された程度に対応する分裂度を、この実施例で達成することができるかもしれない。
【００６１】
例３
さらなる実施例を、１Ａで概説するように、しかし油の代わりに酵素としての６０ｇのＯＦ３６０及び脂肪としての牛脂（ｂｆｔ：漂白できる特選の牛脂）を使用して、実行した。牛脂は、従来の圧力の脂肪の分裂プラントにおいて一般的に高圧の加水分解を受ける牛脂の質に対応する質を有していた。また、高オレイン酸ヒマワリ油の容易さにおけるように、約９３％の同じ高い分裂度は、３０分後のみに到達することができるかもしれない。
【００６２】
例４
さらなる実施例を、１Ａで概説するように、しかし上記の非特異的な酵素ＯＦ３６０（６０ｇ）及び、トリグリセリド骨格の１，３の位置に化学的に結合した長い鎖の脂肪酸を特異的に分裂させることができる（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋによる液体状２００００Ｕ／ｇの１４４０ｇの）酵素Ｎｏｖｏｚｙｍ３８８の混合物（１５００ｇ）を使用して実行した。言い換えれば、Ｎｏｖｏｚｙｍ３８８は、１，３の位置に対する良好な位置特異性、２の位置に対する乏しい位置特異性を有するのに対して、典型的な非特異的な酵素としてのＯＦ３６０は、１，３の位置におけるエステル結合を単に非常に遅く分裂させる。更に、６０％のエルカ酸を有する３０ｋｇのハナマ油を、ヒマワリ油の代わりに当てた。１Ａにおけるような同じ条件を使用して、８０％の分裂度を達成することができるかもしれない。同様に、１Ｂ及び１Ｃで概説した方法のステップをこの例に連続的に適用することができるかもしれない。この結果は、Ｎｏｖｏｚｙｍ３８８が、エルカ酸の場合に主として占められる１，３の位置に対する良好な位置特異性を有するという、及び非特異的な酵素ＯＦ３６０もまた存在していたという事実によっていた。１，３の特異的な酵素及び非特異的な酵素のみを使用することは、同等な好結果を表さなかった。
【００６３】
図２乃至６は、明らかに、分裂反応の速度低下が、その速度低下が反応時間が増加する共に大きくなるように変動することを示す。
【００６４】
【発明の効果】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による実施例を示す産業上の過程に対する例の概略図を示す。
【図２】過程の異なる段階中に起こる転化された油の増加する酸価を示す図である。
【図３】過程の異なる段階中に起こる転化された油の増加する酸価を示す図である。
【図４】過程の異なる段階中に起こる転化された油の増加する酸価を示す図である。
【図５】過程の異なる段階中に起こる転化された油の増加する酸価を示す図である。
【図６】過程の異なる段階中に起こる転化された油の増加する酸価を示す図である。
【符号の説明】
な し

Claims (9)

1. 生体触媒として作用するリパーゼを利用する脂肪酸及びグリセロールを得るためにトリグリセリドを酵素的に分裂させる方法であって、
   トリグリセリド、水、及びリパーゼを含む混合物を調製するステップ、
   前記混合物にグリセリド分裂反応を、前記混合物に対する前記分裂反応の速度低下が予め設定された値以下である、分裂度に到達するまで、受けさせるステップ、
   グリセロールを含む水相及び分裂した遊離の脂肪酸を含む部分的に分裂した有機相を含む、前記分裂反応の前記反応混合物から、第一に前記分裂した遊離の脂肪酸を含む前記部分的に分裂した有機相から前記水相を分離することによって、次に前記分離された部分的に分裂した有機相から前記遊離の脂肪酸を分離することによって、得られる前記脂肪酸を分離するステップ、並びに
   前記分裂反応へ、前記遊離の脂肪酸のない前記有機相の、得られた残留物をフィードバックするステップ、
   を含むと共に、
   前記分離するステップは、
   分裂した遊離の脂肪酸を含む有機相から前記分裂させる過程で得られるグリセロールを含む水相を分離するために、前記反応混合物を自己洗浄性の遠心分離機へ供給することによって、前記分裂反応の前記反応混合物に遠心分離ステップを受けさせるステップ、
   前記水相と前記有機相の間で発達すると共にリパーゼが濃縮された界面の乳濁状の層が前記分離機内に蓄積するように前記分離機を調節するステップ、
   予め決められた時間の後に前記遠心分離機からボウルの内容物を放出させるステップ、及び
   前記グリセリドを分裂させるステップへ前記分離機の前記放出されたボウルの内容物をフィードバックするステップ
   を含む、方法。
2. 前記分裂反応は、６０％及び９５％の間における分裂度に到達するまでのみ実行され、
   前記遊離の脂肪酸を分離するために、前記分離された部分的に分裂した有機相は、短行程蒸留及び流下薄膜蒸留から選択される減圧蒸留を受ける
   請求項１に記載の方法。
3. 生体触媒として作用するリパーゼを利用する脂肪酸及びグリセロールを得るためにトリグリセリドを酵素的に分裂させる方法であって、
   トリグリセリド、水、及びリパーゼを含む混合物を調製するステップ、
   前記混合物にグリセリド分裂反応を受けさせるステップ、
   分裂した遊離の脂肪酸を含む有機相から前記分裂させる過程で得られたグリセロールを含む水相を分離するために、前記反応混合物を自己洗浄性の遠心分離機へ供給することによって、前記分裂反応の前記反応混合物に遠心分離ステップを受けさせるステップ、
   前記水相と前記有機相の間で発達すると共にリパーゼが濃縮された界面の乳濁状の層が前記分離機内に蓄積するように前記分離機を調節するステップ、
   予め決められた時間の後に前記遠心分離機からボウルの内容物を放出させるステップ、並びに
   前記グリセリドを分裂させるステップへ前記分離機の前記放出されたボウルの内容物をフィードバックするステップ
   を含む方法。
4. 生体触媒として作用するリパーゼを利用する脂肪酸及びグリセロールを得るためにトリグリセリドを酵素的に分裂させる方法であって、
   トリグリセリド、水、及びリパーゼを含む混合物を調製するステップ、
   単一の脂肪を分裂させる段階、又は複数の脂肪を分裂させる段階の各一つに対して、循環ループが供給されると共に、内容物をポンプ手段によって循環させることができるように操作可能である、複数の並列の分裂ループ反応器を提供するステップ、
   前記反応器が満たされる間、前記反応器の前記循環ループは活動せず、前記混合物を前記反応器の最初の一つに供給するステップ、
   同時に分裂の操作モードにおいて、活動中の循環ループとともに、同じ段階の第二の反応器を操作するステップ、
   同時に、前記循環ループが活動せず、前記反応器の内容物は、遠心分離機へ放出されるように、前記同じ段階の第三の反応器を操作するステップ、
   分裂した遊離の脂肪酸を含む有機相から前記分裂させる過程で得られるグリセロールを含む水相を分離するために前記遠心分離機を操作するステップ、並びに
   前記分離された有機相から前記遊離の脂肪酸を分離するステップ、
   を含むと共に、
   前記分離するステップは、
   分裂した遊離の脂肪酸を含む有機相から前記分裂させる過程で得られるグリセロールを含む水相を分離するために、前記反応混合物を自己洗浄性の遠心分離機へ供給することによって、前記分裂反応の前記反応混合物に遠心分離ステップを受けさせるステップ、
   前記水相と前記有機相の間で発達すると共にリパーゼが濃縮された界面の乳濁状の層が前記分離機内に蓄積するように前記分離機を調節するステップ、
   予め決められた時間の後に前記遠心分離機からボウルの内容物を放出させるステップ、及び
   前記グリセリドを分裂させるステップへ前記分離機の前記放出されたボウルの内容物をフィードバックするステップ
   を含む、方法。
5. 前記得られた有機相からの前記脂肪酸の前記分離の後に残る前記有機相の残留物は、脱ろうされ、次に前記分裂させる過程へ戻される
   請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
6. 前記分裂反応は、二つの段階で実行され、
   各段階において、所望の分裂度の一部分が達成され、
   前記第二の段階から得られた前記グリセロールの水相は、前記第一の段階に水相として供給され、
   前記第二の段階は、水相としての新鮮な水、及びさらに前記第一の段階で得られた前記有機相が供給される
   請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
7. 脱ろうステップを受けた後、前記有機相の前記残留物は、トリグリセリド、水、及びリパーゼを含む分裂する新鮮な混合物と混合される
   請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
8. 前記自己洗浄性の遠心分離機を離れる前記有機相は、前記分裂させる過程へ前記量を戻すための、前記ボウルの壁における付着物の形態で分離される任意の残留した酵素を回収するために、またボウルの内容物の断続的な放出をする洗浄遠心分離機の形態にあるさらなる自己洗浄性の分離機に供給される
   請求項１乃至７いずれかに記載の方法。
9. ソープストックのモノ、ジ、及びトリグリセリドを分裂させるために適用される
   請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。

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