JP3799059B2 - ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチドに作用する抗体 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチドに作用する抗体、それらの調製方法およびそれらの使用に関する。
ヒスチジン融合ポリペプチドの型でポリペプチドを発現させることは、公知である。かかるポリペプチドにおいて、例えば、６〜１８個の連続したヒスチジン残基等のヒスチジン部分を、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合させる。よって、それを発現する細胞の上清または細胞溶解液から、ニッケル−キレートクロマトグラフィーカラムによりヒスチジン融合ポリペプチドを単離することが可能である。
しかしながら、前記カラムは高価である。さらに、その使用は、多くの時間を消費する。したがって、ヒスチジン融合ポリペプチドの発現を迅速に検出するには適さない。しかし、かかる検出は、特に、多くの細胞をスクリーニングするために使用するときに必要である。
したがって、本発明の目的は、ヒスチジン融合ポリペプチドの発現を迅速に検出できる手段を提供することにある。
本発明によれば、このことは、ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチドに対する抗体により達成される。
かかる抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体が好ましい。抗体は、動物またはヒトから得られてもよく、ポリクローナル抗体に対してはラビットが好ましく、モノクローナル抗体に対してはマウスが好ましい。
また、抗体は合成されてもよく、前記同定に必要でない部分は、それぞれ、任意に抗体から全部または一部を欠失してもよく、これらの部分は、抗体にさらなる有利な性質を与える他の物で置換されてもよい。
「ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチド」という用語は、ヒスチジン部分を有するいかなる種類および長さのポリペプチド（ペプチド）からなるものである。かかるポリペプチドは、例えば、細菌、酵母、昆虫、植物および動物細胞ならびにトランスジェニック動物等の生物等いかなる細胞により発現されてもよい。前記ヒスチジン部分は、例えば、６〜１８個、好ましくは６個の連続したヒスチジン残基からなってもよく、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合してもよい。
本発明の好ましい抗体、すなわち、前記同定を有するモノクローナルマウス抗体は、１９９５年２月１５日に、ＤＳＭ（微生物のドイツタイプコレクション）でＮｏ．ＡＣＣ ２２０７の下で寄託された。
本発明の抗体は、通常の方法により調製することができる。それぞれ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製する際に、例えば、Ｈｉｓ ｐ５３（独国特許出願Ｐ４２ ３２ ８２３．３を参照）またはＨｉｓ ｈｄｍ２（独国特許出願Ｐ４３ ３９ ５５３．３を参照）等の前記ヒスチジン融合ポリペプチドを用いて動物、特に、前者抗体に対してはラビットを、後者抗体に対してはマウスを免疫することが有利であり、それらの混合物を用いることが好ましい。動物は、さらに、同じ１または複数のヒスチジン融合ポリペプチドでブーストすることができる。他のヒスチジン融合ポリペプチドまたはそれらと前記１もしくは複数のヒスチジン融合ポリペプチドの組み合わせも、ブースターに用いてもよい。次いで、動物の血清からポリクローナル抗体を得る。モノクローナル抗体に対しては、動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させる。
合成抗体の調製のために、例えば、前記得られたモノクローナル抗体を基礎として使用してもよい。この目的のために、モノクローナル抗体の抗原結合領域を分析し、前記同定のために必要な部分および必要でない部分を同定することが明白なことである。次いで、それぞれ、必要な部分は修飾してもよく、必要でない部分は全部または一部を除去して、抗体にさらなる有利な性質を与える部分で置換することができる。また、部分は、抗体の結合領域を越えて、修飾、除去または置換することができる。当業者には、特に、ＤＮＡ組み換え技術が前記処置に適することが公知である。当業者は、これらのことに完全に精通している。
本発明の抗体は、ヒスチジン部分を有するいかなる融合ポリペプチドも認識するという点で顕著である。したがって、抗体は、かかる融合ポリペプチドの発現の迅速な検出に適する。このことは、特に、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法または免疫蛍光法等のいかなる検出方法で行なってもよい。この目的のために、もし適当ならば、本発明の抗体を標識してもよいし、本発明の抗体に対する標識抗体と組み合わせて使用してもよい。
以下の実施例により、本発明を説明する。
実施例１：モノクローナル抗体の調製
マウスを免疫化に使用した。Ｈｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸１〜２８４）、Ｈｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸５８〜４９１）およびＨｉｓ ｐ５３（アミノ酸６６〜３９３）（前記参照）を抗原として用いた。８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌからなる緩衝液に、それらを溶解した。
免疫およびブースターのパターン：
２６２日目にマウスを殺した。マウスから脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合させた。モノクローナル抗体が得られた。それらの１つを、１９９５年２月１５日に、ＤＳＭでＡＣＣ ２２０７の下で寄託した。
実施例２：ポリクローナル抗体の調製
ラビットを免疫化に使用した。実施例１の抗原を用いた。免疫化およびブースターのパターンは、９０日目まで実施例１のパターンと同一であった。
実施例３：本発明の抗体によるヒスチジン融合ポリペプチドの検出
（ａ）ウエスタンブロット
ヒスチジン融合ポリペプチド、すなわち、実施例１のＨｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸１〜２８４）、Ｈｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸５８〜４９１）およびＨｉｓ ｐ５３（アミノ酸６６〜３９３）ならびに対照としてのポリペプチドｈｄｍ２（アミノ酸１〜２８４）、ＷＡＦ１（野生型活性化因子）およびｔ１６（細胞制御蛋白質）を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ゲルを一晩、ニトロセルロース膜に転移させた。次いで、該膜を、それぞれ、１：１０および１：５０の比で希釈した前記抗体ＡＣＣ ２２０７とともに、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いる数回の洗浄工程の後、市販のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（製造業者の指示に従って希釈）を添加した。３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳを用いる数回の洗浄工程後、発色溶液（３６μＭ ５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、４００μＭ ニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2）を含むアルカリホスファターゼを用いて、バンドが見えるまで、室温でアルカリホスファターゼ検出反応を行なった。
本発明の抗体ＡＣＣ ２２０７は、特異的にヒスチジン融合ポリペプチドを認識するが、ヒスチジン部分のないポリペプチドを認識しないことがわかった。
（ｂ）ＥＬＩＳＡ
ウエル当たり、ヒスチジン融合ポリペプチドおよび（ａ）の対照をそれぞれ２０ｎｇおよび８ｎｇ含む各１００μｌを有する９６ウエルのプレートを準備した。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳを用いる３回の簡単な洗浄工程を行なった。その後、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて、３７℃で１時間のインキュベーションにより、ポリマー担体の未結合部位をブロックした。１：１０および１：５０の比でそれぞれ希釈した本発明の抗体ＡＣＣ ２２０７を、３７℃で１時間プレート上でインキュベートした。ＰＢＳを用いる８回の洗浄工程後、（ａ）のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、８回洗浄工程を行ない、その後、発色溶液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．４ｍＭ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン ジヒドロクロリド、４．４ｍＭ Ｈ2Ｏ2）を用いて、バンドが見えるまで、室温でペルオキシダーゼ検出反応を行なった。
本発明の抗体ＡＣＣ ２２０７は、特異的にヒスチジン融合ポリペプチドを認識するが、ヒスチジン部分のないポリペプチドを認識しないことがわかった。
ヒスチジン融合ポリペプチドの型でポリペプチドを発現させることは、公知である。かかるポリペプチドにおいて、例えば、６〜１８個の連続したヒスチジン残基等のヒスチジン部分を、ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に融合させる。よって、それを発現する細胞の上清または細胞溶解液から、ニッケル−キレートクロマトグラフィーカラムによりヒスチジン融合ポリペプチドを単離することが可能である。
しかしながら、前記カラムは高価である。さらに、その使用は、多くの時間を消費する。したがって、ヒスチジン融合ポリペプチドの発現を迅速に検出するには適さない。しかし、かかる検出は、特に、多くの細胞をスクリーニングするために使用するときに必要である。
したがって、本発明の目的は、ヒスチジン融合ポリペプチドの発現を迅速に検出できる手段を提供することにある。
本発明によれば、このことは、ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチドに対する抗体により達成される。
かかる抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体が好ましい。抗体は、動物またはヒトから得られてもよく、ポリクローナル抗体に対してはラビットが好ましく、モノクローナル抗体に対してはマウスが好ましい。
また、抗体は合成されてもよく、前記同定に必要でない部分は、それぞれ、任意に抗体から全部または一部を欠失してもよく、これらの部分は、抗体にさらなる有利な性質を与える他の物で置換されてもよい。
「ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチド」という用語は、ヒスチジン部分を有するいかなる種類および長さのポリペプチド（ペプチド）からなるものである。かかるポリペプチドは、例えば、細菌、酵母、昆虫、植物および動物細胞ならびにトランスジェニック動物等の生物等いかなる細胞により発現されてもよい。前記ヒスチジン部分は、例えば、６〜１８個、好ましくは６個の連続したヒスチジン残基からなってもよく、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合してもよい。
本発明の好ましい抗体、すなわち、前記同定を有するモノクローナルマウス抗体は、１９９５年２月１５日に、ＤＳＭ（微生物のドイツタイプコレクション）でＮｏ．ＡＣＣ ２２０７の下で寄託された。
本発明の抗体は、通常の方法により調製することができる。それぞれ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製する際に、例えば、Ｈｉｓ ｐ５３（独国特許出願Ｐ４２ ３２ ８２３．３を参照）またはＨｉｓ ｈｄｍ２（独国特許出願Ｐ４３ ３９ ５５３．３を参照）等の前記ヒスチジン融合ポリペプチドを用いて動物、特に、前者抗体に対してはラビットを、後者抗体に対してはマウスを免疫することが有利であり、それらの混合物を用いることが好ましい。動物は、さらに、同じ１または複数のヒスチジン融合ポリペプチドでブーストすることができる。他のヒスチジン融合ポリペプチドまたはそれらと前記１もしくは複数のヒスチジン融合ポリペプチドの組み合わせも、ブースターに用いてもよい。次いで、動物の血清からポリクローナル抗体を得る。モノクローナル抗体に対しては、動物の脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させる。
合成抗体の調製のために、例えば、前記得られたモノクローナル抗体を基礎として使用してもよい。この目的のために、モノクローナル抗体の抗原結合領域を分析し、前記同定のために必要な部分および必要でない部分を同定することが明白なことである。次いで、それぞれ、必要な部分は修飾してもよく、必要でない部分は全部または一部を除去して、抗体にさらなる有利な性質を与える部分で置換することができる。また、部分は、抗体の結合領域を越えて、修飾、除去または置換することができる。当業者には、特に、ＤＮＡ組み換え技術が前記処置に適することが公知である。当業者は、これらのことに完全に精通している。
本発明の抗体は、ヒスチジン部分を有するいかなる融合ポリペプチドも認識するという点で顕著である。したがって、抗体は、かかる融合ポリペプチドの発現の迅速な検出に適する。このことは、特に、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法または免疫蛍光法等のいかなる検出方法で行なってもよい。この目的のために、もし適当ならば、本発明の抗体を標識してもよいし、本発明の抗体に対する標識抗体と組み合わせて使用してもよい。
以下の実施例により、本発明を説明する。
実施例１：モノクローナル抗体の調製
マウスを免疫化に使用した。Ｈｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸１〜２８４）、Ｈｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸５８〜４９１）およびＨｉｓ ｐ５３（アミノ酸６６〜３９３）（前記参照）を抗原として用いた。８Ｍ 尿素、１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌからなる緩衝液に、それらを溶解した。
免疫およびブースターのパターン：
実施例２：ポリクローナル抗体の調製
ラビットを免疫化に使用した。実施例１の抗原を用いた。免疫化およびブースターのパターンは、９０日目まで実施例１のパターンと同一であった。
（ａ）ウエスタンブロット
ヒスチジン融合ポリペプチド、すなわち、実施例１のＨｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸１〜２８４）、Ｈｉｓ ｈｄｍ２（アミノ酸５８〜４９１）およびＨｉｓ ｐ５３（アミノ酸６６〜３９３）ならびに対照としてのポリペプチドｈｄｍ２（アミノ酸１〜２８４）、ＷＡＦ１（野生型活性化因子）およびｔ１６（細胞制御蛋白質）を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。ゲルを一晩、ニトロセルロース膜に転移させた。次いで、該膜を、それぞれ、１：１０および１：５０の比で希釈した前記抗体ＡＣＣ ２２０７とともに、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いる数回の洗浄工程の後、市販のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体（製造業者の指示に従って希釈）を添加した。３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳを用いる数回の洗浄工程後、発色溶液（３６μＭ ５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、４００μＭ ニトロブルーテトラゾリウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2）を含むアルカリホスファターゼを用いて、バンドが見えるまで、室温でアルカリホスファターゼ検出反応を行なった。
本発明の抗体ＡＣＣ ２２０７は、特異的にヒスチジン融合ポリペプチドを認識するが、ヒスチジン部分のないポリペプチドを認識しないことがわかった。
（ｂ）ＥＬＩＳＡ
ウエル当たり、ヒスチジン融合ポリペプチドおよび（ａ）の対照をそれぞれ２０ｎｇおよび８ｎｇ含む各１００μｌを有する９６ウエルのプレートを準備した。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳを用いる３回の簡単な洗浄工程を行なった。その後、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて、３７℃で１時間のインキュベーションにより、ポリマー担体の未結合部位をブロックした。１：１０および１：５０の比でそれぞれ希釈した本発明の抗体ＡＣＣ ２２０７を、３７℃で１時間プレート上でインキュベートした。ＰＢＳを用いる８回の洗浄工程後、（ａ）のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を添加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、８回洗浄工程を行ない、その後、発色溶液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、０．４ｍＭ ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン ジヒドロクロリド、４．４ｍＭ Ｈ2Ｏ2）を用いて、バンドが見えるまで、室温でペルオキシダーゼ検出反応を行なった。
本発明の抗体ＡＣＣ ２２０７は、特異的にヒスチジン融合ポリペプチドを認識するが、ヒスチジン部分のないポリペプチドを認識しないことがわかった。
Claims (8)
- ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチドに対する抗体であって、該抗体がヒスチジン部分に対するものであり、ヒスチジン部分が６〜１８個のヒスチジン残基からなるものである、ヒスチジン部分のないポリペプチドを認識しない抗体。
- ポリクローナルであることを特徴とする、請求項１記載の抗体。
- モノクローナルであることを特徴とする、請求項１記載の抗体。
- ＤＳＭ（微生物のドイツタイプカルチャーコレクション）でＡＣＣ ２２０７の下で寄託されていることを特徴とする、請求項３記載の抗体。
- ヒスチジン融合ポリペプチドを用いてヒト以外の動物を免疫し、
（ａ）ポリクローナル抗体を動物の血清から得る、または
（ｂ）モノクローナル抗体を動物の脾臓細胞とミエローマ細胞との融合後に得ることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の抗体の調製方法。 - ヒスチジン融合ポリペプチドの混合物を免疫化のために使用することを特徴とする、請求項５記載の方法。
- ヒスチジン部分を有する融合ポリペプチドの検出方法における、請求項１〜４いずれか記載の抗体の使用。
- 検出方法が、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法または免疫沈降法である請求項７記載の使用。
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