JP3658654B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明はmRNAの翻訳のエンハンサーに関する。
【0002】
真核生物及び原核生物が翻訳を開始するメカニズムは、一部共通の特徴を有しているが、他の点では異なっていることが知られている。真核生物のメッセージは機能上モノシストロニック(monocistronic )であって、翻訳は5′末端で始まり、この末端におけるキャップ構造(m7G5′ppp5′G...)の存在によって促進される〔シャトキン,セル,第9巻,第645頁,1976年(Shatkin, Cell, 9, 645 (1976)〕。原核生物のメッセージはポリシストロニック(polycistronic)であって、5′末端以外の部位で開始しうるが、キャップの存在は翻訳促進に繋がらない。真核生物及び原核生物は双方ともコドンAUGで翻訳を開始するが、但し原核生物はGUGを利用することもできる。双方における翻訳は、開始コドン近くのある配列によって促進される。原核生物の場合には、それは所謂シャイン‐ダルガルノ(Shine-Dalgarno)配列(開始コドンより上流のプリンに富む3〜10ヌクレオチドの領域)である。真核生物の場合には、それは(AUG開始コドンのAが+1と表示される場合に)−3位のプリン及び+4位のG残基であるが、更に効果的なチューニング(tuning)のためには他の配列も加わる必要がある。これはスキャニング(scanning)モデルの“緩和”バージョン("relaxed" version )の一部であり〔コザック,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第12巻,第857頁,1984年(kozak, Nucleic Acids Research, 12, 857 (1984))〕、それによって40Sリボソームサブユニットが真核生物mRNAの5′末端で結合し、モデルの要求を満たす最初のAUGと出会うまで、即ち60Sサブユニットが40Sサブユニットと結合してタンパク質合成が始まる時点まで、配列をスキャニングし続ける。この点については、下記コザックの文献を参考にすることができる:セル,第15巻,第1109頁,1978年;ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第9巻,第5233頁,1981年;及びセル,第44巻,第283頁,1986年。
【0003】
開始コドンの中及び近辺で必要なこれらの配列以外に、翻訳を複製の面で促進させることが知られた他のmRNA領域は存在しない。
真核生物の転写において、“エンハンサー”領域として知られる配列は転写促進を図ることができる。
RNAウイルスは、正もしくは負の一重鎖RNA又は二重鎖RNAを含んでいる。RNAウイルス群としては、大多数の植物ウイルス(90%以上)、一部の動物ウイルス及び数種のバクテリオファージがある。
【0004】
RNAウイルスの中で最も広く研究されたものの1つは、タバコモザイクウイルス(以後TMVと称される)である。TMVの完全ヌクレオチド配列が知られている〔ゲレットら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス USA,第79巻,第5818頁,1982年(Goelet et al., Proceeding of National Academy of Science USA, 79, 5818(1982))〕。TMV RNAの5′領域は鎖長70ヌクレオチドのRNアーゼT1耐性断片として1965年に始めて単離されたが〔マンドリー,ツァイトシュリフト・フュール・フェレルブングスレーレ,第97巻,第281頁,1965年( Mundry, Zeitschrift fur Vererbungslehre, 97, 281 (1965) )〕、内部G残基を有していなかった〔マンデレル,ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー,第243巻,第3671頁(Mandeles, Journal of Biological Chemistry, 243,3671)〕。この領域〔以後、オメガと称される;マンデレス,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Molecular Biological Chemistry ),第243巻,第3671頁〕は配列決定され〔リチャーズら,ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー,第84巻,第513頁,1978年(Richards et al., European Journal of Biochemistry, 84, 513 (1978))〕、小麦麦芽リボソームと二重(disome)開始複合体を形成することが示された。1つのリボソームは、126キロドルトン(KDa)のタンパク質コード領域のAUG開始部位を占めており、第二のものは上流リーダー配列と結合している〔フィリポウィクズ(Filipowicz)及びヘッニ(Haenni),プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第76巻,第3111頁,1979年;コナルスカら,ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー,第114巻,第221頁,1981年(Konarska et al., European Journal of Biochemistry, 114, 221 (1981) )〕。リボソーム会合におけるオメガの役割を支持するもう1つの最近の証拠は、ウィルソン(Wilson)及び共同研究者の脱外被(uncoating )/遺伝子発現データからきている〔ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイロロジー,第66巻,第1201頁,1985年(Journal of General Virology,66, 1201 (1985) )及びUCLAシンポジウム,第54巻,第159頁,1987年(UCLA Symposium, 54, 159(1987))で差違検討されている〕。TMV粒子が5′末端へのリボソームの結合及び3′末端方向へのそれらの翻訳移動によって脱外被されていることは、様々なインビトロ翻訳系で観察された。
【0005】
RNAウイルスの5′領域はmRNAの翻訳エンハンサーとして機能することが、ここに発見されたのである。
第一面として、本発明はウイルスRNAの最初の開始コドンまでのRNAウイルスの5′‐リーダー配列(又はその誘導体もしくは部分)を含むmRNAを提供するが、このmRNAはリーダー配列を供与するウイルスに由来しない下流配列も含んでいる。
【0006】
第二面として、本発明はウイルスRNAの最初の開始コドンまでのRNAウイルスの5′‐リーダー配列(又はその誘導体もしくは部分)と相補的なDNA配列を提供する。
【0007】
第三面として、本発明は、プロモーター、ウイルスRNAの最初の開始コドンまでのRNAウイルスの5′‐リーダー配列(又はその誘導体もしくは部分)と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープン読取枠を含んでいるDNA配列を提供する。本発明はこのようなDNA配列を含む発現ベクターをも提供する。
【0008】
第四面として、本発明は、ウイルスRNAの最初の開始コドンまでのRNAウイルスの5′‐リーダー配列(又はその誘導体もしくは部分)における、RNAとしての又は相補的DNAとしての、即ち5′‐リーダーRNAがmRNAと接続している場合のmRNAの翻訳のエンハンサーとしての用途を提供する。
【0009】
配列決定されたほとんどのRNAウイルスは、5′‐リーダー配列、即ち最初の開始コドンまでの(但し、それを含まない)5′末端における配列を含んでいる。いずれのRNAウイルスからの適切な5′‐リーダー配列も、本発明の翻訳エンハンサーとして使用可能である。
【0010】
前記のように、TMVの5′‐リーダー配列+AUG開始コドンはオメガとして知られており、かつそのヌクレオチド配列も公知であるため(リチャーズら,ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー,第84巻,第513頁,1978年)、cDNAは合成することができる。TMVのオメガプライム(Ω′,図1参照)配列は、本発明の好ましい翻訳エンハンサーを表わしている。
【0011】
下記のような他のRNAウイルスの5′‐リーダー配列による翻訳増強に関する情報も利用可能である:
カブ黄斑モザイクウイルスゲノムRNA(フィリポウィクズ及びヘッニ,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第76巻,第3111頁,1979年)、ブロウム(brome)モザイクウイルスRNA3、アルファルファモザイクウイルスRNA4(ゲレットら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第79巻,第5818頁,1982年);ラウス肉腫ウイルス〔ジェイ・エル・ダーリックス(J.L. Darlix)ら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第10巻,第5183頁,1982年〕。
【0012】
いずれの具体的ケースにおいても、翻訳エンハンサーとしての機能が調節されるもののそれが損われないような方法で天然5′‐リーダー配列を変えることは、ほぼ確実に可能であろう。このような変異体は本明細書において“誘導体”と呼ばれているが、天然配列の誘導体及びそれらの翻訳エンハンサーとしての用途は本発明の一部を構成している。天然5′‐リーダー配列(又は誘導体配列)の一部のみが翻訳増強を起こすために必要とされるケースもあるであろう。配列のこのような一部は本明細書において“部分”と呼ばれているが、天然配列もしくはその誘導体の部分及びそれらの翻訳エンハンサーとしての用途は本発明の一部を形成している。
【0013】
いずれの具体的ケースにおいても、RNAウイルスの5′‐リーダーのヌクレオチド配列の決定は、公知かつ易利用性の技術を用いる当業者の技術的範囲内にあるべきである。同様に、翻訳増強のために必要な天然5′‐リーダー配列の一部及び修正もしくは削除されうる配列の同定(即ち、天然配列の誘導体及び部分の同定)は、ルーチン的実験により決定されうる問題である。
【0014】
RNAウイルスの5′‐リーダー配列(又はその誘導体もしくは部分)は、例えばT4RNAリガーゼを用いて適切なmRNAの上流にそれらを結合させることによって、それ自体を本発明の翻訳エンハンサーとして使用することができる。5′‐リーダー配列は下流mRNAの開始コドンのすぐ隣であってもよいし、又は介在配列によってそれから離されていてもよい。しかしながら、相補的DNAの形で5′‐リーダー配列を用いることが好ましい。cDNAは望ましいいかなる方法でも得ることができる。しかしながら、問題の5′‐リーダー配列の比較的短い鎖長を考慮すれば、cDNAを化学的に合成することが通常最も好都合であろう。cDNAは通常発現ベクターに組込まれる。発現ベクターは、ベクター中に含まれているそれらのDNA配列を発現させることができ、かつそのDNA配列がそれらの発現を行なわせうる他の配列と作働可能に結合せしめられているのであれば、いかなるベクターであってもよい。発現ベクターは、プロモーター、ウイルスRNAの最初の開始コドンまでの(但しそれを含まない)RNAウイルスの5′‐リーダー配列(又はその誘導体もしくは部分)と相補的な配列及び適切な開始コドンを含むオープン読取枠を有するDNA配列を通常含んでいる。オープン読取枠は通常重要な1種以上のタンパク質についてコードしている。発現ベクターは、DNA配列が転写及び翻訳により発現される宿主細胞中に安定的に又は一時的に直接組込まれる。安定的発現の場合には、ベクターはエピソームとして又は染色体DNAの必須部分として宿主中で複製可能でなければならない。又は、発現ベクターはインビトロで転写させることができ、その際にはRNAが一時的発現のために細胞中に直接組込まれる。
【0015】
本発明の翻訳エンハンサーは、mRNAの翻訳能力を高めることが望まれるいかなる状況下においても使用可能である。しかしながら、エンハンサーの効果はそれが存在しなければ不十分にしか翻訳されないmRNAの場合において最も著しいことに留意すべきである。したがって、本発明のキャップもしくはエンハンサー又は双方の付加は翻訳を促進させることになる。既にキャップを有しているmRNAの場合であっても、本発明のエンハンサーの効果はなお存在している。
【0016】
本発明の翻訳エンハンサーは、例えば植物細胞、細菌及び動物細胞のような多数の異なるタイプの発現系において有効であるが、但し特定のエンハンサーは他の系よりむしろ1つの系とより適合するようである。例えばインビトロ試験時におけるTMVのオメガ配列はウサギ網状赤血球溶解物系の場合よりも小麦麦芽系及び大腸菌(Escherichia coli)の場合により大きな増強性を示すようであるが、翻訳の増強自体は3種すべての系で観察される。特定のエンハンサーと特定の発現系との適合性は、通常当業者の技術的範囲内に十分属する事項であろう。
【0017】
一般的に、本発明の翻訳エンハンサーは、農業を含む商業面に対する生物又は細胞系の価値がその天然遺伝子又は人工産生遺伝子の1つの発現レベルによって決定される場合であれば、いずれにおいても利点を生かしつつ用いることができる。
(i) 遺伝子工学生物又は細胞系で商業的に有用なタンパク質の産生に際して。
(ii) 酵素で触媒される中間代謝産物の産生速度が特定酵素の合成速度を増加させることによって高められうるような発酵に際して。
(iii) ウイルス感染の影響がウイルス弱毒体との前接触によって抑制させることができ、かつ保護を付与する成分の産生レベルを増加させることにより保護レベルを高めることが有利であるようなウイルス交差保護に際して。例えば植物は、ウイルス外被(coat)タンパク質についてコードするTMV RNA部分のcDNAコピーを含むアグロバクテリウム(Agrobacterium )遺伝子工学株にそれらを接触させることによってTMV感染から保護することができる。植物ゲノムに挿入された細菌cDNAは、ウイルス自体による感染から植物を保護する外被タンパク質を連続的に発現する。
(iv) 除草剤耐性等の性質が植物の中間代謝の人工的修正によって付与されるような植物の遺伝子工学に際して。
(v) 例えば、部分的クローンの発現産物に対する抗体を産生させることが望まれている場合における、遺伝子の部分的クローンの発現に際して。
【0018】
本発明は下記実験操作によって更に詳細に説明されている。
実 験
mRNA
本発明の態様のキメラmRNAを、図1で示されているように、下記方法で産生した。
TMV RNAブルガレ(vulgare )株の配列を用いて(ゲレットら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第79巻,第5818頁,1982年)、126kDaオープン読取枠のAUG開始コドンの上流において5′キャップ(m7Gppp及び隣接G残基)を含まない67塩基配列に対して相補的なDNA配列を含む81塩基オリゴヌクレオチドを合成した。この配列はオメガプライムと呼ばれている。HindIII部位をこのオリゴヌクレオチドの5′末端に組込み、かつSalI部位を3′末端に組込んだ。オメガプライム配列の3′末端における13塩基及びSalI部位を含む20塩基の第二オリゴヌクレオチドを、第二鎖合成用のプライマー(primer)として合成した。アニーリング(annealing )後、第二鎖合成はDNAポリメラーゼIのクレノウ断片を用いて完了させた。
【0019】
得られた二重鎖81bp断片をHindIII/SalIで消化させて一重鎖付着端をもつ77bp断片を作成し、pUC19の対応部位に挿入した。合成の結果TMVのオメガプライム配列が正しい向きをしているという事実は、ジデオキシ鎖ターミネーション法〔サンガ(Sanger)ら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第74巻,第5463頁,1977年〕を用いた配列分析によって立証された。次いで、TMVのオメガプライムを含む断片をプラスミドpJII1のHindIII/SalI部位に組込み、pJII101を得た。pJII1は、BamHI断片としてのアセンブリー(assembly)配列のTMV源をpSP64の対応部位に挿入し〔メルトン(Melton),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第12巻,第7035頁,1984年〕、かつSmaI部位をBglII部位に変えることにより〔スリートら,バイオロジー,第155巻,第299頁,1986年(Sleat et al., Virology, 155, 299 (1986) )〕得られる。
【0020】
Tn9のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(CAT)を含むpCM1から779bpSalI末端断片〔クローズ及びロドリゲス,ジーン,第20巻,第305頁,1982年(Close and Rodriguez, Gene, 20, 305 (1982) )〕をpJII1及びpJII101のSalI部位に組込み、それぞれpJII2及びpJII102を得た。Tn5のネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子(NPTII)を含むpKNR‐Hからの1.2kb BglII/SalI断片〔ギャリーら,ジャーナル・オブ・バイテリオロジー,第161巻,第1034頁,1985年(Gallie et al., Journal of Bacteriology, 161, 1034 (1985))〕をクレノウ断片でブラント末端化し、pJII1及びpJII101のAccI部位に組込み、それぞれpJII3及びpJII103を得た。CAT及びNPTII双方の正確な配向性は制限断片分析によって立証された。
【0021】
pJII2及びpJII102をBglIIでかつpJII3及びpJII103をEcoRIで直鎖化後、各々のRNA転写体をSP6 RNAポリメラーゼの使用により産生した。各々のキャップ体も、キャップ転写体の対応的産生を確保するGpppG及びSP6ポリメラーゼの反応条件を用いて産生した。キャップ及び非キャップ反応からのRNA並びにオメガ配列をもつ又はもたない構造体に関する同量産生は、ホルムアルデヒド‐アガロースゲルを変性させることによって立証された。
【0022】
同量の様々なCAT含有転写体及びNPTII含有転写体を標準的反応条件下でウサギ網状赤血球溶解物(MDL)、小麦麦芽S‐30(WG)及び大腸菌S‐30のインビトロ翻訳系に加えた。得られたポリペプチド産物を35S‐メチオニンで標識した。
【0023】
図2及び図3は、MDL(図2,トラック1〜11)、WG(図2,トラック12〜22)及び大腸菌(図3)からの翻訳産物のSDS‐PAGE分析について示している。図2において、鋳型添加物は:トラック1及び12がH2O(内在性翻訳);トラック2及び13がBalII直鎖化pJII102DNA;トラック3及び14がCAT RNA;トラック4及び15がオメガプライム‐CATRNA;トラック5及び16が5′キャップ‐CAT RNA;トラック6及び17が5′キャップ‐オメガプライム‐CAT RNA;トラック7及び18がEcoRI直鎖化pJII103DNA;トラック8及び19がNPTII RNA;トラック9及び20がオメガプライム‐NPTII RNA;トラック10及び21が5′キャップ‐NPTII RNA;トラック11及び22が5′キャップ‐オメガプライム‐NPTII RNAであった。14C標識マーカータンパク質〔アメルシャム・インターナショナル社(Amersham International, plc )〕はトラックMに加えた。キロドルトン(kDa)としてのそれらの各々の大きさは左側に示されている。乾燥ゲルを室温で3日間オートラジオグラフィーに付した。図3において、鋳型添加物は:トラック1がH2O(内在性翻訳):トラック2がBglII直鎖化pJII102 DNA;トラック3がCAT RNA;トラック4がオメガプライム‐CAT RNA;トラック5が5′キャップ‐CATRNA;トラック6が5′キャップ‐オメガプライム‐CAT RNA;トラック7がEcoRI直鎖化pJII103 DNA;トラック8がNPTII RNA;トラック9がオメガプライム‐NPTII DNA;トラック10が5′キャップ‐NPTII RNA;トラック11が5′キャップ‐オメガプライム‐NPTII RNAであった。14C標識マーカータンパク質はトラックMに加え、それらの大きさ(kDa)は左側に示されている。乾燥ゲルを室温で3日間オートラジオグラフィーに付した。大腸菌S‐30系は転写活性系であるが、天然大腸菌RNAポリメラーゼはSP6プロモーターを認識しえないことに留意すべきである。
【0024】
下記第1表はオメガプライム配列の促進効果について示している。図2及び図3に示されたゲルからゾーンを取出し、翻訳産物の各バンドにおける放射能を測定し、オメガプライム配列を含まないRNAからの放射能に対して各々の場合データを標準化した。この方法でデータを表現すると、キャップ単独による何らかの促進効果は除かれ、オメガプライム配列の促進効果のみが示される。
【0025】
【0026】
考 察
TMVのオメガプライム領域の存在は、キャップ又は非キャップ状態でCAT又はNPTII配列を含む転写体の発現を促進させる。促進は翻訳効率の悪いNPTII転写体の場合に最も著しい。このように、NPTII遺伝子を含むTn5断片は、NPTII遺伝子のAUG開始コドンのすぐ上流に更にAUGを有している。しかも“コザック則(Kozak rule)”(これに関するコザックの論文参照)によれば、NPTII開始コドン近辺の領域は翻訳開始能の乏しいシグナルを構成していることを示唆する。WG及びMDLの場合(図2,第8列及び第19列)で観察されるように、キャップ又はオメガプライムのないNPTII転写体はほとんど機能していない。キャップ又はオメガプライムの付加は翻訳を改善するが、オメガプライムの存在はキャップ単独の存在よりも優れた促進効果を有している。大腸菌翻訳メカニズムは、キャップ依存性ではないものの、オメガプライム配列の存在によって著しく促進される(図3,第4、6、9及び11列)。大腸菌の場合において、CAT又はNPTII mRNA上のオメガプライム配列にキャップを付加してもその翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップCAT又はNPTII mRNAにオメガプライムを付加すると著しく増強された。
【0027】
CAT遺伝子mRNAは、たとえキャップ又はオメガプライム配列を有していない場合であっても、真核生物系においてはより効果的に機能する。5′末端から最初のAUGはCATの開始コドンであって、開始コドン中の及びその近辺の配列は“コザック則”に十分合致している。このことは、更に著しく低いmRNA濃度が利用可能な35S‐メチオニンプールの消費を妨ぐために必要とされるMDL系の場合に最も明らかである。その際に驚くべきことではないが、CAT mRNAにおけるオメガプライム配列の存在は促進的でなかった。MDLはWGほどキャップ依存的でないと考えられるが、しかしながら、NPTII転写体上におけるキャップの存在はわずかに促進効果を有しており(図2,第8列及び第10列)、一方CAT転写体上におけるその存在はさほど効果がなかった(図2,第3列及び第5列)。CAT mRNA単独ではWG系において著しく低い活性しかなかった。結論として、キャップもしくはオメガプライム配列の存在又は双方の存在は非常に促進的であった(図2,第14〜17列)。WGにおいて、NPTII mRNA上のオメガプライム配列にキャップを付加しても(図2,第20列及び第22列)、その翻訳をほとんど促進しなかったが、一方キャップ又は非キャップNPTII mRNAにオメガプライムを付加すると(図2,第19列及び第21列)著しく増強された。
【0028】
したがって、オメガプライム配列の存在は真核生物系(MDL及びWG)及び原核生物系双方において翻訳を増強する。このことはTMV粒子の脱外被能と一致し、RNAは真核生物又は原核生物の翻訳メカニズムによって翻訳される。オメガプライム配列は、キャップ単独の存在の場合よりも転写体の発現に関して通常高い促進効果を有している。しかも、オメガプライム配列は、例えば原核生物系及びある程度MDL系において、キャッピング(capping )では効果のない条件下で翻訳を増強する。
【0029】
継続実験操作
CAT mRNA及びオメガプライムリーダー配列の誘導体もしくは部分を含むキメラRNA構造体を前記と同様の方法で作成したが、最初の合成DNA配列は必要なRNAを生じうるように選択しておいた。図4に示されているように、5つの欠失体(Δ1〜Δ5と表記されている)、1つのA→Cトランスバージョン体(transversion)及び1つの〔C,A〕n→〔U〕n置換体(substitution)があった。
【0030】
CAT mRNAを含む別のキメラRNA構造体を、TMV(U1,ブルガレ(vulgare )又は普通株)以外の下記ウイルスの5′‐リーダー配列を用いて同様の方法で作成した:TMVのトマト株(SPS単離物)、カブ黄斑モザイクウイルス(TYMV)、ブロウムモザイクウイルスRNA3(BMV3)、ラウス肉腫ウイルス部分リーダー(RSV)及びアルファルファモザイクウイルスRNA4(AlMV4)。合成された最初のDNA配列及び制限部位地図は図5〜図9にそれぞれ示されている。
【0031】
RNA構造体の他の1組を同様の方法で製造したが、但しCATの代わりに大腸菌リポーター遺伝子β‐グルクロニダーゼ(GUS)を用いた。用いられたリーダー配列は、ポリリンカー(比較目的用)もしくはU1オメガ(即ち、TMVからのオメガプライム)又はオメガプライムの誘導体もしくは部分、及び前記のような他のウイルスのリーダーであった。GUS遺伝子は、人工的に“良好な”コザックの配列関係(context )(第9表参照)又は天然の“悪い”コザックの配列関係において pRAJ235/240からのSalI断片として用いた〔ジェファーソン(Jefferson )ら,プロシーディンクギ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第83巻,第8447頁,1986年〕。リーダー配列及び制限部位地図は図10〜図13に示されている。リポーター遺伝子の発現は、ジェファーソンら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第83巻,第8447頁,1986年に記載されているような螢光測定法により調べた。
【0032】
前記3つのインビトロ翻訳系に加えて、下記2つのインビボ系を用いたゼノパス・ラエビス(Xenopus laevis)卵母細胞の微量注入及びタバコ〔ニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum )のキサンチ(Xanthi)種〕葉肉原形質体のエレクトロポレーション(electroporation)。それぞれの操作は下記のとおりであった:
各合成SP6 mRNA(又はそれらの対応DNA鋳型)2ngを標準的方法〔コルマン・エー,ハーメス・ビー・デー及びヒギンズ・エス・ジェイ(編集),転写及び翻訳:実用的アプローチ,IRLプレス,オックスフォード,第271頁,1984年(Colman A. In Hames, B.D. and Higgins, S.J.(eds.), Transcription and Translation : A practical Approach, IRL Press,Oxford, 271 (1984))〕に従い30のバッチ中の第6期のX.ラエビス卵母細胞の細胞質に微量注入した。卵母細胞を修正バース塩水(Modified Barths´ Saline, MBS)中で18時間インキュベートし、しかる後蒸留水で簡単に洗浄した。ゼノパス卵母細胞の抽出物は、10mM DTT(17μリットル/卵母細胞)含有のpH7.4の0.25MトリスHCl中に各サンプルを再懸濁し、しかる後15秒間超音波処理することによって調製した。不溶性物質を15分間の微量遠心分離によって除去し、卵母細胞と同数得られた抽出物画分を公表された方法でCAT又はGUS活性について分析した(CAT:ガリーら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第15巻,第3257頁,1987年);GUS:ジェファーソンら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第83巻,第8447頁,1986年)。
【0033】
葉肉原形質体をN.タバクム(キサンチ種)の葉から分離し、0.7Mマンニトール中で保存した。原形質体(106 )を60xgで3分間遠心分離し、RNA(8μg)含有の氷冷0.7Mマンニトール1ml中に再懸濁し、エレクトロポレーション用セルに移し、セルに50nFコンデンサーを取付けることによって単一電圧パルス(2.5kV/cm)を加えた。パルスは速い立上り時間(1μs以下)を有しかつ半減時間約5μsの指数減衰性を有していた。エレクトロポレーション処理原形質体を0〜4℃で10分間保存した。0.7Mマンニトール10mlを加え、原形質体を60xgで3分間の遠心分離によって回収した。次いで原形質体を培地中に再懸濁し、9cm径ペトリ皿中25℃で21時間インキュベートした。
【0034】
エレクトロポレーション処理原形質体の各サンプルを、CATアッセイの場合には2mMロイペプチン及び10mMジチオトレイトール(DTT)含有のpH7.4のの0.25MトリスHCl又はGUSアッセイの場合には10mM 2‐メルカプトエタノール含有のpH7.0の50mMリン酸ナトリウム150μリットル中で沈降させ、再懸濁し、超音波処理した。抽出物を室温又は4℃において10,000xgで10分間微量遠心分離した。
【0035】
図14は、エレクトロポレーション処理タバコ原形質体中におけるキャップ又は非キャップCAT RNAの発現に関してのオメガプライムの効果について示している。各原スポットは5×104 の生存原形質体に相当する抽出物を含んでいた。各サンプルに関する基質(14C‐クロラムフェニコール)からそのモノアセチル化体(左側に表示)への変換率(%)はトラックの上部に示されている。エレクトロポレーション処理RNA又は標準は:トラック1がRNAなし(偽物);トラック2がCAT RNA;トラック3がオメガプライム‐CAT RNA;トラック4が5′キャップ‐CAT RNA;トラック5が5′キャップ‐オメガプライム‐CAT RNA;トラック6がトラック1の同量抽出物に加えられた0.1単位の精製CAT酵素;トラック7が0.1単位の精製CAT酵素単独であった。乾燥tlcプレートを2日間オートラジオグラフィーに付した後、除去し、モノアセチル化産物(3‐Ac/1‐Ac)に相当する14C標識スポット中の放射能について測定したが、変換率%データは抽出物中の関連CAT活性を表わしている。オメガプライム(+/5′キャップ)はCAT RNA発現に関して最も促進的であった。
【0036】
図15は、X.ラエビス卵母細胞中に微量注入されたキャップ又は非キャップCAT RNAの発現に関するオメガプライムの効果について示している。同量の各CAT RNA構造体又は直鎖DNA鋳型(2ng)を完全に卵母細胞1個当たりで注入した。同量の卵母細胞抽出物(0.3×細胞に相当する)を他に言及のない限り各ケースにおいて分析した。14C‐クロラムフェニコールからそのモノアセチル化体への変換体(%)は各トラックの上部に示されている。トラック5及び6において、ジアセチル化体への変換率(%)は*で示されている。微量注入されたRNA又は標準は:トラック1がRNAなし(偽物);トラック2がBglII直鎖化pJII102;トラック3がCAT RNA;トラック4がオメガプライム‐CAT RNA;トラック5が5′キャップ‐CAT RNA;トラック6が5′キャップ‐オメガプライム‐CAT RNA;トラック7が20倍希釈抽出物であること以外はトラック5と同様;トラック8が20倍希釈されていること以外はトラック6と同様;トラック9がトラック1の同量抽出物に加えられた0.1単位の精製CAT酵素;トラック10が0.1単位の精製CAT酵素単独であった。乾燥tlcプレートを室温で18時間オートラジオグラフィーに付した後、関連14C標識スポットを取出してカウントした。
【0037】
下記表は更に得られた結果について示している。
【0038】
上記結果は、オメガプライムがCATの翻訳を促進させることを示している。欠失体1〜5は、この効果を完全に消失させることなく低下させている。同様のことがA→Cトランスバージョン体にもあてはまる。〔U〕n置換体は、あるとしてもほとんど効果をもっていない。
【0039】
【0040】
前記結果は、TMV U1由来オメガプライムがこの系においてCAT RNAの翻訳を促進することを示している。TMVトマト株オメガプライムも同様であるが、但しやや劣っている。他のウイルスリーダーはさほど又は全く効果がなく、TYMVリーダーは阻害的であるかもしれない。
【0041】
第4表
小麦麦芽無細胞系におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼmRNAのインビトロ翻訳に関する5′キャップのある又はない様々な5′非翻訳リーダー配列の効果(下記結果は、CAT mRNA単独よりも何倍促進的であるかを示すため、未修正CAT mRNAリーダー配列を1.0として標準化された)
付加されたRNA 非キャップ体 キャップ体
CAT 1.0 1.0
オメガプライムCAT 2.8 3.7
Δ1‐CAT 1.2 0.6
Δ2‐CAT 2.0 1.8
Δ3‐CAT 1.5 1.3
Δ4‐CAT 3.0 1.5
Δ5‐CAT 1.5 0.7
A→Cトランスバージョン‐CAT 3.3 2.9
〔C,A〕n→〔U〕n置換‐CAT 2.1 3.4
TMV トマト株オメガプライム‐CAT 1.7 3.0
TYMV‐CAT 0.3 3.0
BMV3‐CAT 1.4 2.8
RSV‐CAT 0.6 2.5
AlMV4‐CAT 2.1 2.3
注:これらの数値は、CATメッセージの5′末端の様々な配列の付加によって生じる翻訳の促進率を比較したものである。翻訳はキャップのある又はキャップのないメッセージに関して行なわれた。各欄は(第2表及び第3表のように)独立したゲルから切除回収された放射性CATタンパク質の収率を示している。各バンドを切出し、カウントし、かつmRNAが未修正CATメッセージであるバンドに対して標準化した。
前記結果は、オメガプライムが5′キャップの存在又は非存在下でこの系において促進させることを示している。他のウイルスリーダー配列及びオメガプライムの誘導体もしくは部分は翻訳を様々な程度に増強させるが、但しオメガプライム自体よりも有意に優れているケースはまれである。
【0042】
第5表
大腸菌無細胞系中でのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼmRNAのインビトロ翻訳に関する、すべて5′キャップ構造以外の様々な非翻訳リーダー配列の効果
付加されたRNA 非キャップ体
CAT 1.0
オメガプライムCAT 9.0
Δ1‐CAT 3.3
Δ2‐CAT 2.5
Δ3‐CAT 6.3
Δ4‐CAT 4.2
Δ5‐CAT 3.8
A→Cトランスバージョン CAT 4.1
〔C,A〕n→〔U〕n置換 CAT 1.9
TMV トマト株オメガ CAT 6.6
TYMV CAT 0.2
BMV3 CAT 3.7
RSV CAT 1.5
AlMV4 CAT 1.4
上記結果は、オメガプライム、その誘導体の一部及びトマト株オメガプライムが翻訳を最大に促進させることを示している。他の配列も大半は、但し異なる程度で促進させる。大腸菌は翻訳のために5′キャップを要しない。
【0043】
【0044】
すべてのmRNA構造体を8μg/mlでエレクトロポレーション処理し、洗浄された原形質体を(ガリーら,ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第15巻,第3257頁,1987年)記載のように20時間インキュベートした。
【0045】
“悪い”コザック構造体(235)リーダーの配列は下記のとおりである:
【化1】
【0046】
ポリリンカー中へのオメガプライムの挿入は下記のとおりである:
【化2】
【0047】
*この箇所におけるオメガプライムは下記のとおりである:
【化3】
及び欠失オメガプライム誘導体等がしかるべく後に続く。
【0048】
子牛プレプロキモシン又はチキンプレリゾチームをコードするメッセンジャーRNAを、TMV5′末端配列(オメガプライム)を付加させて又はさせないでインビトロ合成した。mRNAをウサギ網状赤血球(MDL)、小麦麦芽(WG)又は大腸菌(EC)由来の系でインビトロ翻訳させた。
【0049】
プラスミドpJII6及びpJII7(図16)をプラスミドpST64CT、pSP64LT〔スリート(Sleat)ら,バイロロジー,第155巻,第299頁,1986年〕及びpJII101の成分を用いて作成した。pJII6及びpJII7は、M13 mp11由来ポリリンカー配列に隣接するバクテリオファージSP6RNAポリメラーゼのプロモーターを含む転写プラスミドpSP64〔メルトン(Melton) ,1984年〕の誘導体である。pSP64CT及びpSP64LTのプレプロキモシン及びプレリゾチームコード領域をそれぞれHindIII断片として取出し、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片でブラント末端化し、pJII101のHincII部位に組込んでクローニングし、それぞれpJII106及びpJII107を得た(図16)。これらの構造体は、5′末端オメガプライム配列をもつメッセンジャー(messenger-sense )プレプロキモシン及びプレリゾチーム転写体の合成を指示させるために用いた。親プラスミドpSP64CT及びpSP64LTはオメガプライムのないmRNAの合成のための鋳型であった。
【0050】
結果は下記第7表に示されている。
【0051】
前記方法と同様の方法で、様々なキメラRNA構造体を、NPTIIコード領域、及びオメガプライム、2つのタンデム(tandem)オメガプライム領域、長鎖(77塩基)“ジャンク(junk) ”リーダー(ポリリンカー)配列もしくは中央オメガプライムと一緒の“ジャンク”を用いて作成した。構造体は図17に示されており、結果は下記第8表に示されている。
【0052】
【表1】
【0053】
これは、ランダムポリリンカー配列が80Sリボソーム系においてオメガプライムの代わりにならず、原核生物(70S)系でのみわずかに代わりになることを示している。2つのタンデムオメガプライムのみが70S発現に寄与する(例えば、オメガプライムの単一コピー)。
【0054】
β‐グルクロニダーゼmRNA(GUS mRNA)の発現に対するオメガプライムの効果に関して第6表(前掲)に掲示されたデータを更に拡張するために、別の一連の構造体として開始コドン(AUG)近辺の配列関係が修正されたGUS遺伝子を用いた。下記の“良好な配列関係”をもつリーダー:
【0055】
【化4】
を含むプラスミドpRAJ275は、GUSのこのバージョンのための供給源であった。オメガプライム及び様々な他のリーダー構造体を前記のようにHindIII/SalI部位に挿入した。pRAJ275構造体の詳細は下記のとおりである:
【0056】
pRAJ275はpRAJ255の誘導体であって(ジェファーソンら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第83巻,第8447頁,1986年)、ここにおいてGUSの5′配列は連続的(progressive )BAL31削除によって除去され、コザック〔ミクロバイオロジー・レビューズ,第47巻,第1頁,1983年(microbiology Reviews, 47, 1 (1983) )〕により規定された“コンセンサス(consensus )”翻訳イニシエーターを構成していた合成オリゴヌクレオチドで置き換えられている。このプラスミドはイニシエーターATGコドンに位置する特有のNcoI部位(CCATGG)を有しており、その周囲配列関係はGTCGACCATGGTCである。イニシエータ近辺の配列関係は所定量のmRNAの翻訳産物レベルに関して十分な効果を発揮しうることが、インビトロ及びインビボ双方で示された。この構造はこの効果を最大化させるために調整された。それはpUC19におけるSalI‐EcoRI断片として与えられた。
【0057】
5′キャップ又は非キャップ転写体を前記のようにタバコ原形質体中にエレクトロポレーションし、GUS発現レベルを抽出物中で測定した。
非キャップRNAもMDLまたはWG無細胞翻訳系に加え、合成されたGUSタンパク質レベルは図2及び図3(第1表)のように放射性ゲルバンドを切取ってカウントすることによって測定した。結果は第9表に示されている。
【0058】
【表2】
【0059】
【表3】
【0060】
RNA構造体の別の1組を、大腸菌リポーター遺伝子β‐グルクロニダーゼ(GUS)及び更に誘導トリプトファン(Trp)プロモーターを用いて、前記と同様の方法により作成した。Trpプロモーターはファルマシア社(Pharmacia Ltd.)から購入し、制限エンドヌクレアーゼ消化、補充、サブクローニング等の慣用的技術により修正し、3′‐HindIII部位(図18)及びブラント5′末端を作出した。次いで、この二重鎖(ds)DNA断片をSP6プロモーター(インビボの大腸菌中では作働しない)及び重要な5′‐リーダー構造の間で様々なリーダー‐リポーター(GUS)遺伝子プラスミド中に挿入した。
【0061】
得られたプラスミドDNAは標準的方法によりコンピテント(competent )大腸菌細胞を形質転換させるために用いたが、Trpプロモーターは現場で誘導されて、キメラリーダー‐リポーターmRNAを産出した。転写開始点はHindIII部位(AAGCTT)中のGに対応する。
【0062】
形質転換された大腸菌細胞中における転写体の発現は、分光測定法により調べた(ジェファーソンら,プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA,第83巻,第8447頁,1986年)。結果(第10表)は、GUS発現がオメガプライムの存在により及びある程度オメガプライムの他のリーダー配列もしくは誘導体により、コザック配列関係の“良好な”又は“悪い”構造体のいずれかからインビボで増強されたことを示している。
【0063】
【0064】
結 論
オメガプライムは、現場でTrpプロモーターを用いた場合に、プラスミドDNAで形質転換された大腸菌中でのGUS RNAのインビボ発現を増強する。継続実験は超らせん二重鎖pUC19 DNAを用いて行なわれたが、これはカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリンシンターゼターミネーター〔アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens )由来〕及びそれらの中間にCAT DNA(●,塗りつぶし三角)もしくはオメガプライムCAT DNA(○,△)のいずれかを有するように修正されている。
【0065】
構造体(図19)は二元ベクター系から作成したが〔ベバン(Bevan ),ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,第12巻,第8711頁,1984年〕、その場合においてCaMV35Sプロモーター及びNosターミネーターをHindIII及びEcoRI部位で切除し、プラスミドpUC19に挿入することによってpUC35S Nosを得た。
【0066】
構造体pUC35SCATNos及びpUC35SオメガプライムCATNosは、CAT又はオメガプライムCATをそれぞれBamHI部位でプラスミド中に挿入することによって作成した。
【0067】
様々な量のプラスミドDNA(μg/ml)を前記のように原形質体にエレクトロポレーション処理し、細胞を25℃で6時間(○,●)又は26時間インキュベートし、溶離させて、(前記のような)CATアッセイを行なった。
【0068】
図20に示された結果は、図示された100〜150μgの超らせんプラスミドDNAの注入をうけた細胞はオメガプライムが構造体中に存在している場合(△,○)にCAT発現を増強させていた(2倍)ことを示している。
【0069】
これらの結果は、安定的形質転換原性(transgenic)植物中での遺伝子発現がプロモーター(インビボ転写用)及び翻訳オープン読取枠の間へのオメガプライム配列の挿入によって同様に増強されるであろうということを示している。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の態様のキメラmRNAを産生する方法を示す。
【図2】MDL(トラック1〜11)及びWG(トラック12〜22)からの翻訳産物のSDS‐PAGE分析の結果を示す。
【図3】大腸菌からの翻訳産物のSDS‐PAGE分析の結果を示す。
【図4】CAT mRNA及びオメガプライムリーダー配列の誘導体もしくは部分を含むキメラRNA構造体を作成する方法を示す。
【図5】CAT mRNAを含むキメラRNA構造体を、下記ウイルスの5′‐リーダー配列を用いて作成した:TMVのトマト株(SPS単離物)。合成された最初のDNA配列及び制限部位地図を示す。
【図6】CAT mRNAを含むキメラRNA構造体を、下記ウイルスの5′‐リーダー配列を用いて作成した:カブ黄斑モザイクウイルス(TYMV)。合成された最初のDNA配列及び制限部位地図を示す。
【図7】CAT mRNAを含むキメラRNA構造体を、下記ウイルスの5′‐リーダー配列を用いて作成した:ブロウムモザイクウイルスRNA3(BMV3)。合成された最初のDNA配列及び制限部位地図を示す。
【図8】CAT mRNAを含むキメラRNA構造体を、下記ウイルスの5′‐リーダー配列を用いて作成した:ラウス肉腫ウイルス部分リーダー(RSV)。合成された最初のDNA配列及び制限部位地図を示す。
【図9】CAT mRNAを含むキメラRNA構造体を、下記ウイルスの5′‐リーダー配列を用いて作成した:アルファルファモザイクウイルスRNA4(AlMV4)。合成された最初のDNA配列及び制限部位地図を示す。
【図10】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図11】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図12】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図13】リーダー配列及び制限部位地図を示す。
【図14】エレクトロポレーション処理タバコ原形質体中におけるキャップ又は非キャップCAT RNAの発現に関してのオメガプライムの効果について示す。
【図15】X.ラエビス卵母細胞中に微量注入されたキャップ又は非キャップCAT RNAの発現に関するオメガプライムの効果について示す。
【図16】プラスミドpJII6及びpJII7を示す。
【図17】様々なキメラRNA構造体を示す。
【図18】3′‐HindIII部位を示す。
【図19】構造体pUC35S Nosを示す。
【図20】CATアッセイの結果を示す。
Claims (1)
- 【請求項1】 キメラmRNA分子を作製するための、下記のi)、ii)、iii)及び(iv)を含む配列を有するDNAの転写と、ポリペプチドを作製するための、上記キメラmRNA分子の翻訳とによる、ポリペプチドの製造方法:
(i)プロモーター
(ii)RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー配列又はその一部分の配列に相補的な 翻訳増強配列(但し、ブロウムモザイクウイルスRNA 4の5′‐非翻訳リーダー 配列を除く)、
(iii)開始コドン、及び
(iv)プロモーターのコントロール下にある、上記ポリペプチドをエンコードするコー ド配列
但し、上記コード配列は翻訳増強配列が由来するRNAウイルスに非相同であり、上記プロモーター、翻訳増強配列、開始コドン及びコード配列間の関係は、DNAの転写でキメラmRNA分子が作製される関係であり、その翻訳は翻訳増強配列に相当するその部分によって、該部分を欠く相当するmRNA分子に比べて増強される。
【請求項2】 DNAが転写エンハンサー配列をも含む、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー配列が植物ウイルス由来である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】 RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー配列がタバコモザイクウイルスのオメガプライム(Ω′)配列又はその一部分である、請求項3に記載の方法。
【請求項5】 RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー配列がアルファルファモザイクウイルスRNA 4由来である、請求項3に記載の方法。
【請求項6】 DNAが、微生物又は細胞培養物の細胞中に組込まれている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】 下記のi)、ii)及びiii)を含む配列を有するキメラmRNA分子の翻訳によるポリペプチドの製造方法:
(i)RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー又はその一部分である翻訳増強配列(但 し、ブロウムモザイクウイルスRNA 4の5′‐非翻訳リーダー配列を除く)、
(ii)開始コドン、及び
(iii)上記ポリペプチドをエンコードするコード配列
但し、上記コード配列は翻訳増強配列が由来するRNAウイルスに非相同であり、上記翻訳増強配列、開始コドン及びコード配列間の関係は、キメラmRNA分子の翻訳が翻訳増強配列によって、該配列を欠く相当するキメラmRNA分子に比べて増強される関係である。
【請求項8】 キメラmRNAが相補的DNA由来である、請求項7に記載の方法。
【請求項9】 RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー配列が植物ウイルス由来である、請求項7又8に記載の方法。
【請求項10】 RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー配列がタバコモザイクウイルスのオメガプライム(Ω′)配列又はその一部分である、請求項9に記載の方法。
【請求項11】 RNAウイルスの5′‐非翻訳リーダー配列がアルファルファモザイクウイルスRNA 4由来である、請求項9に記載の方法。
【請求項12】 5′キャップが、翻訳増強配列の上流にあるキメラmRNAにつけられている、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
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