DE3750422T2

DE3750422T2 - Translation von mrna.

Info

Publication number: DE3750422T2
Application number: DE3750422T
Authority: DE
Inventors: Thomas Wilson
Original assignee: Diatech Ltd
Current assignee: Copernicus Technology Ltd
Priority date: 1986-06-04
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1994-12-15
Anticipated expiration: 2007-06-05
Also published as: JPH01500961A; JPH10146197A; AU7489687A; GB8801508D0; JP3658654B2; GB8613481D0; GB2199328B; ATE110412T1; US5489527A; JP2814433B2; GB2199328A; EP0270611B1; US5891665A; DE3750422D1; AU614062B2; WO1987007644A1; EP0270611A1

Description

Die Erfindung betrifft Enhancer der Translation der mRNA.
Die Mechanismen, nach denen Eukaryonten und Prokaryonten die Translation initiieren, besitzen bekanntlich einige gemeinsame Merkmale und unterscheiden sich in anderen Merkmalen. Eukaryotische Botschaften sind funktionell monocistronisch, die Translation beginnt an dem 5'-Ende und wird durch das Vorhandensein einer Cap-Struktur (m&sup7;G5'ppp&sup5;'G . . . ) an diesem Ende stimuliert (Shatkin, Cell, 9 645 (1976)). Prokaryotische Botschaften können polycistronisch ein, können an anderen Stellen als dem 5'-Ende beginnen und das Vorhandensein eines Caps führt nicht zu einer Translationsstimulierung. Sowohl Eukaryonten als auch Prokaryonten beginnen die Translation an dem Codon AUG, obwohl die Prokaryonten auch GUG verwenden können. Die Translation in beiden wird durch bestimmte Sequenzen des Startcodons stimuliert. Für die Prokaryonten ist es die sog. Shine-Dalgarno-Sequenz (eine purinreiche Region 3-10 Nucleotide stromaufwärts von dem Initiationscodon). Für Eukaryonten ist es ein Purin in der -3-Position und ein G-Rest in der +4-Position (worin das A des AUG-Startcodons als +1 bezeichnet wird) plus andere Sequenzerfordernisse, die an der Feinabstimmung beteiligt sind. Dies ist ein Teil der "relaxierten" Version des Scanning-Modells (Kozak, Nuc. Acids. Res. 12, 857 (1984)), worin eine ribosomale 40S-Untereinheit an das 5'-Ende der eukaryotischen mRNA bindet und die Sequenz so weit absucht, bis das erste AUG, das die Erfordernisse des Modells erfüllt, auftritt. An diesem Punkt mündet eine 60S-Untereinheit in die 40S-Untereinheit, was schließlich zur Proteinsynthese führt. In diesem Zusammenhang kann auf die folgenden Publikationen von Kozak Bezug genommen werden: Cell 15, 1109 (1978), Nuc. Acid. Res. 9, 5233 (1981) und Cell 44, 283 (1986).
Außer diesen Sequenzerfordernissen in und um das Initiationscodon gibt es keine zusätzlichen Regionen der mRNA, von denen bekannt ist, daß sie reproduzierbar die Translation verstärken.
Während der eukaryotischen Transkription können Sequenzen, die als "Enhancer"-Regionen bekannt sind, eine Transkriptionsstimulierung ergeben.
RNA-Viren enthalten entweder positive oder negative einsträngige RNA oder doppelsträngige RNA. Diese Klasse von RNA-Viren umfaßt den Hauptteil der Pflanzenviren (über 90%), einige Tierviren und mehrere Bacteriophagen.
Einer der am häufigsten untersuchten RNA-Viren ist das Tabak-Mosaik- Virus (nachstehend als TMV bezeichnet). Die vollständige Nucleotidsequenz des TMV ist bekannt (Goelet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818 (1982)). Die 5'-Region der TMV-RNA wurde zuerst 1965 als ein RNase resistentes 70 Nucleotide langes T&sub1;-Fragment isoliert (Mundry, Z. Vererbungsl. 97, 281 (1965)), das frei von internen G-Resten ist (Mandeles, J. Biol. Chem. 243, 3671), angegeben. Diese Region (nachstehend als Ω bezeichnet, Mandeles J. Mol. Biol. Chem. 243, 3671) wurde sequenziert (Richards et al., Eur. J. Biochem. 84, 513 (1978)), und es wurde gezeigt, daß sie disome Initiationskomplexe mit Weizenkeimribosomen bildet. Ein Ribosom nimmt die AUG-Initiationsstelle der 126 langen proteincodierenden Region ein und das zweite bindet an die stromaufwärtige Leadersequenz (Filipowicz und Haenni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3111 (1979); Konarska et al., Eur. J. Biochem. 114, 221 (1981)). Ein jüngster zusätzlicher Beweis zur Stützung der Rolle von Ω in der Ribosomenassoziation stammt aus den Uncoating-Genexpressionsdaten von Wilson und Mitarbeitern (Obersicht in J. Gen. Virol. 66, 1201 (1985) und UCLA Symp. 54, 159 (1987)). Es wurde in verschiedenen in vitro Translationssystemen beobachtet, daß TMV-Teilchen durch die Bindung von Ribosomen an das 5'-Ende und ihre Translationsbewegung gegen das 3'-Ende enthüllt werden.
Die EP 0 067 553 schlägt die Konstruktionen eines RNA-Pflanzenvirusvektors aus TMV durch Kombination von Sequenzen aus:
I) dem 5'-Ende des (+)-Stranges der viralen RNA einschließlich der Cap-Struktur, wobei die 5'-Sequenz so eingeschleust wird, als ob sie eine zur Replikation benötigte Sequenz sein sollte, und
II) dem 3'-Ende des (+)-Stranges der viralen RNA, die die subgenomische Region für das Hüllprotein einschloß, vor,
worin mindestens eines der Fragmente I und II mindestens einen Teil des Gens für das virale Hüllprotein enthält. Eine fremde Gensequenz wird an die Fragmente geknüpft. Die Aufgabe liegt darin, daß die Konstruktion wie ein Virus für den Replikationsapparat des Expressionssystems aussehen soll.
Es wurde nun gefunden, daß die 5'-Regionen der RNA-Viren als Translations-Enhancer der mRNA wirken.
Folglich betrifft die Erfindung die Verwendung der Sequenz eines 5'- nicht-translatierten Leaders eines RNA-Virus oder eines Derivats oder Teils davon in einem chimären mRNA-Molekül, enthaltend zusätzlich dazu ein Initiationscodon und stromabwärts davon eine codierende Sequenz, die heterolog dem RNA-Virus ist, aus dem sich die 5'-nicht-translatierte Leadersequenz als Enhancer der Translation der codierenden Sequenz ableitet. Bevorzugt leitet sich das chimäre RNA-Molekül von der komplementären DNA ab.
Die Erfindung betrifft auch ein DNA-Molekül mit einer Sequenz, umfassend
i) einen Promotor;
ii) eine translationsverstärkende Sequenz komplementär der Sequenz einer 5'-nicht-translatierten Leadersequenz eines RNA-Virus oder eines Derivats oder Teils davon (aber ausschließlich der 5'-nicht-translatierten Leadersequenz der RNA4 der Roggentrespe (brome mosaic virus); und
iii) stromabwärts der die Translation verstärkenden Sequenz, eine codierende Sequenz, die dem RNA-Virus heterolog ist, von dem sich die 5'- nicht-translatierte Leadersequenz ableitet einschließlich eines geeigneten Startcodons;
wobei die Beziehung zwischen dem Promotor, der translationsverstärkenden Sequenz und der codierenden Sequenz so ist, daß die Transkription der codierenden Sequenz unter der Kontrolle des Promotors eine mRNA-Art erzeugt, deren Translation zur Produktion des Expressionsprodukts der codierenden Sequenz durch den Teil der mRNA verstärkt wird, der der translationsverstärkenden Sequenz entspricht.
Zusätzlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend die Expression der codierenden Sequenz, die in das vorstehend beschriebene DNA-Molekül eingeschleust wurde.
Die meisten RNA-Viren, die sequenziert wurden, enthalten 5'-Leadersequenzen, d. h. Sequenzen an dem 5'-Ende bis zu, aber nicht einschließlich dem/des ersten Initiationscodon(s). Geeignete 5'-Leadersequenzen aus je dem beliebigen RNA-Virus können als erfindungsgemäßer Translations-Enhancer verwendet werden.
Wie vorstehend ausgeführt, ist die 5'-Leadersequenz von TMV plus dem AUG-Initiationscodon als Ω bekannt und seine Nucleotidsequenz ist bekannt (Richards et al. Eur. J. Biochem. 84, 513 (1978)), so daß die cDNA synthetisch hergestellt werden kann. Die Omega-Strich- (Ω' siehe Fig. 1) Sequenz von TMV stellt den bevorzugten erfindungsgemäßen Translations-Enhancer dar.
Information bezüglich der Translationsverstärkung durch die 5'-Leadersequenzen anderer RNA-Viren einschließlich der folgenden sind ebenfalls verfügbar:
Gelbe Rüben-Mosaik-Virus-Genom-RNA (Filipowicz und Haenni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3111 (1979), Roggentrespen-Mosaik-Virus-RNA 3, Alfalfa-Mosaik-Virus-RNA 4 (Goelet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818 (1982); Rous-Sarcom-Virus (J.L. Darlix et al., Nuc. Acids Res., 10, 5183 (1982)).
In jedem speziellen Fall ist es fast mit Sicherheit möglich, die natürliche 5'-Leadersequenz so zu variieren, daß der Funktion als Translations-Enhancer moduliert, aber nicht zerstört wird. Solche Varianten werden nachstehend als "Derivate" bezeichnet und Derivate der natürlichen Sequenz und ihre Verwendung als Translations-Enhancer bilden einen Teil der vorliegenden Erfindung. Es kann auch der Fall sein, daß nur Teile der natürlichen 5'-Leadersequenz (oder einer Derivatsequenz) benötigt werden, um eine Translationsverstärkung zu ergeben. Solche Sequenzteile werden nachstehend als "Anteile" bezeichnet, und Anteile der natürlichen Sequenz oder von Derivaten davon und ihre Verwendung als Translations-Enhancer bilden Teil der vorliegenden Erfindung.
In jedem speziellen Fall sollte die Bestimmung der Nucleotidsequenz des 5'-Leaders eines RNA-Virus in das Fachgebiet eines Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet unter Verwendung bekannter und leicht verfügbarer Techniken fallen. Auf ähnliche Weise ist die Identifizierung solcher Teile der natürlichen 5'-Leadersequenz, die für die Translationsverstärkung essentiell sind, und solcher, die modifiziert oder weggelassen werden können (d. h. die Identifizierung der Derivate und Anteile der natürlichen Sequenz) ein Gegenstand, der durch Routineversuche bestimmt werden kann.
Die 5'-Leadersequenzen der RNA-Viren (oder der Derivate oder Anteile davon) können als solche als erfindungsgemäße Translations-Enhancer verwendet werden, indem man sie stromaufwärts einer geeigneten mRNA unter Verwendung von beispielsweise T&sub4; RNA-Ligase ligiert werden. Die 5'-Leadersequenz kann unmittelbar benachbart zu dem Initiationscodon der stromabwärtigen mRNA liegen, oder sie kann davon durch eine dazwischenliegende Sequenz getrennt sein. Jedoch ist es bevorzugt, die 5'-Leadersequenz in Form einer komplementären DNA zu verwenden. Die cDNA kann auf jede beliebige Art, die erwünscht ist, erhalten werden. Jedoch ist es angesichts der relativ kurzen Länge der infragekommenden 5'-Leadersequenzen am zweckmäßigsten, die cDNA chemisch zu synthetisieren. Die cDNA wird im allgemeinen in einen Expressionsvektor eingeschleust. Ein Expressionsvektor ist jeder beliebige Vektor mit der Fähigkeit zur Expression derjenigen DNA-Sequenzen, die darin enthalten sind, die funktionell an andere Sequenzen mit der Fähigkeit zur Bewirkung ihrer Expression verknüpft sind. Ein Expressionsvektor enthält üblicherweise eine DNA-Sequenz, umfassend einen Promotor, die der 5'-Leadersequenz eines RNA-Virus komplementäre Sequenz bis zu, aber ausschließlich des ersten Initiationscodons der viralen RNA (oder eines Derivats oder Teils davon) und ein offenes Leseraster einschließlich eines geeigneten Initiationscodons. Das offene Leseraster codiert im allgemeinen ein oder mehrere Proteine von Interesse. Der Expressionsvektor kann direkt in die Wirtszelle stabil oder vorübergehend eingeschleust werden, wobei die DNA-Sequenz durch Transkription und Translation exprimiert wird. Im Falle der stabilen Expression muß der Vektor in dem Wirt entweder als ein Episom oder als ein integraler Teil der chromosomalen DNA replizierbar sein. Alternativ kann der Expressionsvektor in vitro transkribiert werden und die RNA direkt in die Zelle für eine vorübergehende Expression eingeschleust werden.
Die erfindungsgemäßen Translations-Enhancer können in jeder beliebigen Situation, in der es erwünscht ist, die Translationseffizienz der mRNA zu verstärken, verwendet werden. Jedoch sollte darauf hingewiesen werden, daß die Wirkung der Enhancer im Falle einer mRNA, die sonst schlecht translatiert wird, am ausgeprägtesten ist. So stimulieren die Zugabe entweder eines Caps oder eines erfindungsgemäßen Enhancers oder beides die Translation. In dem Falle, in dem eine mRNA bereits ein Cap trägt, ist die Wirkung des erfindungsgemäßen Enhancers immer noch vorhanden.
Die erfindungsgemäßen Translations-Enhancer sind in vielen verschiedenen Typen von Expressionssystemen effektiv, beispielsweise Pflanzenzellen, Bakterien und tierische Zellen, obwohl ein spezieller Enhancer für ein System geeigneter sein kann als für ein anderes. Beispielsweise schien während in vitro Tests die Ω-Sequenz von TMV einen größeren Verstärkungsgrad in dem Weizenkeimsystem und in dem E. coli-System zu zeigen als in dem Kaninchen-Reticulocytenlysat-System, obwohl die Verstärkung der Translation in allen drei Systemen beobachtet wird. Das Anpassen spezieller Enhancer an spezielle Expressionssysteme ist im allgemeinen ein Problem, das in die Erfahrung des Durchschnittsfachmanns fällt.
Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen Translations-Enhancer vorteilhafterweise in jedem Fall verwendet werden, in dem der Handelswert eines Organismus oder einer Zellinie einschließlich auf dem Gebiet der Landwirtschaft durch den Grad der Expression eines seiner natürlichen Gene oder eines künstlich eingeschleusten Gens bestimmt wird.
(i) Bei der Herstellung von im Handel nützlichen Proteinen in genmanipulierten Organismen oder Zellinien.
(ii) Bei der Fermentation, bei der die Produktionsrate eines Produkts des Intermediärstoffwechsels, die durch Enzyme katalysiert wird, durch Erhöhen der Syntheserate eines speziellen Enzyms verstärkt werden kann.
(iii) Bei Schutz durch virale Kreuzreaktionen, bei denen die Wirkungen einer viralen Infektion durch eine vorherige Exposition gegenüber einer attenuierten Form des Virus verringert werden können, und es vorteilhaft ist, den Grad des Schutzes durch Erhöhen der Produktionsrate der Komponente, die den Schutz gewährleistet, zu verstärken. Beispielsweise können Pflanzen gegen eine Infektion durch TMV geschützt werden, indem man sie gegenüber einem gentechnisch manipulierten Stamm von Agrobacterium exponiert, der eine cDNA-Kopie des Teils der TMV-RNA enthält, die das virale Hüllprotein codiert. Bakterielle cDNA, die in das Pflanzengenom insertiert ist, exprimiert kontinuierlich das Hüllprotein, das die Pflanze gegen Infektionen durch das Virus selbst schützt.
(iv) Bei der gentechnischen Manipulation von Pflanzen, bei der eine Eigenschaft, wie Herbizidresistenz, durch künstliche Modifikation des Intermediärmetabolismus der Pflanze eingerichtet wird.
(v) Bei der Expression eines Teilclons eines Gens, beispielsweise wenn es zweckmäßig ist, Antikörper gegen das Expressionsprodukt des Teilclons zu erzeugen.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Versuche näher erläutert.

Versuchsteil

mRNA

Die chimäre mRNA gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde wie folgt, wie in Fig. 1 erläutert, erzeugt.
Unter Verwendung der RNA-Sequenz des TMV-Stammes vulgare (Goelet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818 (1982)) wurde ein 81 Basen langes Oligonucleotid synthetisiert, welches die DNA-Sequenz, die der 67 Basensequenz stromaufwärts des AUG-Initiationscodons des 126 kDa großen, offenen Leserasters komplementär war, enthielt, aber nicht das 5'-Cap (m&sup7;Gppp und der benachbarte G-Rest) enthielt. Diese Sequenz wurde Ω' genannt. Eine HindIII-Spaltstelle wurde an dem 5'-Ende und eine Sal I- Spaltstelle an dem 3'-Ende dieses Oligonucleotids eingeschleust. Ein zweites Oligonucleotid mit 20 Basen einschließlich 13 Basen an dem 3'- Ende der Ω'-Sequenz und einer Sal I-Spaltstelle wurde als ein Primer zur Synthese des zweiten Stranges synthetisiert. Nach Reassoziierung wurde die Synthese des zweiten Stranges unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I vollendet.
Das so erhaltene doppelsträngige 81 bp lange Fragment wurde mit HindIII/Sal I gespalten, um ein 77 bp langes Fragment mit einzelsträngigen kohäsiven Enden zu erzeugen und in die entsprechenden Stellen von pUC19 insertiert. Die Tatsache, daß die Synthese zu der korrekten Orientierung der Ω'-Sequenz von TMV geführt hatte, wurde durch Sequenzanalyse unter Verwendung des Didesoxy-Kettenterminationsverfahrens verifiziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)). Das Fragment, das Ω' von TMV enthielt, wurde dann in die HindIII/Sal I-Spaltstellen des Plasmids pJII1 eingeschleust, wodurch pJII101 erhalten wurde. pJII1 leitet sich durch Insertieren des TMV-Origins einer zusammengebauten Sequenz als ein BamHI-Fragment in die entsprechende Spaltstelle von pSP64 (Melton, Nuc. Acids. Res. 12, 7035 (1984)) und Modifizieren der SmaI-Spaltstelle in eine BglII-Spaltstelle (Sleat et al., Virology, 155, 299 (1986)) ab.
Ein 779 bp langes Fragment mit einem Sal I-Ende aus pCM1 (Close und Rodriguez, Gene 20, 305 (1982), das das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen (CAT) von Tn9 enthielt, wurde in die Sal I-Spaltstelle von pJII1 und pJII101 eingeschleust, was zu pJII2 bzw. pJII102 führte. Ein 1,2 kb langes BglII/Sal I-Fragment aus pKNR-H (Gallie et al., J. Bacteriol. 161, 1034 (1985)), das das Neomycin-Phosphotransferase II-Gen (NPTII) von Tn5 enthielt, wurde mit einem Klenow-Fragment glattendig gemacht und in die AccI-Spaltstelle von pJII1 und pJII101 eingeschleust, wodurch pJII3 bzw. pJII103 erhalten wurden. Die korrekte Orientierung sowohl der CAT- als auch der NPTII-Gene wurde durch Restriktionsfragmentanalyse bestätigt.
Nach Linearisierung von pJII2 und pJII102 mit BglII und pJII3 und pJII103 mit EcoRI wurden RNA-Transkripte von beiden unter Verwendung der SP6-RNA-Polymerase hergestellt. Die Varianten mit einem Cap von den beiden wurden ebenfalls unter Verwendung von GpppG und SP6-Polymerasereaktionsbedingungen, die vergleichbare Ausbeuten der Transkripte mit einem Cap gewährleisten, hergestellt. Aquivalente Ausbeuten der RNA aus den Reaktionen mit Cap und ohne Cap und für die Konstrukte mit oder ohne der Ω- Sequenz wurden durch Denaturieren der Formaldehyd-Agarose-Gele bestätigt.
Aquivalente Mengen der verschiedenen CAT enthaltenden Transkripte und der NPTII enthaltenden Transkripte wurden dem Kaninchen-Reticulocyten-Lysat (MDL), Weizenkeim S-30 (WG) und E. coli S-30 in vitro Translationssystemen unter Standardreaktionsbedingungen zugesetzt. Die so erhaltenen Polypeptidprodukte wurden mit ³&sup5;S-Methionin markiert.
Die Fig. 2 und 3 zeigen die SDS-PAGE-Analyse der Translationsprodukte aus MDL (Fig. 2, Bahnen 1 bis 11), WG (Fig. 2, Bahnen 12 bis 22) und E. coli (Fig. 3). In Fig. 2 wurden Matrizenzugaben vorgenommen: Bahnen 1 und 12, H&sub2;O (endogene Translation); Bahnen 2 und 13 BglII-linearisierte pJII102 DNA; Bahnen 3 und 14, CAT-RNA; Bahnen 4 und 15, Ω'-CAT-RNA; Bahnen 5 und 16, CAT-RNA mit einem 5'-Cap; Bahnen 6 und 17, 5'Cap-Ω'-CAT- RNA; Bahnen 7 und 18, EcoRI linearisierte pJII103 DNA; Bahnen 8 und 19, NPTII-RNA; Bahnen 9 und 20 Ω'-NPTII-RNA; Bahnen 10 und 21, 5'-Cap-NPTII- RNA; Bahnen 11 und 22, 5'-Cap-Ω'-NPTI1-RNA. ¹&sup4;C-markierte Markerproteine (Amersham International, plc) wurden auf die Bahn M geladen. Ihre jeweiligen Größen in Kilodalton (kDa) sind auf der linken Seite gezeigt. Das getrocknete Gel wurde drei Tage lang bei Raumtemperatur autoradiographisch untersucht. In Fig. 3 betrugen die Zugaben der Matrizen: Bahn 1, H&sub2;O (endogene Translation), Bahn 2, BglII-linearisierte pJI1102 DNA; Bahn 3, CAT-RNA; Bahn 4, Ω'-CAT-RNA; Bahn 5, 5'-Cap-CAT-RNA; Bahn 6, 5'-CapΩ'-CAT-RNA; Bahn 7 EcoRI-linearisierte pJII103 DNA; Bahn 8, NPTII-RNA; Bahn 9, Ω'-NPTII-RNA; Bahn 10, 5'-Cap-NPTII-RNA; Bahn 11, 5'-Cap-Ω'- NPTII-RNA. ¹&sup4;C-markierte Markerproteine wurden auf die Bahn M geladen und ihre Größen (in kDa) sind auf der linken Seite gezeigt. Das getrocknete Gel wurde drei Tage lang autoradiographisch bei Raumtemperatur untersucht. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß, obwohl das E. coli S-30- System ein transkriptionell aktives System ist, die native E. coli-RNA- Polymerase den SP6-Promotor nicht erkennt.
Die folgende Tabelle 1 zeigt die stimulierende Wirkung der Ω'-Sequenz. Zonen aus den Gelen, die in den Fig. 2 und 3 gezeigt sind, wurden herausgeschnitten, und die Radioaktivität in jeder Bande des Translationsprodukts wurde gemessen, und die Daten wurden in jedem Falle bezüglich der aus der RNA, die die Ω'-Sequenz nicht enthielt, normalisiert. Durch Expression der Daten auf diese Art wird jede stimulierende Wirkung des Caps alleine beseitigt und nur die stimulierende Wirkung der -Ω-Sequenz wird gezeigt.

Tabelle 1

mRNA WG E. coli
CAT 1 1 1
Ω'-CAT 10 1,2 11
GpppG-CAT 1 1 1 GpppG-Ω'-CAT 3,8 2,2 2,7
NPTII 1 1 1
Ω'-NPTII 71 17,8 74
GpppG-NPTII 1 1 1
GpppG-Ω'-NPTII 9,5 1,9 9,6

Diskussion

Das Vorhandensein der Ω'-Region von TMV stimuliert die Expression der Transkripte, die entweder die CAT- oder NPTII-Sequenzen in entweder dem Zustand mit Cap oder ohne Cap enthalten. Die Stimulierung war am ausgeprägtesten bei den translationell ineffizienten NPTII-Transkripten. So enthält das Tn5-Fragment, das das NPTII-Gen enthält, ein zusätzliches AUG unmittelbar stromaufwärts von dem AUG-Startcodon des NPTII-Gens. Zusätzlich würden die "Kozak-Regeln" (siehe die vorstehend angegebenen Druckschriften von Kozak) nahelegen, daß die Region um das NPTII-Startcodon ein schlechtes Signal für den Translationsstart darstellt. Wie in WG und MDL (Fig. 2, Bahnen 8 und 19) zu sehen ist, funktionieren die NPTII-Transkripte ohne entweder ein Cap oder eine Ω'-Funktion schlecht. Der Zusatz eines Caps oder eines Ω' verbessert die Translation, obwohl das Vorhandensein von Ω' eine größere stimulierende Wirkung besitzt, als das Vorhandensein eines Caps allein. Der E. coli-Translationsapparat wird, obwohl er nicht CAP-abhängig ist, durch das Vorhandensein der Ω'-Sequenz stark stimuliert (Fig. 3, Bahnen 4, 6, 9 und 11). In E. coli bewirkte die Addition eines Caps an die -'-Sequenz auf CAT- oder NPTII-mRNA wenig, um dessen Translation zu verstärken, wohingegen die Addition von Ω' an CAT- oder NPTII-mRNA mit einem Cap zu einer größeren Verstärkung führte.
Die CAT-Gen-mRNA funktioniert selbst ohne ein Cap oder die Ω'-Sequenz effizienter in den eukaryotischen Systemen. Das erste AUG von dem 5'-Ende ist das Startcodon für CAT und die Sequenz in und um das Startcodon entspricht gut den "Kozak-Regeln". Dies ist in dem MDL-System besonders offensichtlich, in dem eine viel niedrigere mRNA-Konzentration benötigt wurde, um die Erschöpfung des verfügbaren ³&sup5;S-Methionin-Pools zu verhindern. Es ist dann nicht überraschend, daß das Vorhandensein der Ω'- Sequenz in der CAT-mRNA weniger stimulierend war. MDL gilt als weniger Cap-abhängig als WG, obwohl das Vorhandensein eines Caps auf dem NPTII- Transkript einen leicht stimulierenden Effekt hatte (Fig. 2, Bahnen 8 und 10), wohingegen dessen Vorhandensein auf dem CAT-Transkript einen geringen Effekt hatte (Fig. 2, Bahnen 3 und 5). CAT-mRNA allein war viel weniger aktiv in dem WG-System. Als Ergebnis war das Vorhandensein entweder eines Caps oder einer Ω'-Sequenz oder von beidem stark stimulierend (Fig. 2, Bahnen 14 bis 17). In WG bewirkte die Addition eines Caps an die Ω'-Sequenz auf der NPTII-mRNA (Fig. 2, Bahnen 20 und 22) wenig, um dessen Translation zu verstärken, wohingegen die Addition von Ω' an eine NPTII- mRNA mit oder ohne Cap (Fig. 2, Bahnen 19 und 21) zu einer stärkeren Verstärkung führte.
Daher verstärkt das Vorhandensein der Ω'-Sequenz die Translation sowohl in eukaryotischen (MDL und WG) als auch in prokaryotischen Systemen. Dies entspricht der Fähigkeit der TMV-Teilchen, ohne Hülle zu sein und der RNA, die von dem eukaryotischen oder prokaryotischen Translationsapparat translatiert wird. Die Ω'-Sequenz besitzt oft eine größere stimulierende Wirkung auf die Expression von Transkripten als das Vorhandensein eines Caps alleine tut. Zusätzlich verstärkt die Ω'-Sequenz die Translation unter Bedingungen, bei denen das Anfügen eines Caps dies nicht bewirkt, z. B. in prokaryotischen und in einem gewissen Ausmaß den MDL-Systemen.

Weitere experimentelle Versuche

Chimäre RNA-Konstrukte einschließlich CAT-mRNA und Derivate oder Anteile der Ω'-Leadersequenz wurden auf analoge Weise, wie der vorstehend beschriebenen, hergestellt, wobei die anfängliche synthetische DNA-Sequenz so gewählt wurde, daß die benötigte RNA produziert wurde. Wie in Fig. 4 gezeigt, gab es fünf Deletionen (bezeichnet als 1 bis 5, eine A → C Transversion und eine [C,A]n → [U]n-Substitution.
Weitere chimäre RNA-Konstrukte, die CAT-mRNA enthielten, wurden auf analoge Weise mit 5'-Leadersequenzen von Viren außer TMV (U1, vulgare oder allgemeiner Stamm), nämlich dem Tomatenstamm von TMV (SPS-Isolat), dem Gelbe Rüben-Mosaik-Virus (TYMV), der Roggentrespe-Mosaikvirus-RNA 3 (BMV 3), dem Teil-Leader des Rous-Sarcom-Virus (RSV) und Alfalfa-Mosaik- Virus-RNA 4 (AlMV4) hergestellt. Die zuerst synthetisierten DNA-Sequenzen und die Diagramme der Restriktionsspaltstellen sind jeweils in den Fig. 5 bis 9 gezeigt.
Eine weitere Reihe von RNA-Konstrukten wurde auf analoge Weise, aber mit dem E. coli-Reporter-Gen β-Glucuronidase (GUS) anstelle von CAT, hergestellt. Die verwendeten Leadersequenzen waren entweder Polylinker (zu Vergleichszwecken) oder U1Ω (d. h. Ω' aus TMV) oder Derivate und Anteile von Ω' oder anderen viralen Leadern, wie vorstehend beschrieben. Das GUS-Gen wurde entweder in einem künstlichen "guten" Kozak-Kontext (siehe S. 33, re Tabelle 9) oder in dem nativen "schlechten" Kozak-Kontext als Sal I-Fragment aus pRAJ235/240 (Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 8447 (1986)) verwendet. Die Leadersequenzen und die Diagramme der Restriktionsspaltstellen sind in den Fig. 10 bis 13 gezeigt. Die Expression des Reporter-Gens wurde fluorimetrisch, wie von Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 8447 (1986) beschrieben, bestimmt.
Zusätzlich zu den drei vorstehend beschriebenen in vitro Translationssystemen wurden zwei in vivo Systeme verwendet: Mikroinjektion von Xenopus laevis-Oocyten und Elektroporation von Tabak- (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) Mesophyllprotoplasten. Die jeweiligen Techniken waren wie folgt:
2 ng jeder synthetischen SP6-mRNA (oder ihrer entsprechenden DNA-Matrizen) wurden in das Cytoplasma der Stufe 6 von X. laevis-Oocyten in Chargen von 30 unter Verwendung von Standardverfahren (Colman A. In Hames, B.D. und Higgins, S.J. (Hrsg.), Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 271 (1984)) mikroinjiziert. Die Oocyten wurden 18 h lang in modifizierter Barth-Kochsalzlösung (MBS) inkubiert, dann kurz in destilliertem Wasser gewaschen. Extrakte aus Xenopus-Oocyten wurden durch Resuspendieren jeder Probe in 0,25 M Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 10 mM DTT (17 ul/Oocyte) und anschließendes Beschallen während 15 Minuten hergestellt. Das unlösliche Material wurde durch 15- minütige Mikrozentifugation entfernt und Fraktionen des so erhaltenen Extrakts, welche äquivalenten Anzahlen von Oocyten entsprachen, wurden auf CAT- oder GUS-Aktivität gemäß veröffentlichten Verfahren (CAT: Gallie et al., Nuc. Acids. Res. 15, 3257 (1987); GUS: Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 8447 (1986)) untersucht.
Die Mesophyllprotoplasten wurden aus den Blättern von N. tabacum (cv. Xanthi) isoliert und in 0,7 M Mannit gelagert. Die Protoplasten (106) wurden mit 60 x g 3 min lang zentrifugiert, in 1 ml eiskaltem 0,7 M Mannit, enthaltend die RNA (8 ug) resuspendiert, in die Elektroporationszelle überführt, und ihnen wurde ein einzelner Spannungspuls (2,5 kV/cm) durch Entladen eines 50 nF Kondensators durch die Zelle verabreicht. Der Puls hatte eine rasche Abklingzeit (weniger als 1 us) und einen exponentiellen Abfall mit einer Halbwertszeit von etwa 5 us. Die elektroporierten Protoplasten wurden bei 0 bis 4ºC 10 min lang gelagert. 10 ml 0,7 M Mannit wurden zugesetzt, und die Protoplasten wurden durch 3-minütige Zentrifugation bei 60 x g gewonnen. Die Protoplasten wurden dann in dem Kulturmedium resuspendiert und 21 h lang in Petrischalen mit einem Durchmesser von 9 cm bei 25ºC inkubiert.
Jede Probe der elektroporierten Protoplasten wurde in 150 ul 0,25 M Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 2 mM Leupeptin und 10 mM Dithiothreit (DTT) für den CAT-Assay oder 50 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 10 mM 2-Mercaptoethanol für den GUS-Assay, sedimentiert, resuspendiert und beschallt. Die Extrakte wurden 10 min lang bei 10.000 x g bei Raumtemperatur oder 4ºC mikrozentrifugiert.
Die Fig. 14 zeigt den Effekt von Ω' auf die Expression der CAT-RNAs mit oder ohne Cap in den elektroporierten Tabakprotoplasten. Jeder Ausgangsfleck erhielt einen Extrakt, der 5 x 10&sup4; lebensfähigen Protoplasten äquivalent war. Für jede Probe ist die Konversion (%) des Substrats (¹&sup4;C- Chloramphenicol) in dessen monoacetylierte Formen (auf der linken Seite angegeben) am oberen Ende der Spur gezeigt. Die elektroporierten RNAs oder Standards waren: Bahn 1, keine RNA (Kontrolle); Bahn 2, CAT-RNA; Bahn 3, Ω'-CAT-RNA; Bahn 4, 5'-Cap-CAT-RNA; Bahn 5, 5'-Cap-Ω'-CAT-RNA; Bahn 6, 0,1 Einheiten gereinigtes CAT-Enzym, gegeben zu einem äquivalenten Volumen des Extrakts wie für Bahn 1; Bahn 7, 0,1 Einheiten gereinigtes CAT-Enzym allein. Die getrocknete TLC-Platte wurde 2 Tage lang autoradiographiert, bevor sie entfernt wurde und die Radioaktivität in den relevanten ¹&sup4;C-markierten Flecken der monoacetylierten Produkte (3-Ac/1- Ac) bestimmt wurden. Die prozentualen Konversionsdaten spiegeln die relevante CAT-Aktivität in dem Extrakt wider. Ω'(+/- ein 5'-Cap) zeigte die höchste Stimulierung der CAT-RNA-Expression.
Fig. 15 zeigt die Wirkung von Ω' auf die Expression von CAT-RNAs mit oder ohne Cap, die in X. laevis-Oocyten injiziert wurden. Eine gleiche Menge jedes CAT-RNA-Konstrukts oder des linearisierten DNA-Templats (2 ng) wurde pro Oocyt injiziert. Das gleiche Oocyten-Extraktvolumen (äquivalent zu 0,3 x die Zelle) wurde in jedem Fall untersucht, außer anders angegeben. Die prozentuale Konversion von ¹&sup4;C-Chloramphenicol in dessen monoacetylierte Formen ist oben an jeder Bahn gezeigt. In den Bahnen 5 und 6 ist die prozentuale Konversion in die diacetylierte Form durch * angegeben. Die mikroinjizierten RNAs oder Standards waren: Bahn 1, keine RNA (Kontrolle); Bahn 2 BglII-linearisierte pJII102; Bahn 3, CAT-RNA; Bahn 4, Ω'-CAT-RNA; Bahn 5, 5'-Cap-CAT-RNA; Bahn 6, 5'-Cap-Ω'- CAT-RNA; Bahn 7 wie Bahn 5, außer 20fach verdünnter Extrakt; Bahn 8 wie für Bahn 6, aber 20fach verdünnt; Bahn 9, 0,1 Einheiten gereinigtes CAT- Enzym, zugesetzt zu einem äquivalenten Volumen des Extrakts wie in Bahn 1; Bahn 10, 0,1 Einheiten gereinigtes CAT-Enzym allein. Die getrocknete TLC-Platte wurde bei Raumtemperatur 18 h lang autoradiographiert, dann wurde sie ausgeschnitten, und die relevanten ¹&sup4;C-markierten flecken wurden gezählt.
Die folgenden Tabellen zeigen die weiteren erhaltenen Ergebnisse.

Tabelle 2

Wirkung von Deletionen und anderen Sequenzveränderungen auf die Translationsverstärkung durch Ω'. Chloramphenicol-Acetyltransferase- Expression in RNA-mikroinjizierten Xenopus-Oocyten.
Injizierte RNA % Konversion von ¹&sup4;C-Chloramphenicol in die 1- und 3-monoacetylierten Formen
Nichts (Kontrolle) 0,1
CAT 4,5
Ω'-CAT 34,2
Δ1 - CAT 17,2
Δ2- CAT 9,7
Δ3 - CAT 17,6
Δ4 - CAT 14,6
Δ5 - CAT 17,9
A → C Transversion - CAT 15,7
[C,A]n → [U]n Substitution - CAT 34,3
0,1 Einheiten CAT (reines Enzym) 1,2
Alle RNAs waren ohne Cap.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß Ω' die Translation von CAT verstärkt. Die Deletionen 1 bis 5 verringern diesen Effekt, ohne ihn vollständig zu zerstören. Das gleiche trifft für die A → C Transversion zu. Die [U]n-Substitution besitzt, wenn überhaupt, nur einen geringen Effekt.

Tabelle 3

Wirkung der nicht-translatierten 5'-Leadersequenzen aus verschiedenen Viren auf die Expressionshöhe von Chloramphenicol-Acetyltransferase nach Mikroinjektion der mRNA in Xenopus-Oocyten.
Injizierte RNA % Konversion von ¹&sup4;C-Chloramphenicol in die 1- und 3-monoacetylierten Formen
Nichts (Kontrolle) 0,1
CAT 6,3
Ω-U1-CAT 46,5
Ω-(SPS)-CAT 35,8
TVMV-CAT 1,3
BMV3-CAT 5,0
RSV-CAT 5,4
AlMV4 6,7
0,1 Einheiten CAT (reines Enzym) 1,3
Alle RNAs waren ohne Cap.
Ω-U1 leitet sich von dem Standardstamm von TMV (Vulgare) ab. Ω-SPS leitet sich von dem Tomatenstamm des TMV ab.
TYMV: Gelbe Rüben-Mosaik-Virus-Leader.
BMV3: Roggentrespe-Mosaik-Virus-RNA3.
RSV: Eine teilweise Leadersequenz aus dem Rous-Sarcom-Virus.
AlMV4: Alfalfa-Mosaik-Virus-RNA4.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß Ω' aus TMV-U1 die Translation von CAT-RNA in diesem System verstärkt. Der TMV-Tomatenstamm Ω' zeigt dieses Phänomen ebenfalls, aber weniger gut. Andere virale Leader besitzen einen geringen oder keinen Effekt und der TYMV-Leader kann eine Hemmwirkung zeigen.

Tabelle 4

Wirkungen von verschiedenen 5'-nicht-translatierten Leadersequenzen mit oder ohne einem 5'-Cap auf die in vitro Translation von Chloramphenicol-Acetyltransferase-mRNA in einem zellfreien Weizenkeimsystem. (Die nachstehend gezeigten Ergebnisse wurden auf die unmodifizierte CAT-mRNA- Leadersequenz, die als 1,0 genommen wurde, normalisiert, um das Vielfache der Stimulierung gegenüber der CAT-mRNA alleine zu zeigen.) Zugesetzte RNA Ohne Cap Mit Cap A → C Transversion-CAT [C,A]n → [U]n-Substitution-CAT TMV-Tomatenstamm-Ω'-CAT
Anmerkung: Diese Figuren zeigen Vergleiche von proportionalen Stimulierungen der Translation, die durch Einschluß verschiedener Sequenzen an dem 5'-Ende der CAT-Botschaft erzeugt wurden. Die Translationen wurden mit Botschaften mit oder ohne Cap durchgeführt. Jede Spalte entspricht der Ausbeute des radioaktiven CAT-Proteins, das durch Excision aus einem unabhängigen Gel (wie in Fig. 2 und 3) gewonnen wurde. Die Banden wurden ausgeschnitten, gezählt und wurden bezüglich einer Bande, für die die mRNA eine unmodifizierte CAT-Botschaft war, normalisiert.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß Ω' in diesem System mit oder ohne 5'-Cap eine Verstärkung bewirkt. Die anderen viralen Leadersequenzen und Derivate oder Anteile von Ω' verstärken die Translation in variierenden Ausmaßen, aber selten signifikant mehr als Ω' selbst.

Tabelle 5

Wirkungen von verschiedenen nicht-translatierten Leadersequenzen, alle ohne eine 5'-Cap-Struktur auf die in vitro Translation von Chloramphenicol-Acetyltransferase-mRNA in einem zellfreien E. coli-System.
Zugesetzte RNA Ohne Cap
CAT 1,0
Ω'-CAT 9,0
Δ1-CAT 3,3
Δ2-CAT 2,5
Δ3-CAT 6,3
Δ4-CAT 4,2
Δ5-CAT 3,8
A → C Transversion-CAT 4,1
[C,A]n → [U]n-Substitution-CAT 1,9
TMV-Tomatenstamm-Ω'-CAT 6,6
TYMV-CAT 0,2
BMV3-CAT 3,7
RSV-CAT 1,5
AlMV4-CAT 1,4
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß Ω' einige von dessen Derivaten und der Tomatenstamm -Ω' die Translation in dem größten Ausmaß verstärken. Die meisten der anderen Sequenzen verstärken auch, aber in variierenden Ausmaßen. E. coli benötigt kein 5'-Cap zur Translation.

Tabelle 6

Die Wirkung von verschiedenen Leadern auf die Translation von β-Glucuronidase-mRNA (aus pRAJ235/240), elektroporiert in Tabakprotoplasten. GUS-mRNA-Konstrukt nmol gespaltenes 4-Methylumbelliferylgluconid min&supmin;¹/ug Protein in dem Protoplastenextrakt Stimulierung -fach [Leerwert] (keine mRNA] Leader ohne Cap 235 [SP6-Transkript, Polylinker-Leader] Leader mit Cap 235 mit Cap [SP6-Transkript-Polylinker-Leader] A → C-Transversion -235 mit Cap [C,A]n → [U]n-Substitution -235 mit Cap (Leerwert abgezogen von allen anderen)
(* Konstrukte waren "schlechte" GUS aus pRAJ235/240 mit oder ohne einem 5'-Cap) Alle mRNA-Konstrukte wurden bei 8 ug/ml elektroporiert, und die gewaschenen Protoplasten wurden 20 h lang, wie beschrieben, inkubiert (Gallie et al., Nuc. Acids. Res., 15, 3257 (1987)).
Die Sequenz des "schlechten" Kozak-Konstrukts (235)-Leaders lautet wie folgt:
Die Insertion von Ω' in dem Polylinker ist wie nachstehend:
* worin die Ω'-Sequenz wie folgt lautet:
UAU UUU UAC AAC AAU UAC CAA CAA CAA CAA ACA ACA AAC AAC AUU ACA AUU ACU AUU UAC AUU UAC A
und die deletierten Ω'-Derivate etc. folgen entsprechend.
Messenger-RNAs, die Kälber-Präprochymosin oder Hühner-Prälysozym codieren, wurden in vitro mit oder ohne der 5'-terminalen TMV-Sequenz (Ω') synthetisiert. Die mRNAs wurden in vitro in den Systemen, die von Kaninchen-Reticulocyten (MDL), Weizenkeim (WG) oder E. coli (EC) stammten, translatiert.
Die Plasmide pJII6 und pJII7 (Fig. 16) wurden unter Verwendung von Komponenten der Plasmide pSP64CT und pSP64LT (Sleat et al., Virology, 155, 299 (1986)) und pJIII01 konstruiert. Sowohl pJII6 als auch pJII7 sind Derivate des Transkriptionsplasmids pSP64 (Melton, 1984), welches einen Promotor für die Backeriophagen-SP6-RNA-Polymerase benachbart zu der Polylinker-Sequenz, die von M13-mp11 abgeleitet ist, enthält. Die das Präprochymosin und Prälysozym codierenden Regionen von pSP64CT bzw. pSP64LT wurden als HindIII-Fragmente herausgeschnitten, mit dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase 1 glattendig gemacht und in die Hincll-Spaltstelle von pJII101 zur Erzeugung von pJII106 bzw. pJll107 (Fig. 16) konstruiert. Diese Konstrukte wurden zur Direktion der Synthese der Messenger-Sinn-Präprochymosin und Prälysozymtranskripte, die eine 5'-terminale Ω'-Sequenz tragen, verwendet. Die Stammplasmide pSP64CT und pSP64LT waren Matrizen für die Synthese von mRNAs, denen Ω' fehlt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Wirkung von Ω' auf die Expression von zwei eukaryotischen mRNAs in Translationssystemen, basierend auf 80S- und 70S-Ribosomen.
Einbau von L-[³&sup5;S]-Methionin (cpm) in die gelgereinigten Polypeptide. Zellfreies System CPM (Relative Stimulierung) E. coli SP6-Transkript Prälysozym Ω'-Prälysozym Präprochymosin Ω'-Präprochymosin
Analog den vorstehend beschriebenen Verfahren wurden verschiedene chimäre RNA-Konstrukte mit der NPT II-codierenden Region hergestellt und entweder Ω', zwei Tandem-Ω'-Regionen, eine lange (77 Basen) "Junk"-Leader- (Polylinker) Sequenz oder "Junk" zusammen mit einem zentralen Ω' hergestellt. Die Konstruktionen sind in Fig. 17 und die Ergebnisse in der nachstehenden Tabelle 8 gezeigt: Tabelle 8 Wirkung von verschiedenen 5'-Leader-Konstruktionen auf die in vitro Translation von SP6-Transkripten von Neomycin-Phosphotransferase Zellfreies Translationssystem Weizenkeim Kaninchen-Reti-culocytenlysat E. coli * Hintergrund (H&sub2;O oder linearisierte DNA) korrigiert/alle Werte = -fache Stimulierung gegenüber NPTII RNA alleine.
Dies zeigt, daß eine Zufalls-Polylinkersequenz das Ω' in den 80S-Ribosomen-Systemen nicht ersetzt und nur schlecht ersetzt in einem prokaryotischen-(70S)-System. Ebenfalls nützen die zwei Tandem-Ω' nur der 70S- Expression (vergleiche Einzelkopie von Ω').
Um die in der vorstehenden Tabelle 6 gezeigten Daten auf die Wirkung von Ω' auf die Expression von β-Glucuronidase-mRNA (GUS-mRNA) auszudehnen, wurde bei einer neuen Serie von Konstrukten das GUS-Gen mit einem modifizierten Sequenzkontext um das Startcodon (AUG) verwendet. Das Plasmid pRAJ275, das den Leader mit dem "guten Kontext"
enthielt, war die Quelle für diese Version von GUS. Ω' und verschiedene andere Leaderkonstrukte wurden an den HindIII/Sal I-Spaltstellen wie zuvor insertiert. Einzelheiten der pRAJ275-Konstrukts sind wie folgt:
pRAJ275 ist ein Derivat von pRAJ255 (Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 8447 (1986)), worin die 5'-Sequenzen von GUS durch progressive BAL31-Deletion entfernt und durch ein synthetisches Oligonucleotid ersetzt wurden, das einen "Consensus"-Translationsstarter von Kozak definiert (Microbiol. Reviews, 47, 1 (1983)) konstruiert hatte. Dieses Plasmid besitzt eine einzige Ncol-Spaltstelle (CCATGG), die an dem Initiator ATG-Codon mit dem umgebenden Kontext GTCGACCATGGTC angeordnet ist. Es wurde sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt, daß der Kontext um den Initiator einen ausgeprägten Effekt auf die Höhen des translatierten Produkts von einer gegebenen Menge an mRNA haben kann. Diese Konstruktion wurde so angepaßt, um diesen Effekt zu maximieren. Sie wurde als ein Sall-EcoRI-Fragment in pUC19 bereitgestellt.
Transkripte mit 5'-Cap oder ohne Cap wurden in Tabak-Protoplasten wie zuvor elektroporiert, und die Höhe der GUS-Expression wurde in den Extrakten gemessen.
mRNAs ohne Cap wurden auch den zellfreien MDL- oder WG-Translationssystemen zugesetzt, und die Menge des GUS-Proteins, das synthetisiert wurde, wurde durch Herausschneiden und Zählen der radioaktiven Gelbanden wie für die Fig. 2, 3 etc. (Tabelle I) gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9 Translationsverstärkung durch Ω' auf GUS-mRNA In vivo Translation In vitro Translation Elektroporierte Tabak-Proteoblasen Kozak-Kontext GUS-Aktivität nmol gespaltenes 4-Methylumbelliferylglucuronid min&supmin;¹/ug Protein in dem Protoplastenextrakt Stimulierung -fach ³&sup5;S-Methioninmarkiertes GUS in den Gelband RNAs ohne Cap (40b-Polylinkerleader) schlecht gut Tabelle 9 (Fortsetzung) Translationsverstärkung durch Ω' auf GUS-mRNA In vitro Translation Elektroporierte Tabakprotoplasten Leader mit 5'-Cap Kozak-Kontext GUS-Aktivität nmol gespaltenes 4-Methy lumbelliferylglucuronid min&supmin;¹/ug Protein in dem Protoplastenextrakt GUS-235 (40b-Polylinkerleader) schlecht gut
Wieder verstärkt Ω' in allen Fällen sowohl in vitro (MDL, WG) als auch in vitro (Protoplasten) mit 5'-Cap oder Cap-freien GUS-mRNAs mit gutem oder schlechtem Kozak-Kontext um das Startcodon die mRNA-Expression signifikant.
Eine weitere Serie von RNA-Konstrukten wurde analog dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit einem E. coli-Reporter-Gen β-Glucuronidase (GUS) und zusätzlich mit dem induzierbaren Tryptophan-(Trp) Promotor hergestellt. Der Trp-Promotor wurde von Pharmacia Ltd. bezogen und durch herkömmliche Techniken der Restriktionsendonucleasespaltung, des Auffüllens, des Subclonierens etc. zur Erzeugung einer 3'-HindIII-Spaltstelle (Fig. 18) und eines glatten 5'-Endes modifiziert. Dieses dsDNA-Fragment wurde dann in die verschiedenen Leader-Reporter-(GUS) Gen-Plasmide zwischen dem SP6-Promotor (stumm in E. coli in vivo) und dem 5'-Leader-Konstrukt von Interesse insertiert.
Die so erhaltene Plasmid-DNA wurde zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen nach Standardtechniken verwendet, und der Trp-Promotor wurde in situ induziert, um die chimären Leader-Reporter-mRNAs zu ergeben. Der Transkriptionsstartpunkt entspricht dem G in der HindIII-Spaltstelle (AAGCTT).
Die Expression der Transkripte in den transformierten E. coli-Zellen wurde spektrophotometrisch (Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 8447 (1986) bestimmt. Die Ergebnisse (Tabelle 10) zeigen an, daß die Expresston von GUS ihn vivo aus Konstrukten mit entweder "gutem" oder "schlechtem" Kozak-Kontext durch das Vorhandensein von Ω' und in einem gewissen Ausmaß durch die anderen Leadersequenzen oder Derivate von Ω' erhöht wurde.

Tabelle 10

Expression, die durch den Trp-Promotor in stabil transformierten E. coli-Zellen kontrolliert wurde. Ungefähre relative spektrophotometrische Raten der Konversion von p-Nitrophenylglucuronid 235-GUS ("schlechter" Kontext) ("guter" Kontext) (75x: zu bestätigen)
Die vorstehenden Ergebnisse waren auf das jeweilige GUS-Konstrukt mit dem Polylinker-Leader allein normalisiert.

Schlußfolgerungen

Ω' verstärkt die Expression von GUS-RNA in vivo in E. coli, das mit Plasmid-DNAs transformiert wurde, unter Verwendung des Trp-Promotors in situ.
Weitere Experimente wurden durchgeführt, wobei supergecoilte doppelsträngige pUC19-DNA verwendet wurde, die so modifiziert ist, daß sie den Blumenkohl-Mosaik-Virus- (CaMV) 35S-Promotor, den Nopalinsynthase-Terminator (aus Agrobacterium tumefaciens) und dazwischen entweder CAT-DNA ( , ) oder Ω'-CAT-DNA ( ,Δ) enthält.
Die Konstrukte (Fig. 19) wurden aus einem binären Vektorsystem (Bevan, Nuc. Acids Res., 12, 8711 (1984)) hergestellt, worin der CaMV- 35S-Promotor und der Nos-Terminator unter Verwendung von HindIII- und EcoRI-Spaltstellen herausgeschnitten waren und in das Plasmid pUC19 insertiert waren, wodurch pUC35S-Nos erhalten wurde.
Die Konstrukte pUC35SCAT-Nos und pUC35S-Ω'-CAT-Nos wurden durch Insertion von entweder CAT oder Ω'-CAT in die Plasmide unter Verwendung der BamHI-Spaltstelle hergestellt.
Verschiedene Gehalte von jeder Plasmid-DNA (in ug/ml) wurden in die Protoplasten wie vorstehend elektroporiert, und die Zellen wurden 6 h lang ( , ) oder 26 h (Δ, ) bei 25ºC inkubiert und lysiert. CAT-Assays (wie vorstehend) wurden durchgeführt.
Die in Fig. 20 gezeigten Ergebnisse zeigen an, daß Zellen, die 100 ug bis 150 ug supergecoilte Plasmid-DNA erhalten hatten, eine verstärkte CAT-Expression (2fach) zeigen, wenn Ω' in dem Konstrukt (Δ, ) vorhanden ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Gen-Expression in stabilen transgenen Pflanzen auch wahrscheinlich durch den Einschluß der -'-Sequenz zwischen dem Promotor (zur Transkription in vivo) und dem offenen Translations-Leseraster verstärkt wird.

Claims

1. DNA-Molekül mit einer Sequenz, umfassend

i) einen Promotor,

ii) eine translationsverstärkende Sequenz, die der Sequenz einer 5'-nicht-translatierten Leadersequenz eines RNA-Virus komplementär ist, oder ein Derivat oder ein Teil davon, aber unter Ausschluß der 5'-nicht-translatierten Leadersequenz der Brom-Mosaik-Virus-RNA 4 und

iii) stromabwärts der translationsverstärkenden Sequenz eine codierende Sequenz, die dem RNA-Virus heterolog ist, von dem sich die 5'-nicht-translatierte Leadersequenz ableitet, einschließlich eines geeigneten Startcodons, wobei die Beziehung zwischen dem Promotor der translationsverstärkenden Sequenz und der Codierungssequenz so ist, daß die Transkription der codierenden Sequenz unter der Kontrolle des Promotors eine mRNA-Art erzeugt, deren Translation zur Produktion des Expressionsprodukts der codierenden Sequenz durch den Teil der mRNA verstärkt wird, der der translationsverstärkenden Sequenz entspricht.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, umfassend auch eine transkriptionsverstärkende Sequenz.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, worin die 5' nicht-translatierte Leadersequenz von einem Pflanzenvirus abgeleitet ist.

4. DNA-Molekül nach Anspruch 3, worin die 5'-nichttranslatierte Leadersequenz die Ω'-Sequenz des Tabak-Mosaik- Virus oder ein Derivat oder Teil davon ist.

5. DNA-Molekül nach Anspruch 3, worin die 5'-nichttranslatierte Leadersequenz von der Alfalfa-Mosaik-Virus RNA 4 abgeleitet ist.

6. Verfahren zur Produktion eines Polypeptids, umfassend die Expression der codierenden Sequenz, die in ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 eingebaut ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die DNA-Sequenz in die Zellen eines lebenden Organismus, ausgenommen Menschen oder Tiere, eingebaut ist.

8. Lebender Organismus, ausgenommen Menschen oder Tiere, in deren Zellen eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 eingebaut ist.

9. Verwendung der Sequenz eines 5'-nicht-translatierten Leaders eines RNA-Virus oder eines Derivats oder Teils davon in einem chimären mRNA-Molekül, enthaltend zusätzlich dazu ein Startcodon und stromabwärts davon eine codierende Sequenz, die dem RNA-Virus homolog ist, aus dem sich die 5'- nicht-translatierte Leadersequenz ableitet als einen Verstärker der Translation der codierenden Sequenz.

10. Verwendung nach Anspruch 9, worin das chimäre mRNA- Molekül von der komplementären DNA abgeleitet ist.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, worin die 5'- nicht-translatierte Leadersequenz von einem Pflanzenvirus abgeleitet ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin die 5'-nichttranslatierte Leadersequenz die Ω'-Sequenz des Tabak-Mosaik- Virus oder ein Derivat oder Teil davon ist.

13. Verwendung nach Anspruch 11, worin die 5'-nichttranslatierte Leadersequenz von der Alfalfa-Mosaik-Virus-RNA 4 abgeleitet ist.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, worin ein 5'-Cap an der chimären mRNA stromaufwärts der 5'-Leadersequenz vorhanden ist.