JP3489791B2 - 有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能な新規微生物 - Google Patents
有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能な新規微生物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は新規微生物に関するも
のである。さらに詳しくは、この発明は芳香族化合物に
対する有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能な新規
微生物に関するものである。
のである。さらに詳しくは、この発明は芳香族化合物に
対する有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能な新規
微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、難水溶性であり親油性である芳香
族化合物を微生物分解させる場合には芳香族化合物を直
接培地中に懸濁させ微生物分解させるか、あるいは僅か
の芳香族化合物を溶媒に溶かして微生物分解させる方法
が採用されている。しかしながら前者の方法では芳香族
化合物が溶解しないために微生物との接触が不十分で分
解効率が悪い。また後者の場合も芳香族化合物との接触
はよくなるが、有機溶媒に対する抵抗性がないために微
生物の反応性が抑制されてしまい分解効率が極めて低く
なってしまう。
族化合物を微生物分解させる場合には芳香族化合物を直
接培地中に懸濁させ微生物分解させるか、あるいは僅か
の芳香族化合物を溶媒に溶かして微生物分解させる方法
が採用されている。しかしながら前者の方法では芳香族
化合物が溶解しないために微生物との接触が不十分で分
解効率が悪い。また後者の場合も芳香族化合物との接触
はよくなるが、有機溶媒に対する抵抗性がないために微
生物の反応性が抑制されてしまい分解効率が極めて低く
なってしまう。
【０００３】芳香族化合物分解能を有しさらに有機溶媒
耐性能をも兼ね備えた微生物の出現が望まれるが、この
ような機能を十分に備えた微生物は未だ発見されていな
い。多環芳香族炭化水素は石油中に多く含まれる難分解
性炭化水素であるところ、近年、難分解性炭化水素によ
る海洋汚染が大きな問題となっている。これらは天然海
洋環境中に存在する細菌によって分解除去されると考え
られているが、分解に関与する細菌に関する情報は少な
い。石油中には有機溶媒であるベンゼン、トルエン、キ
シレンなどが存在しこれらにより微生物が死滅してしま
うため、分解除去の大きな障害となっている。
耐性能をも兼ね備えた微生物の出現が望まれるが、この
ような機能を十分に備えた微生物は未だ発見されていな
い。多環芳香族炭化水素は石油中に多く含まれる難分解
性炭化水素であるところ、近年、難分解性炭化水素によ
る海洋汚染が大きな問題となっている。これらは天然海
洋環境中に存在する細菌によって分解除去されると考え
られているが、分解に関与する細菌に関する情報は少な
い。石油中には有機溶媒であるベンゼン、トルエン、キ
シレンなどが存在しこれらにより微生物が死滅してしま
うため、分解除去の大きな障害となっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】石油中に含まれる多環
芳香族化合物を微生物により分解させるには有機溶媒で
あるベンゼン、トルエン、キシレンなどに対する耐性も
要求されるところ、このような多環芳香族化合物分解機
能および耐溶媒の機能を十分に兼ね備えた微生物は見い
だされていない。したがってこの発明の目的は芳香族化
合物分解性および有機溶媒耐性に優れた微生物を提供す
ることにある。
芳香族化合物を微生物により分解させるには有機溶媒で
あるベンゼン、トルエン、キシレンなどに対する耐性も
要求されるところ、このような多環芳香族化合物分解機
能および耐溶媒の機能を十分に兼ね備えた微生物は見い
だされていない。したがってこの発明の目的は芳香族化
合物分解性および有機溶媒耐性に優れた微生物を提供す
ることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記条件
を兼ね備えた微生物を見いだすべく鋭意検討を重ねた結
果、土壌から分離された菌株、すなわちシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する菌株が上記条件
を兼ね備えていることを見いだし、その発見に基づいて
この発明を完成させたものである。本発明の新規微生物
は、あらかじめ土壌などの試料をベンゼン、トルエン、
キシレンなどの有機溶媒で処理した後、その有機溶媒の
層に移行した細胞を炭素源として芳香族化合物のみを添
加した培地を用い、該培地で生育可能であるか否かを判
断するスクリーニングを行うことにより分離することが
できる。
を兼ね備えた微生物を見いだすべく鋭意検討を重ねた結
果、土壌から分離された菌株、すなわちシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する菌株が上記条件
を兼ね備えていることを見いだし、その発見に基づいて
この発明を完成させたものである。本発明の新規微生物
は、あらかじめ土壌などの試料をベンゼン、トルエン、
キシレンなどの有機溶媒で処理した後、その有機溶媒の
層に移行した細胞を炭素源として芳香族化合物のみを添
加した培地を用い、該培地で生育可能であるか否かを判
断するスクリーニングを行うことにより分離することが
できる。
【０００６】 その分離方法の詳細を以下に例示する。
有機溶媒であるベンゼン、トルエン、キシレンに対する
耐性が要求されるため、採取した土壌をあらかじめ５０
％トルエンなどで処理する。その後、有機溶媒層に移行
した細胞をトリプトン１．０％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１
％、塩化カルシウム０．１％の組成からなる培地（改変
ＬＢ培地と命名、以下「ＬＢ−Ａ培地」と記す。）を基
準とし、芳香族化合物としてナフタレン１．０％および
寒天１．５％を添加した寒天培地で培養して、生育可能
であるか否かを判断するスクリーニングを行う。生育可
能なコロニーを得、それらのうちナフタレンを分解して
コロニーの周りに透明帯を形成したものをさらにナフタ
レンが１．０％濃度となるように溶解した有機溶媒を含
むＬＢ−Ａ培地で培養する。培養後、有機溶媒中のナフ
タレン濃度の低下が最も大きいものを選択する。
有機溶媒であるベンゼン、トルエン、キシレンに対する
耐性が要求されるため、採取した土壌をあらかじめ５０
％トルエンなどで処理する。その後、有機溶媒層に移行
した細胞をトリプトン１．０％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１
％、塩化カルシウム０．１％の組成からなる培地（改変
ＬＢ培地と命名、以下「ＬＢ−Ａ培地」と記す。）を基
準とし、芳香族化合物としてナフタレン１．０％および
寒天１．５％を添加した寒天培地で培養して、生育可能
であるか否かを判断するスクリーニングを行う。生育可
能なコロニーを得、それらのうちナフタレンを分解して
コロニーの周りに透明帯を形成したものをさらにナフタ
レンが１．０％濃度となるように溶解した有機溶媒を含
むＬＢ−Ａ培地で培養する。培養後、有機溶媒中のナフ
タレン濃度の低下が最も大きいものを選択する。
【０００７】次に、上記分離操作によって得られた微生
物の一例であるＮＡ８１３株を、細菌の分類同定法（バ
ージー・マニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー第一版，１９８４年）にしたがって同定試験
を行った。その結果、ＮＡ８１３株は、以下の菌学的性
質を有する。 （ａ）形態 細胞の形および大きさ 大きさ０．７〜１．０×２〜４μｍの桿菌。胞子を形成
しない。 運動性の有無 有り グラム染色 陰性
物の一例であるＮＡ８１３株を、細菌の分類同定法（バ
ージー・マニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー第一版，１９８４年）にしたがって同定試験
を行った。その結果、ＮＡ８１３株は、以下の菌学的性
質を有する。 （ａ）形態 細胞の形および大きさ 大きさ０．７〜１．０×２〜４μｍの桿菌。胞子を形成
しない。 運動性の有無 有り グラム染色 陰性
【０００８】（ｂ）生理学的性質
硝酸塩の還元性 陰性
デンプンの分解性 陰性
色素の生成 水溶性蛍光色素
オキシダーゼ 陽性
カタラーゼ 陽性
生育の範囲
ｐＨ ５．０〜９．０（最適７．０）
温度 １５〜３７℃（最適３０℃ ４１℃
以上での生育はできない） 酸素要求性 好気性 Ｏ−Ｆテスト 酸化性 ゼラチンの加水分解 陰性 （ｃ）その他の性質 ▲１０▼カゼインの加水分解 陰性 ▲１１▼トレハロースの利用 陰性 ▲１２▼ｍｅｓｏ−イノシトールの利用 陰性 ▲１３▼ゲラニオールの利用 陰性
以上での生育はできない） 酸素要求性 好気性 Ｏ−Ｆテスト 酸化性 ゼラチンの加水分解 陰性 （ｃ）その他の性質 ▲１０▼カゼインの加水分解 陰性 ▲１１▼トレハロースの利用 陰性 ▲１２▼ｍｅｓｏ−イノシトールの利用 陰性 ▲１３▼ゲラニオールの利用 陰性
【０００９】以上の菌学的性質からバージー・マニュア
ル第８巻の分類法に従ってシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）属に属する新規菌株であると判断し、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属ＮＡ８１３
株と命名した。この発明の芳香族化合物に対する有機溶
媒の存在下芳香族化合物を分解可能なシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する新規微生物の一
つであるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
ＮＡ８１３株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に
平成５年１１月１９日付けで寄託した。その微生物の受
託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１３９７７（以下、「ＮＡ８１
３株」と記す。）である。この発明に係る微生物は上記
ＮＡ８１３株のほか自然的および人工的変異株も含むも
のである。
ル第８巻の分類法に従ってシュードモナス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）属に属する新規菌株であると判断し、シ
ュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属ＮＡ８１３
株と命名した。この発明の芳香族化合物に対する有機溶
媒の存在下芳香族化合物を分解可能なシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する新規微生物の一
つであるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属
ＮＡ８１３株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に
平成５年１１月１９日付けで寄託した。その微生物の受
託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１３９７７（以下、「ＮＡ８１
３株」と記す。）である。この発明に係る微生物は上記
ＮＡ８１３株のほか自然的および人工的変異株も含むも
のである。
【００１０】 この発明の芳香族化合物に対する有機溶
媒は、微生物が芳香族化合物を分解するとき、芳香族化
合物が有機溶媒の存在により溶解して微生物との接触が
十分になり、その分解効率が大きくなるものであればな
んでもよい。ペンタン、２−ペンタン、シクロペンタ
ン、メチルシクロペンタン、１，３−ペンタジエン、２
−ヘキサン、メチルシクロヘキサン、ブチルシクロヘキ
サン、ヘプタン、１−オクタン、１，７−オクタジエ
ン、１−ドデセン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、
ブロモベンゼン、メトキシトルエンなどの炭化水素類、
メタノール、エタノール、デシルアルコールなどのアル
コール類、アセトン、２−ヘプタノンなどのケトン類、
ジエチルエーテル、ブチルエーテル、ベンジルエーテル
などのエーテル類、その他、ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシドなどが例示される。
媒は、微生物が芳香族化合物を分解するとき、芳香族化
合物が有機溶媒の存在により溶解して微生物との接触が
十分になり、その分解効率が大きくなるものであればな
んでもよい。ペンタン、２−ペンタン、シクロペンタ
ン、メチルシクロペンタン、１，３−ペンタジエン、２
−ヘキサン、メチルシクロヘキサン、ブチルシクロヘキ
サン、ヘプタン、１−オクタン、１，７−オクタジエ
ン、１−ドデセン、ニトロベンゼン、クロロベンゼン、
ブロモベンゼン、メトキシトルエンなどの炭化水素類、
メタノール、エタノール、デシルアルコールなどのアル
コール類、アセトン、２−ヘプタノンなどのケトン類、
ジエチルエーテル、ブチルエーテル、ベンジルエーテル
などのエーテル類、その他、ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシドなどが例示される。
【００１１】
【実施例】本発明の詳細を実施例で説明する。本発明は
これら実施例によってなんら限定されるものではない。
これら実施例によってなんら限定されるものではない。
【００１２】 実施例１
ＮＡ８１３株の採取方法
土壌１０ｇにトルエン１０ｍｌを添加し３０℃で１０日
間穏やかに振盪培養を行った。培養後、培養物を３時間
静置し有機溶媒層と水層に分離し、有機溶媒層０．１ｍ
ｌをナフタレン１％、寒天１．５％を含むＬＢ−Ａ培地
に塗抹し３７℃で７日間静置培養を行った。培養後、生
育したコロニーの中でコロニーの周りに透明帯を生じた
ものを釣菌し単離後１０ｍｌＬＢ−Ａ培地に接種し、更
に最終濃度１％のナフタレンを含むトルエン１０ｍｌを
加え３０℃７日間振盪培養を行った。これらの操作の中
でトルエン存在下で生育しトルエン中のナフタレン濃度
を最も低下させた菌株がこの発明ＮＡ８１３株である。
間穏やかに振盪培養を行った。培養後、培養物を３時間
静置し有機溶媒層と水層に分離し、有機溶媒層０．１ｍ
ｌをナフタレン１％、寒天１．５％を含むＬＢ−Ａ培地
に塗抹し３７℃で７日間静置培養を行った。培養後、生
育したコロニーの中でコロニーの周りに透明帯を生じた
ものを釣菌し単離後１０ｍｌＬＢ−Ａ培地に接種し、更
に最終濃度１％のナフタレンを含むトルエン１０ｍｌを
加え３０℃７日間振盪培養を行った。これらの操作の中
でトルエン存在下で生育しトルエン中のナフタレン濃度
を最も低下させた菌株がこの発明ＮＡ８１３株である。
【００１３】 実施例２
有機溶媒培養耐性試験
菌体の前培養は、大型試験管にＬＢ−Ａ培地１０ｍｌを
入れシリコン栓を付して滅菌後、ＮＡ８１３株を保存ス
ラントから一白金耳採って培地に接種し３７℃で一昼夜
激しく振盪培養した。次に大型試験管にＬＢ−Ａ培地１
０ｍｌを入れ滅菌後、上記ＮＡ８１３株前培養液０．０
２ｍｌを接種した。これを下記表１の濃度となるように
有機溶媒を重層し３０℃で３日間振盪培養を行った。培
養後、静置して有機溶媒層を分離してＮＡ８１３株の増
殖に伴う濁度を分光光度計を用いて波長６６０ｎｍの
Ｏ．Ｄ．（吸光度）で測定した。その結果を下記表１、
表２および表３に示す。
入れシリコン栓を付して滅菌後、ＮＡ８１３株を保存ス
ラントから一白金耳採って培地に接種し３７℃で一昼夜
激しく振盪培養した。次に大型試験管にＬＢ−Ａ培地１
０ｍｌを入れ滅菌後、上記ＮＡ８１３株前培養液０．０
２ｍｌを接種した。これを下記表１の濃度となるように
有機溶媒を重層し３０℃で３日間振盪培養を行った。培
養後、静置して有機溶媒層を分離してＮＡ８１３株の増
殖に伴う濁度を分光光度計を用いて波長６６０ｎｍの
Ｏ．Ｄ．（吸光度）で測定した。その結果を下記表１、
表２および表３に示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【表３】
【００１６】実施例３
ナフタレンの分解試験
前培養は実施例２と同じ方法で行い、次に大型試験管に
ＬＢ−Ａ培地１０ｍｌを入れ滅菌後、上記ＮＡ８１３株
前培養液０．０２ｍｌを接種、さらに最終濃度１％にな
るようにナフタレンを添加した各種有機溶媒１０ｍｌを
重層し３０℃で７日間激しく振盪培養した。培養後２時
間静置し溶媒層と培地層を分離し有機溶媒層を回収しこ
れに無水硫酸ナトリウム１ｇを加え一昼夜放置した。こ
の溶媒５ｍｌを採りロータリーエバポレーターで減圧乾
固させた。この乾固物を再びヘキサン５ｍｌに溶解し残
存ナフタレン量を測定した。
ＬＢ−Ａ培地１０ｍｌを入れ滅菌後、上記ＮＡ８１３株
前培養液０．０２ｍｌを接種、さらに最終濃度１％にな
るようにナフタレンを添加した各種有機溶媒１０ｍｌを
重層し３０℃で７日間激しく振盪培養した。培養後２時
間静置し溶媒層と培地層を分離し有機溶媒層を回収しこ
れに無水硫酸ナトリウム１ｇを加え一昼夜放置した。こ
の溶媒５ｍｌを採りロータリーエバポレーターで減圧乾
固させた。この乾固物を再びヘキサン５ｍｌに溶解し残
存ナフタレン量を測定した。
【００１７】別に対象実験として下記の対象実験（１）
および対象実験（２）を行った。 対象実験（１） 菌体無接種とする以外は同様の操作を行い上記実験と同
じ処理を行い残存するナフタレン量を測定した。 対象実験（２） 上記実験と同培地にあらかじめ滅菌処理を行ったナフタ
レンを直接最終濃度１％なるように懸濁し培養した後、
未分解のナフタレンを５ｍｌヘキサンで抽出しこれに無
水硫酸ナトリウム１ｇを加え以下上記実験同様の処理を
行い残存するナフタレン量を測定した。ナフタレン分解
率は実験処理前後のナフタレン量の差を処理前のナフタ
レン量で除した数値を％ととして表示し、その結果を下
記表４に示す。
および対象実験（２）を行った。 対象実験（１） 菌体無接種とする以外は同様の操作を行い上記実験と同
じ処理を行い残存するナフタレン量を測定した。 対象実験（２） 上記実験と同培地にあらかじめ滅菌処理を行ったナフタ
レンを直接最終濃度１％なるように懸濁し培養した後、
未分解のナフタレンを５ｍｌヘキサンで抽出しこれに無
水硫酸ナトリウム１ｇを加え以下上記実験同様の処理を
行い残存するナフタレン量を測定した。ナフタレン分解
率は実験処理前後のナフタレン量の差を処理前のナフタ
レン量で除した数値を％ととして表示し、その結果を下
記表４に示す。
【００１８】
【表４】
【００１９】
【発明の効果】芳香族化合物の効率的分解に利用するこ
とができる、有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能
な新規微生物を提供することができる。
とができる、有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能
な新規微生物を提供することができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平４−112796（ＪＰ，Ａ)
特開 昭53−41481（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−207378（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−291575（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−207392（ＪＰ，Ａ)
特開 平１−120292（ＪＰ，Ａ)
特表 昭63−503524（ＪＰ，Ａ)
Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ（1992），Ｖｏｌ．58，Ｎ
ｏ．７，ｐ．2237−2244
Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｎａｔｌ
Ｍｅｅｔ Ｄｉｖ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｃ
ｈｅｍ（1989），Ｖｏｌ．29，Ｎｏ.
１，ｐ．79−81
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 1/00
C02F 3/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】 ナフタレンの分解能および有機溶媒耐性
を有するシュードモナス属 sp.NA813 に属する新規微生
物。 - 【請求項２】 改変ＬＢ培地（トリプトン1.0％、酵母
エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、塩化マグネシウム
0.01％、塩化カルシウム0.1％の培地）による培養条件
下でナフタレンの分解能を有し、かつ、10％の有機溶媒
存在下で生育する特徴を有する請求項１記載の新規微生
物。 - 【請求項３】 有機溶媒が炭化水素類、アルコール類、
ケトン類、エーテル類、ジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシドの少なくとも一種またはそれらの混合物
である請求項１または請求項２記載の新規微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34265493A JP3489791B2 (ja) | 1993-12-05 | 1993-12-05 | 有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能な新規微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34265493A JP3489791B2 (ja) | 1993-12-05 | 1993-12-05 | 有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能な新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07155174A JPH07155174A (ja) | 1995-06-20 |
| JP3489791B2 true JP3489791B2 (ja) | 2004-01-26 |
Family
ID=18355452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34265493A Expired - Fee Related JP3489791B2 (ja) | 1993-12-05 | 1993-12-05 | 有機溶媒の存在下芳香族化合物を分解可能な新規微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3489791B2 (ja) |
-
1993
- 1993-12-05 JP JP34265493A patent/JP3489791B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｎａｔｌ Ｍｅｅｔ Ｄｉｖ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｃｈｅｍ（１９８９），Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．１，ｐ．７９−８１ |
| Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９２），Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．７，ｐ．２２３７−２２４４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07155174A (ja) | 1995-06-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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