JP3408258B2 - 皮膚状態改善剤の評価方法及び皮膚外用剤の製造方法 - Google Patents
皮膚状態改善剤の評価方法及び皮膚外用剤の製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、シワや肌荒れ等の好ましくない皮膚状態を
改善したりその悪化を抑制するための皮膚状態改善剤お
よびこれを含有する皮膚状態改善用の皮膚外用剤（以
下、単に「皮膚外用剤」ということもある）を適切に評
価するための評価方法、並びに、皮膚状態改善作用を十
分に有する皮膚外用剤の製造方法に関する。 背景技術 美しいきれいな皮膚は誰しも求めて止まないものであ
るが、又、皮膚の状態は種々の要因によって変化するも
のでもある。例えば、シワの形成状況は、年齢に従っ
て、或いは手入れや光などの損傷によって変化する。し
かしながら、「シワとは何か」、「何故シワが出来るの
か」と言った基本的な問題についてさえ、定説が無いの
が現状である。また、「エラスチンの構造変化がシワの
原因である」とか、「コラーゲンの量の減少がシワの原
因である」とか諸説が提唱されているが、これらの説と
反する現象が観察されたりしており、シワの形成に代表
される皮膚の状態の変化を完全に矛盾無く説明できるに
至っていない。 一方、これまでに、上記シワ等の望ましくない皮膚の
状態を改善したり、あるいはこの様な皮膚状態が悪化す
るのを抑制したりすることを目的とした皮膚状態改善剤
やこれを含有する皮膚外用剤が数多く開発されている
が、これらを評価する際には、前記皮膚状態改善剤等を
塗布した皮膚表面の変化を官能的に評価する方法にもっ
ぱら頼らざるを得なかった。つまり、各種薬物や製剤の
うちから、上記の様な皮膚状態の改善やその悪化の抑制
を効果的に行えるものをスクリーニングするための、普
遍的な評価基準が存在せず、このために、皮膚状態改善
剤やこれを含有する皮膚外用剤等に適切な評価を与える
ことができなかった。 この様に、皮膚状態の改善や皮膚状態の悪化の抑制の
ための手段を探索する上で、皮膚の状態の変化を正しく
鑑別すること、特に定量的に鑑別することは非常に重要
でありながら、まだこの様な識別手段は得られていない
のが現状である。そこで、皮膚状態改善剤等を適切に評
価するために皮膚状態の変化を正しく鑑別する手段の開
発が望まれていた。 発明の開示 本発明はこの様な状況下行われたものであり、皮膚状
態の改善や皮膚状態の悪化抑制のための皮膚状態改善剤
およびこれを含有する皮膚状態改善用の皮膚外用剤を適
切に評価する方法を提供することを課題とする。また、
本発明は、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用剤の製造
方法において、皮膚状態改善作用を十分に有する皮膚外
用剤の製造方法を提供することを課題とする。 なお、本明細書において「皮膚状態改善剤」の用語
は、皮膚状態の改善作用や皮膚状態の悪化抑制作用を有
する皮膚状態改善のための有効成分のみからなる薬剤を
示すものとして用いられる。 本発明者等は、上記課題を解決するために、シワ等の
皮膚の状態の変化を適切に鑑別する手段を求めて、実際
のシワの形成過程の克明な組織観察を行い、鋭意研究を
重ねた結果、シワ、肌荒れ等で皮膚の状態が悪いとき
程、真皮のコラーゲン線維束の構造が秩序だっておらず
明確でないことを見いだし、つまり、真皮のコラーゲン
線維束の秩序の度合いを指標とすることにより、シワの
形成・シワの改善等の皮膚の状態及びその変化を鑑別し
うることを見いだし、本発明を完成させるに至った。な
お、皮膚表面形態と真皮の形態が相関性良く互いに影響
しあっていること、取り分け、皮膚表面のシワと同様に
真皮にもシワに対応する溝が形成されていることは、こ
れまでに全く知られていなかった事象である。 すなわち本発明は、状態の悪い皮膚部位を少なくとも
１箇所有する動物を用いて皮膚状態改善剤またはこれを
含有する皮膚外用剤を評価する方法であって、前記皮膚
部位に皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤
を塗布した際の、塗布前後における前記皮膚部位の真皮
コラーゲン線維束の秩序度合いの変化量を指標とする方
法を提供する。 本発明の評価方法によれば、真皮コラーゲン線維束の
秩序度合いを大きく改善することができる皮膚状態改善
剤またはこれを含有する皮膚外用剤程、皮膚状態改善作
用に優れると評価される。 本発明の評価方法に用いる動物は、状態の悪い皮膚部
位を少なくとも１箇所有するが、この皮膚の悪い状態と
して、具体的には、シワや肌荒れ等が挙げられる。 また、本発明に用いる、状態の悪い皮膚部位を少なく
とも１箇所有する動物として、具体的には、長期間紫外
線を照射されたマウスや背部剃毛皮膚に陰イオン界面活
性剤を塗布されたモルモット等を挙げることができる。 また、本発明の評価方法において、真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いは、具体的には、前記皮膚部位の少な
くとも一部を採取し作製した真皮標本を100〜10000倍で
顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定する
ことにより測定することができる。 （判定基準） 0:観察領域全域でコラーゲンの線維束構造が認められ
ない。 1:過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構
造への変移が認められる。 2:一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認め
られるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。 3:全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認めら
れ、崩壊・変性はほぼ認められない。 ここで、本発明の評価方法において真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いに関して、上記判定基準を用いた場合
には、前記皮膚状態改善剤等の塗布前の評点に比べて、
塗布後の評点が大きい皮膚状態改善剤等程、皮膚状態改
善作用に優れると評価される。 さらに本発明は、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用
剤の製造方法であって、状態の悪い皮膚部位を少なくと
も１箇所有する動物を準備し、前記皮膚部位に皮膚外用
剤を0.01g/10cm2・１回の量で１日１回８週間連続して
塗布し、塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲ
ン線維束の秩序度合いについて、前記皮膚部位の少なく
とも一部を採取し作製した真皮標本を100〜10000倍で顕
微鏡写真撮影し、得られた写真を上記と同様の判定基準
で判定することにより測定した際の、塗布後の真皮コラ
ーゲン線維束の秩序度合いを塗布前の真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いで除した値が1.5以上となるように皮
膚状態改善剤の含有量を調整することを含む皮膚外用剤
の製造方法を提供するものである。 上記本発明の製造方法が適用される皮膚外用剤として
は、具体的には、シワ改善化粧料、肌荒れ改善化粧料等
が挙げられる。 図面の簡単な説明 図１は、マウス光老化モデルにおける皮膚表面形態の
変化を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ａは紫外線
照射前の写真、Ｂは照射開始後２週間の写真、Ｃは照射
開始後５週間の写真、Ｄは照射開始後10週間の写真であ
る。 図２は、マウス光老化モデルにおける真皮表面形態の
変化を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ｅは紫外線
照射前の写真、Ｆは照射開始後２週間の写真、Ｇは照射
開始後５週間の写真、Ｈは照射開始後10週間の写真であ
る。 図３は、マウス光老化モデルにおける真皮コラーゲン
線維束の構造変化を表す電子顕微鏡写真（500倍）であ
る。Ｉは紫外線照射前の写真、Ｊは照射開始後２週間の
写真、Ｋは照射開始後５週間の写真、Ｌは照射開始後10
週間の写真である。 図４は、マウス光老化モデルにおける真皮コラーゲン
線維束の構造変化を表す電子顕微鏡写真（2500倍）であ
る。Ｍは紫外線照射前の写真、Ｎは照射開始後２週間の
写真、Ｏは照射開始後５週間の写真、Ｐは照射開始後10
週間の写真である。 図５は、マウス光老化モデルの真皮コラーゲン線維束
構造の経時変化を、図４に示すのと同様の電子顕微鏡写
真を一定の基準で評価して得られる評点と紫外線照射時
間の関係で示す図である。●は、マウス光老化モデルの
プロットを、○は、非照射コントロールマウスのプロッ
トをそれぞれ表す。 図６は、マウス光老化モデルの、画像解析により定量
した皮膚表面のシワの量（シワの面積％）と紫外線照射
時間の関係を示す図である。●は、マウス光老化モデル
のプロットを、○は、非照射コントロールマウスのプロ
ットをそれぞれ表す。 図７は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
皮膚表面形態を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ｑ
はエタノール投与マウスの写真、Ｒはデキサメタゾン投
与マウスの写真である。 図８は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
真皮表面形態を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ｓ
はエタノール投与マウスの写真、Ｔはデキサメタゾン投
与マウスの写真である。 図９は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
真皮コラーゲン線維束の構造を表す電子顕微鏡写真（50
0倍）である。Ｕはエタノール投与マウスの写真、Ｖは
デキサメタゾン投与マウスの写真である。 図10は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
真皮コラーゲン線維束の構造を表す電子顕微鏡写真（25
00倍）である。Ｗはエタノール投与マウスの写真、Ｘは
デキサメタゾン投与マウスの写真である。 発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明の評価方法 本発明者等は、上述のように、真皮のコラーゲン線維
束の秩序の度合いを指標とすることにより皮膚の状態及
びその変化を鑑別しうることを見いだした。本発明の評
価方法は、この技術を利用して、予め作成した或いは用
意した状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動
物の前記皮膚部位に皮膚状態改善剤等の検体を塗布し、
それによる皮膚状態の変化を、真皮のコラーゲン線維束
の秩序の度合いの変化を指標として追跡することによ
り、前記検体の皮膚状態の改善作用を定量的に測定する
ものである。 ここで、上記状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所
有する動物の皮膚の悪い状態を目的に合わせて選択すれ
ば、この選択された皮膚の悪い状態、例えば、シワや肌
荒れ等を改善するのに適切な皮膚状態改善剤や皮膚外用
剤を評価・スクリーニングすることが出来る。 この様な状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有す
る動物としては、既に実験動物として確立している、紫
外線長期照射マウス（以下、「マウス光老化モデル」と
いうこともある）や剃毛皮膚をラウリル硫酸ナトリウム
等の陰イオン界面活性剤を含む化学物質で処理したモル
モット（以下「モルモット損傷皮膚モデル」ということ
もある）、感作性物質で感作後に惹起させて炎症を起こ
した動物等のモデル動物を使用することも可能である
し、肌荒れやシワで悩んでいる人をパネラーに使用する
ことも可能である。 しかしながら人を用いる場合には、バイオプシー等の
作業が伴うので、上記モデル動物等を用いるのが好まし
い。また、これら動物のうちでも、本発明で用いる状態
の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物として好
ましいものは、上記マウス光老化モデルやモルモット損
傷皮膚モデルである。さらに、モルモット損傷皮膚モデ
ルのうちでは、背部剃毛皮膚を陰イオン界面活性剤で処
理されたモルモットが本発明の評価方法に好ましく用い
られる。なお、本発明の評価方法においては、マウス光
老化モデルはシワを、モルモット損傷皮膚モデルは肌荒
れを、それぞれ改善するのに適切な皮膚状態改善剤や皮
膚外用剤を評価・スクリーニングするのに好適に用いら
れる。 また、本発明の評価方法において、上記動物の状態の
悪い皮膚部位に皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮
膚外用剤を塗布する方法については、定量的な塗布が行
える方法であれば特に制限されない。また、塗布の際に
前記皮膚状態改善剤等を適当な希釈剤で希釈して用いる
ことも可能である。 本発明の評価方法において真皮のコラーゲン線維束の
秩序の度合いを測定するにあたって必要とされる真皮
は、測定対象部位の皮膚を採取しこれを常法に従って処
理することによって得ることが出来る。この様な皮膚か
ら真皮標本を得る方法としては、例えば、上記採集され
た皮膚をNaOH等で処理するNaOH法が例示できる。真皮の
コラーゲン線維束は、この様にして得られる真皮標本を
電子顕微鏡などで観察することにより見ることが出来
る。さらに、この真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの
測定は、例えば、この電子顕微鏡の像を画像解析した
り、適当な判定基準に従って肉眼観察によりスコアーを
付すことにより行うことができる。 電子顕微鏡の像から肉眼観察により真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いを測定する方法として、具体的には、
上記真皮標本の電子顕微鏡像を100〜10000倍程度、好ま
しくは500〜2500倍程度の倍率で写真撮影し、得られた
写真を、例えば、以下に示す判定基準で判定することに
より測定する方法が挙げられる。 （判定基準） 0:観察領域全域でコラーゲンの線維束構造が認められ
ない。 1:過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構
造への変移が認められる。 2:一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認め
られるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。 3:全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認めら
れ、崩壊・変性はほぼ認められない。 なお、判定基準は上記に制限されず、基準をより詳細
に分類すること等も可能であるが、判定に費やす時間や
判定の普遍性等を考慮すれば、本発明においては上記基
準を標準的に用いることが適当であると考えられる。 本発明の評価方法においては、この様にして真皮コラ
ーゲン線維束の秩序度合いが測定されるが、前記皮膚状
態改善剤等の塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序度合
いに比べて、塗布後の真皮コラーゲン線維束の秩序度合
いを大きく改善できる皮膚状態改善剤等程、皮膚状態改
善作用に優れると評価される。また、例えば、上記判定
基準を用いた場合には、前記皮膚状態改善剤等の塗布前
の評点に比べて、塗布後の評点が大きい皮膚状態改善剤
等程、皮膚状態改善作用に優れると評価される。さら
に、この場合には、塗布前後の評点の差や比を求めて、
これを皮膚状態改善作用の評価に用いることも可能であ
る。 また、本発明の評価方法においては、真皮コラーゲン
線維束の秩序度合いを測定するために皮膚が採取される
ので、皮膚状態改善剤等を塗布する前後での真皮コラー
ゲン線維束の秩序度合いを、実際に全く同じ皮膚部位に
おいて測定することはできないが、この方法における皮
膚採取量は微量であり、前記塗布前と塗布後において極
近辺の皮膚を採取することにより、実質的に塗布の前後
で同じ皮膚部位に対して測定が行われたものと考えるこ
とができる。 さらに本発明の評価方法において、状態の悪い皮膚部
位を少なくとも１箇所有する動物として、上記モデル動
物のような全く同様に皮膚状態が悪い動物を何匹か用い
る場合には、皮膚状態改善剤等の検体を塗布しない個体
の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定してこれを
塗布前の値として、また、これとは別の個体に検体を塗
布した後に真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定し
てこれを塗布後の値として、塗布前後の真皮コラーゲン
線維束の秩序度合いの変化量を求めて検体評価の指標に
用いることも可能である。 また、本発明の評価方法は、皮膚状態改善作用を有す
る経皮投与以外の薬剤の評価にも応用できるものであ
る。 以下に、マウス光老化モデルをシワモデルとして用い
た際の、シワ改善剤の評価・スクリーニング例、及びモ
ルモット損傷皮膚モデルを肌荒れモデルとして用いた際
の、肌荒れ改善剤の評価・スクリーニング例について述
べる。 １）マウス光老化モデルを用いたシワ改善剤の評価 まず、マウス光老化モデルを作製し、作製時における
マウスの皮膚状態の変化と真皮コラーゲン線維束の秩序
度合いの変化の関係を調べた。 ａ）マウス光老化モデルにおける皮膚状態の変化と真皮
コラーゲン線維束の秩序度合いの変化の関係 ６匹ずつ５群のヘアレスマウス（Skh:HR−１、雌性、
８週齢）を準備し、その内の１群については、以下の紫
外線照射を行わずに８週齢の時点、すなわち紫外線照射
前の状態で、各マウスから皮膚及び皮膚表面形態レプリ
カを採取した。残りの４群については、各マウスに紫外
線Ｂ（東芝SEランプ、60mJ/cm2）を１日１回、週５回の
割合で照射しながら飼育した。 上記４群の内の１群については、照射開始から１週間
後に紫外線照射をやめ、その時点で各マウスから皮膚及
び皮膚表面形態レプリカを採取した。同様にして、別の
１群については照射開始から２週間後に、さらに別の１
群については５週間後に、それぞれ紫外線照射をやめて
その時点で各マウスから皮膚及び皮膚表面形態レプリカ
を採取した。さらに、最後の１群については照射開始か
ら10週間後まで紫外線照射を続け、得られたマウスをマ
ウス光老化モデルとした。なお、得られたマウス光老化
モデルは、合計で3J/cm2の紫外線を照射されたマウスで
ある。また、得られたマウス光老化モデルからも皮膚及
び皮膚表面形態レプリカをそれぞれ採取した。 上記の様にして各群のマウスから採取した皮膚につい
て、その表面形態を走査電子顕微鏡により50倍で写真撮
影した後、前記皮膚からNaOH法により真皮標本を作製
し、得られた真皮標本の表面形態を50倍で、コラーゲン
線維束構造を500倍および2500倍で、それぞれ走査電子
顕微鏡により写真撮影した。 図１に、上記マウス群のうち紫外線照射１週間のマウ
ス群を除く、各マウス群６匹のうちの代表的な個体の皮
膚表面形態の倍率50倍での電子顕微鏡写真（A:紫外線照
射前、B:照射開始後２週間、C:照射開始後５週間、D:照
射開始後10週間）を、図２にその真皮表面形態の倍率50
倍での電子顕微鏡写真（E:紫外線照射前、F:照射開始後
２週間、G:照射開始後５週間、H:照射開始後10週間）
を、図３にその真皮コラーゲン線維束構造の倍率500倍
での電子顕微鏡写真（I:紫外線照射前、J:照射開始後２
週間、K:照射開始後５週間、L:照射開始後10週間）を、
図４にその真皮コラーゲン線維束構造の倍率2500倍での
電子顕微鏡写真（M:紫外線照射前、N:照射開始後２週
間、O:照射開始後５週間、P:照射開始後10週間）を、そ
れぞれ示す。 これらの図より、シワが形成される際、それに対応す
るように真皮の表面にも溝が形成されており、皮膚表面
の形態の変化は真皮の表面の形態の変化に対応している
こと、更に真皮表面の変化は真皮に於けるコラーゲン線
維束の構造の変化、即ち、コラーゲン線維束が明確でな
くなる等のコラーゲン線維束の秩序の低下を反映してい
ることが判る。 また、上記紫外線照射前、照射開始後１週間、照射開
始後２週間、照射開始後５週間、照射開始後10週間（＝
マウス光老化モデル）の各マウス群における、真皮コラ
ーゲン線維束構造の倍率2500倍での電子顕微鏡写真をも
とに、各群マウスの真皮コラーゲン線維束構造のそれぞ
れについて、上述した判定基準に従って０〜３のスコア
ーを付した。得られた結果から、紫外線照射の各段階に
おける各群６匹のマウスのスコアーの平均値と標準偏差
を算出した。ここで、照射開始後10週間群、すなわちマ
ウス光老化モデル群におけるスコアー平均値は、0.82で
あった。各群の平均値を図５に●プロットとして、前記
標準偏差と共に示す。なお、図５に示される○プロット
は、上記とは別に、５匹ずつ５群のヘアレスマウス（Sk
h:HR−１、雌性、８週齢）を紫外線照射を行わずに飼育
した（以下、これにより得られたマウスを「非照射コン
トロールマウス」という）際の、上記同様の方法で評価
されたマウスの真皮コラーゲン線維束構造についてのス
コアー平均値を表すものである。図５において、横軸は
紫外線照射時間を、縦軸は上記の方法で評価されたマウ
スの真皮コラーゲン線維束構造についてのスコアーを示
す。 さらに、上記マウス光老化モデル作製時におけるマウ
ス皮膚表面の構造変化の様子を、次の方法で測定される
シワの量の変化によって調べた。すなわち、上記紫外線
照射時間の異なる各マウス群より採取した皮膚表面レプ
リカに、入射角20度でキセノンランプによる光照射を行
い、出来たシワの陰影を画像解析により定量すること
で、シワの量を測定した。ここで、シワの量は、皮膚の
全面積に対するシワ面積の百分率（％）で表される。こ
の様に測定されたシワの量の各群６匹のマウスの平均値
と標準偏差を算出した。得られた平均値を図６に●プロ
ットとして、前記標準偏差と共に示す。なお、図６に示
される○プロットは、非照射コントロールマウスの、上
記同様の方法で測定されたシワの量の平均値を表すもの
である。また、図６において、横軸は紫外線照射時間
を、縦軸は上記の方法で測定されたシワの量を示す。 図５および図６より、マウス光老化モデル作製時にお
ける、皮膚表面でのシワの量の変化と、真皮でのコラー
ゲン線維束の秩序の度合いの変化はよく対応しているこ
とがわかる。また、上記で得られたシワの量の平均値と
真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いを評価したスコア
ーの平均値との相関係数を算出したところ、0.91であ
り、シワの量が真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いを
評価したスコアー値で定量出来ることが判明した。 次に、この様にして得られるマウス光老化モデルをシ
ワモデルとして用いて、紫外線照射により生じたシワ等
を有する状態の悪い皮膚が、皮膚状態改善剤または皮膚
外用剤によりどの様に変化するかを調べ、さらに、本発
明の評価方法によりシワ改善剤の評価を行った。 ｂ）シワ改善剤の評価・スクリーニング 上記と同様にして作製したマウス光老化モデル（紫外
線照射10週間のマウス）に、デキサメタゾンを0.05％の
エタノール溶液として、ローション剤の剤形で塗布した
後の、マウスの皮膚状態と真皮コラーゲン線維束の秩序
度合いを上記同様の方法で調べ、デキサメタゾンのシワ
改善剤としての評価を行った。 すなわち、マウス光老化モデルの１群５匹の各マウス
被験部位には、0.05％デキサメタゾンエタノール溶液
を、もう１群５匹の各マウス被験部位にはコントロール
としてエタノールのみを、それぞれ0.05mlづつ１日/1回
の割合で、８週間連日塗布した。塗布終了後、各マウス
の皮膚を採取しその表面形態を走査電子顕微鏡により写
真撮影した。さらに、前記採取された皮膚から上記同様
に真皮標本を作製し、その表面形態とコラーゲン線維束
構造を走査電子顕微鏡により写真撮影した。 各群５匹のうちの代表的な個体のそれぞれについて、
図７に皮膚表面形態の倍率50倍での電子顕微鏡写真（Q:
エタノール投与マウス、R:デキサメタゾン投与マウス）
を、図８に真皮表面形態の倍率50倍での電子顕微鏡写真
（S:エタノール投与マウス、T:デキサメタゾン投与マウ
ス）を、図９に真皮コラーゲン線維束構造の倍率500倍
での電子顕微鏡写真（U:エタノール投与マウス、V:デキ
サメタゾン投与マウス）を、図10に真皮コラーゲン線維
束構造の倍率2500倍での電子顕微鏡写真（W:エタノール
投与マウス、X:デキサメタゾン投与マウス）を、それぞ
れ示す。 上記図１〜４およびこれらの図より、デキサメタゾン
投与マウスはエタノール投与マウスに比べ皮膚表面形態
において皮膚状態の優れた改善が認められると同時に、
真皮に於けるコラーゲン線維束の秩序の度合いについて
も同様の改善が認められる。 さらに、上記で得られた真皮コラーゲン線維束構造の
倍率2500倍での電子顕微鏡写真をもとに、エタノール投
与群およびデキサメタゾン投与群のそれぞれのマウスの
真皮コラーゲン線維束の秩序度合いについて、上述した
判定基準に従って０〜３のスコアーを付した。結果は、
エタノール投与群については５匹の平均値で0.78であ
り、デキサメタゾン投与群については５匹の平均値で1.
71であった。 これらの値を、本発明の評価方法に従って、上記ａ）
で求めたマウス光老化モデルの皮膚状態改善剤塗布前の
真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを示すスコアー値と
比較すると、皮膚状態の改善度合いはデキサメタゾン投
与群については1.71/0.82＝2.09で、また、エタノール
投与群については0.78/0.82＝0.95となる。あるいは、
デキサメタゾン投与における皮膚状態の改善度合いは、
ローション基剤であるエタノールの影響を勘案すると、
デキサメタゾン投与群のスコアー平均値／エタノール投
与群のスコアー平均値で1.71/0.78＝2.28として算出さ
れる。 この様に、デキサメタゾンローションの塗布前に比べ
て塗布後で真皮コラーゲン線維束の秩序度合いが著しく
向上していることから、本発明の評価方法によれば、デ
キサメタゾンは優れたシワ改善作用を有し、これを含有
するローションは、シワ改善用として有用な皮膚外用剤
と判定される。 この様に、皮膚表面形態の走査顕微鏡写真からデキサ
メタゾンローションのシワ改善作用が認められるのと同
様に、本発明の評価方法によっても、デキサメタゾンロ
ーションはシワ改善用として有用な皮膚外用剤と判定さ
れる。 ２）モルモット損傷皮膚モデルを用いた肌荒れ改善剤の
評価 ａ）肌荒れモデルの作製 ハートレー系白色種モルモット（体重250〜300g）３
匹の背部をそれぞれ剃毛し、ラウリル硫酸ナトリウムを
１％含有するワセリンを48時間閉塞経皮投与して、投与
終了から２日間おいたモルモットを肌荒れモデルとし
た。このモルモット肌荒れモデル３匹の背部皮膚をそれ
ぞれ採取して真皮標本を作製し、電子顕微鏡写真を撮影
して、真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを上記同様に
スコアー判定し、３匹の平均値を算出したところ、結果
は0.89であった。 ｂ）肌荒れ改善剤の評価・スクリーニング 上記と同様にして作製したモルモットの肌荒れモデル
３匹の背部皮膚に、ポリメタクリロイルフォスファチジ
ルコリンを0.5％含有するエタノール溶液を、８週間連
日塗布したところ、真皮コラーゲン線維束の秩序度合い
のスコアーは2.11（３匹の平均値）に上がった。この値
を、本発明の評価方法に従って、上記ａ）で求めたモル
モット肌荒れモデルの前記エタノール溶液塗布前の真皮
コラーゲン線維束の秩序度合いを示すスコアー値と比較
すると、皮膚状態の改善度合いは、2.11/0.89＝2.37と
なる。この様に、ポリメタクリロイルフォスファチジル
コリン含有エタノール溶液の塗布前に比べて塗布後で真
皮コラーゲン線維束の秩序度合いが著しく向上している
ことから、本発明の評価方法によれば、ポリメタクリロ
イルフォスファチジルコリンは優れた肌荒れ改善剤と判
定される。 また、上記ポリメタクリロイルフォスファチジルコリ
ン含有エタノール溶液の塗布前後におけるモルモット肌
荒れモデルの皮膚表面形態の違いを肉眼で観察しても、
塗布後に肌荒れはよく回復していた。 （２）本発明の皮膚外用剤の製造方法 本発明の皮膚外用剤の製造方法は、皮膚状態改善剤を
含有する皮膚外用剤の製造方法に関するものであり、状
態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物を準備
し、前記皮膚部位に皮膚外用剤を0.01g/10cm2・１回の
量で１日１回８週間連続して塗布し、塗布前後における
前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いにつ
いて、前記皮膚部位の少なくとも一部を採取し作製した
真皮標本を100〜10000倍、好ましくは、500〜2500倍で
顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定する
ことにより判定した際の、塗布後の真皮コラーゲン線維
束の秩序度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序
度合いで除した値が1.5以上となるように皮膚状態改善
剤の含有量を調整する工程を含むことを特徴とする。 （判定基準） 0:観察領域全域でコラーゲンの線維束構造が認められ
ない。 1:過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構
造への変移が認められる。 2:一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認め
られるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。 3:全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認めら
れ、崩壊・変性はほぼ認められない。 本発明の皮膚外用剤の製造方法は、上記皮膚状態改善
剤の含有量を調整する工程を含むことを除いては、通常
の皮膚外用剤の製造方法と同様とすることができる。例
えば、上記の様にして皮膚状態改善剤の含有量を調整し
ながら、製造しようとする皮膚外用剤の剤形に応じた成
分組成を決定した後、前記剤形の皮膚外用剤が通常採る
製造方法のうちから適当な方法を適宜選択し、それに従
って製造する方法等を挙げることができる。 この様な本発明の製造方法により得られる皮膚外用剤
は、上記皮膚状態改善剤の含有量を調整する際に用いた
状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物の皮
膚状態の悪化の原因となった皮膚異常又はそれと近似の
皮膚異常を改善する作用に優れる。例えば、状態の悪い
皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物として上記
（１）で詳述したマウス光老化モデルを用いれば、この
モデルはシワモデルの代表的なモデルであるので、皮膚
外用剤としては、シワ改善作用に優れる皮膚外用剤が得
られ、肌荒れモデルとして代表的なモルモット損傷皮膚
モデルを用いれば、肌荒改善作用に優れた皮膚外用剤が
得られる。 また、本発明の製造方法が適用される皮膚外用剤とし
ては、化粧料や、抗炎症剤、抗真菌剤などの皮膚外用医
薬などが例示でき、これらの内では、化粧料が好まし
く、さらに、化粧料の内では、上記製造方法において優
れた動物モデルを用いることが可能な、シワ改善化粧料
と肌荒れ改善化粧料が好ましい。 実施例 以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
る。 下記の表１に示す処方に従って剤形がクリームの化粧
料を作製した。即ち、Ｂ成分を混練りし、Ａ成分で希釈
した後、80℃に温調し、これに予め80℃に温調したＣ成
分を徐々に加え乳化し、攪拌冷却しクリームを得た。
尚、処方の数値は重量部を表す。 次いで、得られた４種類の化粧料を、上述のマウス光
老化モデルと同様にして10週間の紫外線照射を行うこと
により作製されたマウス光老化モデルの被験皮膚部位
に、0.01g/10cm2・１回の量で１日１回８週間連続して
塗布した際の、化粧料の塗布前後における前記皮膚部位
の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの変化を調べた。
ここで、真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いは、前記
皮膚部位の一部を採取し作製した真皮標本を2500倍で顕
微鏡写真撮影し、得られた写真を上述したのと同様の判
定基準で０〜３のいずれかに判定することにより測定し
た。この方法で測定された塗布後の真皮コラーゲン線維
束の秩序の度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩
序の度合いで除した値を評価に用いた。結果をコラーゲ
ン線維束改善度として表１に示す。 また、シワに悩むパネラー40名を任意に10名ずつ１〜
４の４グループに分けて、上記で得られた化粧料１〜４
のうちグループ番号に対応する番号の化粧料を、通常の
方法で２ヶ月間連続使用してもらった。使用期間終了
後、シワの改善状況をアンケート調査した。この結果も
表１に併せて記す。 これらの結果より、本発明の評価方法による評価結果
は、従来のパネラー等を用いた評価方法による評価結果
によく対応していることがわかる。 また、上記で得られたコラーゲン線維束改善度の測定
結果を本発明の製造方法に応用することが可能である。
すなわち、表１の化粧料１にデキサメタゾンを配合して
シワ改善用の皮膚外用剤を製造する際には、デキサメタ
ゾン配合量を概ね表１の化粧料３に示す配合量以上にし
て製造すればよいことがわかる。同様にベクロメタゾン
については、表１の化粧料４の配合量で十分であり、さ
らに少量の配合量による検討も可能であることがわか
る。産業上の利用性 本発明によれば、シワ、肌荒れ等の皮膚状態の改善や
皮膚状態の悪化抑制のための皮膚状態改善剤やこれを含
有する皮膚外用剤を適切に評価する手段を提供できる。
また、本発明によれば、皮膚状態改善剤を含有する皮膚
外用剤の製造方法において、皮膚状態改善作用を十分に
有する皮膚外用剤の製造方法を提供することが可能であ
る。
改善したりその悪化を抑制するための皮膚状態改善剤お
よびこれを含有する皮膚状態改善用の皮膚外用剤（以
下、単に「皮膚外用剤」ということもある）を適切に評
価するための評価方法、並びに、皮膚状態改善作用を十
分に有する皮膚外用剤の製造方法に関する。 背景技術 美しいきれいな皮膚は誰しも求めて止まないものであ
るが、又、皮膚の状態は種々の要因によって変化するも
のでもある。例えば、シワの形成状況は、年齢に従っ
て、或いは手入れや光などの損傷によって変化する。し
かしながら、「シワとは何か」、「何故シワが出来るの
か」と言った基本的な問題についてさえ、定説が無いの
が現状である。また、「エラスチンの構造変化がシワの
原因である」とか、「コラーゲンの量の減少がシワの原
因である」とか諸説が提唱されているが、これらの説と
反する現象が観察されたりしており、シワの形成に代表
される皮膚の状態の変化を完全に矛盾無く説明できるに
至っていない。 一方、これまでに、上記シワ等の望ましくない皮膚の
状態を改善したり、あるいはこの様な皮膚状態が悪化す
るのを抑制したりすることを目的とした皮膚状態改善剤
やこれを含有する皮膚外用剤が数多く開発されている
が、これらを評価する際には、前記皮膚状態改善剤等を
塗布した皮膚表面の変化を官能的に評価する方法にもっ
ぱら頼らざるを得なかった。つまり、各種薬物や製剤の
うちから、上記の様な皮膚状態の改善やその悪化の抑制
を効果的に行えるものをスクリーニングするための、普
遍的な評価基準が存在せず、このために、皮膚状態改善
剤やこれを含有する皮膚外用剤等に適切な評価を与える
ことができなかった。 この様に、皮膚状態の改善や皮膚状態の悪化の抑制の
ための手段を探索する上で、皮膚の状態の変化を正しく
鑑別すること、特に定量的に鑑別することは非常に重要
でありながら、まだこの様な識別手段は得られていない
のが現状である。そこで、皮膚状態改善剤等を適切に評
価するために皮膚状態の変化を正しく鑑別する手段の開
発が望まれていた。 発明の開示 本発明はこの様な状況下行われたものであり、皮膚状
態の改善や皮膚状態の悪化抑制のための皮膚状態改善剤
およびこれを含有する皮膚状態改善用の皮膚外用剤を適
切に評価する方法を提供することを課題とする。また、
本発明は、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用剤の製造
方法において、皮膚状態改善作用を十分に有する皮膚外
用剤の製造方法を提供することを課題とする。 なお、本明細書において「皮膚状態改善剤」の用語
は、皮膚状態の改善作用や皮膚状態の悪化抑制作用を有
する皮膚状態改善のための有効成分のみからなる薬剤を
示すものとして用いられる。 本発明者等は、上記課題を解決するために、シワ等の
皮膚の状態の変化を適切に鑑別する手段を求めて、実際
のシワの形成過程の克明な組織観察を行い、鋭意研究を
重ねた結果、シワ、肌荒れ等で皮膚の状態が悪いとき
程、真皮のコラーゲン線維束の構造が秩序だっておらず
明確でないことを見いだし、つまり、真皮のコラーゲン
線維束の秩序の度合いを指標とすることにより、シワの
形成・シワの改善等の皮膚の状態及びその変化を鑑別し
うることを見いだし、本発明を完成させるに至った。な
お、皮膚表面形態と真皮の形態が相関性良く互いに影響
しあっていること、取り分け、皮膚表面のシワと同様に
真皮にもシワに対応する溝が形成されていることは、こ
れまでに全く知られていなかった事象である。 すなわち本発明は、状態の悪い皮膚部位を少なくとも
１箇所有する動物を用いて皮膚状態改善剤またはこれを
含有する皮膚外用剤を評価する方法であって、前記皮膚
部位に皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮膚外用剤
を塗布した際の、塗布前後における前記皮膚部位の真皮
コラーゲン線維束の秩序度合いの変化量を指標とする方
法を提供する。 本発明の評価方法によれば、真皮コラーゲン線維束の
秩序度合いを大きく改善することができる皮膚状態改善
剤またはこれを含有する皮膚外用剤程、皮膚状態改善作
用に優れると評価される。 本発明の評価方法に用いる動物は、状態の悪い皮膚部
位を少なくとも１箇所有するが、この皮膚の悪い状態と
して、具体的には、シワや肌荒れ等が挙げられる。 また、本発明に用いる、状態の悪い皮膚部位を少なく
とも１箇所有する動物として、具体的には、長期間紫外
線を照射されたマウスや背部剃毛皮膚に陰イオン界面活
性剤を塗布されたモルモット等を挙げることができる。 また、本発明の評価方法において、真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いは、具体的には、前記皮膚部位の少な
くとも一部を採取し作製した真皮標本を100〜10000倍で
顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定する
ことにより測定することができる。 （判定基準） 0:観察領域全域でコラーゲンの線維束構造が認められ
ない。 1:過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構
造への変移が認められる。 2:一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認め
られるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。 3:全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認めら
れ、崩壊・変性はほぼ認められない。 ここで、本発明の評価方法において真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いに関して、上記判定基準を用いた場合
には、前記皮膚状態改善剤等の塗布前の評点に比べて、
塗布後の評点が大きい皮膚状態改善剤等程、皮膚状態改
善作用に優れると評価される。 さらに本発明は、皮膚状態改善剤を含有する皮膚外用
剤の製造方法であって、状態の悪い皮膚部位を少なくと
も１箇所有する動物を準備し、前記皮膚部位に皮膚外用
剤を0.01g/10cm2・１回の量で１日１回８週間連続して
塗布し、塗布前後における前記皮膚部位の真皮コラーゲ
ン線維束の秩序度合いについて、前記皮膚部位の少なく
とも一部を採取し作製した真皮標本を100〜10000倍で顕
微鏡写真撮影し、得られた写真を上記と同様の判定基準
で判定することにより測定した際の、塗布後の真皮コラ
ーゲン線維束の秩序度合いを塗布前の真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いで除した値が1.5以上となるように皮
膚状態改善剤の含有量を調整することを含む皮膚外用剤
の製造方法を提供するものである。 上記本発明の製造方法が適用される皮膚外用剤として
は、具体的には、シワ改善化粧料、肌荒れ改善化粧料等
が挙げられる。 図面の簡単な説明 図１は、マウス光老化モデルにおける皮膚表面形態の
変化を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ａは紫外線
照射前の写真、Ｂは照射開始後２週間の写真、Ｃは照射
開始後５週間の写真、Ｄは照射開始後10週間の写真であ
る。 図２は、マウス光老化モデルにおける真皮表面形態の
変化を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ｅは紫外線
照射前の写真、Ｆは照射開始後２週間の写真、Ｇは照射
開始後５週間の写真、Ｈは照射開始後10週間の写真であ
る。 図３は、マウス光老化モデルにおける真皮コラーゲン
線維束の構造変化を表す電子顕微鏡写真（500倍）であ
る。Ｉは紫外線照射前の写真、Ｊは照射開始後２週間の
写真、Ｋは照射開始後５週間の写真、Ｌは照射開始後10
週間の写真である。 図４は、マウス光老化モデルにおける真皮コラーゲン
線維束の構造変化を表す電子顕微鏡写真（2500倍）であ
る。Ｍは紫外線照射前の写真、Ｎは照射開始後２週間の
写真、Ｏは照射開始後５週間の写真、Ｐは照射開始後10
週間の写真である。 図５は、マウス光老化モデルの真皮コラーゲン線維束
構造の経時変化を、図４に示すのと同様の電子顕微鏡写
真を一定の基準で評価して得られる評点と紫外線照射時
間の関係で示す図である。●は、マウス光老化モデルの
プロットを、○は、非照射コントロールマウスのプロッ
トをそれぞれ表す。 図６は、マウス光老化モデルの、画像解析により定量
した皮膚表面のシワの量（シワの面積％）と紫外線照射
時間の関係を示す図である。●は、マウス光老化モデル
のプロットを、○は、非照射コントロールマウスのプロ
ットをそれぞれ表す。 図７は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
皮膚表面形態を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ｑ
はエタノール投与マウスの写真、Ｒはデキサメタゾン投
与マウスの写真である。 図８は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
真皮表面形態を表す電子顕微鏡写真（50倍）である。Ｓ
はエタノール投与マウスの写真、Ｔはデキサメタゾン投
与マウスの写真である。 図９は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
真皮コラーゲン線維束の構造を表す電子顕微鏡写真（50
0倍）である。Ｕはエタノール投与マウスの写真、Ｖは
デキサメタゾン投与マウスの写真である。 図10は、マウス光老化モデルのシワ改善過程における
真皮コラーゲン線維束の構造を表す電子顕微鏡写真（25
00倍）である。Ｗはエタノール投与マウスの写真、Ｘは
デキサメタゾン投与マウスの写真である。 発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。 （１）本発明の評価方法 本発明者等は、上述のように、真皮のコラーゲン線維
束の秩序の度合いを指標とすることにより皮膚の状態及
びその変化を鑑別しうることを見いだした。本発明の評
価方法は、この技術を利用して、予め作成した或いは用
意した状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動
物の前記皮膚部位に皮膚状態改善剤等の検体を塗布し、
それによる皮膚状態の変化を、真皮のコラーゲン線維束
の秩序の度合いの変化を指標として追跡することによ
り、前記検体の皮膚状態の改善作用を定量的に測定する
ものである。 ここで、上記状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所
有する動物の皮膚の悪い状態を目的に合わせて選択すれ
ば、この選択された皮膚の悪い状態、例えば、シワや肌
荒れ等を改善するのに適切な皮膚状態改善剤や皮膚外用
剤を評価・スクリーニングすることが出来る。 この様な状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有す
る動物としては、既に実験動物として確立している、紫
外線長期照射マウス（以下、「マウス光老化モデル」と
いうこともある）や剃毛皮膚をラウリル硫酸ナトリウム
等の陰イオン界面活性剤を含む化学物質で処理したモル
モット（以下「モルモット損傷皮膚モデル」ということ
もある）、感作性物質で感作後に惹起させて炎症を起こ
した動物等のモデル動物を使用することも可能である
し、肌荒れやシワで悩んでいる人をパネラーに使用する
ことも可能である。 しかしながら人を用いる場合には、バイオプシー等の
作業が伴うので、上記モデル動物等を用いるのが好まし
い。また、これら動物のうちでも、本発明で用いる状態
の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物として好
ましいものは、上記マウス光老化モデルやモルモット損
傷皮膚モデルである。さらに、モルモット損傷皮膚モデ
ルのうちでは、背部剃毛皮膚を陰イオン界面活性剤で処
理されたモルモットが本発明の評価方法に好ましく用い
られる。なお、本発明の評価方法においては、マウス光
老化モデルはシワを、モルモット損傷皮膚モデルは肌荒
れを、それぞれ改善するのに適切な皮膚状態改善剤や皮
膚外用剤を評価・スクリーニングするのに好適に用いら
れる。 また、本発明の評価方法において、上記動物の状態の
悪い皮膚部位に皮膚状態改善剤またはこれを含有する皮
膚外用剤を塗布する方法については、定量的な塗布が行
える方法であれば特に制限されない。また、塗布の際に
前記皮膚状態改善剤等を適当な希釈剤で希釈して用いる
ことも可能である。 本発明の評価方法において真皮のコラーゲン線維束の
秩序の度合いを測定するにあたって必要とされる真皮
は、測定対象部位の皮膚を採取しこれを常法に従って処
理することによって得ることが出来る。この様な皮膚か
ら真皮標本を得る方法としては、例えば、上記採集され
た皮膚をNaOH等で処理するNaOH法が例示できる。真皮の
コラーゲン線維束は、この様にして得られる真皮標本を
電子顕微鏡などで観察することにより見ることが出来
る。さらに、この真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの
測定は、例えば、この電子顕微鏡の像を画像解析した
り、適当な判定基準に従って肉眼観察によりスコアーを
付すことにより行うことができる。 電子顕微鏡の像から肉眼観察により真皮コラーゲン線
維束の秩序度合いを測定する方法として、具体的には、
上記真皮標本の電子顕微鏡像を100〜10000倍程度、好ま
しくは500〜2500倍程度の倍率で写真撮影し、得られた
写真を、例えば、以下に示す判定基準で判定することに
より測定する方法が挙げられる。 （判定基準） 0:観察領域全域でコラーゲンの線維束構造が認められ
ない。 1:過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構
造への変移が認められる。 2:一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認め
られるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。 3:全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認めら
れ、崩壊・変性はほぼ認められない。 なお、判定基準は上記に制限されず、基準をより詳細
に分類すること等も可能であるが、判定に費やす時間や
判定の普遍性等を考慮すれば、本発明においては上記基
準を標準的に用いることが適当であると考えられる。 本発明の評価方法においては、この様にして真皮コラ
ーゲン線維束の秩序度合いが測定されるが、前記皮膚状
態改善剤等の塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序度合
いに比べて、塗布後の真皮コラーゲン線維束の秩序度合
いを大きく改善できる皮膚状態改善剤等程、皮膚状態改
善作用に優れると評価される。また、例えば、上記判定
基準を用いた場合には、前記皮膚状態改善剤等の塗布前
の評点に比べて、塗布後の評点が大きい皮膚状態改善剤
等程、皮膚状態改善作用に優れると評価される。さら
に、この場合には、塗布前後の評点の差や比を求めて、
これを皮膚状態改善作用の評価に用いることも可能であ
る。 また、本発明の評価方法においては、真皮コラーゲン
線維束の秩序度合いを測定するために皮膚が採取される
ので、皮膚状態改善剤等を塗布する前後での真皮コラー
ゲン線維束の秩序度合いを、実際に全く同じ皮膚部位に
おいて測定することはできないが、この方法における皮
膚採取量は微量であり、前記塗布前と塗布後において極
近辺の皮膚を採取することにより、実質的に塗布の前後
で同じ皮膚部位に対して測定が行われたものと考えるこ
とができる。 さらに本発明の評価方法において、状態の悪い皮膚部
位を少なくとも１箇所有する動物として、上記モデル動
物のような全く同様に皮膚状態が悪い動物を何匹か用い
る場合には、皮膚状態改善剤等の検体を塗布しない個体
の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定してこれを
塗布前の値として、また、これとは別の個体に検体を塗
布した後に真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを測定し
てこれを塗布後の値として、塗布前後の真皮コラーゲン
線維束の秩序度合いの変化量を求めて検体評価の指標に
用いることも可能である。 また、本発明の評価方法は、皮膚状態改善作用を有す
る経皮投与以外の薬剤の評価にも応用できるものであ
る。 以下に、マウス光老化モデルをシワモデルとして用い
た際の、シワ改善剤の評価・スクリーニング例、及びモ
ルモット損傷皮膚モデルを肌荒れモデルとして用いた際
の、肌荒れ改善剤の評価・スクリーニング例について述
べる。 １）マウス光老化モデルを用いたシワ改善剤の評価 まず、マウス光老化モデルを作製し、作製時における
マウスの皮膚状態の変化と真皮コラーゲン線維束の秩序
度合いの変化の関係を調べた。 ａ）マウス光老化モデルにおける皮膚状態の変化と真皮
コラーゲン線維束の秩序度合いの変化の関係 ６匹ずつ５群のヘアレスマウス（Skh:HR−１、雌性、
８週齢）を準備し、その内の１群については、以下の紫
外線照射を行わずに８週齢の時点、すなわち紫外線照射
前の状態で、各マウスから皮膚及び皮膚表面形態レプリ
カを採取した。残りの４群については、各マウスに紫外
線Ｂ（東芝SEランプ、60mJ/cm2）を１日１回、週５回の
割合で照射しながら飼育した。 上記４群の内の１群については、照射開始から１週間
後に紫外線照射をやめ、その時点で各マウスから皮膚及
び皮膚表面形態レプリカを採取した。同様にして、別の
１群については照射開始から２週間後に、さらに別の１
群については５週間後に、それぞれ紫外線照射をやめて
その時点で各マウスから皮膚及び皮膚表面形態レプリカ
を採取した。さらに、最後の１群については照射開始か
ら10週間後まで紫外線照射を続け、得られたマウスをマ
ウス光老化モデルとした。なお、得られたマウス光老化
モデルは、合計で3J/cm2の紫外線を照射されたマウスで
ある。また、得られたマウス光老化モデルからも皮膚及
び皮膚表面形態レプリカをそれぞれ採取した。 上記の様にして各群のマウスから採取した皮膚につい
て、その表面形態を走査電子顕微鏡により50倍で写真撮
影した後、前記皮膚からNaOH法により真皮標本を作製
し、得られた真皮標本の表面形態を50倍で、コラーゲン
線維束構造を500倍および2500倍で、それぞれ走査電子
顕微鏡により写真撮影した。 図１に、上記マウス群のうち紫外線照射１週間のマウ
ス群を除く、各マウス群６匹のうちの代表的な個体の皮
膚表面形態の倍率50倍での電子顕微鏡写真（A:紫外線照
射前、B:照射開始後２週間、C:照射開始後５週間、D:照
射開始後10週間）を、図２にその真皮表面形態の倍率50
倍での電子顕微鏡写真（E:紫外線照射前、F:照射開始後
２週間、G:照射開始後５週間、H:照射開始後10週間）
を、図３にその真皮コラーゲン線維束構造の倍率500倍
での電子顕微鏡写真（I:紫外線照射前、J:照射開始後２
週間、K:照射開始後５週間、L:照射開始後10週間）を、
図４にその真皮コラーゲン線維束構造の倍率2500倍での
電子顕微鏡写真（M:紫外線照射前、N:照射開始後２週
間、O:照射開始後５週間、P:照射開始後10週間）を、そ
れぞれ示す。 これらの図より、シワが形成される際、それに対応す
るように真皮の表面にも溝が形成されており、皮膚表面
の形態の変化は真皮の表面の形態の変化に対応している
こと、更に真皮表面の変化は真皮に於けるコラーゲン線
維束の構造の変化、即ち、コラーゲン線維束が明確でな
くなる等のコラーゲン線維束の秩序の低下を反映してい
ることが判る。 また、上記紫外線照射前、照射開始後１週間、照射開
始後２週間、照射開始後５週間、照射開始後10週間（＝
マウス光老化モデル）の各マウス群における、真皮コラ
ーゲン線維束構造の倍率2500倍での電子顕微鏡写真をも
とに、各群マウスの真皮コラーゲン線維束構造のそれぞ
れについて、上述した判定基準に従って０〜３のスコア
ーを付した。得られた結果から、紫外線照射の各段階に
おける各群６匹のマウスのスコアーの平均値と標準偏差
を算出した。ここで、照射開始後10週間群、すなわちマ
ウス光老化モデル群におけるスコアー平均値は、0.82で
あった。各群の平均値を図５に●プロットとして、前記
標準偏差と共に示す。なお、図５に示される○プロット
は、上記とは別に、５匹ずつ５群のヘアレスマウス（Sk
h:HR−１、雌性、８週齢）を紫外線照射を行わずに飼育
した（以下、これにより得られたマウスを「非照射コン
トロールマウス」という）際の、上記同様の方法で評価
されたマウスの真皮コラーゲン線維束構造についてのス
コアー平均値を表すものである。図５において、横軸は
紫外線照射時間を、縦軸は上記の方法で評価されたマウ
スの真皮コラーゲン線維束構造についてのスコアーを示
す。 さらに、上記マウス光老化モデル作製時におけるマウ
ス皮膚表面の構造変化の様子を、次の方法で測定される
シワの量の変化によって調べた。すなわち、上記紫外線
照射時間の異なる各マウス群より採取した皮膚表面レプ
リカに、入射角20度でキセノンランプによる光照射を行
い、出来たシワの陰影を画像解析により定量すること
で、シワの量を測定した。ここで、シワの量は、皮膚の
全面積に対するシワ面積の百分率（％）で表される。こ
の様に測定されたシワの量の各群６匹のマウスの平均値
と標準偏差を算出した。得られた平均値を図６に●プロ
ットとして、前記標準偏差と共に示す。なお、図６に示
される○プロットは、非照射コントロールマウスの、上
記同様の方法で測定されたシワの量の平均値を表すもの
である。また、図６において、横軸は紫外線照射時間
を、縦軸は上記の方法で測定されたシワの量を示す。 図５および図６より、マウス光老化モデル作製時にお
ける、皮膚表面でのシワの量の変化と、真皮でのコラー
ゲン線維束の秩序の度合いの変化はよく対応しているこ
とがわかる。また、上記で得られたシワの量の平均値と
真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いを評価したスコア
ーの平均値との相関係数を算出したところ、0.91であ
り、シワの量が真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いを
評価したスコアー値で定量出来ることが判明した。 次に、この様にして得られるマウス光老化モデルをシ
ワモデルとして用いて、紫外線照射により生じたシワ等
を有する状態の悪い皮膚が、皮膚状態改善剤または皮膚
外用剤によりどの様に変化するかを調べ、さらに、本発
明の評価方法によりシワ改善剤の評価を行った。 ｂ）シワ改善剤の評価・スクリーニング 上記と同様にして作製したマウス光老化モデル（紫外
線照射10週間のマウス）に、デキサメタゾンを0.05％の
エタノール溶液として、ローション剤の剤形で塗布した
後の、マウスの皮膚状態と真皮コラーゲン線維束の秩序
度合いを上記同様の方法で調べ、デキサメタゾンのシワ
改善剤としての評価を行った。 すなわち、マウス光老化モデルの１群５匹の各マウス
被験部位には、0.05％デキサメタゾンエタノール溶液
を、もう１群５匹の各マウス被験部位にはコントロール
としてエタノールのみを、それぞれ0.05mlづつ１日/1回
の割合で、８週間連日塗布した。塗布終了後、各マウス
の皮膚を採取しその表面形態を走査電子顕微鏡により写
真撮影した。さらに、前記採取された皮膚から上記同様
に真皮標本を作製し、その表面形態とコラーゲン線維束
構造を走査電子顕微鏡により写真撮影した。 各群５匹のうちの代表的な個体のそれぞれについて、
図７に皮膚表面形態の倍率50倍での電子顕微鏡写真（Q:
エタノール投与マウス、R:デキサメタゾン投与マウス）
を、図８に真皮表面形態の倍率50倍での電子顕微鏡写真
（S:エタノール投与マウス、T:デキサメタゾン投与マウ
ス）を、図９に真皮コラーゲン線維束構造の倍率500倍
での電子顕微鏡写真（U:エタノール投与マウス、V:デキ
サメタゾン投与マウス）を、図10に真皮コラーゲン線維
束構造の倍率2500倍での電子顕微鏡写真（W:エタノール
投与マウス、X:デキサメタゾン投与マウス）を、それぞ
れ示す。 上記図１〜４およびこれらの図より、デキサメタゾン
投与マウスはエタノール投与マウスに比べ皮膚表面形態
において皮膚状態の優れた改善が認められると同時に、
真皮に於けるコラーゲン線維束の秩序の度合いについて
も同様の改善が認められる。 さらに、上記で得られた真皮コラーゲン線維束構造の
倍率2500倍での電子顕微鏡写真をもとに、エタノール投
与群およびデキサメタゾン投与群のそれぞれのマウスの
真皮コラーゲン線維束の秩序度合いについて、上述した
判定基準に従って０〜３のスコアーを付した。結果は、
エタノール投与群については５匹の平均値で0.78であ
り、デキサメタゾン投与群については５匹の平均値で1.
71であった。 これらの値を、本発明の評価方法に従って、上記ａ）
で求めたマウス光老化モデルの皮膚状態改善剤塗布前の
真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを示すスコアー値と
比較すると、皮膚状態の改善度合いはデキサメタゾン投
与群については1.71/0.82＝2.09で、また、エタノール
投与群については0.78/0.82＝0.95となる。あるいは、
デキサメタゾン投与における皮膚状態の改善度合いは、
ローション基剤であるエタノールの影響を勘案すると、
デキサメタゾン投与群のスコアー平均値／エタノール投
与群のスコアー平均値で1.71/0.78＝2.28として算出さ
れる。 この様に、デキサメタゾンローションの塗布前に比べ
て塗布後で真皮コラーゲン線維束の秩序度合いが著しく
向上していることから、本発明の評価方法によれば、デ
キサメタゾンは優れたシワ改善作用を有し、これを含有
するローションは、シワ改善用として有用な皮膚外用剤
と判定される。 この様に、皮膚表面形態の走査顕微鏡写真からデキサ
メタゾンローションのシワ改善作用が認められるのと同
様に、本発明の評価方法によっても、デキサメタゾンロ
ーションはシワ改善用として有用な皮膚外用剤と判定さ
れる。 ２）モルモット損傷皮膚モデルを用いた肌荒れ改善剤の
評価 ａ）肌荒れモデルの作製 ハートレー系白色種モルモット（体重250〜300g）３
匹の背部をそれぞれ剃毛し、ラウリル硫酸ナトリウムを
１％含有するワセリンを48時間閉塞経皮投与して、投与
終了から２日間おいたモルモットを肌荒れモデルとし
た。このモルモット肌荒れモデル３匹の背部皮膚をそれ
ぞれ採取して真皮標本を作製し、電子顕微鏡写真を撮影
して、真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを上記同様に
スコアー判定し、３匹の平均値を算出したところ、結果
は0.89であった。 ｂ）肌荒れ改善剤の評価・スクリーニング 上記と同様にして作製したモルモットの肌荒れモデル
３匹の背部皮膚に、ポリメタクリロイルフォスファチジ
ルコリンを0.5％含有するエタノール溶液を、８週間連
日塗布したところ、真皮コラーゲン線維束の秩序度合い
のスコアーは2.11（３匹の平均値）に上がった。この値
を、本発明の評価方法に従って、上記ａ）で求めたモル
モット肌荒れモデルの前記エタノール溶液塗布前の真皮
コラーゲン線維束の秩序度合いを示すスコアー値と比較
すると、皮膚状態の改善度合いは、2.11/0.89＝2.37と
なる。この様に、ポリメタクリロイルフォスファチジル
コリン含有エタノール溶液の塗布前に比べて塗布後で真
皮コラーゲン線維束の秩序度合いが著しく向上している
ことから、本発明の評価方法によれば、ポリメタクリロ
イルフォスファチジルコリンは優れた肌荒れ改善剤と判
定される。 また、上記ポリメタクリロイルフォスファチジルコリ
ン含有エタノール溶液の塗布前後におけるモルモット肌
荒れモデルの皮膚表面形態の違いを肉眼で観察しても、
塗布後に肌荒れはよく回復していた。 （２）本発明の皮膚外用剤の製造方法 本発明の皮膚外用剤の製造方法は、皮膚状態改善剤を
含有する皮膚外用剤の製造方法に関するものであり、状
態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物を準備
し、前記皮膚部位に皮膚外用剤を0.01g/10cm2・１回の
量で１日１回８週間連続して塗布し、塗布前後における
前記皮膚部位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いにつ
いて、前記皮膚部位の少なくとも一部を採取し作製した
真皮標本を100〜10000倍、好ましくは、500〜2500倍で
顕微鏡写真撮影し、得られた写真を下記基準で判定する
ことにより判定した際の、塗布後の真皮コラーゲン線維
束の秩序度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩序
度合いで除した値が1.5以上となるように皮膚状態改善
剤の含有量を調整する工程を含むことを特徴とする。 （判定基準） 0:観察領域全域でコラーゲンの線維束構造が認められ
ない。 1:過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構
造への変移が認められる。 2:一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認め
られるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。 3:全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認めら
れ、崩壊・変性はほぼ認められない。 本発明の皮膚外用剤の製造方法は、上記皮膚状態改善
剤の含有量を調整する工程を含むことを除いては、通常
の皮膚外用剤の製造方法と同様とすることができる。例
えば、上記の様にして皮膚状態改善剤の含有量を調整し
ながら、製造しようとする皮膚外用剤の剤形に応じた成
分組成を決定した後、前記剤形の皮膚外用剤が通常採る
製造方法のうちから適当な方法を適宜選択し、それに従
って製造する方法等を挙げることができる。 この様な本発明の製造方法により得られる皮膚外用剤
は、上記皮膚状態改善剤の含有量を調整する際に用いた
状態の悪い皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物の皮
膚状態の悪化の原因となった皮膚異常又はそれと近似の
皮膚異常を改善する作用に優れる。例えば、状態の悪い
皮膚部位を少なくとも１箇所有する動物として上記
（１）で詳述したマウス光老化モデルを用いれば、この
モデルはシワモデルの代表的なモデルであるので、皮膚
外用剤としては、シワ改善作用に優れる皮膚外用剤が得
られ、肌荒れモデルとして代表的なモルモット損傷皮膚
モデルを用いれば、肌荒改善作用に優れた皮膚外用剤が
得られる。 また、本発明の製造方法が適用される皮膚外用剤とし
ては、化粧料や、抗炎症剤、抗真菌剤などの皮膚外用医
薬などが例示でき、これらの内では、化粧料が好まし
く、さらに、化粧料の内では、上記製造方法において優
れた動物モデルを用いることが可能な、シワ改善化粧料
と肌荒れ改善化粧料が好ましい。 実施例 以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
る。 下記の表１に示す処方に従って剤形がクリームの化粧
料を作製した。即ち、Ｂ成分を混練りし、Ａ成分で希釈
した後、80℃に温調し、これに予め80℃に温調したＣ成
分を徐々に加え乳化し、攪拌冷却しクリームを得た。
尚、処方の数値は重量部を表す。 次いで、得られた４種類の化粧料を、上述のマウス光
老化モデルと同様にして10週間の紫外線照射を行うこと
により作製されたマウス光老化モデルの被験皮膚部位
に、0.01g/10cm2・１回の量で１日１回８週間連続して
塗布した際の、化粧料の塗布前後における前記皮膚部位
の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いの変化を調べた。
ここで、真皮コラーゲン線維束の秩序の度合いは、前記
皮膚部位の一部を採取し作製した真皮標本を2500倍で顕
微鏡写真撮影し、得られた写真を上述したのと同様の判
定基準で０〜３のいずれかに判定することにより測定し
た。この方法で測定された塗布後の真皮コラーゲン線維
束の秩序の度合いを塗布前の真皮コラーゲン線維束の秩
序の度合いで除した値を評価に用いた。結果をコラーゲ
ン線維束改善度として表１に示す。 また、シワに悩むパネラー40名を任意に10名ずつ１〜
４の４グループに分けて、上記で得られた化粧料１〜４
のうちグループ番号に対応する番号の化粧料を、通常の
方法で２ヶ月間連続使用してもらった。使用期間終了
後、シワの改善状況をアンケート調査した。この結果も
表１に併せて記す。 これらの結果より、本発明の評価方法による評価結果
は、従来のパネラー等を用いた評価方法による評価結果
によく対応していることがわかる。 また、上記で得られたコラーゲン線維束改善度の測定
結果を本発明の製造方法に応用することが可能である。
すなわち、表１の化粧料１にデキサメタゾンを配合して
シワ改善用の皮膚外用剤を製造する際には、デキサメタ
ゾン配合量を概ね表１の化粧料３に示す配合量以上にし
て製造すればよいことがわかる。同様にベクロメタゾン
については、表１の化粧料４の配合量で十分であり、さ
らに少量の配合量による検討も可能であることがわか
る。産業上の利用性 本発明によれば、シワ、肌荒れ等の皮膚状態の改善や
皮膚状態の悪化抑制のための皮膚状態改善剤やこれを含
有する皮膚外用剤を適切に評価する手段を提供できる。
また、本発明によれば、皮膚状態改善剤を含有する皮膚
外用剤の製造方法において、皮膚状態改善作用を十分に
有する皮膚外用剤の製造方法を提供することが可能であ
る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 見城 由紀子
神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560 ポー
ラ化成工業株式会社戸塚研究所内
(56)参考文献 特開 平８−231368（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−245359（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−269074（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−217622（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−187985（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−48915（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−104635（ＪＰ，Ａ)
特開 平４−124118（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−190809（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−33651（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−48934（ＪＰ，Ａ)
特開 平６−247837（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−139947（ＪＰ，Ａ)
欧州公開379367（ＥＰ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 7/00
A61K 7/48
A61B 5/00
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】紫外線の長期照射によって生じた、真皮に
溝の形成を伴うシワがある皮膚部位を有するヒト以外の
動物を用いて、真皮に於ける溝のレベルまでシワを改善
する皮膚状態改善剤又はこれを含有する皮膚外用剤を評
価する方法であって、前記シワがある皮膚部位に皮膚状
態改善剤又はこれを含有する皮膚外用剤を塗布した際
の、塗布前後に於ける前記シワがある皮膚部位の少なく
とも一部を採取し作製した真皮標本を100〜10000倍で顕
微鏡写真撮影し、得られた塗布前後の写真の前記皮膚部
位の真皮コラーゲン線維束の秩序度合いを下記判定基準
により判定することにより測定し、得られた塗布前後の
秩序度合いの変化量を指標とする方法。 （判定基準） 0:観察領域全域でコラーゲンの線維束構造が認められな
い。 1:過半領域でコラーゲン線維束構造の崩壊又は異常構造
への変移が認められる。 2:一部にコラーゲン線維束構造の崩壊又は変性が認めら
れるが、全体的にはほぼ正常な構造が認められる。 3:全面に亘り正常なコラーゲン線維束構造が認められ、
崩壊・変性はほぼ認められない。
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