JP3382957B2 - スフィンゴ糖脂質含有凍結乾燥組成物およびその製造法 - Google Patents

スフィンゴ糖脂質含有凍結乾燥組成物およびその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、スフィンゴ糖脂質含有凍結乾燥組成物に関
し、より詳細には、本来水に対して低溶解性もしくは難
溶性のスフィンゴ糖脂質の水への溶解性を向上させたス
フィンゴ糖脂質含有凍結乾燥組成物およびその製造法に
関するものである。
背景技術 α−スフィンゴ糖脂質は、生体において種々の有用な
生理活性を示すことから、抗腫瘍剤、免疫賦活剤、骨髄
細胞増殖促進剤など多くの医薬に用いられうる。
スフィンゴ糖脂質の中で、糖部分が単糖類からなるス
フィンゴ糖脂質は水に対して低溶解性もしくは難溶性の
ものが多い。このようなスフィンゴ糖脂質の溶解性を高
めるために、種々の方法が検討されているが、満足のい
く溶解性が得られず、また一度溶解しても保存により析
出物が発生し、経時的に溶解性が低下するという問題が
ある。
発明の開示 本発明は上記事情に鑑み、糖部分が単糖類から構成さ
れる低溶解性もしくは難溶性のスフィンゴ糖脂質を含有
する、長期保存後も高い再溶解性を維持する凍結乾燥組
成物を提供することを目的とするものである。
本発明者等は、糖部分が単糖類からなるα−グリコシ
ル結合構造を有し、水に対して溶解性の低いスフィンゴ
糖脂質（α−グリコシルセラミド）に、ポリオキシソル
ビタン脂肪酸エステルおよびシュクロース（白糖）、マ
ンニトールもしくはグルコースを、あるいは更にデオキ
シコール酸ナトリウムもしくはヒスチジンを配合して溶
媒に溶解させた後に凍結乾燥したところ、長期保存後に
おいても再溶解性が極めて高いことを見出し、この知見
に基づいて本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、次式（Ａ）で示される活性成分
としてのα−グリコシルセラミドまたはその塩、ポリオ
キシソルビタン脂肪酸エステルおよびシュクロース、マ
ンニトールもしくはグルコースを、あるいは更にデオキ
シコール酸ナトリウムもしくはヒスチジンを含有してな
る凍結乾燥組成物に関するものである。
［ただし、式中のR1〜R9およびＸは、それぞれ後述する
特定の基および特定範囲の整数を表す。］ また本発明は、上記組成物の配合成分を加温した水性
溶媒に溶解させ、冷却した後、凍結乾燥の工程に付する
ことを特徴とする凍結乾燥組成物の製造法にも関する。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明で使用するα−グリコシルセラミド
化合物の代表例（KRN7000）の合成反応経路を示す説明
図である。
反応経路中、pyrはピリジン、BrPPh3（CH2）12CH3は
トリデカントリフェニルホスホニムウブロミド、ｎ−Bu
Liはｎ−ブチルリチウム、MsClは塩化メタンスルホニ
ル、BnBrは臭化ベンジル、１−PrOHはプロピルアルコー
ルを表す。
第２図は、図１に続く合成反応経路を示す説明図であ
る。
反応経路中、WSC−HClは１−エチル−３−（３′−ジ
メチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩、MS
4Aはモレキュラーシーブス4A、Hex4NBrはテトラヘキシ
ルアンモニウムブロミドである。
発明を実施するための最良の形態 ［式（Ａ）で示される化合物］ 本発明組成物で使用される化合物は、式（Ａ）で示さ
れるα−グリコシルセラミド構造を有する化合物である
ことは上記したところであり、上記式（Ａ）中のＸおよ
びR1〜R9は下記のように定義されるものである。
［式中、R1はＨまたはOHである； Ｘは７〜25のいずれかの整数である； R2は下記（ａ）〜（ｅ）で定義される置換基のいずれ
かである（ここで、Ｙは５〜17のいずれかの整数であ
る）。
（ａ）−CH2（CH2）YCH3 （ｂ）−CH（OH）（CH2）YCH3 （ｃ）−CH（OH）（CH2）YCH（CH3）２ （ｄ）−CH＝CH（CH2）YCH3 （ｅ）−CH（OH）（CH2）YCH（CH3）CH2CH3; R3およびR4のいずれか一方はＨであり、他方はＨ、O
H、NH2またはNHCOCH3である； R5およびR6のいずれか一方はＨであり、他方はOHであ
る； R7およびR8のいずれか一方はＨであり、他方はOHであ
る； R9はＨ、CH3、またはCH2OHである。］ 上記化合物の好ましい態様は次式（A'）で示されるα
−グリコシルセラミドである。
［式中、R1、R2およびＸは上記で定義した通りであり、 R3〜R9は下記のｉ）〜ｖ）で定義される置換基であ
る。
ｉ） R3、R6およびR8がＨのとき R4はＨ、OH、NH2またはNHCOCH3である； R5はOHである； R7はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである； ii）R3、R6およびR7がＨのとき R4はＨ、OH、NH2またはNHCOCH3である； R5はOHである； R8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである。
iii）R4、R6およびR7がＨのとき R3はＨ、OH、NH2またはNHCOCH3である； R5はOHである； R8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである； iv）R4、R5およびR7がＨのとき R3、R6およびR8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである。
ｖ） R3、R5およびR7がＨのとき R4、R6およびR8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである。
本発明において使用される好ましいα−グリコシルセ
ラミド化合物は、式（Ａ）の糖部分においてR3、R6およ
びR8がＨを表し、R4、R5およびR7がOHを表し、R9がCH2O
Hを表す化合物であり、またセラミド部分においてはR2
がOHを有する置換基（ｂ）、（ｃ）または（ｅ）、特に
（ｂ）を表す化合物である。上記の好ましい化合物にお
いて、セラミド部分のR1がＨでありR2が（ｂ）である化
合物がより好ましい。更に、セラミド部分のアルキル基
におけるメチレンのＸは、好ましくは11〜25の整数、よ
り好ましくは21〜25であり、基R2におけるＹは好ましく
は９〜17の整数、より好ましくは11〜15である。
本発明において用いられるα−グリコシルセラミドの
中で、（2S,3S,4R）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミド−3,4−オク
タデカンジオールが特に好ましい化合物であり、この化
合物を以下KRN7000（構造式は図２を参照されたい）と
呼ぶものとする。
式（Ａ）で示される化合物は、酸付加塩があり得る。
本発明で使用される化合物はこれらの付加塩をも包含す
るものである。
酸付加塩を形成すべき酸としては、例えば無機酸、例
えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸など、あるいは有機酸、
例えば酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、オレイン酸、
パルミチン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、フマル
酸、グルタミン酸、パントテン酸、ラウリルスルホン
酸、メタンスルホン酸およびフタル酸などをあげること
ができる。
なお、酸付加塩を医薬として使用する場合には、酸は
薬学上許容されるものでなければならないことは言うま
でもない。
本発明で使用される活性成分化合物は、α−グリコシ
ルセラミドを合成するための合目的的な任意の方法によ
り製造することができる。
上記α−グリコシルセラミド化合物は、WO93/5055
号、WO94/2168号、およびWO94/9020号の各公報において
一部のものが合成方法と共に記載されており、その合成
方法に準じて調製することができる。また、好ましい方
法として、後記実施例において化合物KRN7000の合成方
法、すなわち、Ｄ−リキソースを出発物質としてセラミ
ド部分を合成し、このセラミドに糖部分のガラクトース
を結合させる方法が例示されており（詳細は後記の実施
例および図１〜２を参照されたい）、この方法に準じて
目的の化合物を合成することができる。なお、α−グリ
コシルセラミドの一般的な合成方法については、例え
ば、J.Med.Chem.,38,2176（1995）を参照することがで
きる。
［凍結乾燥組成物およびその製造法］ 本発明による凍結乾燥組成物は、水、緩衝液等の水性
媒体を溶媒とする注射用および細胞医療用培地等の用途
に用いることができる。
本発明組成物で用いる活性成分としてのα−グリコシ
ルセラミド化合物は、種々の生理活性を有しており、本
発明組成物は抗腫瘍剤、免疫賦活剤（WO93/5055号公報
参照）、骨髄細胞増殖促進剤（特開昭WO94/2168号公報
参照）、自己免疫疾患治療剤、および末梢血幹細胞増加
剤等の医薬として注射用（点滴用を含む）に用いること
ができる。
また、本発明による凍結乾燥組成物は細胞医療用、た
とえば抗原提示細胞あるいは癌細胞等をインビトロで培
養、活性化した後に生体にもどす抗原提示細胞療法（Ya
maguchi,Y.et al.,Oncol.Res.,8,399（1997））あるい
は腫瘍療法等において、細胞の大容量懸濁液もしくは培
養媒体用として用いることもできる。
本発明による凍結乾燥組成物は、上記のα−グリコシ
ルセラミドもしくはその塩、ポリオキシソルビタン脂肪
酸エステルおよび二糖もしくは単糖（併用を含む）を配
合してなるものであり、凍結乾燥後および長期保存後の
水に対する溶解性に優れている。また上記の配合に、更
にデオキシコール酸ナトリウムまたはヒスチジン（併用
を含む）を配合することにより、長期保存後の再溶解性
を更に高めることができる。
ポリオキシソルビタン脂肪酸エステルとしては、ポリ
ソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、
ポリソルベート80などがあげられ、ポリソルベート20が
好ましい。その配合量は、活性化合物１重量部に対して
10〜1000重量部が好ましく、20〜100がより好ましい。
二糖としてはシュクロース、ラクトース、マルトールな
どがあげられ、シュクロースが特に好ましく、また単糖
としてはグルコース、フルクトース、キシリトール、ソ
ルビトール、マンニトールなどがあげられ、グルコース
あるいはマンニトールが特に好ましい。これらの糖の配
合量（併用の場合は総量）は、活性化合物１重量部に対
して100〜10000重量部が好ましく、200〜2000重量部が
より好ましい。また、デオキシコール酸ナトリウムおよ
びヒスチジンの配合量（併用の場合は総量）は、10〜10
00重量部が好ましく、20〜400重量部がより好ましい。
配合成分に関しては、上記基本成分の他に、必要に応
じて溶解補助剤（例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ
油60）、緩衝剤（例えば、リン酸塩）、等張化剤（例え
ば、塩化ナトリウム）、無痛化剤（例えばベンジルアル
コール）などの添加剤を適量加えてもよい。
本発明による凍結乾燥組成物を製造するには、基本的
には、上記の各配合成分を適当な溶剤（たとえば蒸留水
など）に加熱混合撹拌により溶解させた後、冷却し凍結
乾燥を行えばよい。すなわち、本発明による凍結乾燥組
成物の製造法は、上記の配合成分を加温した水性溶媒に
溶解させ、冷却した後、凍結乾燥の工程に付することを
特徴とするものである。
水性溶媒としては蒸留水、生理食塩水、緩衝液などが
あげられる。
上記製造法において、配合成分は溶媒中通常65〜90
℃，好ましくは70〜85℃で加温溶解させる。加温温度が
高すぎると配合成分の保存安定性が低下し、低すぎると
成分が溶解し難い。得られた溶液は通常0.5℃〜1.0℃/m
in以上の降温速度で冷却するか、好ましくは1.5℃/min
以上、より好ましくは2.0℃/min以上、最も好ましくは
4.0℃/min以上で急速冷却する。溶液の冷却は、通常恒
温循環装置を用いて50〜40℃以下、好ましくは20〜30℃
程度の温度に達するまで行ない、その後溶液をフィルタ
ーで濾過し、凍結乾燥工程に付す。短時間で冷却するこ
とにより、長期保存後の再溶解性がより安定する。
凍結乾燥工程は、通常の方法に従いアンプルあるいは
バイアル瓶等の容器および凍結乾燥装置を用いて行なう
ことができるが、凍結温度が−20℃以下で真空度が0.1T
orr以下の条件下で行うことが好ましい。
上記のようにして製造された本発明組成物は、注射用
用途においては使用時に適量の注射用溶媒、通常蒸留
水、生理食塩水などに再溶解させ（通常α−グリコシル
セラミドの濃度を0.1〜1000μg/mlとする）、注射用薬
剤として生体に投与される。
本発明組成物は、合目的的な任意の投与経路、具体的
には、動物の場合には、腹腔内投与、皮下投与、静脈ま
たは動脈への血管内投与、局所投与などの方法が可能で
あり、また、ヒトの場合には、静脈内投与、動脈内投
与、局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋
肉内投与などにより投与することができる。
本発明組成物の注射用としての投与量は、個々の状況
を勘案して、連続的または間欠的に投与したときに総投
与量が一定量を越えないように定められる。具体的な投
与量は、投与方法、患者等の状況、例えば年齢、体重、
性別、感受性、食事（食餌）投与時間、併用する薬剤、
患者またはその病気の程度に応じて変化することは言う
までもなく、また一定の条件のもとにおける適量と投与
回数は、上記指針をもとにして専門医の適量決定試験に
よって決定されなければならない。本発明組成物中の有
効成分の活性の発現に必要な投与量は、例えば、静脈内
投与の場合、ヒト成人に対して、１日あたり0.001〜10m
g程度である。
また非注射用用途においては、たとえば抗原提示細胞
療法、腫瘍療法等においては、水性媒体（蒸留水、生理
食塩水、緩衝液など）を溶媒とする培地に本発明組成物
を再溶解させ、この溶液中で抗原提示細胞（たとえば樹
状細胞など）または免疫原性を増強することが意図させ
る細胞（たとえば腫瘍細胞など）を培養することにより
細胞を本発明組成物とインビトロで接触させ、その抗原
提示活性または免疫原性を増強する。例えば、細胞培養
培地に本発明による組成物を、α−グリコシルセラミド
の最終濃度が0.1〜10000ng/ml（好ましくは10〜1000ng/
ml）となるように加え、該細胞を12時間〜14時間培養す
ることによって、細胞の抗原提示活性または免疫原性を
増強することができる。抗原提示活性または免疫原性が
高められた細胞は、常法に基づいて、注射剤、懸濁剤、
乳化剤等の形態で通常の種々の投与経路（静脈、動脈、
皮下投与など）投与することができる。
実 施 例 以下は、本発明の実施例を示すものであるが、これに
よって本発明が限定されるものではない。
本発明の凍結乾燥組成物に用いる活性成分としてのα
−グリコシルセラミドは、前述のように抗腫瘍活性、免
疫賦活活性、骨髄細胞増殖促進活性あるいは抗原提示活
性増強作用等の種々の生理活性を有している。
［化合物の製造例］ α−グリコシルセラミドの製造 以下は、α−グリコシルセラミドの代表例としてKRN7
000の合成例を示すものである（図１および２を参照さ
れたい）。
（１）化合物G1の合成 Ｄ−リキソース（200g、1.33mol）に塩化カルシウム
で乾燥したアセトン溶液（3.0L）に硫酸（0.5mL）を加
え、18時間室温で攪拌した。モレキュラーシーブス4Aの
粉末（100g）を加え、反応液を中和後、セライト濾過
し、残渣をアセトンで洗浄した。濾液と洗液をあわせて
減圧濃縮し、G1の粗生成物を得た。収量240g（95％）。
これ以上の精製を行わずに次の工程に用いた。分析用の
サンプルは、ヘキサン：アセトン（9:1）を溶出溶媒と
してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
mp76−78℃;FDMS m/z 191（Ｍ＋１）+;1H−NMR（50
0MHz,CDCl3）δ5.45（1H,d,J＝1.8Hz）,4.83（1H,dd,J
＝3.7,5.5Hz）,4.64（1H,d,J＝6.1Hz）,4.27−4.30（1
H,m）,3.90−3.99（2H,m）,1.48（3H,s）,1.32（3H,
s）。
（２）化合物G2の合成 化合物G1（239g、約1.26mmol）の塩化メチレン溶液
（168ml）に、ピリジン（10ml）、塩化トリチル（39.0
g）を加え、32℃で４時間攪拌した。エタノール（8ml）
を滴下し、室温で２時間攪拌した。飽和塩化アンモニウ
ム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水で洗
浄後、減圧濃縮した。残渣は酢酸エチルに溶解し、０℃
に冷却して結晶化した。収量501g（Ｄ−リキソースより
87％）。
mp174−176℃;FDMS m/z 432（Ｍ＋１）+;1H−NMR
（500MHz,CDCl3）δ7.21−7.49（15H,m）,5.38（1H,d,J
＝2.4Hz）,4.75（1H,dd,J＝3.7,6.1Hz）,4.59（1H,d,J
＝6.1Hz）,4.31−4.35（1H,m）,3.43（1H,dd,J＝4.9,9.
8Hz）,3.39（1H,dd,J＝6.7,9.8Hz）,1.29（3H,s）,1.28
（3H,s）。
（３）化合物G3の合成 トリデカントリフェニルホスホニウムブロミド（962
g、1.16mol;1−ブロモトリデカン、トリフェニルホスフ
ィンを4.5時間、140℃に加熱して調製した）のTHF溶液
（1500ml）に、アルゴン雰囲気下、ｎ−ブチルリチウム
の2.5Mヘキサン溶液（462mL;366mmol）を０℃で滴下し
た。滴下終了後、15分間攪拌し、化合物G2（205g、579m
mol）のTNF溶液（450ml）を滴下した。室温まで、徐々
に温度を上げつつ18時間攪拌した。反応液を減圧濃縮
し、残渣にヘキサン：メタノール：水（10:7:3、1000m
l）の混液を加え、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄
した。水層はヘキサン（500ml）で抽出し、すべての有
機層をあわせて無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃
縮し、G3の粗生成物を得た。これ以上の精製を行わずに
次の工程に用いた。収量339g（98％）。分析用のサンプ
ルは、ヘキサン：酢酸エチル（9:1）を溶出溶媒として
シリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
FDMS m/z 598（Ｍ＋１）+;1H−NMR（500MHz,CDC
l3）δ7.21−7.45（15H,m）,5.48−5.59（2H,m）,4.91
（0.7H,t,J＝7.3Hz）,4.44（0.3H,t,J＝7.3Hz）,4.26
（0.3H,dd,J＝4.3,7.4Hz）,4.21（0.7H,dd,J＝4.3,6.7H
z）,3.75（0.7H,m）,3.69（0.3H,m）,3.24（0.3H,dd,J
＝4.9,9.8Hz）,3.17（0.7H,dd,J＝4.9,9.8Hz）,3.09−
3.14［1H,（3.11,dd,J＝4.9,9.2Hz）,H1bEoverlappe
d］,1.75−2.03（2H,m）,1.49（3H,s）,1.39and1.38（3
H,each ｓ）,1.21−1.34（20H,m）,0.88（3H,t,J＝6.7
Hz）。
（４）化合物G4の合成 化合物G3（338g、約565mmol）の塩化メチレン溶液（1
500ml）にピリジン（500ml）を加え、塩化メタンスルホ
ニル（49ml、633mmol）を滴下し、31℃で24時間攪拌し
た。エタノール（40ml）を滴下し、室温で１時間攪拌し
た。減圧濃縮後、残渣にヘキサン：メタノール：水（1
0:7:3、1000ml）の混液を加え、分液した。水層はヘキ
サン（200ml）で３回抽出し、すべての有機層をあわせ
て無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、G4の粗
生成物を得た。これ以上の精製を行わずに次の工程に用
いた。収量363g（95％）。分析用のサンプルは、ヘキサ
ン：酢酸エチル（9:1）を溶出溶媒としてシリカゲルク
ロマトグラフィーにより精製した。
FDMS m/z 676M+;1H−NMR（500MHz,CDCl3）δ7.21−
7.47（15H,m）,5.41（0.7H,ddd,J＝5.5,9.2,11.0Hz）,
5.32（0.7H,bt,J＝11.0Hz）,5.22（0.3H,bdd,J＝9.2,1
5.0Hz）,5.02（0.3H,dt,Jt＝7.3Hz,Jd＝15.0Hz,）,4.08
（0.7H,ddd,J＝3.1,5.5,7.9Hz）,4.73（0.7H,dd,J＝5.
5,9.8Hz）,4.64−4.67（0.3H,m）,4.61（0.3H,dd,J＝5.
5,9.2Hz）,4.48（0.7H,dd,J＝5.5,7.9Hz）,4.22（0.3H,
dd,J＝5.5,9.2Hz）,3.55（0.3H,dd,J＝2.4,11.6Hz）,3.
45（0.7H,dd,J＝3.2,11.0Hz）,3.06−3.12［4H,（3.12,
s），（3.11,s），（3.09,dd,J＝3.1,11.0Hz）］,1.6−
1.82（2H,m）,1.47and1.46（3H,each ｓ）,1.39（3H,
s）,1.13−1.35（20H,m）,0.88（3H,t,J＝6.8Hz）。
（５）化合物G5の合成 化合物G4（362g、約536mmol）の塩化メチレン溶液（1
500ml）にメタノール（350ml）を加え、これに濃塩酸
（200ml）を滴下し、5h室温で攪拌した。反応液に炭酸
水素ナトリウムを加えて中和後、濾過した。濾液を減圧
濃縮し、残渣に酢酸エチルを加え、食塩水で洗浄した。
水層は酢酸エチルで抽出し、すべての有機層をあわせて
無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。ヘキサ
ンより結晶化した。収量161g（G2より70％）。
mp66−67℃;FDMS m/z 377（Ｍ−H2O）+;1H−NMR（5
00MHz,CDCl3＋D2O）δ5.86（0.3H,dt,Jt＝7.3Hz,Jd＝1
4.7Hz）,5.77（0.7H,dt,Jt＝7.3,Jd＝10.4Hz）,5.55
（0.3H,br.dd,J＝7.3,14.7Hz）,5.49（0.7H,bt,J＝9.8H
z）,4.91−4.97（1H,m）,4.51（0.7H,bt,J＝9.8Hz）,4.
11（0.3H,bt,J＝7.3Hz）,3.94−4.03（2H,m）,3.67−3.
73［1H,（3.70,dd,J＝3.1,6.7Hz），（3.69,dd,J＝3.1,
7.3Hz）］,3.20and3.19（3H,each ｓ）,2.05−2.22（2
H,m）,1.22−1.43（20H,m）,0.88（3H,t,J＝6.7Hz）。
（６）化合物G6の合成 化合物G5（160g、405mmol）のTHF溶液（780ml）に５
％パラジウム−硫酸バリウム（16g）を加え、反応容器
を水素ガスで置換後、室温にて20時間攪拌した。反応液
をセライト濾過後、クロロホルム：メタノールの混液
（1:1）で洗浄した。濾液と洗液をあわせ、減圧濃縮し
た。残渣は酢酸エチルより結晶化した。収量146g（91
％）。
［α］23 D＋12゜（c1,CHCl3/MeOH＝1:1）;mp124−126
℃;FDMS m/z 397（Ｍ＋１）+;1H−NMR（500MHz,CDCl3
/CD3OD＝1:1）δ4.93−4.96（1H,m,H2）,3.91（1H,dd,J
＝6.7,12.2Hz）,3.85（1H,dd,J＝4.9,12.2Hz）,3.54−
3.60（1H,m）,3.50（1H,dd,J＝1.8,8.5Hz）,3.19（3H,
s）,1.75−1.83（1H,m）,1.53−1.62（1H,m）,1.21−1.
45（24H,m）,0.89（3H,t,J＝6.7Hz）。
（７）化合物G7の合成 化合物G6（145g、365mmol）のDMF溶液（1000ml）にア
ジ化ナトリウム（47g、730mmol）を加え、95℃で４時間
攪拌した。反応液を濃縮し、残渣に酢酸エチル（450m
l）を加え、水洗した。水層は酢酸エチルで再抽出し
た。すべての有機層をあわせて食塩水で洗浄後、無水硫
酸マグネシウムで乾燥、減圧濃縮し、G7の粗生成物を得
た。収量122g（97％）。これ以上の精製を行わずに次の
工程に用いた。収量126g（95％）。分析用のサンプル
は、ヘキサン：酢酸エチル（9:1）を溶出溶媒としてシ
リカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
［α］23 D＋16.5゜（c0.5,CHCl3−MeOH,1:1）;mp92−
93℃;FDMS m/z 344（Ｍ＋１）+;1H−NMR（500MHz,CD3
OD）δ3.91（1H,dd,J＝3.7,11.6Hz）,3.75（1H,dd,J＝
7.9,11.6Hz）,3.49−3.61（3H,m）,1.50−1.71（2H,
m）,1.22−1.46（24H,m）,0.90（3H,t,J＝6.7Hz）。
（８）化合物G8の合成 化合物G7（121g、約352mmol）の塩化メチレン溶液（7
50ml）にピリジン（250ml）、塩化トリチル（124g、445
mmol）を加え、室温で16時間攪拌した。エタノール（30
ml）を滴下し、室温で30分間攪拌した後、飽和炭酸水素
ナトリウム水溶液、飽和塩化アンモニウム水溶液、食塩
水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、減圧濃縮し
た。残渣は、ヘキサン：酢酸エチル（10:1）を溶出溶媒
としてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
収量34.4g（G6より52％）。
［α］24 D＋11.9゜（c0.9,CHCl3）,FDMS m/z 585
M+;1H−NMR（500MHz,CDCl3＋D2O）δ7.24−7.61（15H,
m）,3.62−3.66（2H,m）,3.51−3.57（2H,m）,3.42（1
H,dd,J＝6.0,10.4Hz）,1.23−1.56（26H,m）,0.88（3H,
t,J＝6.7Hz）。
（９）化合物G9の合成 化合物G8（33.5g、57.3mmol）のDMF溶液（300ml）に6
0％水素化ナトリウム（5.5g、NaHとして約138mmol）を
加え、室温で40分間攪拌した。反応液を０℃に冷却し、
臭化ベンジル（15ml、120mmol）を滴下した。室温まで
徐々に温度をあげながら18時間攪拌した。反応液に氷水
（100ml）を加えて、反応を停止した後、酢酸エチルを
用いて抽出した。抽出液は食塩水で３回洗浄し、すべて
の有機層をあわせて無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減
圧濃縮し、G9の粗生成物を得た。これ以上の精製を行わ
ずに次の工程に用いた。収量42.2g（96％）。分析用の
サンプルは、ヘキサン：酢酸エチル（100:1）を溶出溶
媒としてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し
た。
［α］24 D＋9.8゜（c1.0,CHCl3）,FDMS m/z 738
（Ｍ−N2）+;1H−NMR（500MHz,CDCl3）δ7.07−7.48（2
5H,m）,4.57（1H,d,J＝11.6Hz）,4.44（1H,d,J＝11.6H
z）,4.41（2H,s）,3.73−3.79（1H,m）,3.46−3.56（2
H,m）,3.37（1H,dd,J＝8.6,10.4Hz）,1.20−1.64（26H,
m）,0.88（3H,t,J＝6.7Hz）。
（10）化合物G10およびG11の合成 化合物G9（41.2g、約54mmol）の１−プロパノール溶
液（250ml）にメタノール（30ml）を加え、更に５％パ
ラジウム炭素（4.1g）、蟻酸アンモニウム（27.1g、4.3
mol）を加えた。室温で16時間攪拌後、酢酸エチルで希
釈し、セライト濾過した。濾液を減圧濃縮し、酢酸エチ
ルで溶解後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水で
３回洗浄し、すべての有機層をあわせて無水硫酸マグネ
シウムで乾燥後、減圧濃縮し、G10の粗生成物を得た。
収量38.9g（98％）。得られたG10は、これ以上の精製を
行わずに次の工程に用いた。
化合物G10の塩化メチレン溶液（300ml）に、ヘキサコ
サン酸（22.4g、56.5mmol）、WSC塩酸塩（12.6g、64.6m
mol）を加え、２時間加熱還流した。室温まで冷却後、
減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル（500ml）を加え、0.5
M塩酸水溶液、食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液、更に食塩水で洗浄した。すべての有機層をあわせて
無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、G11の粗
生成物を得た。収量53.2g（88％）。得られたG11は、こ
れ以上の精製を行わずに次の工程に用いた。分析用のサ
ンプルは、ヘキサン：酢酸エチル（100:1）を溶出溶媒
としてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
［α］24 D＋5.3゜（c0.4,CHCl3）;FDMS m/z 1118
M+;1H−NMR（500MHz,CDCl3）δ7.20−7.38（25H,m）,5.
57（1H,d,J＝9.1Hz）,4.80（1H,d,J＝11.6Hz）,4.48−
4.50（3H,m）,4.24−4.32（1H,m）,3.83（1H,dd,J＝3.
0,6.7Hz）,3.43−3.51（2H,m,H1a）,3.29（1H,dd,J＝4.
3,9.8Hz）,1.92（2H,t,J＝7.3Hz）,1.28−1.60（72H,
m）,0.88（6H,t,J＝6.7Hz）。
（11）化合物G12の合成 化合物G11（52.2g、約47mmol）の塩化メチレン溶液
（180ml）にメタノール（36ml）を加え、次いで10％塩
酸メタノール溶液（3.0ml）を滴下し、室温で２時間攪
拌した。反応液は粉状の炭酸水素ナトリウム（18g）で
中和し、セライト濾過した。残渣は塩化メチレンで洗浄
した。濾液と洗液をあわせ、食塩水で洗浄し、有機層を
無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣を
アセトンに加熱溶解し、０℃に冷却して沈殿化により精
製した。収量38.6g（G9より77％）。
［α］24 D−29.7゜（c0.7,CHCl3）;mp75−76.5℃;FDM
S m/z 876M+;1H−NMR（500MHz,CDCl3）δ7.30−7.47
（10H,m）,6.03（1H,d,J＝7.9Hz）,4.72（1H,d,J＝11.6
Hz）,4.66（1H,d,J＝11.6Hz）,4.61（1H,d,J＝11.6H
z）,4.45（1H,d,J＝11.6Hz）,4.12−4.17（1H,m）,4.00
（1H,dt,Jt＝4.3,Jd＝7.3Hz）,3.67−3.72（2H,m）,3.6
1（1H,ddd,J＝4.3,8.6,11.6Hz）,1.94−2.05（2H,m）,
1.15−1.69（72H,m）,0.88（6H,t,J＝6.1Hz）。
（12）化合物G13の合成 １） 2,3,4,6−テトラ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−ガラクト
ピラノシルアセテート（79.8g）をトルエン（160ml）お
よびイソロピルエーテル（520ml）の混液に溶解し、−1
0〜０℃に冷却した。これに、2.0等量のHBrを含むイソ
プロピルエーテル溶液を加えた（2.8mmol/ml、約100m
l）。−10〜０℃で約90分間攪拌後、反応液に５％炭酸
水素ナトリウム水溶液を注ぎ、攪拌して過剰のHBrを中
和した。全量を分液ロートに移して分液後、水層を廃棄
し、10％塩化ナトリウム水溶液で２回洗浄した。減圧濃
縮して2,3,4,6−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラ
クトピラノシルブロミド（Ga1Br）のシロップを得た。
２） 化合物G12（60.0g、68.6mmol）、テトラヘキシル
アンモニウムブロミド（89.4g、206mmol）、モレキュラ
ーシーブス4A（60g）のトルエン溶液（420ml）に、DMF
（140ml）次いで、Ga1Br（約137mmol）のトルエン溶液
（250ml）を加え、室温で72時間攪拌した。反応液にメ
タノール（12ml）を加え、２時間攪拌した。セライト濾
過後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、食塩水で洗浄
後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残
渣にアセトニトリルを加え、２時間攪拌し、沈殿を得
た。得られた沈殿を減圧乾燥し、乾燥粉体を得た。これ
をヘキサン：酢酸エチル（8:1）を溶出溶媒としてシリ
カゲルクロマトグラフィーにより精製した。収量70.9g
（74％）。
［α］24 D＋18.8゜（c0.9,CHCl3）;mp74−75℃;FDMS
m/z 1399（Ｍ＋１）+;1H−NMR（500MHz,CDCl3）δ7.
21−7.37（30H,m）,6.12（1H,d,J＝9.0Hz）,4.91（1H,
d,J＝11.6Hz）,4.84（1H,d,J＝3.7Hz）,4.72−4.80（4
H,m）,4.35−4.65（7H,m）,4.12−4.18（1H,m）,3.99−
4.05（2H,m）,3.84−3.93（4H,m）,3.73（1H,dd,J＝3.
7,11.0Hz）,3.47−3.51（2H,m）,3.42（1H,dd,J＝6.1,
9.1Hz）,1.87−1.99（2H,m）,1.18−1.70（72H,m）,0.8
8（6H,t,J＝7.4Hz）。
（13）化合物KRN7000の合成 化合物G13（60.0g、42.9mmol）をエタノール（960m
l）に加えて懸濁させ、これに20％水酸化パラジウム
（6.0g）のエタノール懸濁液を加えた。更に水素源とな
る４−メチルシクロヘキセン（120ml、93.5mmol）を加
え、４時間加熱還流した後、濾過し、触媒を除いた。残
渣は加温したエタノールで洗浄した。濾液を室温放置す
ることによって得た白色沈殿を濾過、減圧乾燥した。得
られた粉体をエタノール：水（92:8、3.5L）に懸濁し、
攪拌しながら加熱溶解後、室温放置することによって再
度沈殿化した。沈殿液を濾過し、濾取したケーキを減圧
乾燥し、白色粉末を得た。収量35.0g（95％）。
［α］23 D＋43.6゜（c1.0,pyridine）;mp189.5−190.
5℃;negativeFABMS m/z 857（Ｍ−Ｈ）-;IR（cm-1,KB
r）3300,2930,2850,1640,1540,1470,1070;1H−NMR（500
MHz,C5D5N）δ8.47（1H,d,J＝8.5Hz）,5.58（1H,d,J＝
3.7Hz）,5.27（1H,m）,4.63−4.70（2H,m）,4.56（1H,
m）,4.52（1H,t,J＝6.1Hz）,4.37−4.47（4H,m）,4.33
（2H,m）,2.45（2H,t,J＝7.3Hz）,2.25−2.34（1H,m）,
1.87−1.97（2H,m）,1.78−1.85（2H,m）,1.62−1.72
（1H,m）,1.26−1.45（66H,m）,0.88（6H,t,J＝6.7H
z）,13C−NMR（125MHz,C5D5N）δ173.2（ｓ）,101.5
（ｄ）,76.7（ｄ）,73.0（ｄ）,72.5（ｄ）,71.6
（ｄ）,71.0（ｄ）,70.3（ｄ）,68.7（ｔ）,62.7
（ｔ）,51.4（ｄ）,36.8（ｔ）,34.4（ｔ）,32.1
（ｔ）,30.4（ｔ）,30.2（ｔ）,30.03（ｔ）,30.00
（ｔ）,29.93（ｔ）,29.87（ｔ）,29.81（ｔ）,29.76
（ｔ）,29.6（ｔ）,26.5（ｔ）,26.4（ｔ）,22.9
（ｔ）,14.38（ｑ）。
［凍結乾燥組成物］ （１）活性成分の溶媒の選択 実験条件 まず、濃度が10μg/mlとなるように活性成分（KRN700
0）を1mgはかりとり、100mlの各種溶媒（表３）に80℃
温浴中で20分間撹拌し溶解を試みた。10μg/mlが溶けて
いると判定された溶媒に関して、同様の方法で濃度が10
0μg/mlとなるように溶解を試みた。100μg/mlも溶けて
いると判定された溶媒に関してさらに200μg/mlとなる
ように溶解を試み、流水で冷却後溶解性を判定した。
溶解性の判定は、以降に示すような試験を行い判定し
た。まず、各サンプルを5ml容量の無色透明なガラスバ
イアル瓶に約1.5ml充填し、密封した。容器の外部を清
浄にし、暗室のなかで白色光源の直下、約5000ルクスの
明るさの位置で、肉眼で観察するとき、澄明で、析出物
を認めないとき溶けていると判定した。
結果は表３に示す。
以上の結果から、溶媒としてはエタノールあるいは0.
5％ポリソルベート20が考えられたが、100％エタノール
は実用上ふさわしくないため、0.5％ポリソルベート水
溶液を溶媒として選択した。
（２）溶媒の至適添加量の検討 実験条件 まず、ポリソルベート20が表４にあげた各濃度となる
ように蒸留水に溶解させた。つぎに活性成分（KRN700
0）を各20mgはかりとり、各濃度のポリソルベート溶液1
00mlに80℃温浴中で20分間撹拌し溶解を試みた。流水で
冷却後0.22μｍのフィルターで濾過し、得られた各種溶
液を2mlずつ5ml容量の無色透明なガラスバイアル瓶に充
填し、密封した。
このサンプルを25℃で保存し、２週間後の溶解性を判
定し、溶けていると判定されたものはさらに保存を継続
し、１ケ月後にふたたび溶解性を判定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表４に示す。表中、保存後の経時変化は、溶液
のまま保存した場合の溶解性を表わしたものである。
以上の結果から、ポリソルベート20は0.3％以上の添
加が必要であることが判明したが、25℃,1ケ月のデータ
からポリソルベート20のみでは実用上製剤として充分で
ないことも判明した。そこで、保存下の溶解性を維持さ
せるために凍結乾燥製剤の検討を行うことにした。
（３）凍結乾燥製剤化の検討 実験条件 まず、ポリソルベート20が表５にあげた各濃度となる
ように蒸留水に溶解させた。つぎに活性成分（KRN700
0）を各20mgはかりとり、各濃度のポリソルベート溶液1
00mlに80℃温浴中で20分間撹拌し溶解を試みた。流水で
冷却後0.22μｍのフィルターで濾過し、得られた各種溶
液を1mlずつ5ml容量の無色透明なガラスバイアル瓶に充
填し、凍結乾燥した。凍結乾燥条件は、−40℃で２時間
予備凍結をした後−20℃で24時間、10℃で12時間、最後
に25℃で５時間乾燥を行い凍結乾燥物を得た。この間の
真空度は0.1Torr以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を注射
用蒸留水1mlで再溶解し、30分間放置し再溶解時の泡が
消失した後、溶解性を判定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表５に示す。
以上の結果から、ポリソルベート20のみでは凍結乾燥
製剤として相応しくないことが判明した。
（４）凍結乾燥に適した賦形剤の検討１ 実験条件 凍結乾燥製剤の賦形剤として、種々の単糖および二糖
を検討に用いた。なお、以後の検討では活性成分（KRN7
000）は濃度200μg/mlに固定し、またポリソルベート20
は安全性上あまり多量に添加できないことから濃度0.5
％に固定した。
まず、ポリソルベート20が0.5％、糖類が表６にあげ
た各濃度となるように蒸留水に両者を溶解させた。つぎ
に活性成分（KRN7000）を各20mgはかりとり、各溶媒100
mlに80℃温浴中で20分間撹拌し溶解を試みた。流水で冷
却後0.22μｍのフィルターで濾過し、得られた各種溶液
を1mlずつ5ml容量の無色透明なガラスバイアル瓶に充填
し、凍結乾燥した。凍結乾燥条件は、−40℃で２時間予
備凍結をした後−20℃で24時間、10℃で12時間、最後に
25℃で５時間乾燥を行い凍結乾燥物を得た。この間の真
空度は0.1Torr以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を注射
用蒸留水1mlで再溶解し、30分間放置し再溶解時の泡が
消失した後、溶解性を判定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表６に示す。
以上の結果から、凍結乾燥の賦形剤としてはシュクロ
ース、マンニトール、グルコースが適切と考えられた。
（５）凍結乾燥に適した賦形剤の検討２ 実験条件 マンニトールならびにシュクロースを添加した凍結乾
燥製剤の経時変化を観察した。
まず、ポリソルベート20が0.5％、糖類が表７にあげ
た各濃度となるように蒸留水に両者を溶解させた。つぎ
に活性成分（KRN7000）を各20mgはかりとり、各溶媒100
mlに80℃温浴中で20分間撹拌し溶解を試みた。流水で冷
却後0.22μｍのフィルターで濾過し、得られた各種溶液
を1mlずつ5ml容量の無色透明なガラスバイアル瓶に充填
し、凍結乾燥した。凍結乾燥条件は、−40℃で２時間予
備凍結をした後−20℃で24時間、10℃で12時間、最後に
25℃で５時間乾燥を行い凍結乾燥物を得た。この間の真
空度は0.1Torr以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を25℃
で保存した。１ケ月保存後、凍結乾燥組成物を注射用蒸
留水1mで再溶解し、30分間放置し再溶解時の泡が消失し
た後、溶解性を判定した。溶けていると判定されたもの
はさらに保存を継続し、４ケ月後にふたたび溶解性を判
定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表７に示す。
以上の結果から、マンニトールやシュクロースを添加
した凍結乾燥製剤は0.5％ポリソルベート20溶液製剤よ
りも安定であり、25℃,1ケ月後でも溶解した。
さらに長期保存可能な処方を検討するため、以下に添
加剤の検討を行った。
（６）添加剤の検討：保存時の再溶解性を改善させる添
加剤の検討 （ｉ）賦形剤にマンニトールを選択した場合 実験条件 まず、ポリソルベート20が0.5％、マンニトールおよ
び各種添加剤が表８にあげた各濃度となるように蒸留水
に各々を溶解させた。つぎに活性成分（KRN7000）を各2
0mgはかりとり、各溶媒100mlに80℃温浴中で20分間撹拌
し溶解を試みた。流水で冷却後0.22μｍのフィルターで
濾過し、得られた各種溶液を1mlずつ5ml容量の無色透明
なガラスバイアル瓶に充填し、凍結乾燥した。凍結乾燥
条件は、−40℃で２時間予備凍結をした後−20℃で24時
間、10℃で12時間、最後に25℃で５時間乾燥を行い凍結
乾燥物を得た。この間の真空度は0.1Torr以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を25℃
で保存した。１ケ月保存後、凍結乾燥組成物を注射用蒸
留水1mで再溶解し、30分間放置し再溶解時の泡が消失し
た後、溶解性を判定した。溶けていると判定されたもの
はさらに保存を継続し、４ケ月後にふたたび溶解性を判
定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表８に示す。
以上の結果から、マンニトール10％を賦形剤とした
時、デオキシコール酸ナトリウム１％の添加により保存
下での再溶解性が改善されることが判明した。
（ii）賦形剤にシュクロースを選択した場合 実験条件 まず、ポリソルベート20が0.5％、シュクロースおよ
び各種添加剤が表９にあげた各濃度となるように蒸留水
に各々を溶解させた。つぎに活性成分（KRN7000）を各2
0mgはかりとり、各溶媒100mlに80℃温浴中で20分間撹拌
し溶解を試みた。流水で冷却後0.22μｍのフィルターで
濾過し、得られた各種溶液を1mlずつ5ml容量の無色透明
なガラスバイアル瓶に充填し、凍結乾燥した。凍結乾燥
条件は、−40℃で２時間予備凍結をした後−20℃で24時
間、10℃で12時間、最後に25℃で５時間乾燥を行い凍結
乾燥物を得た。この間の真空度は0.1Torr以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を25℃
または50℃、あるいは両方の温度で保存した。25℃１ケ
月または50℃３日保存後、凍結乾燥組成物を注射用蒸留
水1mで再溶解し、30分間放置し再溶解時の泡が消失した
後、溶解性を判定した。溶けていると判定されたものは
さらに保存を継続し、25℃保存は４ケ月後、50℃保存は
２週間後にふたたび溶解性を判定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表９に示す。
以上の結果より、シュクロースを賦形剤とした時、デ
オキシコール酸ナトリウムやヒスチジンの添加により保
存下での再溶解性が改善されることが判明した。
（iii）デオキシコール酸ナトリウムならびにヒスチジ
ンの添加効果 実験条件 賦形剤として糖を含まない場合のデオキシコール酸ナ
トリウムならびにヒスチジンの添加効果を調べた。
まず、ポリソルベート20が0.5％、およびヒスチジン
あるいはデオキシコール酸ナトリウムが1.0％となるよ
うに蒸留水に各々を溶解させた。つぎに活性成分（KRN7
000）を各20mgはかりとり、各溶媒100mlに80℃温浴中で
20分間撹拌し溶解を試みた。流水で冷却後0.22μｍのフ
ィルターで濾過し、得られた各種溶液を1mlずつ5ml容量
の無色透明なガラスバイアル瓶に充填し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥条件は、−40℃で２時間予備凍結をした後
−20℃で24時間、10℃で12時間、最後に25℃で５時間乾
燥を行い凍結乾燥物を得た。この間の真空度は0.1Torr
以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を50℃
で保存した。保存３日後あるいは２週間後、凍結乾燥組
成物を注射用蒸留水1mで再溶解し、30分間放置し再溶解
時の泡が消失した後、溶解性を判定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表10に示す。
以上の結果より、ヒスチジンやデオキシコール酸ナト
リウムのみでは効果がないことが判明した。
（７）最適処方の検討 実験条件 まず、ポリソルベート20が0.5％、シュクロースおよ
びヒスチジンあるいはデオキシコール酸ナトリウムが表
11にあげた各濃度となるように蒸留水に各々を溶解させ
た。つぎに活性成分（KRN7000）を各20mgはかりとり、
各溶媒100mlに80℃温浴中で20分間撹拌し溶解を試み
た。流水で冷却後0.22μｍのフィルターで濾過し、得ら
れた各種溶液を1mlずつ5ml容量の無色透明なガラスバイ
アル瓶に充填し凍結乾燥した。凍結乾燥条件は、−40℃
で２時間予備凍結をした後−20℃で24時間、10℃で12時
間、最後に25℃で５時間乾燥を行い凍結乾燥物を得た。
この間の真空度は0.1Torr以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を25℃
または50℃の温度で保存した。25℃２ケ月または50℃２
週間保存後、凍結乾燥組成物を注射用蒸留水1mlで再溶
解し、30分間放置し再溶解時の泡が消失した後、溶解性
を判定した。25℃２ケ月保存で溶けていると判定された
ものはさらに保存を継続し、４ケ月後にふたたび溶解性
を判定した。
溶解性の判定は、容器の外部を清浄にし、暗室のなか
で白色光源の直下、約5000ルクスの明るさの位置で、肉
眼で観察するとき、澄明で、析出物を認めないとき溶け
ていると判定した。
結果は表11に示す。
以上の結果より、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステ
ルおよび白糖に、更にデオキシコール酸ナトリウムまた
はヒスチジンを適量配合することによって、活性成分の
凍結保存後の経時的再溶解性が向上されることが判明し
た。
（８） 加熱溶解後の冷却条件の検討１ 実験条件 まず、ポリソルベート20が0.5％、ヒスチジン0.75％
およびシュクロース5.6％となるように蒸留水に溶解さ
せた。つぎに活性成分（KRN7000）を800mgはかりとり先
の溶媒4Lに73℃加熱下で30分間攪拌し溶解を試みた。溶
解後約500mLずつ分注し、攪拌下で73℃→30℃（６
分）、73℃→30℃（23分）、73℃→30℃（120分）の冷
却を行った。冷却後の各種溶液を0.22μｍのフィルター
で濾過し、1mLずつ5mL容量の無色透明なガラスバイアル
瓶に充填し凍結乾燥した。凍結乾燥条件は、−50℃で５
時間予備凍結をした後−15℃で48時間、10℃で12時間、
最後に25℃で７時間乾燥を行い凍結乾燥物を得た。この
間の真空度は0.1Torr以下とした。
各冷却条件で調製したフィルター濾過前後の溶液およ
び凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を質温
（25℃）で３時間静置後に再溶解し、濁度を測定した。
なお、凍結乾燥組成物の濁度は注射用蒸留水1mLで再溶
解し、30分放置し、再溶解時の泡が消失したものを用い
た。
濁度測定はまず、濁度標準液（カオリン0.1mg/mL）を
蒸留水を用いて50倍希釈（カオリン２μg/mL、濁度2.0
0）、100倍希釈（カオリン１μg/mL、濁度1.00）、200
倍希釈（カオリン0.5μg/mL 濁度0.50）の各種希釈液
を調製し、蒸留水を対照として分光光度計（日立Ｕ−32
10）を用いて660nmの波長で吸光度を測定することによ
り検量線をもとめた。ついで同じ条件で各種溶液の吸光
度を求め、先の検量線から各種溶液の濁度を算出した。
結果は表12に示す。
以上の結果より、冷却条件を冷却とすることにより、
活性成分の凍結乾燥後の再溶解性が向上することが判明
した。
（９） 加熱溶解後の冷却条件の検討２ 実験条件 まず、ポリソルベート20が0.5％、ヒスチジン0.75％
およびシュクロース5.6％となるように蒸留水に溶解さ
せた。つぎに活性成分（KRN7000）を800mgはかりとり先
の溶媒4Lに73℃加熱下で30分間攪拌し溶解を試みた。溶
解後約500mLずつ分注し、攪拌下で次に示す６つのスピ
ードで急冷〜徐冷を行った。
冷却後の各種溶液を0.22μｍのフィルターで濾過し、
1mLずつ5mL容量の無色透明なガラスバイアル瓶に充填し
凍結乾燥した。凍結乾燥条件は、−50℃で５時間予備凍
結をした後−15℃で48時間、10℃で12時間、最後に25℃
で７時間乾燥を行い凍結乾燥物を得た。この間の真空度
は0.1Torr以下とした。
凍結乾燥工程終了後、得られた凍結乾燥組成物を50℃
で１週間保存し、再溶解液の濁度を測定した。なお、凍
結乾燥組成物の濁度は注射用蒸留水1mLで再溶解し、30
分放置し、再溶解時の泡が消失したものを用いた。
濁度測定はまず、濁度標準液（カオリン0.1mg/mL）を
蒸留水を用いて50倍希釈（カオリン２μg/mL、濁度2.0
0）、100倍希釈（カオリン１μg/mL、濁度1.00）、200
倍希釈（カオリン0.5μg/mL、濁度0.50）の各種希釈液
を調製し、蒸留水を対照とし分光光度計（日立Ｕ−321
0）を用いて660nmの波長で吸光度を測定することにより
検量線をもとめた。ついで同じ条件で各種溶液の吸光度
を求め、先の検量線から各種溶液の濁度を算出した。
結果は表13に示す。
以上の結果より、冷却条件を急冷とすることにより、
保存後の活性成分の経時的再溶解性がより向上すること
が判明した。
［注射用凍結乾燥組成物］ 組成物１ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・マンニトール 100mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物２ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・マンニトール 100mg ・デオキシコール酸ナトリウム 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物３ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 100mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物４ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 96mg ・デオキシコール酸ナトリウム 5mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物５ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 96mg ・デオキシコール酸ナトリウム 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物６ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 96mg ・デオキシコール酸ナトリウム 20mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物７ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 48mg ・デオキシコール酸ナトリウム 5mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物８ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 48mg ・デオキシコール酸ナトリウム 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物９ ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 48mg ・デオキシコール酸ナトリウム 20mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物10 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 75.2mg ・デオキシコール酸ナトリウム 5mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物11 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 72.9mg ・デオキシコール酸ナトリウム 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物12 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 96mg ・ヒスチジン 20mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物13 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 96mg ・ヒスチジン 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物14 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 51mg ・ヒスチジン 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物15 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 50mg ・ヒスチジン 20mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物16 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 32mg・ヒスチジン 20mg ・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物17 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 31mg ・ヒスチジン 30mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物18 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 68.8mg ・ヒスチジン 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物19 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 56mg ・ヒスチジン 7.5mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
組成物20 ・α−グリコシルセラミド（KRN7000） 0.2mg ・ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート20） 5mg ・シュクロース 51.2mg ・ヒスチジン 10mg・溶媒（注射用蒸留水） 適量 計 1ml 上記の処方に従って、80℃、20分間加温によりα−グ
リコシルセラミド（KRN7000）を完全に溶解せしめ、つ
いで流水で15分間冷却後、0.22μｍのフィルターで濾過
し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥製剤とする。
凍結乾燥製剤の溶解性評価 組成物１〜20の凍結乾燥製剤について、凍結乾燥直後
および経時的保存後の溶解性の評価を行ったところ、下
表14に示すようにいずれにおいても良好な溶解性が得ら
れた。
産業上の利用性 本発明によれば、水に対して溶解性の低い活性成分と
してのスフィンゴ糖脂質（糖部分が単糖からなるα−グ
リコシルセラミド）に、ポリオキシソルビタン脂肪酸エ
ステルおよび二糖（シュクロースなど）もしくは単糖
（グルコースまたはマンニトールなど）を配合して凍結
乾燥することにより、活性成分の溶媒に対する溶解性が
著しく向上する。またこの配合に、更にデオキシコール
酸ナトリウムまたはヒスチジンを配合することによって
長期保存後の再溶解性を更に高めることができる。従っ
て、本発明による組成物は、溶解性に優れた注射用凍結
乾燥製剤として有用である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 37/04 Ａ６１Ｐ 37/04 43/00 １０７ 43/00 １０７ (56)参考文献 特開 平９−315980（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−157818（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−245418（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−508640（ＪＰ，Ａ) 国際公開98／44928（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 31/7028 A61K 31/7032 A61K 9/19 A61K 47/26 A61P 35/00 A61P 37/04 A61P 43/00 107 ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式（Ａ）で示されるα−グリコシルセラ
    ミドもしくはその塩、ポリオキシソルビタン脂肪酸エス
    テル、および二糖もしくは単糖を含有してなる、凍結乾
    燥組成物。 ［式中、R1はＨまたはOHである； Ｘは７〜25のいずれかの整数である； R2は下記（ａ）〜（ｅ）で定義される置換基のいずれか
    である（ここで、Ｙは５〜17のいずれかの整数であ
    る）。 （ａ）−CH2（CH2）YCH3 （ｂ）−CH（OH）（CH2）YCH3 （ｃ）−CH（OH）（CH2）YCH（CH3）２ （ｄ）−CH＝CH（CH2）YCH3 （ｅ）−CH（OH）（CH2）YCH（CH3）CH2CH3; R3およびR4のいずれか一方はＨであり、他方はＨ、OH、
    NH2またはNHCOCH3である； R5およびR6のいずれか一方はＨであり、他方はOHであ
    る； R7およびR8のいずれか一方はＨであり、他方はOHであ
    る； R9はＨ、CH3またはCH2OHである。］
  2. 【請求項２】次式（A'）で示されるα−グリコシルセラ
    ミドもしくはその塩、ポリオキシソルビタン脂肪酸エス
    テル、および二糖もしくは単糖を含有してなる、請求項
    １記載の凍結乾燥組成物。 ［式中、R1はＨまたはOHである； Ｘは７〜25のいずれかの整数である； R2は下記（ａ）〜（ｅ）で定義される置換基のいずれか
    である（ここで、Ｙは５〜17のいずれかの整数であ
    る）。 （ａ）−CH2（CH2）YCH3 （ｂ）−CH（OH）（CH2）YCH3 （ｃ）−CH（OH）（CH2）YCH（CH3）２ （ｄ）−CH＝CH（CH2）YCH3 （ｅ）−CH（OH）（CH2）YCH（CH3）CH2CH3;および R3〜R9は下記のｉ）〜ｖ）で定義される置換基である。 ｉ） R3、R6およびR8がＨのとき R4はＨ、OH、NH2またはNHCOCH3である； R5はOHである； R7はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである； ii）R3、R6およびR7がＨのとき R4はＨ、OH、NH2またはNHCOCH3である； R5はOHである； R8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである。 iii）R4、R6およびR7がＨのとき R3はＨ、OH、NH2またはNHCOCH3である； R5はOHである； R8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである； iv）R4、R5およびR7がＨのとき R3、R6およびR8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである。 ｖ） R3、R5およびR7がＨのとき R4、R6およびR8はOHである； R9はＨ、CH3またはCH2OHである。
  3. 【請求項３】α−グリコシルセラミドのR3、R6およびR8
    がＨであり、R4、R5およびR7がOHであり、かつR9がCH2O
    Hである、請求項１または２記載の凍結乾燥組成物。
  4. 【請求項４】α−グリコシルセラミドのR2が置換基
    （ｂ）、（ｃ）または（ｅ）である、請求項１〜３のい
    ずれか１項記載の凍結乾燥組成物。
  5. 【請求項５】α−グリコシルセラミドのR1がＨであり、
    かつR2が置換基（ｂ）である、請求項４記載の凍結乾燥
    組成物。
  6. 【請求項６】アルキル基におけるメチレンのＸが21〜25
    の整数であり、基R2におけるＹが11〜15である、請求項
    ５記載の凍結乾燥組成物。
  7. 【請求項７】α−グリコシルセラミドが（2S,3S,4R）−
    １−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキ
    サコサノイルアミノ−3,4−オクタデカンジオールであ
    る、請求項６記載の凍結乾燥組成物。
  8. 【請求項８】二糖もしくは単糖がシュクロース、マンニ
    トールまたはグルコースである、請求項１〜７のいずれ
    か１項記載の凍結乾燥組成物。
  9. 【請求項９】二糖もしくは単糖がシュクロースである、
    １〜７のいずれか１項記載の凍結乾燥組成物。
  10. 【請求項１０】デオキシコール酸ナトリウムまたはヒス
    チジンを更に含有してなる、請求項１〜９のいずれか１
    項記載の凍結乾燥組成物。
  11. 【請求項１１】α−グリコシルセラミド１重量部に対し
    て、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル10〜1000重量
    部、二糖もしくは単糖100〜10000重量部を含有してな
    る、請求項１〜９のいずれか１項記載の凍結乾燥組成
    物。
  12. 【請求項１２】α−グリコシルセラミド１重量部に対し
    て、ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル10〜1000重量
    部、二糖もしくは単糖100〜10000重量部、デオキシコー
    ル酸ナトリウムまたはヒスチジン10〜1000重量部を含有
    してなる、請求項10記載の凍結乾燥組成物。
  13. 【請求項１３】注射用組成物である、請求項１〜12のい
    ずれか１項に記載の凍結乾燥組成物。
  14. 【請求項１４】請求項１〜13のいずれか１項に記載の組
    成物の配合成分を加温した水性溶媒に溶解させ、冷却し
    た後、凍結乾燥の工程に付すことを特徴とする、凍結乾
    燥組成物の製造法。
  15. 【請求項１５】配合成分を65〜90℃で溶解させた後、こ
    の溶液を1.0℃/min以上の降温速度で冷却することを特
    徴とする、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】溶液を1.5℃/min以上の降温速度で急冷
    することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】溶液を2.0℃/min以上の降温速度で急冷
    することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
  18. 【請求項１８】溶液を4.0℃/min以上の降温速度で急冷
    することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
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