JP3294276B2 - 細菌細胞における異種遺伝子の染色体発現 - Google Patents
細菌細胞における異種遺伝子の染色体発現Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、細菌における異種遺伝子の発現の分野に関
する。
する。
背景技術 E.coli中でのクローニングおよび外来タンパク質の発
現に通常使用される多コピープラスミドの一つに存在す
る遺伝子は、通常20コピー／細胞を超えるコピー数を有
する。低コピー数プラスミド（例えば、pACYC177および
pLG339）でさえ、一般に細胞あたり６〜10コピーで存在
する。ある種の外来タンパク質は微量に発現しても、宿
主細胞を殺し得る（Meth.Enzymol.185:63〜65、D.Goedd
el編、1990を参照のこと）。この理由のために、例え
ば、遺伝子を細菌の染色体に細胞あたり１コピーまたは
少コピー数で組込むことによって、そのような毒性の遺
伝子産物をコードする遺伝子のコピー数を確実に制限す
ることは有利である。例えば、ライブラリー中の１つま
たはそれ以上のcDNAの高コピー発現が、細菌細胞を殺す
か、またはその成長を遅らせる場合、このような系は、
細菌宿主のさらに代表的なcDNA発現ライブラリーを作製
することを可能にする。
現に通常使用される多コピープラスミドの一つに存在す
る遺伝子は、通常20コピー／細胞を超えるコピー数を有
する。低コピー数プラスミド（例えば、pACYC177および
pLG339）でさえ、一般に細胞あたり６〜10コピーで存在
する。ある種の外来タンパク質は微量に発現しても、宿
主細胞を殺し得る（Meth.Enzymol.185:63〜65、D.Goedd
el編、1990を参照のこと）。この理由のために、例え
ば、遺伝子を細菌の染色体に細胞あたり１コピーまたは
少コピー数で組込むことによって、そのような毒性の遺
伝子産物をコードする遺伝子のコピー数を確実に制限す
ることは有利である。例えば、ライブラリー中の１つま
たはそれ以上のcDNAの高コピー発現が、細菌細胞を殺す
か、またはその成長を遅らせる場合、このような系は、
細菌宿主のさらに代表的なcDNA発現ライブラリーを作製
することを可能にする。
異種ポリペプチドをコードする遺伝子の染色体への組
込みはまた、細菌宿主細胞で外来タンパク質を発現する
ための代替手段として有利である。多コピーベクターは
しばしば不安定であり、そして維持のために増殖培地に
抗生物質を使用することを要求する。外来遺伝子を細菌
染色体に組込む現在の方法は有効ではなく、外来遺伝子
の組込み部位を制御することができず、そして／または
組込み遺伝子のコピー数を制御することができない。最
も重要なことに、組換えDNA構築物を細菌染色体上に作
製するための今日までの全ての努力は（ここで、細菌プ
ロモーターは、異種遺伝子に融合される）、構築物を有
するウイルスまたはプラスミド媒介物の作製を含んでい
る。このような媒介物は高コピー数で複製するので、外
来遺伝子産物が細菌細胞に対して毒性である場合には、
それらは回収するのに困難であり得るか、または不可能
でさえあり得る。
込みはまた、細菌宿主細胞で外来タンパク質を発現する
ための代替手段として有利である。多コピーベクターは
しばしば不安定であり、そして維持のために増殖培地に
抗生物質を使用することを要求する。外来遺伝子を細菌
染色体に組込む現在の方法は有効ではなく、外来遺伝子
の組込み部位を制御することができず、そして／または
組込み遺伝子のコピー数を制御することができない。最
も重要なことに、組換えDNA構築物を細菌染色体上に作
製するための今日までの全ての努力は（ここで、細菌プ
ロモーターは、異種遺伝子に融合される）、構築物を有
するウイルスまたはプラスミド媒介物の作製を含んでい
る。このような媒介物は高コピー数で複製するので、外
来遺伝子産物が細菌細胞に対して毒性である場合には、
それらは回収するのに困難であり得るか、または不可能
でさえあり得る。
外来遺伝子の細菌宿主染色体への組込みを達成するた
めの先の方法は、ファージλベクターの使用を包含す
る。環状型のファージDNAは、ファージ付着部位（att
P）（240塩基長）と細菌付着部位（att B）（わずか25
塩基長）との間の単一部位特異的組換えによって、細菌
染色体へ直線状で挿入される。２つの部位は一般に15塩
基を有する。この部位特異的組換えの事象は、ファージ
遺伝子INTにより特定される特別なインテグラーゼによ
り触媒される（Virology、第２版、R.DulbeccoおよびH.
Ginsberg編、Philadelphia:Lippincott,pp.56−57（198
5））。
めの先の方法は、ファージλベクターの使用を包含す
る。環状型のファージDNAは、ファージ付着部位（att
P）（240塩基長）と細菌付着部位（att B）（わずか25
塩基長）との間の単一部位特異的組換えによって、細菌
染色体へ直線状で挿入される。２つの部位は一般に15塩
基を有する。この部位特異的組換えの事象は、ファージ
遺伝子INTにより特定される特別なインテグラーゼによ
り触媒される（Virology、第２版、R.DulbeccoおよびH.
Ginsberg編、Philadelphia:Lippincott,pp.56−57（198
5））。
INT-であるファージベクターは、インテグラーゼが、
例えばINT+ヘルパーファージにより、トランスに供給さ
れる限り、通常の様式で染色体に組込まれ得る（例え
ば、Borckら、（1976）Molec.Gen.Genet.146:199−207
を参照のこと）。
例えばINT+ヘルパーファージにより、トランスに供給さ
れる限り、通常の様式で染色体に組込まれ得る（例え
ば、Borckら、（1976）Molec.Gen.Genet.146:199−207
を参照のこと）。
att-かつINT-であるファージベクターは同様に、att+
INT+ヘルパーファージを用いることによって、二重溶原
体として細菌染色体に組込まれ得る。細菌付着部位での
プロファージの結合により形成される二重溶原体は、欠
陥ファージおよびヘルパーファージの同種配列間での一
般の細菌組換えにより、染色体に組込まれる（例えば、
Struhlら、（1976）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:1471−
1475を参照のこと）。同様に、非複製colE1レプリコン
を、宿主染色体と、プラスミドベクターが有する同種配
列との間の組換えによって、E.coliのpolA株のゲノムに
組込むこともまた可能である（GreenerおよびHill（198
0）J.Bacteriol.144:312−321）。
INT+ヘルパーファージを用いることによって、二重溶原
体として細菌染色体に組込まれ得る。細菌付着部位での
プロファージの結合により形成される二重溶原体は、欠
陥ファージおよびヘルパーファージの同種配列間での一
般の細菌組換えにより、染色体に組込まれる（例えば、
Struhlら、（1976）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 73:1471−
1475を参照のこと）。同様に、非複製colE1レプリコン
を、宿主染色体と、プラスミドベクターが有する同種配
列との間の組換えによって、E.coliのpolA株のゲノムに
組込むこともまた可能である（GreenerおよびHill（198
0）J.Bacteriol.144:312−321）。
発明の開示 本発明は、染色体移入DNA（部位特異的組換え部位を
有する環状非自己複数DNA）を用いることによって、異
種遺伝子のコピーをE.coliのような宿主細胞の染色体に
挿入するための組成物および方法を提供する。宿主細胞
染色体は、第二の部位特異的組換え部位を含む。染色体
移入DNAが宿主細胞に導入される場合、インテグラーゼ
のような組込み酵素が発現すると、第二の組換え部位で
の染色体移入DNAの宿主細胞染色体への組込みが生じ
る。
有する環状非自己複数DNA）を用いることによって、異
種遺伝子のコピーをE.coliのような宿主細胞の染色体に
挿入するための組成物および方法を提供する。宿主細胞
染色体は、第二の部位特異的組換え部位を含む。染色体
移入DNAが宿主細胞に導入される場合、インテグラーゼ
のような組込み酵素が発現すると、第二の組換え部位で
の染色体移入DNAの宿主細胞染色体への組込みが生じ
る。
本発明は、従って、以下を含む染色体移入系を提供す
る： 宿主細胞内で機能するプロモーターに作動可能に連結
した問題の遺伝子、選択マーカー、および第一の組換え
部位を含み、複製起点を欠く染色体移入DNA;および 染色体を含む宿主細胞であって、好ましくはE.coliの
ような細菌細胞であり、この染色体が、第二の組換え部
位、および第一および第二の組換え部位の部位特異的組
換えを触媒し得る酵素をコードするDNA配列を含む、宿
主細胞； これにより、染色体移入DNAの宿主細胞への導入およ
び酵素の発現は、染色体移入DNAの第二の組換え部位で
の宿主細胞の染色体への組込みを生じ； そしてこれにより、問題の遺伝子は、多コピー数ベク
ター内では機能的プロモーターに作動可能に連結しな
い。
る： 宿主細胞内で機能するプロモーターに作動可能に連結
した問題の遺伝子、選択マーカー、および第一の組換え
部位を含み、複製起点を欠く染色体移入DNA;および 染色体を含む宿主細胞であって、好ましくはE.coliの
ような細菌細胞であり、この染色体が、第二の組換え部
位、および第一および第二の組換え部位の部位特異的組
換えを触媒し得る酵素をコードするDNA配列を含む、宿
主細胞； これにより、染色体移入DNAの宿主細胞への導入およ
び酵素の発現は、染色体移入DNAの第二の組換え部位で
の宿主細胞の染色体への組込みを生じ； そしてこれにより、問題の遺伝子は、多コピー数ベク
ター内では機能的プロモーターに作動可能に連結しな
い。
染色体移入DNAの第一の組換え部位は、好ましくは、a
tt Pまたはatt Bであり、第二の組換え部位は、好まし
くは、att Pまたはatt Bであり、そして酵素は好ましく
はインテグラーゼである。
tt Pまたはatt Bであり、第二の組換え部位は、好まし
くは、att Pまたはatt Bであり、そして酵素は好ましく
はインテグラーゼである。
本発明はまた、宿主細胞内で複製し得る第一および第
二のプラスミドベクターを含む染色体移入DNAを構築す
るのに有用な１組のベクターを提供する、 第一のプラスミドベクターは、第一の複製起点、およ
び作動可能に連結したプロモーターを欠いた問題の外来
遺伝子を含み； 第二のプラスミドベクターは、第二の複製起点および
プロモーターを含む； ここで、複製起点およびプロモーターは宿主細胞内で
機能し、そして上記第一のプラスミドまたは上記第二の
プラスミドのいずれかは組換え部位を含み；そして これにより、第一および第二のベクターの各々由来の
制限フラグメントの連結は、染色体移入DNAを生成す
る。
二のプラスミドベクターを含む染色体移入DNAを構築す
るのに有用な１組のベクターを提供する、 第一のプラスミドベクターは、第一の複製起点、およ
び作動可能に連結したプロモーターを欠いた問題の外来
遺伝子を含み； 第二のプラスミドベクターは、第二の複製起点および
プロモーターを含む； ここで、複製起点およびプロモーターは宿主細胞内で
機能し、そして上記第一のプラスミドまたは上記第二の
プラスミドのいずれかは組換え部位を含み；そして これにより、第一および第二のベクターの各々由来の
制限フラグメントの連結は、染色体移入DNAを生成す
る。
このような染色体移入DNAを用いる宿主細胞の染色体
に問題の遺伝子を導入する方法もまた提供される。この
ような方法は以下の工程を包含する： 問題の遺伝子、選択マーカー、および第一の組換え部
位を含み、そして複製起点を欠いた染色体移入DNAを、
宿主細胞に移入する工程であって、この宿主細胞は染色
体を含み、この染色体は、第二の複製部位、および第一
および第二の組換え部位の部位特異的組換えを触媒し得
る酵素をコードするDNA配列を含む、工程； 酵素を発現する工程であって、これにより染色体移入DN
Aが第二の組換え部位で宿主細胞の染色体に組込まれ
る、工程；および 組込まれた染色体移入DNAを有する宿主細胞を選択す
る、工程； これにより、問題の遺伝子は、多コピー数ベクター内
では機能的プロモーターに作動可能に連結しない。
に問題の遺伝子を導入する方法もまた提供される。この
ような方法は以下の工程を包含する： 問題の遺伝子、選択マーカー、および第一の組換え部
位を含み、そして複製起点を欠いた染色体移入DNAを、
宿主細胞に移入する工程であって、この宿主細胞は染色
体を含み、この染色体は、第二の複製部位、および第一
および第二の組換え部位の部位特異的組換えを触媒し得
る酵素をコードするDNA配列を含む、工程； 酵素を発現する工程であって、これにより染色体移入DN
Aが第二の組換え部位で宿主細胞の染色体に組込まれ
る、工程；および 組込まれた染色体移入DNAを有する宿主細胞を選択す
る、工程； これにより、問題の遺伝子は、多コピー数ベクター内
では機能的プロモーターに作動可能に連結しない。
このような方法は、第一および第二のプラスミドベク
ターの各々由来の制限フラグメントを連結し、これによ
り染色体移入DNAを生成する工程をさらに包含し得る。
ターの各々由来の制限フラグメントを連結し、これによ
り染色体移入DNAを生成する工程をさらに包含し得る。
図面の簡単な説明 図１は、染色体移入DNA（すなわち、複製起点を欠き
（従って自己複製できない）、かつ外来遺伝子の細菌染
色体への組込みに適するDNA環）のインビトロ形成の工
程を示している。染色体移入DNAが形成されるまで、発
現される外来遺伝子（ここでは、IGF−１融合遺伝子）
は、機能的細菌プロモーター（ここでは、T7プロモータ
ー）から分離されている。
（従って自己複製できない）、かつ外来遺伝子の細菌染
色体への組込みに適するDNA環）のインビトロ形成の工
程を示している。染色体移入DNAが形成されるまで、発
現される外来遺伝子（ここでは、IGF−１融合遺伝子）
は、機能的細菌プロモーター（ここでは、T7プロモータ
ー）から分離されている。
図２は、２つのDNAフラグメントの連結から形成され
る染色体移入DNAを示す。同時係属米国特許出願第08/10
0,744号（1993年８月２日出願）に記載されるように、
フラグメントの１つは、E.coli DsbA、酵母ユビキチン
（Metで開始する）、およびヒトインシュリン様増殖因
子Ｉをコードする配列を含む融合遺伝子（［dsbA−ubi
−IGF」）（Metで開始しない）を含む。他のDNAフラグ
メントはT7プロモーターを含む。染色体移入DNAおよび
細菌染色体の両方は、ファージλ由来の組換え部位att
Pを含む。染色体移入DNAは、E.coli株B1384に形質転換
され、これは、インテグラーゼ（INT）をtrpプロモータ
ー（Ｐ−trp）の制御下におく。インテグラーゼは、染
色体移入DNAの細菌染色体へのatt部位における部位特異
的組込みを触媒する。trpプロモーターは、1mMのインド
ールアクリル酸（IAA）を培地に添加することによっ
て、形質転換の際に誘導され得る。組込まれた染色体移
入DNA配列を有する細胞は、クロラムフェニコールに耐
性である（CAM−ｒ、10μg/ml）。
る染色体移入DNAを示す。同時係属米国特許出願第08/10
0,744号（1993年８月２日出願）に記載されるように、
フラグメントの１つは、E.coli DsbA、酵母ユビキチン
（Metで開始する）、およびヒトインシュリン様増殖因
子Ｉをコードする配列を含む融合遺伝子（［dsbA−ubi
−IGF」）（Metで開始しない）を含む。他のDNAフラグ
メントはT7プロモーターを含む。染色体移入DNAおよび
細菌染色体の両方は、ファージλ由来の組換え部位att
Pを含む。染色体移入DNAは、E.coli株B1384に形質転換
され、これは、インテグラーゼ（INT）をtrpプロモータ
ー（Ｐ−trp）の制御下におく。インテグラーゼは、染
色体移入DNAの細菌染色体へのatt部位における部位特異
的組込みを触媒する。trpプロモーターは、1mMのインド
ールアクリル酸（IAA）を培地に添加することによっ
て、形質転換の際に誘導され得る。組込まれた染色体移
入DNA配列を有する細胞は、クロラムフェニコールに耐
性である（CAM−ｒ、10μg/ml）。
図３は、図２に記載されるプロセスから生じたB1384
染色体組込み体を示す。組込みは、宿主染色体DNAを種
々のプライマーの組（例えば、UBUF×IGFR、1243×T7RE
V、またはTRPPE×1239）を用いたPCRにより増幅し、増
幅したフラグメントを適切な制限酵素（例えば、それぞ
れ、Sac II、Hinc II、またはBamH I）で消化し、そし
て生成物をゲル電気泳動によりサイズ測定することによ
って達成され得る。
染色体組込み体を示す。組込みは、宿主染色体DNAを種
々のプライマーの組（例えば、UBUF×IGFR、1243×T7RE
V、またはTRPPE×1239）を用いたPCRにより増幅し、増
幅したフラグメントを適切な制限酵素（例えば、それぞ
れ、Sac II、Hinc II、またはBamH I）で消化し、そし
て生成物をゲル電気泳動によりサイズ測定することによ
って達成され得る。
図４は、クロラムフェニコール耐性W3110DE3形質導入
体の全細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。タンパ
ク質のサイズマーカー（一番左のレーン）およびIGF融
合タンパク質（コントロール）もまた含まれる。
体の全細胞溶解物のウェスタンブロットを示す。タンパ
ク質のサイズマーカー（一番左のレーン）およびIGF融
合タンパク質（コントロール）もまた含まれる。
図５は、アナマイシン耐性形質導入体の全細胞溶解物
のウェスタンブロットを示す。
のウェスタンブロットを示す。
図６〜９は、染色体移入DNAのプラスミド系統を示
す。
す。
発明を実施するための態様 本発明は、異種遺伝子のコピーを宿主細胞（例えば、
E.coli）の染色体に簡単、有効かつ確実に挿入するため
に使用され得る「染色体移入DNA」を用いる。染色体移
入DNAは、問題の遺伝子、選択マーカー（例えば、抗生
物質耐性遺伝子）、および組換え部位（例えば、λ att
Pまたはatt B）を含み、かつ複製起点または自律複製
配列（ARS）を欠く、環状のDNAである。従って、染色体
移入DNAは、宿主細胞に導入された場合、独自に複製す
ることができない。
E.coli）の染色体に簡単、有効かつ確実に挿入するため
に使用され得る「染色体移入DNA」を用いる。染色体移
入DNAは、問題の遺伝子、選択マーカー（例えば、抗生
物質耐性遺伝子）、および組換え部位（例えば、λ att
Pまたはatt B）を含み、かつ複製起点または自律複製
配列（ARS）を欠く、環状のDNAである。従って、染色体
移入DNAは、宿主細胞に導入された場合、独自に複製す
ることができない。
第二の同様の組換え部位（例えば、他のatt Pまたはa
tt B部位）を含む染色体を有する宿主細胞に染色体移入
DNAが導入される場合、組換え部位の部位特異的組換え
を触媒し得る酵素（例えば、インテグラーゼ）が宿主細
胞において発現すると、組換え部位における宿主細胞染
色体へのベクターの組込みが生じる。この部位特異的組
換えのプロセスは、同種ベクターおよび宿主染色体配列
について作動する一般の組換え系よりもはるかに効率的
であり、そして特にインテグラーゼの合成が制御され得
る場合には、大きな安定性を有する組込み配列が得られ
る。インテグラーゼはまた、染色体移入DNAが導入され
たときに宿主細胞内に一時的または安定的に存在するプ
ラスミドまたは他のDNA分子により提供され得る。
tt B部位）を含む染色体を有する宿主細胞に染色体移入
DNAが導入される場合、組換え部位の部位特異的組換え
を触媒し得る酵素（例えば、インテグラーゼ）が宿主細
胞において発現すると、組換え部位における宿主細胞染
色体へのベクターの組込みが生じる。この部位特異的組
換えのプロセスは、同種ベクターおよび宿主染色体配列
について作動する一般の組換え系よりもはるかに効率的
であり、そして特にインテグラーゼの合成が制御され得
る場合には、大きな安定性を有する組込み配列が得られ
る。インテグラーゼはまた、染色体移入DNAが導入され
たときに宿主細胞内に一時的または安定的に存在するプ
ラスミドまたは他のDNA分子により提供され得る。
このアプローチの重要な特徴は、問題の遺伝子が多コ
ピーベクター上では機能的プロモーターに作動可能に連
結しないことである。外来遺伝子が低コピー数で細胞内
に安全に存在するまで、機能的プロモーターを問題の遺
伝子から分離しておくことによって、遺伝子産物の潜在
的毒性または致死性の効果が最小化され得る。
ピーベクター上では機能的プロモーターに作動可能に連
結しないことである。外来遺伝子が低コピー数で細胞内
に安全に存在するまで、機能的プロモーターを問題の遺
伝子から分離しておくことによって、遺伝子産物の潜在
的毒性または致死性の効果が最小化され得る。
あるいは、毒性のより低い遺伝子産物の高レベルでの
発現は、複数の組込みまたは組込まれた遺伝子の増幅に
よって達成され得る。
発現は、複数の組込みまたは組込まれた遺伝子の増幅に
よって達成され得る。
染色体移入DNAの細胞あたり１〜３コピーでのE.coli
染色体への導入、および染色体移入DNAが有する外来遺
伝子（IGF−Ｉ融合タンパク質）の発現が、以下の実施
例に記載される。
染色体への導入、および染色体移入DNAが有する外来遺
伝子（IGF−Ｉ融合タンパク質）の発現が、以下の実施
例に記載される。
組換えDNAの方法および試薬 請求された発明の実施に有用な核酸操作の一般的技術
は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、第２版、第１〜３巻、Sambrookら編、Cold Spring H
arbor Laboratory Press（1989）；またはCurrent Prot
ocols in Molecular Biology、F.Ausubelら編、Greene
Publishing and Wiley−Interscience:New York、1987
年および定期最新版、に一般に記載される。制限酵素、
T7 RNAポリメラーゼ、DNAリガーゼなどの核酸操作に有
用な試薬は、New England BioLabs、Boehringer Mannhe
im、Amersham、Promega Biotec、U.S.Biochemicals、お
よびNew England Nuclearのような販売者から市販され
ている。
は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l、第２版、第１〜３巻、Sambrookら編、Cold Spring H
arbor Laboratory Press（1989）；またはCurrent Prot
ocols in Molecular Biology、F.Ausubelら編、Greene
Publishing and Wiley−Interscience:New York、1987
年および定期最新版、に一般に記載される。制限酵素、
T7 RNAポリメラーゼ、DNAリガーゼなどの核酸操作に有
用な試薬は、New England BioLabs、Boehringer Mannhe
im、Amersham、Promega Biotec、U.S.Biochemicals、お
よびNew England Nuclearのような販売者から市販され
ている。
定義 「外来」または「異種」；「本来」または「同種」
「外来」または「異種」のポリペプチドは、特定の種の
宿主細胞内に通常見出されないポリペプチドである。こ
のようなポリペプチドをコードする核酸はまた、「外
来」または「異種」と称される。例えば、インシュリン
様成長因子（IGF）は、哺乳類のポリペプチドであり、
哺乳類細胞に対しては在来であるが、E.coliに対しては
外来または異種である。対照的に、「本来」または「同
種」のポリペプチドまたはDNA配列は、宿主細胞内に通
常見出される。例えば遺伝子の転写または翻訳に作用す
るプロモーターまたは他の配列もまた、それが宿主細胞
内で機能しているならば、「同種」であると考えられ
る。例えば、T7プロモーターはE.coli宿主細胞に対して
「同種」であると考えられる。なぜなら、T7 RNAポリメ
ラーゼが細胞内に存在すれば、T7プロモーターは、それ
が作動可能に連結しているプロペプチドコード配列の転
写を駆動し得るからである。
「外来」または「異種」のポリペプチドは、特定の種の
宿主細胞内に通常見出されないポリペプチドである。こ
のようなポリペプチドをコードする核酸はまた、「外
来」または「異種」と称される。例えば、インシュリン
様成長因子（IGF）は、哺乳類のポリペプチドであり、
哺乳類細胞に対しては在来であるが、E.coliに対しては
外来または異種である。対照的に、「本来」または「同
種」のポリペプチドまたはDNA配列は、宿主細胞内に通
常見出される。例えば遺伝子の転写または翻訳に作用す
るプロモーターまたは他の配列もまた、それが宿主細胞
内で機能しているならば、「同種」であると考えられ
る。例えば、T7プロモーターはE.coli宿主細胞に対して
「同種」であると考えられる。なぜなら、T7 RNAポリメ
ラーゼが細胞内に存在すれば、T7プロモーターは、それ
が作動可能に連結しているプロペプチドコード配列の転
写を駆動し得るからである。
「コードする」 核酸は、それ本来の状態にあるか、ま
たは組換えDNA法により操作された場合、それが転写お
よび／または翻訳されてポリペプチドを生成し得るなら
ば、ポリペプチドを「コードする」といわれる。
たは組換えDNA法により操作された場合、それが転写お
よび／または翻訳されてポリペプチドを生成し得るなら
ば、ポリペプチドを「コードする」といわれる。
「作動可能に連結」 核酸配列は、それが他の核酸配列
と機能的関係に置かれる場合、作動可能に連結してい
る。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響
するならば、プロモーターはコード配列に作動可能に連
結している。一般に、作動可能に連結しているDNA配列
は連続的であり、必要な場合、同じリーディングフレー
ム内にある。
と機能的関係に置かれる場合、作動可能に連結してい
る。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響
するならば、プロモーターはコード配列に作動可能に連
結している。一般に、作動可能に連結しているDNA配列
は連続的であり、必要な場合、同じリーディングフレー
ム内にある。
「組換え」 「組換え」核酸は、２つのそうでなければ
分離している核酸配列のセグメントをインビトロまたは
化学合成により連結することによって作製されるもので
ある。
分離している核酸配列のセグメントをインビトロまたは
化学合成により連結することによって作製されるもので
ある。
プローブおよびプライマー 核酸のプローブおよびプライマーは単離された核酸で
あり、一般には１本鎖であり、そして特にプローブの場
合は、代表的には標識またはレポーター分子に接続して
いる。プローブは、例えば、組織または他のサンプル中
の、あるいはライブラリーのcDNAまたはゲノムクローン
中のハイブリダイズする核酸配列の存在を同定するため
に使用される。プライマーは、例えば、核酸配列の増幅
（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による）のた
めに使用される。プローブおよびプライマーの調製およ
び使用は、例えば、Sambrookら（1989）またはAusubel
ら（1987）に記載される。
あり、一般には１本鎖であり、そして特にプローブの場
合は、代表的には標識またはレポーター分子に接続して
いる。プローブは、例えば、組織または他のサンプル中
の、あるいはライブラリーのcDNAまたはゲノムクローン
中のハイブリダイズする核酸配列の存在を同定するため
に使用される。プライマーは、例えば、核酸配列の増幅
（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による）のた
めに使用される。プローブおよびプライマーの調製およ
び使用は、例えば、Sambrookら（1989）またはAusubel
ら（1987）に記載される。
核酸の化学合成 核酸、特に増幅プライマーのような短い核酸は、化学
合成によって生成され得、例えば、BeaucageおよびCarr
uthers（1981）Tetra.Letts.22:1859−1862に記載され
るホスホルアミダイト法によって、またはMatteucciら
（1981）J.Amer.Chem.Soc.103:3185に従ったトリエステ
ル法によって生成され得、そしてオリゴヌクレオチド自
動合成機で行われ得る。２本鎖フラグメントは、化学合
成の１本鎖生成物から得られ得、相補鎖を合成し、そし
て適切な条件下でその鎖と共にアニーリングするか、ま
たは適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを
用いてその相補鎖を付加するかのいずれかによって得ら
れ得る。
合成によって生成され得、例えば、BeaucageおよびCarr
uthers（1981）Tetra.Letts.22:1859−1862に記載され
るホスホルアミダイト法によって、またはMatteucciら
（1981）J.Amer.Chem.Soc.103:3185に従ったトリエステ
ル法によって生成され得、そしてオリゴヌクレオチド自
動合成機で行われ得る。２本鎖フラグメントは、化学合
成の１本鎖生成物から得られ得、相補鎖を合成し、そし
て適切な条件下でその鎖と共にアニーリングするか、ま
たは適切なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを
用いてその相補鎖を付加するかのいずれかによって得ら
れ得る。
染色体移入DNAおよびそれらの構築に使用されるプラス
ミドの特徴 染色体移入DNAは、選択マーカーをコードするDNAフラ
グメント、および所望の外来ポリペプチドをコードし、
転写および翻訳の開始調節配列および発現制御配列（プ
ロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情
報部位（例えば、リボソーム結合部位）、およびmRNA安
定化配列、ならびに任意の必要な分泌シグナル（適切な
場合に、タンパク質が、細胞膜へ交差および／または滞
在してその機能的トポロジーを達成するか、または細胞
から分泌されることを可能にする）を含み得る）と作動
可能に連結した配列を含む。
ミドの特徴 染色体移入DNAは、選択マーカーをコードするDNAフラ
グメント、および所望の外来ポリペプチドをコードし、
転写および翻訳の開始調節配列および発現制御配列（プ
ロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情
報部位（例えば、リボソーム結合部位）、およびmRNA安
定化配列、ならびに任意の必要な分泌シグナル（適切な
場合に、タンパク質が、細胞膜へ交差および／または滞
在してその機能的トポロジーを達成するか、または細胞
から分泌されることを可能にする）を含み得る）と作動
可能に連結した配列を含む。
染色体移入DNAの構築に使用されるプラスミドはま
た、代表的には、宿主により認識される複製系（複製起
点または自律複製配列（ARS）を含む）を包含する。
た、代表的には、宿主により認識される複製系（複製起
点または自律複製配列（ARS）を含む）を包含する。
染色体移入DNAは、当該分野に周知の標準的組換え技
術によって、そして例えば、Sambrookら（1989）または
Ausubelら（1987）に記載される技術によって、このよ
うなベクターから調製され得る。
術によって、そして例えば、Sambrookら（1989）または
Ausubelら（1987）に記載される技術によって、このよ
うなベクターから調製され得る。
効率的な転写および／または翻訳に必要な、適切なプ
ロモーターおよび他の配列が、宿主細胞内で機能するよ
うに選択される。細胞株と発現ベクターとの作業可能な
組み合わせの例は、Sambrookら（1989）またはAusubel
ら（1987）に記載される；例えば、Metzgerら（1988）N
ature 334:31−36もまた参照のこと。trp、lacおよびフ
ァージプロモーター（例えば、T7、T3、SP6）のような
プロモーター、tRNAプロモーターおよび解糖系酵素プロ
モーターは、原核性の宿主に有用である。有用な酵母プ
ロモーターは、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレ
ートキナーゼまたは他の解糖系酵素（例えば、エノラー
ゼまたはゲリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ）、マルトースおよびガラクトースの利用を
担う酵素、および他のもののプロモーター領域を含む。
例えば、Hitzemanら、EP 73,657Aを参照のこと。適切な
哺乳動物プロモーターは、SV40由来の初期および後期プ
ロモーター（Fiersら（1978）Nature 273:113）、また
はマウスモロニー白血病ウイルス、マウス乳癌ウイル
ス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスII、ウシパピロ
ーマウイルスまたはポリオーマウイルス由来のプロモー
ターを含む。さらに、構築物が増幅可能な遺伝子（例え
ば、DHFR）に連結され得ることにより、所望であれば、
遺伝子の複数コピーが作製され得る。適切な真核生物エ
ンハンサーおよび他の発現制御配列については、例え
ば、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression、Cold
Spring Harbor、Press:N.Y.、1983を参照のこと。
ロモーターおよび他の配列が、宿主細胞内で機能するよ
うに選択される。細胞株と発現ベクターとの作業可能な
組み合わせの例は、Sambrookら（1989）またはAusubel
ら（1987）に記載される；例えば、Metzgerら（1988）N
ature 334:31−36もまた参照のこと。trp、lacおよびフ
ァージプロモーター（例えば、T7、T3、SP6）のような
プロモーター、tRNAプロモーターおよび解糖系酵素プロ
モーターは、原核性の宿主に有用である。有用な酵母プ
ロモーターは、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレ
ートキナーゼまたは他の解糖系酵素（例えば、エノラー
ゼまたはゲリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ）、マルトースおよびガラクトースの利用を
担う酵素、および他のもののプロモーター領域を含む。
例えば、Hitzemanら、EP 73,657Aを参照のこと。適切な
哺乳動物プロモーターは、SV40由来の初期および後期プ
ロモーター（Fiersら（1978）Nature 273:113）、また
はマウスモロニー白血病ウイルス、マウス乳癌ウイル
ス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスII、ウシパピロ
ーマウイルスまたはポリオーマウイルス由来のプロモー
ターを含む。さらに、構築物が増幅可能な遺伝子（例え
ば、DHFR）に連結され得ることにより、所望であれば、
遺伝子の複数コピーが作製され得る。適切な真核生物エ
ンハンサーおよび他の発現制御配列については、例え
ば、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression、Cold
Spring Harbor、Press:N.Y.、1983を参照のこと。
外来遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、宿主の
染色体に組込まれたときに制御可能であることが好まし
い。
染色体に組込まれたときに制御可能であることが好まし
い。
染色体移入DNAおよびそれらの構築に使用されるプラ
スミドは、選択マーカー、染色体移入DNAまたはプラス
ミドで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要
なタンパク質をコードする遺伝子を含む。代表的な選択
マーカーは、（ａ）抗生物質または他の毒性物質（例え
ば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートな
ど）に対する耐性を与え；（ｂ）栄養要求性欠損を相補
し；または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素
を供給する（例えば、BacilliのＤ−アラニンラセマー
ゼをコードする遺伝子）。適正な選択マーカーの選択
は、宿主細胞に依存する。
スミドは、選択マーカー、染色体移入DNAまたはプラス
ミドで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要
なタンパク質をコードする遺伝子を含む。代表的な選択
マーカーは、（ａ）抗生物質または他の毒性物質（例え
ば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートな
ど）に対する耐性を与え；（ｂ）栄養要求性欠損を相補
し；または（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素
を供給する（例えば、BacilliのＤ−アラニンラセマー
ゼをコードする遺伝子）。適正な選択マーカーの選択
は、宿主細胞に依存する。
本発明の染色体移入DNAは、ファージλ att P部位の
ような部位特異的組換え部位を含む。酵素インテグラー
ゼを産生する細菌宿主株（例えば、E.coli B1384）に形
質転換されると、インテグラーゼは、染色体移入DNAのa
tt P部位を認識し、そして細菌宿主染色体のatt部位で
のその組換えを触媒し、染色体移入ベクターが細菌染色
体にatt部位で部位特異的に組込まれる（インテグラー
ゼは、２つのatt Pおよびatt B間で、または２つのatt
P部位間での組換えを触媒し得る）。組込まれたDNAを有
する細菌宿主細胞は、組込まれたDNAが有する選択マー
カーの発現に基づいて選択される。
ような部位特異的組換え部位を含む。酵素インテグラー
ゼを産生する細菌宿主株（例えば、E.coli B1384）に形
質転換されると、インテグラーゼは、染色体移入DNAのa
tt P部位を認識し、そして細菌宿主染色体のatt部位で
のその組換えを触媒し、染色体移入ベクターが細菌染色
体にatt部位で部位特異的に組込まれる（インテグラー
ゼは、２つのatt Pおよびatt B間で、または２つのatt
P部位間での組換えを触媒し得る）。組込まれたDNAを有
する細菌宿主細胞は、組込まれたDNAが有する選択マー
カーの発現に基づいて選択される。
従って、組込みの事象は、一般に、部位特異的組換え
を触媒し得るインテグラーゼのような酵素の発現、およ
び染色体移入DNAおよび細菌染色体の両方におけるこの
酵素により認識される部位の存在を含む。「インテグラ
ーゼ」または類似の酵素により特徴付けられる他の部位
特異的組換え系および「インテグラーゼ」により特異的
に認識される部位も同様に使用され得る。
を触媒し得るインテグラーゼのような酵素の発現、およ
び染色体移入DNAおよび細菌染色体の両方におけるこの
酵素により認識される部位の存在を含む。「インテグラ
ーゼ」または類似の酵素により特徴付けられる他の部位
特異的組換え系および「インテグラーゼ」により特異的
に認識される部位も同様に使用され得る。
宿主細胞の染色体に複数コピーで組込まれた外来遺伝
子の高レベルな発現もまた可能であり、これは例えば、
宿主細胞染色体に複数のatt部位を組入れ、そして複数
の染色体移入DNAを宿主細胞に導入することによって可
能である。あるいは、外来遺伝子は、例えば外来遺伝子
と共に組込みDNAが有するマーカー遺伝子の複製につい
て複数回選択することによって、増幅されて複数コピー
を生成し得る。
子の高レベルな発現もまた可能であり、これは例えば、
宿主細胞染色体に複数のatt部位を組入れ、そして複数
の染色体移入DNAを宿主細胞に導入することによって可
能である。あるいは、外来遺伝子は、例えば外来遺伝子
と共に組込みDNAが有するマーカー遺伝子の複製につい
て複数回選択することによって、増幅されて複数コピー
を生成し得る。
本発明の染色体移入系の重要な特徴は、外来遺伝子が
組込み前に発現しないことである；これは、染色体移入
DNAがインビトロで構築されるまでは、プロモーターに
作動可能に連結していない。染色体移入DNAは、２つま
たはそれ以上のDNA供給源から構築される。１つのDNA供
給源は外来遺伝子を含み、これはプロモーターを欠いて
いるために発現しない。第二のDNA供給源は、それが染
色体移入DNAにおいて作動可能に連結されるプロモータ
ーを含む。このアプローチは、染色体移入DNAを構築す
る際のDNA供給源として高コピー数のプラスミドを使用
することを可能にする。低コピー数のプラスミドは、そ
れを用いて実験室内で作業することがより困難である。
例えば、DNA微量調製（minipreps）は、インビトロの操
作では不適切なDNAを生成し得る。
組込み前に発現しないことである；これは、染色体移入
DNAがインビトロで構築されるまでは、プロモーターに
作動可能に連結していない。染色体移入DNAは、２つま
たはそれ以上のDNA供給源から構築される。１つのDNA供
給源は外来遺伝子を含み、これはプロモーターを欠いて
いるために発現しない。第二のDNA供給源は、それが染
色体移入DNAにおいて作動可能に連結されるプロモータ
ーを含む。このアプローチは、染色体移入DNAを構築す
る際のDNA供給源として高コピー数のプラスミドを使用
することを可能にする。低コピー数のプラスミドは、そ
れを用いて実験室内で作業することがより困難である。
例えば、DNA微量調製（minipreps）は、インビトロの操
作では不適切なDNAを生成し得る。
宿主細胞へのDNA導入 宿主細胞に核酸を導入する種々の方法は、当該分野で
公知であり、エレクトロポレーション；塩化カルシウ
ム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAEデキスト
ラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；
マイクロプロジェクターボンバード（microprojectile
bombardment）；リポフェクション；および感染（ベク
ターが、レトロウイルスゲノムのような感染物である場
合）を含むが、これらに限定されない。一般的に、Samb
rookら、（1989）およびAusubelら、（1987）参照。
公知であり、エレクトロポレーション；塩化カルシウ
ム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、DEAEデキスト
ラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；
マイクロプロジェクターボンバード（microprojectile
bombardment）；リポフェクション；および感染（ベク
ターが、レトロウイルスゲノムのような感染物である場
合）を含むが、これらに限定されない。一般的に、Samb
rookら、（1989）およびAusubelら、（1987）参照。
宿主細胞 本発明の方法は、好ましくは原核生物の宿主細胞で用
いられるが、それらは、真核生物宿主細胞にも適用され
得る。原核生物宿主の中で、Escherichia coliが、好ま
しいが、他の原核生物、Bacillus subtilisまたはPseud
omonasもまた用いられ得る。
いられるが、それらは、真核生物宿主細胞にも適用され
得る。原核生物宿主の中で、Escherichia coliが、好ま
しいが、他の原核生物、Bacillus subtilisまたはPseud
omonasもまた用いられ得る。
哺乳動物または他の真核生物宿主細胞、例えば、酵
母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、または鳥類の種もま
た用いられ得る。Tissue Culture、KruseおよびPatters
on編、Academic Press（1973）参照。有用な哺乳動物宿
主細胞株は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣（CHO）細胞、ならびにWI38、BHK、およびCOS
細胞株を含むが、これらに限定されない。
母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、または鳥類の種もま
た用いられ得る。Tissue Culture、KruseおよびPatters
on編、Academic Press（1973）参照。有用な哺乳動物宿
主細胞株は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣（CHO）細胞、ならびにWI38、BHK、およびCOS
細胞株を含むが、これらに限定されない。
本発明は、以下の実施例の言及によりさらに良く理解
され、この実施例は、本発明の実施のために新たに分か
った最も良い様式の例示を意図しているに過ぎない。従
って、本発明の範囲は、それに限定されると考えるべき
でない。
され、この実施例は、本発明の実施のために新たに分か
った最も良い様式の例示を意図しているに過ぎない。従
って、本発明の範囲は、それに限定されると考えるべき
でない。
実施例 外来遺伝子を含む染色体移入DNAのE.coli株B1384の染色
体への組込み 外来遺伝子を含む染色体移入DNAをE.coliの染色体に
組込む一般的なストラテジーを図１に略図的に示す。２
つのプラスミドを構築した:pDM25432は作動可能に連結
した細菌プロモーターを欠く問題の外来遺伝子（この例
では、IGF−Ｉ融合遺伝子）を含んでいた;pDM25423はT7
プロモーターを含んでいた。各々のこれらのベクターか
ら精製した制限フラグメントを連結することにより、複
製起点を欠くDNA環−−染色体移入DNA−−を生成した。
この染色体移入DNAは、クロラムフェニコールに耐性（C
AM−ｒ）をもたらす抗生物質耐性遺伝子およびファージ
λ由来の部位特異的組換え部位、att Pを含んでいた。
この染色体移入DNAをE.coli B1384のような細菌株に形
質転換し（Mascarenhasら、（1983）Virology 124:100
−108）（図２）、この際菌株は、酵母インテグラーゼ
（INT）をtrpプロモーターの制御下にし、trpプロモー
ターは、1mMインドールアクリル酸（IAA）を培地に添加
することにより、形質転換の間に誘導され得る。B1384
も、att Pをその染色体に含む。インテグラーゼは、染
色体移入DNAおよびB1384の染色体のatt Pを認識し、そ
れらの組換えを触媒し、細菌染色体へのatt P部位での
染色体移入DNAの部位特異的組込みを導く（Weisberg
ら、（1977）Comprehensive Virology,8巻、Fraenckel
−ConratおよびWagner編、Pleum:New York、pp.197−25
8。組み込まれたDNAを有する細菌宿主細胞は、クロラム
フェニコールに対するそれらの耐性に基づき選択され
る。
体への組込み 外来遺伝子を含む染色体移入DNAをE.coliの染色体に
組込む一般的なストラテジーを図１に略図的に示す。２
つのプラスミドを構築した:pDM25432は作動可能に連結
した細菌プロモーターを欠く問題の外来遺伝子（この例
では、IGF−Ｉ融合遺伝子）を含んでいた;pDM25423はT7
プロモーターを含んでいた。各々のこれらのベクターか
ら精製した制限フラグメントを連結することにより、複
製起点を欠くDNA環−−染色体移入DNA−−を生成した。
この染色体移入DNAは、クロラムフェニコールに耐性（C
AM−ｒ）をもたらす抗生物質耐性遺伝子およびファージ
λ由来の部位特異的組換え部位、att Pを含んでいた。
この染色体移入DNAをE.coli B1384のような細菌株に形
質転換し（Mascarenhasら、（1983）Virology 124:100
−108）（図２）、この際菌株は、酵母インテグラーゼ
（INT）をtrpプロモーターの制御下にし、trpプロモー
ターは、1mMインドールアクリル酸（IAA）を培地に添加
することにより、形質転換の間に誘導され得る。B1384
も、att Pをその染色体に含む。インテグラーゼは、染
色体移入DNAおよびB1384の染色体のatt Pを認識し、そ
れらの組換えを触媒し、細菌染色体へのatt P部位での
染色体移入DNAの部位特異的組込みを導く（Weisberg
ら、（1977）Comprehensive Virology,8巻、Fraenckel
−ConratおよびWagner編、Pleum:New York、pp.197−25
8。組み込まれたDNAを有する細菌宿主細胞は、クロラム
フェニコールに対するそれらの耐性に基づき選択され
る。
クロラムフェニコール耐性染色体組込み体を図３に要
約するとおり試験した。組み込まれた染色体移入DNAの
存在を、以下のプライマーの組を用いるPCRで宿主染色
体DNAを増幅することにより確認した（例えば、UBUF×I
GFR、1243×T7REV、またはTRPPF×1239）。
約するとおり試験した。組み込まれた染色体移入DNAの
存在を、以下のプライマーの組を用いるPCRで宿主染色
体DNAを増幅することにより確認した（例えば、UBUF×I
GFR、1243×T7REV、またはTRPPF×1239）。
増幅したフラグメントを、適切な制限酵素（それぞ
れ、Sac II,Hinc II,またはBamH I）で切断した。生成
物をアガロースゲル電気泳動によりサイズ測定した。組
み込まれた配列の存在を、以下の増幅により示した： ・染色体ユビキチンおよびIGF配列、関連した外来遺伝
子の存在を示す； ・染色体tetおよびT7配列、T7プロモーターおよび融合
遺伝子の並列（juxtaposition）を示す；および ・近接染色体trpおよびtet配列、予測位置における染色
体移入DNAの挿入を示す。
れ、Sac II,Hinc II,またはBamH I）で切断した。生成
物をアガロースゲル電気泳動によりサイズ測定した。組
み込まれた配列の存在を、以下の増幅により示した： ・染色体ユビキチンおよびIGF配列、関連した外来遺伝
子の存在を示す； ・染色体tetおよびT7配列、T7プロモーターおよび融合
遺伝子の並列（juxtaposition）を示す；および ・近接染色体trpおよびtet配列、予測位置における染色
体移入DNAの挿入を示す。
染色体移入DNAの染色体組込みはまた、以下の証拠によ
り確認される： ・細菌宿主のクロムフェニコールに対する耐性； ・DNA微量調製でプラスミドDNAがないこと； ・β−ラクタマーゼ酵素活性を欠くこと、親プラスミド
の非存在を確認する（SchindlerおよびHuber（1980）En
zyme Inhibitors,Brodbeck,V.編、Verlag Chemie,pp.16
9−176に記載のとおり、β−ラクタマーゼを、色素原基
質、７−チエニル−２−アセトアミド−３−２−4 n,n
−ジメチルアミノフェニルアゾ−ピリジニウムメチル−
３−セフェム−４−カルボン酸（PADAC）を用いてアッ
セイした）；および ・分離分析：単離物を、1mM IAAを含むまたは含まない
Ｌブロース中で37℃で一夜培養し、LB寒天プレートにプ
レートした。各培養物由来の単一コロニーをクロラムフ
ェニコール耐性の維持について試験した。100％維持をI
AAを含まない培養物から認めた;11％維持をIAAを含む培
養物において認めた。
り確認される： ・細菌宿主のクロムフェニコールに対する耐性； ・DNA微量調製でプラスミドDNAがないこと； ・β−ラクタマーゼ酵素活性を欠くこと、親プラスミド
の非存在を確認する（SchindlerおよびHuber（1980）En
zyme Inhibitors,Brodbeck,V.編、Verlag Chemie,pp.16
9−176に記載のとおり、β−ラクタマーゼを、色素原基
質、７−チエニル−２−アセトアミド−３−２−4 n,n
−ジメチルアミノフェニルアゾ−ピリジニウムメチル−
３−セフェム−４−カルボン酸（PADAC）を用いてアッ
セイした）；および ・分離分析：単離物を、1mM IAAを含むまたは含まない
Ｌブロース中で37℃で一夜培養し、LB寒天プレートにプ
レートした。各培養物由来の単一コロニーをクロラムフ
ェニコール耐性の維持について試験した。100％維持をI
AAを含まない培養物から認めた;11％維持をIAAを含む培
養物において認めた。
試験した７つの単離物のうち６つが、予想した表現型
を示した。
を示した。
B1384は、T7 RNAポリメラーゼの遺伝子を含まない。
染色体構築物の発現を試験するために、組み込まれたDN
Aを有する６つの株の各々について、P1溶解物を調製
し、W3110DE3株をクロラムフェニコール耐性に形質導入
するために用いた。W3110DE3株は、lacプロモーターの
制御下のT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を有する。それはま
た、Gal+であり、B1384とは異なる。従って、形質導入
体を20μg/mlクロラムフェニコールを含むガラクトース
最小プレートで選択した。各形質導入実験（独立した供
与体）からの単一コロニーを精製し、さらに試験した。
染色体構築物の発現を試験するために、組み込まれたDN
Aを有する６つの株の各々について、P1溶解物を調製
し、W3110DE3株をクロラムフェニコール耐性に形質導入
するために用いた。W3110DE3株は、lacプロモーターの
制御下のT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を有する。それはま
た、Gal+であり、B1384とは異なる。従って、形質導入
体を20μg/mlクロラムフェニコールを含むガラクトース
最小プレートで選択した。各形質導入実験（独立した供
与体）からの単一コロニーを精製し、さらに試験した。
得られた結果は６つ全ての独立した場合で同一であっ
た：染色体移入DNAが高頻度で細菌染色体の新たな位
置、W3110DE3中のプロファージに近接するatt部位に移
された。これを以下によって確認した ・クロラムフェニコール耐性； ・DNA微量調製でプラスミドDNAがないこと； ・i21免疫性（DE3溶原体；ファージ溶解物を標準技術に
より細菌ローンにプレートした； ・Gal+（すなわち、ガラクトース最小プレート上での増
殖）； ・lac制御下でのIGFタンパク質の発現（および分析を、
1993年８月２日に出願された同時係属中米国特許出願第
08/101,506号の実施例１に記載のとおり行った。
た：染色体移入DNAが高頻度で細菌染色体の新たな位
置、W3110DE3中のプロファージに近接するatt部位に移
された。これを以下によって確認した ・クロラムフェニコール耐性； ・DNA微量調製でプラスミドDNAがないこと； ・i21免疫性（DE3溶原体；ファージ溶解物を標準技術に
より細菌ローンにプレートした； ・Gal+（すなわち、ガラクトース最小プレート上での増
殖）； ・lac制御下でのIGFタンパク質の発現（および分析を、
1993年８月２日に出願された同時係属中米国特許出願第
08/101,506号の実施例１に記載のとおり行った。
６つの株（「組込み体」）由来の染色体DNAをBgl II
およびNco Iで完全に切断し、切断したDNAのサザンブロ
ットを標識した0.6kb dsbA DNAプローブでプローブし、
このdsbA DNAプローブは、成熟DsbAをコードする全体の
遺伝子配列を含んでいる（Bardwellら、（1991）Cell 6
7:581−589;Kamitaniら、（1992）EBMO J.11:57−62も
参照）。６つの組込み体の各々は挿入物を含んでいた；
ブロットは、いくつかの二重の挿入物、１つの単一の挿
入物、および１つの（WB3−６単離物）見かけ上複製し
た二重の（すなわち、三重の）挿入物の存在を示した。
およびNco Iで完全に切断し、切断したDNAのサザンブロ
ットを標識した0.6kb dsbA DNAプローブでプローブし、
このdsbA DNAプローブは、成熟DsbAをコードする全体の
遺伝子配列を含んでいる（Bardwellら、（1991）Cell 6
7:581−589;Kamitaniら、（1992）EBMO J.11:57−62も
参照）。６つの組込み体の各々は挿入物を含んでいた；
ブロットは、いくつかの二重の挿入物、１つの単一の挿
入物、および１つの（WB3−６単離物）見かけ上複製し
た二重の（すなわち、三重の）挿入物の存在を示した。
６つの組込み体を、イソプロピルβ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）で誘導後のIGF融合タンパク質の発現
について試験した。細胞をIPTGで２時間誘導し、誘導さ
れた組込み体についての全細胞抽出物、ならびにサイズ
マーカーおよびIGF融合タンパク質コントロールを、12
％SDS−PAGEで分離し、ウエスタンブロットし、そして
ポリクローナル抗IGF血清と反応させた（1993年８月２
日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/101,506
号の実施例１を参照）（図４）。単離物WB3−６（図
４、レーン６）は、IGF融合タンパク質の最も高いレベ
ルの発現を示した。同じサイズの誘導されたバンドはま
た、クマシーブルー染色ゲルに見られた。
ラノシド（IPTG）で誘導後のIGF融合タンパク質の発現
について試験した。細胞をIPTGで２時間誘導し、誘導さ
れた組込み体についての全細胞抽出物、ならびにサイズ
マーカーおよびIGF融合タンパク質コントロールを、12
％SDS−PAGEで分離し、ウエスタンブロットし、そして
ポリクローナル抗IGF血清と反応させた（1993年８月２
日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/101,506
号の実施例１を参照）（図４）。単離物WB3−６（図
４、レーン６）は、IGF融合タンパク質の最も高いレベ
ルの発現を示した。同じサイズの誘導されたバンドはま
た、クマシーブルー染色ゲルに見られた。
異なるバイナリー（binary）系を用いて、カナマイシ
ン耐性マーカーを有する染色体移入DNAを生成した。用
いたプラスミド、pDM25424およびpDM25427を図に記載す
る。挿入物の配置および位置をPCRにより確認し、上記
の配置および位置と事実上同一であった結果を得た。W3
110DE3バックグラウンドへの形質導入後、ウエスタンブ
ロッティングにより容易に検出され得るレベルで、IGF
融合タンパク質を発現したいくつかの独立した単離物を
得た（図５）。用いた手順は、使用した抗生物質および
耐性遺伝子がクロラムフェニコールの代わりにカナマイ
シンであったことを除いて、クロラムフェニコール耐性
単離物についての上記の手順と同一であった。精製融合
タンパク質は、コントロールであった。レーン１および
２は、２つの形質導入された単離物由来の全細胞溶解物
を含む。
ン耐性マーカーを有する染色体移入DNAを生成した。用
いたプラスミド、pDM25424およびpDM25427を図に記載す
る。挿入物の配置および位置をPCRにより確認し、上記
の配置および位置と事実上同一であった結果を得た。W3
110DE3バックグラウンドへの形質導入後、ウエスタンブ
ロッティングにより容易に検出され得るレベルで、IGF
融合タンパク質を発現したいくつかの独立した単離物を
得た（図５）。用いた手順は、使用した抗生物質および
耐性遺伝子がクロラムフェニコールの代わりにカナマイ
シンであったことを除いて、クロラムフェニコール耐性
単離物についての上記の手順と同一であった。精製融合
タンパク質は、コントロールであった。レーン１および
２は、２つの形質導入された単離物由来の全細胞溶解物
を含む。
２つのバイナリー系で用いたベクターの構築を、図６
〜９に要約する。用いたプラスミドの供給源は、以下の
とおりであった:pBR322、pUC18、pUC19、pKK233−２、p
tRC99A、pCH110、およびpNEO（Pharmacia,Piscataway,N
J）;pLG339HLY（Dr.Barry Holland,Institute de Gｎ
tiques et Microbiologie,Universit Paris−Su
d）;pRcCMV（Invitrogen,San Diego,CA）;pACYC177およ
びpACYC184（New England Biolabs,Beverly,MA）;pET3b
（StudierおよびMoffat（1986）J.Mol.Biol.189:113−1
30）;pYZ22070（1993年８月２日に出願された同時係属
中の米国特許出願第08/100,744号の実施例１に記載）。
〜９に要約する。用いたプラスミドの供給源は、以下の
とおりであった:pBR322、pUC18、pUC19、pKK233−２、p
tRC99A、pCH110、およびpNEO（Pharmacia,Piscataway,N
J）;pLG339HLY（Dr.Barry Holland,Institute de Gｎ
tiques et Microbiologie,Universit Paris−Su
d）;pRcCMV（Invitrogen,San Diego,CA）;pACYC177およ
びpACYC184（New England Biolabs,Beverly,MA）;pET3b
（StudierおよびMoffat（1986）J.Mol.Biol.189:113−1
30）;pYZ22070（1993年８月２日に出願された同時係属
中の米国特許出願第08/100,744号の実施例１に記載）。
E.coli K−12 W3110株をB.Bachmann,ECGSC,Yale Univ
ersityから得た。それを、DE3欠陥ファージで、Studier
およびMoffat（1986）J.Mol.Biol.198:113−130に記載
のとおり溶原化した。W3110DE3は、このような溶原体の
１つであった。シクロフィリン遺伝子を、プライマーCY
CF1およびCYCR1を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
によりw3110から増幅した（上記を参照）。
ersityから得た。それを、DE3欠陥ファージで、Studier
およびMoffat（1986）J.Mol.Biol.198:113−130に記載
のとおり溶原化した。W3110DE3は、このような溶原体の
１つであった。シクロフィリン遺伝子を、プライマーCY
CF1およびCYCR1を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
によりw3110から増幅した（上記を参照）。
本明細書で引用した全ての特許および特許出願は、個
々の特許または特許出願が、参考として援用されること
を特定して個別に示される場合と同程度に、本明細書に
参考として援用される。
々の特許または特許出願が、参考として援用されること
を特定して個別に示される場合と同程度に、本明細書に
参考として援用される。
当業者が、上に記載の精神内にある本発明の等価物を
推測し得ることは明確である。これらの等価物は本発明
の範囲内に含まれる。
推測し得ることは明確である。これらの等価物は本発明
の範囲内に含まれる。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：セルトリックス ファーマシューティ
カルズ，インコーポレイテッド （ii）発明の名称：細菌細胞における異種遺伝子の染
色体発現 （iii）配列数:9 （iv）連絡住所： （Ａ）名称：モリソン アンド フォレスター （Ｂ）番地：ペイジ ミル ロード 755 （Ｃ）市：パロ アルト （Ｄ）州：カリフォルニア州 （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94304−1018 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用 （Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,
バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：新番号 （Ｂ）出願日：同封 （Ｃ）分類： （viii）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名： （Ｂ）登録番号:35,636 （Ｃ）照会／記録番号:2095−0281.40 （ix）電話回線情報： （Ａ）電話：（415）813−5600 （Ｂ）テレファックス：（415）494−0792 （Ｃ）テレックス:706141 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:36塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:23塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:47塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:48塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:39塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号9:
カルズ，インコーポレイテッド （ii）発明の名称：細菌細胞における異種遺伝子の染
色体発現 （iii）配列数:9 （iv）連絡住所： （Ａ）名称：モリソン アンド フォレスター （Ｂ）番地：ペイジ ミル ロード 755 （Ｃ）市：パロ アルト （Ｄ）州：カリフォルニア州 （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:94304−1018 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用 （Ｃ）OS:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃1.0,
バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：新番号 （Ｂ）出願日：同封 （Ｃ）分類： （viii）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名： （Ｂ）登録番号:35,636 （Ｃ）照会／記録番号:2095−0281.40 （ix）電話回線情報： （Ａ）電話：（415）813−5600 （Ｂ）テレファックス：（415）494−0792 （Ｃ）テレックス:706141 （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:36塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:23塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:47塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:20塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:48塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:32塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:39塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列：配列番号9:
フロントページの続き (72)発明者 オルソン， パメラ エス. アメリカ合衆国 カリフォルニア 95014， クペルティノ，バーンハート アベニュー 18630 (56)参考文献 Ｐｌａｓｍｉｄ，28［１］（1992) ｐ．14−24 Ｇｅｎｅ，107［１］（1991）ｐ．11 −17 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，124［１］（1983) ｐ．100−108 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】染色体移入系であって、以下を包含する： 宿主細胞で機能的なプロモーターに作動可能に連結した
問題の非細菌遺伝子、選択マーカー、および第一の部位
特異的組換え部位を含み、そして複製起点を欠く、染色
体移入DNA;ならびに 染色体を含む該宿主細胞であって、該染色体が、第二の
部位特異的組換え部位、およびプロモーター制御下の該
第一の組換え部位と該第二の組換え部位との部位特異的
組換えを触媒し得る酵素をコードするDNA配列、を含む
宿主細胞であって、該プロモーターがインデューサーの
存在下で形質転換の間に誘導され得る、宿主細胞； これにより、該染色体移入DNAの該宿主細胞への導入お
よび該酵素の発現は、該第二の部位特異的組換え部位で
の該宿主細胞の該染色体への該染色体移入DNAの組込み
を生じ； そしてこれにより、問題の該非細菌遺伝子が、多コピー
数ベクター内では機能的なプロモーターに作動可能に連
結しない、染色体移入系。 - 【請求項２】前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項１
に記載の染色体移入系。 - 【請求項３】前記細菌細胞が、E.coli細胞である、請求
項２に記載の染色体移入系。 - 【請求項４】前記第一の部位特異的組換え部位が、attP
またはattBであり、前記第二の部位特異的組換え部位
が、attPまたはattBであり、そして前記酵素がインテグ
ラーゼである、請求項１に記載の染色体移入DNA。 - 【請求項５】宿主細胞で複製可能な第一のプラスミドベ
クターおよび第二のプラスミドベクターを包含する１組
のベクターであって、 該第一のプラスミドベクターが第一の複製起点および作
動可能に連結したプロモーターを欠く問題の外来遺伝子
を含み； 該第二のプラスミドベクターが第二の複製起点およびプ
ロモーターを含み； ここで、該複製起点および該プロモーターが、該宿主細
胞で機能し、そしてここで、該第一のプラスミドまたは
該第二のプラスミドのいずれかが部位特異的組換え部位
を含み；そして ここで、該第一のプラスミドベクターが第一の制限フラ
グメントを含み、そして該第二のプラスミドベクターが
第二の制限フラグメントを含み； ここで、該第一の制限フラグメントが、該問題の外来遺
伝子を含み、そして該第二の制限フラグメントが該プロ
モーターを含み； ここで、該第一の制限フラグメントまたは該第二の制限
フラグメントのいずれかが、部位特異的組換え部位を含
み、そして該第一の制限フラグメントおよび該第二の制
限フラグメントのいずれもが複製起点を含まず； これにより、該第一の制限フラグメントと該第二の制限
フラグメントとの連結が、請求項１に記載の染色体移入
DNAを生成する、１組のベクター。 - 【請求項６】問題の非細菌遺伝子を宿主細胞の染色体に
導入する方法であって、以下の工程を含む： 請求項５に記載の第一のプラスミドベクターおよび第二
のプラスミドベクターを提供する工程； 該第一のプラスミドベクターおよび該第二のプラスミド
ベクターを消化して、該問題の非細菌遺伝子を含む前記
第一の制限フラグメント、および前記プロモーターを含
む前記第二の制限フラグメントを生成する工程であっ
て、ここで、該第一の制限フラグメントまたは該第二の
制限フラグメントのいずれかが第一の部位特異的組換え
部位を含み、そして該第一の制限フラグメントおよび該
第二の制限フラグメントのいずれもが複製起点を含まな
い、工程； 該第一の制限フラグメントと該第二の制限フラグメント
とを連結する工程であって、それにより、該問題の非細
菌遺伝子、選択マーカー、および該第一の部位特異的組
換え部位を含み、そして複製起点を欠く、染色体移入DN
Aを生産する工程； 該染色体移入DNAを宿主細胞に移入する工程であって、
該宿主細胞が染色体を含み、該染色体が、第二の部位特
異的組換え部位、ならびに該第一の組換え部位と該第二
の組換え部位との部位特異的組換えを触媒し得る酵素を
コードするDNA配列を含む、工程； 該酵素を発現する工程であって、これにより、該第二の
部位特異的組換え部位での該染色体移入DNAの該宿主細
胞の染色体への組込みを引き起こす、工程；および 組み込まれた染色体移入DNAを有する宿主細胞を選択す
る、工程； これにより、該問題の非細菌遺伝子が、多コピー数ベク
ター内では機能的なプロモーターに作動可能に連結しな
い、方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/170,588 | 1993-12-21 | ||
| US08/170,588 US5470727A (en) | 1993-12-21 | 1993-12-21 | Chromosomal expression of non-bacterial genes in bacterial cells |
| PCT/US1994/014834 WO1995017499A1 (en) | 1993-12-21 | 1994-12-21 | Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09505482A JPH09505482A (ja) | 1997-06-03 |
| JP3294276B2 true JP3294276B2 (ja) | 2002-06-24 |
Family
ID=22620477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51762095A Expired - Fee Related JP3294276B2 (ja) | 1993-12-21 | 1994-12-21 | 細菌細胞における異種遺伝子の染色体発現 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5470727A (ja) |
| EP (1) | EP0739411A4 (ja) |
| JP (1) | JP3294276B2 (ja) |
| AU (1) | AU695886B2 (ja) |
| CA (1) | CA2179656C (ja) |
| WO (1) | WO1995017499A1 (ja) |
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