KR20220106566A

KR20220106566A - Cas 단백질 및 HIF의 TAD 도메인을 포함하는 단백질 융합체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220106566A
Application number: KR1020210009631A
Authority: KR
Inventors: 우의전; 안연; 박광현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2022-07-29
Also published as: KR102491095B1

Abstract

본 발명은 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질; 및 HIF(Hypoxia-inducible factors)의 531 내지 826번째의 아미노산 도메인(TAD)을 포함하는 단백질 융합체, 상기 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 단백질 융합체를 포함하는 타겟 유전자 발현 조절용 조성물, 및 상기 단백질 융합체를 발현시키는 단계를 포함하는 타겟 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명은 HIF 도메인 중 저산소 조건에서 선택성이 가장 높은 도메인을 발굴하고, 이를 dCas9 단백질에 융합시킨 경우 저산소 조건에서 타겟 유전자의 발현이 현저히 증가하나, Cas9 단백질에 융합시킨 경우 저산소 조건에서 타겟 유전자가 선택적으로 분해됨을 확인한 바, 본 발명의 단백질 융합체는 저산소 상태에서 타겟 유전자의 과발현 또는 타겟 유전자의 분해를 선택적으로 유도하는 등 광범위한 바이오 의약 분야에 적용할 수 있다.

Description

Cas 단백질 및 HIF의 TAD 도메인을 포함하는 단백질 융합체 및 이의 용도 {Protein fusions comprising Cas protein and TAD domain of HIF and the uses thereof}

본 발명은 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질; 및 HIF(Hypoxia-inducible factors)의 531 내지 826번째의 아미노산 도메인(TAD)을 포함하는 단백질 융합체, 상기 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 단백질 융합체를 포함하는 타겟 유전자 발현 조절용 조성물, 및 상기 단백질 융합체를 발현시키는 단계를 포함하는 타겟 유전자 발현 조절 방법에 관한 것이다.

산소는 세포 대사 및 생화학적 에너지 기작의 주요 기질인 필수 분자이며, 에너지의 생성을 위하여 산소는 필수적인 바, 산소 분자의 결핍은 세포에 큰 스트레스를 유발한다. 유기체에 있어서 필요한 산소 공급이 불충분한 다양한 생리학 및 병리학적 상황을 저산소(hypoxia) 상태라고 지칭한다. 저산소는 조직 허혈(ischemia) 및 염증과 주로 관련이 있으며, 종양의 성장 및 나쁜 예후에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Mol Cell Biol. 34: 3013-3023, 2014). 저산소 환경에서는 세포가 정상적으로 에너지를 생성하지 못하기 때문에, 산소의 이용률을 높이기 위한 여러 반응이 세포에서 일어나게 되며, 이러한 반응 중 가장 기본적인 것은 HIF-1α에 의한 전사 작용이다. 저산소 유도인자(Hypoxia-inducible factors, HIF)는 전사 인자로서, HIF의 타겟 유전자는 에너지 대사 조절, 혈관 생성, 세포 이동 및 세포 생존에 주로 관련되어 있다.

한편, 제3세대 유전자 가위라고 불리는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas 단백질은, RNA 가이드를 통한 유전자 교정 도구로, 박테리아 유도 엔도뉴클레아제인 Cas와 가이드 RNA(gRNA)를 사용하여 가이드 RNA와 게놈 DNA 사이의 서열을 매칭시켜, 게놈 내 특정 위치에 이중 (또는 단일) 가닥 브레이크를 도입할 수 있다. CRISPR/Cas 매개 유전자 녹아웃은 RNA 간섭 매개 유전자 녹다운(RNA interference-mediated gene knockdown) 보다 더 효율적인 것으로 예상되고, 유전자 기능을 연구하기 위한 유용한 실험 도구를 제공하고 있다. 그러나, 저산소 상태에서 선택적으로 세포 내 타겟 유전자의 발현을 조절하거나 편집할 수 있는 크리스퍼/Cas 단백질 시스템에 대해서는 연구된 바 없다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 산소 분압 상태를 감지할 수 있는 HIF 도메인 중 저산소 조건에서 선택성이 가장 높은 도메인을 발굴하고, 이를 dCas9 또는 Cas9 단백질에 융합시킨 경우 저산소 조건에서 타겟 유전자의 발현이 증가되거나 또는 분해됨을 확인한 바, 타겟 유전자의 발현 조절 용도로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질; 및 HIF(Hypoxia-inducible factors)의 531 내지 826번째의 아미노산 도메인(TAD)을 포함하는, 단백질 융합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 상기 단백질 융합체; (b) 상기 (a)의 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 상기 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 타겟 유전자 발현 조절용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단백질 융합체를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, 타겟 유전자 발현 조절 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질; 및 HIF(Hypoxia-inducible factors)의 531 내지 826번째의 아미노산 도메인(TAD)을 포함하는, 단백질 융합체를 제공한다.

본 발명의 "타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질"은 유전자가위로서, 특정 유전자 서열을 인식할 수 있는 가이드 RNA와의 융합을 통하여 핵산 분해 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 상기 상기 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질은 Cas 단백질 (CRISPR-associated protein), 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 또는 TALE (trans activator-like effector) 뉴클레아제일 수 있으며, 상기 단백질들은 공통적으로 DNA 이중나선의 절단을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 징크-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease, ZFN)는 징크 핑거 단백질을 3-5개 조합한 후 핵산 분해효소인 Fok1과 융합하여 만든 단백질이며, 상기 TALE (trans activator-like effector) 뉴클레아제는 식물 병원균인 잔토모나스(Xanthomonas) 유래 단백질인 TALE 모듈을 20여 개 조합하고 Fok1을 융합하여 만든 단백질이다. 그에 비해, CRISPR 기술은 미생물에 존재하는 후천적 면역시스템을 유전자 가위로 응용한 것이다.

본 발명의 "Cas(CRISPR-associated protein)"는 크리스퍼-결합 엔도뉴클레아제이며, cas 유전자에 의해 암호화되는 Cas 단백질이다. 적합한 RNA 성분과 복합체인 경우, Cas 단백질은 특정 DNA 표적 서열의 전부 또는 일부를 절단할 수 있다. Cas 단백질은 표적 서열에서 DNA 이중 가닥을 풀 수 있고, Cas와 복합체인 crRNA 또는 가이드 RNA(gRNA)에 의한 표적 서열의 인식에 의해 매개되는 바와 같이, 적어도 하나의 DNA 가닥을 절단한다. 따라서, 게놈 DNA 중 원하는 DNA 서열을 절단할 수 있다는 점에서, 질병 유전자의 발현 억제를 통한 유전자 치료제로서 활용 가능성을 나타내었다.

한편, CRISPR 시스템은 해당 기작에 관여하는 Cas 단백질의 종류가 여러 개(class 1)인지, 단일(class 2)인 지에 따라 2개의 클래스로 나뉘는데, 두 클래스는 다시 유전체 상 CRISPR-cas 위치(loci), 및 작용하는 Cas 단백질의 종류에 따라 여섯 가지 타입으로 세분화된다. 그 중, Cas9 단백질은 class 2의 타입 Ⅱ에 해당한다. 본 발명의 Cas 단백질은 야생형 Cas9, dCas9 (deactivated Cas9), 및 nCas9 (nickase Cas9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "dCas (deactivated Cas, 또는 dead Cas)" 단백질은 게놈의 특정 유전자를 표적으로 하면서도, 유전자 절단 활성만을 불활성화한 Cas 단백질이다. dCas 단백질은 특정 유전자 서열을 인식하여 결합할 수 있으며, 전사 조절 인자와 결합하여 특정 유전자의 전사를 증가시키거나 억제할 수 있다. 본 발명에서 dCas 단백질은 구체적으로는 dCas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "저산소"는 타겟 유전자가 발현될 수 있는 세포에 있어서, 필요한 산소의 공급이 불충분하거나 부족한 상태를 의미한다. 저산소 조건은 2,2'-bipyridyl 또는 CoCl₂로 유도될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "HIF(Hypoxia-inducible factor)"는 저산소 상태 또는 세포가 이용할 수 있는 산소가 감소하는 경우에 반응하는 전사인자이다. 저산소 상태에서 생존에 필수적인 HIF는 α와 β의 서브유닛(subunit)으로 구성되어 있으며, HIF-α는 정상의 산소 조건에서는 산소 감지 부위의 도메인에 있는 프롤린 잔기에 하이드록실기를 전달하는 효소(proyl hydroxylase, PHD)에 의해 하이드록실화가 되면, pVHL이 결합하여 폴리유비퀴틴화를 유도하고 그에 따라 단백질 분해경로에 따라 분해가 된다 (Cell 107: 43-54, 2001). 저산소 상태에서는 이 PHD가 활성을 상실하여 HIF-α의 프롤린 잔기를 하이드록실화하지 못하기에 분해되지 않고, HIF-α는 안정화되고 활성화된다.

본 발명의 상기 HIF는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 발명의 HIF에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 HIF도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

저산소 유도인자인 HIF는 Helix-loop-Helix(HLH) 도메인, PAS (Per-arnt-Sim) 도메인, 산소와 결합할 수 있는 산소 의존성 분해 도메인(ODD domain), N-말단 전사활성 도메인(N-TAD), 억제 도메인(inhibitory domain), C-말단 전사활성 도메인(C-TAD)으로 구성되어 있다.

본 발명에서 ODD 도메인은 HIF의 401 내지 826번째 아미노산 영역을 의미하며, TAD 도메인은 HIF의 531 내지 826번째 아미노산 영역을 의미하고, CTAD 도메인은 HIF의 786 내지 826번째 아미노산 영역을 의미한다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서는, 상기 HIF의 도메인 중 저산소 조건에서의 선택성이 가장 우수한 도메인을 선별하기 위하여, Gal4-ODD (401-826aa), Gal4-TAD (531-826aa), Gal4-CTAD (786-826aa)의 각기 다른 세 융합체를 제조하고, 루시퍼라아제의 유도 발현을 확인한 결과, 저산소와 일반 산소상태에서의 타겟 유전자 발현 차이가 Gal4-ODD는 약 3배 정도 증가하였으며, Gal4-TAD는 약 14배 정도 증가되었고, Gal4-CTAD에서는 변화가 없음을 확인하였다 (실시예 1). 이를 통해, HIF 도메인 중 ODD 및 TAD 도메인이 저산소 조건에서 선택성을 갖는 것을 확인하였으며, 특히, HIF의 도메인 중 TAD가 산소 유무에 따른 선택성이 가장 큰 것을 알 수 있었다.

본 발명의 "융합체"는 Cas 단백질과 HIF의 TAD 도메인이 결합하여 형성된 단백질 분자를 의미하며, 저산소 환경에서 타겟 유전자의 발현을 조절할 수 있어, 저산소 감지 스위치로 지칭할 수 있다. 본 발명의 단백질 융합체는 인위적으로 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 dCas9을 포함하는 단백질 융합체는 HIF의 401 내지 530번째 아미노산 도메인을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 이 경우, dCas9 단백질에 HIF의 ODD 도메인이 결합하여 형성된 단백질 분자를 의미한다. ODD 도메인을 포함하는 상기 융합체 역시 산소 유무에 따른 선택성을 확인한 바, 저산소 환경에서 타겟 유전자의 발현을 조절할 수 있다.

본 발명의 상기 dCas9을 포함하는 단백질 융합체는 유전자 발현 조절 인자인 VP64-p65-Rta(VPR)을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 "VPR"은 VP64, p65 및 Rta가 연결된 발현 유도 인자의 결합체로서, 타겟 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 상기 VPR은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 서열번호 3의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 3의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서, dCas9, TAD, VPR이 결합된 3종류의 융합 플라스미드를 제작하고, 저산소 조건과 일반 산소 조건에서 단백질의 발현량을 비교한 결과, 상기 3종류의 플라스미드는 모두 모두 일반 조건에서 단백질 발현이 감소되고, 저산소 조건에서 안정된 것을 확인한 바 (실시예 3), 저산소 감지 스위치로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 단백질 융합체는 dCas9-TAD-VPR 순으로 연결되어 있는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, dCas9, TAD, VPR의 결합 순서를 달리한 각 융합체의 저산소 조건에서 플라스미드에서의 단백질의 발현을 비교한 결과, dCas9-TAD-VPR 순서의 단백질 융합체가 가장 현저한 발현 증가 활성을 가짐을 확인하였다 (실시예 4).

본 발명의 dCas9을 포함하는 단백질 융합체는 저산소 환경에서 타겟 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 "타겟 유전자"는 단백질 융합체가 도입되어 발현 수준을 조절하고자 하는 목적 유전자를 의미한다. 본 발명의 "타겟 유전자"는 "표적 유전자"와 혼용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 타겟 유전자는 저산소 조건인지 여부에 따라 발현 조절이 이로운 유전자를 의미할 수 있고, 구체적으로, 악성 빈혈, 심근경색, 뇌졸중, 악성 종양 등의 저산소증과 연관된 질환의 예방 또는 치료를 위한 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서, Mammalian cell 내부에 있는 Genomic DNA 타겟 (IL1RN, NeuroD, HNF4)의 저산소 조건에서의 유도 발현을 확인한 결과, 저산소 조건에서 일반 조건에 비해 IL1RN의 경우 약 10배, NeuroD는 약 7배, HNF4는 약 2배 가량 mRNA 발현량이 증가된 것을 확인한 바 (실시예 5), 본 발명의 dCas9 단백질을 포함하는 단백질 융합체는 저산소 환경에서 타겟 유전자의 발현을 증가시키는 것임을 구체적으로 알 수 있었다.

본 발명의 야생형 Cas9을 포함하는 단백질 융합체는 저산소 환경에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 타겟 유전자는 EMX1, FANCF, WASI1, WASI2, VEGFA1, VEGP2, TAT, INIP, SNAIL로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로, INIP 또는 SNAIL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 야생형 Cas9을 포함하는 단백질 융합체는 야생형 Cas9-TAD 순으로 연결되어 있는 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 야생형 Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 개수 및 순서를 달리한 Cas9^wt, TAD-Cas9^wt, Cas9^wt-TAD, 및 TAD-Cas9^wt-TAD 각 융합체의 저산소 조건에서 luciferase 유도 발현을 확인한 결과, Cas9^wt-TAD 융합체의 경우에만 저산소 조건에서 일반 조건에 비해 단백질의 분해가 증가되어 luciferase의 발현이 일반 조건에 비해 감소됨을 확인하였다 (실시예 7). 또한, 야생형 Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 순서를 달리한 Cas9^wt, TAD-Cas9^wt, 및 Cas9^wt-TAD 각 융합체의 일반 조건 및 저산소 조건에서 타겟 유전자(INIP)에 대한 유전자 분해 활성을 비교한 결과, Cas9^wt-TAD 융합체의 경우에만 저산소 조건에서 일반 조건에 비해 타겟 유전자를 더 많이 분해함을 확인하였다 (실시예 9). 따라서, Cas9-TAD 순의 단백질 융합체가 가장 현저한 타겟 유전자 분해 활성을 가지는 것을 알 수 있었다. 또한, 타겟 유전자를 SNAIL로 변경하여 동일한 실험을 진행한 경우에도, 마찬가지로 Cas9-TAD 순의 단백질 융합체가 가장 현저한 타겟 유전자 분해 활성을 가지는 결과를 확인할 수 있었다 (실시예 10).

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 "단백질 융합체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명의 단백질 융합체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Angew Chem IntEd Engl. 37: 73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.

본 발명의 "벡터"는 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 상기 단백질 융합체; (b) 상기 (a)의 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) 상기 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 타겟 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "단백질 융합체", "폴리뉴클레오티드","벡터", 및 "타겟 유전자"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명의 "발현 조절"은 타겟 유전자의 발현을 증가시키거나, 억제시키는 것을 의미하며, 구체적으로, 세포 환경의 산소 농도에 따라 타겟 유전자의 발현 수준을 변화시키는 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 단백질 융합체를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는 타겟 유전자 발현 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 "단백질 융합체", "타겟 유전자", "저산소" 및 "발현 조절"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 세포는 동물의 세포 또는 분리된 세포일 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 단백질 융합체는 산소 농도에 따라 타겟 유전자의 발현 수준을 조절할 수 있다. 특히, dCas9 융합체일 경우, 저산소 조건에서 타겟 유전자의 발현을 증가시키고, Cas9 융합체일 경우, 저산소 조건에서 타겟 유전자의 발현을 억제시키므로, 목적에 따라 타겟 유전자의 발현 조절에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 타겟 유전자의 발현 조절 방법을 이용하여 특정 유전자의 발현 감소 또는 과발현을 원인으로 하는 질환의 치료에도 널리 적용될 수 있다. 특정 유전자의 발현 감소 또는 과발현을 원인으로 하는 질환은 당업계에 널리 알려져 있으며, 목적하는 질환에 따라 타겟 유전자를 적절히 선택할 수 있다.

본 발명은 HIF 도메인 중 저산소 조건에서 선택성이 가장 높은 도메인을 발굴하고, 이를 dCas9 단백질에 융합시킨 경우 저산소 조건에서 타겟 유전자의 발현이 현저히 증가하나, Cas9 단백질에 융합시킨 경우 저산소 조건에서 타겟 유전자가 선택적으로 분해됨을 확인한 바, 본 발명의 단백질 융합체는 저산소 상태에서 타겟 유전자의 과발현 또는 타겟 유전자의 분해를 선택적으로 유도하는 등 광범위한 바이오 의약 분야에 적용할 수 있다.

도 1은 세 종류의 HIF 도메인(ODD, TAD, CTAD)의 저산소 조건에서의 타겟 유전자 발현 활성을 비교한 도이다.
도 2는 TAD 도메인의 세포 내 작용을 확인한 도이다.
도 3은 정상 산소 조건 및 저산소 조건에서 dCas 단백질과 TAD 도메인이 결합된 융합체의 작용 기작을 나타낸 모식도이다.
도 4는 전사활성 dCas9 융합체를 제작하고, 각 융합체의 저산소 조건에서의 단백질 발현을 비교한 도이다.
도 5는 dCas9, TAD, 및 VPR의 결합 순서에 따른 플라스미드 내 단백질 발현을 비교한 도이다.
도 6은 dCas9, TAD, 및 VPR의 결합 순서에 따른 세포 유전자에서의 단백질 발현을 비교한 도이다.
도 7은 DNA 타겟(IL1RN, NeuroD, HNF4)의 저산소 조건에서의 유도 발현을 확인한 도이다.
도 8은 dCas9, TAD, 및 VPR의 결합 순서에 따른 유전자(IL1RN) 활성을 비교한 도이다.
도 9는 정상 산소 조건 및 저산소 조건에서 야생형 Cas9 단백질과 TAD 도메인이 결합된 융합체의 작용 기작을 나타낸 모식도이다.
도 10은 Cas9 융합체를 제작하고, 각 융합체의 저산소 조건에서의 단백질 분해 활성을 비교한 도이다.
도 11은 야생형 Cas9 및 TAD의 결합 유무 및 결합 개수에 따른 단백질 분해 정도를 비교한 도이다.
도 12는 Cas9 단백질의 질병과 관련된 다양한 유전자에 대한 유전자 절단 활성을 비교한 도이다.
도 13은 Cas9 융합체의 농도에 따른 타겟 유전자 분해 활성을 확인한 도이다.
도 14는 야생형 Cas9 및 TAD의 결합 유무 및 결합 개수에 따른 타겟 유전자 INIP의 분해 활성을 비교한 도이다.
도 15는 야생형 Cas9 및 TAD의 결합 유무 및 결합 개수에 따른 타겟 유전자 SNAIL의 분해 활성을 비교한 도이다.
도 16은 야생형 Cas9 및 TAD의 결합 유무 및 결합 개수에 따른 타겟 유전자 SNAIL의 분해 활성을 NGS sequencing으로 비교한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HIF 도메인 선별

HIF의 도메인 중 선택성이 가장 우수한 도메인을 선별하기 위하여, Gal4-ODD (401-826aa), Gal4-TAD (531-826aa), Gal4-CTAD (786-826aa)의 각기 다른 세 융합체를 제조하였다 (도 1a). Gal4-HIF의 제작 시, pCMV-G4 vector에 있는 EcoRI과 NotI restriction enzyme site를 이용하였다. AccuPower^® PCR PreMix kit를 이용하여 ODD, TAD, CTAD 세 종류의 linear DNA를 얻고, EZ-Fusion^TM Cloning core kit(Enzynomics)를 이용하여 cloning 하여 플라스미드를 제작하였다. Mammalian cell인 HEK293의 배양에서 10% FBS를 추가한 DMEM 배지를 이용하였으며, cell을 12시간 배양 후 Lipofectamine 2000 시약을 이용하여 Gal4-HIF plasmid 및 pRL-CMV plasmid를 트랜스펙션 하였다. Gal4를 이용하여 pGL4.21-Gal4-Luc plasmid에 있는 firefly luciferase의 유도 발현을 진행하였고, pRL-CMV에서 발현되는 Renilla luciferase를 이용하여 normalization를 진행하였다. 트랜스펙션 12시간 이후 저산소 조건을 형성할 수 있는 시약 2,2'-dipyridyl, 단백질 억제제 10uM MG132을 처리하고 약 16시간 배양하였다. 그 후, Dual-Luciferase^® Reporter Assay kit를 이용하여 Gal4 binding site를 함유한 pGL4.21-Gal4-Luc 플라스미드로 luciferase의 유도 발현을 확인하였다.

그 결과, 저산소(hypoxia)와 일반 산소(normoxia) 상태에서의 타겟 유전자 발현 차이가 Gal4-ODD는 약 3배 정도 증가하였으며, Gal4-TAD는 약 14배 정도 증가되었고, Gal4-CTAD에서는 변화가 없었다 (도 1b). 이를 통해, HIF의 도메인 중 TAD가 산소 유무에 따른 선택성이 가장 큰 것을 확인하여 이후 실험에 사용하였다.

아울러, Gal4-TAD가 저산소 조건에서 안정한지를 확인하기 위하여, 6-well plate에 1x10⁶ 양으로 cell을 분할, 12시간 배양 후 Lipofectamine 2000 시약을 이용하여 트랜스펙션을 진행하였다. 트랜스펙션 12시간 이후 저산소 조건을 형성할 수 있는 시약 2,2'-dipyridyl, 단백질 억제제 10uM MG132을 처리하고 약 16시간 동안 배양하였다. 1 x PBS buffer 2ml로 cell 표면을 wash한 후, lysis buffer로 cell을 분쇄하였다. 30분 동안 shaking 진행 후, cell lifter로 cell을 수득하여 e-tube에 옮기고 13000 rpm centrifuge를 통해 상층액을 얻었고, western blot를 이용하여 샘풀 분석을 진행하였다. 그 결과, Gal4-ODD와 Gal4-TAD에서 모두 정상 산소 조건에서 단백질 발현이 감소되고 저산소 조건에서 단백질이 안정한 것을 확인할 수 있었다 (도 1c).

실시예 2. TAD 도메인의 세포 내 작용 확인

선택된 TAD 도메인이 세포 내 genomic DNA에 있는 luciferase를 유도 발현할 수 있는지를 확인하기 위하여, Gal4 bing site를 함유한 pGL4.21-Gal4-Luc 플라스미드를 HEK293 세포에 삽입하여 새로운 cell line #12와 #14를 제작하였다. HEK293 cell에 pGL4.21-Gal4-Luc plasmid를 트랜스펙션 하고, 48시간 뒤 puromycin 1μg/ml을 처리하였다. 약 2주 뒤 콜로니가 형성되는 것을 확인하고, 24개의 콜로니를 분리하여 24 well plate에 옮겼다. 약 3주 뒤, 충분히 자란 cell line들을 이용하여 Dual luciferase assay를 통해 Gal4-Luc가 genomic DNA에 성공적으로 integration 되었는지 여부를 확인하였다. 총 24개의 cell line 중 12개를 먼저 확인하였는데, 96 well plate에 각 cell line을 8 X 10⁴개로 깔아주었다. 24시간 뒤 pCMV-G4 vector, pCMV-G4-NTAD, 그리고 pRL-CMV를 트랜스펙션 하였다. 24시간 뒤 ethanol(control) 또는 2,2'-bipyridyl 100μM을 각각 처리하고 추가로 16시간 배양 후, Dual-Luciferase^® Reporter Assay kit를 이용하여 luciferase 유도 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, TAD 도메인이 삽입된 cell line #12에서는, 저산소 조건(TAD NMX)에서 일반 산소 조건(TAD HPX1)에 비하여 단백질 발현이 약 20배 정도 증가하였다. TAD 도메인이 삽입된 cell line #14에서는, 저산소 조건(TAD NMX)에서 일반 산소 조건(TAD HPX1)에 비하여 단백질 발현이 약 24배 증가하였다. 즉, 저산소 조건에서 TAD 도메인이 세포 내 DNA의 luciferase의 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. 전사활성 dCas9 융합체의 제작

DNA에 특이적으로 결합할 수 있고, DNA 절단 기능을 없앤 Cas9 돌연변이체인 불활성화 Cas9(dCas9)을 이용하여 전사활성 dCas9-HIF 융합체를 제작하였다. 저산소 감지 HIF 도메인인 TAD는 일반 조건에서는 ubiquitination이 진행되어 단백질이 분해되지만, 저산소 조건에서는 단백질이 하이드록실화가 되지 못하여 분해되지 못하므로, 단백질이 안정화되어 특정 유전자를 활성화할 수 있다 (도 3). 이는 실시예 1 및 2에서 실험적으로 확인한 결과와 상응한다.

HEK293T cell의 배양에는 DMEM(gibco) 배지에 10% (v/v) FBS를 사용하였으며 배양된 cell를 6 well plate에 1x10⁶ 개씩 분할하였다. 37℃, 5% CO₂. incubator에 24시간 배양 후 트랜스펙션을 진행하였다. FuGENE^® HD Transfection Reagent를 사용하였고, 1ug DNA당 3ul의 시약을 사용하였다. 트랜스펙션 진행 후 즉시 CoCl₂를 처리하였고 96시간 배양 후 cell harvest를 진행하였다. Passive lysis buffer(Promega)를 이용하여 cell를 분쇄하고 30분 동안 shaking 후 cell lifter로 cell을 수득하여 13000 rpm centrifuge 진행 후 상층액을 얻었고 western blot를 이용하여 샘플 분석을 진행하였다.

도 4a와 같이, dCas9, TAD, VPR(VP64-p65-Rta)이 결합된 3종류의 융합 플라스미드를 제작하고, western blot을 통해 저산소 조건과 일반 산소 조건에서 단백질의 발현량을 비교하였다. 실험에는 Cas9 antibody 및 flag tag antibody의 두 가지 항체를 사용하였으며, CoCl₂를 96시간 처리하여 저산소 조건을 유도하였다.

그 결과, TAD를 포함하는 플라스미드 2, 3, 4는 모두 일반 조건에서 단백질 발현이 감소되고, 저산소 조건에서 안정된 것을 확인하였다 (도 4b).

실시예 4. dCas9, TAD, 및 VPR의 결합 순서에 따른 단백질 발현 비교

dCas9, TAD, VPR의 결합 순서를 달리한 각 융합체의 저산소 조건에서 플라스미드에서의 단백질의 발현을 비교하기 위하여, Dual-Luciferase^® Reporter Assay kit를 이용하여 luciferase 유도 발현을 확인하였다. 구체적으로, cell의 배양에는 10% (v/v) FBS가 첨가된 DMEM(gibco) 배지를 사용하였다. 배양된 cell을 6 well plate에 1x10⁶으로 분할 후 24시간 배양하고 트랜스펙션을 진행하였다. 1ug DNA당 3ul의 FuGENE^® HD Transfection Reagent을 사용하였다. dCas9-TAD-VPR를 이용하여 pGL4.21-Gal4-Luc plasmid에 있는 firefly luciferase를 유도 발현 진행하고 pRL-TK에서 발현되는 Renilla luciferase를 이용하여 normalization를 진행하였다. 트랜스펙션 후 즉시 Hypoxia 시약 CoCl₂ 150uM per well을 처리하고 인큐베이터에서 cell을 96시간 동안 배양하였다.

그 결과, dCas9-TAD-VPR 순서의 융합체가 저산소 조건에서 일반 조건에 비하여 약 5배 발현이 증가된 바, 그 발현 차이가 가장 큰 것을 확인하였다 (도 5).

Gal4 bing site를 함유한 pGL4.21-Gal4-Luc 플라스미드를 HEK293 세포에 삽입한 새로운 cell line인 #14의 세포 내 DNA에 미치는 영향을 확인하기 위하여, dCas9, TAD, VPR의 결합 순서를 달리한 각 융합체의 세포 내 루시퍼레이즈 유도 발현을 진행하였다. 그 결과, dCas9-TAD-VPR 순서의 융합체가 저산소 조건에서 일반 조건에 비하여 약 10배 발현이 증가된 바, 발현 차이가 가장 큰 것을 확인하였다 (도 6)

상기 결과를 통해, dCas9-TAD-VPR 순서의 단백질 융합체가 가장 현저한 발현 증가 활성을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 5. dCas9, TAD, 및 VPR의 결합 순서에 따른 유전자 활성 비교

Mammalian cell 내부에 있는 Genomic DNA 타겟 (IL1RN, NeuroD, HNF4)의 저산소 조건에서의 유도 발현을 확인하였다. 구체적으로, HEK293T cell의 배양에는 10% (v/v) FBS가 첨가된 DMEM(gibco) 배지를 사용하였다. 배양된 cell을 6 well plate에 1x10⁶으로 분할하였으며 37℃, 5% CO₂. 조건에서 24시간 배양 후 트랜스펙션을 진행하였다. FuGENE^® HD Transfection Reagent를 사용하였는데 1ug DNA당 3ul의 FuGENE^® HD Transfection Reagent을 사용하였다. (본 실험에서는 2ug dCas9-TAD-VPR plasmid, 1.2ug linear guide DNA (U6 promoter의 guide RNA)를 사용하였다.) DNA와 reagent를 300ul DMEM 배지에 혼합하고 상온에서 15분 반응시킨 후 각 well에 넣었다. 그 후, Hypoxia 시약 CoCl₂가 150uM per well 되도록 처리하고 cell을 96시간 동안 배양하였다. Cell harvest 진행 후, RNeasy^® Plus Mini Kit(Qiagen)로 RNA를 추출하고, 전체 1000ng RNA로 정량 후, RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 그 후, TOPreal^TM qPCR 2X PreMIX (SYBR Green with low ROX)로 qRT-PCR를 진행하고, CFX96 Real-Time PCR System (BIORAD)로 결과를 분석하였다.

그 결과, Hypoxia 저산소 조건에서 Normoxia 일반 조건에 비해 IL1RN의 경우 약 10배 (도 7a), NeuroD는 약 7배 (도 7b), HNF4는 약 2배 가량 (도 7c) mRNA 발현량이 증가된 것을 확인하였다. 나아가, dCas9, TAD, VPR의 결합 순서를 달리한 각 융합체의 HEK293T 세포 내 IL1RN (Interleukin 1 Receptor Antagonist)에 대하여 mRNA 수준을 측정하였다. 그 결과, dCas9-TAD-VPR 융합체가 저산소 조건에서 일반 조건에 비하여 약 10배, dCas9-VPR-TAD 융합체는 약 2.3배, TAD-dCas9-VPR 융합체는 발현 수준의 차이가 거의 없음을 확인한 바, dCas9-TAD-VPR 순서의 융합체가 저산소 조건과 일반 조건의 mRNA 수준의 차이가 가장 큰 것을 확인하였다 (도 8).

실시예 6. 저산소 감지 유전자 가위(gene editing) Cas9 융합체 제작

타겟 유전자를 절단할 수 있는 야생형 Cas9과 HIF의 TAD 도메인을 결합하여 저산소 감지 gene editing (유전자 가위) Cas9 융합체를 제작하였다. 저산소 감지 HIF 도메인인 TAD는 일반 조건에서는 ubiquitination이 진행되어 단백질이 분해되지만, 저산소 조건에서는 단백질이 하이드록실화가 되지 못하여 분해되지 못하므로, 단백질이 안정화되어 특정 유전자를 절단할 수 있다 (도 9).

이를 실험적으로 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏을 통해 일반 조건 및 저산소 조건에서 단백질의 발현을 비교하였다. 구체적으로, 도 10a와 같이 야생형 Cas9 (Cas9^wt), TAD-Cas9^wt, Cas9^wt-TAD, 및 TAD-Cas9^wt-TAD의 융합체를 제작하고, Cas9 항체 및 flag tag 항체를 사용하여 일반 조건 또는 CoCl₂ 유발 저산소 조건에서의 단백질 발현 차이를 확인하였다. HEK293T cell를 6 well plate에 1x10⁶ 개씩 분할 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. FuGENE^® HD Transfection Reagent를 1ug DNA당 3ul의 양으로 사용하여 트랜스펙션을 진행하였다. 트랜스펙션 진행 후 즉시 CoCl₂를 처리하였고 96시간 배양 후 cell harvest를 진행하였다. Passive lysis buffer(Promega)를 이용하여 cell를 분쇄하고 30분 동안 shaking 후 cell lifter로 cell을 수득하여 13000 rpm centrifuge 진행 후 상층액을 얻었고 western blot를 이용하여 샘플 분석을 진행하였다.

그 결과, 야생형 Cas9에 TAD 도메인이 연결된 TAD-Cas9^wt, Cas9^wt-TAD, 및 TAD-Cas9^wt-TAD 단백질 융합체에서 모두 일반 조건에서는 단백질이 전체적으로 감소되고 저산소 조건에서 안정화 되었다 (도 10b).

실시예 7. Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 개수 및 순서에 따른 단백질 분해 정도 비교

plasmid에 존재하는 luciferase 유전자를 타겟으로 정하여 Cas9의 타겟 유전자 절단으로 인하여 luciferase 발현이 감소된다. HEK293T cell를 6 well plate에 1x10⁶ 개씩 분할 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. FuGENE^® HD Transfection Reagent를 1ug DNA당 3ul의 양으로 사용하여 linear guide DNA 0.5ug, Cas9^wt, TAD-Cas9^wt, Cas9^wt-TAD 및 TAD-Cas9^wt-TAD plasmid를 각각 1.5ug, normalization에 이용되는 TK renilla plasmid 200ng, luciferase 함유 plasmid를 400ng 트랜스펙션 진행하였다. 트랜스펙션 진행 후 즉시 CoCl₂를 처리하였고 96시간 동안 배양하였다. 야생형 Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 개수 및 순서를 달리한 Cas9^wt, TAD-Cas9^wt, Cas9^wt-TAD, 및 TAD-Cas9^wt-TAD 각 융합체의 저산소 조건에서 플라스미드에서의 단백질의 발현을 비교하기 위하여, Dual-Luciferase^® Reporter Assay kit를 이용하여 luciferase 유도 발현을 확인하였다.

그 결과, Cas9^wt-TAD 융합체의 경우에만 저산소 조건에서 일반 조건에 비해 단백질의 분해가 증가되어 luciferase의 발현이 일반 조건에 비해 감소됨을 확인하였다 (도 11). 즉, Cas9-TAD 순의 단백질 융합체가 가장 현저한 발현 감소 활성을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 8. Cas9 융합체의 타겟 유전자 선정

Cas9 융합체의 타겟을 선정하기 위하여, 여러 질환과 관련된 유전자인 EMX1(Empty Spiracles Homeobox 1), FANCF, WASI1, WASI2, VEGFA1, VEGP2, TAT, 및 INIP에 대한 야생형 Cas9의 유전자 분해 활성을 확인하였다.

HEK293T cell를 6 well plate에 1x10⁶ 개씩 분할 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. FuGENE^® HD Transfection Reagent를 1ug DNA당 3ul의 양으로 사용하여 트랜스펙션 진행하였다. 트랜스펙션 진행 후 즉시 CoCl₂를 처리하고 96시간 배양 후 cell harvest를 진행하였다. 다음 PureHelix^TM　Genomic DNA Prep kit를 이용하여 DNA를 추출하고, AccuPower^® PCR PreMix kit를 사용하여 PCR을 통해 야생형 Cas9에 의해 절단된 부위 500bp 정도의 linear DNA를 얻었다. 그 후, 전체 샘플의 annealing 후, 샘플 5μl과 10x buffer 1μl, 및 T7 endonuclease I(NEB) 0.5μl를 넣고 37℃에 1시간 동안 반응시켰다. 10% TBE gel loading 후 Gel doc으로 실험 결과를 확인하였다.

그 결과, 상기 타겟 유전자 중, INIP의 발현이 가장 많이 감소되어 약 50%의 유전자가 Cas9에 의해 절단된 것을 확인하였다 (도 12). 따라서, 이후 실험에서는 INIP 유전자를 선택하여 Cas9 융합체의 유전자 분해 활성을 확인하였다.

실시예 9. Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 순서에 따른 INIP 유전자 분해 유전자 분해 활성 비교

과량의 Cas9 융합체를 사용할 경우, 일반 조건과 저산소 조건에서의 분해 활성의 차이를 확인할 수 없으므로, 먼저 타겟 유전자에 작용할 수 있는 단백질 융합체의 최소 농도를 선택하였다. 구체적으로, Cas9^wt, TAD-Cas9^wt, Cas9^wt-TAD, 및 TAD-Cas9^wt-TAD 각 융합체를 1, 1.5, 2, 2.5, 3μg의 농도로 처리하여 INIP 유전자의 분해 정도를 확인하였다. 그 결과, 1.5μg 농도 이상의 Cas9 융합체 처리한 경우, INIP 유전자가 분해되는 것을 확인한 바 (도 13), 이후 실험에서는 1.5μg의 농도로 Cas9 융합체의 유전자 분해 활성을 확인하였다.

이후, 야생형 Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 순서를 달리한 Cas9^wt, TAD-Cas9^wt, 및 Cas9^wt-TAD 각 융합체의 일반 조건 및 저산소 조건에서 타겟 유전자(INIP)에 대한 유전자 분해 활성을 비교하였다.

그 결과, Cas9^wt-TAD 융합체의 경우에만 저산소 조건에서 일반 조건에 비해 타겟 유전자를 더 많이 분해함을 확인하였다 (도 14c). 즉, Cas9-TAD 순의 단백질 융합체가 가장 현저한 타겟 유전자 분해 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.

실시예 10. Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 순서에 따른 SNAIL 유전자 분해 활성 비교

타겟 유전자를 SNAIL로 변경하여, 야생형 Cas9에 결합하는 TAD 도메인의 개수 및 순서를 달리한 Cas9^wt, TAD-Cas9^wt, Cas9^wt-TAD, 및 TAD-Cas9^wt-TAD 각 융합체의 타겟 유전자 분해 활성을 비교하였다. 구체적으로, HEK293T cell를 6 well plate에 1x10⁶ 개씩 분할한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에 24시간 배양하였다. FuGENE^® HD Transfection Reagent를 1ug DNA당 3ul의 양으로 사용하여 Cas9 함유 plasmid 2ug, linear guide DNA 1.2ug를 트랜스펙션을 진행하였다. 트랜스펙션 진행 후 즉시 CoCl₂를 처리하고 48시간 배양 후 cell harvest를 진행하였다. 다음 PureHelix^TM　Genomic DNA Prep kit를 이용하여 genomic DNA를 추출하고, AccuPower^® PCR PreMix kit를 사용하여 PCR을 통해 야생형 Cas9에 의해 절단된 부위 450bp 정도의 linear DNA를 얻었다. 그 후, 전체 샘플을 annealing 후, 샘플 5μl과 10x buffer 1μl, 및 T7 endonuclease I enzyme(NEB)를 0.5μl 넣고 37℃에 1시간 동안 반응시켰다. 10% TBE gel loading 후 Gel doc으로 실험 결과를 확인하였다.

그 결과, SNAIL 유전자를 타겟으로 한 경우에도, Cas9^wt-TAD 융합체의 경우에만 저산소 조건에서 일반 조건에 비해 타겟 유전자를 더 많이 분해함을 확인하였다 (도 15). 이는, Cas9-TAD 순의 단백질 융합체가 가장 현저한 타겟 유전자 분해 활성을 가진다는 실시예 9의 결과와 상응하는 결과이다.

나아가, NGS sequencing을 통하여 각 Cas9 융합체의 타겟 유전자 indel 활성을 확인하였다. 구체적으로, HEK293T cell를 6 well plate에 1x10⁶ 개씩 분할한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에 24시간 배양하였다. FuGENE^® HD Transfection Reagent를 1ug DNA당 3ul의 양으로 사용하여 트랜스펙션 진행한 후 즉시 CoCl₂를 처리하고 48시간 배양 후 cell harvest를 진행하였다. 다음 PureHelix^TM　Genomic DNA Prep kit를 이용하여 genomic DNA를 추출하고, AccuPower^® PCR PreMix kit를 사용하여 1^st PCR을 통해 linear DNA를 얻었다. 그 후 adaptor primer를 이용하여 2^nd PCR를 진행하였으며, 2ul의 1^st PCR sample를 사용하여 20ul reaction 진행하였다. 마지막으로 3^rd PCR에서 index primer를 이용하여 2ul의 2^nd PCR sample로 20ul reaction을 진행하였다. 다음 전체 sample을 한데 모으고 2% agarose gel loading 후 gel purification을 진행하였다. 최종적으로 15ng의 농도의 샘플을 NGS sequencing 분석 진행하였다.

그 결과, 저산소 조건에서 일반 조건에 비하여 Cas9^wt는 약 0.97배, TAD-Cas9^wt는 약 1.65배, Cas9^wt-TAD는 약 2배, TAD-Cas9^wt-TAD에서 약 1.13배 SNAIL 유전자 분해가 증가된 바 (도 16), Cas9^wt-TAD 융합체가 상대적으로 저산소 조건에서 타겟 유전자를 가장 많이 분해하는 것을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Protein fusions comprising Cas protein and TAD domain of HIF and the uses thereof <130> KPA201417-KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 826 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF <400> 1 Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu 1 5 10 15 Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys 20 25 30 Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His 35 40 45 Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile 50 55 60 Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile 65 70 75 80 Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile 100 105 110 Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr 115 120 125 Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met 130 135 140 Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu 145 150 155 160 Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr 165 170 175 Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu 180 185 190 His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro 195 200 205 Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys 210 215 220 Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys 225 230 235 240 Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp 245 250 255 Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly 260 265 270 Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr 275 280 285 Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln 290 295 300 Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln 305 310 315 320 Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val 325 330 335 Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe 340 345 350 Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp 355 360 365 Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser 370 375 380 Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu 385 390 395 400 Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn 405 410 415 Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn 420 425 430 Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu 435 440 445 Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser 450 455 460 Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro 465 470 475 480 Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp 485 490 495 Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu 500 505 510 Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val 515 520 525 Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr 530 535 540 Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu 545 550 555 560 Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser 565 570 575 Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser 580 585 590 Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln 595 600 605 Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu 610 615 620 Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala 625 630 635 640 Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser 645 650 655 Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala 660 665 670 Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro 675 680 685 Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu 690 695 700 Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg 705 710 715 720 Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr 725 730 735 Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp 740 745 750 Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln 755 760 765 Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly 770 775 780 Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys 785 790 795 800 Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu 805 810 815 Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn 820 825 <210> 2 <211> 2481 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF <400> 2 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa 60 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt 120 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg 180 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt 240 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt 300 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg 360 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac 420 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa 480 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga 540 actatgaaca taaagtctgc aacatggaag gtattgcact gcacaggcca cattcacgta 600 tatgatacca acagtaacca acctcagtgt gggtataaga aaccacctat gacctgcttg 660 gtgctgattt gtgaacccat tcctcaccca tcaaatattg aaattccttt agatagcaag 720 actttcctca gtcgacacag cctggatatg aaattttctt attgtgatga aagaattacc 780 gaattgatgg gatatgagcc agaagaactt ttaggccgct caatttatga atattatcat 840 gctttggact ctgatcatct gaccaaaact catcatgata tgtttactaa aggacaagtc 900 accacaggac agtacaggat gcttgccaaa agaggtggat atgtctgggt tgaaactcaa 960 gcaactgtca tatataacac caagaattct caaccacagt gcattgtatg tgtgaattac 1020 gttgtgagtg gtattattca gcacgacttg attttctccc ttcaacaaac agaatgtgtc 1080 cttaaaccgg ttgaatcttc agatatgaaa atgactcagc tattcaccaa agttgaatca 1140 gaagatacaa gtagcctctt tgacaaactt aagaaggaac ctgatgcttt aactttgctg 1200 gccccagccg ctggagacac aatcatatct ttagattttg gcagcaacga cacagaaact 1260 gatgaccagc aacttgagga agtaccatta tataatgatg taatgctccc ctcacccaac 1320 gaaaaattac agaatataaa tttggcaatg tctccattac ccaccgctga aacgccaaag 1380 ccacttcgaa gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca 1440 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agtgaacaga atggaatgga gcaaaagaca attattttaa taccctctga tttagcatgt 2340 agactgctgg ggcaatcaat ggatgaaagt ggattaccac agctgaccag ttatgattgt 2400 gaagttaatg ctcctataca aggcagcaga aacctactgc agggtgaaga attactcaga 2460 gctttggatc aagttaactg a 2481 <210> 3 <211> 1572 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP64-p65-Rta(VPR) <400> 3 gacgcattgg acgattttga tctggatatg ctgggaagtg acgccctcga tgattttgac 60 cttgacatgc ttggttcgga tgcccttgat gactttgacc tcgacatgct cggcagtgac 120 gcccttgatg atttcgacct ggacatgctg attaactcta gaagttccgg atctccgaaa 180 aagaaacgca aagttggtag ccagtacctg cccgacaccg acgaccggca ccggatcgag 240 gaaaagcgga agcggaccta cgagacattc aagagcatca tgaagaagtc ccccttcagc 300 ggccccaccg accctagacc tccacctaga agaatcgccg tgcccagcag atccagcgcc 360 agcgtgccaa aacctgcccc ccagccttac cccttcacca gcagcctgag caccatcaac 420 tacgacgagt tccctaccat ggtgttcccc agcggccaga tctctcaggc ctctgctctg 480 gctccagccc ctcctcaggt gctgcctcag gctcctgctc ctgcaccagc tccagccatg 540 gtgtctgcac tggctcaggc accagcaccc gtgcctgtgc tggctcctgg acctccacag 600 gctgtggctc caccagcccc taaacctaca caggccggcg agggcacact gtctgaagct 660 ctgctgcagc tgcagttcga cgacgaggat ctgggagccc tgctgggaaa cagcaccgat 720 cctgccgtgt tcaccgacct ggccagcgtg gacaacagcg agttccagca gctgctgaac 780 cagggcatcc ctgtggcccc tcacaccacc gagcccatgc tgatggaata ccccgaggcc 840 atcacccggc tcgtgacagg cgctcagagg cctcctgatc cagctcctgc ccctctggga 900 gcaccaggcc tgcctaatgg actgctgtct ggcgacgagg acttcagctc tatcgccgat 960 atggatttct cagccttgct gggctctggc agcggcagcc gggattccag ggaagggatg 1020 tttttgccga agcctgaggc cggctccgct attagtgacg tgtttgaggg ccgcgaggtg 1080 tgccagccaa aacgaatccg gccatttcat cctccaggaa gtccatgggc caaccgccca 1140 ctccccgcca gcctcgcacc aacaccaacc ggtccagtac atgagccagt cgggtcactg 1200 accccggcac cagtccctca gccactggat ccagcgcccg cagtgactcc cgaggccagt 1260 cacctgttgg aggatcccga tgaagagacg agccaggctg tcaaagccct tcgggagatg 1320 gccgatactg tgattcccca gaaggaagag gctgcaatct gtggccaaat ggacctttcc 1380 catccgcccc caaggggcca tctggatgag ctgacaacca cacttgagtc catgaccgag 1440 gatctgaacc tggactcacc cctgaccccg gaattgaacg agattctgga taccttcctg 1500 aacgacgagt gcctcttgca tgccatgcat atcagcacag gactgtccat cttcgacaca 1560 tctctgtttt ga 1572

Claims

타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질; 및 HIF(Hypoxia-inducible factors)의 531 내지 826번째의 아미노산 도메인(TAD)을 포함하는, 단백질 융합체.
제1항에 있어서, 상기 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 단백질은 Cas 단백질 (CRISPR-associated protein), 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), 및 TALE (trans activator-like effector) 뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 것인, 단백질 융합체.
제2항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 야생형 Cas9, dCas9 (deactivated Cas9), 및 nCas9 (nickase Cas9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단백질 융합체.
제3항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 dCas9이고, 상기 융합체는 HIF의 401 내지 530번째 아미노산 도메인을 추가로 포함하는, 단백질 융합체.
제3항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 dCas9이고, 상기 융합체는 유전자 발현 조절 인자인 VP64-p65-Rta(VPR)을 추가로 포함하는, 단백질 융합체.
제5항에 있어서, 상기 융합체는 dCas9-TAD-VPR 순으로 연결되어 있는, 단백질 융합체.
제6항에 있어서, 상기 융합체는 저산소 환경에서 타겟 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 단백질 융합체.
제3항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 야생형 Cas9이고, 상기 융합체는 저산소 환경에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 것인, 단백질 융합체.
제8항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 EMX1, FANCF, WASI1, WASI2, VEGFA1, VEGP2, TAT, INIP, 및 SNAIL로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 단백질 융합체.
제9항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 INIP 또는 SNAIL인 것인, 단백질 융합체.
제8항에 있어서, 상기 융합체는 야생형 Cas9-TAD 순으로 연결되어 있는, 단백질 융합체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
(a) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단백질 융합체;
(b) 상기 (a)의 단백질 융합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
(c) 상기 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 타겟 유전자 발현 조절용 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단백질 융합체를 세포 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, 타겟 유전자 발현 조절 방법.