JPH09504698A

JPH09504698A - 組み換えダイマー酵素の製造方法

Info

Publication number: JPH09504698A
Application number: JP7513402A
Authority: JP
Inventors: ジーグラー，ロビン・ジェイ; ロング，スーザン
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1993-11-02
Filing date: 1994-11-02
Publication date: 1997-05-13
Also published as: EP0729505A1; CA2175590A1; AU8131994A; WO1995012662A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、原核細胞を用いる組み換え型真核生物ヘテロダイマー酵素の製造方法に関する。該方法は、ダイマー酵素のサブユニットの１つをコードするＤＮＡを含む第１のＤＮＡベクターを構築し、酵素の第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含む第２のＤＮＡベクターを構築することからなる。ＤＮＡべクターを構築したならば、それらを原核生物宿主に形質転換する。次いで、形質転換原核宿主細胞をダイマー酵素の発現に適した条件下で培養する。例えば、本発明方法を用いて、クレアチンキナーゼのイソ体ＣＫＭＢを製造することができる。さらに本発明は、原核生物宿主を用いる活性形態の組み換え型ヒト・ダイマー酵素の製造方法に関し、本発明方法を用いて製造される組み換え型酵素製品、および本発明方法により構築された形質転換原核生物宿主にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】組み換えダイマー酵素の製造方法発明の背景クレアチンキナーゼ（ＣＫ）イソ体の分析は、血栓溶解療法で治療されている患者における急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の初期の診断および冠状動脈の再灌流の初期の確定にとり重要である（アラン（A1an）およびウー（Wu）,ラボラトリー・メディシン（Laboratory Medicine）,第２３巻（５）：２９７〜３０２頁，１９９２年）。ＭＢイソ体の測定によって最も早期かつ最も明確な結果が得られるけれども、ＣＫイソ体であるＣＫＫＭおよびＣＫＭＢを用いて再度灌流療法の成功を確定することができる。また、骨格筋疾患を有する患者においてＭＭイソ体のレベルが上昇し、相対的なＭＢ指数と一緒になって筋肉のダメージが急性であるか慢性であるかの決定に有用でありうる。心筋の代謝ならびに酵素の触媒機構の研究および臨床分析用標準物質ならびに品質管理用物質の調製に純粋なＣＫＭＢが必要とされる。ＣＫＭＢを得る現在の方法は、心臓組織をホモジナイズし、エタノールもしくは硫酸アンモニウムで沈殿させ、次いで、イオン交換、ゲル濾過および／またはアフィニティークロマトグラフィー（グレイス（Grace）およびロバーツ（Roberts）,クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chem.Acta）,第１２３巻,５９〜７１頁,１９８２年；およびハーマン（Herman）およびロバーツ（Roberts）,アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）,第１０６巻：２４４〜２５２頁,１９８０年）を行うことを必要とする。これらの方法は、複数のカラム精製工程を必要とし、時間がかかり退屈であり、収率が低く比活性も低い可能性がある。さらに、ＣＫＭＢ抽出物は多量の混入物質、例えば、ＣＫＭＢと一緒に分画されクロマトグラフィーにおいて一緒に移動するアルブミンおよび特別な取り扱いが必要な病原体を含有する可能性がある。異なるＣＫイソ体の製造を研究者および臨床医の要求を満足する程度まで改良し簡単にする必要性が存在する。発明の概要本発明は、原核生物宿主を用いる活性形態の組み換え型真核生物ヘテロダイマー酵素の製造方法に関する。該方法は、ヘテロダイマー酵素のサブユニットの１つをコードするＤＮＡを含む第１のＤＮＡベクターを構築し、次いで、酵素の第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含む第２のＤＮＡベクターを構築することを包含する。ＤＮＡベクターを構築したならば、それらを用いて原核生物宿主を形質転換する。次いで、ヘテロダイマー酵素の発現に適した条件下で形質転換した原核宿主細胞を培養する。例えば、本発明方法を用いて、クレアチンキナーゼのヘテロダイマーイソ体、すなわち、ＣＫＭＢを製造することができる。さらに本発明は原核生物宿主を用いる活性形態の組み換え型ヒト・ダイマー酵素の製造方法に関する。そのうえ、本発明は、本発明方法を用いて製造される組み換え型酵素製品に関する。さらに本発明は、本発明方法により構築される形質転換真核生物宿主に関する。図面の簡単な説明図１は、本発明組み換え型ダイマー酵素の製造方法をスキーム的に説明したものである。発明の詳細な説明本発明は、酵素の２つの異なるサブユニットに関するＤＮＡベクターを構築し、該２つのＤＮＡベクターで宿主細胞を形質転換することによりクレアチンキナーゼの異なるイソ体（すなわち、ＣＫＢＢ、ＣＫＭＭおよびＣＫＭＢ）を製造することができ、得られた形質転換宿主細胞はＣＫＢＢ、ＣＫＭＭおよびＣＫＭＢを発現することができるという知見に基づく。ＤＮＡベクター用語「ＤＮＡベクター」は、挿入されたＤＮＡフラグメントを担持する能力を有し、その結果、宿主細胞による該ＤＮＡインザートの発現を可能にするすべての複製可能なベクターを意味する。さらに、ＤＮＡベクターは、クレアチンキナーゼ（すなわちＣＫＭおよびＣＫＢ）のごとき目的の真核生物のダイマー酵素のサブユニットを配列がコードしているＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントの挿入を受け入れるものでなくてはならない。さらにそのうえ、ＤＮＡベクターは、宿主細胞により認識されうるプロモーターを含んでいなくてはならない。ＤＮＡベクターの構築手順は、マニアティス（Maniatis）ら,モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual), 第２版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（１９８９年）（本明細書ではマニアティスらという）に記載の手順を包含する。用語［ＤＮＡフラグメント」は、酵素サブユニットをコードするすべてのＤＮＡフラグメントを包含するものとする。ＤＮＡベクター中に挿入されたＤＮＡフラグメントは、形質転換または接合またはトランスフェクションにより宿主微生物に伝達されるべきである。ＤＮＡフラグメントの構築または抽出手順は、マニアティスらに記載の手順および当業者に知られた他の手順を包含する。宿主本発明の形質転換した原核細胞宿主を、当業者に知られた種々の方法により作り出すことができる。例えば、マニアティスらにより説明されているトランスフェクション、形質転換またはエレクトロポーレーションを用いることができる。用語「原核生物宿主」は、外来遺伝子、すなわち、もともと当該原核宿主の核物質の一部でないＤＮＡの摂取および発現をすることのできるすべての原核生物を意味する。適当な原核生物は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、エシェリシア（Escherichia）、ストレプトミセス（Streptomyces）またはバチルス（Bacillus）を包含しうる。組み換え型ダイマー酵素本発明組み換え型ダイマー酵素は、２つのサブユニットからなり、酵素特性を有するすべての蛋白を包含するものとする。以下の限定的でない実施例により本発明をさらに説明する。実施例材料および方法：ＰＣＲを用いるＣＫＭＢｃＤＮＡのクローニングヒト・ｃＤＮＡライブラリーからクローン化されたＣＫＭおよびＣＫＢ蛋白をコードするｃＤＮＡを担持するＤＮＡフラグメントが記載されている（ペリーマン（Perryman）ら,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ（Biochem．and Biophys．Research Comm.）,第１４０巻：９８１〜９８９頁，１９８６年；およびビラリール−レビー（Villarreal-Levy ）ら,バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ,第１４４巻：１１１６〜１１２７頁,１９８７年）。我々はＰＣＲ増幅を用いてＮおよびＣ末端においてＤＮＡ配列を変化させてジェンザイム（Genzyme ）発現ベクター中にＣＫｃＤＮＡをクローニングするのに適した制限酵素部位を付加した。プライマーは以下の５'−３'配列を有していた：ＳＬ２２（ＣＫＢのＡＴＧスタートコドンにおけるＮｄｅＩ部位）ＧＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＳＬ２３（ＣＫＢのストップコドンの後ろのＥｃｏＲＩ部位）ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＴＧＡＧＧＳＬ２４（ＣＫＭのＡＴＧスタートコドンにおけるＮｄｅｌ部位）ＧＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＡＴＴＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＣＡＣＡＡＣＳＬ２５（ＣＫＭのストップコドンの後ろのＢａｍＨＩ部位）ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＴＣＡＴパーキン・エルマー・シタス（Perkin Elmer Cetus）（コネチカット州ノーウォーク（Norwalk）製のAmpliTaq DNA Polymeraseを用いるGeneAmp PCR Reagent KitをＰＣＲ反応に使用した。キットに同封されている文献に概説されている標準的手順に従って反応を行った。詳細には、５〜３０ｎｇＤＮＡ、１００ｐｍｏｌプライマーＤＮＡ、２.５Ｕ Amplitaq DNA Polymerase,および２００μ ｍｏｌｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰをキット支給のバッファーと混合し、反応混合物をAmpliwax（パーキン・エルマー・シタス製）とともに重層した。９４℃（融解）２分、５５℃（アニール）２分、７２℃（伸長）２分からなるサイクルにＰＣＲ装置（コイ・ラボラトリー・プロダクツ・インコーポレイテッド（Coy Laboratory Products,Inc）、ミシガン州グラス・レイク（Grass L ake））をプログラムし、このサイクルを１８回繰り返した。最後の伸長工程を１０分行ってすべてのストランドを完全にポリマー化した。ＰＣＲ生成物（約５〜１０μｇ）をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＣＫＢについて）またはＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＣＫＭについて）で消化し、発現ベクター中にクローニングするために０．７％低融点アガロースＴＡＥ緩衝化ゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ・インコーポレイテッド（FMC BioProducts,Inc.）、メイン州ロツクランド（Ro ckland））により精製した。モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning ）（サムブルック（Sambrook）、フリッチュ（Fritsch）およびマニアティス（M aniatis）、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spri ng Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（Cold Spring Har bor Press,NY））に記載されたようにして電気泳動を行った。制限エンドヌクレアーゼをニュー・イングランド・バイオラブズ（New England BioLabs）（マサチューセッツ州ビバリー（Beverly））から購入し、製造者により指示されたように消化反応をセットアップした。Geneclean kit（Bio101製、カリフォルニア州ラジョラ（La Jolla））を用いてゲルスライスからＤＮＡフラグメントを精製した。ジェンザイム発現ベクターｐＲＺ３８の構築ジェンザイムにおいて、プラスミドpBluescript SK+/-（ストラタジーン（Str atagene）、カリフォルニア州ラジョラから入手可能）の誘導体として発現ベクターを構築した。発現はＬａｃプロモーターによりドライブされる。部位特異的突然変異によりβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＡＴＧスタートコドンにおいて制限酵素部位を付加することにより我々のベクターｐＲＺ３８を構築した。突然変異プロトコールは、バイオラッド（BioRad）（カリフォルニア州リッチモンド（Richmond））製のMuta-Gene In Vitro Mutagenesis Kitを用いる記載されたとおりのものであった。ベクターにおけるこの変化は、ＬａｃＺプロモーターの後ろへの外来遺伝子のクローニングを可能とするが、ネイティブな遺伝子におけるのと同様のプロモーターからの間隔を維持する。ｐＲＺ３８中へのＣＫＭおよびＣＫＢのクローニングベクターＤＮＡ（５μｇ）をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＣＫＢについて）またはＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（ＣＫＭについて）で消化し、上記のようにゲル精製した。約１００ｎｇの消化ベクターＤＮＡおよび１００ｎｇの消化ＰＣＲ生成物を２０μｌの反応物（マサチューセッツ州ビバリーのＮＥＢ社から購入したＴ４ＤＮＡリガーゼ）中で結合した。モレキュラー・クローニング（Molecula r Cloning）に記載のごとく結合反応をセットアップした。１５℃で一晩インキュベーションした後、結合反応混合物をｄＨ₂Ｏで６０μｌに希釈した。各１μ ｌをエレクトロポーレーション可能なイー・コリ（E.coli）株ＭＣ１０６１中にエレクトロポーレーションした。セル−ポーレーター（Cell Porator）およびボルテージ・ブースター（Voltage Booster）をベセスダ・リサーチ・ラブズ（Bet hesda Research Labs）（メリーランド州ベセスダ）から購入した。コンピテント細胞の調製およびエレクトロポーレーションのプロトコールは説明書に記載されている。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足したＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。アルカリン・リシス・ミニプレプ法（alkaline lysis minip rep technique）（モレキュラー・クローニング）を用いて正しい組み換えプラスミドを有しているかどうかについて形質転換体を分析した。ミニプレプＤＮＡを制限酵素マッピングにより分析した。ｐＲＺ５２（ＣＫＢ）およびｐＲＺ５３（ＣＫＭ）の２５ｍｌ培養物を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足したＬＢ中で増殖させ、次いで、大スケールのＤＮＡ調製物をキアジェン（QUIAGEN）プラスミド精製カラム（キアジェン・コーポレイション、カリフォルニア州チャッツワース（Chatsworth））を用いて精製した。ＵＳＢ（オハイオ州クリーブランド（Cleveland））製のシークエンス２．０キット（S equense 2.0 kit）に記載の標準的プロトコールに従ってジデオキシヌクレオシド鎖終結ＤＮＡ配列決定反応を行った。［−３５Ｓ］−ｄＡＴＰ（ニュー・イングランド・ヌクレアー（New England Nuclear）製）を用いて、コダック（Kodak ）のＸＡＲフィルム上に可視化するために配列を放射性標識した。６％ポリアクリルアミドゲルにより反応物を分離し、ゲルを乾燥し、モレキュラー・クローニングに記載されたようにフィルムに曝露した。ＣＫＢおよびＣＫＭのコーディング領域を表すＤＮＡ配列はフィギュアＧ１および２にある。ＣＫＭＤＮＡ配列が正しいと決定したならば、ｐＲＺ５３中のアンピシリン耐性遺伝子をＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子（ノムラ（Nomura）ら，ジーン（Gene）,第３巻：３９〜５１頁，１９８７年）に交換した。制限酵素ＳｓｐＩおよびＢｐｍＩを用いてアンピシリン遺伝子を切り出し、Ｔ４ポリメラーゼを用いてベクター末端を平滑末端化した。カナマイシン耐性遺伝子をｐＢＲ３２２ベクターのポリリンカー中にクローン化した。ＢａｍＨＩを用いて該遺伝子をベクターから切り出し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端化した。得られたＣＫＭプラスミドをｐＲＺ６９と呼ぶ。ＣＫＭＢ同時発現株の構築約５０μｇ／ｍｌとしてｐＲＺ５２およびｐＲＺ６９ＤＮＡを混合し、混合物１μｌを２０μｌのＭＣ１０６１細胞中にエレクトロポーレーションした。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に細胞をプレーティングして、両プラスミドで同時形質転換された細胞を選択した。ミニプレプＤＮＡ（miniprep DNA）の制限消化により同時形質転換を分析した（該標準的方法はモレキュラー・クローニングに記載されている）。発現の分析同時形質転換体の発現分析を以下のように行った。２ｍｌＬＢ、０.２％グルコース、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリン中３７℃で振盪しながら一晩クローンを増殖させた。翌朝、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２５ｍｌのＬＢに０.６ｍｌの一晩培養物を接種し、３０℃で振盪しながら増殖させた。Ａ６００が約０.４となるまで培養を増殖させ、次いで、試料を１時間間隔で４時間にわたり採取した。培養を一晩増殖させ、さらに試料を採取した。全細胞試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で煮沸し、１２％ポリアクリルアミドゲル中を泳動させて蛋白の生産を評価した。ゲルはバイオラッド（BioRad）から得て、ゲルに添付のプロトコールに従った。いくつかのアッセイを用いて発現された組み換え蛋白のレベルおよび品質を調べた。上記のごとく培養を増殖させた。Ａ６００が１.０となった後、あるいは一晩インキュベーションした後、細胞を収穫し、溶解バッファー（２０ｍＭＢｉｓ−ＴｒｉｓｐＨ６．９、０．２５％ツイン２０、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＥＧＴＤ、１ｍＭＰＭＳＦ）に再溶解した。再溶解した細胞を氷上で超音波処理することにより溶解し（あるいは、より大規模スケールにはマイクロフルイダイザーMicrofluidizer（マイクロフルイディクス・コーポレイション、ニュートン、マサチューセッツ州（Micr ofluidics Corp.,Newton,MA）を用いて細胞を溶解した）、遠心分離により細胞残渣を除去した。溶解バッファー中に希釈した後、下記アッセイ系を用いて試料を分析した。クレアチンキナーゼ試薬（シグマ（Sigma）社製、４７−ＵＶ）酵素活性の動力学的測定のための分光学的アッセイである。クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）イソ酵素キット（シグマ社製、７１５−ＥＰ）は種々のイソ体（ＭＭ、ＭＢおよびＢＢ）を分離し、活性に関して染色するものである。アボットＩＭｘアナライザー（Abbot IMx analyzer）用のＣＫ−ＭＢアッセイ系は、試料中のＣＫ−ＭＢの特異的な蛋白量を決定するために微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）を用いる（すべてのプロトコールはアッセイキットについている）。均等物当業者は、これ以上日常的な実験を用いることなく、本明細書記載の発明の特別な具体例に対する多くの均等物を認識し、確認するであろう。かかる均等物は下記請求の範囲に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）（i）酵素の第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含む第１のＤＮＡベクター；および（ii）酵素の第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含む第２のＤＮＡベクターを構築し；（ｂ）（i）第１のＤＮＡベクター；および（ii）第２のＤＮＡベクターで原核生物宿主を形質転換し；次いで、（ｃ）ダイマー酵素の発現に適した条件下で形質転換原核生物宿主を培養することからなる、活性形態の真核生物ヘテロダイマー酵素の製造方法。２．真核生物ヘテロダイマー酵素が哺乳動物のものである請求項１の方法。３．真核生物ヘテロダイマー酵素がキナーゼである請求項１の方法。４．キナーゼがクレアチンキナーゼである請求項３記載の方法。５．（ａ）第１のサブユニットがクレアチンキナーゼサブユニットＢであり、第２のサブユニットがクレアチンキナーゼサブユニットＫであるか；または（ｂ）第１のサブユニットがクレアチンキナーゼサブユニットＭであり、第２のサブユニットがクレアチンキナーゼサブユニットＢである請求項１の方法。６．原核生物宿主が細菌である請求項１の方法。７．細菌宿主がエシェリシア（Escherichia）である請求項６の方法。８．（ａ）（i）酵素の第１のサブユニットをコードするＤＮＡを含む第１のＤＮＡベクター；および（ii）酵素の第２のサブユニットをコードするＤＮＡを含む第２のＤＮＡベクターを構築し；（ｂ）（i）第１のＤＮＡベクター；および（ii）第２のＤＮＡベクターで原核生物宿主を形質転換し；次いで、（ｃ）ヘテロダイマー酵素の発現に適した条件下で形質転換原核生物宿主を培養することからなる、ヒト・ダイマー酵素の製造方法。９．ヒト・ダイマー酵素がキナーゼである請求項８の方法。１０．キナーゼがクレアチンキナーゼである請求項９の方法。１１．原核生物宿主が細菌である請求項８の方法。１２．細菌宿主がエシェリシアである請求項１１の方法。１３．第１および第２のサブユニットがクレアチンキナーゼサブユニットＢである請求項８の方法。１４．第１および第２のサブユニットがクレアチンキナーゼサブユニットＭである請求項８の方法。１５．（ａ）（i）配列番号：１のＤＮＡ配列の全部または一部から選択されるＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含む第１のＤＮＡベクター；および（ii）配列番号：２のＤＮＡ配列の全部または一部から選択されるＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含む第２のＤＮＡベクターを構築し；（ｂ）（i）第１のＤＮＡベクター；および（ii）第２のＤＮＡベクターで細菌宿主を形質転換し；次いで、（ｃ）ダイマー酵素の発現に適した条件下で形質転換細菌宿主を培養することからなる、クレアチンキナーゼ酵素の製造方法。１６．（ａ）（i）配列番号：２のＤＮＡ配列の全部または一部から選択されるＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含む第１のＤＮＡベクター；および（ii）配列番号：１のＤＮＡ配列の全部または一部から選択されるＤＮＡ配列をコードするＤＮＡを含む第２のＤＮＡベクターを構築し；（ｂ）（i）第１のＤＮＡベクター；および（ii）第２のＤＮＡベクターで細菌宿主を形質転換し；次いで、（ｃ）ダイマー酵素の発現に適した条件下で形質転換細菌宿主を培養することからなる、クレアチンキナーゼ酵素の製造方法。１７．請求項１の方法により製造される真核生物ヘテロダイマー酵素。１８．請求項８の方法により製造されるヒト・ダイマー酵素。１９．請求項１５の方法により製造されるクレアチンキナーゼ酵素。２０．請求項１６の方法により製造されるクレアチンキナーゼ酵素。２１．請求項１の方法により製造される形質転換原核生物宿主。２２．請求項２の方法により製造される形質転換原核生物宿主。２３．請求項１５の方法により製造される形質転換原核生物宿主。２４．請求項１６の方法により製造される形質転換原核生物宿主。