JP3166160B2 - 新規な▲上１▼▲上３▼ｃ標識アミノ酸及びその発酵的又は酵素的製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規な¹³C標識アミノ酸及び¹³C標識炭素源
を使用する¹³C標識アミノ酸の発酵的又は酵素的製造法
に関する。

（従来の技術と問題点） ¹³C標識アミノ酸は、蛋白・ペプチドの溶液中の、例
えばNMR法による構造研究用の試薬としての用途、生化
学における、例えばNMR法、マススペクトロメトリーに
よる代謝研究用の試薬としての用途、人・動物の、例え
ば、肝機能を検査するための呼気検査用の診断薬として
の用途等の用途を有する。そして、これらの用途には、
¹³C標識アミノ酸のなかでも相隣る２つの炭素原子が共
に¹³Cであるものが特に望ましい場合が多い。

しかして、従来¹³C標識アミノ酸は化学的合成法によ
って製造された例はあるが、このような合成法による場
合は、アミノ酸の骨格炭素原子中、１位の炭素原子、す
なわち、カルボキシル基の炭素原子のみが¹³Cであるも
のは製造されるが（例えばMSD ISOTOPES社）、１位の
炭素原子以外の炭素原子の一部若しくは全てが¹³Cであ
るもの又は１位の炭素原子を含めて複数の炭素原子が¹³
Cであるもの（全ての炭素原子が¹³Cであるものは除
く。）の製造は極めて困難であって、このような¹³C標
識アミノ酸の容易な製造法の開発が待望されている。

（問題を解決するための手段） 本発明者は、炭素源として¹³C標識炭素源を使用する
アミノ酸発酵の研究の結果、炭素源分子の骨格炭素鎖は
発酵の代謝過程において個々の炭素原子にまで一旦は完
全に分解するとは限らず、例えば、酢酸を炭素源として
使用すると酢酸分子を構成するその炭素原子２個が代謝
過程において終始一体となって挙動すること及びグルコ
ースを炭素源として使用するとその骨格炭素鎖の一部を
構成する相連なる複数個の炭素原子が代謝過程において
一体となって挙動することを見出し、この知見に基いて
本発明を完成した。

因みに、アミノ酸の微生物による代謝過程は知られて
いるが（例えば、日本生化学会編「代謝マップ−経路と
調節−」（昭和55年東京化学同人発行）の第45頁にバリ
ン、ロイシン、イソロイシンの代謝（微生物）マップが
掲載されている。）、この代謝過程は極めて複雑であっ
て、このようなマップをみただけでは、上記した本発明
者による知見を読み取り得ることは到底できない。

以下、本発明について逐次説明する。

先ず、本発明の¹³C標識アミノ酸の製造法について説
明する。

この製造法は発酵法（ファーメンテーション法）又は
酵素法（エンチメーション法）によるので、従って、本
発明で製造できるアミノ酸、すなわち、本発明の対象ア
ミノ酸は、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニ
ン、スレオニン、グルタミン酸、リジン、アルギニン、
オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジ
ン、トリプトファン、グルタミン、セリン、プロリン等
の発酵法又は酵素法によって製造可能なアミノ酸であ
る。このようなアミノ酸の製造法自体は、使用菌、酵素
源、培地、ファーメンテーション又はエンチメーション
の条件、ファーメンテーション又はエンチメーション終
了液からの目的アミノ酸の分離を含めて、炭素源として
¹³C標識炭素源を採用する他は、全て公知の方法による
ことができるので、この相違点のみを説明する。

炭素源として¹³C標識炭素源を採用するといっても、
炭素源自体はこれまた公知の炭素源でよく、ただこのよ
うな炭素源の少くとも一部の分子の炭素原子が少なくと
も１個が¹³Cである分子である必要があるのみである。

それで、これについて説明すると、このような炭素源
としては、例えば、¹³C標識酢酸と無標識酢酸との併
用、¹³C標識酢酸と無標識グルコースとの併用、¹³C標識
グルコースと無標識グルコースとの併用、¹³C標識グル
コースと無標識酢酸との併用を挙げることができる。¹³
C標識炭素源分子内の炭素原子は、上記のように少なく
とも１個が¹³Cである必要があるが、¹³C標識炭素源分子
内における¹³Cの数及び位置は、目的とする¹³C標識アミ
ノ酸が何であるかにより、炭素源分子の骨格炭素鎖はア
ミノ酸発酵の代謝過程においてその全部又は一部が一体
となって挙動する、という前記の本発明者による知見に
より決めることができる。例えば、炭素源として［1,2
−¹³C₂］酢酸を使用する場合、１及び２の両位の炭素原
子が¹³Cであるアミノ酸が相対的に多量に生成するの
で、このような¹³C標識アミノ酸を得たい場合はそのよ
うな標識酢酸を使用する。

ファーメンテーション終了液又はエンチメーション終
了液から分離したアミノ酸は、同じアミノ酸（例えば、
ロイシンとする）であっても、種々の¹³C標識アミノ酸
の混合物、例えばロイシンの場合は種々の¹³C標識ロイ
シンの混合物であるが、前述の¹³C標識アミノ酸の用途
には、このような混合物のままで供することができる。
因みに、¹³C標識アミノ酸分子内における¹³Cの位置はNM
R法によって決定でき、また¹³C標識アミノ酸混合物の¹³
Cに関する各異性体の割合もNMR法によって測定できる。

¹³C標識アミノ酸を発酵法又は酵素法で製造する場合
は、化学合成法で製造する場合に較べて、容易な操作で
しかも高収率に目的アミノ酸を製造できる他に、¹³C標
識アミノ酸分子内における¹³Cである炭素原子の位置と
数とが多様化するというきわめて重要な利点がある。

次に、１位の炭素原子（すなわち、カルボキシル基の
炭素原子）が通常の炭素原子（すなわち、¹²C）であっ
て、その他の炭素原子の１個以上が¹³Cである本発明の
新規なアミノ酸について説明する。

このようなアミノ酸の製造法自体は前記の通りなの
で、ここに付加すべき説明はない。因みに、カルボキシ
ル基の炭素原子のみが¹³Cであるアミノ酸は一般に公知
である。

以下、実施例により本発明を更に説明する。

実施例１（ロイシン（その１）） 下記の培地Ａを500ml容フラスコに50ml張り込み、ロ
イシン発酵菌株ブレビバクテリウム・ラクトフェルメン
タム（Brevibacterium lactofermentum）AJ 3918（FERM
−P 2516）を斜面寒天培養から１白金耳接種し、31℃で
18時間振とう培養した（種培養）。

培地Ａ グルコース ３％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm ビオチン 10μg/ サイアミン塩酸塩 200μg/ 尿素 0.3％ DL−メチオニン 0.04％ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） 2.2％ pH＝6.0（KOHによる） その後、１容ガラスジャーに下記培地Ｂを285ml張
り込み、上に得た種培養液15mlを接種し、NH₃でpHを6.2
5に制御しながら31℃で24時間通気撹拌培養して湿潤菌
体32g得た。

培地Ｂ グルコース 10％ 酢酸 0.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm DL−メチオニン 0.07％ ビオチン 50μg/ サイアミン塩酸塩 300μg/ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） 2.2％ pH＝7.0（KOHによる） この菌体を生理食塩水にて２度洗浄した後、培地Ｂ
の、酢酸を¹³C標識酢酸（［1,2−¹³C₂］酢酸、すなわ
ち、炭素原子が全て¹³Cである酢酸）0.5％で置き換え、
グルコース濃度を0.5％に減じ、そして大豆タンパク塩
酸加水分解液濃縮物を除いた培地（培地Ｂ′）に該菌体
を戻し、NaOH中和を行いながら（pH＝6.25）31℃で24時
間培養（発酵）を行なった。その結果、Ｌ−ロイシン
が、2.24g/蓄積していた。

この培養液を遠心分離機にて菌体を分離した後、イオ
ン交換樹脂法を用いて単離精製して538mgのＬ−ロイシ
ンを得た。

このＬ−ロイシンを分析したところ、１位の炭素原子
（カルボキシル基の炭素原子）と２位の炭素原子（α位
の炭素原子）との両者のみが共に¹³C標識されたＬ−ロ
イシンが75％であった。

前記培地において、炭素源として酢酸は¹³C無標識の
ものを使用し、グルコースは¹³C標識のものを使用して
発酵を行ったところ、１及び２の両位の炭素原子以外の
炭素原子が全て¹³C標識されたＬ−ロイシンが20％であ
った。

これらの結果から、Ｌ−ロイシン生成の代謝過程にお
いて、酢酸分子の両炭素原子は少なくとも一部の酢酸に
おいては一体となって挙動することが理解される。

実施例２（ロイシン（その２）） 種培養を実施例１におけると全く同様にして行なっ
た。

その後、１容ガラスジャーに下記培地Ｃを285ml張
り込み、上に得た種培養液を15ml接種し、NaOHでpHを6.
25に制御しながら31℃で24時間通気撹拌培養して湿潤菌
体を32g得た。

培地Ｃ グルコース 10％ 酢酸 0.5％ 尿素 0.1％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm DL−メチオニン 0.07％ ビオチン 50μg/ サイアミン塩酸塩 300μg/ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） 2.2％ pH＝7.0（KOHによる） この菌体を生理食塩水にて２度洗浄した後、培地Ｃ
の、酢酸を実施例１で使用したと同じ¹³C標識酢酸0.25
％で置き換え、グルコース濃度を0.75％に変え、大豆タ
ンパク塩酸加水分解液濃縮物を除いた培地（培地Ｃ′）
に該菌体を戻し、NaOH中和を行いながら（pH＝6.25）31
℃で24時間培養（発酵）を行った。その結果、Ｌ−ロイ
シンが3.01g/蓄積していた。

この培養液を実施例１におけると同様に処理して722m
gのＬ−ロイシンを得た。

このＬ−ロイシンの分析結果は、１及び２の両位の炭
素原子のみが同時に¹³C標識されたＬ−ロイシンが50％
であった。

前記培地において、炭素源として酢酸は¹³C無標識の
ものを使用し、グルコースは¹³C標識のものを使用して
発酵を行ったところ１及び２の両位の炭素原子以外の炭
素原子が全て¹³C標識されたＬ−ロイシンは45％であっ
た。

実施例３（バリン（その１）） 下記の培地Ｄを、500ml容フラスコに50ml張り込み、
バリン発酵菌株ブレビバクテリウム・ラクトフェルメン
タム（Brevibacterium lactofermentum）AJ 3450（FER
M−P1963）を１白金耳接種し、31℃で13時間振とう培養
した（種培養）。

培地Ｄ グルコース ３％ 尿素 0.3％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm DL−メチオニン 0.01％ ビオチン 10μg/ サイアミン塩酸塩 200μg/ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） ４％ pH＝6.5（KOHによる） その後、１容ガラスジャーに下記培地Ｅを285ml張
り込み、上に得た種培養液を15ml接種し、NH₃でpHを6.5
に制御しながら31℃で48時間通気撹拌培養して湿潤菌体
を23g得た。

培地Ｅ グルコース 13％ 酢酸 0.3％ 硫酸アンモニウム ２％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm DL−メチオニン 0.06％ ビオチン 50μg/ サイアミン塩酸塩 200μg/ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） ３％ pH＝6.5（KOHによる） この菌体を生理食塩水にて２度洗浄した後、培地Ｅ
の、グルコース13％と酢酸0.3％を¹³C標識酢酸0.5％及
び無標識グリコース0.5％で置き換え、大豆タンパク塩
酸加水分解液濃縮物を除いた培地（培地Ｅ′）に該菌体
を戻し、NaOH中和を行いながら（pH＝6.5）31℃で48時
間培養を行った。その結果、Ｌ−バリンが1.7g/蓄積
していた。

この培養液を実施例１におけると同様に処理して510m
gのＬ−バリンを得た。

このＬ−バリンを分析したところ、１位の炭素原子カ
ルボキシル基の炭素原子）と２位の炭素原子（α位の炭
素原子）との両者のみが共に¹³C標識されたＬ−バリン
が24％であった。また、３位の炭素原子（β位の炭素原
子）と４位の炭素原子（γ位の炭素原子）との両者のみ
が共に¹³C標識されたＬ−バリンが24％であった。また
全ての炭素原子が無標識のＬ−バリンが29％であった。

実施例４（ロイシン（その３）） 実施例１におけると同様にして、Ａ及びＢ両培地を使
用して培養して得たブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムAJ3918の菌体を生理食塩水にて２度洗浄した
後、培地Ｂのグルコースを99％¹³C［Ｕ−¹³C］標識した
グルコースを重量比35％含むグルコース20gで置き換
え、さらに大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物を除いた
培地（培地Ｂ″）に該菌体を戻し、NH₃中和を行いなが
らpH7.0、31℃で38時間培養（発酵）した。その結果、
Ｌ−ロイシンガ17.4g/蓄積していた。

この培養液から菌体を遠心分離により除き、イオン交
換樹脂法を用いて単離精製した3660mgのＬ−ロイシンを
得た。

このＬ−ロイシンの¹³C−NMRスペクトルを測定したと
ころ、グルコースを炭素源とする生合成経路を反映した
不均一な¹³C分布を持つことがわかった。すなわち、こ
のNMR法スペクトルの回析の結果、得られたＬ−ロイシ
ンは炭素源として培地中に添加した非標識および¹³C標
識グルコース由来の炭素数２を持つ３個の構造単位（ブ
ロック）から構成されていることが判明した。この３個
のブロックは（１）［Co,Cα］；（２）［Ｃβ,C
δ_１］；（３）［Ｃγ,Cδ_２］である。

ここにCoはカルボキシル基の炭素原子を意味し、Ｃα
は２位の炭素原子を意味し、その他の位置の炭素原子に
ついては下記構造式を参照のこと。

標識グルコース起源のブロック内は85％に及ぶ高い¹³
C標識率を持つが、任意の２つのブロックが同時に¹³C標
識グルコースに由来するブロックとなる確率は、統計的
に予想される限り、約35％の値である。指摘するまでも
ないが、標識ブロックが同一分子に複数含まれる確率
は、標識グルコースの混合比（本実施例では35％）を変
化させることにより容易に制御可能である。

以下の実施例においては、このようにして得られる生
合成経路を反映して不均一に¹³C標識されたアミノ酸を3
5％¹³C“ブロック標識”アミノ酸と呼ぶことにする。即
ち、本実施例でえられたＬ−ロイシンは35％¹³Cブロッ
ク標識Ｌ−ロイシンである。

¹³Cブロック標識ロイシンの最も重要な特徴は、２個
のプロキラルメチル基を立体選択的に標識することが可
能な点である。Ｃδ_１及びＣδ_２はそれぞれpro−Ｓ及
びpro−Ｒメチル基炭素に相当する。ブロック標識の結
果、pro−Ｒメチル基炭素のNMRジクナルは強いダブレッ
トを、pro−Ｓメチル基炭素のそれは強いシングレット
として現れ、容易に区別がつく。このような立体的選択
的に標識されたロイシンは有機合成化学的方法によって
は合成が極めて困難であったが、本発明の方法により安
価、簡便、多量調整技術が確立することになり、蛋白質
のNMRスペクトル中のロイシン残基のメチルシグナルの
立体特異的帰属、ロイシン側鎖シグナルの一括帰属など
NMRによる蛋白質の立体構造の決定技術に欠くことので
きない重要な用途をもつ。

実施例５（ロイシン等（その１）） 実施例１におけると同様にして、Ａ及びＢ両培地を使
用して培養して得たブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムAJ3918の菌体を生理食塩水にて２度洗浄した
後、培地Ｂのグルコースを99％¹³C［１−¹³C］標識した
グルコース20gで置き換え、さらに大豆タンパク塩酸加
水分解液濃縮物を除いた培地（培地Ｂ）該菌体を戻
し、NH₃中和を行いながらpH7.0、31℃で38時間培養（発
酵）した。その結果、Ｌ−ロイシンが20.5g/蓄積して
いた。

この培養液から菌体を遠心分離により除き、イオン交
換樹脂法を用いて単離精製して4840mgのＬ−ロイシンを
得た。

このＬ−ロイシンの¹³C−NMRスペクトルを測定したと
ころ、¹³C標識位置はＣα,Cδ_１及びＣδ_２の３個所に
限られていることがわかった。標識率は約50％程度であ
ったが、このような位置選択的標識ロイシンを化学合成
的に調製することは極めて困難であり、その点本発明の
方法は際立った利点がある。

同様な実験をＬ−バリン、Ｌ−イソロイシンについて
行ったが、バリン、イソロイシンともにＣγ_１とＣγ_２
のみに高濃度（約50％）の¹³C標識が見出された。

ここに、Ｌ−バリン及びＬ−ロイシンの炭素原子の位
置については下記構造式を参照のこと。

当然のことながら、１位の炭素以外に¹³C標識された
グルコース類を用いれば、他の特定部位を標識したアミ
ノ酸類が調製可能である。また、次の実施例に述べるア
ミノ酸類についても同様な手法が適用可能である。

実施例６（ロイシ等（その２）） 実施例１におけると同様にして、Ａ及びＢ両培地を使
用して培養して得たブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムAJ3918の菌体を生理食塩水にて２度洗浄した
後、培地Ｂのグルコースを36％¹³C［Ｕ−¹³C］20gで置
き換え、さらに大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物を除
いた培地（培地Ｂ′）に該菌体を戻し、NH₃中和を行
いながらpH7.0,31℃で38時間培養（発酵）した。その結
果、Ｌ−ロイシンが17.4g/蓄積していた。

この培養液から菌体を遠心分離により除き、イオン交
換樹脂法を用いて単離精製して4070mgのＬ−ロイシンを
得た。

このＬ−ロイシンの¹³C−NMRスペクトルを測定したと
ころ、36％［Ｕ−¹³C］Ｌ−ロイシンが生成しているこ
とが判明した。

従来は均一に¹³C標識したロイシンは標識蛋白質の加
水分解物からの分離によるしかなかったが、本発明の方
法ではロイシン以外にもバリン、イソロイシン、アラニ
ン、グルタン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、オ
ルニチリン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルア
ラニン、チロシン、スレオニンなどグルコースなど標識
した糖源から微生物発酵が可能なアミノ酸であれば、そ
の均一¹³C標識体を必要な量だけ調製することが可能な
点が、特に選れている。

実施例７（プロリン等） 下記の培地Ｆを500ml容フラスコに50ml張り込み、プ
ロリン発酵菌株ブレビバクテリウム・ラクトフェルメン
タム（Brevibacterium lactofermentum）AJ 11225（FE
RMP−4370）を斜面寒天培養から１白金耳接種し、30℃
で18時間振とう培養した（種培養）。

培地Ｆ グルコース ２％ 硫安 1.0％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm MN⁺⁺ 2ppm ビオチン 50μg/ サイアミン塩酸塩 200μg/ 尿素 0.25％ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） 2.2％ pH＝7.0（KOHによる） その後、１容ガラスジャーに下記培地Ｇを270ml張
り込み、上に得た種培養液30mlを接種し、NH₃でpHを7.0
に制御しながら30℃で24時間通気撹拌培養して湿潤菌体
14g得た。

培地Ｇ グルコース 10％ 硫安 ６％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm MN⁺⁺ 2ppm DL−メチオニン 0.07％ ビオチン 450μg/ サイアミン塩酸塩 1000μg/ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） 0.2ml/dl pH＝7.0（KOHによる） この菌体を生理食塩水にて２度洗浄した後、培地Ｇの
グルコース（100g/）をグルコース（5g/）と99％¹³
C［２−¹³C］酢酸（5g/）の糖酢混合物に変え、さら
に大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物を除いた培地（培
地Ｇ′）に該菌体を戻し、NH₃中和を行いながらpH7.0,3
0℃で16時間培養（発酵）した。その結果、Ｌ−プロリ
ンが2.8g/蓄積していた。

この培養液から菌体を遠心分離により除き、イオン交
換樹脂法を用いて、単離精製して700mgのＬ−プロリン
を得た。

このＬ−プロリンを¹³C−NMRスペクトルにより分析し
たところ、Ｃα,Cβ及びＣγに顕著な¹³Cの分布が見ら
れ、特にＣγは強く標識されていた。このようなＣγの
標識体はNMRスペクトルによりタンパク質中のプロリン
を含んだペプチド結合のシス・トランス決定に有用であ
る。

ここに、プロリンの炭素原子の位置については下記構
造式参照のこと。

一方、上の実験で99％¹³C［２−¹³C］酢酸（5g/）
を［１−¹³C］酢酸で置き換えることにより、ＣδとCo
のみを高度に標識したＬ−プロリンを調製することも容
易である。また、酢酸あるいはグルコースと［1,2−¹³C
₂］酢酸を混合した酢酸培地又は糖酢酸培地で置き換え
ることにより、¹³Cブロック標識Ｌ−プロリンを生成さ
せることができた。この場合ブロック構成は（１）［C
o］；（２）［Ｃα,Cβ］；（３）［Ｃγ,Cδ］及び
（１）［Co,Cα］；（２）［Ｃβ］；（３）［Ｃγ,C
δ］の２通りであり、両者は同じ確率で起こっていた。

このような酢酸のみ或いは酢酸とグルコースの混合物
（糖酢酸培地）を利用するブロック標識法はＬ−ロイシ
ンの［Co,Cα］が酢酸起源（アセチルCoA）であること
を利用する標識法（実施例１）を除けば酢酸を高い効率
で資化しアミノ酸に変換しうるアミノ酸発酵系のみ適用
が限られる。これらのアミノ酸はグルタン酸、グルタミ
ン、リジン、アルギニン、オルニチリン、スレオニン、
プロリンの７種類である。これらのアミノ酸の位置特異
的¹³C標識体、均一標識体或いはブロック標識体を比較
的安価な原料である¹³C標識酢酸源を用いて得る本発明
方法は経済性が極めて優れている。

実施例８（イソロイシン） 下記の培地Ｈを500ml容フラスコに50ml張り込み、イ
ソロイシン発酵菌株ブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタム（Brevibacterium lactofermentum）AJ 3689
（FERMP−2436）を斜面寒天培養から１白金耳接種し、3
1℃で18時間振とう培養した（種培養）。

培地Ｈ グルコース ３％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm ビオチン 200μg/ サイアミン塩酸塩 300μg/ 酢酸アンモニウム 0.3％ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素３％） ６％ pH＝8.0（NaOHによる） その後、１容ガラスジャーに下記培地Ｉを285ml張
り込み、上に得た種培養液15mlを接種し、NH₃でpHを7.3
に制御しながら31℃で24時間通気撹拌培養して湿潤菌体
14g得た。

培地Ｉ グルコース 10％ 硫酸アンモニウム 1.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.04％ Fe⁺⁺ 2ppm Mn⁺⁺ 2ppm ビオチン 50μg/ サイアミン塩酸塩 3000μg/ 大豆タンパク塩酸加水分解液 濃縮物（総窒素4.2％） 1.2％ pH＝4.2（KOHによる） この菌体を生理食塩水にて２度洗浄した後、培地Ｉの
中のグルコースを99％¹³C標識体を重量比33％含むグル
コース20gで置き換え、さらに大豆タンパク塩酸加水分
解液濃縮物を除いた培地（培地Ｉ′）に該菌体を戻し、
NH₃中和を行いながらpH7.3、31℃で38時間培養（発酵）
した。その結果、Ｌ−イソロイシンが1.3g/蓄積して
いた。

この培養液から菌体を遠心分離により除き、イオン交
換樹脂法を用いて単離精製して3500mgのＬ−イソロイシ
ンを得た。このＬ−イソロイシンを¹³C−NMRスペクトル
により分析したところ、実施例５で説明したように、¹³
C標識グルコースに由来する¹³C標識されたブロックから
構成される¹³Cブロック標識体であることが判明した。
Ｌ−イソロイシンの場合も、Ｌ−ロイシンの場合と同様
に、３つのグルコースから由来する独立な３ブロックが
見出された。（１）［Co,Cα,Cγ_１］；（２）［Ｃβ,C
γ_２］；（３）［Ｃδ］。同一グルコース由来の複数の
炭素を持つブロック（ブロック（１）及び（２））にお
いては85％程度の高濃度に¹³C標識されたブロックが約3
5％程度含まれていることが明らかである。このブロッ
ク¹³C標識Ｌ−イソロイシンに関しても蛋白質NMRなど広
範な用途が見出され得る。

実施例９（バリン（その２）） 実施例３におけると同様にして、Ｄ及びＥ両培地を使
用して培養して得たブレビバクテリウム・ラクトフエル
メンタムAJ 3450の菌体を生理食塩水にて２度洗浄した
後、培地Ｅ中のグルコースを炭素原子が全て¹³Cである
グルコースを非標識グルコースに約35％の割合で混合し
たもの10gで置き換え、さらに大豆タンパク塩酸加水分
解液濃縮物を除いた培地（培地Ｅ″）に該菌体を戻し、
NH₃中和を行いながらpH6.5、31℃で38時間培養（発酵）
した。その結果、Ｌ−バリンが17.3g/蓄積していた。

この培養液から菌体を遠心分離により除き、イオン交
換樹脂法を用いて単離精製して4240mgのＬ−バリンを得
た。

このＬ−バリンを¹³C−NMRスペクトルにより分析した
ところ、実施例５で説明したように、¹³C標識グルコー
スに由来する、¹³C標識された独立な２ブロックから構
成されるブロック標識体であることが判明した。Ｌ−バ
リンの場合もＬ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンの場合と
同様に、２つのグルコースから由来する独立な２ブロッ
クが見出された：（１）［Co,Cα,Cγ_１］；（２）［Ｃ
β,Cγ_２］。Ｃγ_１及びＣγ_２はそれぞれプロキラルな
メチルシグナルであり、pro−Ｓ及びpro−Ｒに相当す
る。同一グルコース由来の複数の炭素を持つこれら２つ
のブロックにおいては、85％程度の高濃度¹³C標識され
たブロックが約35％程度含まれていることが明らかであ
る。このブロック¹³C標識Ｌ−バリンに関しても最も信
頼性のおけるメチル基シグナルの立体的帰属を始め、蛋
白質NMRなどに大きな用途が拓けている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/04 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】¹³Cで標識されたアミノ酸の製造法であっ
   て、 （イ）二種以上の異なる炭素源を含む培地中に、アミノ
   酸生産能を有する微生物を培養すること、または （ロ）アミノ酸生産能を有する微生物の菌体を、二種以
   上の異なる炭素源を少なくとも含む溶液中に懸濁してア
   ミノ酸を生成せしめる条件下におくこと、 を含み、 上記二種以上の異なる炭素源は、いずれも二個以上の炭
   素原子を有し、上記二種以上の異なる炭素源の少なくと
   も一種の炭素源は隣接する二つの炭素原子が¹³Cであ
   り、上記¹³Cで標識されたアミノ酸が、隣接する二つの
   炭素原子において¹³Cを有する、上記製造法。
2. 【請求項２】上記二種以上の異なる炭素源が、酢酸とグ
   ルコースである請求項１に記載の製造法。
3. 【請求項３】上記二種以上の異なる炭素源の少なくとも
   一種の炭素源が、酢酸である請求項１に記載の製造法。