JP2902108B2 - 走査型分光光度計に於ける試薬供給を監視する方法 - Google Patents

走査型分光光度計に於ける試薬供給を監視する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、走査型分光光度計に於ける試薬供給を監視
する方法及びかかる方法に於いて有用な試薬に関する。
従来の試薬供給システムに於ける問題は、一旦反応混
合物に試薬を加えると、反応混合物中に存在する試薬の
実際量を測定することが困難である点である。これは、
血液凝固分析において特に問題となる。この型の分析で
は、トロンボプラスチン又はトロンビンの如き血液凝固
試薬をピペット中に吸引する際、空気をピペット中に吸
入する場合があり、その結果、不充分な量の試薬を分注
することになる。
上記の型の分析に伴う他の問題は、反応キュベット中
に被検血漿試料が存在するか否か容易に測定することが
できないことである。
発明の概要 従って、本発明の目的は、反応混合物に分注した試薬
の量を正確に測定する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、反応混合物中に被験試料が存在
するか否かを測定する方法を提供することである。
本発明の更に別の目的は、上記方法に於いて有用な試
薬を提供することである。
本発明は、染料が試薬中で所定の濃度になるまで試薬
に染料を添加する工程、試薬と反応して反応生成物を形
成する成分から成る反応混合物を形成させるために試薬
と試料とを混合する工程、第１スペクトル領域で反応生
成物の形成を測定する工程、染料が吸収又は蛍光の如き
光学特性を有する第２スペクトル領域で（第２スペクト
ル領域は第１スペクトル領域と異なる）反応混合物中の
染料の濃度を測定する工程、及び測定した染料の濃度に
基づいて反応混合物中の試薬濃度を決定する工程を含
む、反応混合物中の試薬濃度を測定する方法を提供す
る。試薬又は試料の着色又は濁度によってもたらされる
変動は、反応生成物又は染料のいずれもが光学特性を有
さない第３スペクトル領域での反応混合物の光学特性の
測定を用いて正規化することにより消去することが出来
る。
他の態様に於いて、本発明は目的とする反応混合物の
スペクトル領域の外側のスペクトル領域に光学特性を有
する染料を含有する血液凝固試薬を提供する。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の実施に於いて有用な染料、パテント
ブルーVFのスペクトルを示す。図に示される如く、パテ
ントブルーVF（サルファーブルー、CI42045）は、635nm
に吸収のピーク、410nmに第２ピークを有する。
図２は、トロンボプラスチンに基づくPT凝固時間反応
に於けるパテントブルーVFの効果を示す。図2aは形成さ
れた凝固のピークを、図2bは試薬中に染料を添加した場
合の同じ反応を示す。
好ましい態様の説明 本方法は、好ましくは、本出願の譲受人に譲渡された
“多重光学監視システム”と題するSwope等の同時に出
願され、係属中の米国特許出願番号07/443,952（その開
示内容を参照により本明細書に含めるものとする）中に
開示されたものの如き光学監視システムと関連して用い
る。キュベット中で種々の液状試薬と試料とを混合し反
応物を形成させ、その光学特性を監視する。このシステ
ムは、主に、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し凝
固させるためにトロンボプラスチン、トロンビン又はCa
Cl2の添加を必要とするPT試験及びAPTT試験の如き血漿
試験の遂行に用いる。
本発明に於いて、反応混合物に添加しようとする試薬
の既知量に既知量の染料を加える。試薬中の染料濃度
は、好ましくは約1/1000である。好ましくは染料はトロ
ンボプラスチン、トロンビン又はCaCl2の如き血液凝固
試薬に加えるが、染料を凝固反応又は他の反応の他の試
薬に加えてもよい。
血液凝固試薬に加える染料は、所定の波長に於ける光
吸収又は所定の波長の蛍光発光のいずれかの光学特性を
有する。いずれの光学特性を有する場合も、この染料は
反応混合物の内容物と相容性が有り、反応生成物の形成
の測定をする領域、即ち目的とする反応混合物のスペク
トル領域の外側のスペクトル領域に於いて光学特性を有
する必要が有る。
例えば、凝固分析に於ける試薬がトロンビン又はトロ
ンボプラスチンの如き血液凝固剤であり試料が血漿であ
る場合、被検血漿にトロンビンを加える前に、青色染料
の如き好適な光吸収性染料をトロンビンに加えることが
出来る。この目的に好ましい染料は、図１に示す如きス
ペクトルを有するパテントブルーVFである。このスペク
トルからわかるように、パテントブルーVFは、凝固分析
に於いて血液の凝固が分光光度計により一般的に監視さ
れる領域、即ち400〜550nmの範囲で高い透過度、従って
低い吸収を有するが、635nmの領域に於いては高い吸収
を有する。染料の吸収の正確な範囲は重要ではないが、
好ましくは染料は400〜550nmの領域に於いてあまり吸収
せず、この領域の外側の範囲で顕著に吸収するのが良
い。
染料が吸収する波長で反応混合液中の染料濃度を監視
することにより、反応混合物中のトロンビン濃度を決定
することが出来る。染料の波長に於ける過大な吸収の表
れは、トロンビンを血漿に加える前にトロンビンが十分
に希釈されていなかったか、又は反応混合物中に血漿が
存在しないか又は正しい割合で存在しないかを示す。反
応に、染料の波長に於ける過小な吸収は、トロンビンの
添加が不十分であるか、又は反応混合物に血漿が過剰に
存在することを示す。
分光光度計により染料の波長で過大又は過小のいずれ
かの吸収が測定された場合、分光光度計は表示又は印刷
の手段によって操作者に問題点を警告する。いずれかの
試薬に適当な染料を加えた後、試薬の供給後短時間のあ
いだ適切な波長で吸収を監視することにより、血漿及び
試薬の両者が反応混合物中に存在するか否かを知るに充
分な程度に試薬と血漿との合計量を算定することが出来
る。
水の如く清澄ではない試料又は試薬の場合、染料又は
反応により影響されない第３領域で透過度を測定する複
色光分析法を用いることが好ましい。これを用いること
によってすべての分析前変数を消去し、機器、試料及び
試薬間の変動に対して分析を標準化することができる。
その間、染料の濃度及び従って試薬の濃度を測定し、同
時に反応が進行して結果も決定されるという利点も得ら
れる。
複色光を用いた分析にとって好ましい染料は、635nm
に第１ピーク、410nmに第２ピークを有するパテントブ
ルーVF（CIフードブルー３、＃42045）である。反応
（凝固形成）を阻害しないこと、血漿の存在によって影
響されない波長で透過度のピークを有すること、治療薬
物（例えばヘパリン）と反応しないこと、及び塩化カル
シウム、トロンボプラスチン、トロンビン又はこの分析
に用いる他の試薬との相容性を有することという基準を
満たす、パテントブルーVFの誘導体又は他の染料も用い
ることができる。
複色光分析法は、３種類の波長領域に於ける透過度の
測定に依存する。第１の測定は、この特定の分析によっ
て影響される波長で行う。例えば、血液の凝固は400〜5
50nmの領域に於ける吸収により測定される。第２の測定
は、染料が光を吸収するが反応によって影響されない領
域で行う。例えば、635nmはパテントブルーVFのスペク
トルのピークである。第３の測定は、染料又は反応によ
って影響されないスペクトル領域で行う。本発明者等
は、血液凝固分析のために705〜715nmの領域を選んで第
３の測定を行なった。しかしながら、反応及び染料によ
って影響されない他のいかなる領域をも選択することが
出来る。上記の例として、第３の測定を、250nm等の400
nm未満で行うことが出来る。
染料濃度の決定を標準化するために、試料及び試薬の
透過度特性を、染料濃度＝ｒ（635nm）/r（705nm）（こ
こでｒは反応ゼロ時間のシグナル／水のシグナルを表
す）の式を用いて正規化する。キュベット中の水のシグ
ナルでｒ値を割ることにより、機器間の変動を補正して
決定が正確になる。染料濃度の算定に於いて、ｒ（635n
m）をｒ（705nm）で割ることにより、試料又は試薬の濁
度又は色密度による干渉及び透過度に関して補正をす
る。これは、利用可能な光源に於ける変動を調整する。
実際上、光源に於ける変動又は、反応混合物を生成する
いかなる材料の透過度に於けるいかなる変化をも調整す
る。
血漿の凝固分析の好ましい例では、705nmの光の波長
で吸収を測定しかかる試料での変動を補正する。光が試
料によって吸収される波長である限り、700nm〜715nmの
ような705nmを含む波長の範囲内で同様の結果を得るこ
とが出来る。例えば、特にビリルビンの如き汚染物質に
由来する血漿の濁度又は光密度は、およそ705nmの波長
の範囲で光の吸収を起こす。染料の吸収はパテントブル
ーVFの場合635nmの範囲であり、これらの血液凝固分析
の場合クロットの吸収は400−550nmの範囲であることか
ら、705nmに於ける吸収に関しての調整は、試料中の汚
染物質に由来する変動性を消去する。
前記は特定の試薬及び反応混合物についてであるが、
本発明は他の適当な試薬及び反応混合物についても実施
することが出来る。更に、複数の試薬の添加は、主な吸
収の波長が異なる染料を試薬に添加して反応混合物中の
各染料の濃度をモニターすることにより監視することが
出来る。
光吸収染料についての上記の考察と同様の方法で、反
応混合物の目的とする領域の外側の領域で蛍光を発する
染料を血液凝固剤に加えることが出来る。蛍光染料を光
吸収染料の代りに用いる場合、試薬の濃度は、蛍光の生
じる特定の波長で光の存在を測定することにより監視さ
れる。この目的にとって好適な蛍光染料は、スペクトル
の赤色領域で蛍光を発するローダミンＢである。蛍光染
料は、好ましくは、反応混合物の目的とする領域では有
意に光を吸収しないが、スペクトルのいずれかの波長で
は光を吸収してもよい。
実施例Ｉ APTT試験： CaCl2中の8mg/リットル濃度のパテントブルーVFとCaC
l2の対照ロットをCoag−Ａ−MateX2（Organon Teknika
社）上で比較した。染料が存在する場合、染料の透過度
と一致するほぼ620nmでX2光学系が凝固形成を検出する
という事実に起因する凝固時間の１％の増加が生じた。
又、CaCl2染料溶液も565nmで評価した。染料が存在する
場合、565nmでの波形に於いて顕著な相違は検出されな
かった。試料中の染料の最終濃度は、約50％の透過度に
相応する3mg/リットルであった。
実施例II PT試験： パテントブルーVFを、最終的な試料中の濃度が0.75mg
/リットルになるように1.15mg/リットル濃度でトロンボ
プラスチンに加えた。染料をトロンボプラスチンに加え
た場合、PT凝固時間の１％から２％の増加が生じた。染
料が存在する場合、565nmに於ける波形に顕著な相違は
検出されなかった。クロット形成の検出は、本質的に染
料により影響されなかった。
上記の本発明が、種々変形及び改変できることは明白
である。本発明の範囲は添付のクレームに示されてお
り、それらのクレームの均等の範囲内の変形例は本願発
明に含まれるものである。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/77 G01N 21/78

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】染料が試薬中で所定の濃度になるまで試薬
    に染料を添加する工程、 試薬と、前記試薬と反応して反応生成物を形成する成分
    を含む試料とを混合して反応混合物を形成させる工程、 第１スペクトル領域で反応生成物の形成を測定する工
    程、 染料が光学特性を有し、第１スペクトル領域と異なる第
    ２スペクトル領域で、反応混合物中の染料の濃度を測定
    する工程。 反応生成物又は染料のいずれもが光学特性を有しない第
    ３スペクトル領域で反応混合物の透過度を測定する工
    程、及び 測定した染料の濃度に基づいて反応混合物中の試薬濃度
    を決定する工程、 を含むことを特徴とする、反応混合物中の試薬濃度を測
    定する方法。
  2. 【請求項２】染料が第２スペクトル領域に於いて光を吸
    収することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】染料が第１スペクトル領域に於いて実質的
    に光を吸収しないことを特徴とする、請求項２に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】染料又は反応生成物のいずれもが第３スペ
    クトル領域に於いて実質的に光を吸収しないことを特徴
    とする、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】試薬がトロンボプラスチンを含み、試料が
    血漿を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】試薬がトロンビンを含み、試料が血漿を含
    むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】試薬がCaCl2を含み、試料が血漿を含むこ
    とを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】染料がパテントブルーVFを含み、第２スペ
    クトル領域が約635nm領域にあることを特徴とする、請
    求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】染料が第２スペクトル領域に於いて蛍光を
    発することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】染料がローダミンＢを含むことを特徴と
    する、請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】試料が、添加反応混合物に加えられたか
    否かを、反応混合物中の染料濃度に基づいて決定する工
    程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】添加された染料が試薬の約1/1000の濃度
    であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】約400nm〜550nmの範囲の外側の領域に光
    学特性を有する染料を含有する血液凝固試薬を含む組成
    物。
  14. 【請求項１４】当該血液凝固試薬がトロンビンを含むこ
    とを特徴とする、請求項13に記載の組成物。
  15. 【請求項１５】当該血液凝固試薬がトロンボプラスチン
    を含むことを特徴とする、請求項13に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】当該血液凝固試薬がCaCl2を含むことを
    特徴とする、請求項13に記載の組成物。
  17. 【請求項１７】当該染料が、約400nm〜550nmの範囲の外
    側の領域で光を吸収することを特徴とする、請求項13に
    記載の組成物。
  18. 【請求項１８】当該染料が、約400nm〜550nmの範囲の外
    側の領域で蛍光を発することを特徴とする、請求項13に
    記載の組成物。
  19. 【請求項１９】当該染料がパテントブルーVFを含むこと
    を特徴とする、請求項13に記載の組成物。
  20. 【請求項２０】当該染料がローダミンＢを含むことを特
    徴とする、請求項18に記載の組成物。
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