JP2820785B2 - クロマトグラフアッセイ用多孔質膜装置およびその製法 - Google Patents

クロマトグラフアッセイ用多孔質膜装置およびその製法

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、イムノクロマトグラフィーアッセイ装置に
有用な多孔質膜に関する。さらに詳しくは、疎水性を回
避したラミネート化ニトロセルロース膜に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 多孔質膜、とりわけニトロセルロース膜は、精製、分
析法および免疫診断などの生化学的手順に用いられてい
る。よく知られているウエスタンブロッティングは一つ
の例に過ぎない。ニトロセルロース膜はまた、ヨーロッ
パ特許出願公開EP−Ａ−229,428号明細書（アボット・
ラボラトリーズ）に開示されているようなイムノクロマ
トグラフィーアッセイにも用いられている。
ニトロセルロース膜に付随する問題の一つは、機械的
強度が弱いことである。クロマトグラフィー膜に付随す
る他の問題は、クロマトグラフィー中に流体が蒸発して
しまうことである。機械的強度を大きくして蒸発を最小
にするために、ミラール（Mylar）などの支持体物質に
ニトロセルロース膜をラミネートしている。しかしなが
ら、そのようなラミネートに用いる接着剤は、しばしば
ニトロセルロースの親水性の性質に悪影響を与え、時間
の経過とともに不安定にする。ニトロセルロース膜のラ
ミネートに用いる幾つかの接着剤では、該膜の孔中での
毛管流速の減少によって測定されるように、親水性の低
下を引き起こすことがわかっている。
多孔質膜を支持体にラミネートすることにより膜の親
水性がなぜ失われるのか確かなことことはわかっていな
いが、接着剤から多孔質膜中へ成分が拡散もしくは移動
することにより親水性が失われるものと思われる。その
機構がどのようなものであれ、親水性が時間とともに失
われることは事実であり、本明細書でも第４図および実
施例１に記載してある。このことは、妥当な貯蔵期間に
わたって安定性を保持しなくてはならないので、診断ア
ッセイを製造するに当たって重大な問題である。
湿潤性を改善するために、膜に湿潤性を付与する濃度
にてある種の界面活性剤を該膜に加えることもできる
が、界面活性剤はまた該膜上に存在する生物学的に活性
な試薬を崩壊させることが知られている。たとえば、膜
がタンパク質（たとえば抗体）を結合する能力は、診断
的応用に重要である。それゆえ、膜がタンパク質に結合
する能力とともに膜の親水性の性質を保持したまま、界
面活性剤を含ませた膜を提供することが、本発明の重要
な側面である。
本発明の目的はまた、親水性の性質を保持しながらニ
トロセルロース膜に機械的強度を付与するラミネート法
および物質を考案することにある。本発明の他の目的
は、ニトロセルロース膜の親水性を高め、広範囲のラミ
ネート接着剤に対する安定性を付与するために、さらに
界面活性剤を用いることにある。
（課題を解決するための手段） 一つの観点において、本発明は、湿潤性の多孔質膜を
水性溶媒ベースの接着剤を用いて該膜の少なくとも１つ
の側面にて支持体にラミネートし、生物学的に活性な試
薬と接触させてその試薬の活性を保持させていることを
特徴とする、診断アッセイに有用な固相装置に関する。
好ましくは、多孔質膜はニトロセルロースからなり、接
着剤はアドヒーシブリサーチ（Adhesive Research）AS7
3からなる。膜には、界面活性剤、好ましくは硫酸アル
キルまたスルホン酸アルキル（アルキル鎖の炭素数は１
〜約16）を含ませてよい。水性溶媒ベースの接着剤を用
い、膜の片側または両側にてラミネートする。
他の観点において、本発明は、分析対象物の存在また
は量を決定するための診断アッセイに有用な、ラミネー
トした湿潤性固相支持体の製造方法であって、 （ａ）界面活性剤を約0.01％〜約10％（w/w）の濃度に
て含ませた多孔質膜を、水性溶媒ベースの接着剤を用い
て支持体にラミネートし、ついで （ｂ）該膜中でその活性が保持されるように、該多孔質
膜の特定部分に生物学的に活性な試薬を接触させる ことを特徴とする方法を包含する。
好ましい膜および界面活性剤は上記の通りである。好
ましい支持体は、半剛体のポリエステルまたはポリオレ
フィンプラスチックからなる。本発明の方法には、水性
溶媒ベースの接着剤を用いて該多孔質膜のもう一方の側
をラミネートする工程が含まれていてよい。生物学的に
活性な試薬は、酵素、または抗体や核酸などの結合相手
であるのが好ましい。
最後に、本発明は、湿潤性多孔質膜固相を用いて試料
中のリガンド−分析対象物の存在または量を決定する方
法であって、 （ａ）約0.01％〜約10％（w/w）の濃度にて界面活性剤
を含ませ、水性溶媒ベースの接着剤を用いて支持体にラ
ミネートした湿潤性多孔質膜の特定部分に、該リガンド
と結合し得るリガンドレセプターを固定化し、 （ｂ）工程（ａ）の膜の特定部分を試料と接触させてリ
ガンド／リガンドレセプター複合体を該膜上に生成さ
せ、ついで （ｃ）該複合体の存在または量を検出して分析対象物を
測定する ことを特徴とする方法に関する。
好ましい膜および界面活性剤は上記の通りである。一
つの態様においては、一方の側のみをラミネートし、膜
を試料に浸漬することにより該特定部分を試料と接触さ
せる。他の態様においては、膜の一端を試料と接触さ
せ、毛管作用により試料を該膜中を該特定部分まで移動
させることにより、該特定部分を試料と接触させる。こ
の態様においては、膜の両側をラミネートする。いずれ
の場合も、リガンド／リガンドレセプター複合体の検出
は、検出可能なシグナルを生成し得るトレーサーと接触
させることにより行う。このシグナルは、コロイド結合
体または同位体結合体の場合のように直接検出し得るも
のであっても、酵素結合体を用いて間接的に検出するも
のであってもよい。このシグナルは、目に見える色、化
学ルミネセンス、または蛍光であってよい。
以下、添付の図面を参考にしながら本発明をさらに詳
しく説明する。
第１図は、本発明の態様の一例を示す。改良された多
孔質膜（10）が、少なくとも一方の側で支持体（14）上
にラミネートされている。この膜（10）は、接着剤層
（12）により支持体（14）に保持されている。本発明の
多孔質膜には界面活性剤が含まれており、この界面活性
剤により該膜に湿潤性が付与されるが、該膜と接触して
いる生物学的に活性な試薬の活性を損なうことはない。
「生物学的に活性な試薬」には、酵素、核酸、および
天然の形態で活性を有する他のタンパク質などが含まれ
る。好ましい態様における試薬は一般にタンパク質であ
るので、本明細書において「タンパク質」なる語はしば
しば生物学的に活性な試薬の代わりに用いられる。しか
しながら、本発明はタンパク質に限られるものではな
い。同様に、タンパク質は該膜に固定化されていてもよ
いし、または単に該膜と接触しているだけであってもよ
い。該試薬が、該膜と接触し、界面活性剤が該膜中に存
在しているときに、天然の活性を保持していることが重
要である。
本発明の多孔質膜は、タンパク質を固相に接触させる
かまたは固定化させて流体試料と接触させるような、数
多くの生化学的方法において有用である。一つの系にお
いては（第１図参照）、該膜の一方の側においてのみラ
ミネートし、反対側の表面上の特定部分（15）にタンパ
ク質を適用し、流体を該反対側から接触させる。「ドッ
トブロッティング」（ヨーロッパ特許出願公開EP−Ａ−
063,810号明細書参照）がこのタイプの方法の例であ
る。
他の系においては（第２図参照）、膜を最終的に両側
でラミネートし、薄層クロマトグラフィーのように流体
を膜中を縦方向に流れるようにする。膜（10）を一方の
側でラミネートし、タンパク質を該膜上の特定部分（図
示していない）上に固定化し、第二の支持体（16）およ
び接着層（18）からなる第二のラミネートを反対側に適
用する。このタイプの方法の例は、ヨーロッパ特許出願
公開299,428号明細書中に記載されている。
本明細書において頻繁に用いられる「親水性」および
「湿潤性」なる語は、「疎水性」の反対語として互換的
に用いている。「親水性」を測定するために数多くの方
法を用いることができる。本発明の好ましい態様の膜は
薄層クロマトグラフィーのストリップと類似しているの
で、親水性はここでは溶媒フロントが該膜ストリップを
横切る速度として測定される。ダーシーの法則（Darcy'
s law）で溶媒フロントが移動した距離を時間（ｔ）と
関係付けることにより速度が得られる。一定距離（Ｌ）
に対しては、関連して測定を要するのは該フロントがＬ
に達するのにかかる時間である。親水性の相対的な測定
は、処理したラミネート膜の上記時間または上記時間に
対する「毛管（wicking）」速度を未処理のラミネート
膜の毛管速度と比較することにより得られる。本発明の
目的のためには相対的な親水性が充分であるが、流速
が、溶媒フロントが迅速な診断アッセイと矛盾しない時
間内（すなわち、10分未満、好ましくは５分未満）で結
果を視覚化させ得る長さ（すなわち、２〜10cm）を横切
るようなものである場合にも膜は「親水性」であるとさ
れる。
加えて、膜がタンパク質を結合する能力が本発明にと
って重要である。未処理膜は、おそらく疎水性のタンパ
ク質残基を介して、おそらくは該タンパク質と該膜との
間のイオン相互作用または水素相互作用によりタンパク
質を結合させる（ニトロセルロースは、その硝酸塩基に
より部分的に負の荷電を有していることが知られてい
る）。膜がタンパク質を結合させる相対的な能力は、タ
ンパク質として抗体を用い、既知の一定量の分析対象物
からシグナルの相対強度を決定する数多くの免疫学的方
法により決定することができる。
タンパク質の膜への接触は、数多くの方法により行う
ことができ、たとえば乾燥法、架橋法、共有結合付着法
および吸着法などが挙げられるがこれらに限られるもの
ではない。タンパク質はピペットから適用することがで
き、または一層好ましくは、ラミネートする前に前の特
定部分上／中に噴出させることができる。タンパク質
は、その活性が保持されている限り、固定化されてもよ
いし、また溶媒フロントとともに移動してもよい。
（１）膜物質： 「多孔質膜」とは、毛管作用により流体が流れること
のできる孔を有する膜状物質を意味する。膜の例として
は、ニトロセルロース、焼結ポリエチレン、ポリプロピ
レンまたはポリビニリデンジフルオライド（PVDF）など
の焼結プラスチックが挙げられる。多孔質膜は、約0.4
マイクロメータ（「μｍ」または「ミクロン」）〜約10
μｍの範囲の種々の孔径で利用することができる。免疫
診断のためには、大きな孔径（すなわち５μｍ）が流体
の流速が高く、より迅速なアッセイを行うことができる
ので現在のところ好ましい。
本発明のためには、好ましい多孔質膜はニトロセルロ
ースである。ニトロセルロース膜は、ゲルマン・サイエ
ンスィズ（Gelman Sciences）、アンアーバー、MI;ミリ
ポア（Millipore）、ベッドフォード、MA;シュラヒャー
・アンド・シュエル（Schleicher and Schuell;S＆
Ｓ）、キーン、NH;サルトリウス・ゲゼルシャフト・ミ
ット・ベシュレンクター・ハフトゥング（Sartorius Gm
bH）、ゲッチンゲン、西ドイツ；およびミクロン・セパ
レーションズ（Micron Separations,Inc.;MSI）、ウエ
ストボロー、MAを含む数多くのとこから市販されてい
る。これらニトロセルロースの市販源は、約0.45μｍ〜
約５μｍの孔径を有する膜を製造している。市販のニト
ロセルロース膜には、下記のように、登録商標を有する
界面活性剤を含まれていてよい。
PVDF膜は、ミリポアから入手可能である。これらの膜
もまた、約0.22〜約2.0μｍの範囲の幾つかの孔径で入
手することができるが、他の孔径も利用できるようにな
るかもしれない。PVDFは、一般にニトロセルロースに比
べて疎水性が大きい。その結果、タンパク質を一層強固
に結合させるが、一般に湿潤性は悪く、毛管速度もよく
ない。親水化した生成物、ジュラポア（Durapore）は、
ミリポアから種々の孔径範囲で入手できる。
（２）支持体ラミナ（Support Laminae）： 本発明の目的に対して、「ラミネート」または「膜ラ
ミネート」なる語は、支持体に結合した膜をいう。「ラ
ミナ」なる語は、膜の結合している支持体層をいい、関
連する接着剤層および保護リリースライナー（Protecti
ve release liner）を含む。
膜ラミネートの製造法の一つには、モノコート（Mono
kote）［トップ・フライト（Top Flight）、シカゴ、IL
より入手可］のような熱感ラミナを使用することが含ま
れる。この特定の生成物を用い、膜を支持体のそばに置
き、表面に熱を加えて２つの層を結合させる。この方法
の有利な点は、膜の親水性を保持するためにさらに界面
活性剤を必要としないことである。これは、妥当な貯蔵
時間にわたって安定のままである。しかしなが、熱を加
えることにより、膜にすでに結合していたタンパク質が
不活化されるので現在のところ好ましい方法ではない。
加えて、感圧ラミナを用いれば製造工程を簡略化するこ
とができる。感圧ラミナは、圧力をかけると膜に付着さ
れる。
本発明において有用なラミナとしては、ポリエステル
類（ミラールなど）ポリオレフィン類および匹敵する引
っ張り強度を有する同様のプラスチック類が挙げられ
る。すでに記載したように、支持体ラミナは、多孔質膜
の機械的強度を増強し蒸発を抑止するために用いる。第
３図に示すように、典型的なラミナは、接着性物質の層
（12）でコーティングされた支持体層（14）からなり、
該接着性物質の層（12）はさらにリリースライナー（2
0）で覆われている。一般に、リリースライナーは紙、
ポリエステルまた同様の物質であり、シリコーンや、接
着剤が該リリースライナーにしっかりと結合するのを防
ぐ他の同様の物質のコーティングを有する。「移動（Tr
ansfer）接着剤」は、２つのリリースライナー間にはさ
まれた接着剤層として利用できる。これらは、支持体層
を分離して使用するのが好ましくないような特別の場合
に用いることができる。
支持体の厚さが50〜200mils、好ましくは100〜150mil
sのポリエステル支持体ラミナが、容易に入手できるの
で現在のところ好ましい。たとえば、そのようなラミナ
は、フレキシコン（Flexcon）、スペンサー、MAおよび
アドヒーシブ・リサーチ（Adhesive Research,Inc.）、
グレンロック、PAから入手できる。
支持体ラミナを製造するには、一般に、リリースライ
ナーの一つの表面上に接着性化合物をコーティングし、
オーブン中で乾燥させる。ついで、この乾燥した接着剤
を支持体層と接触させて支持体層を生成させる。
（３）接着剤： 接着剤は、シールズ（Shields,J.）のAdhesive Handb
ook、第３版（改訂1985）中に記載されており、一般に
溶媒中の粘着付与剤形と組み合わせた接着性化合物から
なる。接着性化合物としては、ポリメチルメタクリレー
トなどのアクリル樹脂、ゴム物質およびシリコーン樹脂
などが挙げられる。他の接着ポリマーおよび粘着付与剤
は、当業者に知られている。溶媒は有機ベースであって
も水性ベースであってもよい。たとえば、第Ｉ表に示し
たフレキシコン接着剤V23は有機溶媒ベースの（OSB）接
着剤であり、フレキシコンV95およびV170、および3M＃3
96もそうである。対照的に、アドヒーシブリサーチ（A
R）接着剤AS73（たとえば、製品No.7279）、カゼイン、
ポリ酢酸ビニル（PVA）およびポリビニルピロリドン（P
VP）は有用な水性溶媒ベースの（WSBA）接着剤である。
市販の接着剤の正確な組成についてはラミナ製造業者
によって明らかにされないことがしばしばあるが、本発
明は本明細書中に引用した容易に入手可能な接着剤を用
いて行うことができ、これら接着剤は指定の製造業者か
らの数字で注文することができる。にもかかわらず、本
発明の範囲は記載した特定の接着剤に限定されるもので
はない。
接着剤の例示を第Ｉ表に挙げてある。OSBフレキシコ
ンラミネート、ある種のニトロセルロースロットとはう
まく機能した（すなわち、タンパク質の結合を示すシグ
ナルを保持しながら、経時的に改良された安定性を示
す）が他のものとはうまく機能しなかったことに注意す
ることが重要である。特に、フレキシコンPM100CM/V23/
71PMO（「71PMO」）、ロットNo.1NF3310−33A199011は
Ｓ＆ＳニトロセルロースロットNo.4403/8260および6419
/8921とはうまく機能したが、Ｓ＆ＳロットNo.4406/822
1および4403/8221とはうまく機能しなかった。同様に、
フレキシコンラミナPM150C/V23/ポリSC−９（「ポリSC
−９」）、ロットNo.7ZD3546−33A209841はＳ＆Ｓニト
ロセルロースロットNo.6419/8921とはうまく機能した
が、残りの３つのロットのいずれともうまく試験されな
かった。対照的に、WBS接着剤AR7279/AS73は、一般に、
界面活性剤の加えなくとも、ほとんどのブランドのニト
ロセルロースと良好な安定性を示した。
この結果は、ニトロセルロース膜中に含まれる専用の
界面活性剤の性質および量に及ぼす接着剤溶媒ベースの
影響によるものと思われる。本件出願人はいかなる特定
の理論または機構に限定されることを意図するものでは
ないが、OSB接着剤がある種の疎水性の有機溶媒を膜中
に放出し、親水性の低下をきたしたものと思われる。ま
たは、この疎水性は、支持体層からの可塑剤が接着剤層
を通って膜中に移動した結果、引き起こされたのかもし
れない。
WBS接着剤から放出される水は膜に対しこのような有
害な作用を及ぼさないが、WBS接着剤は水性試料と接触
したときに溶解し、その結果、脱ラミネートおよびラミ
ネート装置の破壊を引き起こすと思われた。しかしなが
ら、驚くべきことに、WBS接着剤は膜ラミネートの破壊
を引き起こさず首尾よく用いることができることがわか
った。
感熱モノコート製品中に含まれる接着剤もまた、試験
したほとんどのニトロセルロースブランドに対し安定で
あった。
それゆえ、WBS接着剤は一般に、市販の「在庫の」ニ
トロセルロース膜に対して安定なラミネートを生成す
る。しかし、使用可能なニトロセルロースおよび支持体
ラミナの複数の入手源を確保するため、もっと多くの製
品が安定に湿潤性ならびにタンパク質結合能を保持する
ように、市販のニトロセルロースを処理する方法を見出
すことが望まれる。それゆえ、ラミネート後にニトロセ
ルロースがOSB接着剤に対して疎水性になるのを抑止し
得るような界面活性剤を開発することを始めた。
（４）界面活性剤： 若干驚くべきことではあるが、すべての界面活性剤が
必ずしもタンパク質を結合する能力に影響を与えること
なしに湿潤性のニトロセルロースを生成できるものでは
ないことがわかった。一般に、タンパク質活性を許容し
得る濃度で加えた界面活性剤は、膜の湿潤性に対して経
時的に全くまたは殆ど改善を示さなかった。第４図から
わかるように、典型的なラミネートは、経時的な親水性
の低下として定義される不安定性を示した。ラミネート
は妥当な貯蔵寿命を有していなければならないので、膜
の湿潤性を保持することは必須である。試験した多くの
界面活性剤は、安定性を改善しなかったか、またはタン
パク質への結合能力が低下したか、またはその両方がみ
られた。安定性が不良であること、またはタンパク質活
性が不良であることは、いずれもラミネートを使用に適
さないものにした。
加えて、驚くべきことに、界面活性剤を膜に適用する
ビヒクルもまた膜の安定性を改善する能力に影響を与え
ることがわかった。すべての界面活性剤がすべてのビヒ
クルに可溶なわけではないが、一般的に、水ビヒクルか
ら適用した界面活性剤の方がイソプロパノールビヒクル
から適用した界面活性剤よりもうまくいった。界面活性
剤の非限定的例示を第II表に挙げる。これらは、非イオ
ン性、カチオン性、アニオン性、双性イオン性または帯
電防止剤として特徴付けられる。第II表にはまた、界面
活性剤を適用するビヒクル、および膜がタンパク質を結
合する能力を保持しながら膜が経時的に疎水性になるの
を抑止する能力として測定される界面活性剤の効果の結
果をも示す。結果は、処理膜が良好なタンパク質活性シ
グナルを示し、かつ安定な経時的毛管速度を保持した
（親水性を保持したことを示すものとされる）場合にの
み「＋」とした。第II表中のデータはまた、下記実施例
中においても検討する。
第II表からかるように、２つのクラスの界面活性剤が
膜の安定性を改善するのに成功したように思われる。第
一のクラスは、水ビヒクルから適用したアニオン性の界
面活性剤である。アニオン界面活性剤は、非極性の尾部
に結合した負に荷電した極性頭部からなっている。極性
の頭部は、一般に、硫酸塩、スルホン酸、リン酸塩、ま
たはカルボン酸塩基からなる。非極性の尾部は、概して
１〜約16個の炭素原子を有する炭化水素鎖からなる。こ
の尾部は、分枝鎖であってもよいし直鎖であってもよ
く、また他の非極性の置換基を有していてもよい。尾部
の長さは１〜約12炭素原子であるのが好ましく、１〜約
８炭素原子であるのが最も好ましい。アニオン界面活性
剤は、一般にナトリウム塩またはカリウム塩として多く
の入手源から市販されている。好ましいアニオン界面活
性剤は、炭素数が１〜８の硫酸アルキルまたはスルホン
酸アルキルである。
アニオン界面活性剤に加えて、帯電防止剤の一つであ
るシアスタット（Cyastat）LSが、ニトロセルロースとP
VDF膜の両方に対してうまく機能した。このクラスの帯
電防止剤は以下、「シアスタット様」と称するが、トリ
メチルアンモニウムカチオン頭部に結合した非極性の鎖
R1と、低級アルキル基R2に結合した極性のアニオンとが
対になったものである。R1としては、炭素数が８〜約20
の直鎖または分枝鎖が挙げられる。R1はまた、シアスタ
ットLSのアミド残基のような、他の置換基を有していて
もよい。R2は、炭素数１〜約５の直鎖または分枝鎖アル
キル側鎖を表す。極性アニオンとしては、アニオン界面
活性剤にみられるいかなるアニオンであってもよいが
（上記）、硫酸塩が現在のところ好ましい。
何故、アニオン性アルキル硫酸塩と対になったカチオ
ン性界面活性剤のように思われるこれらシアスタット様
剤では良い結果が出たのに、同様のカチオン性界面活性
剤のブロマイド塩では失敗したのかは完全にはわかって
いない。しかしながら、アルキル硫酸塩の有しているア
ニオン性界面活性剤としての性質が重要な役割を果たし
たものと思われる。このことは、比較的短い非極性尾部
を有するアニオン性界面活性剤もまた非常に良い結果が
得られるであろうことを示唆している。カチオン性界面
活性剤のブロマイド塩が失敗したのは、イソプロパノー
ルビヒクルのせいであることも考えられる。
使用する界面活性剤の濃度は、特定の界面活性剤に依
存して0.01％〜約10％（w/w）であってよい。一般に、
ニトロセルロースに対しては、アニオン性界面活性剤は
0.1％〜約８％（w/w）の濃度で使用するのが好ましく、
約0.25％〜約3.5％（w/w）の濃度で使用するのが最も好
ましい。PVDFはまず第一に疎水性がより大きいので、わ
ずかに高い処理濃度（w/w）が好ましいが、変換係数が
減少していることにより部分的に相殺される。最終的に
好まし濃度は約1.0％〜約10％（w/w）であり、約２％〜
約５％（w/w）であるのが最も好ましい。
シアスタット様剤は、膜に依存して約0.01％〜約10％
（w/w）の範囲の濃度で使用するのが好ましい。ニトロ
セルロース膜に対しは、これら剤の好ましい濃度は約0.
1％〜約2.0％（w/w）であり、最も好ましい濃度は約0.2
％〜約0.5％（w/w）である。PVDF膜とともに用いる場合
は、好ましい濃度は約２％〜約10％（w/w）の範囲であ
り、最も好ましい濃度は約５％〜約９％（w/w）であ
る。最終濃度（w/w）は、第Ｉ表の注に示したように、
一定の変換係数により処理溶液濃度（w/w）から得るこ
とができる。
試験した最終的な膜には、特定の膜製造業者により用
いられる専用の界面活性剤がいかなるものであっても、
発明者らの手により加えられた界面活性剤で処理された
ことにより失われるよりも少ない量の界面活性剤が含ま
れていた。それゆえ、アニオン性界面活性剤について％
（w/w）で示した本願における界面活性剤の濃度には、
製造業者によって膜に加えられていたかもしれないアニ
オン性界面活性剤に対し約0.01〜約３％の許容量が含ま
れている。これらは、５μｍの市販膜について行った抽
出研究に基づいて評価され、下記のように約0.01％〜約
11％（w/w）の範囲であった。
MSI 9.3％〜11.3％ Ｓ＆Ｓ 0.75％〜2.2％ サルトリウス 0.01％〜1.15％ シアスタットタイプの剤が膜製造業者により加えられ
ていたかどうかは疑わしいので、この剤について掲げた
％については同様の許容は行わない。
（５）方法： 本発明による膜の製造方法については、上記説明およ
び関連実施例から明白である。一般に、界面活性剤処理
したニトロセルロースの全シートを一度ラミネートし、
ついで所望の幅のストリップにカッティングする。シー
トを平らな表面上に置き、リリースライナーを所望のラ
ミナから取り除く。このラミナを、しわができないよう
に注意しながら上記膜上にプレスする。約7.0ポンド圧
を加圧可能なローラーを用い、ラミナを膜に接着させ
る。ついで、所望の幅のストリップを該シートからカッ
ティングする。
界面活性剤はラミネート後（一方の側の）に膜に含ま
せることができるが、ラミネート前に界面活性剤を含ま
せるのが好ましい。
驚くべきことに、膜の反対側も同様の手順に従ってラ
ミネートすることができる。この場合、タンパク質の添
加は第二のラミネートの前に必ずしておかなくてはなら
ない。タンパク質は膜の表面に加えるので、ラミネート
に伴なうタンパク質の安定性の問題は、同じ膜のこの第
二のラミネート操作において最大になることが考えられ
る。しかしながら、本発明の方法および組成物を用いる
ことにより、イムノクロマトグラフィーストリップの両
面をラミネートできることがわかった。このことから、
汚染物質を斥け、試料流体の蒸発を抑制するという利点
がさらに得られる。両側をラミネートする場合は、隣接
する成員またはゾーンと接触させるために、一般な片方
の小さなセクション（約1/4インチ）をラミネートしな
いまま残しておく。
本発明の装置を使用する方法もまた、上記で説明し
た。詳しい上方は、当業者がヨーロッパ特許出願公開EP
−Ａ−299,428号明細書を参照することにより得られ
る。本発明の装置は、抗原性の分析対象物を膜上のタン
パク質抗体により捕捉するクロマトグラフィーイムノア
ッセイにおいて最も効果的に使用できる。捕捉されたリ
ガンド／分析対象物は、ついで抗リガンド抗体とシグナ
ル生成物からなるトレーサー結合体により検出される。
シグナルは、同位体標識やコロイド標識などのように直
接生成させることもできるし、または酵素標識のように
間接的に生成させることもできる。これらの技術は、競
合アッセイプロトコールがそうであるように、すべて当
該技術分野でよく知られている。
つぎに、実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明
するが、本発明はこれに限られるものではない。
実施例１ フレキシコンから入手した溶媒ベースのアクリル酸接
着テープ（PM100CM/V23/71PMO）を用い、ニトロセルロ
ース膜（シュライヒャー＆シュエルから入手した孔径５
ミクロンのもの）を両側でラミネートし、22℃、37℃お
よび45℃で貯蔵した。種々の時間間隔で（０日、７日、
14日、21日、28日、56日、84日、112日など）、ラミネ
ートした膜１〜3mmのストリップを試験溶液（0.1Mトリ
スpH7.4、0.9％NaCl、フェノールレッド）中に浸漬し、
溶液フロントが5.4cmの距離を移動するのに要する時間
を測定することにより膜の親水性を試験した。親水性の
大きな膜は、液体が5.4cm移動するのに要する時間が短
い。第４図の結果は、すべてのラミネート膜が経時的に
親水性が低下したこと、および貯蔵温度を高めると親水
性の喪失の起こる速度が増大することを示している。
実施例２ フレキシコンから入手した溶媒ベースのアクリル酸接
着（V23）テープであるPM100CM/V23/71PMOおよびPM150C
/V23/ポリSC9、およびアドヒーシブ・リサーチから入手
した水のベースのアクリル酸接着（AS73）テープである
AR7279/AS73を用い、ニトロセルロース膜（実施例１と
同様）を両側てラミネートした。２種のフレキシコンテ
ープの主要な違いは、リリースライナー71PMOが紙リリ
ースライナーであるのに対してポリSC9はポリエステル
リリースライナーであることである。AR7279/AS73はポ
リエステルリリースライナーを有する。これら膜を37℃
でインキュベートし、実施例１に記載のようにして試験
した。その結果は、下記の通りである。
AR7279/AS73でラミネートした膜は、168日後でも親水
性が低下しなかった。PM100CM/V23/71PMOでラミネート
した膜は、約140日後に約２の係数で親水性が低下し
た。PM150C/V23/ポリSC9でラミネートした膜は親水性の
低下が最も著しく、わずか35日後に2.7の係数で低下し
た。このデータは、溶媒ベースの接着剤が、ラミネート
膜に疎水性を引き起こし得ることを示している。この系
におけるリリースライナーは、使用時に接着剤層に残留
する溶媒の量に影響を与えるという役割を果たしてい
る。非透過性のポリエステルリリースライナーであるポ
リSC9の方が透過性の紙ライナーである71PMOよりも、接
着剤層中に保持される溶媒の量が多いことが予想され
る。また、所望の親水性の性質を損なうことなく、水ベ
ースの接着剤を用いて膜をラミネートすることができ
る。
実施例３ フレキシコンPM150C/V23/ポリSC9溶媒ベースアクリル
酸接着テープを用い、実施例１に記載のようにしてニト
ロセルロース膜をラミネートし試験した。得られた結果
は、この物質で膜をラミネートした後45℃でインキュベ
ートすると親水性の損なわれ方が最も大きいことを示し
ていた。
実施例４ ニトロセルロース膜を単一の界面活性剤（下記参照）
の溶液中に浸漬し、該膜を該溶液で完全に湿潤させるこ
とにより、該膜に該単一の界面活性剤を含浸させた。こ
の膜を５〜10秒後に溶液から取り、紙用クリップで吊
し、室温条件にて２〜20時間乾燥させた。得られた膜を
下記のようにして試験した。抗HCG抗体の溶液（1.2mg/m
l）を細い毛細管［マイクロMLチュービング（Micro ML
tubing）、エルムハースト（Elmhurst）、NY］を通して
0.05ml/分の流速にてポンプで流し、該チュービングを
膜表面を横切って0.5インチ／秒の速度で移動させるこ
とにより、該溶液を該膜の狭いゾーン中に適用した。こ
の膜の狭いゾーン中に固定化された抗体は、捕捉部位を
形成する。この膜をストリップにカッティングし、HCG
に結合するセレン結合体を用いてイムノクロマトグラフ
ィーを行った（ヨーロッパ特許出願公開EP−Ａ−229,42
8号明細書参照）。抗体が膜へ結合することに及ぼす各
界面活性剤の影響は、50mIUのHCG尿素を用いてイムノク
ロマトグラフィーを行ったときの該捕捉部位に結合した
セレン結合体の相対量により評価した。この試験におけ
るシグナルの減少は、界面活性剤のブロッキング作用に
より引き起こされたニトロセルロース抗体結合能の喪失
と解釈した。
工程Ａ 下記界面活性剤（特に断らない限り水から）のそれぞ
れを１％（w/v）の濃度で用い、上記のようにしてニト
ロセルロース膜を処理し、試験した：トリトンX100、ト
リトンX405、プルロニック（Pluronic）F68、プルロニ
ックL62F、プルロニックL101、ツイーン80、ツイーン2
0、Brij35、マッカネート（Mackanate）DC30、CHAPS、
およびジオクチルスルホサクシネート（イソプロパノー
ルから）。各場合において、界面活性剤処理した膜で
は、イムノクロマトグラフィーの間にシグナルの展開に
減少がみられた。
工程Ｂ 下記界面活性剤（イソプロパノールから）のそれぞれ
を0.1％（w/v）の濃度で用い、上記のようにしてニトロ
セルロース膜を処理し、試験した：マッカネートDC30、
セチルアルコール、ゾニル（Zonyl）FSO、ゾニルFSN、
ゾニルFSP、ゾニルFSJ、およびプルロニックL101。これ
らの界面活性剤で処理した膜ではイムノクロマトグラフ
ィーの間にシグナルの展開に減少はみられなかったが、
膜の毛管速度は処理の結果減少した（このことは、上記
で説明したように、膜の親水性が低下したことを意味す
るものとされる）。
工程Ｃ 上記工程Ｂに記載したようにしてニトロセルロース膜
を処理し試験したが、毛管速度を増大させるために界面
活性剤溶液に0.5％グリセロールを加えた。得られた膜
は、イムノクロマトグラフィーの間にシグナルの展開で
減少がみられなかった（しかし、親水性に対する影響に
ついては実施例５を参照のこと）。
工程Ｄ 下記界面活性剤（イソプロパノール溶液から）のそれ
ぞれを１％（w/v）の濃度で用い、上記のようにしてニ
トロセルロース膜を処理し、試験した：ドデシルトリメ
チルアンモニウムブロマイド、セチルトリメチルエチル
アンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアン
モニウムブロマイド、およびスルホニル（Surfonyl）10
4PA。得られた膜は、イムノクロマトグラフィーの間に
シグナルの展開で減少がみられなかった（しかし、親水
性に対する影響については実施例５を参照のこと）。
工程Ｅ 下記界面活性剤（水溶液中）のそれぞれを用い、上記
のようにしてニトロセルロース膜を処理し、試験した:1
％ペンタンスルホン酸、１％ヘプタンスルホン酸、１％
オクタンスルホン酸、１％デカンスルホン酸、0.1％ド
デカンスルホン酸、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、お
よび0.2％シアスタットLS。得られた膜は、イムノクロ
マトグラフィーの間にシグナルの展開で減少がみられな
かった。
実施例５ 実施例４工程Ｃおよび工程Ｄに記載のようにして製造
した膜を、実施例３に記載のようにして試験した。フレ
キシコンPM150C/V23/ポリSC9でラミネートした結果、す
べての膜は親水性の性質が低下し、14日後に流速が使用
不能な程遅くなりまたは変化した。これらの研究の目的
においては、5.4cmのストリップに対して流動時間が10
分を越えるか、または流速の変化が20％を越えるときは
使用不能であると考えた。ラミネートが使用不能である
と決定した時点でこれらの研究を終えた。
実施例６ 実施例４工程Ｅに記載のようにして製造した膜を、実
施例３に記載のようにして試験した。フレキシコンPM15
0C/V23/ポリSC9でラミネートし45℃にて加速熟成（acce
lerated aging）した後、すべての膜は親水性の性質を
保持した。
このことは、これらの界面活性剤がニトロセルロース
の抗体結合を妨害せず、また溶媒ベースのアクリル酸接
着剤により引き起こされる親水性の低下に対する抵抗性
を付与することを意味している。
実施例７ イソプロパノールかまたは水中の１％シアスタットLS
を用い、実施例４工程Ｅに記載のようにしてニトロセル
ロース膜を処理および試験し、ついで実施例３に記載の
ようにして試験した。イソプロパノール溶液から処理し
た膜ではPM150C/V23/ポリSC9でラミネートし熟成した後
に親水性の性質が失われたが、水溶液から処理した膜で
は親水性の性質は失われなかった。
実施例８ 有機溶媒ゴムベース接着剤（3M−＃396）を用いてニ
トロセルロース膜（Ｓ＆Ｓ、５ミクロン）をラミネート
し、37℃にて貯蔵し、毛管速度について試験した。
実施例９ 有機溶媒アクリル酸ベース接着剤（フレキシコンV9
5）を用いてニトロセルロース膜をラミネートし、37℃
にて貯蔵し、毛管速度について試験した。
実施例10 有機溶媒アクリル酸ベース接着剤（フレキシコンV17
0）を用いてニトロセルロース膜をラミネートし、37℃
にて貯蔵し、毛管速度について試験した。
実施例11 熱活性化接着剤（モノコート）を用いてニトロセルロ
ース膜をラミネートし、37℃にて貯蔵し、毛管速度につ
いて試験した。
実施例12 ホットメルト接着剤を用い、ポリエステルに結合した
ポリエチレン層からなるニトロセルロースをラミネート
した。ホットメルト接着剤は、溶融温度が65〜90℃の10
0％固形分からなる熱可塑性の接着剤である。このラミ
ネート手順では、疎水性の有機溶媒が結合層から膜中へ
移動する機会がないので、膜の流速に影響を与えること
はない。
実施例13 水ベースのカゼイン接着剤を用い、ポリエステル支持
体に結合した粘性カゼイン溶液層からなるニトロセルロ
ースをラミネートした。そのような物質は、水中の20％
カゼイン溶液の薄層をポリエステルに適用し、最終濃度
が70〜90％になるまで薄層から水を蒸発させることによ
り製造する。この接着性物質を用いてラミネートした場
合は、接着剤から膜へ水が移動することにより膜の水和
の度合が増大するので、膜の親水性の性質が低下するこ
とはない。
実施例14 水ベースのポリビニルピロリドン（PVP）接着剤を用
い、ポリエステル支持体に結合した粘性PVP溶液からな
るニトロセルロースをラミネートした。そのような物質
は、20〜30％（w/v）PVP（分子量3,000〜5,000）の薄層
をポリエステルに適用し、最終濃度が70〜90％（w/v）
になるまで該層から水を蒸発させることにより製造す
る。この物質を用いてラミネートした場合も、実施例13
に記載したのと同じ理由で、膜の親水性の性質が低下す
ることはない。
実施例15 ポリ酢酸ビニル（PVA）粒子の水性乳濁液から製造し
た接着剤を用い、ニトロセルロースをラミネートした。
PVA粒子（直径１〜50ミクロン）の70％固形分水溶液０
を0.5％ドデシル硫酸ナトリウム安定化界面活性剤とと
もに薄層としてポリエステル支持体に適用し、最終濃度
が90〜99％固形分になるまで水を蒸発させる。この物質
を用いてラミネートした場合も、実施例13に記載したの
と同じ理由で、膜の親水性の性質が低下することはな
い。
実施例16 幅7.3インチのニトロセルロース織物を、下記濃度の
シアスタットLSの幾つかの溶液の一つの浴中を0.5フィ
ート／分に引っ張って移動させた:0.1、0.2、0.3、0.4
および0.5％（w/v）。浸漬路の長さは約３〜４インチで
あり、滞留時間は30〜40秒であった。ついで、この織物
を60℃の乾燥トンネル中で約10分間乾燥させた。このシ
ートからカッティングしたストリップを、37℃で貯蔵し
たポリSC−９ラミネートを用い上記実施例３および４と
同様に試験した。未処理コントロールおよび0.1％およ
び0.2％処理試料からのシグナルは良好であった。0.3％
および0.4％処理試料からのシグナルは普通であった。
0.5％処理試料からのシグナルは不良であった。親水性
の安定性は以下の通りであった 実施例17 ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜（2.0ミク
ロン）をミリポアか入手した。この物質は、ミリポアの
親水性デュラポア（Durapore）物質の疎水性前駆体であ
る。入手したままの膜は水溶液で湿潤することができな
かったので、抗体試薬を都合よく膜に適用することがで
きない。親水性デュラポアのタンパク質結合は非常に低
かったので、抗体試薬を吸着により固定化するには有用
でない。
実施例18 疎水性PVDF膜（2.0ミクロン）に１％（w/v）プルロニ
ックL101溶液を含浸させ、乾燥させた。得られた膜は抗
HCG抗体の水溶液で湿潤させることができたが、抗HCGセ
レン結合体を500mIU分析対象物濃度で用いたイムノクロ
マトグラフィーを10分間行ってもシグナルの展開はみら
れなかった。おそらく、界面活性剤により湿潤が可能と
なったが、タンパク質の結合がブロックされたものと思
われる。
実施例19 疎水性PVDF膜（2.0ミクロン）に6.7％（w/v）シアス
タットLS溶液を含浸させ、乾燥させた。得られた膜は抗
HCG抗体（3.3mg/ml、１μ）を適用し、抗HCGセレン結
合体および500mIU HCG尿試料を用いてイムノクロマトグ
ラフィーを行った。その結果、ニトロセルロース膜を用
いて観察した場合と同等のシグナルの展開が示された。
実施例20 PVDF膜をイソプロパノール中に浸漬させ、該膜を完全
に湿潤させる。洗浄水を数回交換しながら上記湿潤膜を
水浴中に浸漬させることにより、イソプロパノールを洗
い出す。ついで、該膜のボイド構造中に拡散するのに充
分な時間、該膜をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）界面
活性剤の５％（w/v）水溶液中に浸漬することにより、
該膜にSDS界面活性剤を含浸させる。得られた５％SDS水
溶液含浸膜を浴から取り、乾燥させる。タンパク質をPV
DFへの結合がニトロセルロースの場合と同様であると仮
定すると、この膜は容易に湿潤することができ、抗体の
水溶液を容易に固定化することができるであろう。これ
が、水に可溶であるがイソプロパノールのような有機溶
媒には不溶である界面活性剤を疎水性PVDF膜中に導入す
る一般的手段である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、片面でラミネートする本発明の多孔質膜の模
式図である。 第２図は、両面でラミネートする本発明の多孔質膜の模
式図である。 第３図は、多孔質膜に適用する前のラミナ層を示す模式
図である。 第４図は、ラミネート前の熟成後の親水性の減少を示す
グラフである。 （主要符号の説明） 10:多孔質膜、12、18:接着剤層、14:支持体、16:第二の
支持体
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジュリアン・ゴードン アメリカ合衆国イリノイ 60044、レイ ク・ブラフ、シェリダン・ロード 307 番 (72)発明者 ツン―フイ・ケイ・ヨウ アメリカ合衆国イリノイ 60061、バー ノン・ヒルズ、オースチン・コート 102番 (72)発明者 ドナルド・アービン・スティンプソン アメリカ合衆国イリノイ 60031、ガー ニー、パイン・グローブ 573番 (72)発明者 ドロシー・ザクラ アメリカ合衆国イリノイ 60030、グレ イスレイク、ボニー・ブラエ 285番 (72)発明者 ピーター・ザウン アメリカ合衆国イリノイ 60048、リバ ティビル、オーク・レーン、ボックス 154、ルート・ナンバー １ (56)参考文献 特開 平２−107649（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−56856（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−218957（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−206658（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−140066（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−62866（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−180857（ＪＰ，Ａ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】硫酸アルキルまたはスルホン酸アルキル
    （アルキル鎖の炭素数は１〜約16）またはシアスタット
    LSから選ばれた界面活性剤を含ませたニトロセルロース
    またはポリビニリデンジフルオライドからなる湿潤性の
    多孔質膜を該多孔質膜の親水性の性質に悪影響を及ぼさ
    ない水溶溶媒ベースの接着剤を用いて該多孔質膜の少な
    くとも１つの側面にて支持体にラミネートし、かつ該多
    孔質膜上に生物学的に活性な試薬を保持させてなること
    を特徴とする、診断アッセイ用固相装置。
  2. 【請求項２】該接着剤がアドヒーシブリサーチ接着剤AS
    73、カゼイン、ポリ酢酸ビニルまたはポリビニルピロリ
    ドンである請求項（１）に記載の装置。
  3. 【請求項３】界面活性剤が１−ペンタンスルホン酸、１
    −ヘプタンスルホン酸、１−オクタンスルホン酸、１−
    デカンスルホン酸、１−ドデカンスルホン酸およびドデ
    シル硫酸塩よりなる群から選ばれたものである請求項
    （１）に記載の装置。
  4. 【請求項４】該多孔質膜の両側を該水性溶媒ベースの接
    着剤を用いて支持体にラミネートした、請求項（１）に
    記載の装置。
  5. 【請求項５】ラミネートした湿潤性多孔質膜からなる分
    析対象物の存在または量を決定するための診断アッセイ
    用固相の製造方法であって、 （ａ）硫酸アルキルまたはスルホン酸アルキル（アルキ
    ル鎖の炭素数は１〜約16）またはシアスタットLSから選
    ばれた界面活性剤を約0.01％〜約10％（w/w）の濃度に
    て含ませたニトロセルロースまたはポリビニリデンジフ
    ルオライドからなる湿潤性の多孔質膜を、該多孔質膜の
    親水性の性質に悪影響を及ぼさない水性溶媒ベースの接
    着剤を用いて、該多孔質膜の１つの側面にて支持体にラ
    ミネートし、ついで （ｂ）該多孔質膜中でその活性が保持されるように、該
    多孔質膜の特定部分に生物学的に活性な試薬を接触させ
    る ことを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】該接着剤がアドヒーシブリサーチ接着剤AS
    73、カゼイン、ポリ酢酸ビニルまたはポリビニルピロリ
    ドンである、請求項（５）に記載の方法。
  7. 【請求項７】界面活性剤が１−ペンタンスルホン酸、１
    −ヘプタンスルホン酸、１−オクタンスルホン酸、１−
    デカンスルホン酸、１−ドデカンスルホン酸およびドデ
    シル硫酸塩よりなる群から選ばれたものである請求項
    （５）に記載の方法。
  8. 【請求項８】該多孔質膜のもう一方の側を該水性溶媒ベ
    ースの接着剤を用いてラミネートする工程をさらに含
    む、請求項（５）に記載の方法。
  9. 【請求項９】湿潤性多孔質膜固相を用いて試料中の特異
    的結合リガンドの存在または量を決定する方法であっ
    て、 （ａ）約0.01％〜約10％（w/w）の濃度にて硫酸アルキ
    ルまたはスルホン酸アルキル（アルキル鎖の炭素数は１
    〜約16）またはシアスタットLSから選ばれた界面活性剤
    を含ませたニトロセルロースまたはポリビニリデンジフ
    ルオライドからなる湿潤性の多孔質膜を、該多孔質膜の
    親水性の性質に悪影響を及ぼさない水性溶媒ベースの接
    着剤を用いて、該多孔質膜の少なくとも１つの側面を支
    持体にラミネートしたものの該多孔質膜の特定部分に、
    該リガンドと結合し得るリガンドレセプターを固定化
    し、 （ｂ）工程（ａ）の多孔質膜の該特定部分を試料と接触
    させてリガンド／リガンドレセプター複合体を該多孔質
    膜上に生成させ、ついで （ｃ）該複合体の存在または量を検出して分析対象物を
    測定する ことを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】該接着剤がアドヒーシブリサーチ接着剤
    AS73、カゼイン、ポリ酢酸ビニルまたはポリビニルピロ
    リドンである、請求項（９）に記載の方法。
  11. 【請求項１１】界面活性剤が１−ペンタンスルホン酸、
    １−ヘプタンスルホン酸、１−オクタンスルホン酸、１
    −デカンスルホン酸、１−ドデカンスルホン酸およびド
    デジル硫酸塩よりなる群から選ばれたものである請求項
    （９）に記載の方法。
  12. 【請求項１２】工程（ｂ）の接触を、該多孔質膜を試料
    中に浸漬することにより行う請求項（９）、（10）また
    は（11）に記載の方法。
  13. 【請求項１３】工程（ｂ）の接触を、該多孔質膜の一端
    を試料と接触させ、毛管作用により試料を該多孔質膜中
    を該特定部分まで移動させることにより行う請求項
    （９）、（10）または（11）に記載の方法。
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