JP2767164B2 - オキソ化合物、特にアセトフエノンの酵素還元法及びこれに適する酵素 - Google Patents
オキソ化合物、特にアセトフエノンの酵素還元法及びこれに適する酵素Info
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Description
をR(+)- フエニルエタノールへ還元することができ
る酵素である。
常の方法では入手が難しい価値あるキラル合成- 成分で
ある。
母細胞を用いて発酵製造する方法は、最近F.アラゴツ
ィーニ(Aragozzini)等によって(Appl. Microbiol. Biot
echnol. (1986)24,175−177)記載され
ている:それによればS(−)- フエニルエタノール
を、アセトフエノン(200mg/l)からハンゼヌラ
グルコツィーマ(Hansenula glucozuma) を用いて48時
間の培養で52%収率(92%ee)で、及びトルロプ
シス セステルリ(Torulopsis Cestellii)を用いて20
%収率(95%ee)で形成する。
上、たとえば酵母、プフエルデレバー(Pfermoanaerobiu
m)又はサーモアナエロビウム(Thermoanaerobium)ブロキ
(brockii) から、市場で入手できるアルコールデヒドロ
ゲナーゼを用いてアセトフエノンを還元する試みがしば
しば記載されているが、この酵素はアセトフエノンを変
換しない(たとえばカイナン(Keninan) 、E.等(19
87)Ann. N.Y.Acad, Sci.501,130−149,
表5参照)。
くべきことに乳酸菌からデヒドロゲナーゼを単離し、こ
の酵素はR(+)- フエニルエタノールをケト成分(ア
セトフエノン)から製造することができることを見い出
した。
存在下でアセトフエノンをR(+)- フエニルエタノー
ルに還元する能力のある、乳酸菌から単離されたフエニ
ルエタノール- デヒドロゲナーゼである。
ルス ケフィル(Lactobacillus Kefir) から得られるの
が特に好ましい。
ノールへ還元する能力のあるデヒドロゲナーゼは、特に
次のパラメーターによって特徴づけられる: ──pH7のアセトフエノン- 還元及びpH8の逆反応
に対するpH-最適条件; ──25−30℃の温度- 最適条件; ──5.3mMアセトフエノン又は6×10-4Mアセト
フエノンのKM - 値でアセトフエノン- 反応の最大活
性; ──190μM NADPHでの最大活性; ──EDTAによる急速な不活性化、しかも通常の阻害
剤、キレート剤及びSH- 保護試剤の活性への僅かな影
響; ──芳香族、脂環式及び脂肪族ケトン、たとえば特にア
セトフエノン、p- ブロム- アセトフエノン、メチルシ
クロヘキサノン、アセトン、メチル- ヘキシル- ケト
ン、4- フエニル -2-ブタノン、1- フエニル -1,
2- プロパンジン、エチルフエニルケトン、ピナコリ
ン、プロピオフエノン、p- クロルアセトフエノンの付
加的な還元能力。
する。反応のバランスは、はるかにアルコールの側にあ
るので、──たとえば補酵素の再生下で連続的反応の実
施に於て──この酵素はR(+)- フエニルエタノール
又は他の第二アルコールの合成に良好に適する。その際
たとえば次の反応が進行する:
キシ- 化合物の形成下にオキソ- 化合物の酵素還元する
にあたり、オキソ化合物をNADPHの存在下で本発明
によるフエニルエタノール- デヒドロゲナーゼによって
変換することを特徴とする、上記オキソ- 化合物の酵素
還元方法を包含する。
が反応混合物内で、特にグルコース-6- P/グルコー
ス -6- デヒドロゲナーゼによって行われる。
ールの収得のためにも使用することができる。すなわち
R(+)- アルコールを、ラセミ体(R,S)- アルコ
ール混合物からNADP+ の存在下でフエニルエタノー
ル- デヒドロゲナーゼを用いて酵素反応させ、ケトンと
なし、これを困難なく残存するS(−)- アルコールか
ら分離することができる。酵素反応を、ケトンの存在下
にNADP+ の再生に実施するのが好ましく、このNA
DP+ を容易に分離することができ、大過剰で使用し、
このために酵素は可能な限り小さいKm - 値を有する。
細に記載する。この例中、ラクトバチルスケフィル菌D
SM20587を用いて実施する。同時にグラフを添付
する;これは次のことを示す: 図1 ラクトバチルス ケフィルの発酵に於ける、時間
に依存するフエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの形
成 図2 フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの活性の
pH- 依存性 図3 バッチ- 反応でアセトフエノン- 減少又はフエニ
ルエタノール- 増加及び 図4 アセトフエノンの (a)ラセミ体混合物 (b)酵素反応生成物を用いてR(+)- 及び(S)-
フエニルエタノールのキラル分離 (保持時間: 3.8分:誘導体化試剤 10.4分:R(+)- 11.7分:S(−)- フエニルエタノール 16.1分:アセトフエノン)
の培地中で培養する(1lあたり): グルコース 20g 酵母抽出物 5g ユニバーサルペプトン 10g 肉抽出物 5g クエン酸水素ジアンモニウム 2g 酢酸ナトリウム 5g 硫酸マグネシウム 0.1g 硫酸マンガン 0.05g リン酸水素ジカリウム 2g 蒸留水 1l この溶液のpH- 値を6.5に調整し、次いで15分間
120℃で(2バール)滅菌する。微生物を嫌気的に培
養する。その際培地を、N2 で覆いかぶせるので十分で
ある。10l- スケールで、30℃のふ化温度に達した
後、24時間たった準備培養物300mlを媒体に植菌
する。この様な10l- 混合物中で、具体的に時間に関
する酵素活性の経過を測定する。その場合試料を種々の
時間で取り、フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの
活性を、細胞の分解後に測定する。図1中にフエニルエ
タノール- デヒドロゲナーゼの活性が短時間後最大値に
達し、次いでその値を長時間維持する経過を示す。
し、75時間後、4.15のpH- 値及び4.12のO
D660 で、分離して湿潤細胞物質320gを収得する。
この場合数ケ月を経て、全く活性損失が認められない。 B.酵素単離(粗抽出物) 細胞からの酵素の遊離を、それ自体公知の方法(ウルト
ラシヤル、高圧- 高均- 、湿式粉砕等)によって行うこ
とができる。この際細胞をガラス球による湿式粉砕によ
って分解する。更に菌体(80g)を100mMトリス
- HCl- 緩衝液(pH9.0)中に0.1%2- メル
カプトエタノールの添加下に懸濁して、細胞湿潤体の濃
度は40%となる(最終容量200ml)。細胞内容物
を、冷却された懸濁液(4℃)からガラスパールミル
(商品名ディノーミル、バコフエン社)による機械的分
解によって遊離する。340mlの粉砕容器をガラス球
で満たして、290mlの堆積容量が生じる(85%充
填率)。分解を撹拌歯車回転数2000UpMで実施す
る。冷却マント及び撹拌歯車軸受けを運転の間冷却す
る。
及びたん白質含有量11mg/mlを有する粗抽出物1
38mlを生じる。このことから、次のことが達成され
る。すなわち100l発酵混合物から、約27,000
単位フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼを得ること
ができる(1酵素単位は、1μMol基質/分を変換す
る酵素量である。)。 C.酵素の強化 酵素を、イオン交換- クロマトグラフィー及びゲル濾過
によって精製する。その際Mg2+- イオン(クロリド、
フルフアート等々として)の添加は、精製の間全く不可
欠であることが明らかである。たとえば0.1mMMg
Cl2 の濃度が有効である。この様な添加なしに酵素
は、精製の間完全に不活性化され、後からの添加によっ
てこの酵素を再活性化することができない。 1.イオン交換- クロマトグラフィー:粗抽出物(例1
Bに相当)を、モノ- Q- カラム(アニオン- 交換体)
に装填する(FPLC- クロマトグラフィーシステム、
フアルマジア社、フライブルグ、BRD)。カラムを緩
衝液Aで平衡化する(0.05Mリン酸カリウム- 緩衝
液、0.1mM MgCl2 でpH7.0)。カラムを
緩衝液Aで多数回洗滌後、直線状のNaCl- 勾配(0
−1M)を有するフエニルエーテル- デヒドロゲナーゼ
を溶離する。この場合酵素を約0.35M NaClで
溶離する。得られた富化を、表1にまとめて示す。 2.ゲル濾過:最高の活性度を有するモノ -Q- クロマ
トグラフィーの分画を、スーパーローズ6HR10/3
0(EPLC- システム、フアルマシア社、フライブル
グ、BRD)のクロマトグラフィーによって再度精製す
る。平衡化及びクロマトグラフィー分離のために、緩衝
液Aを使用し、クロマトグラフィー分離を流動速度0.
5ml/分で実施する。強化を表1にまとめて示す。 表1:フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの強化 ───────────────────────────────── 精製工程 全活性 比活性 収率 強化- U U/mg % 倍 ───────────────────────────────── 粗抽出物 16.9 1.4 100 1 モノ- Q(アニオン- AT) 14.5 28.3 86 20 スペローズ(ゲル- F.) 12.8 99.1 76 70 ───────────────────────────────── 〔例2〕フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの特性 A.反応のpH- 依存性 pH- 値の活性依存性を測定する。その際アセトフエノ
ン(11mM)を種々の緩衝液中に溶解し、緩衝液は夫
々0.1Mであり、異なるpH- 値(4.0−10.
0;図1参照)を有する。この様な基質溶液970μl
に、20μlNADPH(菌株溶液8mg/ml)及び
10μl酵素溶液を加え、活性を340nm(30℃)
で測定する。図2は、得られた活性のpH- 値依存性を
示す。アセトフエノン- 還元に対する最適条件は、pH
7.0である。
フエニルエタノール- 酸化を測定する。(±)- フエニ
ルエタノール(22mM)を、4.0〜10.0のpH
- 値を有する0.1M緩衝液中に溶解し、20μl N
ADP+ (165mg/ml)及び10μl粗抽出物を
加え、NADPH- 形成率を光度測定によって測定す
る。図2にこの値をまとめて示し、酸化反応に対するp
H- 最適条件は、8.0である。 B.アセトフエノン- 還元に対する温度最適条件 最適テスト温度の測定に、25〜40℃の酵素活性を測
定する。テスト仕込物は夫々を含有する:970μlア
セトフエノン- 溶液(リン酸カリウム緩衝液中5.5m
M、pH7.0;テスト液中の最終濃度:5.3m
M);20μlNADPH(テスト液中で0.2mM) 10μl酵素溶液。
25−30℃で温度最適条件を有し、より一層高い温度
は酵素を不活性化する。 C.種々の金属カチオン、阻害剤及びSH- 保護試剤の
影響 次の試験に関して、部分的に精製された酵素(モノ -Q
- クロマトグラフィーによる、20- 倍増加)を使用す
る。 1.金属カチオン:Mg2+,Zn2+及びMn2+- イオン
の影響を調べる。その際次のテスト混合物を使用する:
0.1Mリン酸カリウム- 緩衝液、pH7.0、5.5
mM アセトフエノン 0.2mM NADPH 10μl酵素/ml(制限濃度:1−10μgたん白質
/ml)、MgCl2 、ZnCl2 又はMnCl2 を、
1mMの最終濃度で添加する。
の変化を、340nmで1分につき計測して測定する。
表3は、カチオンの、特にMg2+イオンの安定化作用を
示す。 2.阻害剤及びSH- 保護試剤:金属カチオンの無添加
で上記テスト混合(例2,Cl)を用いていくつかの阻
害剤又はSH- 保護試剤を1mM最終濃度でテスト混合
物に加え、残存活性を測定する:p- ヒドロキシ安息香
酸水銀を、難溶解性のために0.1mM濃度で使用す
る。
アセトニトリル中に溶解する。それによって条件づけら
れたアセトニトリル- 濃度は、1mMであり、コントロ
ール試験で試みられた様に酵素活性に影響を与えない。
はキレート化剤EDTAによって完全に、キレート化剤
1,10- フエナントロリン及び2,2- ジピリジンに
よって実質上阻害されないことが分る。これは、Mg2+
イオンが酵素の不可欠な成分であることに相応する。阻
害剤ヨードアセトアミド、p- ヒドロキシ安息香酸水銀
及びN- エチルマレインイミドによるほんの僅かな阻害
は、酵素が外見上SH- 基を活性中心中に含有しないこ
とを示す。これを、添加されたSH- 保護試剤によって
確認する。この試剤はこの場合作用を示さない。 表3:金属カチオン、阻害剤及びSH- 保護試剤の影響 ────────────────────────────────── 添加率(%) 残存活性 ────────────────────────────────── 金属カチオン: MgCl2 132 ZnCl2 114 MnCl2 114 阻害剤及びキレート化剤: EDTA 0 2,2- ジピリジン 106 1,10- フエナントロリン 99 ヨードアセトアミド 90 p- ヒドロキシ安息香酸水銀 92 N- エチルマレインイミド 81 フエニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF) 94 トリトン X- 100 94 SH- 保護試剤: ジチオスレイトール 95 グルタチオン 99 ────────────────────────────────── D.反応促度のアセトフエノン濃度依存性 反応に最適なアセトフエノン- 濃度の測定のために、酵
素活性度を基質濃度に基づいて測定する。これに次のテ
スト混合物を使用する:970μlアセトフエノン- 溶
液(リン酸カリウム- 緩衝液、pH7.0)50〜71
00mMの濃度20μlNADPH(8.0mg/ml
菌株溶液:テスト中の濃度:0.2mM) 10μl酵素溶液。
30℃で行う。値を夫々基質依存の背景となる反応(ア
セトフエノン- 溶液の代りに970μl緩衝液を有する
テスト混合物)の分だけ修正する。最大活性を、アセト
フエノン- 濃度5.3mM(18.6U/ml)で達成
し、KM - 値は6.0・10-4Mアセトフエノンであ
る。アセトフエノン- 濃度10.6mMまで、基質過剰
- 阻害は生じない。 E.反応速度のNADPH- 濃度依存性 NADPH- 濃度に基づいて、反応速度を測定する。次
のテスト混合物を使用する:970μlアセトフエノン
- 溶液(リン酸カリウム緩衝液中で5.5mM、pH
7.0;テスト中で最終濃度;5.3mM);20μl
NADPH(13〜380μM最終濃度のいくつかの
濃度) 10μl酵素溶液。
で、30℃で行う。最大活性を190μM NADPH
で測定することができる(16.9U/ml)、KM -
値は1.4・10-4Mである。 F.フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの基質スペ
クトル 例2.Dに対応して、アセトフエノンの代りに一連の芳
香族及び長鎖脂肪族ケトンを、これが酵素触媒で還元さ
れうるかどうかテストする。これに次のテスト混合物を
使用する:970μlケトン- 溶液(リン酸カリウム-
緩衝液、pH7.0)夫々のケトンの受容体に応じて1
0μM〜10mMの種々の濃度;20μl NADPH
(8.0mg/ml菌株溶液;テスト中の濃度:0.2
mM)、10μl 酵素溶液(部分的に精製;モノ -Q
- クロマトグラフィーによって20- 倍)。
度でしか使用しない。結果を、表4中にまとめて示す。
酵素は多数の芳香族及び脂肪族第二ケトンを受け入れる
ことが分る。 表4:フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの基質特異性 1)n.b.=未測定 ──────────────────────────────────── 基質 KM (mM) Vmax (%) ──────────────────────────────────── A.)NADPH- 依存還元: 芳香族化合物: アセトフエノン(メチル- フエニルケトン) 0.600 100 プロピオフエノン(エチル- フエニルケトン) 2.74 43 4- フエニル -2- ブタノン 9.40 90 4- ブロモ- アセトフエノン 0.372 101 1- フエニル -1,2- プロパンジオン n.b.1) 70 メチル -2- ナフチルケトン n.b. 11 ベンズアルデヒド n.b. 10 4- クロル- アセトフエノン 0.390 93 環状及び非環状脂肪族化合物: (±)-メチルシクロヘキサノン 70.0 109 ピナコリン(t- ブチル- メチルケトン) 3.38 63 メチル- ヘキシルケトン 0.251 91 エチル- ペンチルケトン 0.681 66 メシルオキシド(4-メチル-3- ペンテン-2- オン) n.b. 12 アセトン 37.9 96 NADPH 0.14 100 B.)NADP+ - 依存酸化: R(+)-フエニルエタノール 3.5 11 (±)-フエニルエタノール 4.3 17 イソプロパノール 0.117 18 NADP+ 0.19 17 ──────────────────────────────────── 〔例3〕バッチ中で(+)-フエニルエタノールの酵素触
媒による製造 アセトフエノンを含有する10mM溶液を、酵素(0.
5U/ml)及び補酵素(0.05mM)と反応させる
(5ml全体)。その際補酵素NADPHを、グルコー
ス -6- ホスフアート(15mM)及びグルコース -6
- ホスフアート- デヒドロゲナーゼ(0.5U/ml)
でカップリングして再生する。10分間隔で、試料を取
り出し(50μl)、HPLCによってフエニルエタノ
ール及びアセトフエノンの含有量を分析する。
沈殿するたん白質を遠心分離し、上澄液50μlにHP
LC- 展開剤450μlを加える。 HPLCの分離条件:カラム:ODS- ハイパーシル5
μ(250×4.6mm);展開剤:トリス-HCl、
35%アセトニトリルでpH8.41濾過し、ヘリウム
でガス処理する);流動速度:1ml/分;温度:25
℃(冷却オーブン);検出:226nmで光度測定;試
料の量:40μl;溶離時間:アセトフエノン=12.
6分、フエニルエタノール=7.8分。
エノンを連続的に約0.5mMにまで下げ、これに対称
的にフエノールエタノールを形成する。
する他の再生可能性を試験する。上記混合物中に、グル
コース -6- ホスフアート及びグルコース -6- ホスフ
アート- デヒドロゲナーゼを一方でグルコース(15m
M)及びグルコース- デヒドロゲナーゼ(0.5U/m
l)に代え、他方でイソプロパノール(20mM)に代
える。イソプロパノールは、フエニルエタノール- デヒ
ドロゲナーゼの基質でもあり、その際NADP+ の還元
下に化学量論的にアセトンを形成する。上記試験に於け
る様にすべて10分の試料を取り出し、フエニルエタノ
ールの含有量を測定する。表5にこの3つの再生可能性
の代表的な値を、まとめて示す。 表5:種々のNADPH- 再生剤の存在下で10mMアセトフエノンの反応 (DH=デヒドロゲナーゼ) ─────────────────────────────────── 下記化合物によるNADPH 再生 フエニルエタノール(mM) 10分後 30分後 60分後 ─────────────────────────────────── グルコース/グルコース- DH 1.8 3.8 7.9 グルコース -6- P/グルコース -6- P- DH 6.2 8.8 8.6 イソプロパノール 1.6 4.6 8.0 ─────────────────────────────────── 〔例4〕酵素- 膜- 反応器中で(+)-フエニルエタノー
ルを酵素触媒によって製造フエニルエタノールの連続的
合成は、酵素- 膜-反応器の使用下に可能である。この
際酵素を、限外濾過膜(YM5、アミコン社、ヴィッテ
ン、BRD)を通して反応器(CEC1、アミコン社)
中に保留する。一方反応溶液の低分子成分(未反応基
質、生成物、緩衝液)を、連続的に溶液から除去する
(滞留時間2時間)。反応容量を一定に保つ。その際同
一割合で貯蔵槽から10mMアセトフエノンを緩衝液
(0.1Mリン酸カリウム、pH7.0)中に配量添加
し、限外濾過液を反応器に残す。反応器容量は10ml
であり、それは詳細に次のものを含有する:0.1Mリ
ン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中に0.5U/ml
フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼ、0.5U/m
lグルコース -6- ホスフアート- デヒドロゲナーゼ、
5mMグルコース -6- ホスフアート、10mMアセト
フエノン、0.4mMNADP+ 。4時間間隔でNAD
P+ 及びグルコース -6- ホスフアートを反応容器中に
配量添加し、上記最終濃度が得られる。
間)中のアセトフエノン及びフエニルエタノールの含有
量を、HPLCによって例3に記載した様に測定する。
結果を表6中にまとめて示す。 表6:酵素 -膜- 反応器中でアセトフエノンのフエニルエタノールへの連続的変 換 ─────────────────────────────────── 時間(h) アセトフエノン(mM) フエニルエタノール(mM) ─────────────────────────────────── 0 10 0 1 3.8 5.2 4 2 6.9 8 0.8 7.8 26 0.6 7.7 32 0.2 8.7 46 0.2 8.6 52 0.2 8.4 ─────────────────────────────────── 〔例5〕酵素の立体特異性の検出 酵素の立体特異性及び生成物の鏡像体単位の検出に、2
つの方法を使用する。一つは、酵素により製造された生
成物を、キラルHPLC──これはR(+)-及びS
(−)-フエニルエタノールを分離することができる──
で検査し、もう1つはR(+)-又はS(−)-フエニルエ
タノールの、市場で入手できる純粋な異性体を用いて光
度測定によって酸化反応を測定する。 A.キラルHPLC 比較的多量の酵素により製造された生成物を分析に使用
しうるために、アセトフエノンの連続反応の生成物を使
用する。これは補酵素NADPHの再生下に製造され
る。反応自体は、例4中に詳述した。
でフエノールエタノールを誘導体化してベンゾイル誘導
体にした後しか可能ではない。更に生成物溶液1mlを
ジクロルメタン1mlと共に振とうし、水性相の分離後
ジクロルメタンを除去し、次いでピリジン1mlを加え
る。誘導体化のために、ベンゾイルクロリド5μlを加
え、30分室温で放置する。H2 O 0.5mlの添加
後、生成物をヘキサン2mlで抽出し、HPLCを用い
て分析する。 分離条件:カラム:ヌクレオシル- キラル2(250×
4mm)、マクヘレイ(Macherey)及びナゲル(Nagel) 社
(デュレン(Duren) 、FRG);展開剤:0.05%1
- プロパノール及び0.05%トリフルオル酢酸を有す
るn- ヘプタン(残存水を分子ふるい0.4Aで除去す
る);温度:25℃(冷却オーブンを用いて);流動速
度:1ml/分:250nmで分光光度による検出;試
料ループ:40μl。10.4分で生成物- ピークの相
関性が起り、その際誘導体化をR(+)-及びS(−)-フ
エニルエタノール(フルカ(Fluka) 社の市場で入手でき
る純粋な化合物を用いて実施する。
フエニルエタノールが得られ、S(−)-フエニルエタノ
ールは全く検出されないことを示す。 B.R(+)-又はS(−)-フエニルエタノールを用いる
逆反応 立体特異性の光度測定による検出に、次のテスト混合物
を使用する: 1)970μlR(+)-フエニルエタノール(11m
M;0.1Mリン酸カリウム緩衝液中で、pH8.0) 20μl NADP+ (165mg/ml) 10μl 酵素溶液 II)970μl S(−)-フエニルエタノール(11
mM;0.1Mリン酸カリウム緩衝液中で、pH8.
0) 20μl NADP+ (165mg/ml) 10μl 酵素溶液 比較として22mM(±)-フエニルエタノールを有する
第三混合物を使用する。
(30℃)で行われる。
高めて特異的であることが明らかである。混合物III
との比較は、S(−)-フエニルエタノールの同時の存在
が、酵素でさえも阻害することを示す。 〔例6〕S(−)-アルコールの調製 S(−)-アルコールを、ラルトバチルスケフィールから
の酵素を用いて製造することが可能である。その際アル
コール、たとえば(R,S)-フエニルエタノールのラセ
ミ体混合物を基質として使用し、酵素によりR- 成分を
酸化して対応するケトンとなす。その場合酵素の基質自
体であるケトン、たとえばアセトンの添加が有利である
ので生じるNADPHを再び酸化することができ、それ
によって反応を好都合に進行させることができる。その
時補酵素を、触媒上まさにまだ有効な量でしか必要しな
い。S- フエニルエタノールの製造例を、反応式(1)
−(3)にひとまとめにする。
分を表に対応して使用する: 表6:R,S- フエニルエーテルからS- フエニルエタノールを酵素により製造 する条件 ──────────────────────────────────── 成分 反応A 反応B ──────────────────────────────────── (最終濃度) R,S- フエニルエタノール 5mM 5mM リン酸カリウム- 緩衝液 (0.4M;pH7.0) 875μl 875μl MgCl2 ×6H2 O 0.1mM 0.1mM NADP+ 1mM 1mM フエニルエタノール- デヒドロゲナーゼ (28U/mg) 0.6U 0.6U アセトン ---- 10mM ──────────────────────────────────── 反応は30℃で進行し、0.10時点及び30分で試料
を取り出し、例3中に記載した様にフエニルエタノール
とアセトフエノンの含有量をHPLCによって測定す
る。結果を表7中にまとめて示す。 表7:R,S- フエニルエタノール(5mM)の酵素による反応 ──────────────────────────────────── 混合物 反応時間 アセトフエノン フエニルエタノール (分) (mM) (mM) ──────────────────────────────────── A 0 0 5 A 10 0.21 4.79 A 30 0.38 4.62 B 0 0 0 B 10 0.50 4.50 B 30 0.88 4.12
ドロゲナーゼは、NADPHの存在下で光学的に活性な
ヒドロキシ- 化合物の形成下にオキソ- 化合物を酵素還
元することに適し、この際反応混合物内の同時のNAD
PH- 再生が、特にグルコース-6- P/グルコース-6
- p- デヒドロゲナーゼ又はイソプロパノールによって
行われる。
るフエニルエタノール- デヒドロゲナーゼの形成を示
す。
のpH-依存性を示す。
ニルエタノールの増加を示す。
(b)酵素反応生成物を用いるR(+)-及び(S)-フエ
ニルエタノールのキラル分離を示す。
Claims (7)
- 【請求項1】――pH7のアセトフエノン−還元及び pH8の逆反応に対するpH−最適条件; ――25−30℃の温度−最適条件; ――5.3mMアセトフエノン又は6×10−4Mアセ
トフエノンのKM−値でアセトフエノン−反応の最大活
性; ――190μM NADPHで最大活性; ――EDTAによる急速な不活性化、しかも通常の阻害
剤、キレート剤及びSH−保護試剤の活性への僅かな影
響; ――芳香族、脂還式及び脂肪族ケトン、たとえば特にア
セトフエノン、p−ブロム−アセトフエノン、メチルシ
クロヘキサノン、アセトン、メチル−ヘキシルケトン、
4−フエニル−2−ブタノン、1−フエニル−1,2−
プロパンジオン、エチル−ペンチルケトン、ピナコリ
ン、プロピオフエノン、p−クロル−アセトフエノンを
還元する付加的な能力を有しかつNADPHの存在下で
アセトフエノンをR(+)−フエニルエタノールに還元
する能力のある、乳酸菌から単離されたフエニルエタノ
ール−デヒドロゲナーゼ。 - 【請求項2】 ラクトバチルス ケフィル(Lacto
bacillusKefir)から単離された請求項1
記載のデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項3】 ラクトバチルス ケフィル菌DSM20
587から単離されるデヒドロゲナーゼ。 - 【請求項4】 オキソ−化合物を、NADPHの存在下
にフエニルエタノール−デヒドロゲナーゼによって請求
項1−3のいずれか1つに従って変換することを特徴と
する、光学的に活性なヒドロキシ−化合物の形成下にオ
キソ−化合物を酵素還元する方法。 - 【請求項5】 同時にNADPH−再生を反応混合物内
で、特にグルコース−6−p/グルコース−6−p−デ
ヒドロゲナーゼによって行う請求項4記載の方法。 - 【請求項6】 (R)−アルコールの分離によって
(R,S)−アルコールのラセミ体混合物からS(−)
−アルコールを収得するにあたり、ラセミ体混合物とフ
エニルエタノール−デヒドロゲナーゼとを、請求項1−
3のいずれか1つに従ってNADP+の存在下に酵素反
応させ、形成されたR(+)−ケトンを未反応S(−)
−アルコールから分離することを特徴とする、上記化合
物の収得方法。 - 【請求項7】 酵素反応を、ケトンの存在下で実施し
て、NADP+を再生する請求項6記載の方法。
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