JP2703937B2 - チオール基を含有するポリマーおよびその製法 - Google Patents
チオール基を含有するポリマーおよびその製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はチオール基を含有するポリマーの製法に関す
る。
る。
メルカプト基で誘導体形成されたポリマー担体物質は
大変重要である。何故ならその物質により一方では通常
スルフヒドリル基と相互作用する物質が精製され、他方
では物質がスルフヒドリル基に不可逆的に固定されうる
からである。かかる物質は例えば酵素、抗体、プロ酵素
または抗原でありうる。担体マトリツクスとしてはこれ
まで特にアガロースの誘導体が用いられてきた。これら
ポリマー担体の製造においてはスルフヒドリル官能基の
化学的導入が特に注目に値する。すでに知られており従
って従来法に相当するものは、ホモシステインチオラク
トンを用いるポリマー誘導体形成、予めブロムシアンで
活性化されたグルタチオンとの結合ならびにエピクロロ
ヒドリンでの活性化および続く還元を伴うチオ硫酸塩と
の反応、のみならずジチオトレイトールとオキシラン基
との反応である（R.Axｎ氏他、Acta Chemica Scan.B
29,471〜474（1975））。
大変重要である。何故ならその物質により一方では通常
スルフヒドリル基と相互作用する物質が精製され、他方
では物質がスルフヒドリル基に不可逆的に固定されうる
からである。かかる物質は例えば酵素、抗体、プロ酵素
または抗原でありうる。担体マトリツクスとしてはこれ
まで特にアガロースの誘導体が用いられてきた。これら
ポリマー担体の製造においてはスルフヒドリル官能基の
化学的導入が特に注目に値する。すでに知られており従
って従来法に相当するものは、ホモシステインチオラク
トンを用いるポリマー誘導体形成、予めブロムシアンで
活性化されたグルタチオンとの結合ならびにエピクロロ
ヒドリンでの活性化および続く還元を伴うチオ硫酸塩と
の反応、のみならずジチオトレイトールとオキシラン基
との反応である（R.Axｎ氏他、Acta Chemica Scan.B
29,471〜474（1975））。
しかしながらこれらチオール含有ポリマーならびにそ
れらの製法には欠点があって、それゆえ改善が望まれて
いる。その理由の一つはマトリツクスが炭水化物構造を
有するゆえに機械的影響に対して感受性でありかつ微生
物により攻撃されうることがである。もう一つの理由は
スルフヒドリル基の導入法が高価であるかまたは煩雑で
ありそして多くの場合に不安定な結合を生ずるからであ
る。
れらの製法には欠点があって、それゆえ改善が望まれて
いる。その理由の一つはマトリツクスが炭水化物構造を
有するゆえに機械的影響に対して感受性でありかつ微生
物により攻撃されうることがである。もう一つの理由は
スルフヒドリル基の導入法が高価であるかまたは煩雑で
ありそして多くの場合に不安定な結合を生ずるからであ
る。
それゆえ、本発明の目的はチオール基を含有するポリ
マーを簡単にかつ経済的に製造しうる方法を開発するこ
とであった。その他に形成される化学的結合が高い安定
性を有するという条件を満たす必要があった。
マーを簡単にかつ経済的に製造しうる方法を開発するこ
とであった。その他に形成される化学的結合が高い安定
性を有するという条件を満たす必要があった。
本発明の目的はまた、誘導体形成に用いられるマトリ
ツクスに起因して優れた機械的および化学的安定性を有
するチオール基含有ポリマーを製造することであった。
ツクスに起因して優れた機械的および化学的安定性を有
するチオール基含有ポリマーを製造することであった。
今、驚くべきことに、オキシラン基で誘導体形成され
たポリマーが硫化水素の水溶性塩と反応して固定された
スルフヒドリル官能基を形成することが見出された。
たポリマーが硫化水素の水溶性塩と反応して固定された
スルフヒドリル官能基を形成することが見出された。
本発明は、ヒドロキシル基を含有する水不溶性ポリマ
ーを40〜50℃でエピクロロヒドリンまたはブタンジオー
ルジグリシジルエーテルからなるオキシラン基導入剤と
１〜４時間反応させ、それによりオキシラン基をポリマ
ー中に導入させ、得られたオキシラン基を含有するポリ
マーを水洗し、該ポリマーを水中に分散させ、０〜70℃
で２〜48時間硫化アルカリ金属で処理しそして該ポリマ
ーを水または希酸で洗浄することからなる、チオール基
含有ポリマーの製法に関する。
ーを40〜50℃でエピクロロヒドリンまたはブタンジオー
ルジグリシジルエーテルからなるオキシラン基導入剤と
１〜４時間反応させ、それによりオキシラン基をポリマ
ー中に導入させ、得られたオキシラン基を含有するポリ
マーを水洗し、該ポリマーを水中に分散させ、０〜70℃
で２〜48時間硫化アルカリ金属で処理しそして該ポリマ
ーを水または希酸で洗浄することからなる、チオール基
含有ポリマーの製法に関する。
ヒドロキシル基を含有するポリマーとしては炭水化物
に基づくポリマー例えばアガロースゲルまたはデキスト
ランゲルあるいはメタクリルアミド、Ｎ−メチレン−ビ
ス−メタクリルアミド、グリシジルメタクリレート／ポ
リエチレングリコール誘導体およびペンタエリトリトー
ルジメタクリレートに基づくポリマーが適当である。
に基づくポリマー例えばアガロースゲルまたはデキスト
ランゲルあるいはメタクリルアミド、Ｎ−メチレン−ビ
ス−メタクリルアミド、グリシジルメタクリレート／ポ
リエチレングリコール誘導体およびペンタエリトリトー
ルジメタクリレートに基づくポリマーが適当である。
化学的性質が共重合体としての特徴を有し、アクリル
酸またはメタクリル酸誘導体から構成されそしてオキシ
ラン基を有するポリマーがチオール基含有ポリマーの製
造に適する。かかる共重合体のモノマー成分の例をあげ
れば、メタクリルアミド、Ｎ−メチレン−ビス−メタク
リルアミド、グリシジルメタクリレート、グリシジルメ
タクリレート／ポリエチレングリコール誘導体またはペ
ンタエリトリトールメタクリル酸誘導体である。特にフ
ラクトゲル（Fractogel ）またはセパビーズ（Sepabea
ds ）なる名称の下に市販されている樹脂が適当であ
る。
酸またはメタクリル酸誘導体から構成されそしてオキシ
ラン基を有するポリマーがチオール基含有ポリマーの製
造に適する。かかる共重合体のモノマー成分の例をあげ
れば、メタクリルアミド、Ｎ−メチレン−ビス−メタク
リルアミド、グリシジルメタクリレート、グリシジルメ
タクリレート／ポリエチレングリコール誘導体またはペ
ンタエリトリトールメタクリル酸誘導体である。特にフ
ラクトゲル（Fractogel ）またはセパビーズ（Sepabea
ds ）なる名称の下に市販されている樹脂が適当であ
る。
これら水不溶性樹脂のヒドロキシル基は知られた方法
例えばEP−Ａ−0,203,463号の記載に従い１−クロロ−
2,3−エポキシプロパン（エピクロロヒドリン）または
1,4−ビス−（2,3−エポキシプロポキシ）−ブタン（ブ
タンジオールジグリシジルエーテル）からなるオキシラ
ン導入剤と反応させて、それによりオキシラン基をポリ
マー中に導入する。
例えばEP−Ａ−0,203,463号の記載に従い１−クロロ−
2,3−エポキシプロパン（エピクロロヒドリン）または
1,4−ビス−（2,3−エポキシプロポキシ）−ブタン（ブ
タンジオールジグリシジルエーテル）からなるオキシラ
ン導入剤と反応させて、それによりオキシラン基をポリ
マー中に導入する。
エポキシド化は、例えば水で湿らせたポリマー1kgを
水1500mlおよび2N水酸化ナトリウム溶液650ml中に懸濁
させそしてこの懸濁液を高められた温度例えば40〜50℃
でエピクロロヒドリン200mlと反応させることにより行
われる。１〜４時間後にポリマーを水洗しそして吸引乾
燥する。
水1500mlおよび2N水酸化ナトリウム溶液650ml中に懸濁
させそしてこの懸濁液を高められた温度例えば40〜50℃
でエピクロロヒドリン200mlと反応させることにより行
われる。１〜４時間後にポリマーを水洗しそして吸引乾
燥する。
次にオキシランを含有するポリマーを水または水性緩
衝溶液中に分散させる。その場合通常樹脂1kg当り500ml
〜３好ましくは約１が添加される。緩衝液としては
塩溶液例えばpH4〜13を有する燐酸ナトリウム緩衝液、
クエン酸ナトリウム緩衝液またはヘペス緩衝液が用いら
れうる。好ましくはポリマー1kg当り0.25モル炭酸水素
ナトリウム溶液１が添加される。
衝溶液中に分散させる。その場合通常樹脂1kg当り500ml
〜３好ましくは約１が添加される。緩衝液としては
塩溶液例えばpH4〜13を有する燐酸ナトリウム緩衝液、
クエン酸ナトリウム緩衝液またはヘペス緩衝液が用いら
れうる。好ましくはポリマー1kg当り0.25モル炭酸水素
ナトリウム溶液１が添加される。
次に水溶性硫化物または硫化水素化物、好ましくは硫
化アルカリ金属の10〜200gを加える。特に好ましくは硫
化ナトリウム×9H2O 70〜80gを加え、そして反応混合物
を０〜70℃好ましくは35〜45℃で撹拌する。反応時間と
しては２〜48時間、好ましくは12〜14時間が選択され
る。次にポリマーを水および／または0.5ml/100ml酢酸
で洗浄する。
化アルカリ金属の10〜200gを加える。特に好ましくは硫
化ナトリウム×9H2O 70〜80gを加え、そして反応混合物
を０〜70℃好ましくは35〜45℃で撹拌する。反応時間と
しては２〜48時間、好ましくは12〜14時間が選択され
る。次にポリマーを水および／または0.5ml/100ml酢酸
で洗浄する。
本発明はまたヒドロキシル基を含有する水不溶性ポリ
マーを40〜50℃で１−クロロ−2,3−エポキシプロパン
（エピクロロヒドリン）または1,4−ビス−（2,3−エポ
キシプロポキシ）−ブタンと１〜４時間反応させて、そ
れによりオキシラン基をポリマー中に導入させ、ポリマ
ーを水洗し、水溶液中にとり、０〜70℃で２〜48時間水
溶性硫化物で処理しそしてポリマーを水または希酸で洗
浄することからなるチオール基含有ポリマーの製法にも
関する。
マーを40〜50℃で１−クロロ−2,3−エポキシプロパン
（エピクロロヒドリン）または1,4−ビス−（2,3−エポ
キシプロポキシ）−ブタンと１〜４時間反応させて、そ
れによりオキシラン基をポリマー中に導入させ、ポリマ
ーを水洗し、水溶液中にとり、０〜70℃で２〜48時間水
溶性硫化物で処理しそしてポリマーを水または希酸で洗
浄することからなるチオール基含有ポリマーの製法にも
関する。
本発明による好ましいポリマーは、ペンタエリトリト
ール、メタクリル酸誘導体およびポリエチレングリコー
ルからなりかつジビニルベンゼンで架橋された共重合体
をエピクロロヒドリンと反応させることによりこの共重
合体中にオキシラン基を導入し、そして硫化ナトリウム
で処理することにより得られうるポリマーである。
ール、メタクリル酸誘導体およびポリエチレングリコー
ルからなりかつジビニルベンゼンで架橋された共重合体
をエピクロロヒドリンと反応させることによりこの共重
合体中にオキシラン基を導入し、そして硫化ナトリウム
で処理することにより得られうるポリマーである。
本発明によるさらに好ましいポリマーは、メタクリル
酸誘導体に基づくポリマー、例えばSepabeads （三菱
化成社製品）をブタンジオールジグリシジルエーテルと
反応させることによりこのポリマー中にオキシラン基を
導入し、そして硫化ナトリウムで処理することにより得
られうるポリマーである。
酸誘導体に基づくポリマー、例えばSepabeads （三菱
化成社製品）をブタンジオールジグリシジルエーテルと
反応させることによりこのポリマー中にオキシラン基を
導入し、そして硫化ナトリウムで処理することにより得
られうるポリマーである。
前記方法によりチオール官能基を備えたポリマー担体
はそれらが機械的および化学的に安定であるゆえに酵
素、プロ酵素、抗体または抗原の固定、ならびにメルカ
プト基と相互作用する物質のクロマトグラフイーに特に
好ましくかつ適する。
はそれらが機械的および化学的に安定であるゆえに酵
素、プロ酵素、抗体または抗原の固定、ならびにメルカ
プト基と相互作用する物質のクロマトグラフイーに特に
好ましくかつ適する。
さらに、かくして製造されたチオール含有ポリマーは
予めジスルフイツドでの活性化後に、チオール基を含有
する物質例えばタンパク質と反応してジスルフイツド交
換させるのにも適する。それによりかかるタンパク質は
濃縮されうるしまたはポリマーから溶離され、従って精
製されうる。重合体状メルカプト基の活性化に特に適す
るジスルフイツドの例をあげれば、2,2′−ジピリジル
ジスルフイツド、ビス−（２−ピリジル−ｎ−オキサイ
ド）−ジスルフイツド、および5,5′−ジチオビス−
（２−ニトロ安息香酸）である。
予めジスルフイツドでの活性化後に、チオール基を含有
する物質例えばタンパク質と反応してジスルフイツド交
換させるのにも適する。それによりかかるタンパク質は
濃縮されうるしまたはポリマーから溶離され、従って精
製されうる。重合体状メルカプト基の活性化に特に適す
るジスルフイツドの例をあげれば、2,2′−ジピリジル
ジスルフイツド、ビス−（２−ピリジル−ｎ−オキサイ
ド）−ジスルフイツド、および5,5′−ジチオビス−
（２−ニトロ安息香酸）である。
本発明によるポリマーはα１−アンチトリプシンの精
製に好都合に使用されうる。
製に好都合に使用されうる。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例 １ フラクトゲル（Fractogel ）に基づくチオール含有ポ
リマーの製造 ペンタエリトリトール、メタクリル酸誘導体およびポ
リエチレングリコールからなる共重合体フラクトゲルHW
−65（Ｆ）（東洋曹達社製）1000mlに水350mlおよび5N
水酸化ナトリウム溶液275mlを加え、この混合物を45℃
に加温した。これにエピクロロヒドリン200mlを加え、
この温度で２時間撹拌した。この混合物を過し、そし
て洗液のpHが７となるまで水洗した。吸引乾燥した樹脂
を0.2モルの炭酸水素ナトリウム溶液1400ml中にとりそ
してNa2S×9H2O 72gを加えた。この反応混合物を40℃で
15時間撹拌し、吸引過し、そして水および次に0.5ml/
100mlの酢酸で充分に洗浄した。
リマーの製造 ペンタエリトリトール、メタクリル酸誘導体およびポ
リエチレングリコールからなる共重合体フラクトゲルHW
−65（Ｆ）（東洋曹達社製）1000mlに水350mlおよび5N
水酸化ナトリウム溶液275mlを加え、この混合物を45℃
に加温した。これにエピクロロヒドリン200mlを加え、
この温度で２時間撹拌した。この混合物を過し、そし
て洗液のpHが７となるまで水洗した。吸引乾燥した樹脂
を0.2モルの炭酸水素ナトリウム溶液1400ml中にとりそ
してNa2S×9H2O 72gを加えた。この反応混合物を40℃で
15時間撹拌し、吸引過し、そして水および次に0.5ml/
100mlの酢酸で充分に洗浄した。
実施例 ２ セパビーズ（Sepabeads ）（三菱化成社製）に基づく
チオール含有ポリマーの製造 NaBH42gを含有する0.6N NaOH 1000ml中にセパビーズH
G 05 1000mlを懸濁させた。次にこれにブタンジオール
ジグリシジルエーテル1000mlを加え、この懸濁液を室温
で８時間撹拌した。エポキシ活性化されたセパビーズHG
05物質をガラスフリツト上、水15を用いて洗浄し
た。これを実施例１と同様にしてNa2S×9H2Oと反応させ
た。
チオール含有ポリマーの製造 NaBH42gを含有する0.6N NaOH 1000ml中にセパビーズH
G 05 1000mlを懸濁させた。次にこれにブタンジオール
ジグリシジルエーテル1000mlを加え、この懸濁液を室温
で８時間撹拌した。エポキシ活性化されたセパビーズHG
05物質をガラスフリツト上、水15を用いて洗浄し
た。これを実施例１と同様にしてNa2S×9H2Oと反応させ
た。
参考例 １ 2,2−ジチオビス−（ピリジン−Ｎ−オキサイド）を用
いるチオール含有フラクトゲルの活性化 実施例１に記載されるようにして製造されたチオール
含有フラクトゲルHW−65 500mlを、50ミリモル／の
トリス/HClおよび150ミリモル／のNaClを含有するpH
7.5の緩衝液Ａで平衡とした。次にこの樹脂物質を緩衝
液Ａ＋1.5ミリモル／の2,2′−ジチオビス−（ピリジ
ン−Ｎ−オキサイド）１ずつと４回室温で320分間イ
ンキユベーシヨンしそして次に再び緩衝液Ａで洗浄し
た。かくして活性化された樹脂物質はここで例えばジス
ルフイツド交換反応に使用できる。
いるチオール含有フラクトゲルの活性化 実施例１に記載されるようにして製造されたチオール
含有フラクトゲルHW−65 500mlを、50ミリモル／の
トリス/HClおよび150ミリモル／のNaClを含有するpH
7.5の緩衝液Ａで平衡とした。次にこの樹脂物質を緩衝
液Ａ＋1.5ミリモル／の2,2′−ジチオビス−（ピリジ
ン−Ｎ−オキサイド）１ずつと４回室温で320分間イ
ンキユベーシヨンしそして次に再び緩衝液Ａで洗浄し
た。かくして活性化された樹脂物質はここで例えばジス
ルフイツド交換反応に使用できる。
参考例 ２ ジ−（２−ピリジル）ジスルフイツドを用いるチオール
含有セパビーズHG 05の活性化 実施例２に記載されるようにして製造されたチオール
含有セパビーズHG 05の500mlを参考例１に記載される条
件下に1.5ミリモル／のジ−（２−ピリジル）−ジス
ルフイツドを用いて活性化した。
含有セパビーズHG 05の活性化 実施例２に記載されるようにして製造されたチオール
含有セパビーズHG 05の500mlを参考例１に記載される条
件下に1.5ミリモル／のジ−（２−ピリジル）−ジス
ルフイツドを用いて活性化した。
参考例 ３ α１−アンチトリプシンの精製 ヒト血漿500mlを30ミリモル／のメルカプトエタノ
ールを含有する水1000mlで希釈し、室温で１時間インキ
ユベーシヨンしそして次に硫酸アンモニウムを用い50％
（w/v）飽和と75％（w/v）飽和の間の分割沈殿にかけ
た。50〜75％（w/v）残留物を50ミリモル／のトリ
ス、200ミリモル／のNaClおよび１ミリモル／のEDT
Aを含有するpH8.0の溶液中に溶解させ、そして500mlのA
CA 202カラム（アクリルアミドをベースとしたカラ
ム、バイオ・ラッド社製）でクロマトグラフイーした。
α１−アンチトリプシンを含有するフラクシヨンを合し
そして2,2′−ジチオビス−（ピリジン−Ｎ−オキサイ
ド）で活性化したチオール−フラクトゲルカラム（100m
l）に加えた。このカラムを同じ緩衝液で洗いそしてα
１−アンチトリプシンを10ミリモル／のジチオトレイ
トールを含有する溶液を用いて溶離した。かくして得ら
れたα１−アンチトリプシンは実質上不純物を含有して
いなかった。
ールを含有する水1000mlで希釈し、室温で１時間インキ
ユベーシヨンしそして次に硫酸アンモニウムを用い50％
（w/v）飽和と75％（w/v）飽和の間の分割沈殿にかけ
た。50〜75％（w/v）残留物を50ミリモル／のトリ
ス、200ミリモル／のNaClおよび１ミリモル／のEDT
Aを含有するpH8.0の溶液中に溶解させ、そして500mlのA
CA 202カラム（アクリルアミドをベースとしたカラ
ム、バイオ・ラッド社製）でクロマトグラフイーした。
α１−アンチトリプシンを含有するフラクシヨンを合し
そして2,2′−ジチオビス−（ピリジン−Ｎ−オキサイ
ド）で活性化したチオール−フラクトゲルカラム（100m
l）に加えた。このカラムを同じ緩衝液で洗いそしてα
１−アンチトリプシンを10ミリモル／のジチオトレイ
トールを含有する溶液を用いて溶離した。かくして得ら
れたα１−アンチトリプシンは実質上不純物を含有して
いなかった。
Claims (6)
- 【請求項１】ヒドロキシル基を含有する水不溶性ポリマ
ーを40〜50℃でエピクロロヒドリンまたはブタンジオー
ルジグリシジルエーテルからなるオキシラン基導入剤と
１〜４時間反応させ、それによりオキシラン基をポリマ
ー中に導入させ、得られたオキシラン基を含有するポリ
マーを水洗し、該ポリマーを水中に分散させ、０〜70℃
で２〜48時間硫化アルカリ金属で処理しそして該ポリマ
ーを水または希酸で洗浄することからなる、チオール基
含有ポリマーの製法。 - 【請求項２】ヒドロキシル基を含有する水不溶性ポリマ
ーが炭水化物に基づくポリマーであるか、またはメタク
リルアミド、Ｎ−メチレン−ビス−メタクリルアミド、
グリシジルメタクリレート／ポリエチレングリコール誘
導体またはペンタエリトリトールジメタクリレートに基
づくポリマーである請求項１記載のポリマーの製法。 - 【請求項３】ヒドロキシル基を含有する水不溶性ポリマ
ーがアガロースゲルである請求項１記載のポリマーの製
法。 - 【請求項４】オキシラン基を含有するポリマーがアクリ
ルまたはメタクリル酸誘導体を含有する請求項１記載の
ポリマーの製法。 - 【請求項５】ヒドロキシル基を含有する水不溶性ポリマ
ーが、ペンタエリトリトール、メタクリル酸誘導体およ
びポリエチレングリコールからなり且つジビニルベンゼ
ンで架橋された共重合体であり、オキシラン導入剤がエ
ピクロロヒドリンであり、そして硫化アルカリ金属が硫
化ナトリウムである請求項１記載のポリマーの製法。 - 【請求項６】ヒドロキシル基を含有する水不溶性ポリマ
ーが、メタクリル酸誘導体に基づくポリマーであり、オ
キシラン導入剤がブタンジオールジグリシジルエーテル
であり、そして硫化アルカリ金属が硫化ナトリウムであ
る請求項１記載のポリマーの製法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3726454.0 | 1987-08-08 | ||
| DE19873726454 DE3726454A1 (de) | 1987-08-08 | 1987-08-08 | Thiolgruppenhaltige polymere, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPS6466213A JPS6466213A (en) | 1989-03-13 |
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