PT88191B

PT88191B - Processo para a preparacao de polimeros contendo grupos tiol

Info

Publication number: PT88191B
Application number: PT88191A
Authority: PT
Inventors: Werner Stueber; Hartmut Loebermann
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-08-08
Filing date: 1988-08-04
Publication date: 1995-03-01
Also published as: DK439988A; KR890003842A; FI90779B; AU616898B2; FI90779C; PT88191A; JPS6466213A; AU2043188A; DE3864958D1; ES2025743T3; JP2703937B2; ATE67509T1; GR3003361T3; DK439988D0; EP0305749B1; CA1315464C; EP0305749A1; FI883648A0; KR0131766B1; DE3726454A1

Description

A presente invenção refere-se a um processo para preparação de polimeros contendo grupos tiol e sua utilização.

Os materiais de suporte polímeros, derivatizados com grupos mercapto, são de grande interesse pois com eles ê possível por um lado purificar substâncias que normal mente sofrem interacções com grupos tiol, e por outro imobilizar irreversivelmente substâncias nos grupos tiol. Tais substâncias podem ser por exemplo enzimas, anticorpos, pró-enzimas ou antige neos. Como matriz de suporte foram utilizados até agora em especial derivados da agarose. Na preparação destes suportes polímeros dã-se especial atenção à introdução química das funções tiol, São conhecidas e correspondem portanto ao estado actual da tecno logia as derivatizações de polímeros com homocisteina-tiolactona, acoplações com glutationa antecedidas de activação com bromo-cia

N

no, bem como a activação com epiclorhidrina e posterior reacção j com tiosulfato e uma reacção de redução, bem como uma transforma!

i ção do grupo oxirano com ditiotreitol (R. Axén et al., Acta Chemica Scan. B 29, 471-474, 1975).

No entanto, estes polímeros conten[ do grupos tiol bem como os seus processos de preparação apreseni

H tam desvantagens e carecem portanto de melhoramentos. Por um lajjdo, as razões para tal residem na matrix, que devido ã sua estru j! tura de hidrato de carbono ê sensível do ponto de vista mecânico e também susceptível de ataque microbiológico. Por outro lado, essas razões residem no processo para introdução dos grupos tiol_; i que ou é demasiado dispendioso ou complexo, e em alguns processos j de preparação que implica ainda a formação de ligações instãveisj j 0 objectivo da presente invenção consistia pois em desenvolver um processo que permitisse preparar de forma simples e económica polímeros contendo grupos tiol. Para além disso deveria ser satisfeita a condição de as ligações químicas formadas se caracterizarem por uma elevada estabilidade.

Era também objectivo da presente in venção a preparação de polímeros contendo grupos tiol caracterii zados por uma estabilidade mecânica e química superiores graças à matrix utilizada para derivatização.

Verificou-se agora surpreendentemen

I te, que os polímeros derivatizados com grupos oxirano reagem com sais hidrossolúveis do ãcido sulfídrico formando funções tiol imobilizadas.

Objecto da presente invenção é um polímero contendo grupos tiol obtido através da introdução de grupos oxirano num polímero não solúvel em ãgua e contendo grupos hidroxi, e tratamento do polímero contendo os grupos oxirano com um sal hidrossoluvel do ãcido sulfídrico, de preferência um sal alcalino ou de terras alcalinas.

Como polímeros contendo grupos hidroxi são adequados polímeros à base de hidratos de carbono, por exemplo geles de agarose ou geles de dextrano, ou polimerizados à base de metacrilamida, N-metileno-bis-metacrilamida, derivados do glicidilmetacrilato-polietilenoglicol e pentaeritrita-dimetacrilato.

il reza química são designados copolimerizados e são constituídos ípor derivados do ãcido acrílico ou metacrílico e que possuem gru !pos oxirano, são preferencialmente indicados para a preparação í

ίde polímeros contendo grupos tiol. As componentes monõmeras de • tais copolimerizados são por exemplo metacril-amida, N-metilenoi -bis-metacrilamida, glicidil-metacrilatos, derivados do glicidili metacrilato-polietilenoglicóis ou derivados do ãcido pentaeri|tritmetacrílico. São em especial indicadas resinas que são comerí cializadas sob as designações Fractogel ou Sepabeads .

^! Os grupos hidroxi destas resinas não hidrossoluveis são transformados por processos jã conhecidos ί ί (por exemplo, segundo a EP-A-0 203 463) com l-cloro-2,3-epoxií : -propano (epiclorhidrina) ou com 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)-butajno, introduzindo-se assim os grupos oxirano nos polímeros.

A epoxidação faz-se por exemplo sus pendendo 1 kg de polímero humedecido com ãgua em 1500 ml de água e 650 ml de solução de hidróxido de sódio 2N, e fazendo reagir 'com 200 ml de epiclorhidrina a temperatura aumentada, por exemjpio a 40-509 C. Passadas 1-4 horas lava-se o polímero com ãgua e· seca-se por aspiração.

O polímero contendo os grupos oxira no é então retomado com ãgua ou com uma solução tampão aquosa, ! adicionando-se normalmente 500 ml a 3 1, de preferência no entan to cerca de 1 1, por cada kg de resina. Como tampões podem utili zar-se soluções de sais, por exemplo tampão de fosfato de sódio, ί tampão de citrato de sódio ou tampão Hespes com um pH de 4 atê í pH 13. De preferência adiciona-se por cada kg de polímero 1 li; tro de uma solução 0,25 molar de bicarbonato de sõdio.

ί Depois disso adicionam-se 10-200 g de um sulfureto hidrossoluvel ou hidrossulfureto, de preferência um sulfureto alcalino. Dá-se especial preferência à adição de 70-80 g de sulfureto de sõdio x 9HgO e agita-se a mistura a uma temperatura de 0-709 C, de preferência a 35-459 C. Como tempo de reacção escolhem-se 2 a 48 horas, de preferência 12-14 horas. O polímero é então lavado com ãgua ou/e com um ãcido acético 0,5 ml/100 ml.

Objecto da presente invenção ê também um processo para preparação de um polímero contendo grupos tiol, caracterizado por se fazer reagir durante uma a quatro horas a 40-509 C um polímero não solúvel em água e contendo grupos! hidroxi com l-cloro-2,3-epoxipropano (epiclorhidrina) ou 1,4-bis i (2,3-epoxipropoxi)-butano, sendo assim introduzidos os grupos ] J oxirano no polímero, se lavar o polímero com água, se retomar em j solução aquosa, se tratar com um sulfureto hidrosoluvel a uma temperatura de 0-709 C durante 2 a 48 horas e se lavar o polímero com ãgua ou com ãcido diluído.

Dá-se preferência a um polímero a ' I que se refere a presente invenção que pode ser obtido introduzin do grupos oxirano, através de reacção com epiclorhidrina, num co polimerizado de pentaeritrita, derivados de ãcido metacrílico e polietilenoglicol, ligado a divinil-benzeno, e que ê tratado com ί sulfureto de sódio.

i ,

Para alem disso, da-se também prefe rência a um polímero a que se refere a presente invenção, que po í; de ser obtido introduzindo num polímero à base de derivados do í ãcido metacrílico (Sepabeads ) os grupos oxirano através de reac j ção com éter butanodiol-glicidílico, e se tratar com sulfureto j de sódio.

Os suportes polímeros contendo funções tiol obtidos de acordo com o processo acima descrito são es pecialmente adequados, graças ã sua estabilidade química e mecânica, para a imobilização de enzimas, pró-enzimas, anticorpos ou antigêneos, bem como para a cromatografia de compostos que sofrem interacções com grupos mercapto.

; Para além disso, os polímeros contendo grupos tiol assim obtidos são adequados para reagirem após activação prévia com um dissulfureto, com compostos contendo gru pos tiol, por exemplo proteínas, através de permuta de dissulfuretos. Desta forma é possível concentrar tais proteínas ou eluir do polímero, e assim purificá-las. Os dissulfuretos especialmente indicados para a activação de grupos mercapto polímeros são por exemplo dissulfureto de 2,2'-dipiridilo, dissulfureto de bis^ -(2-piridil-N-õxido) ou ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzôico).

ι De preferência pode utilizar-se um í ΐ polímero a que se refere a presente invenção para a purificação ι de alfa.-antitripsina.

' -L ί ’ Os exemplos que se seguem ilustram i !

!a presente invenção: j ; ' !

j p EXEMPLO 1 j Processo para preparação de um poli.

I *· R ímero contendo grupos tiol a base de Fractogel A 1000 ml de Frac R togel HW-65 (F), um copoliemrizado de pentaeritrita, derivados do ãcido metacrílico e polietileno-glicol (fabricante: Toyo Soda) adicionaram-se 350 ml de água e 275 ml de solução 5N de hidrôxi-| ’do de sódio e aqueceu-se a 459 C. Juntaram-se 200 ml de epiclorhidrina e agitou-se durante 2 horas a esta temperatura. Filtrou -se e lavou-se tantas vezes com ãgua até o pH baixar para 7. A resina seca por aspiração foi retomada em 1400 ml de solução de bicarbonato de sódio 0,3 mol/1 e tratada com 72 g de Na₂S x 9H₂O.

íAgitou-se a mistura durante 15 horas a 409 C, filtrou-se por aspiração e em seguida lavou-se com ãcido acético 0,5 ml/100 ml. ι

I í

EXEMPLO 2

Processo para preparação de um poli, mero contendo grupos tiol à base de Sepabeads (fabricante: Mitsubishi) .

P

Suspenderam-se 1000 ml de Sepabeads HG05 em 1000 ml de 0,6 N NaOH que continha 2 g de NaBH^. Em seguida juntaram-se 1000 ml de éter butanodiol-diglicidilico e agi. tou-se a suspensão durante 8 horas à temperatura ambiente. O Sepabeads HG05 activado com grupos epóxi foi lavado em seguida so bre um filtro de porcelano com 15 1 de ãgua. A transformação com Na₂S x 9H₂O faz-se conforme descrito no Exemplo 1.

— RI j Activação de Fractogel contendo grupos tiol, com 2,2'-ditiobis-piridina-N-õxido.

500 ml de Fractogel^R HW-65, prepara j'do conforme descrito no Exemplo 1, foram equilibrados com um tam Πpão A, que continha 50 mmol/1 de Tris/HCl e 150 mmol/m de NaCl, pH 7,5. Em seguida a resina foi incubada 4 vezes com respectiva;mente 1 litro de tampão A +1,5 mmol/1 de 2,2'-ditiobis-piridina -N-óxido durante 320 minutos â temperatura ambiente, e em seguiI da lavada de novo com tampão A. A resina assim activada pode ser utilizada por exemplo para reacções de permuta de dissulfuretos. ί ί ί EXEMPLO 4

I

I — r

Activação de Sepabeads HG05 conten j do grupos tiol com dissulfureto de di-(2-piridilo).

ι R

500 ml de Sepabeads HG05, preparados de acordo com o exemplo 2, foram activados com 1,5 mmol/1 de dissulfureto de di-(2-piridilo) nas mesmas condições do Exemplo lí 3.

i

EXEMPLO 5

Purificação de alfa^-antitripsina. 500 ml de plasma humano foram diluí.

dos com 1000 ml de ãgua, que continha 30 mmol/1 de mercapto-etanol, incubados durante uma hora à temperatura ambiente e em seguida submetidos a uma precipitação fraccionada com sulfato de amónia entre uma saturação de 50% (p/v) e uma saturação de 75% (p/v). O resíduo de 50%-70% (p/v) foi dissolvido numa solução que continha 50 mmol/1 de Tris, 200 mmol/1 de NaCl e 1 mmol/1 de EDTA, pH 8,0, e cromatografado sobre coluna ACA 202^R de 500 ml. As fracções contendo a alfa-, -antitripsina foram reunidas e vazadas sobre uma coluna de tiol-Fractogel (100 ml) activada com 2,

2'-ditiobis-(piridina)-N-õxido. A coluna foi lavada com a mesma solução tampão e a alfa^-antitripsina foi eluida com uma solução que continha 10 mmol/1 de ditiotreitol. A alfa^-antitripsina assim obtida encontrava-se praticamente isenta de impurezas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

X- ί

Processo para preparaçao de um poli?

I mero contendo grupos tiol, caracterizado por se fazer reagir du-i

J rante uma a quatro horas a 40 - 509 C um polímero não solúvel em I ãgua e contendo grupos hidroxi com l-cloro-2,3-epõxi-propano [ (epiclorhidrina) ou um 1,4-bis-(2,3-epoxipropõxi)-butano, introduzindo-se assim grupos oxirano no polímero, se lavar o polímero com ãgua, se retomar em solução aquosa, se tratar com um sulfure to hidrossolúvel a uma temperatura de 0-709 C durante 2 a 48 hoí ras e se lavar o polímero com ãgua ou com ãcido diluído.

j

I i

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o polímero contendo os grupos hidroxi ser um polímero â base de hidratos de carbono, um polimerizado à base de metacrilamida, N-metileno-bis-metacrilamida, derivados do glicidil-metacrilato-polietileno-glicol ou pentaeritritidimetacrilato.

- 3- Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o polímero contendo os grupos hidroxi ser um gel de agarose.

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o sal do ãcido sulfldrico ser um sal a/ calino ou um sal de terras alcalinas.

i Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o polímero contendo os grupos oxirano conter derivados do ãcido acrílico ou metacrílico.

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o polímero não solúvel em ãgua e conten do os grupos hidroxi ser um copolimerizado de pentaeritrol, deri. vados do ãcido metacrílico e polietileno-glicol, que é ligado com divinil-benzeno, sendo os grupos oxirano introduzidos através de reacção deste copolimerizado com epiclorhidrina e que é tratado com sulfureto de sódio.

Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por se obter um polímero não solúvel em ãguõ. e contendo grupos hidroxi â base de derivados do ãcido metacríli co (Sepabeads ), sendo os grupos oxirano introduzidos através de reacção deste polímero com éter butanodiol-glicidílico, e que ê tratado com sulfureto de sódio.

i¹ A requerente declara que o primeiro li pedido desta patente foi apresentado na Republica Federal Alemã,í /em 8 de Agosto de 1987, sob o n9. P 37 26 454.0. |