CN87104007A - 用于固定生物活性物质的可再生的担体基质 - Google Patents

Abstract

一种通常用于固定生物活性物质的担体基质，含有用纤维素的二烷基氨烷基醚衍生物覆盖的核心担体。这类担体基质通常能固定带净负电荷的蛋白质类物质。此担体基质容易再生，如当已固定的生物制剂失去其有用的活性后，可简单地用碱和一种合适的盐溶液洗涤。固定化—担体基质再生能进行多次的循环而无显著的有害影响。

Description

近年来，生物活性物质，特别是酶的固定化方法，已经有了迅速的发展，可以公正地说担体基质及其制法，如具有工业重要性的酶催化反应，已成为相当成熟的知识领域。发展它们的初始动力是为了保存酶;在应用酶的均相反应中，酶一般只用一次。由于酶通常是昂贵的，并可能是反应物中最昂贵的，因此需要发展允许多次使用酶的方法。把酶固定在固体担体上导致了多相的酶催化反应，在这种场合下已固定的酶能容易地除掉，如在间歇式搅拌反应器中，或可用于连续过程，如固定床中，可是在两种情况下都可使酶催化过程中的酶能重复使用，直至其活性降低至如再使用经济上已不可行时为止。

目前已有了各种担体基质，特殊地说来能用于制备固定化酶和一般地说来能用于制备固定化生物活性物质。有一些担体基质通过离子相互作用和酶-典型的生物活性物质-相结合，其它则通过截留的方式与酶结合。在另一些情况下，生物活性物质则用共价键固定在担体上或以中间类型的键与担体相连接。因此，熟悉技术的人们当在其工艺室中寻找一种担体基质来固定一种生物活性物质时，已经有一些实际的选用方案。

然而，在担体基质的领域中仍存在一些工艺方面的重大空白。当固定化生物活性物质的活性已消耗掉-再使用已无经济效益时，制备一种担体基质能方便地和便宜地再生就是一个迫切需要解决的目标。更理想的是能使担体基质多次再生，而其继续固定生物活性物质的活性并不减弱。虽然目前已取得了某些有限的成就，如美国专利第4，248，969及4，250，260号所指出的方法，但是还迫切需要更经济的方法。

二乙基氨乙基纤维素（DEAE纤维素）是一种已用于固定酶的担体，它被选做担体材料是由于价格比较低廉，但其应用则仅局限于在釜式搅拌反应器中。见KirK-Othmer    EnCyClOPedia    of    ChemiCal    Technology，第三版，卷9，155页（J.Wiley    &    SOns出版公司，1980）。这种担体材料由于流动特性不良而不适用于填充床反应器中，因为流动特性是用做填充床所必需的一种特性。事实上，DEAE纤维素是用在美国第一个采用固定化葡萄糖异构酶的工业过程中（前引文献157页），但不久便被其它能用做填充床的固定化葡萄糖异构酶所代替。

为了得到在填充床反应器中连续过程所必需的良好流动性，担体的颗粒应当是不可压缩的、硬的、不参加反应的材料所制成，特别是难熔无机氧化物，如氧化铝、氧化硅、玻璃、陶瓷等。美国专利4，141，857曾举例说明后者是用作有机树脂复盖的担体中的核心材料，而有机树脂则与生物活性物质结合在一起。

本申请书介绍一种具有成功地用于填充床中一切特性的担体基质，此外它还具备了从用过的固定在其上的酶中容易再生的特性。本发明的担体基质容易制备，经济，能固定很多生物活性物质，并用特别简单和快速的方法便能再生。

本发明的目的是制备一种用于固定生物活性物质的担体基质，并当生物活性物质的活性降至某要求水平以下时，能容易地再生。在一个实施方案中包含一种用部分羟基已转化成二烷基氨烷基醚衍生物的纤维素所复盖的难熔氧化物的核心担体。在一个更具体的实施方案中，纤维素用DEAE纤维素。在另一个更具体的实施方案中，氧化物用氧化铝。

本发明的担体基质至少在概念上可以看做系由几种功能上有关的部分组成的。在基质的中心是核心担体，它通常是一种不可压缩的、抗磨损的、在典型的酶催化过程的条件下是化学惰性的固体。采用这种担体的填充床具有良好的流动特性。核心担体用一种其中部分羟基已衍生成二烷基氨烷基醚的纤维素加以复盖。所得的担体基质借助于强的离子交换力能够固定很多酶。虽然在典型的酶催化反应条件下，酶仍结合在担体基质上而基本上不被浸洗掉，但用过了的酶能容易地用碱或浓盐溶液从基质上洗掉，从而再生了担体基质。可以进行多次酶的固定化-担体基质再生的循环，而并无有害的后果。

本发明的实践中可以采用的核心担体最好以功能来表征。它们是不可压缩的物料，在典型的酶反应条件下是完全惰性的，并且是坚韧的抗磨损的颗粒，填充在床层中则表现出良好的流动特性。任何有这些功能特性的材料都可以用在本发明的实践中。例子包括难熔的无机氧化物、玻璃、特别是多孔玻璃和陶瓷材料。在难熔的无机氧化物中可以举出的有氧化铝、氧化硅、氧化钍、氧化锆、氧化镁、氧化钛及其组合物。氧化铝是一种特别希望的核心担体。

然后用纤维素复盖核心担体。因为纤维素本身在多数溶剂中不溶解，所以一般不直接用纤维素，而用水解时能容易转化成纤维素本身的可溶性纤维素的衍生物复盖核心担体。任何溶于低沸点有机溶剂并容易经化学转化生成纤维素的纤维素衍生物，都可用于本发明的实践中。纤维素酯类是可用于本发明实践中的良好的纤维素衍生物，而使用乙酸纤维素特别方便。虽然在下面的叙述中是用乙酸纤维素这个词来表达，但应当认为乙酸酯是仅作为这类化合物的代表。

例如，用溶于有机溶剂的乙酸纤维素的溶液与核心担体相接触的方法，可以复盖核心担体。一种复盖核心担体的方法是，使核心担体与乙酸纤维素的溶液相混合，乙酸纤维素的量应能满足复盖核心担体所需的重量，然后逐渐蒸发掉溶剂。这种复盖核心担体的方法，特别希望使用一种较低沸点，即沸点低于约100℃的溶剂，使得有利于以后将溶剂除掉。但是，应当认为这种做法的优点仅在于方便，有机溶剂的沸点在本发明的成功中不是关键性的。

另一种用乙酸纤维素复盖核心担体的常用方法是将乙酸酯的有机溶液循环通过核心担体的床层。在连续循环过程中，核心担体一般吸收了平衡量的乙酸纤维素，吸收的数量和溶液中乙酸纤维素的浓度、溶剂的性质和自溶液中吸收乙酸酯的担体有一定的关系。平衡达到后，多余的溶液自柱中排出，用加热或放在气流中的方法把有机溶剂蒸发掉。

然后使乙酸纤维素复盖的核心担体反应，以便把所有的乙酸基团除掉。在碱的存在下进行水解的方法特别有效，可以用技术上已熟知的方法完成。例如，乙酸纤维素复盖的核心担体可以和浓度约为0.5%-4%（重量/体积）的碱在温度约为25℃-约70℃下反应。不讲自明，很多水解的方法是已知的，因此不需要举例说明。技术熟练者容易懂得重要之处在于所用的碱、碱的浓度、反应温度和反应时间除了水解乙酸酯键以外对核心担体应当没有影响。采用这类水解方法至少可以除掉约80%的酯基，一般约90%以上的酯基可以除去。

在制成的产物中，以干剂计算，希望纤维素占约1%至20%（重量）。在实践本发明时，已发现纤维素含量超过15%（重量）时，并不更为有利。以制成的产物的干燥重量计算，纤维素复盖的核心担体以含约1%-约10%（重量）较好。

然后把以上制得的纤维素复盖的核心担体上的自由羟基转化成二烷基氨烷基纤维素醚。根据自由羟基与二烷基氨烷基卤化物反应的方法也是已知的，例如纤维素复盖的核心担体和盐酸二烷基氨烷基卤化物的溶液在约30℃-80℃和碱的存在下，反应约1-10小时。

制得的纤维素醚的二烷基氨烷基部分的结构式为R_aR_bN（CH₂）^- _p，其中R_a和R_b是分别选自饱和的烷基C_nH_2n+1，其中n是由1至20的整数，通常是1至6，更常用的是1至4。可用于实践本发明的烷基有甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基。伯烷基的位阻现象的影响最小，因而优先采用，特别可取的是二乙基氨烷基醚。

亚甲基链的长度可从亚乙基（P＝2）直到约亚癸基（P＝10），优先选用链长P为2，3或4的，特别可取的是亚乙基（P＝2）。实践本发明时，采用二乙基氨乙基醚特别理想，其中R_a，R_b和（CH₂）_p都是两个碳原子的分子片。

不可能也不必要把复盖在核心担体上的纤维素中所有的羟基都转化成对应的二烷基氨烷基醚。一般希望衍生作用的程度能使每克制成的干担体基质产生0.2至约2.0毫当量的醚基已经足够，最通常的衍生程度的范围约为0.5至约1.2毫当量/克。

到这个阶段，担体基质已制成。现在它便可以承载生物活性物质，如一般的酶、辅助因子、抗体、抗原和蛋白质类。由于担体基质的性质，生物活性物质必需具备合适的电荷类型。即，本发明的担体基质在固定生物活性物质时，起着和阴离子交换剂相似的作用。所以在本发明的实践中，至少具有微量过剩负电荷的生物活性物质能最有效地被固定。固定作用的实施比较简单，首先用有合适PH值，一般在5.5和约8.5的范围之间的缓冲剂冲洗担体基质，然后把担体与酶在和冲洗用同样PH值的缓冲剂中的溶液相混合，保持足够长的时间直至达到平衡为止，一般约为5至约20小时。排出多余的酶溶液，仔细用水洗涤此被固定的生物活性物质以除去附着在上面的生物活性物质，在任何填充床连续过程的初始阶段这种附着物会很容易地淋洗掉。固定作用一般在40℃以下进行，更经常地在低于约25℃下进行，常在约5℃至约20℃范围之间进行。

正如前面已经谈到，任何合适的净电荷型的生物活性物质都可根据本发明的实践加以固定。这样，具有净负电荷即等电点大于7的酶、辅助因子、抗体、抗原和其它蛋白质类物质都能按本发明叙述的方法加以固定，尽管并非所有的物质都必定固定至同样的程度或都具有相同效率。可用于本发明的实践的一些酶的例子有葡萄糖异构酶、蔗糖酶、青霉素酰基转移酶、柚苷酶、葡聚糖蔗糖酶和三磷酸腺苷脱酰胺酶，但上述例子只是用于说明而已。

本发明的担体基质的重要而又显著的特点是，当所固定的生物活性物质已丧失了活性或由于别的原因而不想再使用时，这种担体基质容易再生。将稀碱溶液或浓盐溶液与该固定化系统相接触即可容易地完成固定基质的再生。

可以使用的碱有碱金属氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂;碱土金属氢氧化物，如氢氧化钡、氢氧化钙和氢氧化镁;以及氢氧化铵和季铵碱。达到能分解里面的核心担体的碱浓度是碱浓度的最高限度;例如，当用碱金属氢氧化物处理的系统中核心担体是氧化铝时，碱的浓度要避免超过约1N。虽然可以用稀至0.02N的碱水溶液，但更有代表性的碱溶液浓度是约0.1至1.0N。碱液的体积为固定化系统的10-15倍已足够，不过也可以用低至2-3倍体积但浓度足够高的碱溶液，但可能需要延长接触时间，在室温下再生时间一般不需要超过30分钟。当用高度离子型的化合物如氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸铵、硫酸钠等盐类溶液再生时，2-3摩尔的浓度就已足够。盐的性质不大重要，只要它不与核心担体反应，在水溶液中高度离解，并在水中足够溶解而得到一种其离子强度至少相当于2摩尔的氯化钠溶液即可用于再生。不论是用碱或盐处理生物活性体系，可以接着用大量的水或PH值为中性或接近中性的5.5-8.5的缓冲剂洗涤已处理过的体系，就可以除去多余的碱或盐。按以上叙述的方法处理已失效的固定化体系即可再生担体基质，此担体基质又可用于固定新的或不同的被固定的生物活性物质。可以进行多次这样的再生循环，并对所得的固定化生物活性物质或担体基质本身都没有明显不良的影响。

以下的实例只是对本发明的说明，而不是对本发明的限制。

实例1

纤维素复盖的γ-氧化铝。γ-氧化铝（30g，约100ml），在105℃下干燥过夜，装入一个带夹套的柱子（3.0×50cm）。不同浓度的乙酸纤维素（乙酸酯含量约28%）的丙酮溶液（30ml）用泵送由下至上地通过柱子，用一个振动器帮助氧化铝流化。系统循环1小时后，用泵将丙酮溶液由柱子下部排出。用氮气流由下至上吹扫2小时，同时夹套中用60℃的水循环，已复盖的载体即被干燥。

用300ml含6g氢氧化钠的溶液，在60℃下处理得到的乙酸纤维素复盖的载体，使乙酸酯水解。反应完成后（2小时），用去离子水洗涤纤维素复盖的载体至洗涤液PH值呈中性。用900℃下灼烧失重的方法测定复盖的载体上的纤维素含量，所得数值列于表1。

表1    担体的纤维素含量

每30g氧化铝    灼烧失重    固定化之后葡萄糖

载体提供的    纤维素含量，%    异构酶的活性，

乙酸纤维素    单位/g

6.0    6.9    1475

9.0    10.2    1480

12.0    13.7    1560

所有纤维素复盖的载体（30g）曾用9g二乙基氯乙基胺盐酸盐（diethylaminoethyl    chloride    hydrochloride）处理，以固定葡萄糖异构酶。

制备DEAE纤维素复盖的氧化铝载体。10%纤维素复盖的氧化铝载体（30g）按上述方法在有夹套的柱中用含3g氢氧化钠和不同数量的二乙基氯乙基胺盐酸盐的300ml溶液流化。溶液在60℃下以向上流动方式循环4-5小时。然后此用过的溶液由柱中向下排出，载体用去离子水洗涤至流出液的PH值为7.5-8.0。

制备固定化葡萄糖异构酶。向上述制成的30g    DEAE纤维素复盖的氧化铝载体以向上流动的方式通入500mlPH值为7.2的0.2M盐酸咪唑缓冲剂。多余的缓冲剂用去离子水洗掉并将水排出。用0.05MPH值为7.2的咪唑缓冲剂把葡萄糖异构酶稀释成500ml的酶溶液。酶溶液在柱中以向上流动方式循环16-20小时。当提供溶液中的酶含量为每克1100-3200单位，载体含10.2%纤维素，30g载体曾用3.0g二乙基氯乙基胺盐酸盐处理过时，表2列出这样所得的固定化葡萄糖异构酶的活性。酶溶液和担体在柱中60℃下流化。排出柱中的液体并用水洗涤此固定化酶的体系以除去未结合的酶。

表2    葡萄糖异构酶在DEAE纤维素复盖的

氧化铝载体上的固定化

提供的酶，单位/g    固定化葡萄糖异构酶

的初始活性，单位/g

1100    620

1600    990

2500    1180

3200    1420

把葡萄糖异构酶固定在曾用不同数量的二乙基氯    乙基胺盐酸盐处理过的纤维素复盖的载体上（10%重量的纤维素），结果列于表3。

表3    二乙基氯    乙基胺盐酸盐的浓度在制备

DEAE纤维素复盖的氧化铝时的影响

每30g载体提供的二乙基氯    葡萄糖异构酶

乙基胺盐酸盐    的活性，单位/g

3.0    1740

4.5    1470

6.0    1460

4.0    1350

固定化葡萄糖异构酶的半寿期。一个带水夹套的柱子用做积分反应器，用15ml以上制得的固定化葡萄糖异构酶，在60℃及65℃下测定固定化葡萄糖异构酶的热稳定性。原料含45%（重量比）葡萄糖，10-3M MgCl₂和1000PPm Na₂SO₃，用氢氧化钠调至PH值8.0。原料用泵送入，向下流经反应器，将流速调至产物中含42%果糖。收集反应器的样品，用高压液体色谱测定葡萄糖和果糖的浓度。在60℃时半寿期约为90天，65℃时半寿期约为35天。

葡萄糖异构酶的脱除和再固定。把固定在DEAE纤维素复盖的氧化铝上的葡萄糖异构酶脱除的方法，是用氢氧化钠溶液（0.5N）或盐溶液（NaCl或KCl，2M）洗去失效的酶，此载体可接着再用于酶的固定化。葡萄糖异构酶按上述方法固定。例如，用0.5N氢氧化钠在室温下洗涤催化剂，即可除去葡萄糖异构酶。洗涤过的担体用水洗，再用PH值7.2的咪唑缓冲液平衡。按上述的方法向已再生的担体基质供给葡萄糖异构酶（3200单位/g）。经三次再生尚未发现固定葡萄糖异构酶的能力有明显的下降，结果列于表4。由60℃下半寿期为92天的固定化葡萄糖异构酶再生而得的担体基质用于制备新的葡萄糖异构酶。经过实验此新催化剂的半寿期和原有的相比无明显的区别。

表4    葡萄糖异构酶的脱除和再固定

固定次数    脱除    活性，单位/g

1    0    1910

2    1    2000

3    2    1860

4    3    1820

实例2

固定蔗糖酶。将蔗糖酶固定在DEAE纤维素氧化铝载体上与固定葡萄糖异构酶的方法相同。向每克载体提供的蔗糖酶的量为13000单位左右，固定后酶活性为每克8200单位。在50℃，PH值5.5和有500PPm Na₂SO₃存在下，用60%（重量比）蔗糖为原料，测定了催化剂的热稳定性。催化剂连续工作12天以上，并未呈现热失活的迹象。

Claims (9)

1、一种可再生的担体基质，含有选自一种难熔无机氧化物、玻璃或陶瓷材料的核心担体，其上用纤维素的二烷基氨烷基醚复盖，该二烷基氨烷基部分的结构式为R_aR_bN(CH₂)_p-，其中R_a，R_b是各自选自含结构式为C_nH_2n+1的烷基，其中n是由1至约10的整数。

2、权利要求1中表征的基质，其中难熔无机氧化物是选自氧化铝、氧化硅、氧化钍、氧化锆、氧化钛、氧化镁及其组合物。

3、权利要求1中表征的基质，其中每个R_a，R_b是乙基，P是由2至约4的整数。

4、权利要求1中的基质，按纤维素计算，复盖物占制成材料的约1%至约20%（重量）。

5、一种固定化生物活性体系，含有权利要求1至4任一项所表征的一种担体基质和一种固定化生物活性物质。

6、权利要求5中表征的固定化生物活性体系，其中生物活性物质是等电点大于7左右的蛋白质类物质，它是选自一种酶，一种辅助因子，一种抗体或一种抗原。

7、一种制备在权利要求1中表征的可再生的担体基质的方法，包括用一种纤维素酯复盖核心担体，水解除去至少约80%的酯基以提供自由的羟基，转化该羟基成二烷基氨烷基醚部分，该二烷基氨烷基醚部分的结构式为R_aR_bN（CH₂）_p-，其中R_a，R_b是各自选自结构式为C_nH_2n+1的烷基，n是由1至约20的整数，P是由2至约10的整数，然后回收此生成的担体基质。

8、权利要求7中表征的方法，其中水解是使在核心担体上的纤维素酯与一种浓度自约0.5%至约4%（重量/体积）的碱溶液在温度自约25℃至约70℃下进行反应，而羟基的转化是使该羟基与一种二烷基氨烷基卤化物进行反应。

9、权利要求5或6表征的再生固定化生物活性体系的方法，包括在选定的条件下使固定化体系与一种碱或一种高离解性的盐的水溶液相接触，除去固定于其上的废生物活性物质，用水或缓冲溶液洗涤以除去多余的碱或盐，回收已再生的担体基质，并在所得的已再生的担体基质上固定上新的生物活性物质。