CN100371068C - 硅胶负载染料亲和基质的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型硅胶负载染料亲和基质的制备及应用。本发明将活性蓝共价固载在采用致孔剂聚乙二醇20000制备的硅胶负载多孔交联壳聚糖微珠上，致孔剂的抽提与活性蓝的共价固载同时进行，制备方法简单。本发明采用含有环氧基团、水溶性的无机硅烷试剂γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷作为壳聚糖的交联试剂，交联在水溶液中进行，过程简单，无需任何有机溶剂。本发明将壳聚糖负载在硅胶上，以硅胶作为壳聚糖微珠的核，无需壳聚糖造粒过程，机械强度高。本发明硅胶负载活性蓝染料亲和基质，具有优良的表面多孔结构，亲和配基密度大，蛋白吸附量大，且有利于生物分子构像和活性的保持。本发明染料配基键合牢固，无染料泄漏，非特异性吸附小。

Description

硅胶负载染料亲和基质的制备及应用
【技术领域】
本发明涉及一种染料亲和基质，特别是一种新型硅胶负载染料亲和基质的制备及应用。
【背景技术】
亲和层析是一种具有高度选择性的生物分子纯化方法，广泛应用于蛋白质和多肽等生物分子的分离纯化。将对目标分子具有特异性和选择性的配基偶联到载体材料上可制得亲和层析基质。抗体等生物大分子配基特异性高，但本身需分离纯化，制备复杂、价格较高，且在载体上不易保持其生物活性。仿生染料亲和配基易于合成、价格低廉、物理化学性能稳定、不易被生物降解，已成为目前使用最为广泛的一类配基。染料亲和层析已成功用于蛋白质和酶的分离纯化中。
三嗪染料活性蓝Cibacron blue F3GA是一种重要的仿生染料。活性蓝具有的平面环状结构和带负电荷的基团与天然生物配基NAD+极其相似，是一种分离核苷酸识别蛋白质的理想配基。活性蓝已被固载于琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等软质载体及改性硅胶、多孔玻璃等硬质载体上，用于核苷酸识别蛋白质和酶的分离纯化。软凝胶介质机械强度差、承受压力小，不能进行快速淋洗，且分离时间长，易造成生物分子的变性。而硬质载体有一定的非特异性吸附。
壳聚糖(Chitosan)是天然类多糖甲壳素脱乙酰化得到的生物大分子。壳聚糖对水和绝大多数有机溶剂不溶解，分子中存在丰富的氨基具有良好的化学反应特性，适于作为亲和基质的载体材料。交联壳聚糖克服了壳聚糖酸溶性的缺点，具有溶涨性小、性质较稳定、低的非特异性吸附和强的亲水性。一般采用微乳液聚合法制备交联壳聚糖微珠。此方法通常需使用大量的液体石蜡等有机溶剂，制得的微珠中包含大量的表面活性剂抽提较为困难。除此之外，所得壳聚糖微珠通常机械强度较差。
本发明的目的是提供一种制备性能优良、适用于亲和层析的染料亲和基质的新方法。本发明的另一目的是考察制备的染料亲和基质的应用。本发明将活性蓝共价固载在采用致孔剂聚乙二醇20000制备的硅胶负载多孔交联壳聚糖微珠上，致孔剂的抽提与活性蓝的共价固载同时进行。本发明将壳聚糖负载在硅胶上，以硅胶作为壳聚糖微珠的核，无需壳聚糖造粒过程，且壳聚糖的负载克服了硅胶的非特异性吸附，所得载体机械强度高。本发明采用的交联试剂为含有环氧基团、水溶性的无机硅烷试剂γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷，壳聚糖的交联在水溶液中进行，无需任何有机溶剂，所得材料性质稳定。本发明的染料亲和基质具有表面多孔结构，亲和配基密度大，且有利于生物分子构像和活性的保持。
【发明内容】
本发明提供一种制备性能优良的染料亲和基质的新方法，并以过氧化氢酶为例考察其应用。本发明染料亲和基质制备方法包括以下步骤：
——a在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入壳聚糖4g，致孔剂聚乙二醇15g，磁力搅拌30min，过滤；
——b在滤液中加入无机硅烷试剂γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷4mL，磁力搅拌30min；
——c向完成b步骤所得溶液中加入60-80目硅胶50g，搅拌均匀，超声40min后，将所得溶液倾倒到培养皿中，搅拌均匀，室温静置至固体干燥；
——d将所得固体置于50倍体积的蒸馏水中，然后加入2g活性蓝，60℃密封搅拌30min后加入24g氯化钠，反应2h后升温至80℃，加入碳酸钠使pH值为10，继续反应30min后冷却，用去离子水将所得固体洗涤至无色，然后依次用甲醇、2mol/L氯化钠、6mol/L尿素清洗，去离子水洗涤后，40℃烘干，即得硅胶负载染料亲和基质。
本发明染料亲和基质制备方法中，直接将活性蓝Cibacron blue F3G-A共价偶联固载在壳聚糖载体上。染料的固载是通过活性蓝活泼的三嗪基氯与壳聚糖上的氨基的亲核取代反应进行的，如图1所示。
本发明是将壳聚糖负载在硅胶表面制备载体材料，无需壳聚糖造粒过程，壳聚糖微珠的粒径可以通过改变硅胶粒径实现。硅胶具有大的比表面积和优良的机械强度，因此制备的载体材料机械强度高。同时，壳聚糖的涂覆可以克服硅胶对蛋白质的非特异性吸附。
本发明壳聚糖的交联是通过交联试剂实现的。水溶性的γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷交联剂含有双官能团：硅甲氧基和环氧基团。壳聚糖的交联通过氨基与环氧基团的反应及硅甲氧基的水解、缩合实现。壳聚糖的交联在水溶液中进行，无需任何有机溶剂，所得材料性质稳定。
本发明染料亲和基质的制备，采用一种高分子聚合物-聚乙二醇20000作为致孔剂。聚乙二醇分子中丰富的醚键使其具有优良的水溶性，能与壳聚糖、硅胶及交联剂形成大量氢键，具有良好的相容性。温度的升高可导致氢键的断裂导致聚乙二醇的溶解，从而使载体材料具有表面多孔结构。本发明活性蓝的共价偶联在水溶液中进行且需较高的温度。因此，本发明染料亲和基质的制备，致孔剂的抽提与活性蓝的共价固载同时进行。所得染料亲和基质红外光谱谱图中无聚乙二醇的特征吸收峰，表明聚乙二醇已被完全抽提。SIRION扫描电子显微镜(FEI，USA)用于检测本专利制得的染料亲和基质的表面形貌，固体均经镀金后进行测试。图2为本专利制得的染料亲和基质的扫描电子显微镜图。基质材料具有明显的大孔结构。
本专利制得的染料亲和基质染料偶联量为25.8mg/g，染料树脂泄漏率实验表明，分别在0.1、0.5mol/L NaOH；0.1、0.5mol/L HCl、50mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液中振荡3天，染料的泄漏率为零，表明染料在交联壳聚糖微珠上的键合是非常牢固的。
过氧化氢酶是一种核苷酸识别蛋白，因而活性蓝可用于该酶的亲和层析分离。以对过氧化氢酶(Catalase)的亲和吸附为例，考察本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质的应用。
在过氧化氢酶的初始浓度为2mg/mL时，在不同的pH下测定本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质对过氧化氢酶的吸附能力。在pH为7时，本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质对过氧化氢酶的吸附能力最大。
采用静态吸附法测定本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质对过氧化氢酶的吸附容量。称取0.1g染料亲和基质，加入到4mL不同浓度的过氧化氢酶溶液中，25℃下振荡吸附2h。以牛血清白蛋白为标准蛋白，考马斯亮兰法测定上清液中过氧化氢酶。
染料亲和基质对过氧化氢酶的吸附容量由下式计算
Q＝(C0-Ci)V0/W
C0：过氧化氢酶的初始浓度；Ci：吸附后过氧化氢酶的平衡浓度；V0：溶液体积；W：染料亲和基质质量。
本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质对过氧化氢酶的饱和吸附量为38.41mg/g。无染料的硅胶负载壳聚糖载体对过氧化氢酶的饱和吸附量为0.41mg/g，表明本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质的非特异性吸附很小。
本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质在柱富集和分离过氧化氢酶过程如下：
将本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质以匀浆法装柱(10cm×1.6cm i.d.)，以50mmol/LpH7.0的磷酸盐溶液作为平衡缓冲液平衡柱子。将10mL过氧化氢酶溶液(2mg/mL)以0.5mL/min的流速上柱，然后用平衡缓冲液以1.0mL/min的流速冲洗柱子至流出液的OD280较低。最后，用1mol/L NaSCN pH 8.0溶液以1.0mL/min的流速洗脱。高锰酸钾滴定法测定洗脱液中过氧化氢酶活性，收集有活性的洗脱液。过氧化氢酶活性回收率为89％，表明本专利硅胶负载活性蓝染料亲和基质能有效地用于过氧化氢酶的在柱富集和分离。
本发明的优点及效果：
1、本发明将活性蓝共价固载在硅胶负载多孔交联壳聚糖微珠上，键合牢固，无染料泄漏。
2、本发明硅胶负载活性蓝染料多孔亲和基质的制备，致孔剂的抽提与活性蓝的共价固载同时进行，制备方法简单。
3、本发明硅胶负载活性蓝染料多孔亲和基质的制备，将壳聚糖负载在硅胶上，采用水溶性的无机硅烷试剂γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷对其进行交联，交联过程简单，无需任何有机溶剂。且改善了壳聚糖载体质软的缺点，机械强度高。
4、本发明硅胶负载活性蓝染料多孔亲和基质，具有优良的表面多孔结构，亲和配基密度大，蛋白吸附量大，且有利于生物分子构像和活性的保持。
5、壳聚糖的负载克服了硅胶的非特异性吸附，本发明硅胶负载活性蓝染料多孔亲和基质非特异性吸附小。
【附图说明】
图1、活性蓝(a)与壳聚糖(b)的偶联反应
图2、硅胶负载活性蓝染料亲和基质的扫描电子显微镜图
【具体实施方式】
在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入精制壳聚糖4g和致孔剂聚乙二醇15g，磁力搅拌30min，滤布过滤后去除不溶残渣；向滤液中加入无机硅烷试剂γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷4mL，磁力搅拌30min后边搅拌边在溶液中加入60-80目硅胶50g，搅拌均匀，超声40min；将悬浮液倾倒到培养皿中，搅拌均匀，室温静置至固体干燥，将所得固体置于50倍体积的蒸馏水中，然后加入2g活性蓝，60℃密封搅拌30min后氯化钠24g，反应2h后升温至80℃，加入碳酸钠使pH值约为10，继续反应30min后冷却，用去离子水将所得固体洗涤至无色，然后依次用甲醇、2mol/L氯化钠、6mol/L尿素清洗，去离子水洗涤后，40℃烘干，即得活性蓝偶联的硅胶负载多孔染料亲和基质。
在柱富集和分离过氧化氢酶：
将制得的硅胶负载活性蓝染料亲和基质以匀浆法装柱(10cm×1.6cm i.d.)，以50mmol/LpH7.0的磷酸盐溶液作为平衡缓冲液平衡柱子。将10mL过氧化氢酶溶液(2mg/mL)以0.5mL/min的流速上柱，然后用平衡缓冲液以1.0mL/min的流速冲洗柱子至流出液的OD280较低。最后，用1mol/L NaSCN pH 8.0溶液以1.0mL/min的流速洗脱。高锰酸钾滴定法测定洗脱液中过氧化氢酶活性，收集有活性的洗脱液。

Claims (1)

1.一种硅胶负载染料亲和基质的制备方法，其特征是该硅胶负载染料亲和基质是通过以下步骤制备的：
-a在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入4g壳聚糖，15g致孔剂聚乙二醇20000，磁力搅拌30min，过滤；
-b在滤液中加入交联剂γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷4mL，磁力搅拌30min；
-c向完成b步骤所得溶液中加入60-80目硅胶50g，搅拌均匀，超声40min后，将溶液倾倒到培养皿中，搅拌均匀，室温静置至固体干燥；
-d将所得固体置于50倍体积的蒸馏水中，然后加入2g染料活性蓝Cibacron blue F3GA，60℃密封搅拌30min后加入24g氯化钠，反应2h后升温至80℃，加入碳酸钠使pH值为10，继续反应30min后冷却，用去离子水将所得固体洗涤至无色，然后依次用甲醇、2mol/L氯化钠、6mol/L尿素清洗，去离子水洗涤后，40℃烘干，即得硅胶负载染料亲和基质。
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