JP2024510465A - スパイクタンパク質の変異を有する重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）バリアントを検出するための組成物および方法 - Google Patents
スパイクタンパク質の変異を有する重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）バリアントを検出するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
生体試料または非生体試料中のスパイク（Ｓ）タンパク質遺伝子に変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のバリアントの存在を迅速に検出するための方法が記載されている。方法は、増幅工程、ハイブリダイズ工程、および検出工程を実施することを含み得る。さらに、Ｓ遺伝子の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを標的とするプライマーおよびプローブ、ならびにＳ遺伝子の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するために設計されたキットが提供される。【選択図】図１
Description
発明の分野
本開示は、ウイルス診断の分野に関し、より詳細には、スパイク（Ｓ）タンパク質遺伝子に変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のバリアントの検出に関する。
本開示は、ウイルス診断の分野に関し、より詳細には、スパイク（Ｓ）タンパク質遺伝子に変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のバリアントの検出に関する。
発明の背景
コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスは、２６～３２キロベースの範囲の長さの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。コロナウイルスは、いくつかの鳥類宿主において、ならびにラクダ、コウモリ、ハクビシン（ｍａｓｋｅｄ ｐａｌｍ ｃｉｖｅｔｓ）、マウス、イヌおよびネコを含む様々な哺乳動物において同定されている。新規な哺乳動物のコロナウイルスは、現在定期的に同定されている。例えば、コウモリ起源のＨＫＵ２関連コロナウイルスは、２０１８年にブタの致命的な急性下痢症候群の原因であった。
コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスは、２６～３２キロベースの範囲の長さの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。コロナウイルスは、いくつかの鳥類宿主において、ならびにラクダ、コウモリ、ハクビシン（ｍａｓｋｅｄ ｐａｌｍ ｃｉｖｅｔｓ）、マウス、イヌおよびネコを含む様々な哺乳動物において同定されている。新規な哺乳動物のコロナウイルスは、現在定期的に同定されている。例えば、コウモリ起源のＨＫＵ２関連コロナウイルスは、２０１８年にブタの致命的な急性下痢症候群の原因であった。
ヒトに対して病原性であるいくつかのコロナウイルスの中で、ほとんどは、２つの顕著な例外（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）（２００２年１１月に中国南部の広東省で出現し、２００２～０３年の間に３７か国で８０００件を超えるヒト感染および７７４の死亡例をもたらした新規なベータコロナウイルス）；および中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）（２０１２年にサウジアラビアで初めて検出され、２０１２年９月以降の検査所で確認された２４９４件の感染および死者８５８人の原因であり、そのうち３８人は韓国への１回の訪問後に死亡した））を除いて、軽度の臨床症状を伴う。
２０１９年１２月下旬、ウイルス性肺炎を有する数人の患者が、鳥およびウサギなどのいくつかの非水生動物も大流行前に販売されていた、中国湖北省の武漢の市場に疫学的に関連していることが分かった。２０１９新規コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）と最初に命名された新規ヒト感染性コロナウイルスを、次世代シーケンシングを使用して同定した。この新規コロナウイルスは、コロナウイルス科、ベータコロナウイルス属およびサルベコウイルス亜属に分類され、Ｌｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ、２０２０、Ｖｏｌ．３９５、ｐ．５６５－５７４による「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ」に記載されている。２０２０年２月１１日に、世界保健機関（ＷＨＯ）は、ウイルスの正式名称を重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）として発表した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の蔓延に対抗し、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する罹患率および死亡率を低減するために、いくつかの種類の研究および製品開発戦略が追求されている。これらには、ｍＲＮＡ、ウイルスベクター、およびタンパク質サブユニットワクチン、小分子抗ウイルス薬、免疫調節剤、および他の非医薬的介入の開発が含まれる。これまで研究開発されてきたワクチンは、主にウイルスエンベロープ糖タンパク質（スパイク、Ｓ）に焦点を当てており、これまで顕著に成功している。さらに、Ｓを標的とするモノクローナル抗体は、抗ウイルス薬として開発されており、感染または症状発症後すぐに投与される場合に有効な処置である。モノクローナル抗体を非感染個体に投与して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を防ぐこともできる。
すべてのＲＮＡウイルスと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、エラーを起こしやすいＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび大きな集団サイズのために、外部選択圧に応答して進化する傾向がある。コロナウイルスは、レプリカーゼ複合体の一部としてプルーフリーディング機能を有するが、各宿主および感染した人々の膨大な集団におけるその高い複製速度により、より適合したバリアントが出現し得るウイルスバリアントの膨大なプールの生成をもたらす。部分免疫を有する感染者または単一の抗Ｓモノクローナル抗体で処置された感染者で起こり得る、強力であるが不完全な複製阻害が、感受性である宿主の集団において、野生型ウイルスよりも高い複製適合性を有する、Ｓにエスケープ変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの選択をもたらすことはほぼ確実である。同様に、天然に存在するバリアントが、免疫学的にナイーブな集団において蔓延する能力が高まった場合、それは比較的短期間で野生型ウイルスを凌駕することができた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックが始まって１年以上が経過し、制御されない世界的な伝染および著しいウイルス進化により、数百のバリアントが生じている。懸念されるバリアント（ＶＯＣ）、例えば、英国（Ｂ．１．１．１７）、南アフリカ（Ｂ．１．３５１）、ブラジル（Ｐ．１／Ｂ．１．１．２４８）、および注目すべきバリアント（ＶＯＩ）ＵＳ［Ｂ．１．５２６（ＮＹ）およびＢ．１．４２７／Ｂ．１．４２９（カリフォルニア、およびオハイオ）］と見なされるこれらのバリアントのいくつかは、より伝染性が高く、および／または治療応答もしくはワクチン応答に影響を及ぼす可能性がある。疫学的およびウイルス学的評価により、より伝染性の高いＶＯＣが現在独立して発生していることが確認されており、２０２０年１２月の英国からの最初の報告に続いてすぐに、南アフリカからの報告は異なる系統が急速に蔓延し、数週間以内に優勢な系統になることを示した。変異の重要性はまだ完全には断定されていないが、他の系統の迅速な置き換えを示すゲノムデータは、この系統が伝染性の増加に関連し得ることを示唆している。ブラジルからのバリアントが２０２０年１２月上旬に出現し、２０２１年１月半ばまでには、症例において既に大規模な再興を引き起こしていた。ワクチンおよび関連するスパイク媒介性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２適応に関する懸念により、ＶＯＣ選択のための疫学的および監視的努力が必要になった。これらの新興株に見られる重要な変異（ｄｅｌ６９－７０、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ）は、これらの最も懸念される株の蔓延を追跡するために使用されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子の変異は、ウイルスを高度に伝染性にする。そのため、当技術分野では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアント、特に６９～７０欠失（ｄｅｌ６９－７０）ならびにスパイクタンパク質遺伝子のＮ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋでの変異を含むバリアントを検出するための、迅速で、信頼性があり、特異的で、高感度の方法が必要とされている。
本開示は、生体または非生体試料中のスパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの有無の迅速な検出方法、例えば、単一の試験管中での定性的または定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのマルチプレックス検出に関する。実施形態は、逆転写工程と、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１回のサイクリング工程とを実施することを含む、ｄｅｌ６９－７０、Ｎ５０１Ｙ、およびＥ４８４Ｋを含む変異の１つまたは複数を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの検出方法を含む。さらに、本開示は、単一のチューブ中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するように設計された、プライマー、プローブ、およびキットを含む。
一態様では、試料中のスパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出する方法が提供され、該方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸が試料中に存在する場合、試料をプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；増幅産物を１つまたは複数の検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；ならびに増幅産物の存在を検出することであって、増幅産物の検出は試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの存在を示す、増幅産物の存在を検出することを含み；プライマーセットは、配列番号１～５からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる第１のプライマー、および配列番号７～１４からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる第２のプライマーを含み；１つまたは複数の検出可能プローブは、配列番号１６～２５からなる群から選択される第３のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなり；スパイクタンパク質の変異は、６９－７０欠失（ｄｅｌ６９－７０）、Ｎ５０１Ｙ変異、もしくはＥ４８４Ｋ変異、またはそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、工程は、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施される。さらなる実施形態では、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３７、３８もしくは３９のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むかまたはそれらからなる。
別の態様では、試料中のスパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するためのマルチプレックス方法が提供され、該方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸が試料中に存在する場合、試料を少なくとも２つのプライマーセットと接触させて第１の増幅産物および第２の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；増幅産物を、少なくとも２つのプライマーセットによって生成された第１の増幅産物および第２の増幅産物にハイブリダイズする少なくとも２つの検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；ならびに少なくとも１つの増幅産物の存在を検出することであって、少なくとも１つの増幅産物の存在は、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの存在を示す、少なくとも１つの増幅産物の存在を検出することを含み；第１のプライマーセットは、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号７または８のオリゴヌクレオチドを含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み、第２のプライマーセットは、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号９、１０または１１のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み；第１のプライマーセットによって生成された第１の増幅産物にハイブリダイズする第１の検出可能プローブは、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなり；第２のプライマーセットによって生成された第２の増幅産物にハイブリダイズする第２の検出可能プローブは、配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなり；スパイクタンパク質の変異は、６９～７０欠失（ｄｅｌ６９－７０）、Ｎ５０１Ｙ変異、もしくはＥ４８４Ｋ変異、またはそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、工程は、配列番号３７、３８もしくは３９のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むかまたはそれらからなる１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施される。
本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、Ｓ遺伝子のそれぞれの変異および欠失の結果としてのスパイクタンパク質の６９～７０欠失（ｄｅｌ６９－７０）、Ｎ５０１Ｙ変異もしくはＥ４８４Ｋ変異、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、第１または第２の検出可能プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の６９～７０欠失を引き起こすＳ遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１または第２の検出可能プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ５０１Ｙ変異を引き起こすＳ遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１または第２の検出可能プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＥ４８４Ｋ変異を引き起こすＳ遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする。一実施形態では、１つまたは複数のブロッキングプローブは、スパイクタンパク質の第６９～７０位のアミノ酸、または第４８４位のアミノ酸または第５０１位のアミノ酸において野生型であるＳ遺伝子配列と完全に一致するオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のブロッキングプローブは、配列番号３７、３８もしくは３９のオリゴヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる。さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）由来の特定の核酸配列を増幅するプライマーセットおよびプライマーセットによって生成されたＯＲＦ１ａ／ｂ増幅産物にハイブリダイズして検出する検出可能プローブが提供される。一実施形態では、プライマーセットは、配列番号６のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み；検出可能プローブは、配列番号３６のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの増幅のためのプライマーセットは、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むかそれからなる第１のプライマー、および配列番号７または８のオリゴヌクレオチド配列を含むかそれからなる第２のプライマー、および配列番号１６もしくは１７のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる検出可能プローブを含む。別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第２のプライマーは、配列番号９～１１のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、配列番号１８～２０のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる検出可能プローブ。一実施形態では、第１のプライマーは、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第２のプライマーは、配列番号８のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、検出可能プローブは、配列番号１７のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第２のプライマーは、配列番号１０のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、検出可能プローブは、配列番号１９のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。さらに別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第２のプライマーは、配列番号１０のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、検出可能プローブは、配列番号２０のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。
本開示の他の態様は、１００またはそれ以下のヌクレオチドを有する、配列番号１～３９から選択されるヌクレオチドの配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、１００またはそれ以下のヌクレオチドを有する、配列番号１～３９のいずれかに対して、少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％など）を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補体を提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、プローブ核酸などであり得る。
ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、４０またはそれ以下のヌクレオチド（例えば、３５またはそれ以下のヌクレオチド、３０またはそれ以下のヌクレオチド、２５またはそれ以下のヌクレオチド、２０またはそれ以下のヌクレオチド、１５またはそれ以下のヌクレオチドなど）を有する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば未改変ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーションの安定性を変化させるために、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、任意に少なくとも１つの標識および任意に少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。
一態様では、増幅は、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用い得る。したがって、ドナー蛍光部分およびアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いの５～２０ヌクレオチド以内（例えば、８または１０ヌクレオチド以内）であり得る。別の態様では、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第１および第２の蛍光部分の間に空間的近接をもたらし得る。この方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
一態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するための検出可能プローブは、レポーターとして作用する蛍光色素で標識され得る。プローブはまた、クエンチャーとして作用する第２の色素を有し得る。レポーター色素は、規定された波長で測定されることによって、増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の検出および識別を可能にする。インタクトなプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制される。ＰＣＲの増幅工程中、特定の一本鎖ＤＮＡテンプレートへのプローブのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性による切断をもたらし、レポーターおよびクエンチャー色素の分離、および蛍光シグナルの発生をもたらす。各ＰＣＲサイクルに伴い、切断されたプローブの量は増加し、レポーター色素の累積シグナルはそれに伴って増加する。任意に、１つまたは複数のさらなるプローブ（例えば、内部基準対照または他の標的化されたプローブなど（例えば、他のウイルス核酸）はまた、固有かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブに関連する蛍光色素標識とは異なるレポーター蛍光色素で標識され得る。そのような場合、個別のレポーター色素は規定された波長で測定されるので、増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的および１つまたは複数のさらなるプローブの同時検出および識別が可能である。
本開示はまた、個体由来の生体試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、またはスパイクタンパク質遺伝子に変異もしくは欠失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸の有無を検出する方法を提供する。これらの方法は、診断試験での使用については、鼻咽頭（ＮＳＰ）および中咽頭のスワブ試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、またはスパイク遺伝子の変異もしくは欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有無を検出するために用いられ得る。さらに、当業者によって同じ試験を使用し、他の種類の試料を評価して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子の変異および欠失を検出し得る。そのような方法は一般に、逆転写工程と、増幅工程および色素結合工程を含む少なくとも１回のサイクリング工程とを実施することを含む。典型的には、増幅工程は、核酸分子が試料中に存在する場合、試料を複数ペアのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて１つまたは複数の増幅産物を生成することを含み、色素結合工程は、増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の有無を検出することを含み、結合の存在は試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子の変異および欠失の存在を示し、結合の非存在は試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子の変異および欠失の非存在を示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、ならびにＹＯ－ＹＯ（登録商標）およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどのシアニン色素が挙げられる。さらに、そのような方法はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸の変異および欠失の有無を確認する、増幅産物および二本鎖ＤＮＡ結合色素の間の融解温度を決定することを含み得る。
さらなる態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来の１つまたは複数のスパイク遺伝子の変異を検出するためのキットが提供される。キットは、遺伝子標的の増幅に特異的な１つまたは複数のプライマーセット；および増幅産物の検出に特異的な１つまたは複数の検出可能オリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
一態様では、キットは、ドナーおよび対応するアクセプター部分、例えば他の蛍光部分またはダーククエンチャーで既に標識されたプローブを含み得るか、またはプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含み得る。キットはまた、プライマー、プローブおよびフルオロフォア部分を使用して、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子の変異および欠失の有無を検出するための添付文書および説明書を含み得る。
一態様では、試料中にいくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のための方法が提供され、該方法は、５’末端、３’末端、およびロックド核酸（ＬＮＡ）である少なくとも１つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供することを含み、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１の複合体を形成する場合、野生型（ＷＴ）配列に完全に相補的であり、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第２の融解温度（Ｔｍ）を有する第２の複合体を形成する場合、１つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体（ＭＴ）配列に部分的に非相補的であり、第１のＴｍは第２のＴｍよりも高く、ブロッキングオリゴヌクレオチドは３’末端でブロックされ伸長を妨げ；第２のＴｍよりも高いが第１のＴｍよりも低い温度で増幅工程を実施し、増幅工程は、ＷＴ配列および／または標的ＭＴ配列が試料中に存在する場合、試料をプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含み、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅工程中に標的ＭＴ配列にはハイブリダイズしなくなるが、ＷＴ配列とハイブリダイズしたままでありＷＴ配列の増幅を阻害する。
別の態様では、いくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のためのキットが提供され、該キットは、プライマーセット；５’末端、３’末端、およびロックド核酸（ＬＮＡ）である少なくとも１つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを含み、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１の複合体を形成する場合、野生型（ＷＴ）配列に完全に相補的であり、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第２の融解温度（Ｔｍ）を有する第２の複合体を形成する場合、１つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体（ＭＴ）配列に部分的に非相補的であり、第１のＴｍは第２のＴｍよりも高い。
別の態様では、いくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅を実施するためのオリゴヌクレオチドが提供され、該オリゴヌクレオチドは、５’末端、および３’末端でブロックされ伸長を妨げる３’末端を含み、配列は、ハイブリダイズして第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１の複合体を形成する場合、野生型（ＷＴ）配列と完全に相補的であり、ハイブリダイズして第２の融解温度（Ｔｍ）を有する第２の複合体を形成する場合、１つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体（ＭＴ）配列に部分的に非相補的であり、第１のＴｍは第２のＴｍよりも高く；少なくとも１つのヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）である。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料が本主題の実践または試験で使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載されている。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することは意図されない。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、図面および発明を実施するための形態、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
核酸増幅によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断（野生型およびバリアントの両方）は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、および感度よく検出するための方法を提供する。非生体または生体試料中の、スパイクタンパク質遺伝子の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するためのリアルタイムリバーストランスクリプターゼＰＣＲアッセイが本明細書に記載されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含む製造品またはキットも提供される。他の方法と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの検出のためのリアルタイムＰＣＲの高い特異度および感度、ならびに試料の封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの改善された特徴により、臨床検査室におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染だけでなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの感染の日常的な診断のために、この技術の実装が実現可能になる。さらに、この技術は、インビトロ診断ならびに予後診断のために用いられ得る。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント検出アッセイはまた、他の核酸、例えばインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの検出のために、他のアッセイと並行して多重化され得る。
核酸増幅によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断（野生型およびバリアントの両方）は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、および感度よく検出するための方法を提供する。非生体または生体試料中の、スパイクタンパク質遺伝子の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するためのリアルタイムリバーストランスクリプターゼＰＣＲアッセイが本明細書に記載されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含む製造品またはキットも提供される。他の方法と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの検出のためのリアルタイムＰＣＲの高い特異度および感度、ならびに試料の封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの改善された特徴により、臨床検査室におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染だけでなく、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの感染の日常的な診断のために、この技術の実装が実現可能になる。さらに、この技術は、インビトロ診断ならびに予後診断のために用いられ得る。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント検出アッセイはまた、他の核酸、例えばインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの検出のために、他のアッセイと並行して多重化され得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、２９，９０３塩基長のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子であり（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０４５５１２に示される通り）、以下のような遺伝子の順序（５’から３’）を有する：レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ（ウイルス複製およびウイルスアセンブリに必須の１６個の予測非構造タンパク質を有する２１，２９１塩基）、スパイク（Ｓ遺伝子、細胞受容体への結合に関与するスパイクタンパク質をコードする３，８２２塩基）、ＯＲＦ３ａｂ（８２８塩基長）、エンベロープ（Ｅ遺伝子、エンベロープタンパク質をコードする２２８塩基）、メンブレン（Ｍ遺伝子、メンブレンタンパク質をコードする６６９塩基）、ヌクレオカプシド（Ｎ遺伝子、ゲノムＲＮＡと複合体を形成するヌクレオカプシドタンパク質をコードする１２６０塩基）。さらに、５’末端に２６５塩基の非コード領域、３’末端に２２９塩基の非コード領域が存在する。
Ｓ遺伝子は、膜貫通グリコシル化タンパク質である、Ｓタンパク質または表面糖タンパク質とも称されるスパイクタンパク質をコードし、ホモ三量体としてアセンブルし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスエンベロープから突出するスパイクを形成する１２７３アミノ酸から構成される。スパイクタンパク質は、最初にＳ１サブユニット内の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を介して宿主受容体に結合し、次いでＳ２サブユニットを介してウイルス膜および宿主膜を融合することによって、宿主細胞へのウイルス侵入を媒介する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ウイルスのＳタンパク質に結合するその宿主受容体としてアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を認識する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＲＢＤは、残基第３３１位から第５２４位（または他の報告では残基第３３３位から第５２７位）のおよそ２００アミノ酸の領域として特徴付けられている。
最近の知見は、野生型のＳ標的を使用するワクチンによって生成される抗体による中和の減少と相まって、より大きな感染力、高いウイルス量、潜在的に増加した致死率を示すＳ遺伝子バリアントの出現を報告している。これらの懸念されるバリアント（ＶＯＣ）は、ＵＫ Ｂ１．１．７（とりわけ、６９－７０ｄｅｌ、Ｎ５０１Ｙ）、南アフリカＢ．１．３５１（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ）およびブラジルＢ．１．１．２８（Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）およびＰ１である。これらのバリアントは、ＰＣＲに基づく検出後に試料を配列決定することによって検出された。６９－７０ｄｅｌ、Ｎ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋ変異、ならびに共通して観察されるＤ６１４Ｇ変異の位置を図１に示す。
本開示は、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを特異的に同定するための、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのスパイクタンパク質遺伝子にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプライマーおよび蛍光標識された加水分解プローブを含む。オリゴヌクレオチドはＳ遺伝子に特異的にハイブリダイズする。ゲノム内の複数の位置にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを有することは、単一の遺伝子座のみを標的とすることと比較して感度の改善に有利であるため、本開示はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の他の領域（例えば、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子）にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプライマーおよび加水分解プローブを提供する。
開示されている方法は、逆転写工程と、１つまたは複数のプライマーペアを使用して試料から核酸分子の遺伝子標的の１つまたは複数の部分を増幅することを含む少なくとも１回のサイクリング工程とを実施することを含み得る。本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー（複数可）」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列に特異的にアニーリングし、適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始して、それぞれの増幅産物を生成するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列の例としては、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子、Ｓ遺伝子、ＯＲＦ３ａｂ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子およびＮ遺伝子および他の予測されるＯＲＦ領域内の核酸が挙げられる。検討されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーの各々は、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、標的領域にアニーリングする。１つまたは複数の核酸が試料中に存在すれば、１つまたは複数の増幅産物が生成され、したがって、１つまたは複数の増幅産物の存在が試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示す。増幅産物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についての１つまたは複数の検出可能プローブに相補的な核酸配列を含むはずである。本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブ（複数可）」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程（ここで、試料が、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有無を検出するための１つまたは複数の検出可能ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブと接触する）を含む。
本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、テンプレート核酸分子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム由来の核酸分子）の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、テンプレート核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーをテンプレート核酸にアニーリングすること、およびプライマーから酵素的に伸長して増幅産物を生成することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）ならびにポリメラーゼ酵素の最適活性のための適切な緩衝液および／または補因子（例えば、ＭｇＣｌ２および／またはＫＣｌ）の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に公知であり、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる改変オリゴヌクレオチドも指しており、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、そこで、３’から５’へのホスホジエステル連結を確立するテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによってさらに「ヌクレオチド」が付着され得、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つまたは複数のプローブのアニーリングを指す。「ハイブリダイゼーション条件」には、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度が含まれる。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、すなわち、酵素は、テンプレートに相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖テンプレート核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に供された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、テンプレート鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それでもなお、必要に応じて、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼもＰＣＲアッセイに用いられ得る。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、かつ正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」または「延長」という用語は、さらなるヌクレオチド（または他の類似の分子）が核酸に取り込まれる場合を指す。例えば、核酸は、ヌクレオチドを取り込む生体触媒、例えば、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼによって、任意に伸長される。
２つまたはそれ以上の核酸配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは目視検査によって測定して、最大の一致となるように比較およびアラインメントした場合、同一または特定パーセンテージの同一ヌクレオチドを有する２つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載されている。
オリゴヌクレオチドの文脈における「改変ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つのヌクレオチドで、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書に記載されているオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な改変ヌクレオチドとしては、例えば、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、シュードｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－Ｏ－メチルリボ－Ｕ、２’－Ｏ－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡなどが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の改変ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、またはそうでなければ当技術分野で公知である。ある特定の実施形態では、改変ヌクレオチド置換は、対応する改変されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を改変する。ヌクレオシドの改変はまた、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させる部分、またはオリゴヌクレオチドプローブの融解温度を増加させる部分を含み得る。例えば、ヌクレオチド分子は、２’および４’炭素を接続する追加のブリッジで改変され、ヌクレアーゼによる切断に抵抗性である「ロックド核酸（ＬＮＡ）」ヌクレオチドをもたらし得る（Ｉｍａｎｉｓｈｉらの米国特許第６，２６８，４９０号およびＷｅｎｇｅｌらの米国特許第６，７９４，４９９号に記載されている通り）。さらに説明すると、ある特定の改変ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅を減少させ（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）、意図された標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらの種類の核酸改変の例は、例えば、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。他の改変ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、または他の望ましい特徴を提供し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
本開示は、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の核酸配列の一部を増幅することにより、スパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出する方法を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの核酸配列は利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０４５５１２、ここでは、Ｓ遺伝子はヌクレオチド第２１５６３位から第２５３８４位に位置する）。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の変異および欠失標的配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが、本開示の実施形態によって提供される。
本開示は、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の核酸配列の一部を増幅することにより、スパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出する方法を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの核酸配列は利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０４５５１２、ここでは、Ｓ遺伝子はヌクレオチド第２１５６３位から第２５３８４位に位置する）。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ遺伝子の変異および欠失標的配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが、本開示の実施形態によって提供される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＯＣの検出のために、Ｓ遺伝子を増幅するプライマーおよびＳ遺伝子の変異および欠失を特異的に検出するプローブが提供される。本明細書に例示されているもの以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸も、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するために使用され得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異度および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸における１つまたは複数の欠失、挿入および／または置換を含み得る。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～５、７～１４、および１６～２５、または配列番号１～５、７～１４、および１６～２５の相補体から選択される配列を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３７～３９から選択される、野生型（例えば野生型残基第６９～７０位、Ｅ４８４、Ｎ５０１）の検出をブロックするオリゴヌクレオチドプローブが提供される。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを含むと疑われる生体試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を提供するために、上述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーセットおよびプローブが使用される（表１～４）。プライマーセットおよびプローブは、配列番号１～５、７～１４、１６～２５、および３７～３９の核酸配列を含むかまたはそれからなる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸配列に特異的なプライマーおよびプローブを含むかまたはそれからなり得る。
上に詳述したように、プライマー（および／またはプローブ）は化学的に改変され得、すなわち、プライマーおよび／またはプローブは、改変ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含み得る。したがって、プローブ（またはプライマー）は改変オリゴヌクレオチドである。「改変ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類似体」）は、いくつかの改変によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基もしくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分もしくはリン酸様部分、またはそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を付着させて、「改変ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基はまた、例えば、７－デアザプリンによって置き換えられてもよく、それによっても同様に「改変ヌクレオチド」が得られる。「改変ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類似体」という用語は、本出願において互換的に使用される。「改変ヌクレオシド」（または「ヌクレオシド類似体」）は、「改変ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類似体」）について上に概説したような様式で、いくらかの改変により天然のヌクレオシドとは異なる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的をコードする核酸、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の別の部分をコードする核酸分子を増幅する、改変オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｏｌｏ．）などのコンピュータプログラムを使用して設計され得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、プライマーペアのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性をもってアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に正確性が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、または５０ヌクレオチド長）である。
プライマーセットに加えて、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの有無を検出するために１つまたは複数のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的または生物学的に生成された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指し、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（標的）核酸が存在する場合、設計または選択により、規定される所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、選好的に）、「標的核酸」にハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、開示されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブは、ドナー蛍光部分、例えば、蛍光色素、および対応するアクセプター部分、例えば、クエンチャーで標識され得る。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むかまたはそれからなり、核酸配列は配列番号２１～２６を含むかまたはそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の様式で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブまたはプローブペアを使用し得る。実施形態に応じて、使用されるプローブ（複数可）は、少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に正確性が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。
構築物は、それぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーおよびプローブ核酸分子のうちの１つを含むベクターを含み得る。構築物は、例えば、対照テンプレート核酸分子として使用され得る。使用に適したベクターは、市販されている、および／または当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって作成される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸分子は、例えば、化学合成、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの直接クローニング、または核酸増幅によって得ることができる。
方法での使用に適した構築物は、典型的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸分子（例えば、配列番号１～５、７～１４、および１６～２５のうちの１つまたは複数の配列を含む核酸分子）に加えて、所望の構築物および／または形質転換体を選択するための選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、および複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性および回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸分子を含む構築物は、宿主細胞内で増やされ得る。本明細書で使用される場合、宿主細胞という用語は、原核生物および真核生物、例えば酵母、植物および動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられ得る。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、ならびにアラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）およびニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。構築物は、当業者に一般的に公知な技法のいずれかを使用して宿主細胞に導入され得る。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。さらに、ネイキッドＤＮＡは細胞に直接送達され得る（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照）。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技法を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸テンプレート（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーとしては、記載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～２０）が挙げられる。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製され得るか、または合成的に生成され得る。プライマーは、増幅における最大効率のためには一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であり得る。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するように処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、および同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技法を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸テンプレート（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーとしては、記載されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～２０）が挙げられる。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製され得るか、または合成的に生成され得る。プライマーは、増幅における最大効率のためには一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であり得る。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するように処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
テンプレート核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲでテンプレートとして使用され得る前に、二本の鎖を分離することが必要である。鎖の分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成され得る。核酸の鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性される（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える変性）まで加熱することを含む。テンプレート核酸を変性させるために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長などの反応物の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分間～２分３０秒間、または１．５分間）実施される。
二本鎖テンプレート核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、その標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒；約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こり、テンプレート核酸に相補的な産物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸テンプレートにアニーリングされた各プライマーから伸長産物を合成するのに十分でなくてはならないが、その相補的なテンプレートから伸長産物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、一般に、約４０℃～約８０℃の範囲（例えば、約５０℃～約７０℃；約６０℃）である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分；約１分～約３分；約１分３０秒～約２分）であり得る。
レトロウイルスまたはＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびに他のフラビウイルスのゲノムは、リボ核酸、すなわちＲＮＡから構成される。そのような場合、テンプレート核酸であるＲＮＡは、酵素リバーストランスクリプターゼの作用を介して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に最初に転写されなければならない。リバーストランスクリプターゼは、ＲＮＡテンプレートおよびＲＮＡの３’末端に相補的な短いプライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成を指示し、次いでこれはポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして直接使用され得る。
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸を用い得る。テンプレート核酸は精製される必要はなく；ヒト細胞に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）、１９９３、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているものなどの日常的な技法によって生体試料から抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、あるいは細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、または植物もしくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号１～２０）は、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わされる。例えば、鎖伸長反応物には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性されたテンプレートＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、および１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはそれらの１つもしくは複数の類似体を含む。
新規に合成される鎖は、反応の後続工程で使用され得る二本鎖分子を形成する。標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖の分離、アニーリング、および伸長の工程は必要に応じて何度でも繰り返され得る。反応の制限因子は、反応物中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用については、サイクリング工程の数は、例えば、試料の性質に依存し得る。試料が核酸の複合混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となり得る。一般に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、または１００回でさえ繰り返えされ得る。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、および同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いにある特定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それは可視化され得るか、または別様に検出および／または定量化され得るという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動する。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。ある特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光ドナー部分を含む生体分子を介して、ドナー部分およびアクセプター部分の間で移動され得る（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）。
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、および同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いにある特定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それは可視化され得るか、または別様に検出および／または定量化され得るという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動する。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。ある特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光ドナー部分を含む生体分子を介して、ドナー部分およびアクセプター部分の間で移動され得る（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分（例えば、ＨＥＸ）、および蛍光性であってもなくてもよく、移動されたエネルギーを光以外の形態で散逸させる対応するクエンチャー（例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）を含み得る。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナーおよびアクセプター部分の間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、および同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプターペアには、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡペアが含まれる。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーには、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌ．）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ．、Ｄｅｘｔｅｒ、Ｍｉｃｈ．）が含まれる。
別の例では、それぞれが蛍光部分を含む２つのオリゴヌクレオチドプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物の核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルを発生する。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲での蛍光発光をモニターするためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、またはフルオロフォアの直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナーおよび対応するアクセプター部分に関して本明細書で使用される場合、「対応する」とは、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有する、アクセプター蛍光部分またはダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。それにより、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動が生じ得る。
蛍光ドナーおよび対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｅｒｓｔｅｒエネルギー移動；（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）；（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；および（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近にその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍ）、高い消光係数、高い量子収率、およびその蛍光発光が対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルと良好な重複を有する、ドナー蛍光部分が選択され得る。高い消光係数、高い量子収率、その励起がドナー蛍光部分の発光と良好に重複、および可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）での発光を有する対応する、アクセプター蛍光部分が選択され得る。
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用され得る代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンイミジル１－ピレンブチレート、および４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオン（例えば、ユウロピウム、またはテルビウム）の他のキレートが挙げられる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｉｔｙ、Ｏｒｅｇ．）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から得ることができる。
ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに付着され得る。リンカーアームはドナーおよびアクセプター蛍光部分の間の距離に影響を及ぼし得るので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、ＷＯ８４／０３２８５に記載されている種類のものであり得る。ＷＯ８４／０３２８５はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に付着させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに付着させる方法を開示している。
ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含むオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識されたオリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドにカップリングするために頻繁に使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍＧｅｎｅ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来、例えば、ＢｉｏＧｅｎｅｘ（Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ、Ｃａｌｉｆ．）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧ）、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルのカップリングを必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出
本開示は、生体または非生体試料中のスパイクタンパク質の変異（欠失および挿入を含む）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの有無を検出するための方法を提供する。提供される方法は、試料の汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。方法は、逆転写工程、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーの１つまたは複数のペアを使用して試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子核酸分子の部分を増幅することを含む少なくとも１回のサイクリング工程、およびＦＲＥＴ検出工程を実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで実施される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子変異の存在を特異的に検出するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子のプライマーおよびプローブを使用して方法を実施することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの存在を示す。
本開示は、生体または非生体試料中のスパイクタンパク質の変異（欠失および挿入を含む）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの有無を検出するための方法を提供する。提供される方法は、試料の汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。方法は、逆転写工程、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーの１つまたは複数のペアを使用して試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子核酸分子の部分を増幅することを含む少なくとも１回のサイクリング工程、およびＦＲＥＴ検出工程を実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで実施される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子変異の存在を特異的に検出するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子のプライマーおよびプローブを使用して方法を実施することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの存在を示す。
本明細書に記載されているように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を活用する標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用して検出され得る。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の有無、したがってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの有無を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１つの蛍光色素（例えばＨＥＸ）および１つのクエンチャー（例えばＢＨＱ）（これは蛍光性であってもなくてもよい）で標識された１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起される場合、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分またはダーククエンチャーに移動する。第２の部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分およびクエンチャー部分が互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下で第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光が検出され得る。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの有無を検出するために、本明細書に記載されている方法を実施するのに適している。
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用した増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分および第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造の形成（例えば、ヘアピン）を可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内での二次構造の形成の結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部分が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分は互いに分離され、それにより、適切な波長の光での励起後、第１の蛍光部分の発光が検出され得る。
ＦＲＥＴ技術の別の一般的なフォーマットは、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識され得、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ６４０）またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ７０５）に移動する。次いで、アクセプター蛍光部分は、より長い波長の光を発し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重複している場合にのみ起こり得る。発出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの数）と相関し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が生成される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブペアのメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、ＦＲＥＴの存在は試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、ＦＲＥＴの非存在は試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、またはある特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功および／または精度に影響を及ぼし得る条件である。
方法の実践で使用され得る代表的な生体試料としては、呼吸器検体（鼻咽頭およびび中咽頭スワブ）、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、および軟部組織感染が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料の収集および保存方法は、当業者に公知である。生体試料は（例えば、当技術分野で公知の核酸抽出方法および／またはキットによって）処理され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸を放出させ得るか、またはいくつかの場合では、生体試料はＰＣＲ反応構成要素および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触され得る。
融解曲線分析は、サイクリングプロファイルに含められ得る追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡデュプレックスの半分が一本鎖に分離した温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、ＧおよびＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することによって、プローブの融解温度は決定され得る。同様に、シグナルが発生する温度を検出することによって、プローブのアニーリング温度は決定され得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増幅産物からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブの融解温度（複数可）により、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有無を確認し得る。
各サーモサイクラーを運転している間に、対照試料も同様にサイクルされ得る。陽性対照試料は、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、（記載されている標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照テンプレートを増幅し得る。陽性対照試料はまた、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅し得る。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で（例えば、試料内で）または患者の試料と並んで実行される別々の試料中で増幅され得る。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション、および／またはＦＲＥＴ反応の成功または失敗の指標である。各サーモサイクラーの実行はまた、例えば、標的テンプレートＤＮＡを欠く陰性対照を含み得る。陰性対照は汚染を測定し得る。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照の反応は、例えば、プライマーが配列特異性をもってアニーリングし、伸長を開始する能力、ならびにプローブが配列特異性をもってハイブリダイズし、ＦＲＥＴが起こる能力を容易に判定することができる。
ある実施形態では、方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、あるサーモサイクラーの運転および次のものの間の汚染を低減または排除するための、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号および同第５，９４５，３１３号に記載されている。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、方法を実践することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：ＷＯ９７／４６７０７、ＷＯ９７／４６７１４、およびＷＯ９７／４６７１２。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作され得、Ｗｉｎｄｏｗ ＮＴオペレーティングシステムを利用し得る。試料からのシグナルは、機械が光学ユニット上にキャピラリを順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示し得る。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示は、すべての試料について連続的に更新され得る。生成されたデータは、さらなる分析のために保存され得る。
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用して、増幅産物は検出され得る。二本鎖核酸と相互作用すると、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光での励起後に、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素も使用され得る。二本鎖ＤＮＡ結合色素が使用される場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
当業者は、他の核酸またはシグナル増幅方法も用いられ得ることを理解するであろう。そのような方法の例としては、限定されないが、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、またはスマート増幅プロセスバージョン２（ＳＭＡＰ２）が挙げられる。
本開示の実施形態は、１つまたは複数の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製造品／キット
本開示の実施形態は、スパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するための製造品またはキットをさらに提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子標的を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子変異の特異的検出のための代表的なプライマーおよびプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素、およびＤＮＡ標準など、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子標的核酸分子を増幅し、それにハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
本開示の実施形態は、スパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するための製造品またはキットをさらに提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子標的を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子変異の特異的検出のための代表的なプライマーおよびプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素、およびＤＮＡ標準など、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ遺伝子標的核酸分子を増幅し、それにハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
製造品はまた、プローブを標識するための１つまたは複数の蛍光部分を含み得るか、あるいは、キットと共に供給されるプローブは標識化され得る。例えば、製造品は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブを標識するためのドナーおよび／またはアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例は上に提供されている。
製造品はまた、試料中のスパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーおよびプローブを使用するための説明書を有する添付文書または包装ラベルを含み得る。製造品は、本明細書に開示されている方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、または汚染を防止するための薬剤）をさらに含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載されている市販の機器のうちの１つに特異的であり得る。
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載されている発明の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに説明される。
以下の実施例および図は、主題の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載されている手順に改変が加えられ得ることが理解される。
実施例１ アッセイの説明
リアルタイム逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）試験を、公知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者からの例えば鼻および鼻咽頭スワブ検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異Ｎ５０１Ｙ、ｄｅｌ６９－７０およびＥ４８４Ｋの定性的および識別のために、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムで開発して、集団健康管理（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）のためのバリアント疫学の理解をサポートした。変異特異的ＰＣＲアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの監視戦略の一部として、懸念される既知の変異を同定するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性試料の反射試験として使用され得る。アッセイは、ロックド核酸（ＬＮＡ）化学を組み込んだ加水分解（ＴａｑＭａｎ（登録商標））プローブを用いて融解温度（Ｔｍ）を上昇させて単一塩基変異検出を可能にし、点変異（Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ）の検出に対する特異度を推進するように戦略的に設計した。ｄｅｌ６９－７０における６塩基欠失の検出は、従来のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて行うことができた。アッセイはまた、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブとして作用する、ｄｅｌ６９－７０、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ用の３つの色素なし野生型（ｗｔ）プローブを含んだ。アッセイは、蛍光標識された変異体プローブおよびｗｔの色素なしプローブの両方が存在する競合条件下で実施されたので、不一致のプローブは、正確に一致するプローブの安定な結合によって結合が阻害され得る。一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブには、完全に一致および一塩基（またはそれ以上）の不一致配列の間のＴｍ差をさらに増大させるためにＬＮＡを組み込まれている。試験には、対照として、クマリン標識されたプローブを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型特異的ＯＲＦ１ａ／ｂアッセイも含まれた。
リアルタイム逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）試験を、公知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者からの例えば鼻および鼻咽頭スワブ検体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異Ｎ５０１Ｙ、ｄｅｌ６９－７０およびＥ４８４Ｋの定性的および識別のために、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムで開発して、集団健康管理（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）のためのバリアント疫学の理解をサポートした。変異特異的ＰＣＲアッセイは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの監視戦略の一部として、懸念される既知の変異を同定するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性試料の反射試験として使用され得る。アッセイは、ロックド核酸（ＬＮＡ）化学を組み込んだ加水分解（ＴａｑＭａｎ（登録商標））プローブを用いて融解温度（Ｔｍ）を上昇させて単一塩基変異検出を可能にし、点変異（Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ）の検出に対する特異度を推進するように戦略的に設計した。ｄｅｌ６９－７０における６塩基欠失の検出は、従来のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて行うことができた。アッセイはまた、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブとして作用する、ｄｅｌ６９－７０、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ用の３つの色素なし野生型（ｗｔ）プローブを含んだ。アッセイは、蛍光標識された変異体プローブおよびｗｔの色素なしプローブの両方が存在する競合条件下で実施されたので、不一致のプローブは、正確に一致するプローブの安定な結合によって結合が阻害され得る。一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブには、完全に一致および一塩基（またはそれ以上）の不一致配列の間のＴｍ差をさらに増大させるためにＬＮＡを組み込まれている。試験には、対照として、クマリン標識されたプローブを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型特異的ＯＲＦ１ａ／ｂアッセイも含まれた。
患者試料からの核酸および添加されたＲＮＡ内部対照分子（既存のＲＮＡ ＱＳ試薬と同じ）は、同時に抽出される。ウイルス核酸は、試料へのプロテイナーゼおよび溶解試薬の添加によって放出される。放出された核酸は、添加された磁性ガラス粒子のシリカ表面に結合する。未結合物質および不純物、例えば変性したタンパク質、細胞デブリおよび潜在的なＰＣＲ阻害物は、その後の洗浄試薬工程で除去され、精製された核酸は、高温で溶出緩衝液を用いて磁性ガラス粒子から溶出される。
実施例２：プライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドの選択
マスターミックスは、Ｓ遺伝子の変異Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、ｄｅｌ６９－７０、およびさらに野生型ＯＲＦ１ａ／ｂ遺伝子に特異的な蛍光標識された検出プローブを含む。ＲＮＡ内部対照検出プローブも、レポーターとして作用するＣｙ５．５色素で標識した。各プローブはまた、クエンチャーとして作用する第２の色素を含んだ。目的の領域を増幅するためのＰＣＲプライマーを標的領域に対して設計した。したがって、以下を使用してＳ遺伝子の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出する単一ウェルアッセイ設計で研究を開始した：（ｉ）クマリンチャネルでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム中の非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）；（ｉｉ）ＦＡＭチャネルでのＳ遺伝子Ｅ４８４Ｋ変異；（ｉｉｉ）ＨＥＸチャネルでのＳ遺伝子Ｎ５０１Ｋ変異；（ｉｖ）ＪＡ２７０チャネルでのＳ遺伝子の６９～７０欠失。プロセス対照の検出に使用されるＲＮＡ内部対照オリゴヌクレオチドと多重化され得る、様々なアッセイのバイオインフォマティクス分析を行い、性能についての初期アッセイをスクリーニングした。アッセイの特異度を高めるために、Ｅ４８４、Ｎ５０１、ｗｔ６９－７０のマスターミックスに、競合する非標識野生型オリゴヌクレオチド（すなわち、ブロッキングプローブ）を含めた。プライマーセットおよびプローブの選択された組み合わせを表５に示す。
マスターミックスは、Ｓ遺伝子の変異Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、ｄｅｌ６９－７０、およびさらに野生型ＯＲＦ１ａ／ｂ遺伝子に特異的な蛍光標識された検出プローブを含む。ＲＮＡ内部対照検出プローブも、レポーターとして作用するＣｙ５．５色素で標識した。各プローブはまた、クエンチャーとして作用する第２の色素を含んだ。目的の領域を増幅するためのＰＣＲプライマーを標的領域に対して設計した。したがって、以下を使用してＳ遺伝子の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出する単一ウェルアッセイ設計で研究を開始した：（ｉ）クマリンチャネルでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム中の非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）；（ｉｉ）ＦＡＭチャネルでのＳ遺伝子Ｅ４８４Ｋ変異；（ｉｉｉ）ＨＥＸチャネルでのＳ遺伝子Ｎ５０１Ｋ変異；（ｉｖ）ＪＡ２７０チャネルでのＳ遺伝子の６９～７０欠失。プロセス対照の検出に使用されるＲＮＡ内部対照オリゴヌクレオチドと多重化され得る、様々なアッセイのバイオインフォマティクス分析を行い、性能についての初期アッセイをスクリーニングした。アッセイの特異度を高めるために、Ｅ４８４、Ｎ５０１、ｗｔ６９－７０のマスターミックスに、競合する非標識野生型オリゴヌクレオチド（すなわち、ブロッキングプローブ）を含めた。プライマーセットおよびプローブの選択された組み合わせを表５に示す。
実施例３：ＰＣＲアッセイ試薬および条件
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型およびバリアントの両方）のリアルタイムＰＣＲ検出は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を使用して実施した。増幅試薬の最終濃度を以下に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（野生型およびバリアントの両方）のリアルタイムＰＣＲ検出は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を使用して実施した。増幅試薬の最終濃度を以下に示す。
以下の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す。
Ｐｒｅ－ＰＣＲプログラムは、初期変性およびＲＮＡテンプレートの逆転写のための５５℃、６０℃および６５℃でのインキュベーションを含んだ。３つの温度でインキュベートすることは、より低い温度ではわずかに不一致な標的配列（生物の遺伝的バリアントなど）も転写されるが、より高い温度ではＲＮＡ二次構造の形成が抑制され、したがってより効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。ＰＣＲサイクリングを２回の測定に分け、いずれの測定も１段階の設定（アニーリングおよび伸長を組み合わせる）を適用する。５５℃での最初の５サイクルは、わずかに不一致な標的配列を予備増幅することによって包括性の向上を可能にするが、第２の測定の４５サイクルは、５８℃のアニーリング／伸長温度を使用することによって特異度を高める。
実施例４：性能評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント試験のための構成要素、ワークフローおよびアッセイ試薬の評価を、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００試薬を使用して行った。線状化組換えプラスミドを、アッセイオリゴヌクレオチドを用いて試験して性能を評価した。合成ＲＮＡを使用したアッセイの性能を評価するために、インビトロ転写物も生成した。核酸の定量は、ＱｕｂｉｔをＤＮＡおよびＲＮＡ標準と共に使用して行った。プラスミドＤＮＡおよび転写物をＭｕｌｔｉＰｒｅｐ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｌｋ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔとしても公知）に段階希釈し、アッセイ性能研究に使用した。線状化ＤＮＡおよびＲＮＡ転写物の両方を用いた評価には、内部対照オリゴヌクレオチド（汎用内部対照、ＧＩＣ）を含めた。実験は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムの分析用サイクラーで行った。鼻咽頭（ＮＳＰ）試料を、凝集スワブを使用して上気道症状を呈する患者から得て、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ（３ｍＬ）に収集した。改変された試料の調製ワークフロー（プロセスおよび溶出、ＰｎＥ）をｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムで使用し、３００または４００μＬのＮＳＰ試料のいずれかを処理して核酸溶出液を調製した。これらの溶出液は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００で同じＮＳＰ試料調製プロセスに従い、内部試料処理対照として作用するｇＩＣ外装（ａｒｍｏｒｅｄ）ＲＮＡ（ＱＳ ＲＮＡ対照）を含有する。次いで、溶出液を、ＬＣ４８０および／またはｃｏｂａｓ（登録商標）６８００分析用サイクラーでの増幅および検出を伴うＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイを用いた試験で使用した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント試験のための構成要素、ワークフローおよびアッセイ試薬の評価を、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００試薬を使用して行った。線状化組換えプラスミドを、アッセイオリゴヌクレオチドを用いて試験して性能を評価した。合成ＲＮＡを使用したアッセイの性能を評価するために、インビトロ転写物も生成した。核酸の定量は、ＱｕｂｉｔをＤＮＡおよびＲＮＡ標準と共に使用して行った。プラスミドＤＮＡおよび転写物をＭｕｌｔｉＰｒｅｐ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｌｋ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔとしても公知）に段階希釈し、アッセイ性能研究に使用した。線状化ＤＮＡおよびＲＮＡ転写物の両方を用いた評価には、内部対照オリゴヌクレオチド（汎用内部対照、ＧＩＣ）を含めた。実験は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムの分析用サイクラーで行った。鼻咽頭（ＮＳＰ）試料を、凝集スワブを使用して上気道症状を呈する患者から得て、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｍｅｄｉｕｍ（３ｍＬ）に収集した。改変された試料の調製ワークフロー（プロセスおよび溶出、ＰｎＥ）をｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムで使用し、３００または４００μＬのＮＳＰ試料のいずれかを処理して核酸溶出液を調製した。これらの溶出液は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００で同じＮＳＰ試料調製プロセスに従い、内部試料処理対照として作用するｇＩＣ外装（ａｒｍｏｒｅｄ）ＲＮＡ（ＱＳ ＲＮＡ対照）を含有する。次いで、溶出液を、ＬＣ４８０および／またはｃｏｂａｓ（登録商標）６８００分析用サイクラーでの増幅および検出を伴うＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイを用いた試験で使用した。
次いで、マルチプレックスＰＣＲアッセイを実施し、表５に記載されているプライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドを単一反応で試験した。試験試料（ｎ＝２）には、１ｅ６～１ｅ１コピー／ＰＣＲの濃度で試験したＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型ゲノムＲＮＡ、１ｅ１０～１ｅ１コピー／ＰＣＲの濃度で試験したＥ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙ変異の両方を含む変異体転写物、および１ｅ６～１ｅ１コピー／ＰＣＲの濃度で試験したＮ５０１Ｙ変異および６９～７０欠失の両方を有するＴｗｉｓｔ合成対照転写物が含まれた。すべての実験は、考案されたＮＰＳで実施され、これらの試験の結果を図２、図３および図４に示す。データは、広いダイナミックレンジにわたってロバストな成長曲線およびＰＣＲ効率を示し、転写物はすべての標的に対してＰＣＲ反応あたり１０コピーまで検出された。
実施例５：分析感度（検出限界）の決定
分析感度の決定のために、６つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスストックを使用した。それぞれ２つの分離株を、チューリッヒ大学（ＵＺ１単離株：Ｐ．２系統、Ｅ４８４Ｋを有するクレード２０Ｂ；ＵＺ２単離株：Ｂ．１系統、Ｎ５０１Ｙを有するクレード２０Ａ）およびフランクフルト大学（ＵＦ１単離株：Ｂ．１．３５１系統、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙを有するクレード２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２；ならびにＵＦ２単離株：Ｂ．１．１．７系統、Ｎ５０１Ｙおよびｄｅｌ６９／７０を有するクレード２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１）で調製した。Ｌａｂｏｒ Ｂｅｒｌｉｎは、ベルリンのＣｈａｒｉｔｅにあるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのコロナウイルス国立研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）（ＬＢ１単離株：Ｂ．１．３５１系統、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙを有するクレード２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２；ならびにＬＢ２単離株：Ｂ．１．１．７系統、Ｎ５０１Ｙおよびｄｅｌ６９／７０を有するクレード２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１）から厚意により提供された２つの分離株を使用した。
分析感度の決定のために、６つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスストックを使用した。それぞれ２つの分離株を、チューリッヒ大学（ＵＺ１単離株：Ｐ．２系統、Ｅ４８４Ｋを有するクレード２０Ｂ；ＵＺ２単離株：Ｂ．１系統、Ｎ５０１Ｙを有するクレード２０Ａ）およびフランクフルト大学（ＵＦ１単離株：Ｂ．１．３５１系統、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙを有するクレード２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２；ならびにＵＦ２単離株：Ｂ．１．１．７系統、Ｎ５０１Ｙおよびｄｅｌ６９／７０を有するクレード２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１）で調製した。Ｌａｂｏｒ Ｂｅｒｌｉｎは、ベルリンのＣｈａｒｉｔｅにあるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのコロナウイルス国立研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）（ＬＢ１単離株：Ｂ．１．３５１系統、Ｅ４８４ＫおよびＮ５０１Ｙを有するクレード２０Ｈ／５０１Ｙ．Ｖ２；ならびにＬＢ２単離株：Ｂ．１．１．７系統、Ｎ５０１Ｙおよびｄｅｌ６９／７０を有するクレード２０Ｉ／５０１Ｙ．Ｖ１）から厚意により提供された２つの分離株を使用した。
ウイルスストックの力価は、サイクル閾値（Ｃｔ）値を報告するｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムでの使用のｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイを使用して決定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２リボ核酸に対する世界保健機関（ＷＨＯ）の最初の国際規格（ＲＮＡ；ＮＩＢＳＣ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｄｅ ２０／１４６）はまた、このアッセイにて２つの異なる濃度（３．７および５．７ｌｏｇ ＩＵ／ｍｌ）で試験され、標準曲線の線形回帰に基づいて未知試料のＣｔを国際単位（ＩＵ）に変換することを可能にした（ｌｏｇ１０ ＩＵ／ｍＬ＝１２．６６－０．２９７＊Ｃｔ）。以下の少なくとも４つの濃度を含むパネルを生成するために、６つの異なるウイルス分離株のそれぞれの４～７つの希釈物をＣＰＭ（ｃｏｂａｓ（登録商標）ＰＣＲ Ｍｅｄｉａ）またはＵＴＭベースの模擬マトリックス（ＵＴＭ、５０，０００ヒト末梢血単球細胞／ｍＬ、０．０５％ムチン）中で調製した：予想される検出限界（ＬｏＤ）の約３倍、等倍、０．３倍、および０．１倍。各パネルメンバーを２１回繰り返しで試験した。ヒット率分析を使用してＬｏＤ（少なくとも９５％の陽性結果をもたらす濃度）を決定し、ＩＵ／ｍＬで報告した。
各遺伝子座について少なくとも９５％の陽性結果を与えた試験した最低ウイルス濃度、ならびにＳＣＩ対照についての対応する平均サイクル閾値を表８に示す。Ｅ４８４Ｋの場合、この方法によって決定された検出限界（ＬｏＤ）は、試験した３つの異なる分離株に対して１８０および６２０ＩＵ／ｍＬの間であった。Ｎ５０１Ｙの場合、ＬｏＤは２７０および７２０ＩＵ／ｍＬの間（５つの分離株）であったが、コドン６９および７０の欠失の場合、それは８０または９２ＩＵ／ｍＬであった。ＳＣＩ陽性対照標的のＬｏＤは１８および８０ＩＵ／ｍＬの間であった。
実施例６：臨床検体を使用した精度の決定
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント試験の精度を決定するために、３つの標的遺伝子座のうちの１つまたは複数を含むかまたは含まないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む標本を４つの部位で試験した。変異の有無は、標準的なサンガーベースの方法（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）または次世代の方法（Ｌａｂｏｒ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＲｅｇｅｎｓｂｕｒｇおよびＢｉｏｓｃｉｅｎｔｉａ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；補足の方法を参照）を使用したＳの配列決定によって確立した。合計２７３分離株を含めた。チューリッヒ大学で使用された標準的なサンガーベースの方法は、コドン６９～７０の欠失をカバーしないので、これらの試料はその遺伝子座の分析から除外した。すべての試料は、様々な市販または実験室で開発された試験を使用して、ＲＴ－ＰＣＲ陽性であった。鼻、鼻咽頭および中咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄液、気管分泌物、および多様な媒体（水、生理食塩水、ユニバーサルトランスポート媒体、ｃｏｂａｓ ＰＣＲ媒体など）での呼吸器洗浄液を含む様々な種類の検体が含まれた（表９）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント試験の精度を決定するために、３つの標的遺伝子座のうちの１つまたは複数を含むかまたは含まないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む標本を４つの部位で試験した。変異の有無は、標準的なサンガーベースの方法（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）または次世代の方法（Ｌａｂｏｒ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＲｅｇｅｎｓｂｕｒｇおよびＢｉｏｓｃｉｅｎｔｉａ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；補足の方法を参照）を使用したＳの配列決定によって確立した。合計２７３分離株を含めた。チューリッヒ大学で使用された標準的なサンガーベースの方法は、コドン６９～７０の欠失をカバーしないので、これらの試料はその遺伝子座の分析から除外した。すべての試料は、様々な市販または実験室で開発された試験を使用して、ＲＴ－ＰＣＲ陽性であった。鼻、鼻咽頭および中咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄液、気管分泌物、および多様な媒体（水、生理食塩水、ユニバーサルトランスポート媒体、ｃｏｂａｓ ＰＣＲ媒体など）での呼吸器洗浄液を含む様々な種類の検体が含まれた（表９）。
２７３個すべての分離株に対するＳＣＩ対照反応は陽性であり、試料中のウイルスＲＮＡの存在を示した。配列決定によって、Ｅ４８４Ｋが存在した合計２０検体を試験した（表１０）。すべてが、Ｅ４８４Ｋプローブに反応性であった（感度：１００％）。逆に、第４８４位が置換されていない２５２検体では、Ｅ４８４Ｋとの反応性がなかった（特異度：１００％）。１つの試料は、第４８４位の配列データが欠落していた。Ｎ５０１Ｙ（置換あり１０８検体、置換なし１６４検体；１つの試料は配列データ欠落）ならびにコドン６９および７０の欠失（欠失あり９９検体、欠失なし１５７検体；１７個の試料については、この領域の配列データが欠落していた）に対しても同様の結果が得られ、表１０に要約されている。偽陽性および偽陰性の結果は観察されなかった。
実施例７：分析特異度（干渉生物）の決定
特異度は、１７個の異なるウイルス（目標濃度：ＵＴＭベースの模擬マトリックス中１０５ユニット／ｍＬ）、８種類の細菌（１０６ユニット／ｍＬ）またはニューモシスチス・イロベチイ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）（１０６ユニット／ｍＬ）のうちの１つを含むように工夫した試料を使用して評価した。試験した１７種のウイルスは、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、およびＯＣ４３、ヒトメタニューモウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルス、ＭＥＲＳ－コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス１、２、３および４、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ならびにＳＡＲ－コロナウイルスであった。８種類の細菌は、百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であった。ＳＣＩおよび潜在的に交差反応性な生物を含む検体のいずれかを用いた標的化変異のいずれに対してもシグナルは観察されなかった。
特異度は、１７個の異なるウイルス（目標濃度：ＵＴＭベースの模擬マトリックス中１０５ユニット／ｍＬ）、８種類の細菌（１０６ユニット／ｍＬ）またはニューモシスチス・イロベチイ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）（１０６ユニット／ｍＬ）のうちの１つを含むように工夫した試料を使用して評価した。試験した１７種のウイルスは、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、およびＯＣ４３、ヒトメタニューモウイルス、インフルエンザＡおよびＢウイルス、ＭＥＲＳ－コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス１、２、３および４、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ならびにＳＡＲ－コロナウイルスであった。８種類の細菌は、百日咳菌（ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎レンサ球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であった。ＳＣＩおよび潜在的に交差反応性な生物を含む検体のいずれかを用いた標的化変異のいずれに対してもシグナルは観察されなかった。
前述の発明を明確化および理解する目的で、ある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態および詳細に様々な変更がなされ得ることが、当業者には明らかであろう。例えば、上述したすべての技法および装置は、様々な組み合わせで使用され得る。
Claims (22)
- 生体試料中のスパイクタンパク質の変異を有する重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）バリアントを検出する方法であって、
－ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸が前記試料中に存在する場合、前記試料をプライマーセットおよび５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素と接触させて増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；
－ 前記増幅産物を１つまたは複数の検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；ならびに
－ 前記増幅産物の存在を検出することであって、前記増幅産物の検出が前記試料中の前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの存在を示す、前記増幅産物の存在を検出すること
を含み、
前記プライマーセットが、配列番号１～５からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のプライマー、および配列番号７～１４からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第２のプライマーを含み；
前記１つまたは複数の検出可能プローブが、配列番号１６～２５からなる群から選択される第３のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含み；
前記スパイクタンパク質の変異が、６９～７０欠失（ｄｅｌ６９－７０）、Ｎ５０１Ｙ変異、もしくはＥ４８４Ｋ変異、またはそれらの組み合わせから選択される
方法。 - 前記ハイブリダイズ工程、または前記増幅工程および前記ハイブリダイズ工程の両方が、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施され、前記１つまたは複数のブロッキングプローブが、配列番号３７、３８もしくは３９のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズ工程が、前記増幅産物を、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識された１つまたは複数の検出可能プローブと接触させることを含み、前記検出工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分および前記アクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の有無を検出することを含み、蛍光の存在が、前記試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの存在を示す、請求項１または２に記載の方法。
- 前記生体試料が、鼻咽頭試料または中咽頭試料である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）由来の特定の核酸配列を増幅するプライマーセット、および前記プライマーセットによって生成されたＯＲＦ１ａ／ｂ増幅産物にハイブリダイズして検出する検出可能プローブを提供することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、配列番号６のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み；前記検出可能プローブが、配列番号３６のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の方法。
- 生体試料中のスパイクタンパク質の変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントを検出するためのマルチプレックス方法であって、
－ 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸が前記試料中に存在する場合、前記試料を少なくとも２つのプライマーセットと接触させて第１の増幅産物および第２の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること；
－ 前記増幅産物を、前記少なくとも２つのプライマーセットによって生成された前記第１の増幅産物および前記第２の増幅産物にハイブリダイズする少なくとも２つの検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること；ならびに
－ 前記第１の増幅産物および前記第２の増幅産物のうちの少なくとも１つの存在を検出することであって、前記少なくとも１つの増幅産物の存在が、前記試料中の前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの存在を示す、前記第１の増幅産物および前記第２の増幅産物のうちの少なくとも１つの存在を検出すること
を含み、
第１のプライマーセットが、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号７または８のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み；第２のプライマーセットが、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号９、１０または１１のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み；
前記第１のプライマーセットによって生成された前記第１の増幅産物にハイブリダイズする第１の検出可能プローブが、配列番号１６～１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含み；前記第２のプライマーセットによって生成された前記第２の増幅産物にハイブリダイズする第２の検出可能プローブが、配列番号１８～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含み；
前記スパイクタンパク質の変異が、６９～７０欠失（ｄｅｌ６９－７０）、Ｎ５０１Ｙ変異、もしくはＥ４８４Ｋ変異、またはそれらの組み合わせから選択される
マルチプレックス方法。 - 前記ハイブリダイズ工程、または前記増幅工程および前記ハイブリダイズ工程の両方が、１つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施され、前記１つまたは複数のブロッキングプローブが、配列番号３７、３８もしくは３９のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）遺伝子由来の特定の核酸配列を増幅するプライマーセット、および前記プライマーセットによって生成されたＯＲＦ１ａ／ｂ増幅産物にハイブリダイズして検出する検出可能プローブを提供することをさらに含む、請求項７または８に記載の方法。
- 前記ＯＲＦ１ａ／ｂ遺伝子を増幅する前記プライマーセットが、配列番号６のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み、前記検出可能プローブが、配列番号３６のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸を増幅するための前記第１のプライマーセットが、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号８のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み、前記第１の検出可能プローブが、配列番号１７のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸を増幅するための前記第２のプライマーセットが、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号１０のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み、前記第２の検出可能プローブが、配列番号１９のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２のプライマーセットによって生成された前記第２の増幅産物にハイブリダイズする第３の検出可能プローブが提供される、請求項７から１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第３の検出可能プローブが、配列番号２０のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１３に記載の方法。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来の１つまたは複数のスパイクタンパク質（Ｓ）遺伝子の変異を検出するためのキットであって、
－ 配列番号１～５からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１のプライマー；
－ 配列番号７～１４からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第２のプライマー；ならびに
－ 配列番号１６～２５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列または相補体を含む検出可能に標識されたプローブであって、前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成され、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含む、検出可能に標識されたプローブ
を含む、キット。 - － 前記第１のプライマーが、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含み；
－ 前記第２のプライマーが、配列番号７または８のオリゴヌクレオチド配列を含み；
－ 前記検出可能に標識されたプローブが、配列番号１６もしくは１７のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１５に記載のキット。 - － 前記第１のプライマーが、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を含み；
－ 前記第２のプライマーが、配列番号９、１０または１１のオリゴヌクレオチド配列を含み；
－ 前記検出可能に標識されたプローブが、配列番号１８、１９もしくは２０のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１５に記載のキット。 - － 配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマー；
－ 配列番号８のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマー；および
－ 配列番号１７のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む検出可能に標識されたプローブ
をさらに含む、請求項１７に記載のキット。 - 試料中にいくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅の方法であって、
－ ５’末端、３’末端、およびロックド核酸（ＬＮＡ）である少なくとも１つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供することであって、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１の複合体を形成する場合、野生型（ＷＴ）配列に完全に相補的であり、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第２の融解温度（Ｔｍ）を有する第２の複合体を形成する場合、１つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体（ＭＴ）配列に部分的に非相補的であり、前記第１のＴｍが前記第２のＴｍよりも高く、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが３’末端でブロックされ伸長を妨げる、ブロッキングオリゴヌクレオチドを提供すること；ならびに
－ 核酸ポリメラーゼを利用して、前記第２のＴｍよりも高いが前記第１のＴｍよりも低い温度で増幅工程を実施することであって、前記ＷＴ配列および／または前記標的ＭＴ配列が前記試料中に存在する場合、前記増幅工程が、前記試料をプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含み、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記増幅工程中に前記標的ＭＴ配列にはハイブリダイズしなくなるが、前記ＷＴ配列とハイブリダイズしたままであり前記ＷＴ配列の増幅を阻害する、増幅工程を実施すること
を含む、方法。 - 前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号３７、３８もしくは３９のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。
- いくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のためのキットであって、
－ プライマーセット；ならびに
－ ５’末端、３’末端、およびロックド核酸（ＬＮＡ）である少なくとも１つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドであって、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第１の融解温度（Ｔｍ）を有する第１の複合体を形成する場合、野生型（ＷＴ）配列に完全に相補的であり、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第２の融解温度（Ｔｍ）を有する第２の複合体を形成する場合、１つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体（ＭＴ）配列に部分的に非相補的であり、前記第１のＴｍが前記第２のＴｍよりも高い、ブロッキングオリゴヌクレオチド
を含む、キット。 - 前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号３７、３８もしくは３９のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２１に記載のキット。
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