JP2024510465A - スパイクタンパク質の変異を有する重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(sars-cov-2)バリアントを検出するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
生体試料または非生体試料中のスパイク(S)タンパク質遺伝子に変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)のバリアントの存在を迅速に検出するための方法が記載されている。方法は、増幅工程、ハイブリダイズ工程、および検出工程を実施することを含み得る。さらに、S遺伝子の変異を含むSARS-CoV-2バリアントを標的とするプライマーおよびプローブ、ならびにS遺伝子の変異を含むSARS-CoV-2バリアントを検出するために設計されたキットが提供される。【選択図】図1
Description
発明の分野
本開示は、ウイルス診断の分野に関し、より詳細には、スパイク(S)タンパク質遺伝子に変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)のバリアントの検出に関する。
本開示は、ウイルス診断の分野に関し、より詳細には、スパイク(S)タンパク質遺伝子に変異を含む重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)のバリアントの検出に関する。
発明の背景
コロナウイルス(Coronaviridae)科のウイルスは、26~32キロベースの範囲の長さの一本鎖ポジティブセンスRNAゲノムを有する。コロナウイルスは、いくつかの鳥類宿主において、ならびにラクダ、コウモリ、ハクビシン(masked palm civets)、マウス、イヌおよびネコを含む様々な哺乳動物において同定されている。新規な哺乳動物のコロナウイルスは、現在定期的に同定されている。例えば、コウモリ起源のHKU2関連コロナウイルスは、2018年にブタの致命的な急性下痢症候群の原因であった。
コロナウイルス(Coronaviridae)科のウイルスは、26~32キロベースの範囲の長さの一本鎖ポジティブセンスRNAゲノムを有する。コロナウイルスは、いくつかの鳥類宿主において、ならびにラクダ、コウモリ、ハクビシン(masked palm civets)、マウス、イヌおよびネコを含む様々な哺乳動物において同定されている。新規な哺乳動物のコロナウイルスは、現在定期的に同定されている。例えば、コウモリ起源のHKU2関連コロナウイルスは、2018年にブタの致命的な急性下痢症候群の原因であった。
ヒトに対して病原性であるいくつかのコロナウイルスの中で、ほとんどは、2つの顕著な例外(重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス(SARS-CoV)(2002年11月に中国南部の広東省で出現し、2002~03年の間に37か国で8000件を超えるヒト感染および774の死亡例をもたらした新規なベータコロナウイルス);および中東呼吸器症候群(MERS)コロナウイルス(MERS-CoV)(2012年にサウジアラビアで初めて検出され、2012年9月以降の検査所で確認された2494件の感染および死者858人の原因であり、そのうち38人は韓国への1回の訪問後に死亡した))を除いて、軽度の臨床症状を伴う。
2019年12月下旬、ウイルス性肺炎を有する数人の患者が、鳥およびウサギなどのいくつかの非水生動物も大流行前に販売されていた、中国湖北省の武漢の市場に疫学的に関連していることが分かった。2019新規コロナウイルス(2019-nCoV)と最初に命名された新規ヒト感染性コロナウイルスを、次世代シーケンシングを使用して同定した。この新規コロナウイルスは、コロナウイルス科、ベータコロナウイルス属およびサルベコウイルス亜属に分類され、Lu,R.et al.、Lancet、2020、Vol.395、p.565-574による「Genomic characterization and epidemiology of 2019 novel coronavirus:implications for virus origins and receptor binding」に記載されている。2020年2月11日に、世界保健機関(WHO)は、ウイルスの正式名称を重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)として発表した。
SARS-CoV-2の蔓延に対抗し、COVID-19に関連する罹患率および死亡率を低減するために、いくつかの種類の研究および製品開発戦略が追求されている。これらには、mRNA、ウイルスベクター、およびタンパク質サブユニットワクチン、小分子抗ウイルス薬、免疫調節剤、および他の非医薬的介入の開発が含まれる。これまで研究開発されてきたワクチンは、主にウイルスエンベロープ糖タンパク質(スパイク、S)に焦点を当てており、これまで顕著に成功している。さらに、Sを標的とするモノクローナル抗体は、抗ウイルス薬として開発されており、感染または症状発症後すぐに投与される場合に有効な処置である。モノクローナル抗体を非感染個体に投与して、SARS-CoV-2による感染を防ぐこともできる。
すべてのRNAウイルスと同様に、SARS-CoV-2は、エラーを起こしやすいRNA依存性RNAポリメラーゼおよび大きな集団サイズのために、外部選択圧に応答して進化する傾向がある。コロナウイルスは、レプリカーゼ複合体の一部としてプルーフリーディング機能を有するが、各宿主および感染した人々の膨大な集団におけるその高い複製速度により、より適合したバリアントが出現し得るウイルスバリアントの膨大なプールの生成をもたらす。部分免疫を有する感染者または単一の抗Sモノクローナル抗体で処置された感染者で起こり得る、強力であるが不完全な複製阻害が、感受性である宿主の集団において、野生型ウイルスよりも高い複製適合性を有する、Sにエスケープ変異を有するSARS-CoV-2バリアントの選択をもたらすことはほぼ確実である。同様に、天然に存在するバリアントが、免疫学的にナイーブな集団において蔓延する能力が高まった場合、それは比較的短期間で野生型ウイルスを凌駕することができた。
SARS-CoV-2のパンデミックが始まって1年以上が経過し、制御されない世界的な伝染および著しいウイルス進化により、数百のバリアントが生じている。懸念されるバリアント(VOC)、例えば、英国(B.1.1.17)、南アフリカ(B.1.351)、ブラジル(P.1/B.1.1.248)、および注目すべきバリアント(VOI)US[B.1.526(NY)およびB.1.427/B.1.429(カリフォルニア、およびオハイオ)]と見なされるこれらのバリアントのいくつかは、より伝染性が高く、および/または治療応答もしくはワクチン応答に影響を及ぼす可能性がある。疫学的およびウイルス学的評価により、より伝染性の高いVOCが現在独立して発生していることが確認されており、2020年12月の英国からの最初の報告に続いてすぐに、南アフリカからの報告は異なる系統が急速に蔓延し、数週間以内に優勢な系統になることを示した。変異の重要性はまだ完全には断定されていないが、他の系統の迅速な置き換えを示すゲノムデータは、この系統が伝染性の増加に関連し得ることを示唆している。ブラジルからのバリアントが2020年12月上旬に出現し、2021年1月半ばまでには、症例において既に大規模な再興を引き起こしていた。ワクチンおよび関連するスパイク媒介性SARS-CoV-2適応に関する懸念により、VOC選択のための疫学的および監視的努力が必要になった。これらの新興株に見られる重要な変異(del69-70、N501Y、E484K)は、これらの最も懸念される株の蔓延を追跡するために使用されている。SARS-CoV-2スパイク遺伝子の変異は、ウイルスを高度に伝染性にする。そのため、当技術分野では、SARS-CoV-2のバリアント、特に69~70欠失(del69-70)ならびにスパイクタンパク質遺伝子のN501YおよびE484Kでの変異を含むバリアントを検出するための、迅速で、信頼性があり、特異的で、高感度の方法が必要とされている。
本開示は、生体または非生体試料中のスパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントの有無の迅速な検出方法、例えば、単一の試験管中での定性的または定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によるSARS-CoV-2バリアントのマルチプレックス検出に関する。実施形態は、逆転写工程と、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも1回のサイクリング工程とを実施することを含む、del69-70、N501Y、およびE484Kを含む変異の1つまたは複数を有するSARS-CoV-2バリアントの検出方法を含む。さらに、本開示は、単一のチューブ中でSARS-CoV-2バリアントを検出するように設計された、プライマー、プローブ、およびキットを含む。
一態様では、試料中のスパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出する方法が提供され、該方法は、SARS-CoV-2の核酸が試料中に存在する場合、試料をプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること;増幅産物を1つまたは複数の検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること;ならびに増幅産物の存在を検出することであって、増幅産物の検出は試料中のSARS-CoV-2バリアントの存在を示す、増幅産物の存在を検出することを含み;プライマーセットは、配列番号1~5からなる群から選択される第1のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる第1のプライマー、および配列番号7~14からなる群から選択される第2のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる第2のプライマーを含み;1つまたは複数の検出可能プローブは、配列番号16~25からなる群から選択される第3のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなり;スパイクタンパク質の変異は、69-70欠失(del69-70)、N501Y変異、もしくはE484K変異、またはそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、工程は、1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施される。さらなる実施形態では、1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号37、38もしくは39のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むかまたはそれらからなる。
別の態様では、試料中のスパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出するためのマルチプレックス方法が提供され、該方法は、SARS-CoV-2の核酸が試料中に存在する場合、試料を少なくとも2つのプライマーセットと接触させて第1の増幅産物および第2の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること;増幅産物を、少なくとも2つのプライマーセットによって生成された第1の増幅産物および第2の増幅産物にハイブリダイズする少なくとも2つの検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること;ならびに少なくとも1つの増幅産物の存在を検出することであって、少なくとも1つの増幅産物の存在は、試料中のSARS-CoV-2バリアントの存在を示す、少なくとも1つの増幅産物の存在を検出することを含み;第1のプライマーセットは、配列番号1のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号7または8のオリゴヌクレオチドを含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み、第2のプライマーセットは、配列番号2のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号9、10または11のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み;第1のプライマーセットによって生成された第1の増幅産物にハイブリダイズする第1の検出可能プローブは、配列番号16~17からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなり;第2のプライマーセットによって生成された第2の増幅産物にハイブリダイズする第2の検出可能プローブは、配列番号18~20からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなり;スパイクタンパク質の変異は、69~70欠失(del69-70)、N501Y変異、もしくはE484K変異、またはそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、工程は、配列番号37、38もしくは39のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含むかまたはそれらからなる1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施される。
本明細書では、SARS-CoV-2バリアントは、S遺伝子のそれぞれの変異および欠失の結果としてのスパイクタンパク質の69~70欠失(del69-70)、N501Y変異もしくはE484K変異、またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、第1または第2の検出可能プローブは、SARS-CoV-2の69~70欠失を引き起こすS遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第1または第2の検出可能プローブは、SARS-CoV-2のN501Y変異を引き起こすS遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第1または第2の検出可能プローブは、SARS-CoV-2のE484K変異を引き起こすS遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする。一実施形態では、1つまたは複数のブロッキングプローブは、スパイクタンパク質の第69~70位のアミノ酸、または第484位のアミノ酸または第501位のアミノ酸において野生型であるS遺伝子配列と完全に一致するオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のブロッキングプローブは、配列番号37、38もしくは39のオリゴヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる。さらなる実施形態では、SARS-CoV-2の非構造オープンリーディングフレーム(ORF1a/b)由来の特定の核酸配列を増幅するプライマーセットおよびプライマーセットによって生成されたORF1a/b増幅産物にハイブリダイズして検出する検出可能プローブが提供される。一実施形態では、プライマーセットは、配列番号6のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるフォワードプライマー、および配列番号15のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるリバースプライマーを含み;検出可能プローブは、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、SARS-CoV-2バリアントの増幅のためのプライマーセットは、配列番号1のオリゴヌクレオチド配列を含むかそれからなる第1のプライマー、および配列番号7または8のオリゴヌクレオチド配列を含むかそれからなる第2のプライマー、および配列番号16もしくは17のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる検出可能プローブを含む。別の実施形態では、第1のプライマーは、配列番号2からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第2のプライマーは、配列番号9~11のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、配列番号18~20のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる検出可能プローブ。一実施形態では、第1のプライマーは、配列番号1のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第2のプライマーは、配列番号8のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、検出可能プローブは、配列番号17のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。別の実施形態では、第1のプライマーは、配列番号2のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第2のプライマーは、配列番号10のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、検出可能プローブは、配列番号19のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。さらに別の実施形態では、第1のプライマーは、配列番号2のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、第2のプライマーは、配列番号10のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり、検出可能プローブは、配列番号20のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含むかまたはそれからなる。
本開示の他の態様は、100またはそれ以下のヌクレオチドを有する、配列番号1~39から選択されるヌクレオチドの配列またはその相補体を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、100またはそれ以下のヌクレオチドを有する、配列番号1~39のいずれかに対して、少なくとも70%の配列同一性(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%または95%など)を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドまたはその相補体を提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、プローブ核酸などであり得る。
ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、40またはそれ以下のヌクレオチド(例えば、35またはそれ以下のヌクレオチド、30またはそれ以下のヌクレオチド、25またはそれ以下のヌクレオチド、20またはそれ以下のヌクレオチド、15またはそれ以下のヌクレオチドなど)を有する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば未改変ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーションの安定性を変化させるために、少なくとも1つの改変ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、任意に少なくとも1つの標識および任意に少なくとも1つのクエンチャー部分を含む。
一態様では、増幅は、5’から3’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用い得る。したがって、ドナー蛍光部分およびアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いの5~20ヌクレオチド以内(例えば、8または10ヌクレオチド以内)であり得る。別の態様では、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第1および第2の蛍光部分の間に空間的近接をもたらし得る。この方法によれば、プローブ上の第2の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
一態様では、SARS-CoV-2バリアントを検出するための検出可能プローブは、レポーターとして作用する蛍光色素で標識され得る。プローブはまた、クエンチャーとして作用する第2の色素を有し得る。レポーター色素は、規定された波長で測定されることによって、増幅されたSARS-CoV-2標的の検出および識別を可能にする。インタクトなプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制される。PCRの増幅工程中、特定の一本鎖DNAテンプレートへのプローブのハイブリダイゼーションにより、DNAポリメラーゼの5’から3’へのヌクレアーゼ活性による切断をもたらし、レポーターおよびクエンチャー色素の分離、および蛍光シグナルの発生をもたらす。各PCRサイクルに伴い、切断されたプローブの量は増加し、レポーター色素の累積シグナルはそれに伴って増加する。任意に、1つまたは複数のさらなるプローブ(例えば、内部基準対照または他の標的化されたプローブなど(例えば、他のウイルス核酸)はまた、固有かつSARS-CoV-2プローブに関連する蛍光色素標識とは異なるレポーター蛍光色素で標識され得る。そのような場合、個別のレポーター色素は規定された波長で測定されるので、増幅されたSARS-CoV-2標的および1つまたは複数のさらなるプローブの同時検出および識別が可能である。
本開示はまた、個体由来の生体試料中のSARS-CoV-2バリアント、またはスパイクタンパク質遺伝子に変異もしくは欠失を含むSARS-CoV-2の核酸の有無を検出する方法を提供する。これらの方法は、診断試験での使用については、鼻咽頭(NSP)および中咽頭のスワブ試料中のSARS-CoV-2バリアント、またはスパイク遺伝子の変異もしくは欠失を有するSARS-CoV-2の有無を検出するために用いられ得る。さらに、当業者によって同じ試験を使用し、他の種類の試料を評価して、SARS-CoV-2バリアントまたはSARS-CoV-2スパイク遺伝子の変異および欠失を検出し得る。そのような方法は一般に、逆転写工程と、増幅工程および色素結合工程を含む少なくとも1回のサイクリング工程とを実施することを含む。典型的には、増幅工程は、核酸分子が試料中に存在する場合、試料を複数ペアのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて1つまたは複数の増幅産物を生成することを含み、色素結合工程は、増幅産物を二本鎖DNA結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖DNA結合色素の結合の有無を検出することを含み、結合の存在は試料中のSARS-CoV-2バリアントまたはSARS-CoV-2スパイク遺伝子の変異および欠失の存在を示し、結合の非存在は試料中のSARS-CoV-2バリアントまたはSARS-CoV-2スパイク遺伝子の変異および欠失の非存在を示す。代表的な二本鎖DNA結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、DAPI、Hoechst色素、PicoGreen(登録商標)、RiboGreen(登録商標)、OliGreen(登録商標)、ならびにYO-YO(登録商標)およびSYBR(登録商標)Greenなどのシアニン色素が挙げられる。さらに、そのような方法はまた、SARS-CoV-2バリアントまたはSARS-CoV-2の核酸の変異および欠失の有無を確認する、増幅産物および二本鎖DNA結合色素の間の融解温度を決定することを含み得る。
さらなる態様では、SARS-CoV-2バリアント由来の1つまたは複数のスパイク遺伝子の変異を検出するためのキットが提供される。キットは、遺伝子標的の増幅に特異的な1つまたは複数のプライマーセット;および増幅産物の検出に特異的な1つまたは複数の検出可能オリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
一態様では、キットは、ドナーおよび対応するアクセプター部分、例えば他の蛍光部分またはダーククエンチャーで既に標識されたプローブを含み得るか、またはプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を含み得る。キットはまた、プライマー、プローブおよびフルオロフォア部分を使用して、試料中のSARS-CoV-2スパイク遺伝子の変異および欠失の有無を検出するための添付文書および説明書を含み得る。
一態様では、試料中にいくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のための方法が提供され、該方法は、5’末端、3’末端、およびロックド核酸(LNA)である少なくとも1つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供することを含み、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第1の融解温度(Tm)を有する第1の複合体を形成する場合、野生型(WT)配列に完全に相補的であり、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第2の融解温度(Tm)を有する第2の複合体を形成する場合、1つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体(MT)配列に部分的に非相補的であり、第1のTmは第2のTmよりも高く、ブロッキングオリゴヌクレオチドは3’末端でブロックされ伸長を妨げ;第2のTmよりも高いが第1のTmよりも低い温度で増幅工程を実施し、増幅工程は、WT配列および/または標的MT配列が試料中に存在する場合、試料をプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含み、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、増幅工程中に標的MT配列にはハイブリダイズしなくなるが、WT配列とハイブリダイズしたままでありWT配列の増幅を阻害する。
別の態様では、いくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のためのキットが提供され、該キットは、プライマーセット;5’末端、3’末端、およびロックド核酸(LNA)である少なくとも1つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを含み、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第1の融解温度(Tm)を有する第1の複合体を形成する場合、野生型(WT)配列に完全に相補的であり、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズして第2の融解温度(Tm)を有する第2の複合体を形成する場合、1つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体(MT)配列に部分的に非相補的であり、第1のTmは第2のTmよりも高い。
別の態様では、いくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅を実施するためのオリゴヌクレオチドが提供され、該オリゴヌクレオチドは、5’末端、および3’末端でブロックされ伸長を妨げる3’末端を含み、配列は、ハイブリダイズして第1の融解温度(Tm)を有する第1の複合体を形成する場合、野生型(WT)配列と完全に相補的であり、ハイブリダイズして第2の融解温度(Tm)を有する第2の複合体を形成する場合、1つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体(MT)配列に部分的に非相補的であり、第1のTmは第2のTmよりも高く;少なくとも1つのヌクレオチドはロックド核酸(LNA)である。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料が本主題の実践または試験で使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載されている。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することは意図されない。
本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、図面および発明を実施するための形態、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
核酸増幅によるSARS-CoV-2感染の診断(野生型およびバリアントの両方)は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、および感度よく検出するための方法を提供する。非生体または生体試料中の、スパイクタンパク質遺伝子の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出するためのリアルタイムリバーストランスクリプターゼPCRアッセイが本明細書に記載されている。SARS-CoV-2バリアントを検出するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含む製造品またはキットも提供される。他の方法と比較して、SARS-CoV-2バリアントの検出のためのリアルタイムPCRの高い特異度および感度、ならびに試料の封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムPCRの改善された特徴により、臨床検査室におけるSARS-CoV-2感染だけでなく、SARS-CoV-2バリアントの感染の日常的な診断のために、この技術の実装が実現可能になる。さらに、この技術は、インビトロ診断ならびに予後診断のために用いられ得る。このSARS-CoV-2バリアント検出アッセイはまた、他の核酸、例えばインフルエンザウイルス、SARS-CoV、MERS-CoVの検出のために、他のアッセイと並行して多重化され得る。
核酸増幅によるSARS-CoV-2感染の診断(野生型およびバリアントの両方)は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、および感度よく検出するための方法を提供する。非生体または生体試料中の、スパイクタンパク質遺伝子の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出するためのリアルタイムリバーストランスクリプターゼPCRアッセイが本明細書に記載されている。SARS-CoV-2バリアントを検出するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含む製造品またはキットも提供される。他の方法と比較して、SARS-CoV-2バリアントの検出のためのリアルタイムPCRの高い特異度および感度、ならびに試料の封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムPCRの改善された特徴により、臨床検査室におけるSARS-CoV-2感染だけでなく、SARS-CoV-2バリアントの感染の日常的な診断のために、この技術の実装が実現可能になる。さらに、この技術は、インビトロ診断ならびに予後診断のために用いられ得る。このSARS-CoV-2バリアント検出アッセイはまた、他の核酸、例えばインフルエンザウイルス、SARS-CoV、MERS-CoVの検出のために、他のアッセイと並行して多重化され得る。
SARS-CoV-2ゲノムは、29,903塩基長のポジティブセンス一本鎖RNA分子であり(GenBankアクセッション番号NC_045512に示される通り)、以下のような遺伝子の順序(5’から3’)を有する:レプリカーゼORF1ab(ウイルス複製およびウイルスアセンブリに必須の16個の予測非構造タンパク質を有する21,291塩基)、スパイク(S遺伝子、細胞受容体への結合に関与するスパイクタンパク質をコードする3,822塩基)、ORF3ab(828塩基長)、エンベロープ(E遺伝子、エンベロープタンパク質をコードする228塩基)、メンブレン(M遺伝子、メンブレンタンパク質をコードする669塩基)、ヌクレオカプシド(N遺伝子、ゲノムRNAと複合体を形成するヌクレオカプシドタンパク質をコードする1260塩基)。さらに、5’末端に265塩基の非コード領域、3’末端に229塩基の非コード領域が存在する。
S遺伝子は、膜貫通グリコシル化タンパク質である、Sタンパク質または表面糖タンパク質とも称されるスパイクタンパク質をコードし、ホモ三量体としてアセンブルし、SARS-CoV-2ウイルスエンベロープから突出するスパイクを形成する1273アミノ酸から構成される。スパイクタンパク質は、最初にS1サブユニット内の受容体結合ドメイン(RBD)を介して宿主受容体に結合し、次いでS2サブユニットを介してウイルス膜および宿主膜を融合することによって、宿主細胞へのウイルス侵入を媒介する。SARS-CoVと同様に、SARS-CoV-2は、ウイルスのSタンパク質に結合するその宿主受容体としてアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)を認識する。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のRBDは、残基第331位から第524位(または他の報告では残基第333位から第527位)のおよそ200アミノ酸の領域として特徴付けられている。
最近の知見は、野生型のS標的を使用するワクチンによって生成される抗体による中和の減少と相まって、より大きな感染力、高いウイルス量、潜在的に増加した致死率を示すS遺伝子バリアントの出現を報告している。これらの懸念されるバリアント(VOC)は、UK B1.1.7(とりわけ、69-70del、N501Y)、南アフリカB.1.351(K417N、E484KおよびN501Y)およびブラジルB.1.1.28(E484K、N501Y)およびP1である。これらのバリアントは、PCRに基づく検出後に試料を配列決定することによって検出された。69-70del、N501YおよびE484K変異、ならびに共通して観察されるD614G変異の位置を図1に示す。
本開示は、例えば、TaqMan(登録商標)増幅および検出技術を使用してSARS-CoV-2バリアントを特異的に同定するための、SARS-CoV-2ゲノムのスパイクタンパク質遺伝子にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプライマーおよび蛍光標識された加水分解プローブを含む。オリゴヌクレオチドはS遺伝子に特異的にハイブリダイズする。ゲノム内の複数の位置にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを有することは、単一の遺伝子座のみを標的とすることと比較して感度の改善に有利であるため、本開示はまた、SARS-CoV-2ゲノム内の他の領域(例えば、ORF1ab遺伝子)にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプライマーおよび加水分解プローブを提供する。
開示されている方法は、逆転写工程と、1つまたは複数のプライマーペアを使用して試料から核酸分子の遺伝子標的の1つまたは複数の部分を増幅することを含む少なくとも1回のサイクリング工程とを実施することを含み得る。本明細書で使用される「SARS-CoV-2プライマー(複数可)」とは、SARS-CoV-2ゲノムに見られる核酸配列に特異的にアニーリングし、適切な条件下でそこからDNA合成を開始して、それぞれの増幅産物を生成するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。SARS-CoV-2ゲノムに見られる核酸配列の例としては、ORF1ab遺伝子、S遺伝子、ORF3ab遺伝子、E遺伝子、M遺伝子およびN遺伝子および他の予測されるORF領域内の核酸が挙げられる。検討されるSARS-CoV-2プライマーの各々は、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、標的領域にアニーリングする。1つまたは複数の核酸が試料中に存在すれば、1つまたは複数の増幅産物が生成され、したがって、1つまたは複数の増幅産物の存在が試料中のSARS-CoV-2の存在を示す。増幅産物は、SARS-CoV-2についての1つまたは複数の検出可能プローブに相補的な核酸配列を含むはずである。本明細書で使用される「SARS-CoV-2プローブ(複数可)」とは、SARS-CoV-2ゲノムに見られる核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程(ここで、試料が、試料中のSARS-CoV-2の有無を検出するための1つまたは複数の検出可能SARS-CoV-2プローブと接触する)を含む。
本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、テンプレート核酸分子(例えば、SARS-CoV-2ゲノム由来の核酸分子)の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、テンプレート核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーをテンプレート核酸にアニーリングすること、およびプライマーから酵素的に伸長して増幅産物を生成することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ酵素(例えば、Platinum(登録商標)Taq)ならびにポリメラーゼ酵素の最適活性のための適切な緩衝液および/または補因子(例えば、MgCl2および/またはKCl)の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に公知であり、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、テンプレート依存性DNAポリメラーゼによるDNA合成を「プライミング」することができる改変オリゴヌクレオチドも指しており、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの3’末端が遊離3’-OH基を提供し、そこで、3’から5’へのホスホジエステル連結を確立するテンプレート依存性DNAポリメラーゼによってさらに「ヌクレオチド」が付着され得、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への1つまたは複数のプローブのアニーリングを指す。「ハイブリダイゼーション条件」には、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度が含まれる。
「5’から3’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の5’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、すなわち、酵素は、テンプレートに相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖テンプレート核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に供された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの3’末端で開始され、テンプレート鎖に沿って5’から3’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス(Thermus flavus)、T.ルーバー(T.ruber)、T.サーモフィルス(T.thermophilus)、T.アクアティカス(T.aquaticus)、T.ラクテウス(T.lacteus)、T.ルベンス(T.rubens)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、およびメタノサーマス・フェルビダス(Methanothermus fervidus)から単離されている。それでもなお、必要に応じて、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼもPCRアッセイに用いられ得る。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、かつ正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」または「延長」という用語は、さらなるヌクレオチド(または他の類似の分子)が核酸に取り込まれる場合を指す。例えば、核酸は、ヌクレオチドを取り込む生体触媒、例えば、典型的には核酸の3’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼによって、任意に伸長される。
2つまたはそれ以上の核酸配列の文脈における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの1つを使用してまたは目視検査によって測定して、最大の一致となるように比較およびアラインメントした場合、同一または特定パーセンテージの同一ヌクレオチドを有する2つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す。配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、BLASTプログラムであり、例えば、Altschul et al.(1990)「Basic local alignment search tool」J.Mol.Biol.215:403-410、Gish et al.(1993)「Identification of protein coding regions by database similarity search」Nature Genet.3:266-272、Madden et al.(1996)「Applications of network BLAST server」Meth.Enzymol.266:131-141、Altschul et al.(1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs」Nucleic Acids Res.25:3389-3402、およびZhang et al.(1997)「PowerBLAST:A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation」Genome Res.7:649-656に記載されている。
オリゴヌクレオチドの文脈における「改変ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つのヌクレオチドで、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書に記載されているオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な改変ヌクレオチドとしては、例えば、t-ブチルベンジル、C5-メチル-dC、C5-エチル-dC、C5-メチル-dU、C5-エチル-dU、2,6-ジアミノプリン、C5-プロピニル-dC、C5-プロピニル-dU、C7-プロピニル-dA、C7-プロピニル-dG、C5-プロパルギルアミノ-dC、C5-プロパルギルアミノ-dU、C7-プロパルギルアミノ-dA、C7-プロパルギルアミノ-dG、7-デアザ-2-デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、シュードdU、ニトロピロール、ニトロインドール、2’-O-メチルリボ-U、2’-O-メチルリボ-C、N4-エチル-dC、N6-メチル-dAなどが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の改変ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、またはそうでなければ当技術分野で公知である。ある特定の実施形態では、改変ヌクレオチド置換は、対応する改変されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm)を改変する。ヌクレオシドの改変はまた、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加させる部分、またはオリゴヌクレオチドプローブの融解温度を増加させる部分を含み得る。例えば、ヌクレオチド分子は、2’および4’炭素を接続する追加のブリッジで改変され、ヌクレアーゼによる切断に抵抗性である「ロックド核酸(LNA)」ヌクレオチドをもたらし得る(Imanishiらの米国特許第6,268,490号およびWengelらの米国特許第6,794,499号に記載されている通り)。さらに説明すると、ある特定の改変ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅を減少させ(例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える)、意図された標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらの種類の核酸改変の例は、例えば、米国特許第6,001,611号に記載されている。他の改変ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、または他の望ましい特徴を提供し得る。
SARS-CoV-2の検出
本開示は、例えばSARS-CoV-2 S遺伝子の核酸配列の一部を増幅することにより、スパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出する方法を提供する。SARS-CoV-2ゲノムの核酸配列は利用可能である(例えば、GenBankアクセッション番号NC_045512、ここでは、S遺伝子はヌクレオチド第21563位から第25384位に位置する)。具体的には、SARS-CoV-2 S遺伝子の変異および欠失標的配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが、本開示の実施形態によって提供される。
本開示は、例えばSARS-CoV-2 S遺伝子の核酸配列の一部を増幅することにより、スパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出する方法を提供する。SARS-CoV-2ゲノムの核酸配列は利用可能である(例えば、GenBankアクセッション番号NC_045512、ここでは、S遺伝子はヌクレオチド第21563位から第25384位に位置する)。具体的には、SARS-CoV-2 S遺伝子の変異および欠失標的配列を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが、本開示の実施形態によって提供される。
SARS-CoV-2 VOCの検出のために、S遺伝子を増幅するプライマーおよびS遺伝子の変異および欠失を特異的に検出するプローブが提供される。本明細書に例示されているもの以外のSARS-CoV-2の核酸も、試料中のSARS-CoV-2バリアントを検出するために使用され得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異度および/または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示されているSARS-CoV-2の核酸における1つまたは複数の欠失、挿入および/または置換を含み得る。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号1~5、7~14、および16~25、または配列番号1~5、7~14、および16~25の相補体から選択される配列を有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号37~39から選択される、野生型(例えば野生型残基第69~70位、E484、N501)の検出をブロックするオリゴヌクレオチドプローブが提供される。
一実施形態では、SARS-CoV-2バリアントを含むと疑われる生体試料中のSARS-CoV-2の検出を提供するために、上述のSARS-CoV-2プライマーセットおよびプローブが使用される(表1~4)。プライマーセットおよびプローブは、配列番号1~5、7~14、16~25、および37~39の核酸配列を含むかまたはそれからなる、SARS-CoV-2の核酸配列に特異的なプライマーおよびプローブを含むかまたはそれからなり得る。
上に詳述したように、プライマー(および/またはプローブ)は化学的に改変され得、すなわち、プライマーおよび/またはプローブは、改変ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含み得る。したがって、プローブ(またはプライマー)は改変オリゴヌクレオチドである。「改変ヌクレオチド」(または「ヌクレオチド類似体」)は、いくつかの改変によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基もしくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分もしくはリン酸様部分、またはそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を付着させて、「改変ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基はまた、例えば、7-デアザプリンによって置き換えられてもよく、それによっても同様に「改変ヌクレオチド」が得られる。「改変ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類似体」という用語は、本出願において互換的に使用される。「改変ヌクレオシド」(または「ヌクレオシド類似体」)は、「改変ヌクレオチド」(または「ヌクレオチド類似体」)について上に概説したような様式で、いくらかの改変により天然のヌクレオシドとは異なる。
SARS-CoV-2標的をコードする核酸、例えばSARS-CoV-2の別の部分をコードする核酸分子を増幅する、改変オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.、Cascade、Colo.)などのコンピュータプログラムを使用して設計され得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出(例えば、電気泳動によって)を容易にするための適切なサイズの増幅産物、プライマーペアのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ(すなわち、プライマーは、配列特異性をもってアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に正確性が低下するほど長くはない)が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは8~50ヌクレオチド長(例えば、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、または50ヌクレオチド長)である。
プライマーセットに加えて、方法は、SARS-CoV-2バリアントの有無を検出するために1つまたは複数のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的または生物学的に生成された核酸(DNAまたはRNA)を指し、これは、SARS-CoV-2(標的)核酸が存在する場合、設計または選択により、規定される所定のストリンジェンシーの下で特異的に(すなわち、選好的に)、「標的核酸」にハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、開示されているSARS-CoV-2プローブは、少なくとも1つの蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、SARS-CoV-2プローブは、ドナー蛍光部分、例えば、蛍光色素、および対応するアクセプター部分、例えば、クエンチャーで標識され得る。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むかまたはそれからなり、核酸配列は配列番号21~26を含むかまたはそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の様式で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブまたはプローブペアを使用し得る。実施形態に応じて、使用されるプローブ(複数可)は、少なくとも1つの標識および/または少なくとも1つのクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に正確性が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に15~40(例えば、16、18、20、21、22、23、24、または25)ヌクレオチド長である。
構築物は、それぞれがSARS-CoV-2プライマーおよびプローブ核酸分子のうちの1つを含むベクターを含み得る。構築物は、例えば、対照テンプレート核酸分子として使用され得る。使用に適したベクターは、市販されている、および/または当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって作成される。SARS-CoV-2の核酸分子は、例えば、化学合成、SARS-CoV-2からの直接クローニング、または核酸増幅によって得ることができる。
方法での使用に適した構築物は、典型的には、SARS-CoV-2の核酸分子(例えば、配列番号1~5、7~14、および16~25のうちの1つまたは複数の配列を含む核酸分子)に加えて、所望の構築物および/または形質転換体を選択するための選択可能マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)をコードする配列、および複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性および回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
SARS-CoV-2の核酸分子を含む構築物は、宿主細胞内で増やされ得る。本明細書で使用される場合、宿主細胞という用語は、原核生物および真核生物、例えば酵母、植物および動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主としては、大腸菌(E.coli)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、およびバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)が挙げられ得る。真核生物宿主としては、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、S.ポンベ(S.pombe)、ピキア パストリス(Pichia pastoris)などの酵母、COS細胞またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、ならびにアラビドプシス タリアナ(Arabidopsis thaliana)およびニコチアナ タバカム(Nicotiana tabacum)などの植物細胞が挙げられる。構築物は、当業者に一般的に公知な技法のいずれかを使用して宿主細胞に導入され得る。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。さらに、ネイキッドDNAは細胞に直接送達され得る(例えば、米国特許第5,580,859号および同第5,589,466号を参照)。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,800,159号、および同第4,965,188号は、従来のPCR技法を開示している。PCRは、典型的には、選択された核酸テンプレート(例えば、DNAまたはRNA)に結合する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーとしては、記載されているSARS-CoV-2の核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド(例えば、配列番号1~20)が挙げられる。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製され得るか、または合成的に生成され得る。プライマーは、増幅における最大効率のためには一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であり得る。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するように処理される。二本鎖核酸を変性させる1つの方法は、加熱によるものである。
米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号、同第4,800,159号、および同第4,965,188号は、従来のPCR技法を開示している。PCRは、典型的には、選択された核酸テンプレート(例えば、DNAまたはRNA)に結合する2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーとしては、記載されているSARS-CoV-2の核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド(例えば、配列番号1~20)が挙げられる。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製され得るか、または合成的に生成され得る。プライマーは、増幅における最大効率のためには一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であり得る。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するように処理される。二本鎖核酸を変性させる1つの方法は、加熱によるものである。
テンプレート核酸が二本鎖である場合、PCRでテンプレートとして使用され得る前に、二本の鎖を分離することが必要である。鎖の分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成され得る。核酸の鎖を分離する1つの方法は、核酸が優位に変性される(例えば、50%、60%、70%、80%、90%または95%を超える変性)まで加熱することを含む。テンプレート核酸を変性させるために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長などの反応物の特徴に応じて、約90℃~約105℃の範囲である。変性は、典型的には、約30秒間~4分間(例えば、1分間~2分30秒間、または1.5分間)実施される。
二本鎖テンプレート核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、その標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリングの温度は、通常、約35℃~約65℃、(例えば、約40℃~約60℃、約45℃~約50℃)である。アニーリング時間は、約10秒~約1分(例えば、約20秒~約50秒;約30秒~約40秒)であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こり、テンプレート核酸に相補的な産物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸テンプレートにアニーリングされた各プライマーから伸長産物を合成するのに十分でなくてはならないが、その相補的なテンプレートから伸長産物を変性させるほど高くすべきではない(例えば、伸長のための温度は、一般に、約40℃~約80℃の範囲(例えば、約50℃~約70℃;約60℃)である)。伸長時間は、約10秒~約5分(例えば、約30秒~約4分;約1分~約3分;約1分30秒~約2分)であり得る。
レトロウイルスまたはRNAウイルス、例えばSARS-CoV-2、ならびに他のフラビウイルスのゲノムは、リボ核酸、すなわちRNAから構成される。そのような場合、テンプレート核酸であるRNAは、酵素リバーストランスクリプターゼの作用を介して相補的DNA(cDNA)に最初に転写されなければならない。リバーストランスクリプターゼは、RNAテンプレートおよびRNAの3’末端に相補的な短いプライマーを使用して、第1鎖cDNAの合成を指示し、次いでこれはポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして直接使用され得る。
PCRアッセイは、RNAまたはDNA(cDNA)などのSARS-CoV-2の核酸を用い得る。テンプレート核酸は精製される必要はなく;ヒト細胞に含まれるSARS-CoV-2の核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。SARS-CoV-2の核酸分子は、Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications(Persing et al.(eds)、1993、American Society for Microbiology、Washington D.C.)に記載されているものなどの日常的な技法によって生体試料から抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、あるいは細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、または植物もしくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマー(例えば、配列番号1~20)は、プライマー伸長を誘導する反応条件下でPCR試薬と組み合わされる。例えば、鎖伸長反応物には、一般に、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.3)、15mM MgCl2、0.001%(w/v)ゼラチン、0.5~1.0μgの変性されたテンプレートDNA、50pmolの各オリゴヌクレオチドプライマー、2.5UのTaqポリメラーゼ、および10%DMSO)が含まれる。反応物は、通常、それぞれ150~320μMのdATP、dCTP、dTTP、dGTP、またはそれらの1つもしくは複数の類似体を含む。
新規に合成される鎖は、反応の後続工程で使用され得る二本鎖分子を形成する。標的SARS-CoV-2の核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖の分離、アニーリング、および伸長の工程は必要に応じて何度でも繰り返され得る。反応の制限因子は、反応物中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程(すなわち、変性、アニーリング、および伸長)は、好ましくは少なくとも1回繰り返される。検出での使用については、サイクリング工程の数は、例えば、試料の性質に依存し得る。試料が核酸の複合混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となり得る。一般に、サイクリング工程は少なくとも約20回繰り返されるが、40、60、または100回でさえ繰り返えされ得る。
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、同第5,565,322号、同第5,849,489号、および同第6,162,603号を参照)は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いにある特定の距離内に配置されると、2つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それは可視化され得るか、または別様に検出および/または定量化され得るという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動する。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。ある特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光ドナー部分を含む生体分子を介して、ドナー部分およびアクセプター部分の間で移動され得る(例えば、米国特許第7,741,467号を参照)。
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、同第5,565,322号、同第5,849,489号、および同第6,162,603号を参照)は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いにある特定の距離内に配置されると、2つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それは可視化され得るか、または別様に検出および/または定量化され得るという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動する。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。ある特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光ドナー部分を含む生体分子を介して、ドナー部分およびアクセプター部分の間で移動され得る(例えば、米国特許第7,741,467号を参照)。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分(例えば、HEX)、および蛍光性であってもなくてもよく、移動されたエネルギーを光以外の形態で散逸させる対応するクエンチャー(例えば、BlackHole Quencher(商標)(BHQ)を含み得る。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナーおよびアクセプター部分の間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばTaqポリメラーゼの5’から3’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第5,210,015号、同第5,994,056号、および同第6,171,785号に記載されている。一般的に使用されるドナー-アクセプターペアには、FAM-TAMRAペアが含まれる。一般的に使用されるクエンチャーは、DABCYLおよびTAMRAである。一般的に使用されるダーククエンチャーには、BlackHole Quenchers(商標)(BHQ)、(Biosearch Technologies,Inc.、Novato、Cal.)、Iowa Black(商標)(Integrated DNA Tech.,Inc.、Coralville、Iowa)、BlackBerry(商標)Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.、Dexter、Mich.)が含まれる。
別の例では、それぞれが蛍光部分を含む2つのオリゴヌクレオチドプローブは、SARS-CoV-2標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズし得る。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物の核酸にハイブリダイゼーションすると、FRETシグナルを発生する。ハイブリダイゼーション温度は、約10秒間~約1分間、約35℃~約65℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム(適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲での蛍光発光をモニターするためのフィルタを備える)、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、またはフルオロフォアの直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀(Hg)アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナーおよび対応するアクセプター部分に関して本明細書で使用される場合、「対応する」とは、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有する、アクセプター蛍光部分またはダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも100nm大きくなければならない。それにより、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動が生じ得る。
蛍光ドナーおよび対応するアクセプター部分は、一般に、(a)高効率Foersterエネルギー移動;(b)大きな最終ストークスシフト(>100nm);(c)可能な限り可視スペクトルの赤色部分(>600nm)への発光のシフト;および(d)ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近にその最大励起波長(例えば、ヘリウム-カドミウム442nmまたはアルゴン488nm)、高い消光係数、高い量子収率、およびその蛍光発光が対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルと良好な重複を有する、ドナー蛍光部分が選択され得る。高い消光係数、高い量子収率、その励起がドナー蛍光部分の発光と良好に重複、および可視スペクトルの赤色部分(>600nm)での発光を有する対応する、アクセプター蛍光部分が選択され得る。
FRET技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用され得る代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、B-フィコエリトリン、9-アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローVS、4-アセトアミド-4’-イソチオ-シアナトスチルベン-2,2’-ジスルホン酸、7-ジエチルアミノ-3-(4’-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン、スクシンイミジル1-ピレンブチレート、および4-アセトアミド-4’-イソチオシアナトスチルベン-2,2’-ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、リサミンローダミンBスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンxイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオン(例えば、ユウロピウム、またはテルビウム)の他のキレートが挙げられる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、例えば、Molecular Probes(Junction City、Oreg.)またはSigma Chemical Co.(St.Louis、Mo.)から得ることができる。
ドナーおよびアクセプター蛍光部分は、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに付着され得る。リンカーアームはドナーおよびアクセプター蛍光部分の間の距離に影響を及ぼし得るので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム(Å)の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約10Å~約25Åである。リンカーアームは、WO84/03285に記載されている種類のものであり得る。WO84/03285はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に付着させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに付着させる方法を開示している。
LC Red 640などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー(例えば、ABI(Foster City、Calif.)またはGlen Research(Sterling、VA)から入手可能なC6-アミノホスホラミダイト)を含むオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、LC Red 640標識されたオリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドにカップリングするために頻繁に使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー(FITC由来、例えばGlen ResearchまたはChemGene(Ashland、Mass.)製のフルオレセイン-CPG)、アミド-リンカー(フルオレセイン-NHS-エステル由来、例えば、BioGenex(San Ramon、Calif.)製のCX-フルオレセイン-CPG)、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン-NHS-エステルのカップリングを必要とする3’-アミノ-CPGが挙げられる。
SARS-CoV-2の検出
本開示は、生体または非生体試料中のスパイクタンパク質の変異(欠失および挿入を含む)を有するSARS-CoV-2バリアントの有無を検出するための方法を提供する。提供される方法は、試料の汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。方法は、逆転写工程、SARS-CoV-2プライマーの1つまたは複数のペアを使用して試料からSARS-CoV-2S遺伝子核酸分子の部分を増幅することを含む少なくとも1回のサイクリング工程、およびFRET検出工程を実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで実施される。SARS-CoV-2のS遺伝子変異の存在を特異的に検出するために、SARS-CoV-2S遺伝子のプライマーおよびプローブを使用して方法を実施することができ、SARS-CoV-2の検出は試料中のSARS-CoV-2バリアントの存在を示す。
本開示は、生体または非生体試料中のスパイクタンパク質の変異(欠失および挿入を含む)を有するSARS-CoV-2バリアントの有無を検出するための方法を提供する。提供される方法は、試料の汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。方法は、逆転写工程、SARS-CoV-2プライマーの1つまたは複数のペアを使用して試料からSARS-CoV-2S遺伝子核酸分子の部分を増幅することを含む少なくとも1回のサイクリング工程、およびFRET検出工程を実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで実施される。SARS-CoV-2のS遺伝子変異の存在を特異的に検出するために、SARS-CoV-2S遺伝子のプライマーおよびプローブを使用して方法を実施することができ、SARS-CoV-2の検出は試料中のSARS-CoV-2バリアントの存在を示す。
本明細書に記載されているように、増幅産物は、FRET技術を活用する標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用して検出され得る。1つのFRETフォーマットは、TaqMan(登録商標)技術を利用して、増幅産物の有無、したがってSARS-CoV-2バリアントの有無を検出する。TaqMan(登録商標)技術は、例えば、1つの蛍光色素(例えばHEX)および1つのクエンチャー(例えばBHQ)(これは蛍光性であってもなくてもよい)で標識された1つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第1の蛍光部分が適切な波長の光で励起される場合、吸収されたエネルギーは、FRETの原理に従って第2の蛍光部分またはダーククエンチャーに移動する。第2の部分は、一般的には、クエンチャー分子である。PCR反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的DNA(すなわち、増幅産物)に結合し、その後の伸長段階中に、例えばTaqポリメラーゼの5’から3’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分およびクエンチャー部分が互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下で第1の蛍光部分を励起すると、第1の蛍光部分からの蛍光発光が検出され得る。例として、ABI PRISM(登録商標)7700配列検出システム(Applied Biosystems)は、TaqMan(登録商標)技術を使用し、試料中のSARS-CoV-2バリアントの有無を検出するために、本明細書に記載されている方法を実施するのに適している。
FRETと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムPCR法を使用した増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第1の蛍光部分および第2の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第2の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造の形成(例えば、ヘアピン)を可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内での二次構造の形成の結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部分が空間的に近接する。標的核酸(すなわち、増幅産物)へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分は互いに分離され、それにより、適切な波長の光での励起後、第1の蛍光部分の発光が検出され得る。
FRET技術の別の一般的なフォーマットは、2つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識され得、一般に、標的DNA分子(例えば、増幅産物)内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、LightCycler(登録商標)機器の光源によって470nmで励起される。FRETの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばLightCycler(登録商標)-Red640(LC Red640)またはLightCycler(登録商標)-Red705(LC Red705)に移動する。次いで、アクセプター蛍光部分は、より長い波長の光を発し、これはLightCycler(登録商標)機器の光学検出システムによって検出される。効率的なFRETは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重複している場合にのみ起こり得る。発出されたシグナルの強度は、元の標的DNA分子の数(例えば、SARS-CoV-2ゲノムの数)と相関し得る。SARS-CoV-2標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が生成される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブペアのメンバー間のFRETに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、FRETの存在は試料中のSARS-CoV-2の存在を示し、FRETの非存在は試料中のSARS-CoV-2の非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、またはある特定の収集スワブ(アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト)の使用はいずれも、試験結果の成功および/または精度に影響を及ぼし得る条件である。
方法の実践で使用され得る代表的な生体試料としては、呼吸器検体(鼻咽頭およびび中咽頭スワブ)、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚、および軟部組織感染が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料の収集および保存方法は、当業者に公知である。生体試料は(例えば、当技術分野で公知の核酸抽出方法および/またはキットによって)処理され、SARS-CoV-2の核酸を放出させ得るか、またはいくつかの場合では、生体試料はPCR反応構成要素および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触され得る。
融解曲線分析は、サイクリングプロファイルに含められ得る追加の工程である。融解曲線分析は、DNAデュプレックスの半分が一本鎖に分離した温度として定義される、融解温度(Tm)と呼ばれる特徴的な温度でDNAが融解するという事実に基づいている。DNAの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、GおよびCヌクレオチドが豊富なDNA分子は、AおよびTヌクレオチドが豊富なDNA分子よりも高いTmを有する。シグナルが失われる温度を検出することによって、プローブの融解温度は決定され得る。同様に、シグナルが発生する温度を検出することによって、プローブのアニーリング温度は決定され得る。SARS-CoV-2増幅産物からのSARS-CoV-2プローブの融解温度(複数可)により、試料中のSARS-CoV-2の有無を確認し得る。
各サーモサイクラーを運転している間に、対照試料も同様にサイクルされ得る。陽性対照試料は、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、(記載されている標的遺伝子の増幅産物以外の)標的核酸対照テンプレートを増幅し得る。陽性対照試料はまた、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅し得る。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で(例えば、試料内で)または患者の試料と並んで実行される別々の試料中で増幅され得る。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション、および/またはFRET反応の成功または失敗の指標である。各サーモサイクラーの実行はまた、例えば、標的テンプレートDNAを欠く陰性対照を含み得る。陰性対照は汚染を測定し得る。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照の反応は、例えば、プライマーが配列特異性をもってアニーリングし、伸長を開始する能力、ならびにプローブが配列特異性をもってハイブリダイズし、FRETが起こる能力を容易に判定することができる。
ある実施形態では、方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、あるサーモサイクラーの運転および次のものの間の汚染を低減または排除するための、ウラシル-DNAグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、米国特許第5,035,996号、同第5,683,896号および同第5,945,313号に記載されている。
FRET技術と組み合わせた従来のPCR法を使用して、方法を実践することができる。一実施形態では、LightCycler(登録商標)機器が使用される。以下の特許出願は、LightCycler(登録商標)技術で使用されるリアルタイムPCRを記載している:WO97/46707、WO97/46714、およびWO97/46712。
LightCycler(登録商標)は、PCワークステーションを使用して動作され得、Window NTオペレーティングシステムを利用し得る。試料からのシグナルは、機械が光学ユニット上にキャピラリを順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示し得る。蛍光取得時間は10~100ミリ秒(msec)である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示は、すべての試料について連続的に更新され得る。生成されたデータは、さらなる分析のために保存され得る。
FRETの代替として、蛍光DNA結合色素(例えば、SYBR(登録商標)GreenまたはSYBR(登録商標)Gold(Molecular Probes))などの二本鎖DNA結合色素を使用して、増幅産物は検出され得る。二本鎖核酸と相互作用すると、このような蛍光DNA結合色素は、適当な波長の光での励起後に、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖DNA結合色素も使用され得る。二本鎖DNA結合色素が使用される場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
当業者は、他の核酸またはシグナル増幅方法も用いられ得ることを理解するであろう。そのような方法の例としては、限定されないが、分岐DNAシグナル増幅、ループ媒介等温増幅(LAMP)、核酸配列ベース増幅(NASBA)、自立配列複製(3SR)、鎖置換増幅(SDA)、またはスマート増幅プロセスバージョン2(SMAP2)が挙げられる。
本開示の実施形態は、1つまたは複数の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製造品/キット
本開示の実施形態は、スパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出するための製造品またはキットをさらに提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、SARS-CoV-2のS遺伝子標的を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。SARS-CoV-2のS遺伝子変異の特異的検出のための代表的なプライマーおよびプローブは、SARS-CoV-2標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素、およびDNA標準など、DNA固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、SARS-CoV-2S遺伝子標的核酸分子を増幅し、それにハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
本開示の実施形態は、スパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出するための製造品またはキットをさらに提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、SARS-CoV-2のS遺伝子標的を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。SARS-CoV-2のS遺伝子変異の特異的検出のための代表的なプライマーおよびプローブは、SARS-CoV-2標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素、およびDNA標準など、DNA固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、SARS-CoV-2S遺伝子標的核酸分子を増幅し、それにハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
製造品はまた、プローブを標識するための1つまたは複数の蛍光部分を含み得るか、あるいは、キットと共に供給されるプローブは標識化され得る。例えば、製造品は、SARS-CoV-2プローブを標識するためのドナーおよび/またはアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なFRETドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例は上に提供されている。
製造品はまた、試料中のスパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出するために、SARS-CoV-2プライマーおよびプローブを使用するための説明書を有する添付文書または包装ラベルを含み得る。製造品は、本明細書に開示されている方法を実施するための試薬(例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、または汚染を防止するための薬剤)をさらに含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載されている市販の機器のうちの1つに特異的であり得る。
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載されている発明の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに説明される。
以下の実施例および図は、主題の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載されている手順に改変が加えられ得ることが理解される。
実施例1 アッセイの説明
リアルタイム逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)試験を、公知のSARS-CoV-2感染患者からの例えば鼻および鼻咽頭スワブ検体中のSARS-CoV-2変異N501Y、del69-70およびE484Kの定性的および識別のために、cobas(登録商標)6800/8800システムで開発して、集団健康管理(Population Health Management)のためのバリアント疫学の理解をサポートした。変異特異的PCRアッセイは、SARS-CoV-2バリアントの監視戦略の一部として、懸念される既知の変異を同定するためのSARS-CoV-2陽性試料の反射試験として使用され得る。アッセイは、ロックド核酸(LNA)化学を組み込んだ加水分解(TaqMan(登録商標))プローブを用いて融解温度(Tm)を上昇させて単一塩基変異検出を可能にし、点変異(E484KおよびN501Y)の検出に対する特異度を推進するように戦略的に設計した。del69-70における6塩基欠失の検出は、従来のTaqMan(登録商標)プローブを用いて行うことができた。アッセイはまた、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブとして作用する、del69-70、E484KおよびN501Y用の3つの色素なし野生型(wt)プローブを含んだ。アッセイは、蛍光標識された変異体プローブおよびwtの色素なしプローブの両方が存在する競合条件下で実施されたので、不一致のプローブは、正確に一致するプローブの安定な結合によって結合が阻害され得る。一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブには、完全に一致および一塩基(またはそれ以上)の不一致配列の間のTm差をさらに増大させるためにLNAを組み込まれている。試験には、対照として、クマリン標識されたプローブを使用したSARS-CoV-2野生型特異的ORF1a/bアッセイも含まれた。
リアルタイム逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)試験を、公知のSARS-CoV-2感染患者からの例えば鼻および鼻咽頭スワブ検体中のSARS-CoV-2変異N501Y、del69-70およびE484Kの定性的および識別のために、cobas(登録商標)6800/8800システムで開発して、集団健康管理(Population Health Management)のためのバリアント疫学の理解をサポートした。変異特異的PCRアッセイは、SARS-CoV-2バリアントの監視戦略の一部として、懸念される既知の変異を同定するためのSARS-CoV-2陽性試料の反射試験として使用され得る。アッセイは、ロックド核酸(LNA)化学を組み込んだ加水分解(TaqMan(登録商標))プローブを用いて融解温度(Tm)を上昇させて単一塩基変異検出を可能にし、点変異(E484KおよびN501Y)の検出に対する特異度を推進するように戦略的に設計した。del69-70における6塩基欠失の検出は、従来のTaqMan(登録商標)プローブを用いて行うことができた。アッセイはまた、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブとして作用する、del69-70、E484KおよびN501Y用の3つの色素なし野生型(wt)プローブを含んだ。アッセイは、蛍光標識された変異体プローブおよびwtの色素なしプローブの両方が存在する競合条件下で実施されたので、不一致のプローブは、正確に一致するプローブの安定な結合によって結合が阻害され得る。一実施形態では、ブロッキングオリゴヌクレオチドプローブには、完全に一致および一塩基(またはそれ以上)の不一致配列の間のTm差をさらに増大させるためにLNAを組み込まれている。試験には、対照として、クマリン標識されたプローブを使用したSARS-CoV-2野生型特異的ORF1a/bアッセイも含まれた。
患者試料からの核酸および添加されたRNA内部対照分子(既存のRNA QS試薬と同じ)は、同時に抽出される。ウイルス核酸は、試料へのプロテイナーゼおよび溶解試薬の添加によって放出される。放出された核酸は、添加された磁性ガラス粒子のシリカ表面に結合する。未結合物質および不純物、例えば変性したタンパク質、細胞デブリおよび潜在的なPCR阻害物は、その後の洗浄試薬工程で除去され、精製された核酸は、高温で溶出緩衝液を用いて磁性ガラス粒子から溶出される。
実施例2:プライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドの選択
マスターミックスは、S遺伝子の変異E484K、N501Y、del69-70、およびさらに野生型ORF1a/b遺伝子に特異的な蛍光標識された検出プローブを含む。RNA内部対照検出プローブも、レポーターとして作用するCy5.5色素で標識した。各プローブはまた、クエンチャーとして作用する第2の色素を含んだ。目的の領域を増幅するためのPCRプライマーを標的領域に対して設計した。したがって、以下を使用してS遺伝子の変異を含むSARS-CoV-2バリアントを検出する単一ウェルアッセイ設計で研究を開始した:(i)クマリンチャネルでのSARS-CoV-2のゲノム中の非構造オープンリーディングフレーム(ORF1a/b);(ii)FAMチャネルでのS遺伝子E484K変異;(iii)HEXチャネルでのS遺伝子N501K変異;(iv)JA270チャネルでのS遺伝子の69~70欠失。プロセス対照の検出に使用されるRNA内部対照オリゴヌクレオチドと多重化され得る、様々なアッセイのバイオインフォマティクス分析を行い、性能についての初期アッセイをスクリーニングした。アッセイの特異度を高めるために、E484、N501、wt69-70のマスターミックスに、競合する非標識野生型オリゴヌクレオチド(すなわち、ブロッキングプローブ)を含めた。プライマーセットおよびプローブの選択された組み合わせを表5に示す。
マスターミックスは、S遺伝子の変異E484K、N501Y、del69-70、およびさらに野生型ORF1a/b遺伝子に特異的な蛍光標識された検出プローブを含む。RNA内部対照検出プローブも、レポーターとして作用するCy5.5色素で標識した。各プローブはまた、クエンチャーとして作用する第2の色素を含んだ。目的の領域を増幅するためのPCRプライマーを標的領域に対して設計した。したがって、以下を使用してS遺伝子の変異を含むSARS-CoV-2バリアントを検出する単一ウェルアッセイ設計で研究を開始した:(i)クマリンチャネルでのSARS-CoV-2のゲノム中の非構造オープンリーディングフレーム(ORF1a/b);(ii)FAMチャネルでのS遺伝子E484K変異;(iii)HEXチャネルでのS遺伝子N501K変異;(iv)JA270チャネルでのS遺伝子の69~70欠失。プロセス対照の検出に使用されるRNA内部対照オリゴヌクレオチドと多重化され得る、様々なアッセイのバイオインフォマティクス分析を行い、性能についての初期アッセイをスクリーニングした。アッセイの特異度を高めるために、E484、N501、wt69-70のマスターミックスに、競合する非標識野生型オリゴヌクレオチド(すなわち、ブロッキングプローブ)を含めた。プライマーセットおよびプローブの選択された組み合わせを表5に示す。
実施例3:PCRアッセイ試薬および条件
SARS-CoV-2(野生型およびバリアントの両方)のリアルタイムPCR検出は、cobas(登録商標)6800/8800システムプラットフォーム(Roche Molecular Systems,Inc、Pleasanton、CA)を使用して実施した。増幅試薬の最終濃度を以下に示す。
SARS-CoV-2(野生型およびバリアントの両方)のリアルタイムPCR検出は、cobas(登録商標)6800/8800システムプラットフォーム(Roche Molecular Systems,Inc、Pleasanton、CA)を使用して実施した。増幅試薬の最終濃度を以下に示す。
以下の表は、PCR増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す。
Pre-PCRプログラムは、初期変性およびRNAテンプレートの逆転写のための55℃、60℃および65℃でのインキュベーションを含んだ。3つの温度でインキュベートすることは、より低い温度ではわずかに不一致な標的配列(生物の遺伝的バリアントなど)も転写されるが、より高い温度ではRNA二次構造の形成が抑制され、したがってより効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。PCRサイクリングを2回の測定に分け、いずれの測定も1段階の設定(アニーリングおよび伸長を組み合わせる)を適用する。55℃での最初の5サイクルは、わずかに不一致な標的配列を予備増幅することによって包括性の向上を可能にするが、第2の測定の45サイクルは、58℃のアニーリング/伸長温度を使用することによって特異度を高める。
実施例4:性能評価
SARS-CoV-2バリアント試験のための構成要素、ワークフローおよびアッセイ試薬の評価を、cobas(登録商標)6800試薬を使用して行った。線状化組換えプラスミドを、アッセイオリゴヌクレオチドを用いて試験して性能を評価した。合成RNAを使用したアッセイの性能を評価するために、インビトロ転写物も生成した。核酸の定量は、QubitをDNAおよびRNA標準と共に使用して行った。プラスミドDNAおよび転写物をMultiPrep Specimen Diluent Buffer(Bulk Generic Specimen Diluentとしても公知)に段階希釈し、アッセイ性能研究に使用した。線状化DNAおよびRNA転写物の両方を用いた評価には、内部対照オリゴヌクレオチド(汎用内部対照、GIC)を含めた。実験は、cobas(登録商標)6800システムの分析用サイクラーで行った。鼻咽頭(NSP)試料を、凝集スワブを使用して上気道症状を呈する患者から得て、Universal Viral Transport Medium(3mL)に収集した。改変された試料の調製ワークフロー(プロセスおよび溶出、PnE)をcobas(登録商標)6800システムで使用し、300または400μLのNSP試料のいずれかを処理して核酸溶出液を調製した。これらの溶出液は、cobas(登録商標)6800で同じNSP試料調製プロセスに従い、内部試料処理対照として作用するgIC外装(armored)RNA(QS RNA対照)を含有する。次いで、溶出液を、LC480および/またはcobas(登録商標)6800分析用サイクラーでの増幅および検出を伴うSARS-CoV-2アッセイを用いた試験で使用した。
SARS-CoV-2バリアント試験のための構成要素、ワークフローおよびアッセイ試薬の評価を、cobas(登録商標)6800試薬を使用して行った。線状化組換えプラスミドを、アッセイオリゴヌクレオチドを用いて試験して性能を評価した。合成RNAを使用したアッセイの性能を評価するために、インビトロ転写物も生成した。核酸の定量は、QubitをDNAおよびRNA標準と共に使用して行った。プラスミドDNAおよび転写物をMultiPrep Specimen Diluent Buffer(Bulk Generic Specimen Diluentとしても公知)に段階希釈し、アッセイ性能研究に使用した。線状化DNAおよびRNA転写物の両方を用いた評価には、内部対照オリゴヌクレオチド(汎用内部対照、GIC)を含めた。実験は、cobas(登録商標)6800システムの分析用サイクラーで行った。鼻咽頭(NSP)試料を、凝集スワブを使用して上気道症状を呈する患者から得て、Universal Viral Transport Medium(3mL)に収集した。改変された試料の調製ワークフロー(プロセスおよび溶出、PnE)をcobas(登録商標)6800システムで使用し、300または400μLのNSP試料のいずれかを処理して核酸溶出液を調製した。これらの溶出液は、cobas(登録商標)6800で同じNSP試料調製プロセスに従い、内部試料処理対照として作用するgIC外装(armored)RNA(QS RNA対照)を含有する。次いで、溶出液を、LC480および/またはcobas(登録商標)6800分析用サイクラーでの増幅および検出を伴うSARS-CoV-2アッセイを用いた試験で使用した。
次いで、マルチプレックスPCRアッセイを実施し、表5に記載されているプライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドを単一反応で試験した。試験試料(n=2)には、1e6~1e1コピー/PCRの濃度で試験したZeptometrix SARS-CoV-2野生型ゲノムRNA、1e10~1e1コピー/PCRの濃度で試験したE484KおよびN501Y変異の両方を含む変異体転写物、および1e6~1e1コピー/PCRの濃度で試験したN501Y変異および69~70欠失の両方を有するTwist合成対照転写物が含まれた。すべての実験は、考案されたNPSで実施され、これらの試験の結果を図2、図3および図4に示す。データは、広いダイナミックレンジにわたってロバストな成長曲線およびPCR効率を示し、転写物はすべての標的に対してPCR反応あたり10コピーまで検出された。
実施例5:分析感度(検出限界)の決定
分析感度の決定のために、6つのSARS-CoV-2ウイルスストックを使用した。それぞれ2つの分離株を、チューリッヒ大学(UZ1単離株:P.2系統、E484Kを有するクレード20B;UZ2単離株:B.1系統、N501Yを有するクレード20A)およびフランクフルト大学(UF1単離株:B.1.351系統、E484KおよびN501Yを有するクレード20H/501Y.V2;ならびにUF2単離株:B.1.1.7系統、N501Yおよびdel69/70を有するクレード20I/501Y.V1)で調製した。Labor Berlinは、ベルリンのChariteにあるInstitute of Virology、Medical Universityのコロナウイルス国立研究所(National Consultation Laboratory for Coronaviruses)(LB1単離株:B.1.351系統、E484KおよびN501Yを有するクレード20H/501Y.V2;ならびにLB2単離株:B.1.1.7系統、N501Yおよびdel69/70を有するクレード20I/501Y.V1)から厚意により提供された2つの分離株を使用した。
分析感度の決定のために、6つのSARS-CoV-2ウイルスストックを使用した。それぞれ2つの分離株を、チューリッヒ大学(UZ1単離株:P.2系統、E484Kを有するクレード20B;UZ2単離株:B.1系統、N501Yを有するクレード20A)およびフランクフルト大学(UF1単離株:B.1.351系統、E484KおよびN501Yを有するクレード20H/501Y.V2;ならびにUF2単離株:B.1.1.7系統、N501Yおよびdel69/70を有するクレード20I/501Y.V1)で調製した。Labor Berlinは、ベルリンのChariteにあるInstitute of Virology、Medical Universityのコロナウイルス国立研究所(National Consultation Laboratory for Coronaviruses)(LB1単離株:B.1.351系統、E484KおよびN501Yを有するクレード20H/501Y.V2;ならびにLB2単離株:B.1.1.7系統、N501Yおよびdel69/70を有するクレード20I/501Y.V1)から厚意により提供された2つの分離株を使用した。
ウイルスストックの力価は、サイクル閾値(Ct)値を報告するcobas(登録商標)6800/8800システムでの使用のcobas(登録商標)SARS-CoV-2アッセイを使用して決定した。SARS-CoV-2リボ核酸に対する世界保健機関(WHO)の最初の国際規格(RNA;NIBSC National Institute of Biological Standards and Control code 20/146)はまた、このアッセイにて2つの異なる濃度(3.7および5.7log IU/ml)で試験され、標準曲線の線形回帰に基づいて未知試料のCtを国際単位(IU)に変換することを可能にした(log10 IU/mL=12.66-0.297*Ct)。以下の少なくとも4つの濃度を含むパネルを生成するために、6つの異なるウイルス分離株のそれぞれの4~7つの希釈物をCPM(cobas(登録商標)PCR Media)またはUTMベースの模擬マトリックス(UTM、50,000ヒト末梢血単球細胞/mL、0.05%ムチン)中で調製した:予想される検出限界(LoD)の約3倍、等倍、0.3倍、および0.1倍。各パネルメンバーを21回繰り返しで試験した。ヒット率分析を使用してLoD(少なくとも95%の陽性結果をもたらす濃度)を決定し、IU/mLで報告した。
各遺伝子座について少なくとも95%の陽性結果を与えた試験した最低ウイルス濃度、ならびにSCI対照についての対応する平均サイクル閾値を表8に示す。E484Kの場合、この方法によって決定された検出限界(LoD)は、試験した3つの異なる分離株に対して180および620IU/mLの間であった。N501Yの場合、LoDは270および720IU/mLの間(5つの分離株)であったが、コドン69および70の欠失の場合、それは80または92IU/mLであった。SCI陽性対照標的のLoDは18および80IU/mLの間であった。
実施例6:臨床検体を使用した精度の決定
SARS-CoV-2バリアント試験の精度を決定するために、3つの標的遺伝子座のうちの1つまたは複数を含むかまたは含まないSARS-CoV-2を含む標本を4つの部位で試験した。変異の有無は、標準的なサンガーベースの方法(University of Zurich)または次世代の方法(Labor Berlin、University Hospital of RegensburgおよびBioscientia、Ingelheim;補足の方法を参照)を使用したSの配列決定によって確立した。合計273分離株を含めた。チューリッヒ大学で使用された標準的なサンガーベースの方法は、コドン69~70の欠失をカバーしないので、これらの試料はその遺伝子座の分析から除外した。すべての試料は、様々な市販または実験室で開発された試験を使用して、RT-PCR陽性であった。鼻、鼻咽頭および中咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄液、気管分泌物、および多様な媒体(水、生理食塩水、ユニバーサルトランスポート媒体、cobas PCR媒体など)での呼吸器洗浄液を含む様々な種類の検体が含まれた(表9)。
SARS-CoV-2バリアント試験の精度を決定するために、3つの標的遺伝子座のうちの1つまたは複数を含むかまたは含まないSARS-CoV-2を含む標本を4つの部位で試験した。変異の有無は、標準的なサンガーベースの方法(University of Zurich)または次世代の方法(Labor Berlin、University Hospital of RegensburgおよびBioscientia、Ingelheim;補足の方法を参照)を使用したSの配列決定によって確立した。合計273分離株を含めた。チューリッヒ大学で使用された標準的なサンガーベースの方法は、コドン69~70の欠失をカバーしないので、これらの試料はその遺伝子座の分析から除外した。すべての試料は、様々な市販または実験室で開発された試験を使用して、RT-PCR陽性であった。鼻、鼻咽頭および中咽頭スワブ、気管支肺胞洗浄液、気管分泌物、および多様な媒体(水、生理食塩水、ユニバーサルトランスポート媒体、cobas PCR媒体など)での呼吸器洗浄液を含む様々な種類の検体が含まれた(表9)。
273個すべての分離株に対するSCI対照反応は陽性であり、試料中のウイルスRNAの存在を示した。配列決定によって、E484Kが存在した合計20検体を試験した(表10)。すべてが、E484Kプローブに反応性であった(感度:100%)。逆に、第484位が置換されていない252検体では、E484Kとの反応性がなかった(特異度:100%)。1つの試料は、第484位の配列データが欠落していた。N501Y(置換あり108検体、置換なし164検体;1つの試料は配列データ欠落)ならびにコドン69および70の欠失(欠失あり99検体、欠失なし157検体;17個の試料については、この領域の配列データが欠落していた)に対しても同様の結果が得られ、表10に要約されている。偽陽性および偽陰性の結果は観察されなかった。
実施例7:分析特異度(干渉生物)の決定
特異度は、17個の異なるウイルス(目標濃度:UTMベースの模擬マトリックス中105ユニット/mL)、8種類の細菌(106ユニット/mL)またはニューモシスチス・イロベチイ(pneumocystis jirovecii)(106ユニット/mL)のうちの1つを含むように工夫した試料を使用して評価した。試験した17種のウイルスは、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヒトコロナウイルス229E、HKU1、NL63、およびOC43、ヒトメタニューモウイルス、インフルエンザAおよびBウイルス、MERS-コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス1、2、3および4、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ならびにSAR-コロナウイルスであった。8種類の細菌は、百日咳菌(bordetella pertussis)、肺炎クラミジア(chlamydia pneumoniae)、インフルエンザ菌(haemophilus influenzae)、レジオネラ・ニューモフィラ(legionella pneumophila)、結核菌(mycobacterium tuberculosis)、肺炎マイコプラズマ(mycoplasma pneumoniae)、化膿性レンサ球菌(streptococcus pyogenes)、肺炎レンサ球菌(streptococcus pneumoniae)であった。SCIおよび潜在的に交差反応性な生物を含む検体のいずれかを用いた標的化変異のいずれに対してもシグナルは観察されなかった。
特異度は、17個の異なるウイルス(目標濃度:UTMベースの模擬マトリックス中105ユニット/mL)、8種類の細菌(106ユニット/mL)またはニューモシスチス・イロベチイ(pneumocystis jirovecii)(106ユニット/mL)のうちの1つを含むように工夫した試料を使用して評価した。試験した17種のウイルスは、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヒトコロナウイルス229E、HKU1、NL63、およびOC43、ヒトメタニューモウイルス、インフルエンザAおよびBウイルス、MERS-コロナウイルス、パラインフルエンザウイルス1、2、3および4、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ならびにSAR-コロナウイルスであった。8種類の細菌は、百日咳菌(bordetella pertussis)、肺炎クラミジア(chlamydia pneumoniae)、インフルエンザ菌(haemophilus influenzae)、レジオネラ・ニューモフィラ(legionella pneumophila)、結核菌(mycobacterium tuberculosis)、肺炎マイコプラズマ(mycoplasma pneumoniae)、化膿性レンサ球菌(streptococcus pyogenes)、肺炎レンサ球菌(streptococcus pneumoniae)であった。SCIおよび潜在的に交差反応性な生物を含む検体のいずれかを用いた標的化変異のいずれに対してもシグナルは観察されなかった。
前述の発明を明確化および理解する目的で、ある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態および詳細に様々な変更がなされ得ることが、当業者には明らかであろう。例えば、上述したすべての技法および装置は、様々な組み合わせで使用され得る。
Claims (22)
- 生体試料中のスパイクタンパク質の変異を有する重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)バリアントを検出する方法であって、
- SARS-CoV-2の核酸が前記試料中に存在する場合、前記試料をプライマーセットおよび5’から3’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素と接触させて増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること;
- 前記増幅産物を1つまたは複数の検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること;ならびに
- 前記増幅産物の存在を検出することであって、前記増幅産物の検出が前記試料中の前記SARS-CoV-2バリアントの存在を示す、前記増幅産物の存在を検出すること
を含み、
前記プライマーセットが、配列番号1~5からなる群から選択される第1のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1のプライマー、および配列番号7~14からなる群から選択される第2のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2のプライマーを含み;
前記1つまたは複数の検出可能プローブが、配列番号16~25からなる群から選択される第3のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含み;
前記スパイクタンパク質の変異が、69~70欠失(del69-70)、N501Y変異、もしくはE484K変異、またはそれらの組み合わせから選択される
方法。 - 前記ハイブリダイズ工程、または前記増幅工程および前記ハイブリダイズ工程の両方が、1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施され、前記1つまたは複数のブロッキングプローブが、配列番号37、38もしくは39のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズ工程が、前記増幅産物を、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識された1つまたは複数の検出可能プローブと接触させることを含み、前記検出工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分および前記アクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の有無を検出することを含み、蛍光の存在が、前記試料中のSARS-CoV-2バリアントの存在を示す、請求項1または2に記載の方法。
- 前記生体試料が、鼻咽頭試料または中咽頭試料である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- SARS-CoV-2の非構造オープンリーディングフレーム(ORF1a/b)由来の特定の核酸配列を増幅するプライマーセット、および前記プライマーセットによって生成されたORF1a/b増幅産物にハイブリダイズして検出する検出可能プローブを提供することをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーセットが、配列番号6のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号15のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み;前記検出可能プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項5に記載の方法。
- 生体試料中のスパイクタンパク質の変異を有するSARS-CoV-2バリアントを検出するためのマルチプレックス方法であって、
- 前記SARS-CoV-2の核酸が前記試料中に存在する場合、前記試料を少なくとも2つのプライマーセットと接触させて第1の増幅産物および第2の増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること;
- 前記増幅産物を、前記少なくとも2つのプライマーセットによって生成された前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物にハイブリダイズする少なくとも2つの検出可能プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること;ならびに
- 前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物のうちの少なくとも1つの存在を検出することであって、前記少なくとも1つの増幅産物の存在が、前記試料中の前記SARS-CoV-2バリアントの存在を示す、前記第1の増幅産物および前記第2の増幅産物のうちの少なくとも1つの存在を検出すること
を含み、
第1のプライマーセットが、配列番号1のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号7または8のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み;第2のプライマーセットが、配列番号2のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号9、10または11のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み;
前記第1のプライマーセットによって生成された前記第1の増幅産物にハイブリダイズする第1の検出可能プローブが、配列番号16~17からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含み;前記第2のプライマーセットによって生成された前記第2の増幅産物にハイブリダイズする第2の検出可能プローブが、配列番号18~20からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含み;
前記スパイクタンパク質の変異が、69~70欠失(del69-70)、N501Y変異、もしくはE484K変異、またはそれらの組み合わせから選択される
マルチプレックス方法。 - 前記ハイブリダイズ工程、または前記増幅工程および前記ハイブリダイズ工程の両方が、1つまたは複数のブロッキングオリゴヌクレオチドプローブの存在下で実施され、前記1つまたは複数のブロッキングプローブが、配列番号37、38もしくは39のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項7に記載の方法。
- SARS-CoV-2の非構造オープンリーディングフレーム(ORF1a/b)遺伝子由来の特定の核酸配列を増幅するプライマーセット、および前記プライマーセットによって生成されたORF1a/b増幅産物にハイブリダイズして検出する検出可能プローブを提供することをさらに含む、請求項7または8に記載の方法。
- 前記ORF1a/b遺伝子を増幅する前記プライマーセットが、配列番号6のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号15のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み、前記検出可能プローブが、配列番号36のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記SARS-CoV-2の核酸を増幅するための前記第1のプライマーセットが、配列番号1のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号8のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み、前記第1の検出可能プローブが、配列番号17のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項7から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SARS-CoV-2の核酸を増幅するための前記第2のプライマーセットが、配列番号2のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマー、および配列番号10のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーを含み、前記第2の検出可能プローブが、配列番号19のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項7から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のプライマーセットによって生成された前記第2の増幅産物にハイブリダイズする第3の検出可能プローブが提供される、請求項7から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3の検出可能プローブが、配列番号20のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項13に記載の方法。
- SARS-CoV-2バリアント由来の1つまたは複数のスパイクタンパク質(S)遺伝子の変異を検出するためのキットであって、
- 配列番号1~5からなる群から選択される第1のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第1のプライマー;
- 配列番号7~14からなる群から選択される第2のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む第2のプライマー;ならびに
- 配列番号16~25からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列または相補体を含む検出可能に標識されたプローブであって、前記第1のプライマーおよび前記第2のプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成され、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含む、検出可能に標識されたプローブ
を含む、キット。 - - 前記第1のプライマーが、配列番号1のオリゴヌクレオチド配列を含み;
- 前記第2のプライマーが、配列番号7または8のオリゴヌクレオチド配列を含み;
- 前記検出可能に標識されたプローブが、配列番号16もしくは17のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項15に記載のキット。 - - 前記第1のプライマーが、配列番号2のオリゴヌクレオチド配列を含み;
- 前記第2のプライマーが、配列番号9、10または11のオリゴヌクレオチド配列を含み;
- 前記検出可能に標識されたプローブが、配列番号18、19もしくは20のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項15に記載のキット。 - - 配列番号1のオリゴヌクレオチド配列を含む第1のプライマー;
- 配列番号8のオリゴヌクレオチド配列を含む第2のプライマー;および
- 配列番号17のオリゴヌクレオチド配列またはその相補体を含む検出可能に標識されたプローブ
をさらに含む、請求項17に記載のキット。 - 試料中にいくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅の方法であって、
- 5’末端、3’末端、およびロックド核酸(LNA)である少なくとも1つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドを提供することであって、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第1の融解温度(Tm)を有する第1の複合体を形成する場合、野生型(WT)配列に完全に相補的であり、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第2の融解温度(Tm)を有する第2の複合体を形成する場合、1つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体(MT)配列に部分的に非相補的であり、前記第1のTmが前記第2のTmよりも高く、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが3’末端でブロックされ伸長を妨げる、ブロッキングオリゴヌクレオチドを提供すること;ならびに
- 核酸ポリメラーゼを利用して、前記第2のTmよりも高いが前記第1のTmよりも低い温度で増幅工程を実施することであって、前記WT配列および/または前記標的MT配列が前記試料中に存在する場合、前記増幅工程が、前記試料をプライマーセットと接触させて増幅産物を生成することを含み、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、前記増幅工程中に前記標的MT配列にはハイブリダイズしなくなるが、前記WT配列とハイブリダイズしたままであり前記WT配列の増幅を阻害する、増幅工程を実施すること
を含む、方法。 - 前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号37、38もしくは39のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項19に記載の方法。
- いくつかのバリアント配列の形態で存在する、標的配列の対立遺伝子特異的増幅のためのキットであって、
- プライマーセット;ならびに
- 5’末端、3’末端、およびロックド核酸(LNA)である少なくとも1つのヌクレオチドを含むブロッキングオリゴヌクレオチドであって、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第1の融解温度(Tm)を有する第1の複合体を形成する場合、野生型(WT)配列に完全に相補的であり、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズして第2の融解温度(Tm)を有する第2の複合体を形成する場合、1つまたは複数のヌクレオチドにおいて、標的変異体(MT)配列に部分的に非相補的であり、前記第1のTmが前記第2のTmよりも高い、ブロッキングオリゴヌクレオチド
を含む、キット。 - 前記ブロッキングオリゴヌクレオチドが、配列番号37、38もしくは39のオリゴヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項21に記載のキット。
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