JP2023153260A - 膜融合を促進するための組成物およびその使用 - Google Patents

膜融合を促進するための組成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】膜融合を促進するための組成物およびその使用の提供。【解決手段】いくつかの態様では、フソゲンを含む膜封入調製物を含む、フソソーム組成物および方法は、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞に融合することができ、それによって、複合生物学的薬剤を標的細胞の細胞質に送達する。本開示は、いくつかの態様では、（ａ）脂質二重層と、（ｂ）脂質二重層によって囲まれている内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、（ｃ）外因性または過剰発現したフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、を含む、フソソームを提供し、フソソームは、供給源細胞に由来し、フソソームは、部分的または完全な核の不活性化（例えば、核の除去）を有する。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０１７年５月８日に出願された米国特許出願第６２／５０２，９９８号、２０１７年１０月２０日に出願された米国特許出願第６２／５７５，１４７号、および２０１７年１２月７日出願された米国特許出願第６２／５９５，８６２号の優先権を主張し、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
複合生物学的製剤は、様々な疾患に有望な治療的候補である。しかしながら、細胞膜が、細胞と細胞外空間との間の障壁として機能するため、大きな生物学的薬剤を細胞に送達することは困難である。当該技術分野において、対象における細胞に複雑な生物学的製剤を送達する新しい方法が必要である。
膜融合は、受精、発達、免疫応答、および腫瘍形成などの多様な生物学的プロセスに必要である。本開示は、複合生物学的カーゴを細胞に送達する融合ベースの方法を提供する。
したがって、本開示は、いくつかの態様では、脂質二重層、脂質二重層に囲まれた内腔、およびフソゲンを含むフソソームを提供する。フソソームは、例えば、標的細胞への内腔または脂質二重層内のカーゴの送達のために使用することができる。カーゴには、例えば、治療用タンパク質、核酸、および小分子が含まれる。
本開示は、いくつかの態様では、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって囲まれている内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）外因性または過剰発現したフソゲンであって、例えば、フソゲンが、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、を含む、フソソームを提供し、
フソソームは、供給源細胞に由来し、
フソソームは、部分的または完全な核の不活性化（例えば、核の除去）を有する。
いくつかの実施形態において、以下のもののうちの１つ以上が、以下を示す：
ｉ）フソソームは、細胞生物学的製剤を含むか、または細胞生物学的製剤に含まれる、
ｉｉ）フソソームは、除核細胞を含む、
ｉｉｉ）フソソームは、不活性化された核を含む、
ｉｖ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で標的細胞と融合する、
ｖ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で標的細胞と融合する、
ｖｉ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の薬剤が、２４、４８、または７２時間後、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｖｉｉ）フソゲンは、例えば、実施例２９のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
ｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例４３または１５６のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数の治療剤を含む、
ｉｘ）フソゲンのコピー数と治療剤のコピー数の比は、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００である、
ｘ）フソソームは、供給源細胞中の脂質組成と実質的に同様の脂質組成物を含むか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上は、供給源細胞中の対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％以内である、
ｘｉ）フソソームは、例えば、実施例４２または１５５のアッセイを使用して、供給源細胞のプロテオーム組成物と同様のプロテオーム組成物を含む、
ｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質の比率を含む、
ｘｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えばＤＮＡ）の比率を含む、
ｘｉｖ）フソソームは、例えば、実施例５１または１５９のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質対核酸（例えばＤＮＡ）の比率を含む、
ｘｖ）フソソームは、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内である、対象、例えば、マウスにおける半減期を有する、
ｘｖｉ）フソソームは、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定されるように、膜を介してグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を、例えば、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く（例えば、約１１．６％多く）輸送する、
ｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である内腔中のエステラーゼ活性を含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中のクエン酸シンターゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である代謝活性レベルを含む、
ｘｉｘ）フソソームは、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中の呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を含む、
ｘｘ）フソソームは、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、または１０，０００のＭＦＩのアネキシン－Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームは、例えば、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の同様のフソソームのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームは、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含む、
ｘｘｉ）フソソームは、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のｍｉＲＮＡ含有レベルよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きいｍｉＲＮＡ含有レベルを有する、
ｘｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞の比率よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、例えば、供給源細胞の比率の１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％以内である、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームは、例えば、質量分析により測定されるように、例えば、実施例４８のアッセイによって、供給源細胞のＬＰＳ含量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％未満またはそれより少ないＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉｖ）フソソームは、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナル、例えば、インスリンに応答するＡＫＴリン酸化反応、またはインスリンに応答するグルコース（例えば、標識グルコース、例えば２－ＮＢＤＧ）の取り込みを、例えば、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く輸送することを可能にする、
ｘｘｖ）フソソームは、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、対象、例えば、マウスに投与される場合、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、例えば、実施例８７または１００のアッセイによって、２４、４８、または７２時間後、標的組織中に存在する、
ｘｘｖｉ）フソソームは、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）により誘発されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多くジャスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマクロファージにより誘発されるパラクリンシグナル伝達レベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多いパラクリンシグナル伝達のレベルを有する、
ｘｘｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＣ２Ｃ１２細胞中の重合アクチンのレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内のレベルでアクチンを重合する、
ｘｘｉｘ）フソソームは、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＣ２Ｃ１２細胞中の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を有するか、またはフソソームは、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、または－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｘ）フソソームは、例えば、実施例５７のアッセイによって、供給源細胞または供給源細胞と同じタイプの細胞の溢出率の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の割合で血管から溢出することができ、例えば、供給源細胞は、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、またはＮＫ細胞である、
ｘｘｘｉ）フソソームは、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる、
ｘｘｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胎児線維芽細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より多い割合でタンパク質を分泌することができる、
ｘｘｘｉｉｉ）フソソームは、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｘｘｘｉｖ）フソソームは、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｘｘｘｖ）フソソームは、所定の基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、実質的に病原体を含まない、
ｘｘｘｖｉ）フソソームは、所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有する、例えば、実質的に汚染物質を含まない、
ｘｘｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｘｘｘｖｉｉｉ）供給源細胞は、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、あるいは
ｘｘｘｉｘ）供給源細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外である。
本開示はまた、いくつかの態様では、
ａ）フソソームが供給源細胞に由来する、脂質二重層、および水溶液、例えば水と混和性である内腔と、
ｂ）脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現したフソゲンと、
ｃ）内腔内に配置されたオルガネラ、例えば治療上有効な数のオルガネラと、を含む、フソソームも提供する。
いくつかの実施形態において、以下のもののうちの１つ以上は、以下を示す：
ｉ）供給源細胞は、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞）、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、
ｉｉ）オルガネラは、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、ミトコンドリア、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒から選択される、
ｉｉｉ）フソソームは、５ｕｍ、１０ｕｍ、２０ｕｍ、５０ｕｍ、または１００ｕｍより大きいサイズを有する、
ｉ）フソソーム、または複数のフソソームを含む組成物もしくは調製物は、例えば、実施例３３のアッセイによって測定されるように、１．０８ｇ／ｍｌ～１．１２ｇ／ｍｌ以外の密度を有し、例えば、フソソームは、１．２５ｇ／ｍｌ＋／－０．０５の密度を有する、
ｉｖ）フソソームは、循環中のスカベンジャーシステムまたは肝臓洞のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｖ）供給源細胞は、２９３細胞以外である、
ｖｉ）供給源細胞は、形質転換または不死化されていない、
ｖｉｉ）供給源細胞は、アデノウイルス媒介による不死化以外の方法を使用して形質転換または不死化される、例えば、自然突然変異またはテロメラーゼ発現による不死化によって不死化される、
ｖｉｉｉ）フソゲンは、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、または分泌顆粒タンパク質以外である、
ｉｘ）フソソームは、ＣｒｅまたはＧＦＰ、例えば、ＥＧＦＰを含まない、
ｘ）フソソームは、ＣｒｅまたはＧＦＰ以外の外因性タンパク質、例えば、ＥＧＦＰをさらに含む、
ｘｉ）フソソームは、例えば、内腔内に外因性核酸（例えば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）または外因性タンパク質（例えば、抗体、例えば抗体）をさらに含む、
ｘｉｉ）フソソームは、ミトコンドリアを含まない。
本開示はまた、いくつかの態様では、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって囲まれている内腔（例えば、サイトゾルを含む）と、
（ｃ）外因性または過剰発現したフソゲンであって、例えば、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）機能的核と、を含む、フソソームも提供し、
フソソームは、供給源細胞に由来する。
いくつかの実施形態において、以下のもののうちの１つ以上は、以下を示す：
ｉ）供給源細胞は、樹枝状細胞または腫瘍細胞以外であり、例えば、内皮細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞）、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、
ｉｉ）フソゲンは、フソゲン糖タンパク質以外である、
ｉｉｉ）フソゲンは、フェルチリン－ベータ以外の哺乳動物タンパク質であり、
ｉｖ）フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、
ｖ）フソソームは、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｖｉ）フソソームは、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｖｉｉ）フソソームは、所定の基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、実質的に病原体を含まない、
ｖｉｉｉ）フソソームは、所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有する、例えば、実質的に汚染物質を含まない。
本開示はまた、いくつかの態様では、複数のフソソームを含む精製されたフソソーム組成物を提供し、少なくとも１つのフソソームは、
ａ）脂質二重層および水性内腔であって、フソソームは、供給源細胞に由来する、脂質二重層および水性内腔と、
ｂ）脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現したフソゲンと、を含み、
フソソームは、４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃未満の温度である。
本開示はまた、いくつかの態様では、複数のフソソームを含む精製されたフソソーム組成物も提供し、少なくとも１つのフソソームは、
ａ）脂質二重層および水性内腔と、
ｂ）脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現したタンパク質フソゲンと、を含み、
フソソームは、４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃未満の温度である。
本開示はまた、いくつかの態様では、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物も提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物も提供し、複数のフソソームは、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）サイトゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれている、内腔と、
（ｃ）脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現したフソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
フソソームは、核を含まず、
フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満であり、
複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも３０％の数の細胞にカーゴを送達する。
本開示はまた、いくつかの態様では、供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物も提供し、複数のフソソームは、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）サイトゾルを含む内腔であって、脂質二重層によって囲まれている、内腔と、
（ｃ）脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現した再標的化フソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
フソソームは、核を含まず、
フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満であり、
（ｉ）複数のフソソームは、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴは、非標的細胞よりも標的細胞中に少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍多く存在するか、あるいは
（ｉｉ）複数のフソソームは、非標的細胞よりも少なくとも５０％高い割合で標的細胞と融合する。
本開示はまた、いくつかの態様では、供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物も提供し、複数のフソソームは、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって囲まれている内腔と、
（ｃ）外因性または過剰発現したフソゲンであって、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
フソソームは、核を含まず、
ｉ）フソゲンは、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｉｉ）フソソームは、少なくとも１，０００コピーのコピー数で治療剤を含む、
ｉｉｉ）フソソームは、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が供給源細胞中の対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｉｖ）フソソームは、供給源細胞のプロテオーム組成物と同様のプロテオーム組成物を含む、
ｖ）フソソームは、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルを送信すること、例えば、インスリンに応答するＡＫＴリン酸化反応、または例えば、陰性対照、例えばインスリンの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、インスリンに応答するグルコース（例えば、標識グルコース、例えば２－ＮＢＤＧ）の取り込みを可能にする、
ｖｉ）フソソームは、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、対象、例えば、マウスに投与される場合、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％または１０％が、２４時間後に標的組織中に存在するか、あるいは
供給源細胞は、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２、３つ、４つ、または５つ）である。
本開示はまた、いくつかの態様では、本明細書に記載のフソソーム組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物も提供する。
本開示は、ある特定の態様では、フソソーム組成物を、対象（例えば、ヒト対象）、標的組織、または細胞に投与する方法であって、対象に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載のフソソーム組成物、もしくは本明細書に記載の薬学的組成物と接触させ、それによって、フソソーム組成物を対象に投与することを含む、方法も提供する。
本開示はまた、ある特定の態様では、治療剤（例えば、ポリペプチド、核酸、代謝産物、オルガネラ、または細胞下構造）を、対象、標的組織、または細胞に送達する方法であって、対象に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、もしくは本明細書に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法も提供し、フソソーム組成物は、治療剤が送達されるような量および／または時間で投与される。
本開示はまた、ある特定の態様では、ある機能を、対象、標的組織、または細胞に送達する方法であって、対象に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、もしくは本明細書に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法も提供し、フソソーム組成物は、ある機能（ｆｉｕｎｃｔｉｏｎ）が送達されるような量および／または時間で投与される。
本開示はまた、ある特定の態様では、ある機能を、対象、標的組織、または細胞に標的化する方法であって、対象に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、もしくは本明細書に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、方法も提供し、フソソーム組成物は、ある機能が標的化されるような量および／または時間で投与される。
本開示はまた、ある特定の態様では、対象、標的組織、または細胞における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、対象に投与すること、または標的組織もしくは細胞を、本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、もしくは本明細書に記載の薬学的組成物と接触させ、それによって、対象における生物学的機能を調節することを含む、方法も提供する。
本開示はまた、ある特定の態様では、機能を対象に送達または標的化する方法であって、対象に、機能を含む本明細書に記載の複数のフソソームを含むフソソーム組成物、本明細書に記載のフソソーム組成物、または本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含み、フソソーム組成物は、対象の機能が送達または標的化されるような量および／または時間で投与される、方法も提供する。実施形態において、対象は、がん、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、損傷した臓器機能、感染症、変性疾患、遺伝病、または傷害を有する。
本開示はまた、いくつかの態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）フソゲンを含む、例えば、それを発現する供給源細胞を提供することと、
ｂ）供給源細胞から、脂質二重層、内腔、およびフソゲンを含むフソソームを生成し、それによってフソソームを作製することと、
ｃ）フソソームを、例えば、対象への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含む、方法も提供する。
実施形態において、以下のもののうちの１つ以上は、以下を示す：
ｉ）供給源細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外である、
ｉｉ）フソゲンは、ウイルスタンパク質以外である、
ｉｉｉ）フソソーム、または複数のフソソームを含む組成物もしくは調製物は、例えば、１．０８ｇ／ｍｌ～１．１２ｇ／ｍｌ以外の密度を有する、
ｉｖ）フソソームは、例えば、実施例３３のアッセイによって測定されるように、１．２５ｇ／ｍｌ＋／－０．０５の密度を有する、
ｖ）フソソームは、循環中のスカベンジャーシステムまたは肝臓洞のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｖｉ）フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによって、対象における細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、
ｖｉｉ）複数のフソソームが対象に投与される場合、複数の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満は、例えば、実施例７６のアッセイによって、２４、４８、または７２時間後、ＲＥＳによって捕捉されるかまたは捕捉されない、
ｖｉｉｉ）フソソームは、５ｕｍ、６ｕｍ、７ｕｍ、８ｕｍ、１０ｕｍ、２０ｕｍ、５０ｕｍ、１００ｕｍ、１５０ｕｍ、または２００ｕｍより大きい直径を有する、
ｉｘ）フソソームは、細胞生物学的物質を含む、
ｘ）フソソームは、除核細胞を含むか、あるいは
ｘｉ）フソソームは、不活性化された核を含む。
いくつかの態様では、本開示は、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソーム、本明細書に記載のフソソーム組成物、または本明細書に記載の薬学的組成物を提供することと、
ｂ）フソソームを、例えば、対象への投与に適した薬学的組成物として製剤化することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソームまたは本明細書に記載のフソソーム組成物を提供する、例えば、生成することと、
ｂ）１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）の基準が満たされているかどうかを判定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、を含む、方法を提供する。実施形態において、基準（複数可）は、以下から選択される：
ｉ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で標的細胞と融合する、
ｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で標的細胞と融合する、
ｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の薬剤が、２４、４８、または７２時間後、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する、
ｉｖ）フソゲンは、例えば、実施例２９のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、
ｖ）フソソームは、例えば、実施例４３または１５６のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数の治療剤を含む、
ｖｉ）フソゲンのコピー数と治療剤のコピー数の比は、１，０００，０００：１、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１～５０：１、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、１：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００、または１：２０～１：５０、１：１００、１，０００：１、１０，０００：１、１００，０００：１、および１，０００，０００：１である、
ｖｉｉ）フソソームは、供給源細胞の脂質組成物と実質的に同様の脂質組成物を含むか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上は、供給源細胞中の対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または７５％以内である、
ｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例４２または１５５のアッセイを使用して、供給源細胞のプロテオーム組成物と同様のプロテオーム組成物を含む、
ｉｘ）フソソームは、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質の比率を含む、
ｘ）フソソームは、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるタンパク質と核酸（例えばＤＮＡ）の比率を含む、
ｘｉ）フソソームは、例えば、実施例５１または１５９のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えばＤＮＡ）の比率を含む、
ｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内である、対象、例えば、マウスにおける半減期を有する、
ｘｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定されるように、膜を介してグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を、例えば、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く輸送する、
ｘｉｖ）フソソームは、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である内腔中のエステラーゼ活性を含む、
ｘｖ）フソソームは、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中の代謝活性（例えば、クエン酸シンターゼ活性）の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である代謝活性レベルを含む、
ｘｖｉ）フソソームは、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中の呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）を含む、
ｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、または１０，０００のＭＦＩのアネキシン－Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームは、例えば、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の同様のフソソームのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームは、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含む、
ｘｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のｍｉＲＮＡ含有レベルよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも高いｍｉＲＮＡ含有レベルを有する、
ｘｉｘ）フソソームは、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞の比率よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、例えば、供給源細胞の比率の１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％以内である、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比率を有する、
ｘｘ）フソソームは、例えば、質量分析によって測定されるように、例えば、実施例４８のアッセイによって、供給源細胞のＬＰＳ含量またはフソソームの脂質含量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％未満またはそれより低いＬＰＳレベルを有する、
ｘｘｉ）フソソームは、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナル、例えば、インスリンに応答するＡＫＴリン酸化反応、またはインスリンに応答するグルコース（例えば、標識グルコース、例えば２－ＮＢＤＧ）の取り込みを、例えば、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％多く輸送することを可能にする、
ｘｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）により誘発されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より高いジャスタクリンシグナル伝達レベルを有する、
ｘｘｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマクロファージにより誘発されるパラクリンシグナル伝達レベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％より高いパラクリンシグナル伝達のレベルを有する、
ｘｘｉｖ）フソソームは、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＣ２Ｃ１２細胞中の重合アクチンのレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内のレベルでアクチンを重合する、
ｘｘｖ）フソソームは、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＣ２Ｃ１２細胞中の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を有するか、またはフソソームは、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、または－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有する、
ｘｘｖｉ）フソソームは、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胎児線維芽細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高い割合でタンパク質を分泌することができる、あるいは
ｘｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する、ならびに
ｃ）（任意に）基準のうちの１つ以上が満たされた場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認する。
本開示はまた、いくつかの態様では、フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）本明細書に記載の複数のフソソームまたは本明細書に記載のフソソーム組成物を提供する、例えば、生成することと、
ｂ）
ｉ）例えば、本明細書に記載されるように、免疫原性分子、例えば、免疫原性タンパク質、
ｉｉ）病原体、例えば、細菌もしくはウイルス、または
ｉｉｉ）汚染物質、の因子のうちの１つ以上の存在またはレベルを決定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｃ）（任意に）因子のうちの１つ以上が、基準値を下回っている場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含む、方法も提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、ヒト対象にフソソーム組成物を投与する方法であって、
ａ）対象における１つ以上の標的細胞中の第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、対象に第１のフソゲンを投与することと、
ｉ）第１のフソゲンの投与は、１つ以上の標的細胞中の第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含むか、または
ｉｉ）第１のフソゲンは、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上であり、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含むフソソーム組成物を投与することであって、ここで、第２のフソゲンは第１のフソゲンと適合性である、投与することと、
それによって、フソソーム組成物を対象に投与することと、を含む、方法も提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、治療剤を対象に送達する方法であって、
ａ）対象における１つ以上の標的細胞中の第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、対象に第１のフソゲンを投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンの投与は、１つ以上の標的細胞中の第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含むか、または
ｉｉ）第１のフソゲンは、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含むフソソーム組成物および治療剤を投与することであって、ここで、第２のフソゲンは第１のフソゲンと適合性である、投与することと、
それによって、治療剤を対象に送達することと、を含む、方法も提供する。
本開示はまた、いくつかの態様では、対象における生物学的機能を調節する、例えば、増強する方法であって、
ａ）対象における１つ以上の標的細胞中の第１のフソゲンの配置を可能にする条件下で、対象に第１のフソゲンを投与することであって、
ｉ）第１のフソゲンの投与は、１つ以上の標的細胞中の第１のフソゲンの発現を可能にする条件下で、第１のフソゲンをコードする核酸を投与することを含むか、または
ｉｉ）第１のフソゲンは、コイルドコイルモチーフを含まない、のうちの１つ以上である、投与することと、
ｂ）ヒト対象に、第２のフソゲンを含む複数のフソソームを含むフソソーム組成物を投与することであって、ここで、第２のフソゲンは第１のフソゲンと適合性である、投与することと、
それによって、対象における生物学的機能を調節することと、を含む、方法も提供する。
一態様では、本発明は、コンドリソームおよびフソゲンを含むフソソームを含む。
一態様では、本発明は、複数のフソソームを含む組成物を含み、少なくとも１つのフソソームは、コンドリソームおよびフソゲンを含む。
本開示はまた、いくつかの態様では、対象における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法であって、フソソーム組成物（例えば、本明細書に記載のフソソーム組成物）を受容している対象からの生物学的試料を提供することと、本明細書に記載のフソソームと生物学的試料中の標的細胞の融合から生じる生物学的試料の１つ以上の特性を決定するために、アッセイを実施することと、を含む、方法も提供する。いくつかの態様では、本開示は、例えば、実施例５４または１２４に記載されるように、標的細胞との融合を測定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、生物学的試料の１つ以上の特性を決定することは、フソゲンの存在、またはカーゴもしくはペイロードのレベル、またはカーゴもしくはペイロードに関連する活性を決定することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、対象における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法であって、例えば、本明細書に記載されるように、フソソーム組成物を受容している対象からの生物学的試料を提供することと、フソゲン、例えば、本明細書に記載のフソゲンの存在について生物学的試料を試験することと、を含む、方法を提供する。場合によっては、検出されるフソゲンのレベルは、フソソーム組成物を受容していない対象からの対応する生物学的試料中で観察されたものよりも高い（例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、または１００，０００％高い）。いくつかの実施形態において、対象は、フソソーム組成物の投与前の同じ対象であり、いくつかの実施形態において、対象は、異なる対象である。
いくつかの態様では、本開示は、対象における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法であって、例えば、本明細書に記載されるように、フソソーム組成物を受容している対象からの生物学的試料を提供することと、フソゲン、例えば、本明細書に記載のフソゲンの存在について生物学的試料を試験することと、を含む、方法を提供する。場合によっては、検出されるカーゴまたはペイロードのレベルは、フソソーム組成物を受容していない対象からの対応する生物学的試料中で観察されたものよりも高い（例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、または１００，０００％高い）。いくつかの実施形態において、対象は、フソソーム組成物の投与前の同じ対象であり、いくつかの実施形態において、対象は、異なる対象である。
いくつかの態様では、本開示は、標的細胞のフソソーム含有量（例えば、対象における標的細胞へのフソソーム融合）を評価する方法であって、例えば、本明細書に記載されるように、フソソーム組成物を受容している対象からの生物学的試料を提供することと、フソソーム組成物に関連する活性、例えば、フソソーム組成物によって送達されたカーゴまたはペイロードに関連する活性の変化について生物学的試料を試験することと、を含む、方法を提供する。場合によっては、検出された活性のレベルは、フソソーム組成物を受容していない対象（例えば、フソソーム組成物の投与前の同じ対象）からの対応する生物学的試料のものと比較して、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、または１００，０００％増加する。場合によっては、検出された活性のレベルは、フソソーム組成物を受容していない対象からの対応する生物学的試料のものと比較して、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、１０，０００％、５０，０００％、または１００，０００％減少する。いくつかの実施形態において、対象は、フソソーム組成物の投与前の同じ対象であり、いくつかの実施形態において、対象は、異なる対象である。
一態様では、本開示は、対象における標的細胞へのフソソーム融合を評価する方法であって、例えば、本明細書に記載されるように、フソソーム組成物を受容している対象からの生物学的試料を提供することと、生物学的試料中の未融合フソソームのレベルを評価することと、を含む、方法を提供する。
本明細書の態様のいずれか、例えば、上記のフソソーム、フソソーム組成物、および方法は、本明細書の実施形態、例えば、以下の実施形態のうちの１つ以上と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞のサイトゾルに薬剤、例えば、タンパク質、核酸（例えばｍＲＮＡ）、オルガネラ、または代謝産物を送達（例えば送達）することができる。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的細胞のサイトゾルに薬剤を送達することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、標的細胞内に存在しないか、変異体であるか、または野生型より低いレベルであるタンパク質（またはタンパク質をコードする核酸、例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、遺伝的疾患、例えば、単一遺伝子疾患、例えば、単一遺伝子細胞内タンパク質疾患を有する対象からのものである。いくつかの実施形態において、薬剤は、転写因子、例えば、外因性転写因子または内因性転写因子を含む。いくつかの態様では、フソソームは、１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、または５０）の追加の転写因子、例えば、外因性転写因子、内因性転写因子、またはそれらの組み合わせをさらに含むか、またはそれらを送達することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、複数の薬剤（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、または５０の薬剤）を含み（例えば、標的細胞に送達することができ）、複数の各薬剤は、標的細胞内の経路のステップに作用し、例えば、経路は、生合成経路、異化経路、またはシグナル伝達カスケードである。実施形態において、複数の各薬剤は、経路を上方調節するか、経路を下方調節する。いくつかの実施形態において、フソソームは、経路のステップに作用しない、例えば、第２の経路のステップに作用する１つ以上のさらなる薬剤（例えば、第２の複数の薬剤を含む）をさらに含むか、または本方法は、それらを送達することをさらに含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、複数の薬剤（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、または５０の薬剤）を含み（例えば、標的細胞に送達することができ）、複数の各薬剤は、単一経路の一部であり、例えば、その経路は、生合成経路、異化経路、またはシグナル伝達カスケードである。いくつかの実施形態において、フソソームは、単一経路の一部ではない、例えば第２の経路の一部である、１つ以上のさらなる薬剤（例えば、複数の第２の薬剤を含む）をさらに含むか、または本方法は、それらを送達することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、標的細胞は、凝集したまたはミスフォールドしたタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞内の凝集したまたはミスフォールドしたタンパク質のレベルを減少させることができる（例えば、レベルを減少させる）か、または本明細書の方法は、標的細胞内の凝集したまたはミスフォールドしたタンパク質のレベルを減少させることを含む。
いくつかの実施形態において、薬剤は、転写因子、酵素（例えば、核酵素もしくはサイトゾル酵素）、ＤＮＡへの配列特異的修飾を媒介する試薬（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、もしくはＴＡＬＥＮ）、ｍＲＮＡ（例えば、細胞内タンパク質をコードするｍＲＮＡ）、オルガネラ、または代謝産物から選択される。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞の細胞膜に薬剤、例えばタンパク質を送達することができる（例えば送達する）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的細胞の細胞膜に薬剤を送達することを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質の送達は、標的細胞がタンパク質を生成し、それを膜に局在化するように、タンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）を標的細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、タンパク質を含み、または本方法は、タンパク質を送達することをさらに含み、フソソームと標的細胞との融合は、タンパク質を標的細胞の細胞膜に移す。いくつかの実施形態において、薬剤は、細胞表面受容体に結合する細胞表面リガンドまたは抗体を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞表面受容体に結合する第２の細胞表面リガンドまたは抗体を含むか、またはそれをコードする第２の薬剤をさらに含むか、または本方法は、それらを送達することをさらに含み、任意に、細胞表面受容体に結合する１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、５０、またはそれ以上）の追加の細胞表面リガンドまたは抗体をさらに含むか、またはそれらをコードする。いくつかの実施形態において、第１の薬剤および第２の薬剤は、複合体を形成し、任意に、複合体は、１つ以上の追加の細胞表面リガンドをさらに含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、細胞表面受容体、例えば、外因性細胞表面受容体を含むか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態において、フソソームは、第２の細胞表面受容体を含むか、またはそれをコードし、任意に、１つ以上の追加の細胞表面受容体（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、５０、またはそれ以上の細胞表面受容体）をさらに含むか、またはそれらをコードする。
いくつかの実施形態において、第１の薬剤および第２の薬剤は、複合体を形成し、任意に、複合体は、１つ以上の追加の細胞表面受容体をさらに含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗原または抗原提示タンパク質を含むか、またはそれをコードする。
いくつかの態様では、フソソームは、例えば、標的細胞がタンパク質を産生および分泌することを可能にする条件下で、タンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）を標的細胞に送達することによって、分泌された薬剤、例えば、分泌タンパク質を標的部位（例えば細胞外領域）に送達することができる（例えば送達する）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、本明細書に記載の分泌剤を送達することを含む。実施形態において、分泌タンパク質は、内因性または外因性である。実施形態において、分泌タンパク質は、治療用タンパク質、例えば、抗体分子、サイトカイン、または酵素を含む。実施形態において、分泌タンパク質は、オートクリンシグナル伝達分子またはパラクリンシグナル伝達分子を含む。実施形態において、分泌された薬剤は、分泌顆粒を含む。
いくつかの態様では、フソソームは、例えば、転写因子またはｍＲＮＡ、または複数の当該薬剤から選択される薬剤を送達することによって、標的細胞（例えば免疫細胞）を再プログラミングすることができる（例えば再プログラミングする）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的細胞を再プログラミングすることを含む。実施形態において、再プログラミングは、ドーパミン作動性ニューロンの１つ以上の特性を呈するように非ドーパミン作動性ニューロンを誘導することによって、または消耗していないＴ細胞、例えば、キラーＴ細胞の１つ以上の特性を呈するように消耗したＴ細胞を誘導することによって、膵臓ベータ細胞の１つ以上の特性を呈するように膵臓内分泌細胞を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、抗原を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、抗原を含む第１の薬剤、および抗原提示タンパク質を含む第２の薬剤を含む。
いくつかの態様では、フソソームは、１つ以上の細胞表面受容体を標的細胞（例えば免疫細胞）に提供することができる（例えば提供する）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、１つ以上の細胞表面受容体を提供することを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的腫瘍細胞を改変することができる、例えば、改変する。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的腫瘍細胞を改変することを含む。実施形態において、フソソームは、免疫刺激リガンド、抗原提示タンパク質、腫瘍抑制タンパク質、またはプロアポトーシスタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、免疫抑制リガンド、細胞増殖シグナル、または成長因子の標的細胞のレベルを減少させることができるｍｉＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、免疫調節性、例えば免疫刺激性である薬剤を含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞に抗原を提示させることができる（例えば提示させる）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的細胞上に抗原を提示することを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的組織の再生を促進する。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的組織の再生を促進することを含む。実施形態において、標的細胞は、心臓細胞、例えば、心筋細胞（例えば静止心筋細胞）、肝芽細胞（例えば胆管肝芽細胞）、上皮細胞、ナイーブＴ細胞、マクロファージ（例えば腫瘍湿潤マクロファージ）、または線維芽細胞（例えば心臓線維芽細胞）である。実施形態において、供給源細胞は、Ｔ細胞（例えばＴｒｅｇ）、マクロファージ、または心筋細胞である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、遺伝子療法のために、例えば、標的細胞のゲノムを安定に改変するために、核酸を標的細胞に送達することができる（例えば、送達する）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、核酸を標的細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、標的細胞は、酵素欠乏を有し、例えば、酵素の活性の減少（例えば、活性なし）をもたらす酵素の変異を含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞内のＤＮＡ（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、またはＴＡＬＥＮ）への配列特異的修飾を媒介する試薬を送達することができる（例えば送達する）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、試薬を標的細胞に送達することを含む。実施形態において、標的細胞は、筋肉細胞（例えば骨格筋細胞）、腎臓細胞、または肝臓細胞である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、標的細胞における遺伝子発現を一時的に改変するために、核酸を標的細胞に送達することができる（例えば送達する）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、タンパク質欠乏を一時的に救助するために、タンパク質を標的細胞に送達することができる（例えば送達する）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、タンパク質を標的細胞に送達することを含む。実施形態において、タンパク質は、膜タンパク質（例えば膜輸送体タンパク質）、細胞質タンパク質（例えば酵素）、または分泌タンパク質（例えば免疫抑制タンパク質）である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、オルガネラを標的細胞に送達することができ（例えば送達し）、例えば、標的細胞は、欠陥オルガネラネットワークを有する。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、オルガネラを標的細胞に送達することを含む。実施形態において、供給源細胞は、肝細胞、骨格筋細胞、またはニューロンである。
いくつかの実施形態において、フソソームは、核を標的細胞に送達することができ（例えば送達し）、例えば、標的細胞は、遺伝子変異を有する。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、核を標的細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態において、核は、自己であり、標的細胞に関連する１つ以上の遺伝的変化を含み、例えば、核は、ＤＮＡに対する配列特異的改変（例えば、Ｃａｓ９、ＺＦＮ、もしくはＴＡＬＥＮ）、または人工染色体、ゲノムに組み込まれた追加の遺伝子配列、欠失、またはそれらの任意の組み合わせを含む。実施形態において、自己核の供給源は、幹細胞、例えば造血幹細胞である。実施形態において、標的細胞は、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞もしくは心筋細胞）、肝細胞、またはニューロンである。
いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞内分子送達を可能にし、例えば、タンパク質薬剤を標的細胞に送達する。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、分子を標的細胞の細胞内領域に送達することを含む。実施形態において、タンパク質薬剤は、阻害剤である。実施形態において、タンパク質薬剤は、ナノボディ、ｓｃＦｖ、ラクダ科抗体、ペプチド、マクロサイクル、または小分子を含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞にタンパク質、例えば治療用タンパク質を分泌させることができる（例えば分泌させる）。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的細胞にタンパク質を分泌させることを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、薬剤、例えばタンパク質を分泌することができる（例えば分泌する）。いくつかの実施形態において、薬剤、例えば分泌された薬剤は、対象において標的部位に送達される。いくつかの実施形態において、薬剤は、組換え的に作製することができないか、組換え的に作製することが困難なタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質を分泌するフソソームは、ＭＳＣまたは軟骨細胞から選択される供給源細胞からのものである。
いくつかの実施形態において、フソソームは、その膜上に１つ以上の細胞表面リガンド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、５０、またはそれ以上の細胞表面リガンド）を含む。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的細胞に１つ以上の細胞表面リガンドを提示することを含む。いくつかの実施形態において、細胞表面リガンドを有するフソソームは、好中球（例えば、標的細胞は腫瘍浸潤リンパ球である）、樹状細胞（例えば、標的細胞はナイーブＴ細胞である）、または好中球（例えば、標的は腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞である）から選択される供給源細胞からのものである。いくつかの実施形態において、フソソームは、膜複合体、例えば、少なくとも２、３つ、４つ、または５つのタンパク質を含む複合体、例えば、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、またはヘテロ四量体を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、抗体、例えば毒性抗体を含み、例えば、フソソームは、例えば標的部位にホーミングすることによって、抗体を標的部位に送達することができる。いくつかの実施形態において、供給源細胞は、ＮＫ細胞または好中球である。
いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、標的細胞からのタンパク質の分泌または標的細胞の表面上のリガンド提示を引き起こすことを含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞の細胞死を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、フソソームは、ＮＫ供給源細胞からのものである。
いくつかの実施形態において、フソソームまたは標的細胞は、（例えば、病原体の）食作用が可能である。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、食作用を引き起こすことを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、その局所環境を感知し、それに反応する。いくつかの実施形態において、フソソームは、代謝産物、インターロイキン、または抗原のレベルを感知することができる。
実施形態において、フソソームは、走化性、溢出、または１つ以上の代謝活性が可能である。実施形態において、代謝活性は、キヌリニン、糖新生、プロスタグランジン脂肪酸酸化、アデノシン代謝、尿素サイクル、および発熱呼吸から選択される。いくつかの実施形態において、供給源細胞は、好中球であり、フソソームは、損傷部位にホーミングすることができる。いくつかの実施形態において、供給源細胞は、マクロファージであり、フソソームは、食作用が可能である。いくつかの実施形態において、供給源細胞は、褐色脂肪組織細胞であり、フソソームは、脂肪分解が可能である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、複数の薬剤（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、１０、２０、または５０の薬剤）を含む（例えば、標的細胞に送達することができる）。実施形態において、フソソームは、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）およびｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、膜タンパク質または膜タンパク質をコードする核酸を含む（例えば、標的細胞に送達することができる）。実施形態において、フソソームは、標的細胞を再プログラミングまたは分化形質転換させることができ、例えば、フソソームは、標的細胞の再プログラミングまたは分化形質転換を誘導する１つ以上の薬剤を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、再生を必要としている。いくつかの実施形態において、対象は、がん、自己免疫疾患、感染症、代謝性疾患、神経変性疾患、または遺伝病（例えば、酵素欠乏症）に罹患している。
いくつかの実施形態（例えば、カーゴの非エンドサイトーシス送達をアッセイするための実施形態）において、カーゴ送達は、（ａ）３０，０００個のＨＥＫ－２９３Ｔ標的細胞を１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１を含む９６ウェルプレートの第１のウェルに配置し、同様の数の同様の細胞をバフィロマイシンＡ１を欠く９６ウェルプレートの第２のウェルに配置するステップ、（ｂ）３７℃および５％ＣＯ２でＤＭＥＭ培地中で標的細胞を４時間培養するステップ、（ｃ）カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと標的細胞を接触させるステップ、（ｄ）３７℃および５％ＣＯ２で標的細胞とフソソームを２４時間インキュベートするステップ、ならびに（ｅ）カーゴを含む第１のウェルおよび第２のウェル中の細胞の割合を決定するステップ、のうちの１つ以上（例えば、すべて）を使用してアッセイする。ステップ（ｅ）は、顕微鏡検査を使用して、例えば免疫蛍光を使用してカーゴを検出することを含み得る。ステップ（ｅ）は、カーゴを間接的に検出すること、例えば、レポータータンパク質の存在などのカーゴの下流効果を検出することを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ以上は、実施例１３５に記載されるように実施される。
いくつかの実施形態において、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、クロロキンまたはバフィロマイシンＡ１）は、エンドソームの酸性化を阻害する阻害する。いくつかの実施形態において、カーゴ送達は、リソソーム酸性化と無関係である。いくつかの実施形態において、エンドサイトーシスの阻害剤（例えば、ダイナソーレ）は、ダイナミンを阻害する。いくつかの実施形態において、カーゴ送達は、ダイナミン活性と無関係である。
いくつかの実施形態（例えば、標的細胞対非標的細胞へのカーゴの特異的送達のための実施形態）において、カーゴ送達は、（ａ）ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現する３０，０００個のＨＥＫ－２９３Ｔ標的細胞を９６ウェルプレートの第１のウェルに配置し、ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現しない３０，０００個のＨＥＫ－２９３Ｔ非標的細胞を９６ウェルプレートの第２のウェルに配置するステップ、（ｂ）３７℃および５％ＣＯ２でＤＭＥＭ培地中で標的細胞を４時間培養するステップ、（ｃ）カーゴを含む１０ｕｇのフソソームと標的細胞を接触させるステップ、（ｄ）３７℃および５％ＣＯ２で標的細胞とフソソームを２４時間インキュベートするステップ、ならびに（ｅ）カーゴを含む第１のウェルおよび第２のウェル中の細胞の割合を決定するステップ、のうちの１つ以上（例えば、すべて）を使用してアッセイする。ステップ（ｅ）は、顕微鏡検査を使用して、例えば免疫蛍光を使用して、カーゴを検出することを含み得る。ステップ（ｅ）は、カーゴを間接的に検出すること、例えば、レポータータンパク質の存在などのカーゴの下流効果を検出することを含み得る。いくつかの実施形態において、上記のステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ以上は、実施例１２４に記載されるように実施される。
いくつかの実施形態において、
ｉｉ）供給源細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞以外である、
ｉｉｉ）フソゲンは、ウイルスタンパク質以外である、
ｉｖ）フソソーム、または複数のフソソームを含む組成物もしくは調製物は、例えば、１．０８ｇ／ｍｌ～１．１２ｇ／ｍｌ以外の密度を有する、
ｖ）フソソームは、例えば、実施例３３のアッセイによって測定されるように、１．２５ｇ／ｍｌ＋／－０．０５の密度を有する、
ｖｉ）フソソームは、循環中のスカベンジャーシステムまたは肝臓洞のクッパー細胞によって捕捉されない、
ｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例７６のアッセイによって、対象における細網内皮系（ＲＥＳ）によって捕捉されない、
ｖｉｉｉ）複数のフソソームが対象に投与される場合、複数の１％未満、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、例えば、実施例７６のアッセイによって、２４、４８、または７２時間後、ＲＥＳによって捕捉される、
ｉｘ）フソソームは、５ｕｍ、６ｕｍ、７ｕｍ、８ｕｍ、１０ｕｍ、２０ｕｍ、５０ｕｍ、１００ｕｍ、１５０ｕｍ、または２００ｕｍより大きい直径を有する。
いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞生物学的製剤を含むか、または細胞生物学的製剤に含まれる。いくつかの実施形態において、フソソームは、除核細胞を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、不活性化された核を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、機能的核を含まない。
いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、本明細書の特性、例えば以下の特性のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）を有する、または有すると特定される。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞よりも、例えば、少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で標的細胞と融合する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％高い割合で標的細胞と融合する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の薬剤が、２４、４８、または７２時間後、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合する。実施形態において、標的化融合の量は、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、約３０％～７０％、３５％～６５％、４０％～６０％、４５％～５５％、または４５％～５０％、例えば約４８．８％である。実施形態において、標的化融合の量は、例えば、実施例５５のアッセイにおいて、約２０％～４０％、２５％～３５％、または３０％～３５％、例えば約３２．２％である。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、例えば、実施例２９のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する。いくつかの実施形態において、フソソームに含まれるフソゲンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、細胞膜に配置される。実施形態において、フソソームはまた、内部に、例えば細胞質またはオルガネラにフソゲンも含む。いくつかの実施形態において、フソゲンは、例えば、実施例１６２に記載の方法に従っておよび／または質量分析アッセイによって決定されるように、フソソーム中の総タンパク質の約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％以上、または約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、または１３．６％を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソゲンは、フソソーム中の総タンパク質の約１３．６％を含む（またはそれを含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソゲンは、例えば、実施例１６２に記載の方法に従って決定されるように、対象となる１つ以上の追加のタンパク質よりも多かれ少なかれ豊富である（または特定される）。一実施形態において、フソゲンは、約１４０、１４５、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７（例えば１５６．９）、１５８、１５９、１６０、１６５、または１７０のＥＧＦＰに対する比を有する（または有すると特定される）。別の実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、約２７００、２８００、２９００、２９１０（例えば２９１２）、２９２０、２９３０、２９４０、２９５０、２９６０、２９７０、２９８０、２９９０、もしくは３０００、または約１０００～５０００、２０００～４０００、２５００～３５００、２９００～２９３０、２９１０～２９１５、もしくは２９１２．０のＣＤ６３に対する比を有する（または有すると特定される）。一実施形態において、フソゲンは、約６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０（例えば６６４．９）、６７０、６８０、６９０、または７００のＡＲＲＤＣ１に対する比を有する（または有すると特定される）。別の実施形態において、フソゲンは、約５０、５５、６０、６５、７０（例えば６９）、７５、８０、もしくは８５、または約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、または１３．６％のＧＡＰＤＨに対する比を有する（または有すると特定される）。別の実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、約５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０（例えば、５５８．４）、５７０、５８０、５９０、もしくは６００、または約３００～８００、４００～７００、５００～６００、５２０～５９０、５３０～５８０、５４０～５７０、５５０～５６０、もしくは５５８．４のＣＮＸに対する比を有する（または有すると同定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例４３または１５６のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、もしくは１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数の治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例４３または１５６のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数のタンパク質治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数の核酸治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数のＤＮＡ治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数のＲＮＡ治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数の外因性治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数の外因性タンパク質治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーのコピー数の外因性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）治療剤を含む。いくつかの実施形態において、フソゲンのコピー数と治療剤のコピー数の比は、１，０００，０００：１～１００，０００：１、１００，０００：１～１０，０００：１、１０，０００：１～１，０００：１、１，０００：１～１００：１、１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１、５：１～２：１、２：１～１：１、１：１～１：２、１：２～１：５、１：５～１：１０、１：１０～１：２０、１：２０～１：５０、１：５０～１：１００、１：１００～１：１，０００、１：１，０００～１：１０，０００、１：１０，０００～１：１００，０００、または１：１００，０００～１：１，０００，０００である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、治療剤の少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーを標的細胞に送達する。いくつかの実施形態において、フソソームは、タンパク質治療剤の少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーを標的細胞に送達する。いくつかの実施形態において、フソソームは、核酸治療剤の少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーを標的細胞に送達する。いくつかの実施形態において、フソソームは、ＲＮＡ治療剤の少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーを標的細胞に送達する。いくつかの実施形態において、フソソームは、ＤＮＡ治療剤の少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピーを標的細胞に送達する。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞に、フソソームに含まれるカーゴ（例えば、治療剤、例えば、内因性治療剤または外因性治療剤）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％送達する。いくつかの実施形態において、標的細胞（複数可）と融合するフソソームは、標的細胞に、標的細胞（複数可）と融合するフソソームに含まれるカーゴ（例えば、治療剤、例えば、内因性治療剤または外因性治療剤）の平均少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％送達する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、標的組織に、フソソームに含まれるカーゴ（例えば、治療剤、例えば、内因性治療剤または外因性治療剤）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％送達する。
いくつかの実施形態において、フソソームは、フソソーム中の総タンパク質１ｍｇ当たり１ｍｇのフソゲンの０．０００００００１ｍｇのフソゲン、例えば、フソソーム中の総タンパク質１ｍｇ当たり０．０００００００１～０．００００００１、０．００００００１～０．０００００１、０．０００００１～０．００００１、０．００００１～０．０００１、０．０００１～０．００１、０．００１～０．０１、０．０１～０．１、または０．１～１ｍｇのフソゲンを含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、フソソーム中の脂質１ｍｇ当たり０．０００００００１ｍｇ～５ｍｇのフソゲン、例えば、フソソーム中の脂質１ｍｇ当たり０．０００００００１～０．００００００１、０．００００００１～０．０００００１、０．０００００１～０．００００１、０．００００１～０．０００１、０．０００１～０．００１、０．００１～０．０１、０．０１～０．１、０．１～１、または１～５ｍｇのフソゲンを含む。
いくつかの実施形態において、カーゴは、タンパク質カーゴである。実施形態において、カーゴは、内因性または合成タンパク質カーゴである。いくつかの実施形態において、フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、またはそれ以上のタンパク質カーゴ分子を有する（または有すると特定される）。一実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１５６に記載の方法に従って定量化されるように、１フソソーム当たり約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１６６、１７０、１８０、１９０、または２００個のタンパク質薬剤分子を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、内因性または合成タンパク質カーゴは、フソソーム中の総タンパク質の約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％またはそれ以上を含む（または含むと特定される）。一実施形態において、合成タンパク質カーゴは、フソソーム中の総タンパク質の約１３．６％を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、合成タンパク質カーゴは、約４×１０－３、５×１０－３、６×１０－３（例えば、６．３７×１０－３）、７×１０－３、または８×１０－３のＶＳＶ－Ｇに対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、合成タンパク質カーゴは、約１０、１５、１６、１７、１８（例えば、１８．６）、１９、２０、２５、もしくは３０、または約１０～３０、１５～２５、１６～１９、１８～１９、または１８．６のＣＤ６３に対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、合成タンパク質カーゴは、約２、３、４（例えば、４．２４）、５、６、または７のＡＲＲＤＣ１に対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、合成タンパク質カーゴは、約０．１、０．２、０．３、０．４（例えば、０．４４）、０．５、０．６、または０．７のＧＡＰＤＨに対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、合成タンパク質カーゴは、約１、２、３（例えば、３．５６）、４、５、または６のＣＮＸに対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、合成タンパク質カーゴは、約１０、１５、１６、１７、１８、１９（例えば、１９．５２）、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または３０のＴＳＧ１０１に対する比率を有する（または有すると特定される）。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、フソソーム中の総タンパク質の少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、またはそれ以上含む（または含むと特定される）。一実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、フソソーム中の総タンパク質の約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、または１３．６％含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソゲンは、対象となる他のタンパク質よりも豊富である。実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、約１４５～１７０、１５０～１６５、１５５～１６０、１５６．９のペイロードタンパク質、例えばＥＧＦＰに対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、約１０００～５０００、２０００～４０００、２５００～３５００、２９００～２９３０、２９１０～２９１５、または２９１２．０のＣＤ６３に対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、約３００～１０００、４００～９００、５００～８００、６００～７００、６４０～６９０、６５０～６８０、６６０～６７０、または６６４．９のＡＲＲＤＣ１に対する比率を有する。実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、約２０～１２０、４０～１００、５０～９０、６０～８０、６５～７５、６８～７０、または６９．０のＧＡＰＤＨに対する比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソゲンは、例えば、質量分析アッセイによって、約２００～９００、３００～８００、４００～７００、５００～６００、５２０～５９０、５３０～５８０、５４０～５７０、５５０～５６０、または５５８．４のＣＮＸに対する比率を有する。実施形態において、質量分析エッセイは、実施例１６２のアッセイである。
いくつかの実施形態において、フソソームおよび供給源細胞の両方に存在する（例えば、共有される）脂質種の数は、例えば、質量分析アッセイを使用して、少なくとも３００、４００、５００、５５０、５６０、または５６９である（またはそれであると特定される）か、または５００～７００、５５０～６００、または５６０～５８０である。実施形態において、供給源細胞中の対応する脂質レベルの少なくとも２５％のレベルでフソソーム中に存在する（両方とも試料内の総脂質レベルに対して正規化されている）脂質種の数は、例えば、質量分析アッセイを使用して、少なくとも３００、４００、５００、５３０、５４０、または５４８である（またはそれであると特定されている）か、または４００～７００、５００～６００、５２０～５７０、５３０～５６０、または５４０～５５０である。いくつかの実施形態において、供給源細胞中の総脂質種に対するフソソームおよび供給源細胞の両方に存在する（例えば、共有される）脂質種の割合は、例えば、質量分析アッセイを使用して、約０．４～１．０、０．５～０．９、０．６～０．８、または０．７である（またはそれであると特定される）か、または少なくとも０．４、０．５、０．６、または０．７である。いくつかの実施形態において、質量分析アッセイは、実施例１５４のアッセイである。
いくつかの実施形態において、フソソームおよび供給源細胞の両方に存在する（例えば、共有される）タンパク質種の数は、例えば、質量分析アッセイを使用して、少なくとも５００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４８７、１５００、または１６００である（またはそれであると特定される）か、または１２００～１７００、１３００～１６００、１４００～１５００、１４５０～１５００、または１４８０～１４９０である（またはそれであると特定される）。実施形態において、供給源細胞中の対応するタンパク質レベルの少なくとも２５％のレベルでフソソーム中に存在する（両方とも試料内の総タンパク質レベルに対して正規化されている）タンパク質種の数は、例えば、質量分析アッセイを使用して、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、９５０、９５７、１０００、または１２００である（または特定されている）。いくつかの実施形態において、供給源細胞中の総タンパク質種に対するフソソームおよび供給源細胞の両方に存在する（例えば、共有される）タンパク質種の割合は、例えば、質量分析アッセイを使用して、約０．１～０．６、０．２～０．５、０．３～０．４、もしくは０．３３３、または少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３３３、もしくは０．４である（またはそれであると特定される）。実施形態において、質量分析アッセイは、実施例１５５のアッセイである。
いくつかの実施形態において、ＣＤ６３は、例えば、質量分析アッセイ、例えば、実施例１５７のアッセイによって、フソソーム中の総タンパク質の量の０．０４８％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％未満の量で存在する（または存在すると特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、フィルター、例えば、約１～１０、２～８、３～７、４～６、または５ｕｍのフィルターを通した押出によって生成される。いくつかの実施形態において、フソソームは、約１～５、２～５、３～５、４～５、または５ｕｍの平均直径を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、少なくとも１、２、３、４、または５ｕｍの平均直径を有する（または有すると特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、供給源細胞：コレステリルエステル、遊離コレステロール、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジン酸塩、エーテル結合ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびスフィンゴミエリンと比較して、以下の脂質のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべて）が濃縮されている（または濃縮されていると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、供給源細胞：セラミド、カルジオリピン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、エーテル結合ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびトリアシルグリセロールと比較して、以下の脂質のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべて）が枯渇している（または枯渇していると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、前述の濃縮脂質のうちの１つ以上が濃縮され（または濃縮されていると特定される）、かつ前述の枯渇脂質のうちの１つ以上が枯渇している。いくつかの実施形態において、フソソームは、総脂質の割合として濃縮脂質を、供給源細胞中の対応するレベルよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、または１０倍多く含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、総脂質の割合として枯渇脂質を、供給源細胞中の対応するレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満含む（または含むと特定される）。実施形態において、脂質濃縮は、質量分析アッセイ、例えば、実施例１６４のアッセイによって測定される。
いくつかの実施形態において、ＣＥ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソーム中よりもフソソーム中で約２倍高く、および／または親細胞中よりもフソソーム中で約５、６、７、８、９、もしくは１０倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、セラミド脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりも親細胞中で約２、３、４、または５倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、コレステロールレベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２倍高く、および／または親細胞中よりもフソソーム中で約２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＣＬ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりも親細胞中で少なくとも約５、１０、２０、３０、または４０倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＤＡＧ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約２もしくは３倍高く、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１．５もしくは２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＣ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームの間でほぼ等しく（またはほぼ等しいと特定される）、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、もしくは１．８倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＣ Ｏ－脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＥ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソーム中よりもフソソーム中で約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、もしくは１．８倍高く、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、もしくは１．８倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＥ Ｏ－脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームとの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＧ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＩ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約３、４、５、６、もしくは７倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＳ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）、および／または親細胞中よりもフソソーム中で約２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＳＭ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）、および／または親細胞中よりもフソソーム中で約２、２．５、または３倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＴＡＧ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソームとフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０ ８０、９０、１００倍、またはそれ以上高い（または高いと特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソーム：コレステリルエステル、セラミド、ジアシルグリセロール、リゾホスファチデート、およびホスファチジルエタノールアミン、およびトリアシルグリセロールと比較して、以下の脂質のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべて）が濃縮されている（または濃縮されていると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソームと比較して（例えば、試料中の総脂質と比較して）、脂質：遊離コレステロール、ヘキソシルセラミド、リゾホスファチジルコリン、エーテル結合リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、およびリゾホスファチジルセリンのうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはすべて）が枯渇している（または枯渇していると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、前述の濃縮脂質のうちの１つ以上が濃縮され（または濃縮されていると特定され）、かつ前述の枯渇脂質のうちの１つ以上が枯渇している。いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソーム中の対応するレベルよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、または１０倍多い総脂質の割合として濃縮脂質を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソーム中の対応するレベルの９０％、８０％、７０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％より少ないレベルで総脂質の割合として枯渇脂質を含む（または含むと特定される）。実施形態において、脂質濃縮は、質量分析アッセイ、例えば、実施例１６４のアッセイによって測定される。
いくつかの実施形態において、セラミド脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソーム中よりもフソソーム中で約２倍高く、および／またはフソソーム中よりもエキソソーム中で約２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＨｅｘＣｅｒ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２倍高く（または高いと特定される）、および／または親細胞中およびフソソーム中でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）。いくつかの実施形態において、ＬＰＡ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソーム中よりもフソソーム中で約３もしくは４倍高く（または高いと特定される）、および／または親細胞中よりもフソソーム中で約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、もしくは１．８倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＬＰＣ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約２倍高く、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＬＰＣ Ｏ－脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約３もしくは４倍高く、および／または親細胞とフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）。いくつかの実施形態において、ＬＰＥ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２倍高く、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＬＰＥ Ｏ－脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約２倍もしくは３倍高く（または高いと特定される）、および／または親細胞とフソソームの間でほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）。いくつかの実施形態において、ＬＰＳ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソーム中よりもエキソソーム中で約３倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＡ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）エキソソーム中よりもフソソーム中で約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、もしくは２倍高く、および／または親細胞中よりもフソソーム中で約２倍高い（または高いと特定される）。いくつかの実施形態において、ＰＧ脂質レベルは、（試料中の総脂質と比較して）フソソームとエキソソームの間でほぼ等しく（またはほぼ等しいと特定される）、および／またはフソソーム中よりも親細胞中で約１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５倍高い（または高いと特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、供給源細胞の脂質組成物と実質的に同様の脂質組成物を含むか、またはＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上は、供給源細胞中の対応する脂質レベルの１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％以内である。実施形態において、フソソームの脂質組成物は、それらが由来する細胞に同様である。実施形態において、フソソームおよび親細胞は、例えば、実施例１５４に従って決定されるように、親細胞の任意の複製試料で特定される脂質種の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％以上が、フソソームの任意の複製試料中に存在する（または存在すると特定される）場合、同様の脂質組成物を有する（または有すると特定される）。特定された脂質の実施形態において、フソソーム中の平均レベルは、（試料中の総脂質と比較して）親細胞中の対応する平均脂質種レベルの約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％高い。一実施形態において、フソソームの脂質組成物は、（試料中の総脂質と比較して）親細胞と比較して特異的脂質が濃縮される、および／または枯渇している。
いくつかの実施形態において、フソソームの脂質組成物は、例えば、実施例１６４に記載の方法に従って決定されるように、親細胞と比較して特異的な脂質が濃縮され、および／または枯渇している（あるいは濃縮され、および／または枯渇していると特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞の比率よりも大きいホスファチジルセリンと総脂質の比率を有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソソームは、親細胞の比率と比較して、約１１０％、１１５％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、またはそれ以上のホスファチジルセリンと総脂質の比率を有する（または有すると同定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して、コレステリルエステル、遊離コレステロール、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジン酸塩、エーテル結合ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、および／またはスフィンゴミエリンが濃縮される（または濃縮されると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して、セラミド、カルジオリピン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、エーテル結合ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、および／またはトリアシルグリセロールが枯渇している（または枯渇していると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソームと比較して、コレステリルエステル、セラミド、ジアシルグリセロール、リゾホスファチジン酸塩、ホスファチジルエタノールアミン、および／またはトリアシルグリセロールが濃縮される（または濃縮されると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソームと比較して、遊離コレステロール、ヘキソシルセラミド、リゾホスファチジルコリン、エーテル結合リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、および／またはリゾホスファチジルが枯渇している（または枯渇していると特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、供給細胞中のカルジオリピン：セラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：セラミドの比率を有するか、または供給細胞中のカルジオリピンのカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給細胞中のカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ヘキソシルセラミドの比率を有するか、または供給細胞中のカルジオリピン：リゾホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：リゾホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給細胞中のカルジオリピン：リゾホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：リゾホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：リゾホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：リゾホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：リゾホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：リゾホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：ホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：コレステロールエステルの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：コレステロールエステルの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：スフィンゴミエリンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：セラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：セラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：ヘキソシルセラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：リゾホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のカルジオリピン：ホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：ホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるカルジオリピン：ホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：ホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：コレステロールエステルの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：スフィンゴミエリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルコリン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：セラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ヘキソシルセラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比率の

１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：セラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：セラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：ホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：コレステロールエステルの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：スフィンゴミエリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルエタノールアミン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：セラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：セラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ヘキソシルセラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：コレステロールエステルの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：スフィンゴミエリンの比率を有するか、または供給源細胞中のホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるホスファチジルセリン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：セラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：セラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：ヘキソシルセラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：ホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：ホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：ホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：コレステロールエステルの比率を有するか、または供給源細胞中のスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるスフィンゴミエリン：トリアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：セラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：セラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：ジアシルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：ヘキソシルセラミドの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：

リゾホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：リゾホスファチジルコリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチジルコリンの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチジルエタノールアミンの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：リゾホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：リゾホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：リゾホスファチジルセリンの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：ホスファチジン酸塩の比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：ホスファチジン酸塩の比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：ホスファチジルグリセロールの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：ホスファチジルイノシトールの比率を有するか、または供給源細胞中のコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内であるコレステロールエステル：トリアシルグリセロールの比率を有する。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例４２または１５５のアッセイを使用して、供給源細胞のプロテオーム組成物と同様のプロテオーム組成物を含む。いくつかの実施形態において、フソソームのタンパク質組成物は、それらが由来する親細胞に同様である。いくつかの実施形態において、タンパク質の複数のカテゴリーの各々の分画含有量は、例えば、実施例１５５に記載されるように、試料中のすべての特定されたタンパク質の強度シグナルの合計で割った各カテゴリーからの強度シグナルの合計として決定される。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１６５に記載の方法に従って決定されるように、親細胞および／またはエキソソームと比較して様々な量のコンパートメント特異的タンパク質を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞およびエキソソームと比較して、小胞体タンパク質が枯渇している（または枯渇していると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソームと比較して、エキソソームタンパク質が枯渇している（または枯渇していると特定される）。いくつかの態様では、フソソームは、エキソソームタンパク質であるとしてフソソーム中のタンパク質の１５％、２０％、または２５％未満を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して、ミトコンドリアタンパク質が枯渇している（または枯渇していると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して、核タンパク質が濃縮される（または濃縮されると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞およびエキソソームと比較して、リボソームタンパク質が濃縮される（または濃縮されると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソーム中のタンパク質の少なくとも０．０２５％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％ ８％、９％、または１０％は、リボソームタンパク質であるか、またはフソソーム中のタンパク質の約０．０２５～０．２％、０．０５～０．１５％、０．０６～１．４％、０．０７％～１．３％、０．０８％～１．２％、０．０９％～１．１％、１％～２０％、３％～１５％、５％～１２．５％、７．５％～１１％、８．５％～１０．５％、または９％～１０％は、リボソームタンパク質である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例４９のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質とタンパク質の比率を含む。実施形態において、フソソームは、有核細胞における脂質質量対タンパク質の比率にほぼ等しい脂質質量とタンパク質の比率を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソームは、親細胞よりも大きい脂質：タンパク質の比率を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソームは、親細胞の脂質：タンパク質の比率の約１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３１％、１３２％、１３２．５％、１３３％、１３４％、１３５％、１４０％、１４５％、または１５０％の脂質：タンパク質の比率を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、実施例１５０のアッセイにおいて、約１００～１８０、１１０～１７０、１２０～１６０、１３０～１５０、１３５～１４５、１４０～１４２、または１４１μｍｏｌ／ｇのリン脂質：タンパク質の比率を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、実施例１５０のアッセイにおいて、供給源細胞中の対応する比率の約６０～９０％、７０～８０％、または７５％であるリン脂質：タンパク質の比率を有する（または有すると特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内にあるタンパク質と核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の比率を含む。実施形態において、フソソームは、親細胞の比率と同様のタンパク質質量とＤＮＡ質量の比率を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソームは、親細胞の約約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．２％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、または１１０％であるタンパク質：ＤＮＡの比率を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５０のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率より大きい、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％大きいタンパク質とＤＮＡの比率を含む。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、実施例１５１のアッセイによって、約２０～３５、２５～３０、２６～２９、２７～２８、または２７．８ｇ／ｇであるタンパク質：ＤＮＡの比率を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、実施例１５１のアッセイによって、供給源細胞中の対応する比率の約１％、２％、５％、１０％、または２０％以内であるタンパク質：ＤＮＡの比率を含む（または含むと特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５１または１５９のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内である脂質と核酸（例えばＤＮＡ）の比率を含む。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、実施例１５２のアッセイによって、約２．０～６．０、３．０～５．０、３．５～４．５、３．８～４．０、または３．９２μｍｏｌ／ｍｇである、脂質：ＤＮＡの比率を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５１または１５９のアッセイを使用して測定されるように、供給源細胞中の対応する比率より大きい、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い脂質と核酸（例えばＤＮＡ）の比率を含む。実施形態において、フソソームは、親細胞よりも大きい脂質：ＤＮＡの比を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して、約１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、またはそれ以上の脂質：ＤＮＡの比を含む。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、例えば、実施例７５のアッセイによって、参照細胞組成物、例えば、供給源細胞の半減期の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内である、対象、例えば、マウスにおける半減期を有する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、例えば、実施例７５のアッセイによって、例えば、ヒト対象またはマウスにおいて、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、または２４時間である、対象、例えば、マウスにおける半減期を有する。実施形態において、フソソーム組成物は、例えば、実施例１３４のアッセイにおいて、対象における少なくとも１、２、４、６、１２、または２４時間の半減期を有する。いくつかの実施形態において、治療剤は、フソソーム組成物の半減期よりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、５０％、２倍、５倍、または１０倍長い、対象における半減期を有する。例えば、フソソームは、治療剤を標的細胞に送達してもよく、治療剤は、フソソームがもはや存在しないか、または検出できなくなった後に存在してもよい。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６４のアッセイを使用して測定されるように、膜を介してグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を、例えば、陰性対照、例えば、グルコースの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％輸送する、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上輸送する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１２６のアッセイにおいて、フロレチンで処理された他の同様のフソソームよりも高いレベルで膜を介してグルコース（例えば、標識グルコース、例えば、２－ＮＢＤＧ）を輸送する（または輸送すると特定される）。実施形態において、フロレチンで処理されていないフソソームは、例えば、実施例１２６のアッセイにおいて、フロレチンで処理された他の同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、５％、または１０％高い（および任意に最大１５％高い）レベルでグルコースを輸送する（または輸送しないと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６６のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマウス胚線維芽細胞におけるエステラーゼ活性のエステラーゼ活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である内腔中のエステラーゼ活性を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１２７のアッセイによって、非染色対照よりも少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、または５０００倍高い内腔中のエステラーゼ活性を含む（または含むと同定される）。いくつかの態様では、フソソームは、例えば、実施例１２７のアッセイによって、供給源細胞のエステラーゼ活性よりも約１０～１００倍低い内腔中のエステラーゼ活性を含む（または含むと同定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１２８のアッセイによって、約１Ｅ５～１Ｅ６、６Ｅ５～８Ｅ５、６．５Ｅ５～７Ｅ５、または６．８３Ｅ５のエキソソーム等価物のアセチルコリンエステラーゼ活性を含む（または含むと特定される）。いくつかの態様では、フソソームは、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中の代謝活性レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である代謝活性レベル（例えば、クエン酸シンターゼ活性）を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６８に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中の代謝活性レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である代謝活性レベル（例えば、クエン酸シンターゼ活性）を含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１２９のアッセイによって、約１Ｅ－２～２Ｅ－２、１．３Ｅ－２～１．８Ｅ－２、１．４Ｅ－２～１．７Ｅ－２、１．５Ｅ－２～１．６Ｅ－２、または１．５７Ｅ－２ｕｍｏｌ／ｕｇフソソーム／分であるクエン酸シンターゼ活性を含む（または含むと特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中の呼吸レベルの１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内である呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）、例えば、基礎呼吸レベル、非結合呼吸レベル、または最大呼吸レベルを含む。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６９に記載されるように、参照細胞、例えば、供給源細胞中の呼吸レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である呼吸レベル（例えば、酸素消費速度）、例えば、基礎呼吸レベル、非結合呼吸レベル、または最大呼吸レベルを含む。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３０のアッセイによって、約８～１５、９～１４、１０～１３、１１～１２、または１１．３ｐｍｏｌ／分／２０μｇフソソームの基礎呼吸速度を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３０のアッセイによって、約８～１３、９～１２、１０～１１、１０～１０．２、または１０．１ｐｍｏｌ／分／２０μｇフソソームの非結合呼吸速度を含む（または含むと同定される）。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３０のアッセイによって、約１５～２５、１６～２４、１７～２３、１８～２２、１９～２１、または２０ ｐｍｏｌ／分／２０μｇフソソームの最大呼吸速度を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３０のアッセイによって、非結合呼吸速度よりも約１％、２％、５％、または１０％、例えば最大約１５％高い基礎呼吸速度を有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３０のアッセイによって、基礎呼吸速度よりも、例えば、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い最大呼吸速度を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例７０のアッセイを使用して、最大で１８，０００、１７，０００、１６，０００、１５，０００、１４，０００、１３，０００、１２，０００、１１，０００、または１０，０００のＭＦＩのアネキシン－Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームは、例えば、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理された他の同様のフソソームのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含むか、またはフソソームは、実施例７０のアッセイにおいてメナジオンで処理されたマクロファージのアネキシン－Ｖ染色レベルよりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低いアネキシン－Ｖ染色レベルを含む。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３１のアッセイにおいて、アンチマイシンＡで処理された他の同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルよりも少なくとも約１％、２％、５％、または１０％低いアネキシンＶ染色レベルを含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３１のアッセイにおいて、アンチマイシンＡで処理された他の同様のフソソームのアネキシンＶ染色レベルの約１％、２％、５％、または１０％以内であるアネキシンＶ染色レベルを含む（または含むと特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のｍｉＲＮＡ含有レベルよりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きいｍｉＲＮＡ含有レベルを有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例３９のアッセイによって、供給源細胞のｍｉＲＮＡ含有レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上（例えば、供給源細胞のｍｉＲＮＡ含有量レベルの最大１００％）のｍｉＲＮＡ含有レベルを有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１０８のアッセイによって測定されるように、供給源細胞の総ＲＮＡ含有レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上（例えば、供給源細胞の総ＲＮＡ含有量レベルの最大１００％）の総ＲＮＡ含有レベルを有する。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例４７のアッセイによって、供給源細胞の比率よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、例えば、供給源細胞の比率の１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％以内である可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比率を有する。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例４７のアッセイによって、約０．３～０．８、０．４～０．７、または０．５～０．６、例えば約０．５６３の可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比率を有する。いくつかの実施形態において、フソソームの集団は、約０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５よりも約０．３～０．８、０．４～０．７、０．５～０．６、または０．５６３、もしくはそれ以上の可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の質量比を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームの集団は、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、または２０倍高い、供給源細胞の質量比より大きい可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の質量比を有する（または有すると同定される）。実施形態において、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の質量比は、実施例１２３のアッセイによって決定される。実施形態において、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の質量比は、親細胞よりもフソソーム集団において低い（または低いと特定される）。実施形態において、フソソームと親細胞の比率は、約３％、４％、５％、６％、７％、または８％である（またはそれであると特定される）場合、フソソームの集団の可溶性：不溶性の比率は、親細胞の可溶性：不溶性の比率にほぼ等しい（またはほぼ等しいと特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、質量分析により測定されるように、例えば、実施例４８のアッセイによって、供給源細胞のＬＰＳ含量の５％未満、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％以下のＬＰＳレベルを有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６３のアッセイを使用して、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナル、例えば、インスリンに応答するＡＫＴリン酸化反応、またはインスリンに応答するグルコース（例えば、標識グルコース、例えば２－ＮＢＤＧ）の取り込みを、例えば、陰性対照、例えば、インスリンの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上輸送することを可能にする。いくつかの実施形態において、フソソームは、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、対象、例えば、マウスに投与される場合、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、例えば、実施例８７または１００のアッセイによって、２４、４８、または７２時間後に標的組織中に存在する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）により誘発されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高いジャスタクリンシグナル伝達レベルを有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例７１のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞または骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）により誘発されるジャクスタクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大１００％）のジャスタクリンシグナル伝達レベルを有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマクロファージにより誘発されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％より大きいパラクリンシグナル伝達のレベルを有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例７２のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはマクロファージにより誘発されるパラクリンシグナル伝達のレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大１００％）のパラクリンシグナル伝達レベルを有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例７３のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＣ２Ｃ１２細胞中の重合アクチンのレベルと比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以内のレベルでアクチンを重合する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１４７のアッセイによって、経時的に、例えば、少なくとも３、５、または２４時間にわたって一定であるレベルでアクチンを重合する（またはアクチンを重合すると特定される）。実施形態において、アクチン重合のレベルは、例えば、実施例１４７のアッセイによって、５時間にわたって１％、２％、５％、１０％、または２０％未満変化する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例７４のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＣ２Ｃ１２細胞の膜電位の約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内の膜電位を有するか、またはフソソームは、約－２０～－１５０ｍＶ、－２０～－５０ｍＶ、－５０～－１００ｍＶ、または－１００～－１５０ｍＶの膜電位を有するか、またはフソソームは、－１ｍｖ、－５ｍｖ、－１０ｍｖ、－２０ｍｖ、－３０ｍｖ、－４０ｍｖ、－５０ｍｖ、－６０ｍｖ、－７０ｍｖ、－８０ｍｖ、－９０ｍｖ、－１００ｍｖ未満の膜電位を有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１３２のアッセイにおいて、約－２５～－３５、－２７～－３２、－２８～－３１、－２９～－３０、または－２９．６ミリボルトの膜電位を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５７のアッセイを使用して、供給源細胞の溢出率の少なくとも１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の割合で血管から溢出することができ、例えば、供給源細胞は、好中球、リンパ球、Ｂ細胞、マクロファージ、またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例５８のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大１００％）の走化性を可能にする。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージと比較して、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大１００％）の食作用を可能にする。いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞膜、例えば、内皮細胞膜または血液脳関門を通過することができる。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胎児線維芽細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きい割合でタンパク質を分泌することができる。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例６２のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マウス胎児線維芽細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％（例えば、最大１００％）の割合でタンパク質を分泌することができる。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１９のアッセイを使用して、参照細胞、例えば供給源細胞を転写することができないか、または参照細胞、例えば供給源細胞の転写活性の転写の１％、２．５％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満の転写活性を有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例２０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば供給源細胞の核のＤＮＡ複製ができないか、または参照細胞、例えば供給源細胞の核のＤＮＡ複製の１％、２．５％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満の核のＤＮＡ複製を有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例３７のアッセイを使用して、参照細胞、例えば供給源細胞のクロマチン含量の１％、２．５％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のクロマチン含量を有する。
いくつかの実施形態において、フソソームの特徴は、参照細胞との比較によって記載されている。実施形態において、参照細胞は、供給源細胞である。実施形態において、参照細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ ９０、ＩＭＲ ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、またはＢＪ細胞である。いくつかの実施形態において、フソソームの集団の特徴は、参照細胞の集団、例えば、供給源細胞の集団、またはＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ ９０、ＩＭＲ ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、またはＢＪ細胞の集団と比較することによって記載されている。
いくつかの実施形態において、フソソームは、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている。いくつかの実施形態において、フソソームは、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された。いくつかの実施形態において、フソソームは、所定の基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、実質的に病原体を含まない。いくつかの実施形態において、フソソームは、所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有する、例えば、実質的に汚染物質を含まない。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物の免疫原性は、血清不活化アッセイ（例えば、抗体媒介性中和または補体媒介性分解を検出するアッセイ）によってアッセイされる。いくつかの実施形態において、フソソームは、血清によって不活性化されないか、または所定の値を下回るレベルで不活性化される。いくつかの実施形態において、フソソームナイーブ対象（例えば、ヒトまたはマウス）の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。いくつかの実施形態において、フソソームの１回以上の投与を施した、例えば、フソソームの少なくとも２回の投与を施した対象の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。次いで、実施形態において、血清に曝露されたフソソームを、カーゴを標的細胞に送達する能力について試験する。いくつかの実施形態において、血清をインキュベートしたフソソームでの処理後にカーゴを検出可能に含む細胞の割合は、血清と接触していない陽性対照フソソームによる処理後にカーゴを検出可能に含む細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。いくつかの実施形態において、血清の不活性化は、実施例１６８のアッセイを使用して測定される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物の免疫原性は、フソソームに応答した補体活性化を検出することによってアッセイされる。いくつかの実施形態において、フソソームは、補体を活性化しないか、または所定の値を下回るレベルで補体を活性化する。いくつかの実施形態において、フソソームナイーブ対象（例えば、ヒトまたはマウス）の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。いくつかの実施形態において、フソソームの１回以上の投与を施した、例えば、フソソームの少なくとも２回の投与を施した対象の血清を、試験フソソーム組成物と接触させる。次いで、実施形態において、血清およびフソソームを含む組成物は、例えばＥＬＩＳＡによって、活性化補体因子（例えば、Ｃ３ａ）について試験される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変を含むフソソーム（例えば、参照細胞と比較して、補体調節タンパク質のレベルが高い）は、改変を欠いている他の同様のフソソームと比較して、補体活性化が低下し、例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％低下する。いくつかの実施形態において、補体活性化は、実施例１６９のアッセイを使用して測定される。
いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム集団は、血清によって実質的に不活性化されないだろう。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム集団は、例えば、実施例１６７または１６８に記載の方法に従って定量化されるように、血清不活化に耐性を示す。実施形態において、フソソームまたはフソソーム集団は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、対象へのフソソームまたはフソソーム集団の複数回投与後、血清によって実質的に不活性化されないか、または血清不活化に耐性を示す。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１６７または１６８に記載の方法に従って定量化されるように、改変フソソームの複数回投与後、例えば、対応する非改変フソソームと比較して、血清不活化が低下するように改変される。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例１６９に記載の方法に従って測定されるように、補体活性を実質的に誘導しない。いくつかの実施形態において、フソソームは、対応する非修飾フソソームと比較して、低下した補体活性を誘導するように改変される。実施形態において、補体活性は、細胞中の、補体タンパク質（例えば、ＤＡＦ、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えば、因子Ｈ（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、Ｃ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、補体受容体１（ＣＤ３５）、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、プロフェクチン（ＣＤ５９）、古典的および代替補体経路ＣＤ／Ｃ５変換酵素を阻害するタンパク質、またはＭＡＣアセンブリを調節するタンパク質）の発現または活性を決定することによって測定される。
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、内皮細胞、線維芽細胞、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、例えば、対象の細胞に由来する人工多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球生成組織、造血組織からの幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数細胞、巨核芽細胞、前巨核芽球、メラニン芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正常細胞、または血管芽細胞）、前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、衛星細胞、放射線ギアル細胞、骨髄間質細胞、膵臓前駆細胞、内皮前駆細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ ９０、ＩＭＲ ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、またはＢＪ細胞）である。いくつかの実施形態において、供給源細胞は、２９３細胞、ＨＥＫ細胞、ヒト内皮細胞、またはヒト上皮細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、または幹細胞以外である。
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、ＡＲＲＤＣ１またはその活性断片またはバリアントを発現する（例えば、過剰発現する）。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、質量分析アッセイによって、約１～３、１～１０、１～１００、３～１０、４～９、５～８、６～７、１５～１００、６０～２００、８０～１８０、１００～１６０、１２０～１４０、３～１００、４～１００、５～１００、６～１００、１５～１００、８０～１００、３～２００、４～２００、５～２００、６～２００、１５～２００、８０～２００、１００～２００、１２０～２００、３００～１０００、４００～９００、５００～８００、６００～７００、６４０～６９０、６５０～６８０、６６０～６７０、１００～１０，０００、または約６６４．９のフソゲンとＡＲＲＤＣ１の比率を有する。いくつかの実施形態において、例えば、質量分析によって、例えば、実施例１６６に記載の方法に従って測定されるように、総タンパク質含有量の割合としてＡＲＲＤＣ１のレベルは、少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％であるか、または、総タンパク質含有量の割合としてＡＲＲＤＣ１のレベルは、約０．０５～１．５％、０．１％～０．３％、０．０５～０．２％、０．１～０．２％、０．２５～７．５％、０．５％～１．５％、０．２５～１％、０．５～１％、０．０５～１．５％、１０％～３０％、５～２０％、または１０～２０％である。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、質量分析アッセイ、例えば、実施例１６２のアッセイを使用して、約１００～１，０００、１００～４００、１００～５００、２００～４００、２００～５００、２００～１，０００、３００～４００、１，０００～１０，０００、２，０００～５，０００、３，０００～４，０００、３，０５０～３，１００、３，０６０～３，０７０、または約３，０６４、１０，０００～１００，０００、１０，０００～２００，０００、１０，０００～５００，０００、２０，０００～５００，０００、３０，０００～４００，０００のフソゲンとＴＳＧ１０１の比率を有する。いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、例えば、質量分析アッセイ、例えば、実施例１６３のアッセイを使用して、約１～３、１～３０、１～２０、１～２５、１．５～３０、１０～３０、１５～２５、１８～２１、１９～２０、１０～３００、１０～２００、１５～３００、１５～２００、１００～３００、１００～２００、１５０～３００、または約１９．５のカーゴとｔｓｇ１０１の比率を有する。いくつかの実施形態において、例えば、質量分析、例えば、実施例１６６に記載の方法に従って測定されるように、総タンパク質含有量の割合としてＴＳＧ１０１のレベルは、少なくとも約０．０００１％、０．０００２％、０．０００３％、０．０００４％、０．０００５％、０．０００６％、０．０００７％、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％であるか、または総タンパク質含有量の割合としてＴＳＧ１０１のレベルは、約０．０００１～０．００１、０．０００１～０．００２、０．０００１～０．０１、０．０００１～０．１、０．００１～０．０１、０．００２～０．００６、０．００３～０．００５、０．００１～０．１、０．０１～０．１、０．０２～０．０６、０．０３～０．０５、または０．００４である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、カーゴ、例えば治療剤、例えば、内因性治療剤または外因性治療剤を含む。いくつかの実施形態において、治療剤は、タンパク質、例えば、酵素、膜貫通タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または小分子のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態において、治療剤は、ミトコンドリア以外のオルガネラ、例えば、核、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒から選択されるオルガネラである。いくつかの実施形態において、オルガネラは、ミトコンドリアである。
いくつかの実施形態において、フソソームは、エンドサイトーシスによって標的細胞に入り、例えば、エンドサイトーシス経路を介して送達される治療剤のレベルは、例えば、実施例９１のアッセイによって、０．０１～０．６、０．０１～０．１、０．１～０．３、または０．３～０．６であるか、または同様のフソソームと接触されたクロロキンで処理した参照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％は、非エンドサイトーシス経路を介して入る、例えば、フソソームは、細胞表面との融合を介して標的細胞に入る。いくつかの実施形態において、所定のフソソームにおける非エンドサイトーシス経路を介して送達される治療剤のレベルは、
例えば、実施例９０のアッセイを使用して、０．１～０．９５、０．１～０．２、０．２～０．３、０．３～０．４、０．４～０．５、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、０．９～０．９５であるか、またはクロロキンで処理した参照細胞よりも少なくとも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、標的細胞に進入するフソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％は、細胞質に入る（例えば、エンドソームまたはリソソームに入らない）。いくつかの実施形態において、標的細胞に入るフソソーム組成物中のフソソームの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満は、エンドソームまたはリソソームに入る。いくつかの実施形態において、フソソームは、非エンドサイトーシス経路によって標的細胞に入り、例えば、送達される治療剤のレベルは、例えば、実施例９１のアッセイを使用して、クロロキンで処理した参照細胞のレベルの少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％である。一実施形態において、フソソームは、ダイナミン媒介性経路を介して標的細胞に薬剤を送達する。一実施形態において、ダイナミン媒介経路を介して送達される薬剤のレベルは、０．０１～０．６の範囲であるか、または例えば、実施例９２のアッセイで測定されるように、同様のフソソームと接触したＤｙｎａｓｏｒｅで処理した標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。一実施形態において、フソソームは、マクロピノサイトーシスを介して標的細胞に薬剤を送達する。一実施形態において、マクロピノサイトーシスを介して送達される薬剤のレベルは、０．０１～０．６の範囲であるか、または例えば、実施例９２のアッセイで測定されるように、同様のフソソームと接触したＥＩＰＡで処理した標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。一実施形態において、フソソームは、アクチン媒介性経路を介して標的細胞に薬剤を送達する。一実施形態において、アクチン媒介性経路を介して送達される薬剤のレベルは、０．０１～０．６の範囲であるか、または例えば、実施例９２のアッセイで測定されるように、同様のフソソームと接触したラトランクリンＢで処理した標的細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、実施例３３のアッセイによって、１未満、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、１．２５～１．３５、または１．３５ｇ／ｍｌ超の密度を有する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、タンパク質質量によって０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、または１０％未満の供給源細胞を含むか、または細胞の０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、または１０％未満は、機能核を有する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物中のフソソームの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、外因性治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、外因性治療剤は、タンパク質、例えば、酵素、膜貫通タンパク質、受容体、抗体、核酸、例えば、ＤＮＡ、染色体（例えば、ヒト人工染色体）、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または小分子のうちの１つ以上から選択される。
実施形態において、フソソームは、エンドサイトーシスまたは非エンドサイトーシス経路によって細胞に入る。
いくつかの実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、冷蔵または冷凍されている。実施形態において、フソソームは、機能核を含まないか、またはフソソーム組成物は、機能核を有しないフソソームを含む。実施形態において、フソソーム組成物は、タンパク質質量によって０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、または１０％未満の供給源細胞を含むか、または細胞の０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、または１０％未満は、機能核を有する。実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１、２、３、６、または１２時間、１、２、３、４、５、または６日間、１、２、３、または４週間、１、２、３、または６カ月間、または１、２、３、４、または５年間、当該温度で維持されている。実施形態において、フソソーム組成物は、当該温度での維持前に、集団の活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の活性を有し、例えば、
ｉ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、非標的細胞よりも、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い割合で標的細胞と融合する、
ｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、他のフソソームよりも、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い割合で標的細胞と融合する、
ｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５４のアッセイにおいて、フソソーム中の薬剤が、２４、４８、または７２時間後、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％に送達されるような割合で標的細胞と融合するか、または
ｉｖ）フソゲンは、例えば、実施例２９のアッセイによって測定されるように、少なくとも１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００コピー、またはそれ以下のコピー数で存在する、のうちの１つ以上である。
実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１、２、３、６、または１２時間、１、２、３、４、５、または６日間、１、２、３、または４週間、１、２、３、または６カ月間、または１、２、３、４、または５年間、４℃未満の温度で安定している。実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１、２、３、６、または１２時間、１、２、３、４、５、または６日間、１、２、３、または４週間、１、２、３、または６カ月間、または１、２、３、４、または５年間、－２０℃未満の温度で安定している。実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１、２、３、６、または１２時間、１、２、３、４、５、または６日間、１、２、３、または４週間、１、２、３、または６カ月間、または１、２、３、４、または５年間、－８０℃未満の温度で安定している。
実施形態において、
ｉ）供給源細胞は、２９３細胞以外である、
ｉｉ）供給源細胞は、形質転換または不死化されていない、
ｉｉｉ）供給源細胞は、アデノウイルス媒介による不死化以外の方法を使用して形質転換または不死化される、例えば、自然突然変異またはテロメラーゼ発現による不死化によって不死化される、
ｉｖ）フソゲンは、ＶＳＶＧ、ＳＮＡＲＥタンパク質、または分泌顆粒タンパク質以外である、
ｖ）治療剤は、ＣｒｅまたはＥＧＦＰ以外である、
ｖｉ）治療剤は、例えば、内腔内に外因性核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡ）または外因性タンパク質（例えば、抗体、例えば、抗体）をさらに含む、
ｖｉｉ）フソソームは、ミトコンドリアを含まない、のうちの１つ以上である。
実施形態において、
ｉ）供給源細胞は、２９３またはＨＥＫ細胞以外である、
ｉｉ）供給源細胞は、形質転換または不死化されていない、
ｉｉｉ）供給源細胞は、アデノウイルス媒介による不死化以外の方法を使用して形質転換または不死化される、例えば、自然突然変異またはテロメラーゼ発現による不死化によって不死化される、
ｉｖ）フソゲンは、ウイルスフソゲンではない、または
ｖ）フソソームは、４０～１５０ｎｍ以外、例えば、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、または５００ｎｍより大きいサイズを有する、のうちの１つ以上である。
実施形態において、
ｉ）治療剤は、供給源細胞によって発現される可溶性タンパク質である、
ｉｉ）フソゲンは、ＴＡＴ、ＴＡＴ－ＨＡ２、ＨＡ－２、ｇｐ４１、アルツハイマー病のベータアミロイドペプチド、センダイウイルスタンパク質、または両親媒性の正味の負ペプチド（ＷＡＥ １１）以外である、
ｉｉｉ）フソゲンは、哺乳動物フソゲンである、
ｉｖ）フソソームは、酵素、抗体、または抗ウイルス性ポリペプチドから選択されるポリペプチドをその内腔中に含む、
ｖ）フソソームは、外因性治療的膜貫通タンパク質を含まないか、または
ｖｉ）フソソームは、ＣＤ６３またはＧＬＵＴ４を含まないか、またはフソソームは、例えば、実施例１５７に記載の方法に従って決定されるように、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％以下（例えば、約０．０４８％以下）のＣＤ６３を含む、のうちの１つ以上である。
実施形態において、フソソームは、
ｉ）ウイルスを含まない、感染性がない、または宿主細胞中で増殖しない、
ｉｉ）ウイルスベクターではない、
ｉｉｉ）ＶＬＰ（ウイルス様粒子）ではない、
ｉｖ）ウイルス構造タンパク質、例えば、ｇａｇ由来のタンパク質、例えば、ウイルスカプシドタンパク質、例えば、ウイルスカプセルタンパク質、例えばウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まないか、またはウイルスカプシドタンパク質の量は、例えば、質量分析によって、例えば、実施例５３または１６１のアッセイを使用して、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満である、
ｖ）ウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
ｖｉ）ウイルスの非構造タンパク質、例えば、ｐｏｌまたはその断片もしくはバリアント、ウイルス逆転写酵素タンパク質、ウイルスインテグラーゼタンパク質、またはウイルスプロテアーゼタンパク質を含まない、
ｖｉｉ）ウイルス核酸、例えば、ウイルスＲＮＡまたはウイルスＤＮＡを含まない、
ｖｉｉｉ）ウイルス構造タンパク質の１小胞当たり１０、５０、１００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００未満のコピーを含むか、あるいは
ｉｘ）フソソームは、ウイロソームではない。
いくつかの態様では、フソソームは、約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％未満のウイルスカプシドタンパク質（例えば、約０．０５％のウイルスカプシドタンパク質）を含む（または含むと特定される）。実施形態において、ウイルスカプシドタンパク質は、ウサギ内因性レンチウイルス（ＲＥＬＩＫ）カプシドとシクロフィリンＡとの複合体である。実施形態において、ウイルスカプシドタンパク質：総タンパク質の比率は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１である（またはそうであると特定される）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、ｇａｇタンパク質またはその断片もしくはバリアントを含まない（または含まないと特定される）か、またはｇａｇタンパク質またはその断片もしくはバリアントの量は、例えば、実施例５３または１６１のアッセイによって、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満である。
実施形態において、フソソームのコピー数とフソソーム上のウイルス構造タンパク質のコピー数の比は、少なくとも１，０００，０００：１、１００，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、または１：１であるか、または１００：１～５０：１、５０：１～２０：１、２０：１～１０：１、１０：１～５：１または１：１である。実施形態において、フソソームのコピー数とフソソーム上のウイルスマトリックスタンパク質のコピー数の比は、少なくとも１，０００，０００：１、１００．０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、５：１、または１：１である。
実施形態において、
ｉ）フソソームは、水不混和性の液滴を含まない、
ｉｉ）フソソームは、水性内腔および親水性外部を含む、
ｉｉｉ）フソゲンは、タンパク質フソゲンであるか、または
ｉｖ）オルガネラは、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒から選択される、のうちの１つ以上である。
実施形態において、
ｉ）フソゲンは、哺乳動物フソゲンまたはウイルスフソゲンである、
ｉｉ）フソソームは、治療物質または診断物質でフソソームを充填させることによって作製されなかった、
ｉｉｉ）供給源細胞は、治療物質または診断物質で充填されなかった、
ｉｖ）フソソームは、ドキソルビシン、デキサメタゾン、シクロデキストリン、ポリエチレングリコール、マイクロＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ１２５、ＶＥＧＦ受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、酸化鉄、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰまたはＲＦＰ、ナノ粒子、またはＲＮａｓｅを含まないか、または前述のうちのいずれかの外因性形態を含まないか、あるいは
ｖ）フソソームは、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、グリコシル化を有する外因性治療剤をさらに含む、のうちの１つ以上である。
実施形態において、フソソームは、単層または多層である。
実施形態において、フソソームは、例えば、実施例３０のアッセイによって測定されるように、供給源細胞のサイズの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内のサイズを有するか、またはフソソーム集団は、供給源細胞の平均サイズの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内の平均サイズを有する。実施形態において、フソソームは、例えば、実施例３０のアッセイによって測定されるように、供給源細胞のサイズの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のサイズを有するか、またはフソソーム集団は、供給源細胞の平均サイズの約０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の平均サイズを有する。実施形態において、フソソームは、親細胞より小さいサイズを有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソソームは、親細胞の約５０％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、または９０％以内のサイズを有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソソームは、例えば、試料の約９０％以内に、約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満またはそれより少なく親細胞のサイズ分布の変動を有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソソームは、例えば、試料の約９０％以内に、約４０％、４５％、５０％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、または７０％より少なく親細胞のサイズ分布の変動を有する（または有すると特定される）。いくつかの実施形態において、フソソームは、直径が３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ｎｍ超の平均サイズを有する（または有すると特定される）。実施形態において、フソソームは、直径が約１００、１１０、１２０、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１４０、または１５０ｎｍの平均サイズを有する。実施形態において、例えば、実施例３０のアッセイによって測定されるように、フソソームは、供給源細胞のサイズの約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％以内のサイズを有するか、またはフソソームの集団は、供給源細胞のサイズの約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％以内の平均サイズを有する。実施形態において、例えば、実施例３０のアッセイによって測定されるように、フソソームは、供給源細胞のサイズの約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％以内のサイズを有するか、あるいはフソソームの集団は、供給源細胞のサイズの約０．０１％～０．０５％、０．０５％～０．１％、０．１％～０．５％、０．５％～１％、１％～２％、２％～３％、３％～４％、４％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、または８０％～９０％以内の平均サイズを有する。実施形態において、例えば、実施例１１９、１２０、または１２１のアッセイによって測定されるように、フソソームは、直径を有するか、またはフソソームの集団は、約５００ｎｍ未満（例えば、約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０ｎｍ未満）の平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例１１９、１２０、または１２１のアッセイによって測定されるように、フソソームは、約８０～１８０、９０～１７０、１００～１６０、１１０～１５０、１２０～１４０、または１３０ｎｍの直径を有するか、あるいはフソソームの集団は、約８０～１８０、９０～１７０、１００～１６０、１１０～１５０、１２０～１４０、または１３０ｎｍの平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例１１９、１２０、または１２１のアッセイによって測定されるように、フソソームは、約１１，０００ｎｍ～２１，０００ｎｍの直径を有するか、あるいはフソソームの集団は、約１１，０００ｎｍ～２１，０００ｎｍの平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例１１９、１２０、または１２１のアッセイによって測定されるように、フソソームは、約１０～２２，０００、１２～２０，０００、１４～１８，７２０ｎｍ、２０～１６，０００ｎｍの直径を有するか、あるいはフソソームの集団は、約１０～２２，０００、１２～２０，０００、１４～１８，７２０ｎｍ、２０～１６，０００ｎｍの平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例１１９、１２０、または１２１のアッセイによって測定されるように、フソソームは、約０．０１～０．１μｍ３、０．０２～１μｍ３、０．０３～１μｍ３、０．０４～１μｍ３、０．０５～０．０９μｍ３、０．０６～０．０８μｍ３、０．０７μｍ３の体積を有するか、またはフソソームの集団は、約０．０１～０．１μｍ３、０．０２～１μｍ３、０．０３～１μｍ３、０．０４～１μｍ３、０．０５～０．０９μｍ３、０．０６～０．０８μｍ３、０．０７μｍ３平均体積を有する。実施形態において、例えば、実施例３２のアッセイによって測定されるように、フソソームは、少なくとも約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、または２５０ｎｍの直径を有するか、あるいはフソソームの集団は、少なくとも約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、または２５０ｎｍの平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例３２のアッセイによって測定されるように、フソソームは、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、または２５０ｎｍ（例えば、±２０％）の直径を有するか、あるいはフソソームの集団は、約１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、または２５０ｎｍ（例えば、±２０％）の平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例３２のアッセイによって測定されるように、フソソームは、少なくとも約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、または２０，０００ｎｍの直径を有するか、あるいはフソソームの集団は、少なくとも約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、または２０，０００ｎｍの平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例３２のアッセイによって測定されるように、フソソームは、約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、または２０，０００ｎｍ（例えば、±２０％）の直径を有するか、あるいはフソソームの集団は、約５００ｎｍ、７５０ｎｍ、１，０００ｎｍ、１，５００ｎｍ、２，０００ｎｍ、２，５００ｎｍ、３，０００ｎｍ、５，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、または２０，０００ｎｍ（例えば、±２０％）の平均直径を有する。実施形態において、例えば、実施例１２０のアッセイによって、フソソームの集団は、約４０～９０ｎｍ、４５～６０ｎｍ、５０～５５ｎｍ、または５３ｎｍの１０％の四分位直径、約７０～１００ｎｍ、８０～９５ｎｍ、８５～９０ｎｍ、または８８ｎｍの２５％の四分位直径、約２００～２５０ｎｍ、２１０～２４０ｎｍ、２２０～２３０ｎｍ、または２２６ｎｍの７５％の四分位直径、または約４０００～５０００ｎｍ、４３００～４６００ｎｍ、４４００～４５００ｎｍ、４４５０ｎｍの９０％の四分位直径、のうちの１つ以上を有する（または有すると特定される）。
実施形態において、フソソーム組成物は、例えば、実施例１４９のアッセイにおいて、約３５～４０、３６～３９、３７～３８、または３７．２ｎｇ／ｍＬのＧＡＰＤＨ濃度を含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソーム組成物のＧＡＰＤＨ濃度は、例えば、実施例１４９のアッセイにおいて、供給源細胞のＧＡＰＤＨ濃度の約１％、２％、５％、１０％、または２０％以内である（またはそうであると特定される）。実施形態において、フソソーム組成物のＧＡＰＤＨ濃度は、例えば、実施例１４９のアッセイにおいて、供給源細胞のＧＡＰＤＨ濃度よりも少なくとも１％、２％、５％、１０％、または２０％低い（または低いと特定される）。実施形態において、フソソーム組成物は、総タンパク質１グラム当たり約３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、または７０μｇ未満のＧＡＰＤＨを含む（または含むと特定される）。実施形態において、フソソーム組成物は、総タンパク質１グラム当たり約５００、２５０、１００、または５０μｇ未満のＧＡＰＤＨを含む（または含むと特定される）。実施形態において、親細胞は、フソソーム組成物よりも総タンパク質当たり少なくとも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３０％、５０％、またはそれ以上のＧＡＰＤＨを含む（または含むと特定される）。
実施形態において、
ｉ）フソソームは、エキソソームではない、
ｉｉ）フソソームは、微小胞である、
ｉｉｉ）フソソームは、非哺乳動物フソゲンを含む、
ｉｖ）フソソームは、フソゲンを組み込むように操作されている、
ｖ）フソソームは、外因性フソゲンを含む、
ｖｉ）フソソームは、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍのサイズを有するか、あるいはフソソーム集団は、少なくとも８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍの平均サイズを有する、
ｖｉｉ）フソソームは、１つ以上のオルガネラ、例えば、ミトコンドリア、ゴルジ装置、リソソーム、小胞体、液胞、エンドソーム、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、およびストレス顆粒を含む、
ｖｉｉｉ）フソソームは、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、ホルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含む、
ｉｘ）フソソーム、または複数のフソソームを含む組成物もしくは調製物は、例えば、蔗糖勾配遠心アッセイにおいて、例えば、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ
ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．” Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載されるように、１．０８～１．２２ｇ／ｍｌの浮選密度を有しないか、または少なくとも１．１８～１．２５ｇ／ｍｌ、または１．０５～１．１２ｇ／ｍｌの密度を有する、
ｘ）脂質二重層は、供給源細胞と比較して、セラミドもしくはスフィンゴミエリンまたはそれらの組み合わせが濃縮されているか、あるいは脂質二重層は、供給源細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、もしくはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせが濃縮されていない（例えば、枯渇している）、
ｘｉ）フソソームは、例えば、実施例５２または１６０のアッセイにおいて測定した場合、ホスファチジルセリン（ＰＳ）もしくはＣＤ４０リガンドまたはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含む、
ｘｉｉ）フソソームは、供給源細胞と比較して、ＰＳが濃縮されており、例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のフソソーム集団において、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイによって、ＰＳが陽性である、
ｘｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例６７のアッセイによって、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）を実質的に含まないか、または０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００未満のＡＣｈＥ活性単位／ｕｇタンパク質を含む、
ｘｉｖ）フソソームは、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、またはそれらの任意の組み合わせを実質的に含まないか、あるいは例えば、実施例４４または１５７のアッセイによって、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、または１０％未満の任意の個々のエキソソームマーカータンパク質、および／または０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％未満の当該タンパク質のいずれかの総エキソソームマーカータンパク質を含むか、あるいは供給源細胞と比較して、これらのタンパク質のうちの任意の１つ以上が、脱濃縮されているか、あるいはこれらのタンパク質のうちの任意の１つ以上が、濃縮されていない、
ｘｖ）フソソームは、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、または１ｎｇのＧＡＰＤＨ／ｕｇ総タンパク質を下回る、または供給源細胞中のＧＡＰＤＨレベルを下回る、例えば、供給源細胞中の総タンパク質当たりのＧＡＰＤＨのレベル（ｎｇ／ｕｇ）よりも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満より少ない、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）レベルを含む、
ｘｖｉ）フソソームは、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは１つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが濃縮されているか、またはカルネキシンの量は、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、または１ｎｇのカルネキシン／ｕｇ総タンパク質未満である、またはフソソームは、例えば、実施例４６または１５８のアッセイを使用して、供給源細胞と比較して、総タンパク質当たり１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少ないカルネキシン（ｎｇ／ｕｇ）を含むか、またはフソソーム中のカルネキシンの平均画分含量は、約１×１０－４、１．５×１０－４、２×１０－４、２．１×１０－４、２．２×１０－４、２．３×１０－４、２．４×１０－４、２．４３×１０－４、２．５×１０－４、２．６×１０－４、２．７×１０－４、２．８×１０－４、２．９×１０－４、３×１０－４、３．５×１０－４、または４ｘ１０－４未満であるか、またはフソソームは、親細胞のカルネキシンの量よりも総タンパク質当たり約７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上低いカルネキシンの量を含む、
ｘｖｉｉ）フソソームは、例えば、実施例３９または４０のアッセイを使用して測定されるように、外因性薬剤（例えば、外因性タンパク質、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ）を含むか、あるいは
ｘｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイによって、少なくとも３０分間の原子間力顕微鏡法によって、雲母表面上に固定化することができる、のうちの１つ以上である。
実施形態において、
ｉ）フソソームは、エキソソームである、
ｉｉ）フソソームは、微小胞ではない、
ｉｉｉ）フソソームは、８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍ未満のサイズを有するか、あるいはフソソーム集団は、８０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍ未満の平均サイズを有する、
ｉｖ）フソソームは、オルガネラを含まない、
ｖ）フソソームは、細胞骨格またはその成分、例えば、アクチン、Ａｒｐ２／３、ホルミン、コロニン、ジストロフィン、ケラチン、ミオシン、またはチューブリンを含まない、
ｖｉ）フソソーム、または複数のフソソームを含む組成物もしくは調製物は、例えば、蔗糖勾配遠心アッセイにおいて、例えば、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ
ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．” Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載されるように、１．０８～１．２２ｇ／ｍｌの浮選密度を有する、
ｖｉｉ）脂質二重層は、供給源細胞と比較して、セラミドまたはスフィンゴミエリンまたはそれらの組み合わせが濃縮されていないか、あるいは脂質二重層は、供給源細胞と比較して、糖脂質、遊離脂肪酸、またはホスファチジルセリン、またはそれらの組み合わせが濃縮されている、
ｖｉｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５２または１６０のアッセイにおいて測定した場合、供給源細胞、ホスファチジルセリン（ＰＳ）またはＣＤ４０リガンド、またはＰＳおよびＣＤ４０リガンドの両方を含まないか、あるいはそれらが枯渇している、
ｉｘ）フソソームは、供給源細胞と比較して、ＰＳが濃縮されておらず（枯渇しており）、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のフソソーム集団において、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイによって、ＰＳが陽性である、
ｘ）フソソームは、例えば、実施例６７のアッセイによって、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）、例えば、少なくとも０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１０００のＡＣｈＥ活性単位／ｕｇタンパク質を含む、
ｘｉ）フソソームは、テトラスパニンファミリータンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、もしくはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（例えば、ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、もしくはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、例えば、例えば、実施例４４または１５７のアッセイによって、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、５％、または１０％未満の任意の個々のエキソソームマーカータンパク質、および／または０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％未満の当該タンパク質のいずれかの総エキソソームマーカータンパク質を含むか、あるいは供給源細胞と比較して、これらのタンパク質のうちの任意の１つ以上は、濃縮されている、
ｘｉｉ）フソソームは、例えば、実施例４５のアッセイを使用して、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、または１ｎｇのＧＡＰＤＨ／ｕｇ総タンパク質を上回る、または供給源細胞中のＧＡＰＤＨレベルを下回る、例えば、供給源細胞中の総タンパク質当たりのＧＡＰＤＨのレベル（ｎｇ／ｕｇ）よりも少なくとも１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％より多い、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）レベルを含む、
ｘｉｉｉ）フソソームは、１つ以上の小胞体タンパク質（例えば、カルネキシン）、１つ以上のプロテアソームタンパク質、もしくは１つ以上のミトコンドリアタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせが濃縮されておらず（例えば、枯渇しており）、例えば、カルネキシンの量は、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、または１ｎｇのカルネキシン／ｕｇ総タンパク質未満であるか、またはフソソームは、例えば、実施例４６または１５８のアッセイを使用して、供給源細胞と比較して、総タンパク質当たり１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少ないカルネキシン（ｎｇ／ｕｇ）を含むか、あるいはフソソーム中のカルネキシンの平均画分含量は、約１×１０－４、１．５×１０－４、２×１０－４、２．１×１０－４、２．２×１０－４、２．３×１０－４、２．４×１０－４、２．４３×１０－４、２．５×１０－４、２．６×１０－４、２．７×１０－４、２．８×１０－４、２．９×１０－４、３×１０－４、３．５×１０－４、または４ｘ１０－４未満であるか、またはフソソームは、親細胞のカルネキシンの量よりも総タンパク質当たり約７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上低いカルネキシンの量を含むか、あるいは
ｘｉｖ）フソソームは、例えば、Ｋａｎａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆａｔｅｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１２：Ｅ１４３３－Ｅ１４４２のアッセイによって、少なくとも３０分間の原子間力顕微鏡法によって、雲母表面上に固定化することができない、のうちの１つ以上である。
実施形態において、フソソーム中のカルネキシンの平均画分含量は、約１×１０－４、１．５×１０－４、２×１０－４、２．１×１０－４、２．２×１０－４、２．３×１０－４、２．４×１０－４、２．４３×１０－４、２．５×１０－４、２．６×１０－４、２．７×１０－４、２．８×１０－４、２．９×１０－４、３×１０－４、３．５×１０－４、または４×１０－４未満である（またはあると同定される）。実施形態において、フソソームは、親細胞のカルネキシンの量よりも総タンパク質当たり約７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９５％、９９％以上低いカルネキシンの量を含む。
実施形態において、
ｉ）フソソームは、ＶＬＰを含まない、
ｉｉ）フソソームは、ウイルスを含まない、
ｉｉｉ）フソソームは、複製可能なウイルスを含まない、
ｉｖ）フソソームは、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドタンパク質またはウイルスマトリックスタンパク質を含まない、
ｖ）フソソームは、エンベロープウイルスのカプシドタンパク質を含まない、
ｖｉ）フソソームは、ヌクレオカプシドタンパク質を含まない、または
ｖｉｉ）フソゲンは、ウイルスフソゲンではない、のうちの１つ以上である。
実施形態において、フソソームは、サイトゾルを含む。
実施形態において、
ｉ）フソソームまたは供給源細胞は、例えば、実施例１０２のアッセイによって、対象に移植したときに奇形腫を形成しない、
ｉｉ）フソソームは、例えば、実施例５８のアッセイを使用して、参照細胞、例えば、マクロファージよりも、例えば、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれより大きい走化性を可能にする、
ｉｉｉ）フソソームは、例えば、損傷部位でホーミングすることができ、フソソームまたは細胞生物学は、例えば、実施例５９のアッセイを使用して、例えば、供給源細胞は好中球である、ヒト細胞からのものであるか、または
ｉｖ）フソソームは、食作用が可能であり、例えば、フソソームによる食作用は、例えば、供給源細胞がマクロファージである、実施例６０のアッセイを使用して、０．５、１、２、３、４、５、または６時間以内で検出可能である、のうちの１つ以上である。
実施形態において、フソソームまたはフソソーム組成物は、対象、例えばヒト対象への投与後、５日以下、例えば、４日以下、３日以下、２日以下、１日以下、例えば、約１２～７２時間、特性のいずれかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上保持する。
実施形態において、フソソームは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
ａ）供給源細胞からの１つ以上の内因性タンパク質、例えば、膜タンパク質またはサイトゾルタンパク質を含む、
ｂ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、または５０００個の異なるタンパク質を含む、
ｃ）少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、または１００個の異なる糖タンパク質を含む、
ｄ）フソソーム中のタンパク質の質量で少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、天然に存在するタンパク質である、
ｅ）少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、または５０００個の異なるＲＮＡを含むか、あるいは
ｆ）例えば、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧから選択される少なくとも２、３、４、５、１０、または２０個の異なる脂質を含む。
実施形態において、フソソームは、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を有するように操作されているか、またはフソソームが天然に存在する細胞ではなく、または核は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上天然に有しない：
ａ）核の部分的な不活性化は、核機能の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少、例えば、転写またはＤＮＡ複製、またはその両方の減少をもたらし、転写は、実施例１９のアッセイによって測定され、ＤＮＡ複製は、実施例２０のアッセイによって測定される、
ｂ）フソソームは、例えば、実施例１９のアッセイを使用して、参照細胞、例えば供給源細胞を転写することができないか、または参照細胞、例えば供給源細胞の転写活性の転写の１％、２．５％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満の転写活性を有する、
ｃ）フソソームは、例えば、実施例２０のアッセイを使用して、参照細胞、例えば供給源細胞の核のＤＮＡ複製ができないか、または参照細胞、例えば供給源細胞の核のＤＮＡ複製の１％、２．５％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満の核のＤＮＡ複製を有する、
ｄ）フソソームは、クロマチンを欠いているか、または例えば、実施例３７のアッセイを使用して、参照細胞、例えば供給源細胞のクロマチン含量の１％、２．５％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のクロマチン含量を有する、
ｅ）フソソームは、核膜を欠いているか、または例えば、実施例３６のアッセイによって、参照細胞、例えば、供給源細胞またはジャーカット細胞の核膜の量の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満有する、
ｆ）フソソームは、機能的な核膜孔複合体を欠いているか、または例えば、実施例３６のアッセイによって、核の輸入または輸出活性が、例えば、少なくとも５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％低下しているか、またはフソソームは、核膜孔タンパク質、例えば、ＮＵＰ９８またはインポーチン７の１つ以上欠いている、
ｇ）フソソームは、ヒストンを含まないか、または例えば、実施例３７のアッセイによって、供給源細胞のヒストンレベルの（例えば、Ｈ１、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂ、Ｈ３、またはＨ４の）１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のヒストンレベルを有する、
ｈ）フソソームは、２０、１０、５、４、３、２、または１未満の染色体を含む、
ｉ）核機能は、排除される、
ｊ）フソソームは、除核された哺乳動物細胞である、
ｋ）核は、除去または不活性化され、例えば、機械的力、放射線、または化学的アブレーションによって押し出されるか、あるいは
ｌ）フソソームは、例えば、中間期または有糸分裂中に完全にまたは部分的に除去されたＤＮＡを有する哺乳動物細胞からのものである。
実施形態において、フソソームは、ｍｔＤＮＡまたはベクターＤＮＡを含む。実施形態において、フソソームは、ＤＮＡを含まない。
実施形態において、供給源細胞は、初代細胞、不死化細胞、または細胞株（例えば、骨髄芽球細胞株、例えば、Ｃ２Ｃ１２）である。実施形態において、フソソームは、（例えばＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ複合体を除去するために、例えば、ゲノム編集によって）免疫原性の低下を有する、改変ゲノムを有する供給源細胞からのものである。実施形態において、供給源細胞は、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物からのものである。実施形態において、供給源細胞は、免疫抑制剤で処理された細胞培養物からのものである。実施形態において、供給源細胞は、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して、実質的に非免疫原性である。実施形態において、供給源細胞は、外因性薬剤、例えば治療剤を含む。実施形態において、供給源細胞は、組換え細胞である。
実施形態において、フソソームは、外因性薬剤、例えば治療剤、例えば、タンパク質または核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体（例えばヒト人工染色体）、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）をさらに含む。実施形態において、外因性薬剤は、例えば、フソソームに含まれる、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー、またはそれ以下で存在するか、または１フソソーム当たり少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、または１，０００，０００コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する。実施形態において、フソソームは、例えば、哺乳動物細胞をｓｉＲＮＡまたは遺伝子編集酵素で処理することにより、１つ以上の内因性分子、例えば、タンパク質または核酸のレベルを変化、例えば、増加または減少させる。実施形態において、内因性分子は、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、１００，０００，０００、５００，０００，０００、または１，０００，０００，０００コピー（例えば、フソソームに含まれるコピー）、またはそれ以下で存在するか、または１フソソーム当たり少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、５００，０００、または１，０００，０００コピー、またはそれ以下の平均レベルで存在する。実施形態において、内因性分子（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）は、供給源細胞中のその濃度よりも少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、または１．０×１０８高い濃度で存在する。
実施形態において、活性剤は、タンパク質、タンパク質複合体（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、または５０個のタンパク質、例えば、少なくとも少なくとも２、３、４、５、１０、２０、または５０個の異なるタンパク質を含む）ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、染色体、またはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ）、または小分子から選択される。実施形態において、外因性薬剤は、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９分子、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮを含む。
実施形態において、フソゲンは、ウイルス性フソゲン、例えば、ＨＡ、ＨＩＶ－１ ＥＮＶ、ＨＨＶ－４、ｇｐ１２０、またはＶＳＶ－Ｇである。実施形態において、フソゲンは、哺乳動物フソゲン、例えば、ＳＮＡＲＥ、シンシチン、ミオメーカー、ミオミキサー、ミオマージャー、またはＦＧＦＲＬ１である。実施形態において、フソゲンは、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性である。実施形態において、フソゲンは、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性ではない。実施形態において、フソソームは、標的細胞の表面で標的細胞に融合する。実施形態において、フソゲンは、リソソーム非依存的な様式で融合を促進する。実施形態において、フソゲンは、タンパク質フソゲンである。実施形態において、フソゲンは、脂質フソゲン、例えば、オレイン酸、モノオレイン酸グリセロール、グリセリド、ジアシルグリセロール、または改質不飽和脂肪酸である。実施形態において、フソゲンは、化学的フソゲン、例えばＰＥＧである。実施形態において、フソゲンは、小分子フソゲン、例えば、ハロタン、ＮＳＡＩＤ、例えば、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンである。実施形態において、フソゲンは、組み換えである。実施形態において、フソゲンは、生化学的に組み込まれ、例えば、フソゲンは、精製タンパク質として提供され、フソゲンと脂質二重層との結合を可能にする条件下で脂質二重層と接触される。実施形態において、フソゲンは、生合成的に組み込まれ、例えば、フソゲンが脂質二重層と結合することを可能にする条件下で供給源細胞に発現される。
実施形態において、フソソームは、標的細胞に結合する。実施形態において、標的細胞は、ＨｅＬａ細胞以外であるか、標的細胞は、形質転換または不死化されていない。
フソソーム組成物を含むいくつかの実施形態において、複数のフソソームは、同じである。いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、異なる。いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、１つ以上の供給源細胞からのものである。いくつかの実施形態において、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均直径の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内の直径を有する。いくつかの実施形態において、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均体積の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内の体積を有する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満のサイズ分布の変動、例えば、実施例３１に基づいて、供給源細胞集団の１０％、５０％、または９０％以内のサイズ分布の変動を有する。いくつかの実施形態において、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均フソゲンコピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以内のフソゲンのコピー数を有する。いくつかの実施形態において、複数のフソソームの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、フソソーム組成物中のフソソームの平均治療剤のコピー数の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以内のフソゲンのコピー数を有する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５個以上のフソソームを含む。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１ｕｌ、２ｕｌ、５ｕｌ、１０ｕｌ、２０ｕｌ、５０ｕｌ、１００ｕｌ、２００ｕｌ、５００ｕｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、５ｍｌ、または１０ｍｌの体積内である。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の数の細胞にカーゴを送達する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団または非標識細胞集団と比較して、標的細胞集団に少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のカーゴを送達する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照標的細胞集団または非標識細胞集団と比較して、標的細胞集団に少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％多くのカーゴを送達する。
いくつかの実施形態において、カーゴの１０％未満は、エンドサイトーシスによって細胞に入る。
いくつかの実施形態において、エンドサイトーシスの阻害剤は、リソソーム酸性化の阻害剤、例えばバフィロマイシンＡ１である。いくつかの実施形態において、エンドサイトーシスの阻害剤は、ダイナミン阻害剤、例えばダイナソーレである。
いくつかの実施形態において、標的細胞集団は、生理学的ｐＨ（例えば、７．３～７．５、例えば７．３８～７．４２）である。
いくつかの実施形態において、送達されるカーゴは、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、実施例９０、９２、または１３５のアッセイを使用して決定される。
いくつかの実施形態において、カーゴは、ダイナミン非依存性経路またはリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路を通って細胞に入る（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤は、例えば２５μＭの濃度で、マクロピノサイトーシスの阻害剤、例えば５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）である）、またはアクチン非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤は、アクチン重合の阻害剤である場合、例えば６μＭの濃度で、ラトランキュリンＢである）。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、標的化部分をさらに含む。実施形態において、標的化部分は、フソゲンに含まれるか、または別個の分子に含まれる。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触した場合、カーゴは、非標的細胞よりも少なくとも１０倍多くの標的細胞中に存在する。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触した場合、カーゴは、非標的細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または５０倍多くの標的細胞中に存在する、および／またはカーゴは、参照細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または５０倍多くの標的細胞中に存在する。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、非標的細胞よりも標的細胞と少なくとも５０％高い割合で融合する。
いくつかの実施形態において、カーゴの存在は、例えば、実施例１２４のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される。いくつかの実施形態において、融合は、例えば、実施例５４のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、標的細胞上の細胞表面マーカーに特異的である。実施形態において、細胞表面マーカーは、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞の細胞表面マーカーである。
いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ラブドウイルス科フソゲン（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、フィロウイルス科フソゲン、アレナウイルス科フソゲン、トガウイルス科フソゲン、フラビウイルス科フソゲン、ブニヤウイルス科フソゲン、またはヘパドナウイルス科フソゲン（例えば、Ｈｅｐ Ｂ）、またはそれらの誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも３０％の数の細胞にカーゴを送達する。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも３０％のカーゴを送達する。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞集団と接触した場合、エンドソームまたはリソソーム以外の標的細胞位置、例えばサイトゾルにカーゴを送達する。実施形態において、カーゴの５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満は、エンドソームまたはリソソームに送達される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量は、質量分析を使用して、例えば、実施例５３または１６１のアッセイを使用して決定される。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、エキソソーム、微小胞、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、少なくとも５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍの平均サイズを有する。他の実施形態において、複数のフソソームは、１００ｎｍ、８０ｎｍ、６０ｎｍ、４０ｎｍ、または３０ｎｍ未満の平均サイズを有する。
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、好中球、ＨＥＫ２９３細胞、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、細胞生物学的製剤を含む。いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、除核細胞を含む。
いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、哺乳動物フソゲンを含む。いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ウイルス性フソゲンを含む。いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、タンパク質フソゲンである。いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、またはアブラウイルスＦタンパク質、またはそれらの誘導体を含む。
いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性である。いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性ではない。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、５、または１０コピーのコピー数で存在する。
いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスタンパク質Ｇ、麻疹タンパク質Ｈ、ツパイアパラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＧタンパク質、パラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＨＮタンパク質、モルビリウイルスＨタンパク質、レスピロウイルスＨＮタンパク質、センダイＨＮタンパク質、ルブラウイルスＨＮタンパク質、アブラウイルスＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）は、ニパウイルスＦおよびＧタンパク質、麻疹ウイルスＦおよびＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦおよびＨタンパク質、パラミクソウイルスＦおよびＧタンパク質またはＦおよびＨタンパク質またはＦおよびＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦおよびＧタンパク質、ヘニパウイルスＦおよびＧタンパク質、モルビリウイルスＦおよびＨタンパク質、レスピロウイルスＦおよびＨＮタンパク質、センダイウイルスＦおよびＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはアブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、カーゴは、外因性タンパク質または外因性核酸を含む。いくつかの実施形態において、カーゴは、細胞質タンパク質を含むか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態において、カーゴは、膜タンパク質を含むか、またはそれをコードする。いくつかの実施形態において、カーゴは、治療剤を含む。いくつかの実施形態において、カーゴは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、または２００コピー（例えば、１フソソーム当たり最大約１，０００コピー）のコピー数で存在する。いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）のコピー数とカーゴのコピー数の比は、１０００：１～１：１、または５００：１～１：１、または２５０：１～１：１、または１５０：１～１：１、または１００：１～１：１、または７５：１～１：１、または５０：１～１：１、または２５：１～１：１、または２０：１～１：１、または１５：１～１：１、または１０：１～１：１、または５：１～１：１、または２：１～１：１、または１：１～１：２である。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、
ａ）医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｂ）適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｃ）所定の基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、実質的に病原体を含まない、または
ｄ）所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有する、例えば、実質的に汚染物質を含まない。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃未満の温度である。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ウイルスカプシドタンパク質またはＤＮＡ組み込みポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、カーゴは、ウイルスゲノムを含む。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、例えば、遺伝子療法のために、例えば、標的細胞のゲノムを安定に改変するために、核酸を標的細胞に送達することができる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まないか、またはウイルスヌクレオカプシドタンパク質の量は、例えば、質量分析によって、例えば、実施例５３または１６１のアッセイを使用して、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満である。
実施形態において、本明細書に記載される薬学的組成物は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
ａ）薬学的組成物は、医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｂ）薬学的組成物は、適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｃ）薬学的組成物は、所定の基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、実質的に病原体を含まない、
ｄ）薬学的組成物は、所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有する、例えば、実質的に汚染物質を含まない、あるいは
ｅ）薬学的組成物は、例えば、本明細書に記載されるように、低い免疫原性を有する。
実施形態において、薬学的組成物のカーゴは、治療剤を含む。
実施形態において、生物学的機能は、
ａ）酵素を調節する、例えば、阻害または刺激すること、
ｂ）例えば、因子の合成を阻害もしくは刺激することによって、または分解を阻害もしくは刺激することによって、対象における分子（例えば、タンパク質、核酸、または代謝産物、薬物、または毒素）のレベルを調節する、例えば増加または減少させること、
ｃ）標的細胞または組織の生存率を調節する、例えば増加または減少させること、あるいは
ｄ）タンパク質の状態を調節する、例えば、タンパク質のリン酸化の増加または減少させること、またはタンパク質の立体構造を調節すること、
ｅ）傷害の治癒を促進すること、
ｆ）２つの細胞間の相互作用を調節する、例えば増加または減少させること、
ｇ）細胞分化を調節する、例えば、促進または阻害させること、
ｈ）対象における因子（例えば、タンパク質、核酸、代謝産物、薬物、または毒素）の分布を変化させること、
ｉ）免疫応答を調節する、例えば、増加または減少させること、あるいは
ｊ）標的組織への細胞の動員を調節する、例えば、増加または減少させること、から選択される。
本明細書の治療方法のいくつかの実施形態において、複数のフソソームは、局所効果を有する。いくつかの実施形態において、複数のフソソームは、遠位効果を有する。
いくつかの実施形態において、対象は、がん、炎症性障害、自己免疫疾患、慢性疾患、炎症、損傷した臓器機能、感染症、代謝性疾患、変性障害、遺伝性疾患（例えば、遺伝的欠損、劣性遺伝性障害、もしくは優性遺伝障害）、または傷害を有する。いくつかの実施形態において、対象は、感染症を有し、フソソームは、感染症の抗原を含む。いくつかの実施形態において、対象は、遺伝的欠損を有し、フソソームは、対象が欠損しているタンパク質、またはタンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ）、またはタンパク質をコードするＤＮＡ、またはタンパク質をコードする染色体、またはタンパク質をコードする核酸を含む核を含む。いくつかの実施形態において、対象は、優性遺伝障害を有し、フソソームは、優性突然変異対立遺伝子の核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、対象は、優性遺伝障害を有し、および／またはフソソームは、優性変異対立遺伝子の核酸阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含み、および／またはフソソームは、核酸阻害剤によって標的化されない変異遺伝子の非変異対立遺伝子をコードするｍＲＮＡも含む。いくつかの実施形態において、対象は、ワクチン接種を必要としている。いくつかの実施形態において、対象は、例えば、損傷した部位の再生を必要としている。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、対象に、少なくとも１、２、３、４、または５回投与される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、対象に、全身的（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内）または局所的に投与される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物が、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼から選択される標的組織に到達するように、フソソーム組成物は、対象に投与される。いくつかの実施形態（例えば、対象が自己免疫疾患を有する場合）において、フソソーム組成物は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、またはイムノフィリン調節剤と同時投与される。いくつかの実施形態（例えば、対象ががんまたは感染症を有する場合）において、フソソーム組成物は、免疫賦活剤、例えば、アジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと同時投与される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物の投与は、対象における標的細胞中の遺伝子の上方調節または下方調節をもたらし、例えば、フソソームは、転写活性化因子もしくは抑制因子、翻訳活性化因子もしくは抑制因子、または後成的活性化因子もしくは抑制因子を含む。
本明細書の作製方法のいくつかの実施形態において、フソゲンを発現する供給源細胞を提供することは、供給源細胞中で外因性フソゲンを発現すること、または供給源細胞中で内因性フソゲンの発現を上方調節することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、供給源細胞の核を不活性化することを含む。
実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５個のフソソームを含む。実施形態において、フソソーム組成物は、少なくとも１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、５００ｍｌ、１Ｌ、２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、または５０Ｌ含む。実施形態において、本方法は、例えば、化学的除核、機械的力の使用、例えば、フィルターもしくは遠心分離機の使用、細胞骨格の少なくとも部分的な破壊、またはそれらの組み合わせによって、哺乳動物細胞を除核することを含む。実施形態において、本方法は、供給源細胞中にフソゲンまたは他の膜タンパク質を発現させることを含む。実施形態において、本方法は、小胞形成、低張処理、押出、または遠心分離のうちの１つ以上を含む。実施形態において、本方法は、細胞中に外因性因子を遺伝的に発現させること、または細胞もしくはフソソームに外因性因子を負荷することを含む。実施形態において、本方法は、例えば、核を不活性化する前に、細胞（例えば供給源細胞）を除核する前に、細胞（例えば供給源細胞）を、ポリペプチド剤をコードするＤＮＡと接触させることを含む。実施形態において、本方法は、例えば、核を不活性化する、例えば、細胞を除核する前または後に、細胞を、ポリペプチド剤をコードするＲＮＡと接触させることを含む。実施形態において、本方法は、例えば、エレクトロポレーションによって、治療剤（例えば、核酸またはタンパク質）をフソソームに導入することを含む。
実施形態において、フソソームは、例えば、免疫原性を低下させるために（例えば、ゲノム編集によって、例えば、ＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ複合体を除去するために）改変ゲノムを有する哺乳動物細胞からのものである。実施形態において、供給源細胞は、抗炎症シグナルで処理された細胞培養物からのものである。実施形態において、本方法は、例えば、核を不活性化する、例えば、細胞を除核する前または後に、ステップａ）の供給源細胞を、免疫抑制剤または抗炎症シグナルと接触させることをさらに含む。
いくつかの実施形態において、検出可能なレベル、例えば基準値を超える値が決定される場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物を含む試料は、廃棄される。
いくつかの実施形態において、第１のフソゲンは、リポペプチドではない。
対象におけるレシピエント細胞の形成をもたらす標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソームの融合）を評価する方法のいくつかの実施形態において、本方法は、対象から生物学的試料を収集することをさらに含む。実施形態において、生物学的試料は、１つ以上のレシピエント細胞を含む。
対象における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソームの融合）を評価する方法のいくつかの実施形態において、本方法は、例えば、遠心分離機によって、生物学的試料中のレシピエント細胞を生物学的試料中の融合されていないフソソームから分離することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、遠心分離機によって、生物学的試料中の融合されていないフフソソームと比較して、レシピエント細胞を濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、例えばＦＡＣＳによって、生物学的試料中の非標的細胞と比較して、標的細胞を濃縮することをさらに含む。
対象における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソームの融合）を評価する方法のいくつかの実施形態において、フソソーム組成物に関する活性は、代謝産物の存在またはレベル、バイオマーカーの存在またはレベル（例えば、タンパク質レベルまたは翻訳後修飾、例えば、リン酸化または切断）から選択される。
対象における標的細胞のフソソーム含有量（例えば、標的細胞へのフソソームの融合）を評価する方法のいくつかの実施形態において、フソソーム組成物に関連する活性は、免疫原性である。実施形態において、標的細胞は、ＣＤ３＋細胞であり、生物学的試料は、対象から採取された血液試料である。実施形態において、血液細胞は、例えば緩衝塩化アンモニウム溶液を使用して、血液試料から濃縮される。実施形態において、濃縮された血液細胞は、抗ＣＤ３抗体（例えば、マウス抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体）でインキュベートされ、ＣＤ３＋細胞は、例えば、蛍光活性化細胞選別によって選択される。実施形態において、細胞、例えば選別された細胞、例えばＣＤ３＋細胞は、例えば、抗ＩｇＭ抗体で染色することによって、細胞表面上の抗体の存在について分析される。いくつかの実施形態において、抗体が基準レベルを超えるレベルで存在する場合、対象は、レシピエント細胞に対する免疫応答を有すると特定される。
実施形態において、免疫原性は、細胞溶解アッセイによってアッセイされる。実施形態において、生物学的試料からのレシピエント細胞は、他の細胞を溶解することができる免疫エフェクター細胞とインキュベートされる。実施形態において、免疫エフェクター細胞は、対象、またはフソソーム組成物を投与されていない対象からのものである。例えば、実施形態において、免疫原性は、ＰＢＭＣ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、生物学的試料からのレシピエント細胞は、対象からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、またはフソソーム組成物を投与されていない対象からの対照ＰＢＭＣとインキュベートされ、次いで、ＰＢＭＣによるレシピエント細胞の溶解について評価される。実施形態において、免疫原性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、対象からのＮＫ細胞、またはフソソーム組成物を投与されていない対象からの対照ＮＫ細胞と共インキュベートされ、次いで、ＮＫ細胞によるレシピエント細胞の溶解について評価される。実施形態において、免疫原性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、対象からのＣＤ８＋Ｔ細胞、またはフソソーム組成物を投与されていない対象からの対照ＣＤ８＋Ｔ細胞と共インキュベートされ、次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞による標的細胞の溶解について評価される。いくつかの実施形態において、細胞溶解が基準レベルを超えるレベルで起こる場合、対象は、レシピエント細胞に対する免疫応答を有すると特定される。
いくつかの実施形態において、免疫原性は、レシピエント細胞、例えばマクロファージの食作用によってアッセイされる。実施形態において、レシピエント細胞は、食作用のためにマクロファージによって標的化されない。実施形態において、生物学的試料は、対象から採取された血液試料である。実施形態において、血液細胞は、例えば緩衝塩化アンモニウム溶液を使用して、血液試料から濃縮される。実施形態において、濃縮された血液細胞は、抗ＣＤ３抗体（例えば、マウス抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体）でインキュベートされ、ＣＤ３＋細胞は、例えば、蛍光活性化細胞選別によって選択される。実施形態において、蛍光標識されたＣＤ３＋細胞は、マクロファージとインキュベートされ、次いで、例えばフローサイトメトリーによって、マクロファージ内の細胞内蛍光について試験される。いくつかの実施形態において、マクロファージの食作用が基準レベルを超えるレベルで起こる場合、対象は、レシピエント細胞に対する免疫応答を有すると特定される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、例えば、実施例５４または１２４に記載されるように、標的細胞のフソソーム含有量、例えば、標的細胞によるフソソームの融合を測定または判定すること（例えば、融合が起こったかどうかを判定すること）を含む。実施形態において、検出可能なマーカーは、（例えば、フソソーム中のカーゴまたはペイロード分子にコンジュゲートされた）フソソーム中に存在し得る。カーゴまたはペイロードがタンパク質を含む実施形態において、カーゴまたはペイロードは、例えば、結合部分（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を使用して直接検出され得る。ある特定の実施形態において、タンパク質ペイロードは、検出可能な部分、例えば、抗体分子によって特異的に結合され得る部分と関連付けられる（例えば、コンジュゲートされる）。カーゴまたはペイロードが核酸（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含む実施形態において、カーゴまたはペイロードは、核酸にハイブリダイズすることができる核酸プローブを使用して、または核酸によってコードされるポリペプチドに特異的に結合することができる結合部分（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を使用して検出され得る。実施形態において、標的細胞へのフソソームの融合は、検出可能なマーカーを検出することによって判定される。実施形態において、標的細胞へのフソソームの融合は、カーゴまたはペイロード（例えば、核酸カーゴまたはペイロードによってコードされるポリペプチドまたは非コードＲＮＡ）の発現を測定することによって判定される。実施形態において、標的細胞へのフソソームの融合は、カーゴまたはペイロード活性の下流マーカーを測定することによって判定される。いくつかの実施形態において、標的細胞またはレシピエント細胞は、標的細胞またはレシピエント細胞のフソゲン含有量、例えば、標的細胞によるフソソームの融合を測定または判定する前に、対象から単離される。実施形態において、標的細胞またはレシピエント細胞はまた、エンドソームまたはリソソーム色素または抗体で染色して、ペイロードがエンドソームまたはリソソーム中に存在するかどうかを判定される。いくつかの実施形態において、ペイロードは、エンドソームまたはリソソームと共局在しないか、またはペイロードの５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％未満は、エンドソームまたはリソソームと共局在化する。実施形態において、レシピエント細胞はまた、細胞質、核、ミトコンドリア、または原形質膜の色素または抗体で染色して、ペイロードが、標的コンパートメント、例えば、細胞質、核、ミトコンドリア、または原形質膜と共局在化するかどうかを判定し、そのような実施形態において、ペイロードは、核、ミトコンドリア、または原形質膜と局在化し得る。
実施形態において、本明細書のフソソームを製造する方法は、供給源細胞中でＡＲＲＤＣ１またはその活性断片もしくはバリアントを発現（例えば、過剰発現）させることを含む。実施形態において、本方法は、フソソームを、ＡＲＲＤＣ１を発現する供給源細胞から分離することをさらに含む。実施形態において、本方法は、１ｍＬ当たり少なくとも１．２×１０１１、１．４×１０１１、１．６×１０１１、１．８×１０１１、２．０×１０１１、２．２×１０１１、２．４×１０１１、２．６×１０１１、または２．８×１０１１個の粒子、例えば、１ｍＬ当たり最大約３×１０１１個の粒子を得る。いくつかの実施形態において、本方法は、ＡＲＲＤＣ１またはその活性断片またはバリアントを発現しない、または過剰発現しない、他の同様の供給源細胞で実施される同じ方法よりも、１ｍＬ当たり約１．２、１．４、１．６、１．８、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍多く粒子を得る。いくつかの実施形態において、供給源細胞から生成されるフソソームは、標的細胞と接触した場合、ＡＲＲＤＣ１またはその活性断片またはバリアントを発現させること（例えば、過剰発現させること）を含み、例えば、顕微鏡アッセイ、例えば、実施例１７０のアッセイを使用して、ＡＲＲＤＣ１またはその活性断片またはバリアントを発現しない、または過剰発現しない、賢明な同様の供給源細胞から生成されるフソソームに少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０倍多い細胞で検出可能なカーゴ送達を生成する。
列挙実施形態
１．供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームが、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）サイトゾルを含む内腔であって、脂質二重層に囲まれている、内腔と、
（ｃ）脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現したフソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
フソソームは、核を含まず、
フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満であり、
複数のフソソームは、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも３０％の数の細胞にカーゴを送達する。
２．参照標的細胞集団もしくは非標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％の数の細胞にカーゴを送達するか、または参照標的細胞集団もしくは非標的細胞集団と比較して、標的細胞集団に少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のカーゴを送達する、実施形態１に記載のフソソーム組成物。
３．カーゴの１０％未満がエンドサイトーシスによって細胞に入る、実施形態１または２に記載のフソソーム組成物。
４．エンドサイトーシスの阻害剤が、リソソーム酸性化の阻害剤、例えばバフィロマイシンＡ１である、実施形態１～３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
５．送達されるカーゴが、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、実施例９０または１３５のアッセイを使用して決定される、実施形態１～４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
６．カーゴが、ダイナミン非依存性経路またはリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路を通って細胞に入る（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤は、例えば２５μＭの濃度で、マクロピノサイトーシスの阻害剤、例えば５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）である）、またはアクチン非依存性経路（例えば、エンドサイトーシスの阻害剤は、アクチン重合の阻害剤である場合、例えば６μＭの濃度で、ラトランキュリンＢである）、実施形態１～５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
７．複数のフソソームが標的化部分をさらに含む、実施形態１～６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
８．標的化部分が、フソゲンに含まれるか、または別個の分子に含まれる、実施形態７に記載のフソソーム組成物。
９．複数のフソソームが、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、
（ｉ）カーゴが、非標的細胞よりも少なくとも１０倍多くの標的細胞中に存在するか、または
（ｉｉ）カーゴが、非標的細胞および／または参照細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または５０倍多くの標的細胞中に存在する、実施形態１～８のいずれかに記載のフソソーム組成物。
１０．複数のフソソームが、非標的細胞よりも少なくとも５０％高い割合で標的細胞と融合する、実施形態１～９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
１１．供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームが、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）サイトゾルを含む内腔であって、脂質二重層によって囲まれている、内腔と、
（ｃ）脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現した再標的化フソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
フソソームは、核を含まず、
フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量は、総タンパク質の１％未満であり、
（ｉ）複数のフソソームが、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、カーゴが、非標的細胞よりも少なくとも１０倍多くの標的細胞中に存在するか、または少なくとも１０倍多くのカーゴが、参照細胞集団よりも細胞集団に送達されるか、あるいは
（ｉｉ）複数のフソソームが、非標的細胞よりも少なくとも少なくとも５０％高い割合で標的細胞と融合するか、または少なくとも５０％多くのカーゴが、参照細胞集団と比較して、細胞集団に送達される、フソソーム組成物。
１２．カーゴの存在が、例えば、実施例１２４のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される、実施形態１１に記載のフソソーム組成物。
１３．融合が、例えば、実施例５４のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される、実施形態１１に記載のフソソーム組成物。
１４．標的化部分が、標的細胞上の細胞表面マーカーに特異的である、実施形態７～１３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
１５．細胞表面マーカーが、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞の細胞表面マーカーである、実施形態１４に記載のフソソーム組成物。
１６．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ラブドウイルス科フソゲン（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、フィロウイルス科フソゲン、アレナウイルス科フソゲン、トガウイルス科フソゲン、フラビウイルス科フソゲン、ブニヤウイルス科フソゲン、またはヘパドナウイルス科フソゲン（例えば、Ｈｅｐ Ｂ）、またはそれらの誘導体を含む、実施形態１１～１５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
１７．複数のフソソームが、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、およびエンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、
（ｉ）参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団中の少なくとも３０％数の細胞にカーゴを送達する、
（ｉｉ）参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団に少なくとも３０％のカーゴを送達する、または
（ｉｉｉ）参照標的細胞集団と比較して、標的細胞集団に少なくとも３０％多くのカーゴを送達する、実施形態７～１６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
１８．標的細胞集団と接触した場合、エンドソームまたはリソソーム以外の標的細胞位置、例えば、サイトゾルにカーゴを送達する、実施形態１～１７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
１９．カーゴの５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満が、エンドソームまたはリソソームに送達される、実施形態１８に記載のフソソーム組成物。
２０．フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量が、質量分析を使用して、例えば、実施例５３または１６１のアッセイを使用して決定される、および／または
フソソーム組成物は、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質を含まないか、またはウイルスヌクレオカプシドタンパク質の量は、例えば、質量分析によって、例えば、実施例５３または１６１のアッセイを使用して、総タンパク質の１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満である、実施形態１～１９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２１．複数のフソソームが、エキソソーム、微小胞、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１～２０のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２２．複数のフソソームが、少なくとも５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍの平均サイズを有する、実施形態１～２１のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２３．複数のフソソームが、１００ｎｍ、８０ｎｍ、６０ｎｍ、４０ｎｍ、または３０ｎｍ未満の平均サイズを有する、実施形態１～２１のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２４．供給源細胞が、好中球、ＨＥＫ２９３細胞、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、実施形態１～２３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２５．複数のフソソームが、細胞生物学的製剤を含む、実施形態１～２４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２６．複数のフソソームが、除核細胞を含む、実施形態１～２５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２７．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、哺乳動物フソゲンを含む、実施形態１～２６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２８．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ウイルス性フソゲンを含む、実施形態１～２７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
２９．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性である、実施形態１～２８のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３０．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性ではない、実施形態１～２９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３１．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、タンパク質フソゲンである、実施形態１～３０のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３２．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、またはアブラウイルスＦタンパク質、またはそれらの誘導体を含む、実施形態１～３１のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３３．フソゲンが、１フソソーム当たり少なくとも２、５、または１０コピーのコピー数で存在する、実施形態１～３２のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３４．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ニパウイルスタンパク質Ｇ、麻疹タンパク質Ｈ、ツパイアパラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＧタンパク質、パラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＨＮタンパク質、モルビリウイルスＨタンパク質、レスピロウイルスＨＮタンパク質、センダイＨＮタンパク質、ルブラウイルスＨＮタンパク質、アブラウイルスＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体を含む、実施形態１～３３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３５．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ニパウイルスＦおよびＧタンパク質、麻疹ウイルスＦおよびＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦおよびＨタンパク質、パラミクソウイルスＦおよびＧタンパク質またはＦおよびＨタンパク質またはＦおよびＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦおよびＧタンパク質、ヘニパウイルスＦおよびＧタンパク質、モルビリウイルスＦおよびＨタンパク質、レスピロウイルスＦおよびＨＮタンパク質、センダイウイルスＦおよびＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはアブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む、実施形態１～３４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３６．カーゴが、外因性タンパク質または外因性核酸を含む、実施形態１～３５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３７．カーゴが、細胞質タンパク質または膜タンパク質を含むか、またはそれをコードする、実施形態１～３６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３８．カーゴが、治療剤を含む、実施形態１～３７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
３９．カーゴが、１フソソーム当たり少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、または２００コピー（例えば、１フソソーム当たり最大約１，０００コピー）のコピー数で存在する、実施形態１～３８のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４０．フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）のコピー数とカーゴのコピー数の比が、１０００：１～１：１、５００：１～１：１、２５０：１～１：１、１５０：１～１：１、１００：１～１：１、７５：１～１：１、５０：１～１：１、２５：１～１：１、２０：１～１：１、１５：１～１：１、１０：１～１：１、５：１～１：１、２：１～１：１、または１：１～１：２である、実施形態１～３９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４１．
ａ）フソソーム組成物が、例えば、質量分析アッセイによって、約１００～１０，０００、５００～５，０００、１０００～５０００、２０００～４０００、２５００～３５００、２９００～２９３０、２９１０～２９１５、もしくは２９１２．０のフソゲンとＣＤ６３の比率を有するか、または
ｂ）フソソーム組成物が、約５～３５、１０～３０、１５～２５、１６～１９、１８～１９、もしくは１８．６のタンパク質カーゴとＣＤ６３の比率であるか、または
ｃ）フソソーム中のタンパク質の１５％、２０％、または２５％未満が、エキソソームタンパク質である、のうちの１つ以上である、実施形態１～４０のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４２．
ａ）フソゲンが、例えば、質量分析アッセイによって、フソソーム中の総タンパク質の約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、または１３．６％を含む、
ｂ）フソゲンが、例えば、質量分析アッセイによって、約２０～１２０、４０～１００、５０～９０、６０～８０、６５～７５、６８～７０、または６９のＧＡＰＤＨに対する比率を有する、
ｃ）フソゲンが、例えば、質量分析アッセイによって、約２００～９００、３００～８００、４００～７００、５００～６００、５２０～５９０、５３０～５８０、５４０～５７０、５５０～５６０、または５５８．４のＣＮＸに対する比率を有する、
ｄ）フソソーム中のタンパク質の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％８％、９％、または１０％が、リボソームタンパク質であるか、またはフソソーム中のタンパク質の約１％～２０％、３％～１５％、５％～１２．５％、７．５％～１１％、８．５％～１０．５％、または９％～１０％が、リボソームタンパク質である、のうちの１つ以上である、実施形態１～４１のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４３．供給源細胞が、ＡＲＲＤＣ１またはその活性断片またはバリアントを発現する（例えば、過剰発現する）、実施形態１～４２のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４４．例えば、質量分析アッセイによって、約１～３、１～１０、１～１００、３～１０、４～９、５～８、６～７、１５～１００、６０～２００、８０～１８０、１００～１６０、１２０～１４０、３～１００、４～１００、５～１００、６～１００、１５～１００、８０～１００、３～２００、４～２００、５～２００、６～２００、１５～２００、８０～２００、１００～２００、１２０～２００、３００～１０００、４００～９００、５００～８００、６００～７００、６４０～６９０、６５０～６８０、６６０～６７０、１００～１０，０００、または約６６４．９のフソゲンとＡＲＲＤＣ１の比率を有する、実施形態１～４３のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４５．総タンパク質含有量の割合としてＡＲＲＤＣ１のレベルは、少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％であるか、または、総タンパク質含有量の割合としてＡＲＲＤＣ１のレベルは、約０．０１～２５％、０．５～２０％、２～１５％、または５～１０％である、実施形態１～４４のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４６．例えば、質量分析アッセイ、例えば、実施例１６２のアッセイを使用して、約１，０００～１０，０００、２，０００～５，０００、３，０００～４，０００、３，０５０～３，１００、３，０６０～３，０７０、または約３，０６４のフソゲンとｔｓｇ１０１の比率を有する、実施形態１～４５のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４７．例えば、質量分析アッセイ、例えば、実施例１６３のアッセイを使用して、約１０～３０、１５～２５、１８～２１、１９～２０、または１９．５のフソゲンとｔｓｇ１０１の比率を有する、実施形態１～４６のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４８．総タンパク質含有量の割合としてＴＳＧ１０１のレベルは、少なくとも約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、または０．００７％であるか、または総タンパク質含有量の割合としてＴＳＧ１０１のレベルは、約０．００１～０．０１、０．００２～０．００６、０．００３～０．００５、または０．００４である、実施形態１～４７のいずれかに記載のフソソーム組成物。
４９．
ｅ）医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｆ）適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｇ）所定の基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、実質的に病原体を含まない、あるいは
ｈ）所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有する、例えば、実質的に汚染物質を含まない、実施形態１～４８のいずれかに記載のフソソーム組成物。
５０．４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃未満の温度である、実施形態１～４９のいずれかに記載のフソソーム組成物。
５１．先行する実施形態のいずれかのフソソーム組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
５２．カーゴが、治療剤を含む、実施形態５１に記載の薬学的組成物。
５３．対象に治療剤を送達する方法であって、対象に、実施形態５２に記載の薬学的組成物を投与することを含み、フソソーム組成物が、治療剤が送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
５４．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）実施形態１～５０のいずれかに記載のフソソーム組成物を提供することと、
ｂ）対象への投与に適した薬学的組成物としてフソソームを製剤化することと、を含む、方法。
５５．フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）実施形態１～５０のいずれかに記載のフソソーム組成物を提供することと、
ｂ）（ｉ）免疫原性分子、（ｉｉ）病原体、または（ｉｉｉ）汚染物質、の因子のうちの１つ以上の存在またはレベルを決定するために、複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｃ）因子のうちの１つ以上が、基準値を下回っている場合、複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含む、方法。
５６．供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、複数のフソソームが、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）脂質二重層によって囲まれている内腔と、
（ｃ）外因性または過剰発現したフソゲンであって、脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
フソソームが、核を含まず、
ｉ）フソゲンが、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｉｉ）フソソームが、少なくとも１，０００コピーのコピー数の治療剤を含む、
ｉｉｉ）フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が供給源細胞中の対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｉｖ）フソソームが、供給源細胞のプロテオーム組成物と同様のプロテオーム組成物を含む、
ｖ）フソソームが、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルを送信すること、例えば、インスリンに応答するＡＫＴリン酸化反応、または例えば、陰性対照、例えばインスリンの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、インスリンに応答するグルコース（例えば、標識グルコース、例えば２－ＮＢＤＧ）の取り込みを可能にする、
ｖｉ）フソソームが、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、対象、例えば、マウスに投与される場合、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％または１０％が、２４時間後に標的組織中に存在するか、または
ｖｉｉ）供給源細胞は、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）である。
５７．ウイルスカプシドタンパク質またはＤＮＡ組み込みポリペプチドを含む、実施形態５６に記載のフソソーム組成物。
５８．カーゴが、ウイルスゲノムを含む、実施形態５６に記載のフソソーム組成物。
５９．例えば、遺伝子療法のために、例えば、標的細胞のゲノムを安定的に修飾するために、核酸を標的細胞に送達することができる、実施形態５６に記載のフソソーム組成物。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。例えば、本明細書で、例えば、本明細書の任意の表内において言及されるすべてのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。特に明記しない限り、本明細書の任意の表内を含む本明細書に特定した配列受入番号は、２０１７年５月８日現在のデータベースエントリを指す。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受入番号を参照する場合、配列バリアントのすべてが包含される。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみであり、限定することを意図しない。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、前記複数のフソソームが、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）サイトゾルを含む内腔であって、前記脂質二重層によって囲まれている、内腔と、
（ｃ）前記脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現したフソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
前記フソソームが、核を含まず、
前記フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量が、総タンパク質の１％未満であり、
前記複数のフソソームが、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、および前記エンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、前記参照標的細胞集団と比較して、前記標的細胞集団中の少なくとも３０％の数の細胞に前記カーゴを送達するか、または前記参照標的細胞集団と比較して、前記標的細胞集団に少なくとも３０％多くの前記カーゴを送達する、フソソーム組成物。
（項目２）
前記参照標的細胞集団と比較して、前記標的細胞集団中の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％の数の細胞に前記カーゴを送達するか、または前記参照標的細胞集団と比較して、前記標的細胞集団に少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％多くの前記カーゴを送達する、項目１に記載のフソソーム組成物。
（項目３）
カーゴの１０％未満がエンドサイトーシスによって前記細胞に入る、項目１または２に記載のフソソーム組成物。
（項目４）
前記エンドサイトーシスの阻害剤が、リソソーム酸性化の阻害剤、例えばバフィロマイシンＡ１である、項目１～３のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目５）
送達されるカーゴが、エンドサイトーシス阻害アッセイ、例えば、実施例１３５のアッセイを使用して決定される、項目１～４のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目６）
カーゴが、ダイナミン非依存性経路またはリソソーム酸性化非依存性経路、マクロピノサイトーシス非依存性経路、またはアクチン非依存性経路を通って前記細胞に入る、項目１～５のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目７）
前記複数のフソソームが標的化部分をさらに含む、項目１～６のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目８）
前記標的化部分が、フソゲンに含まれるか、または別個の分子に含まれる、項目７に記載のフソソーム組成物。
（項目９）
前記複数のフソソームが、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触した場合、前記カーゴが、非標的細胞よりも少なくとも１０倍多くの標的細胞中に存在するか、または少なくとも１０倍多くの前記カーゴが、前記参照標的細胞集団と比較して、前記標的細胞集団中に存在する、項目１～８のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目１０）
前記複数のフソソームが、非標的細胞または参照細胞よりも少なくとも５０％高い割合で標的細胞と融合する、項目１～９のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目１１）
供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、前記複数のフソソームが、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）サイトゾルを含む内腔であって、前記内腔が脂質二重層によって囲まれている、内腔と、
（ｃ）前記脂質二重層内に配置された外因性または過剰発現した再標的化フソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
前記フソソームが、核を含まず、
前記フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量が、総タンパク質の１％未満であり、
（ｉ）前記複数のフソソームが、標的細胞および非標的細胞を含む細胞集団と接触する場合、前記カーゴが、非標的細胞もしくは参照細胞よりも少なくとも１０倍多くの標的細胞中に存在するか、または
（ｉｉ）前記複数のフソソームが、非標的細胞または参照細胞よりも少なくとも少なくとも５０％高い割合で標的細胞と融合する、フソソーム組成物。
（項目１２）
カーゴの存在が、例えば、実施例１２４のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される、項目１１に記載のフソソーム組成物。
（項目１３）
融合が、例えば、実施例５４のアッセイを使用して、顕微鏡検査によって測定される、項目１１に記載のフソソーム組成物。
（項目１４）
前記標的化部分が、前記標的細胞上の細胞表面マーカーに特異的である、項目７～１３のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目１５）
前記細胞表面マーカーが、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞の細胞表面マーカーである、項目１４に記載のフソソーム組成物。
（項目１６）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ラブドウイルス科フソゲン（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、フィロウイルス科フソゲン、アレナウイルス科フソゲン、トガウイルス科フソゲン、フラビウイルス科フソゲン、ブニヤウイルス科フソゲン、またはヘパドナウイルス科フソゲン（例えば、Ｈｅｐ Ｂ）、またはそれらの誘導体を含む、項目１１～１５のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目１７）
前記複数のフソソームが、エンドサイトーシスの阻害剤の存在下で標的細胞集団と接触した場合、および前記エンドサイトーシスの阻害剤で処理されていない参照標的細胞集団と接触した場合、前記参照標的細胞集団と比較して、前記標的細胞集団中の少なくとも３０％の数の細胞に前記カーゴを送達する、項目７～１６のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目１８）
標的細胞集団と接触した場合、エンドソームまたはリソソーム以外の標的細胞位置、例えば、前記サイトゾルにカーゴを送達する、項目１～１７のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目１９）
前記カーゴの５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％未満が、エンドソームまたはリソソームに送達される、項目１８に記載のフソソーム組成物。
（項目２０）
前記フソソーム組成物中のウイルスカプシドタンパク質の量が、質量分析を使用して、例えば、実施例５３のアッセイを使用して決定される、項目１～１９のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２１）
複数のフソソームが、エキソソーム、微小胞、またはそれらの組み合わせを含む、項目１～２０のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２２）
前記複数のフソソームが、少なくとも５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１４００ｎｍ、または１５００ｎｍの平均サイズを有する、項目１～２１のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２３）
前記複数のフソソームが、１００ｎｍ、８０ｎｍ、６０ｎｍ、４０ｎｍ、または３０ｎｍ未満の平均サイズを有する、項目１～２１のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。（項目２４）
前記供給源細胞が、好中球、ＨＥＫ２９３細胞、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、項目１～２３のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２５）
前記複数のフソソームが、細胞生物学的製剤を含む、項目１～２４のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２６）
前記複数のフソソームが、除核細胞を含む、項目１～２５のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２７）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、哺乳動物フソゲンを含む、項目１～２６のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２８）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ウイルスフソゲンを含む、項目１～２７のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目２９）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性である、項目１～２８のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３０）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、または９～１０のｐＨで活性ではない、項目１～２９のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３１）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、タンパク質フソゲンである、項目１～３０のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３２）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、またはアブラウイルスＦタンパク質、またはそれらの誘導体を含む、項目１～３１のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３３）
前記フソゲンが、１フソソーム当たり少なくとも１０コピーのコピー数で存在する、項目１～３２のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３４）
前記複数のフソソームが、ニパウイルスタンパク質Ｇ、麻疹タンパク質Ｈ、ツパイアパラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＧタンパク質、パラミクソウイルスＨタンパク質、パラミクソウイルスＨＮタンパク質、モルビリウイルスＨタンパク質、レスピロウイルスＨＮタンパク質、センダイＨＮタンパク質、ルブラウイルスＨＮタンパク質、アブラウイルスＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体をさらに含む、項目１～３３のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３５）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）が、ニパウイルスＦおよびＧタンパク質、麻疹ウイルスＦおよびＨタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦおよびＨタンパク質、パラミクソウイルスＦおよびＧタンパク質またはＦおよびＨタンパク質またはＦおよびＨＮタンパク質、ヘンドラウイルスＦおよびＧタンパク質、ヘニパウイルスＦおよびＧタンパク質、モルビリウイルスＦおよびＨタンパク質、レスピロウイルスＦおよびＨＮタンパク質、センダイウイルスＦおよびＨＮタンパク質、ルブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはアブラウイルスＦおよびＨＮタンパク質、またはそれらの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせから選択される配列を含む、項目１～３４のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３６）
前記カーゴが、外因性タンパク質または外因性核酸を含む、項目１～３５のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３７）
前記カーゴが、細胞質タンパク質または膜タンパク質を含むか、またはそれをコードする、項目１～３６のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３８）
前記カーゴが、治療剤を含む、項目１～３７のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目３９）
前記カーゴが、１フソソーム当たり少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、または２００コピー（例えば、１フソソーム当たり最大約１，０００コピー）のコピー数で存在する、項目１～３８のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目４０）
前記フソゲン（例えば、再標的化されたフソゲン）のコピー数と前記カーゴのコピー数の比が、１０００：１～１：１、５００：１～１：１、２５０：１～１：１、１５０：１～１：１、１００：１～１：１、７５：１～１：１、５０：１～１：１、２５：１～１：１、２０：１～１：１、１５：１～１：１、１０：１～１：１、５：１～１：１、２：１～１：１、または１：１～１：２である、項目１～３９のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目４１）
ａ）前記フソソーム組成物が、例えば、質量分析アッセイによって、約１００～１０，０００、５００～５，０００、１０００～５０００、２０００～４０００、２５００～３５００、２９００～２９３０、２９１０～２９１５、もしくは２９１２．０のフソゲンとＣＤ６３の比率を有するか、または
ｂ）前記フソソーム組成物が、約５～３５、１０～３０、１５～２５、１６～１９、１８～１９、もしくは１８．６のタンパク質カーゴとＣＤ６３の比率であるか、または
ｃ）前記フソソーム中の前記タンパク質の１５％、２０％、もしくは２５％未満が、エキソソームタンパク質である、のうちの１つ以上である、項目１～４０のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目４２）
ａ）前記フソゲンが、例えば、質量分析アッセイによって、フソソーム中の総タンパク質の約１～３０％、５～２０％、１０～１５％、１２～１５％、１３～１４％、または１３．６％を含む、
ｂ）フソゲンが、例えば、質量分析アッセイによって、約２０～１２０、４０～１００、５０～９０、６０～８０、６５～７５、６８～７０、または６９のＧＡＰＤＨに対する比率を有する、
ｃ）フソゲンが、例えば、質量分析アッセイによって、約２００～９００、３００～８００、４００～７００、５００～６００、５２０～５９０、５３０～５８０、５４０～５７０、５５０～５６０、または５５８．４のＣＮＸに対する比率を有する、
ｄ）前記フソソーム中の前記タンパク質の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％８％、９％、または１０％が、リボソームタンパク質であるか、または前記フソソーム中の前記タンパク質の約１％～２０％、３％～１５％、５％～１２．５％、７．５％～１１％、８．５％～１０．５％、または９％～１０％が、リボソームタンパク質である、のうちの１つ以上である、項目１～４１のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目４３）
ａ）医薬品または適正製造基準（ＧＭＰ）の基準を満たしている、
ｂ）適正製造基準（ＧＭＰ）に従って作製された、
ｃ）所定の基準値を下回る病原体レベルを有する、例えば、実質的に病原体を含まない、あるいは
ｄ）所定の基準値を下回る汚染物質レベルを有する、例えば、実質的に汚染物質を含まない、項目１～４２のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目４４）
４、０、－４、－１０、－１２、－１６、－２０、－８０、または－１６０℃未満の温度である、項目１～４３のいずれか１項に記載のフソソーム組成物。
（項目４５）
先行する項目のいずれかに記載のフソソーム組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
（項目４６）
前記カーゴが、治療剤を含む、項目４５に記載の薬学的組成物。
（項目４７）
対象に治療剤を送達する方法であって、前記対象に、項目４６に記載の薬学的組成物を投与することを含み、前記フソソーム組成物が、前記治療剤が送達されるような量および／または時間で投与される、方法。
（項目４８）
フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）項目１～４４のいずれか１項に記載のフソソーム組成物を提供することと、
ｂ）対象への投与に適した薬学的組成物として前記フソソームを製剤化することと、を含む、方法。
（項目４９）
フソソーム組成物を製造する方法であって、
ａ）項目１～４４のいずれか１項に記載のフソソーム組成物を提供することと、
ｂ）（ｉ）免疫原性分子、（ｉｉ）病原体、または（ｉｉｉ）汚染物質、の因子のうちの１つ以上の存在またはレベルを決定するために、前記複数からの１つ以上のフソソームをアッセイすることと、
ｃ）前記因子のうちの１つ以上が、基準値を下回っている場合、前記複数のフソソームまたはフソソーム組成物の放出を承認することと、を含む、方法。
（項目５０）
供給源細胞に由来する複数のフソソームを含むフソソーム組成物であって、前記複数のフソソームが、
（ａ）脂質二重層と、
（ｂ）前記脂質二重層によって囲まれている内腔と、
（ｃ）外因性または過剰発現したフソゲンであって、前記脂質二重層内に配置されている、フソゲンと、
（ｄ）カーゴと、を含み、
前記フソソームが、核を含まず、
ｖｉｉｉ）前記フソゲンが、少なくとも１，０００コピーのコピー数で存在する、
ｉｘ）前記フソソームが、少なくとも１，０００コピーのコピー数で治療剤を含む、
ｘ）前記フソソームが、ＣＬ、Ｃｅｒ、ＤＡＧ、ＨｅｘＣｅｒ、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＬＰＥ、ＬＰＧ、ＬＰＩ、ＬＰＳ、ＰＡ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＩ、ＰＳ、ＣＥ、ＳＭ、およびＴＡＧのうちの１つ以上が前記供給源細胞中の前記対応する脂質レベルの７５％以内である脂質を含む、
ｘｉ）前記フソソームが、供給源細胞のプロテオーム組成物と同様のプロテオーム組成物を含む、
ｘｉｉ）前記フソソームが、シグナル伝達、例えば、細胞外シグナルを送信すること、例えば、インスリンに応答するＡＫＴリン酸化反応、または例えば、陰性対照、例えばインスリンの非存在下で他の同様のフソソームよりも少なくとも１０％多い、インスリンに応答するグルコース（例えば、標識グルコース、例えば２－ＮＢＤＧ）の取り込みを可能にする、
ｘｉｉｉ）前記フソソームが、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、または眼を標的とし、対象、例えば、マウスに投与される場合、投与されたフソソームの集団中の前記フソソームの少なくとも０．１％または１０％が、２４時間後に前記標的組織中に存在するか、または
ｘｉｖ）前記供給源細胞が、好中球、顆粒球、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄芽球、筋芽細胞、肝細胞、またはニューロン、例えば、網膜神経細胞から選択される、のうちの１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つ）である、フソソーム組成物。
（項目５１）
ウイルスカプシドタンパク質またはＤＮＡ組み込みポリペプチドを含む、項目５０に記載のフソソーム組成物。
（項目５２）
前記カーゴが、ウイルスゲノムを含む、項目５０に記載のフソソーム組成物。
（項目５３）
例えば、遺伝子療法のために、例えば、前記標的細胞の前記ゲノムを安定的に修飾するために、核酸を標的細胞に送達することができる、項目５０に記載のフソソーム組成物。
本発明の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的で、本明細書に記載の図面には、現在例示されている特定の実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な配置および手段に限定されないことが、理解されるべきである。
小胞体用色素によるフソソームの染色を定量化する。 ミトコンドリア用色素によるフソソームの染色を定量化する。 リソソーム用色素によるフソソームの染色を定量化する。 Ｆ－アクチン用色素によるフソソームの染色を定量化する。 ＣｒｅおよびＧＦＰを発現するフソゲンと接触した細胞の光退色後のＧＦＰ蛍光の回復を示すグラフである。 フソソームまたは陰性対照との接触後にＲＦＰを発現する標的細胞の割合を示すグラフである。 ドナーＨｅＬａ細胞とレシピエントＨｅＬａ細胞との間での融合を介した陽性オルガネラ送達の画像である。白で示された細胞内領域は、ドナーのミトコンドリアとレシピエントのミトコンドリアとの間での重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重複しない場所を示す。 ドナーＨｅＬａ細胞とレシピエントＨｅＬａ細胞との間での融合を介した陽性オルガネラ送達の画像である。白で示された細胞内領域は、ドナーのミトコンドリアとレシピエントのミトコンドリアとの間での重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重複しない場所を示す。 フソソームを注射したマウスから指示された組織の顕微鏡画像を示す。白は、ＲＦＰ蛍光細胞を表し、インビボでの細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す。 指示された投与経路によりインビボでのマウス組織へのフソソームの成功した送達を示す一連の画像であり、標的化細胞によるルシフェラーゼの発現をもたらす。 マウス筋肉組織のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の顕微鏡画像を示し、細胞生物学による筋肉細胞へのタンパク質カーゴの送達を示す。 タンパク質が増強し、除核されたＶＳＶ－Ｇ ＨｅＬａ細胞を使用して、レシピエントＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞にミトコンドリアの送達を示すグラフである。 巨大原形質膜フソソームの生成および単離を示す一連の画像である。 示されているように、Ｃｒｅリコンビナーゼを担持するフソソームでインキュベートし、様々なサイズの細孔を有する膜を通して押し出すことにより生成されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＲＦＰの発現を示すグラフである。 親細胞およびフソソームのＡＦ４８８のＥｕ：４８８陽性事象（左パネル）および中央値蛍光強度（ＭＦＩ；右パネル）を示す一連のグラフである。 親細胞およびフソソームのＡＦ６４７のＥｄｕ：６４７陽性事象および中央値蛍光強度を示す一連のグラフである。 ３、５、および２４時間にわたるポリメラーゼアクチンに対するフソソームおよび親細胞の能力を示すグラフである。 脂質二重層構造を有するフソソームを示す電子顕微鏡画像である。 ウエスタンブロットによるＶＳＶ－Ｇ発現の検出を示す図である。「＋対照」は、ＶＳＶ－Ｇでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を表す。「－対照」は、トランスフェクトされていない２９３Ｔ細胞を表す。 サブミクロンのフソソームの測定パラメーターおよび設定を示す表である。 超ミクロンのフソソームの測定パラメーターおよび設定を示す表である。 ＮＴＡおよび顕微鏡によって測定されるように、フソソームおよび親細胞のサイズ分布を示す一連のグラフである。 ＮＴＡおよび顕微鏡によって測定されるように、フソソームおよび親細胞の平均直径を示す表である。 ＮＴＡおよび顕微鏡によって測定されるように、フソソームおよび親細胞のサイズ分布統計を示す表である。 フソソームおよび親細胞の平均サイズおよび体積を示す表である。 フソソーム内のオルガネラの検出を示す一連のグラフである。（Ａ）小胞体、（Ｂ）ミトコンドリア、（Ｃ）リソソーム。 フソソームまたは細胞調製において観察された可溶性：不溶性の比を示す一連の図である。 標的細胞または非標的細胞へのＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆフソソーム融合、および標的融合の絶対量を示す一連の図である。 フソソームで処置したＰＣ３細胞でのｈＯｘ４０Ｌの発現を示す図である。 ＶＳＶ－Ｇフソソームの２－ＮＢＤＧ平均蛍光強度を示す図である。 ＶＳＶ－Ｇフソソームのサイトゾルのエステラーゼ活性を示す図である。 フソソームを注射したマウスの組織におけるホタルルシフェラーゼシグナルの持続性を示す一連の図である。（Ａ）ＦＶＢマウスのフソソームで処置した（右脚）とＰＢＳで処置した（左脚）の腹部画像および発光シグナル。左側は、画像および発光シグナルのオーバーレイであり、右側は、発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームで処置したＴＡ（黒四角）、ＰＢＳで処置したＴＡ（白丸）、マウスバックグラウンド（黒六角形）、およびステージバックグラウンド（白六角形）の全磁束シグナル。ｙスケールは、ｌｏｇ１０スケールである。フソソームで処置した脚は、処置から１時間後（ｐ＜０．０００１）、６時間後（ｐ＜０．０１）、および１２時間後（ｐ＜０．０１）、著しく大きなシグナルを有した。 同上。 マウスにおける生物発光画像によって検出されるように、フソソームによるＣｒｅリコンビナーゼの送達を示す一連の図である。（Ａ）ＩＶフソソームで処置したマウスの露出肝臓および脾臓の腹側画像および発光シグナルオーバーレイ（１倍および３倍の濃度）。下部は発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームを標的とした脾臓および肝臓の全磁束シグナル；ｙスケールは、ｌｏｇ１０スケールである。３倍濃度のフソソームで処置したマウスは、処置から７２時間後のバックグラウンドよりも脾臓において著しく大きなシグナルを有した（ｐ＝０．０００４）。 同上。 生物発光画像によって検出されるフソソームによるマウス肝臓および脾臓へのＣｒｅリコンビナーゼを示す一連の図である。（Ａ）左から右へ；殺処分から５分以内に収集および画像化された、切除された肝臓、心臓、肺、腎臓、小腸、膵臓、および脾臓の背側画像および発光シグナルのオーバーレイ。下部は発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームを標的とした脾臓および肝臓および他の組織の全フラックスシグナル；ｙスケールは、ｌｏｇ１０スケールである。３倍濃度のフソソーム処理で処置したマウスは、最も低いシグナルを有する組織（心臓）と比較して、脾臓でのシグナルが有意に大きかった（ｐ＜０．０００１）。 同上。 非エンドサイトーシス経路を介したＮｉｖＧ＋ＦフソソームによるＣｒｅカーゴの送達を示す表である。 エンドサイトーシス経路を介したＶＳＶ－ＧフソソームによるＣｒｅカーゴの送達を示す一連の画像である。 Ｓｙｎ１ ＨｅＬａ細胞フソソームを使用して、レシピエントＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞への機能的ミトコンドリアの送達を示すグラフである。 フソソームを介したレシピエント細胞へのＤＮＡのインビトロ送達を示す一連の画像である。 フソソームを介したレシピエント細胞へのｍＲＮＡのインビトロ送達を示す一連の画像である。 フソソームを使用して、マウスの組織への蛍ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡのインビボ送達を示す一連の図である。（Ａ）ＦＶＢマウスのフソソームで処置した（右脚）とＰＢＳで処置した（左脚）の腹部画像および発光シグナル。左側は、画像および発光シグナルのオーバーレイであり、右側は、発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームで処置したＴＡ（黒四角）、ＰＢＳで処置したＴＡ（白丸）、マウスバックグラウンド（黒六角形）、およびステージバックグラウンド（白六角形）の全磁束シグナル。ｙスケールは、ｌｏｇ１０スケールである。フソソームで処置した脚は、処置から１時間後（ｐ＜０．０００１）、６時間後（ｐ＜０．０１）、および１２時間後（ｐ＜０．０１）、著しく大きなシグナルを有した。 同上。 フソソームを介したレシピエント細胞へのタンパク質のインビトロ送達を示す一連の画像である。 フソソームを使用して、マウスの組織へのＣｒｅリコンビナーゼタンパク質のインビボ送達を示す一連の図である。（Ａ）左から右へ；腹部に露出した処置済みＴＡの発光シグナルおよびマウスの画像、および発光シグナルのみ。（Ｂ）処置済みの脚対未治療の脚、バックグラウンド（マウス胸部）、およびステージバックグラウンドの合計フラックス；ｙスケールは、ｌｏｇ１０スケールである。 同上。 超音波処理によりロードされたフソソームを介したレシピエント細胞へのｍｉＲＦＰ６７０ ＤＮＡの送達を示す一連の図である。 超音波処理によりロードされたフソソームを介したレシピエント細胞へのＢＳＡ－ＡＦ６４７タンパク質の送達を示す一連の図である。 フソソームゴーストのサイズ分布および濃度を示すヒストグラムである。 親細胞およびフソソームのＥｄｕ：６４７陽性事象およびＡＦ６４７の中央値蛍光強度を示す一連のグラフである。 フソソームおよび親細胞においてビシンコニン酸アッセイにより測定されたＧＡＰＤＨ：総タンパク質の比率を示すグラフである。 フソソームおよび親細胞においてビシンコニン酸アッセイにより測定された脂質：タンパク質の比率を示すグラフである。 フソソームおよび親細胞においてビシンコニン酸アッセイにより測定されたタンパク質：ＤＮＡの比率を示すグラフである。 フソソームおよび親細胞においてビシンコニン酸アッセイにより測定された脂質：ＤＮＡの比率を示すグラフである。 ダイナミン阻害剤Ｄｙｎａｓｏｒｅの存在下または非存在下でのＶＳＶ－Ｇフソソームによる細胞内へのＣｒｅの送達を示す一連の画像である。 エキソソームおよびフソソームにおけるエキソソームマーカーＣＤ６３のタンパク質レベルを示すグラフである。 フソソームおよび親細胞で検出されたカルネキシンシグナルの強度を示すグラフである。 フソソームおよび親細胞について決定された脂質：ＤＮＡの比率を示すグラフである。 親細胞、エキソソーム、およびフソソームにおける総脂質の割合として脂質種の比率を示す一連のグラフである。 同上。 示されているように、特定のコンパートメントに関連するタンパク質に関する親細胞、エキソソーム、およびフソソームのタンパク質含有量を示す一連のグラフである。 親細胞、エキソソーム、およびフソソームにおける総タンパク質含有量の割合としてＡＲＲＤＣ１（左パネル）またはＴＳＧ１０１（右パネル）のレベルを示す一連のグラフである。 アレスチンドメイン含有タンパク質１（ＡＲＲＤＣ１）を、Ｃｒｅを内包するフソソームの生成物に組み込む効果を示す一連のグラフである。（Ａ）ＡＲＲＤＣ１の存在下または非存在下で生成されたフソソームとのインキュベーション後に検出されたＲＦＰ陽性細胞の割合。（Ｂ）ＡＲＲＤＣ１の存在下または非存在下で生成されたフソソームに対してナノ粒子追跡分析（ｆＮＴＡ）を使用して検出された１ｍＬ当たりの粒子数。 同上。
本発明は、フソゲンを含む天然由来または設計された二脂質膜を記載している。
定義
本明細書で使用される、「細胞膜」は、細胞、例えば、供給源細胞または標的細胞に由来する膜を指す。
本明細書で使用される、「コンドリソーム」は、天然の細胞または組織起源のミトコンドリアネットワークから由来および単離または精製された細胞内装置である。「コンドリソーム調製物」は、生物活性（細胞または組織と相互作用するか、または細胞もしくは組織に影響を与えることができる）および／または薬学的活性を有する。
本明細書で使用される、「細胞生物学的製剤」とは、内腔および細胞膜を含む細胞の一部、または部分的もしくは完全な核不活性化を有する細胞を指す。いくつかの実施形態において、細胞生物学的製剤は、細胞骨格成分、オルガネラ、およびリボソームのうちの１つ以上を含む。実施形態において、細胞生物学的製剤は、除核細胞、微小胞、または細胞ゴーストである。
本明細書で使用される、「サイトゾル」は、細胞の細胞質の水性成分を指す。サイトゾルは、タンパク質、ＲＮＡ、代謝産物、およびイオンを含んでもよい。
本明細書で使用される、「外因性薬剤」とは、ｉ）内在性タンパク質と比較して（例えば、挿入、欠失、または置換によって）変更された配列を有するタンパク質など、天然には存在しない、または、ｉｉ）外因性物質が配置されているフソソームの天然に存在する供給源細胞には天然に存在しない、薬剤を指す。
本明細書で使用される、「融合」とは、２つの膜で囲まれた内腔の間に相互作用を作り出すこと、例えば、２つの膜の融合を促進すること、または２つの内腔の間に接続、例えば孔を作り出すことを指す。
本明細書で使用される、「フソゲン」とは、２つの膜で囲まれた内腔の間の相互作用を作り出す薬剤または分子を指す。実施形態において、フソゲンは、膜の融合を促進する。他の実施形態において、フソゲンは、２つの内腔（例えば、フソソームの内腔と標的細胞の細胞質）との間に接続、例えば、孔を作り出す。いくつかの実施形態において、フソゲンは、例えば、いずれのタンパク質も融合活性を単独で有していない、２つ以上のタンパク質の複合体を含む。いくつかの実施形態において、フソゲンは、標的化ドメインを含む。
本明細書で使用される、「フソゲン結合パートナー」とは、フソゲンと相互作用して、２つの膜の間の融合を促進する薬剤または分子を指す。いくつかの実施形態において、フソゲン結合パートナーは、細胞の表面特徴であり得るか、またはそれを含み得る。
本明細書で使用される、「フソソーム」とは、膜封入調製物および両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンを指す。
本明細書で使用される、「フソソーム組成物」とは、１つ以上のフソソームを含む組成物を指す。
本明細書で使用される、「膜封入調製物」とは、内腔または空洞内のカーゴを囲んでいる両親媒性脂質二重層を指す。いくつかの実施形態において、カーゴは、内腔または空洞に対して外因性である。他の実施形態において、カーゴは、内腔または空洞に対して内因性、例えば、供給源細胞に対して内因性である。
本明細書で使用される、「ミトコンドリア生物発生」は、ミトコンドリアのバイオマスを増加させるプロセスを示す。ミトコンドリア生物発生には、細胞中のミトコンドリアの数および／またはサイズを増加させることが含まれる。
本明細書で使用される、「精製された」という用語は、自然状態から変更または取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する細胞または細胞断片は、「精製されて」いないが、その自然状態の共存材料から部分的または完全に分離された同じ細胞または細胞断片は、「精製されて」いる。精製されたフソソーム組成物は、実質的に純粋な形態で存在することができるか、または例えば、細胞を含む培養培地などの培養培地などの非天然の環境に存在することができる。
本明細書で使用される、「再標的化されたフソゲン」とは、天然に存在する形態のフソゲンの一部ではない配列を有する標的化部分を含むフソゲンを指す。実施形態において、フソゲンは、天然に存在する形態のフソゲンにおける標的化部分と比較して、異なる標的化部分を含む。実施形態において、天然に存在する形態のフソゲンは、標的化ドメインを欠いており、再標的化フソゲンは、天然に存在する形態のフソゲンに存在しない標的化部分を含む。実施形態において、フソゲンは、標的化部分を含むように改変される。実施形態において、フソゲンは、例えば、膜貫通ドメイン、融合活性ドメイン、または細胞質ドメインにおいて、天然に存在する形態のフソゲンと比較して、標的化部分の外側に１つ以上の配列変異を含む。
本明細書で使用される、「供給源細胞」（「親細胞」と交換可能に使用される）とは、フソソームが由来する細胞を指す。
フソソーム
いくつかの態様では、本明細書に記載のフソソーム組成物および方法は、フソゲンを含む膜封入調製物、例えば、天然由来のまたは操作された脂質膜を含む。いくつかの態様では、本開示は、非植物細胞、例えば、哺乳動物細胞、またはそれらの誘導体（例えば、ミトコンドリア、コンドリソーム、オルガネラ、小胞、または除核細胞）の一部を提供し、これには、フソゲン、例えば、タンパク質、脂質、および化学的フソゲンが含まれる。
カプセル化
本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの実施形態において、フソソーム、例えば、フソゲンを有する、天然由来のまたは操作された両親媒性脂質の二重層が含まれる。そのような組成物は、驚くべきことに、本発明の方法に使用することができる。いくつかの例では、膜は、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｍｉｒｏ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ
ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ＆
ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｓｃｕｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．３３（９）：９９４－１０１０に記載されるように、自己、同種異系、異種、または操作された細胞の形をとり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、Ｏｒｉｖｅ．ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ：ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；３６（８）：５３７－４６、およびＭｉｓｈｒａ．２０１６．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓに記載されているような、操作された膜を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、天然に存在する膜を含む（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ａ Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐａｔｈｗａｙ Ｓｈｕｔｔｌｅｓ Ｃａｒｇｏ ｆｒｏｍ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｔｏ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２：１３５－１４１）。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、天然由来の膜、例えば、細胞または組織から調製された膜小胞を含む。一実施形態において、フソソームは、ＭＳＣまたは星状細胞からの小胞である。
一実施形態において、フソソームは、エキソソームである。
例示的なエキソソームおよび他の膜封入体は、例えば、ＵＳ２０１６１３７７１６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、細胞から得られる小胞、例えば、微小胞、エキソソーム、アポトーシス体（アポトーシス細胞から）、微粒子（例えば、血小板に由来し得る）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）（例えば、血清中の好中球および単球から誘導することができる）、プロスタトソーム（ｐｒｏｓｔａｔｏｓｏｍｅ）（前立腺がん細胞から得ることができる）、カルディオソーム（ｃａｒｄｉｏｓｏｍｅ）（心臓細胞から誘導することができる）などを含む。
例示的なエキソソームおよび他の膜封入体はまた、ＷＯ／２０１７／１６１０１０、ＷＯ／２０１６／０７７６３９、ＵＳ２０１６０１６８５７２、ＵＳ２０１５０２９０３４３、およびＵＳ２００７０２９８１１８に記載されており、これらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞外小胞、ナノ小胞、またはエキソソームを含む。実施形態において、フソソームは、細胞外小胞、例えば、内部空間を取り囲み、それが由来する細胞よりも小さい直径を有する膜を含む細胞由来の小胞を含む。実施形態において、細胞外小胞は、２０ｎｍ～１０００ｎｍの直径を有する。実施形態において、フソソームは、アポトーシス体、細胞の断片、直接的または間接的な操作による細胞に由来する小胞、小胞化されたオルガネラ、および生細胞によって（例えば、直接的な原形質膜の出芽または原形質膜を有する後期エンドソームの融合によって）生成された小胞を含む。実施形態において、細胞外小胞は、生きているまたは死んだ生物、外植された組織または器官、または培養細胞に由来する。実施形態において、フソソームは、ナノ小胞、例えば、内部空間を取り囲む膜を含む細胞由来の小さい（例えば、直径２０～２５０ｎｍ、または直径３０～１５０ｎｍ）小胞を含み、これは、直接的または間接的な操作によって前記小胞から生成される。ナノ小胞の生成は、場合によっては、供給源細胞の破壊を引き起こし得る。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含み得る。実施形態において、フソソームは、エキソソームを含む。実施形態において、エキソソームは、内部空間を取り囲む膜を含む細胞由来の小さい（例えば、直径２０～３００ｎｍ、または直径４０～２００ｎｍ）小胞であり、直接的な原形質膜の出芽または原形質膜を有する後期エンドソームの融合によって前記細胞から生成される。実施形態において、エキソソームの生成は、供給源細胞の破壊をもたらさない。実施形態において、エキソソームは、脂質または脂肪酸およびポリペプチドを含む。
例示的なエキソソームおよび他の膜封入体はまた、ＵＳ２０１６０３５４３１３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。実施形態において、フソソームは、生体適合性送達モジュール、エキソソーム（例えば、直径約３０ｎｍ～約２００ｎｍ）、微小胞（例えば、直径約１００ｎｍ～約２０００ｎｍ）、アポトーシス体（例えば、直径約３００ｎｍ～約２０００ｎｍ）、膜粒子、膜小胞、エキソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム、またはエキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）を含む。
一実施形態において、フソソームは、微小胞である。いくつかの実施形態において、微小胞は、直径が約１０～１０，０００ｎｍの間の細胞内または細胞外小胞である。いくつかの実施形態において、微小胞は、細胞から自然に放出され、いくつかの実施形態において、細胞は、小胞の形成を促進するために処理される。一実施形態において、フソソームは、エキソソームである。場合によっては、エキソソームは、直径約３０～１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、エキソソームは、多小胞体から生成される。いくつかの実施形態において、細胞は、エキソソームの形成を促進するために処理される。一実施形態において、フソソームは、細胞ゴーストである。一実施形態において、小胞は、原形質膜小胞、例えば、巨大な原形質膜小胞である。
フソソームは、いくつかの異なるタイプの脂質、例えば、リン脂質などの両親媒性脂質から作製され得る。フソソームは、最外表面として脂質二重層を含んでもよい。この二重層は、同じまたは異なるタイプの１つ以上の脂質で構成されてもよい。例には、ホスホコリンおよびホスホイノシトールなどのリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。特定の例には、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、およびＤＳＰＣが含まれるが、これらに限定されない。
フソソームは、主に、天然のリン脂質と、１，２－ジステアロリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、およびモノシアロガングリオシドなどの脂質と、からなり得る。実施形態において、フソソームは、リン脂質のみを含み、血漿中での安定性が低い。しかしながら、コレステロールによる脂質膜の操作は、実施形態において、安定性を高め、血漿へのカプセル化された生物活性化合物の急速な放出を減らすことができる。いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、安定性を高めるために、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む（例えば、総説についてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、膜の湾曲に影響する脂質を含むか、または濃縮されている（例えば、Ｔｈｉａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（１２）：７７５－７８５，２０１３を参照のこと）。いくつかの脂質は、小さな親水性頭部と大きな疎水性尾部を有し、これは、局所領域に集中することによって融合孔の形成を促進する。いくつかの実施形態において、フソソームは、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジグリセリド（ＤＡＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、脂肪酸（ＦＡ）などの負曲率の脂質を含むか、または濃縮されている。いくつかの実施形態において、フソソームは、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（Ｐｔｄｌｎｓ）、リゾホスファチジル酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）などの正曲率の脂質を含まないか、枯渇しないか、またはほとんど含まない。
いくつかの実施形態において、脂質は、フソソームに添加される。いくつかの実施形態において、脂質は、フソソームの形成前または形成中に、脂質をそれらの膜に組み込む培養中の供給源細胞に添加される。いくつかの実施形態において、脂質は、リポソームの形態で細胞またはフソソームに添加される。いくつかの実施形態において、メチル－ベータシクロデキストラン（ｍβ－ＣＤ）を使用して、脂質を濃縮または枯渇させる（例えば、Ｋａｉｎｕ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１（１２）：３５３３－３５４１，２０１０を参照のこと）。
フソソームは、限定されないが、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢを単独で、またはコレステロールと一緒に含むことで、ＤＯＰＥおよびコレステロール、ＤＯＴＭＡおよびコレステロール、ＤＯＴＡＰおよびコレステロール、ＤＯＴＩＭおよびコレステロール、ならびにＤＤＡＢおよびコレステロールを含み得る。多重膜小胞脂質の調製のための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号を参照されたく、多重膜小胞脂質調製に関する教示は参照により本明細書に組み込まれる）。脂質膜が水溶液と混合されるときに、フソソームの形成は自発的になり得るが、ホモジナイザー、ソニケーター、または押出装置を使用することによって、振とうする形で力を加えることによって促進することもできる（総説についてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。押し出された脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７（押し出された脂質調製に関連する教示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、サイズを小さくするフィルターを通して押し出すことによって調製することができる。
別の実施形態において、脂質は、フソソームを形成するために使用することができる。ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００、補脂質ジステオイルホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＭＧを含むが、これらに限定されない、脂質は、自発的な小胞形成手順を使用して製剤化され得る（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２） １，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照のこと）。Ｔｅｋｍｉｒａの刊行物には、脂質小胞および脂質小胞製剤の様々な態様が記載されている（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号、同第７，７９９，５６５号、同第８，０５８，０６９号、同第８，２８３，３３３号、同第７，９０１，７０８号、同第７，７４５，６５１号、同第７，８０３，３９７号、同第８，１０１，７４１号、同第８，１８８，２６３号、同第７，９１５，３９９号、同第８，２３６，９４３号、および同第７，８３８，６５８号、ならびに欧州特許第１７６６０３５号、同第１５１９７１４号、同第１７８１５９３号、および同第１６６４３１６号を参照のこと）、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれ、本発明に使用および／または適合され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるフソソームは、１つ以上のポリマーを含み得る。ポリマーは、生分解性であり得る。生分解性ポリマー小胞は、当該技術分野で公知の方法を使用して合成され得る。ポリマー小胞を合成するための例示的な方法は、Ｂｅｒｓｈｔｅｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ４：１７８７－１７８７，２００８およびＵＳ２００８／００１４１４４ Ａ１によって記載されており、微粒子合成に関する特定の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
使用することができる例示的な合成ポリマーには、脂肪族ポリエステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、乳酸とグリコール酸（ＰＬＧＡ）のコポリマー、ポリカルプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、およびポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ならびに天然ポリマー、例えば、アルブミン、アルギン酸塩、および他の多糖類（デキストランおよびセルロースを含む）、コラーゲン、それらの化学誘導体（化学基（例えば、アルキル、アルキレン）の置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって通常なされる他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよびその他プロラミンおよび疎水性タンパク質、これらのコポリマーおよび混合物が含まれるが、これらに限定されない。一般に、これらの材料は、酵素加水分解またはインビボでの水への曝露、表面侵食またはバルク侵食によって分解する。
フソゲン
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソーム（例えば、小胞または細胞の一部を含む）は、例えば、膜、例えば細胞膜へのフソソームの融合を促進するために、１つ以上のフソゲンを含む。また、これらの組成物は、１つ以上のフソゲンを含むために、合成中または合成後になされる表面修飾を含んでもよく、例えば、フソゲンは、標的細胞に相補的であってもよい。表面修飾は、膜への修飾、例えば、膜への脂質またはタンパク質の挿入を含み得る。
いくつかの実施形態において、フソソームは、特定の細胞または組織タイプ（例えば、心筋細胞）を標的とするために、（例えば、細胞膜に統合された）それらの外部表面上に１つ以上のフソゲンを含む。フソゲンには、タンパク質ベース、脂質ベース、および化学ベースのフソゲンが含まれるが、これらに限定されない。フソゲンは、標的細胞の表面上のパートナーに結合し得る。いくつかの実施形態において、フソゲンを含むフソソームは、膜を標的細胞の脂質二重層に統合するであろう。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のフソゲンは、フソソームに含まれ得る。
タンパク質フソゲン
いくつかの実施形態において、フソゲンは、タンパク質フソゲン、例えば、哺乳動物タンパク質または哺乳動物タンパク質のホモログ（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有する）、ウイルスタンパク質またはウイルスタンパク質のホモログなどの非哺乳類動物タンパク質（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有する）、天然タンパク質または天然タンパク質の誘導体、合成タンパク質、その断片、そのバリアント、フソゲンまたは断片のうちの１つ以上を含むタンパク質フソゲン、およびそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、フソソーム中の脂質と標的細胞中の脂質との間の混合をもたらす。いくつかの実施形態において、フソゲンは、フソソームの内腔と標的細胞のサイトゾルとの間に１つ以上の孔の形成をもたらし、例えば、フソソームは、本明細書に記載のコネキシンであるか、またはそれを含む。
哺乳動物タンパク質
いくつかの実施形態において、フソゲンは、哺乳動物タンパク質を含んでもよい（表１を参照）。哺乳動物フソゲンの例には、ｖＳＮＡＲＥおよびｔＳＮＡＲＥなどのＳＮＡＲＥファミリーのタンパク質、シンシチン－１（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．１３．６４４２－６４５２．２００２）およびシンシチン－２などのシンシチンタンパク質、ミオメーカー（ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０２／１２３１５８、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２３１５８、ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．２０１６００９４５Ｒ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオミキサー（ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｎａｔｕｒｅ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ４９９／ｎ７４５８／ｆｕｌｌ／ｎａｔｕｒｅ１２３４３．ｈｔｍｌ、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）、ミオマージャー（ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅａｒｌｙ／２０１７／０４／０５／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１、ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ９３６１）、ＦＧＦＲＬ１（線維芽細胞成長因子受容体様１）、Ｍｉｎｉｏｎ（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／１２２６９７）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のアイソフォーム（例えば、ＵＳ６，０９９，８５７Ａに開示されている）、コネキシン４３、コネキシン４０、コネキシン４５、コネキシン３２、またはコネキシン３７などのギャップ結合タンパク質（例えば、ＵＳ２００７／０２２４１７６に開示されている、Ｈａｐ２、異種細胞間でシンシチウム形成を誘導可能な任意のタンパク質（表２を参照）、フソゲン特性を有する任意のタンパク質（表３を参照）、そのホモログ、その断片、そのバリアント、および１つ以上のタンパク質またはそれらの断片を含むタンパク質融合体が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、フソゲンは、ヒトゲノムに見られるヒト内在性レトロウイルス要素（ｈＥＲＶ）によってコードされる。追加の例示的なフソゲンは、ＵＳ６，０９９，８５７ＡおよびＵＳ２００７／０２２４１７６に開示されており、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
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Figure 2023153260000004
Figure 2023153260000005
Figure 2023153260000006
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いくつかの実施形態において、フソソームは、曲率生成タンパク質、例えば、エプシン１、ダイナミン、またはＢＡＲドメインを含むタンパク質を含む。例えば、Ｋｏｚｌｏｖｅｔ ａｌ，ＣｕｒｒＯｐ ＳｔｒｕｃＢｉｏ ２０１５、Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ ２００６、Ｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２０１１を参照のこと。
非哺乳動物タンパク質
ウイルスタンパク質
いくつかの実施形態において、フソゲンは、非哺乳動物タンパク質、例えば、ウイルスタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルスフソゲンは、クラスＩウイルス膜融合タンパク質、クラスＩＩウイルス膜タンパク質、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質、ウイルス膜糖タンパク質、または他のウイルス融合タンパク質、またはそれらのホモログ、それらの断片、それらのバリアント、または１つ以上のタンパク質もしくはそれらの断片を含むタンパク質融合体である。
いくつかの実施形態において、クラスＩウイルス膜融合タンパク質には、バキュロウイルスＦタンパク質、例えば、核多角体ウイルス（ＮＰＶ）属のＦタンパク質、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ ＭＮＰＶ（ＳｅＭＮＰＶ）Ｆタンパク質およびＬｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ ＭＮＰＶ（ＬｄＭＮＰＶ）、およびパラミクソウイルスＦタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、クラスＩＩウイルス膜タンパク質には、ダニ骨脳炎Ｅ（ＴＢＥＶ Ｅ）、セムリキ森林熱ウイルスＥ１／Ｅ２が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、クラスＩＩＩウイルス膜融合タンパク質には、ラブドウイルスＧ（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）の膜融合タンパク質Ｇ）、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｂ（例えば、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）ｇＢ））、エプスタインバーウイルス糖タンパク質Ｂ（ＥＢＶ ｇＢ）、トゴトウイルスＧ、バキュロウイルスｇｐ６４（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＮＰＶ（ＡｃＭＮＰＶ）ｇｐ６４）、およびボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）糖タンパク質（ＢＤＶ Ｇ）が含まれるが、これらに限定されない。
他のウイルスフソゲン、例えば、膜糖タンパク質およびウイルス融合タンパク質の例には、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）などのウイルス合胞体タンパク質または変異体、またはその融合タンパク質；ヒト免疫不全ウイルス１型エンベロープタンパク質（ＨＩＶ－１ ＥＮＶ）、リンパ球合胞体を形成するためにＨＩＶ結合ＬＦＡ－１からのｇｐ１２０、ＨＩＶ ｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１６０、またはＨＩＶ転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）；ウイルス糖タンパク質ＶＳＶ－Ｇ、ラブドウイルス科の水疱性口内炎ウイルスからのウイルス糖タンパク質；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タンパク質ｇＢおよびｇＨ－ｇＬ；マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）－１０Ａ１；テナガザル白血病ウイルス糖タンパク質（ＧａＬＶ）；狂犬病、モコラ、水疱性口内炎ウイルス、およびトガウイルスのＧ型糖タンパク質；マウス肝炎ウイルスＪＨＭ表面投影タンパク質；ブタ呼吸器コロナウイルススパイクおよび膜糖タンパク質；鳥類伝染性気管支炎スパイク糖タンパク質およびその前駆体；ウシ腸内コロナウイルススパイクタンパク質；麻疹ウイルスのＦおよびＨ、ＨＮまたはＧ遺伝子；イヌジステンパーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス３、シミアンウイルス４１、センダイウイルス、およびヒト呼吸器合胞体ウイルス；シャペロンタンパク質ｇＬを含むヒトヘルペスウイルス１型およびサル水痘ウイルスのｇＨ；ヒト、ウシ、およびセルコピチシンヘルペスウイルスｇＢ；フレンドマウス白血病ウイルスおよびメイソンファイザーサルウイルスのエンベロープ糖タンパク質；流行性耳下腺炎ウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ、ならびに糖タンパク質Ｆ１およびＦ２；ベネズエラウマ脳脊髄炎からの膜糖タンパク質；パラミクソウイルスＦタンパク質；ＳＩＶ ｇｐ１６０タンパク質；エボラウイルスＧタンパク質；またはセンダイウイルス融合タンパク質、またはそのホモログ、その断片、そのバリアント、および１つ以上のタンパク質またはそれらの断片を含むタンパク質融合体が含まれるが、これらに限定されない。
非哺乳動物フソゲンには、ウイルスフソゲン、そのホモログ、その断片、および１つ以上のタンパク質またはそれらの断片を含む融合タンパク質が含まれる。ウイルスフソゲンには、クラスＩフソゲン、クラスＩＩフソゲン、クラスＩＩＩフソゲン、およびクラスＩＶフソゲンが含まれる。実施形態において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ４１などのクラスＩフソゲンは、中央コイルドコイル構造を有するαヘリックスヘアピンの特徴的な三量体との特徴的な融合後構造を有する。クラスＩウイルス融合タンパク質には、中央融合後６ヘリックスバンドルを有するタンパク質が含まれる。クラスＩウイルス融合タンパク質には、インフルエンザＨＡ、パラインフルエンザＦ、ＨＩＶ Ｅｎｖ、エボラＧＰ、オルトミクソウイルスからのヘマグルチニン、パラミクソウイルスからのＦタンパク質（例えば、麻疹、（Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０、１０：３７））、レトロウイルスからのＥＮＶタンパク質、およびフィロウイルスおよびコロナウイルスのフソゲンが含まれる。実施形態において、デングＥ糖タンパク質などのクラスＩＩウイルスフソゲンは、折り畳まれてヘアピンの三量体をもたらす細長い細胞外ドメインを形成するβシートの構造的特徴を有する。実施形態において、クラスＩＩウイルスフソゲンは、中央コイルドコイルを欠いている。クラスＩＩウイルスフソゲンは、アルファウイルス（例えばＥ１タンパク質）およびフラビウイルス（例えばＥ糖タンパク質）に見られ得る。クラスＩＩウイルスフソゲンには、セムリキ森林ウイルス、シンビス、風疹ウイルス、およびデング熱ウイルスからのフソゲンが含まれる。実施形態において、水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質などのクラスＩＩＩウイルスフソゲンは、クラスＩおよびＩＩに見られる構造的特徴を組み合わせる。実施形態において、クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、αヘリックス（例えば、クラスＩウイルスフソゲンと同様にタンパク質を折り返す６ヘリックスバンドルを形成する）、およびクラスＩＩウイルスフソゲンを連想させる、両親媒性融合ペプチドをその末端に有するβシートを含む。クラスＩＩＩウイルスフソゲンは、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスに見られ得る。実施形態において、クラスＩＶウイルスフソゲンは、非エンベロープレオウイルスによってコードされる、融合関連小膜貫通（ＦＡＳＴ）タンパク質である（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００７６７，Ｎｅｓｂｉｔｔ，Ｒａｅ Ｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＦＡＳＴ ｐｒｏｔｅｉｎｓ” （２０１２）．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ．Ｐａｐｅｒ ３８８）。実施形態において、クラスＩＶウイルスフソゲンは、ヘアピンを形成しないほど十分に小さい（ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｃｅｌｌｂｉｏ－１０１５１２－１２２４２２、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００７．１２．００８）。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、パラミクソウイルスフソゲンである。いくつかの実施形態において、フソゲンは、ニパウイルスタンパク質Ｆ、麻疹ウイルスＦタンパク質、ツパイアパラミクソウイルスＦタンパク質、パラミクソウイルスＦタンパク質、ヘンドラウイルスＦタンパク質、ヘニパウイルスＦタンパク質、モルビリウイルスＦタンパク質、レスピロウイルスＦタンパク質、センダイウイルスＦタンパク質、ルブラウイルスＦタンパク質、またはアブラウイルスＦタンパク質である。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、ポックスウイルス科フソゲンである。
さらなる例示的なフソゲンは、ＵＳ９，６９５，４４６、ＵＳ２００４／００２８６８７、ＵＳ６，４１６，９９７、ＵＳ７，３２９，８０７、ＵＳ２０１７／０１１２７７３、ＵＳ２００９／０２０２６２２、ＷＯ２００６／０２７２０２、およびＵＳ２００４／０００９６０４（これらのすべての全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
他のタンパク質
いくつかの実施形態において、フソゲンは、ｐＨ依存性（例えば、虚血性傷害の場合のように）タンパク質、そのホモログ、その断片、および１つ以上のタンパク質またはそれらの断片を含むタンパク質融合体を含み得る。フソゲンは、細胞表面またはエンドソームまたは別の細胞膜結合空間における膜融合を媒介し得る。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、ＥＦＦ－１、ＡＦＦ－１、ギャップ結合タンパク質、例えば、コネキシン（Ｃｎ４３、ＧＡＰ４３、ＣＸ４３など）（ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．６ｂ０５１９１）、他の腫瘍結合タンパク質、そのホモログ、その断片、そのバリアント、および１つ以上のタンパク質またはそれらの断片を含むタンパク質融合体を含む。
タンパク質フソゲンの修飾
タンパク質フソゲンは、融合タンパク質または標的化タンパク質（例えば、血球凝集素タンパク質）のアミノ酸残基を変異させることによって再標的化され得る。いくつかの実施形態において、フソゲンは、ランダムに変異している。いくつかの実施形態において、フソゲンは、合理的に変異している。いくつかの実施形態において、フソゲンは、指向進化に供される。いくつかの実施形態において、フソゲンは、切断され、ペプチドのサブセットのみがフソソームで使用される。例えば、麻疹血球凝集素タンパク質のアミノ酸残基を変異させて、タンパク質の結合特性を変更し、融合の方向を変えることができる（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９４２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１６ ｎｏ．８，１４２７－１４３６ Ａｕｇ．２００８、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０６０、ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．７．３５５８－３５６３．２００２、ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．１７．８０１６－８０２０．２００１、ｄｏｉ：１０．１０７３ｐｎａｓ．０６０４９９３１０３）。
タンパク質フソゲンは、標的化部分を融合タンパク質または標的化タンパク質（血球凝集素タンパク質など）に共有結合させることによって再標的化され得る。いくつかの実施形態において、フソゲンおよび標的化部分は、標的化部分に連結されたフソゲンを含むキメラタンパク質の発現によって共有結合している。標的は、標的細胞に提示される任意のペプチド（例えば受容体）を含む。いくつかの例では、標的は、非標的細胞よりも標的細胞でより高いレベルで発現される。例えば、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を、フソゲンにコンジュゲートして、ｓｃＦｖ結合標的（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０６０、ＤＯＩ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１２－１１－４６８５７９、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１５１４、ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｔｈｅ．２００２．０５５０，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ １１：８１７－ ８２６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９４２、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２６３８１、ＤＯＩ １０．１１８６／ｓ１２８９６－０１５－０１４２－ｚ）を提示する細胞に対する融合活性を再指向し得る。例えば、設計されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を、フソゲンにコンジュゲートして、ＤＡＲＰｉｎ結合標的（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１３．１６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２９８、ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１５００９５６）、および異なるＤＡＲＰｉｎ（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｏ．２０１６．３）の組み合わせを提示する細胞に対する融合活性を再指向し得る。例えば、受容体リガンドおよび抗原を、フソゲンにコンジュゲートして、標的受容体（ＤＯＩ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１２．０５４、ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７６．７．３５５８－３５６３．２００２）を提示する細胞に対する融合活性を再指向し得る。標的化タンパク質はまた、例えば、抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線形抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ナノボディ、またはラクダ科ＶＨＨドメイン）、フィブロネクチンポリペプチドミニボディなどの抗原結合フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）足場、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も含み得る。タンパク質フソゲンは、標的化部分を融合タンパク質または標的化タンパク質（例えば、血球凝集素タンパク質）に非共有結合させることによって再標的化され得る。例えば、融合タンパク質を操作して、標的細胞上の抗原を標的とする抗体のＦｃ領域に結合し、抗体の標的を提示する細胞に融合活性を再指向し得る（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．１７．８０１６－８０２０．２００１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ１１９２）。変化したおよび変化していないフソゲンは、同じフソソームに提示され得る（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１４．０１．０５１）。
標的化部分は、例えば、ヒト化抗体分子、無傷のＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二重または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離されたＣＤＲまたはそれらのセットなどの抗体断片；単鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）；カメロイド抗体；マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；Ｓｍａｌｌ
Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）；単鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリン反復タンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）を含み得る。
実施形態において、再標的化フソゲンは、標的細胞上の細胞表面マーカー、例えば、タンパク質、糖タンパク質、受容体、細胞表面リガンド、アゴニスト、脂質、糖、クラスＩ膜貫通タンパク質、クラスＩＩ膜貫通タンパク質、またはクラスＩＩＩ膜貫通タンパク質に結合する。
フソソームは、標的化部分に結合した細胞に融合活性を再指するために、またはフソソームのホーミングに影響を与えるために、タンパク質フソゲンにコンジュゲートしていない標的化部分を提示し得る。
フソソームに追加された標的化部分は、異なる結合強度を有するように調節され得る。例えば、ｓｃＦｖおよび様々な結合強度を有する抗体を使用して、大量または少量の標的抗原を提示する細胞に対してフソソームの融合活性を変化させ得る（ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０１４１５－０７、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｇｔ．２０１４．２５、ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．１１５１）。例えば、異なる親和性を有するＤＡＲＰｉｎを使用して、大量または少量の標的抗原を提示する細胞に対してフソソームの融合活性を変化させ得る（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２９８）。標的化部分はまた、標的リガンド上の異なる領域を標的とするように調節され得、これは、標的を提示する細胞との融合速度に影響を与える（ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｖ００５）。
いくつかの実施形態において、タンパク質フソゲンは、免疫反応性を低下させるために、変化させることができる。例えば、タンパク質フソゲンは、ＰＥＧなどの免疫相互作用を低下させる分子で装飾され得る（ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２．９１２－９２１．２００４）。したがって、いくつかの実施形態において、フソゲンは、ＰＥＧを含み、例えば、ＰＥＧ化ポリペプチドである。免疫系によって標的となるフソゲンのアミノ酸残基は、免疫系によって認識されないように変化させ得る（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２０１４．０１．０２７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４６６６７）。いくつかの実施形態において、フソゲンのタンパク質配列は、ヒト（ヒト化）に見られるアミノ酸配列に類似するように変化させる。いくつかの実施形態において、フソゲンのタンパク質配列は、ＭＨＣ複合体にあまり強く結合しないタンパク質配列に変化させる。いくつかの実施形態において、タンパク質フソゲンは、ヒトに感染しない（およびヒトがワクチン接種を受けていない）ウイルスまたは生物に由来し、患者の免疫系がタンパク質フソゲンに対してナイーブである可能性を高める（例えば、フソゲンに対する無視できる程度の体液性または細胞媒介性の適応免疫応答である）（ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｔｈｅ．２００２．０５５０、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１００５６４１、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１１．２０９、ＤＯＩ １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１４－０２－５５８１６３）。いくつかの実施形態において、フソゲンのグリコシル化は、免疫相互作用を変化させるか、または免疫反応性を低下させるために、変化させ得る。理論に拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態において、ヒトに感染しないウイルスまたは生物に由来するタンパク質フソゲンは、患者に天然の融合標的を持たず、したがって高い特異性を有する。
脂質フソゲン
いくつかの実施形態において、フソソームは、飽和脂肪酸などの融合脂質で処理されてもよい。いくつかの実施形態において、飽和脂肪酸は、１０～１４個の炭素を有する。いくつかの実施形態において、飽和脂肪酸は、長鎖カルボン酸を有する。いくつかの実施形態において、飽和脂肪酸は、モノエステルである。
いくつかの実施形態において、フソソームは、不飽和脂肪酸で処理されてもよい。いくつかの実施形態において、不飽和脂肪酸は、Ｃ１６からＣ１８の不飽和脂肪酸を有する。いくつかの実施形態において、不飽和脂肪酸には、オレイン酸、グリセロールモノオレエート、グリセリド、ジアシルグリセロール、修飾不飽和脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
理論に拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態において、負曲率の脂質は、膜融合を促進する。いくつかの実施形態において、フソソームは、膜中に１つ以上の負曲率の脂質、例えば、外因性の負曲率の脂質を含む。実施形態において、負曲率の脂質またはその前駆体は、供給源細胞またはフソソームを含む培地に添加される。実施形態において、供給源細胞は、１つ以上の脂質合成遺伝子を発現または過剰発現するように操作される。負曲率の脂質は、例えば、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、コレステロール、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、または脂肪酸（ＦＡ）であり得る。
理論に拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態において、正曲率の脂質は、膜融合を阻害する。いくつかの実施形態において、フソソームは、膜中に１つ以上の正曲率の脂質、例えば、外因性の正曲率の脂質の減少したレベルを含む。実施形態において、このレベルは、供給源細胞における脂質合成を阻害することによって、例えば、脂質合成遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって低下する。正曲率の脂質は、例えば、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、またはモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）であり得る。
化学的フソゲン
いくつかの実施形態において、フソソームは、融合化学物質で処理されてもよい。いくつかの実施形態において、融合化学物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体である。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、二層の好ましくない分子充填をもたらす２つの膜間の局所的脱水を誘発する。いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、脂質二重層付近の領域の脱水を誘発し、細胞間の水性分子の置換を引き起こし、２つの膜間の相互作用を可能にする。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、陽性イオンである。陽性イオンのいくつかの非限定的な例には、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｌａ３＋、Ｓｒ３＋、およびＨ＋が含まれる。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、表面極性を改変することによって標的膜に結合し、水和依存性の膜間反発力を変化させる。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、可溶性脂溶性である。いくつかの非限定的な例には、オレオイルグリセロール、ジオレオイルグリセロール、トリオレオイルグリセロール、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体が含まれる。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、水溶性化学物質である。いくつかの非限定的な例には、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体が含まれる。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、小有機分子である。非限定的な例には、臭化ｎ－ヘキシルが含まれる。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、フソゲンまたは標的膜の構成、細胞生存率、またはイオン輸送特性を変化させない。
いくつかの実施形態において、化学的フソゲンは、ホルモンまたはビタミンである。いくつかの非限定的な例には、アブシジン酸、レチノール（ビタミンＡ１）、トコフェロール（ビタミンＥ）、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体が含まれる。
いくつかの実施形態において、フソソームは、アクチン、および重合アクチンを安定化する薬剤を含む。理論に拘束されることを望まないが、フソソーム内の安定化されたアクチンは、標的細胞との融合を促進し得る。実施形態において、重合アクチンを安定化する薬剤は、アクチン、ミオシン、ビオチン－ストレプトアビジン、ＡＴＰ、ニューロンのウィスコット－アルドリッチ症候群タンパク質（Ｎ－ＷＡＳＰ）、またはホルミンから選択される。例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１１ Ａｕｇ １６；２７（１６）：１００６１－７１およびＷｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６ Ａｕｇ ３１；７を参照のこと。実施形態において、フソソームは、外因性アクチン、例えば、野生型アクチン、または重合を促進する変異を含むアクチンを含む。実施形態において、フソソームは、ＡＴＰまたはホスホクレアチン、例えば、外因性ＡＴＰまたはホスホクレアチンを含む。
小分子フソゲン
いくつかの実施形態において、フソソームは、融合性小分子で処理されてもよい。いくつかの非限定的な例には、ハロタン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム、およびクロルプロマジンが含まれる。
いくつかの実施形態において、小分子フソゲンは、ミセル様凝集体中に存在し得るか、または凝集体を含み得る。
フソゲンの修飾
いくつかの実施形態において、フソゲンは、切断可能なタンパク質に結合している。場合によっては、切断可能なタンパク質は、プロテアーゼへの曝露によって切断され得る。操作された融合タンパク質は、膜貫通タンパク質の任意のドメインに結合し得る。操作された融合タンパク質は、切断可能なペプチドによって膜間空間内に位置するタンパク質ドメインに結合し得る。切断可能なペプチドは、膜間プロテアーゼのうちの１つまたはこれらの組み合わせによって切断され得る（例えば、非極性脂肪族アミノ酸－バリン、イソロイシン、またはメチオニンを必要とするＨＴＲＡ２／ＯＭＩは、Ｐ１位で好ましく、親水性残基－アルギニンは、Ｐ２およびＰ３位で好ましい）。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、親和性タグに結合している。いくつかの実施形態において、親和性タグは、フソソームの分離および単離に役立つ。いくつかの実施形態において、親和性タグは、切断可能である。いくつかの実施形態において、親和性タグは、フソゲンに非共有結合している。いくつかの実施形態において、親和性タグは、フソソーム上に存在し、フソゲンから分離している。
いくつかの実施形態において、フソゲンタンパク質は、タンパク質分解配列、例えば、ミトコンドリアまたは細胞質分解配列を含むように、当該技術分野で公知の任意の方法または本明細書に記載の任意の方法によって操作される。タンパク質分解配列、例えば、カスパーゼ２タンパク質配列（例えば、Ｖａｌ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ａｓｐ－｜－）または他のタンパク質分解配列（例えば、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ；２００５：５７１－６０７を参照のこと）、野生型タンパク質分解配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性を有する修飾タンパク質分解配列、例えば、細胞質タンパク質分解配列、例えばユビキチン、または野生型タンパク質分解配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性を有する修飾された細胞質タンパク質分解配列が含まれるが、これらに限定されない、フソゲンタンパク質が、操作され得る。一実施形態において、本発明は、例えば、野生型タンパク質分解配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性のあるタンパク質分解配列で修飾されたタンパク質、例えば、細胞質タンパク質分解配列、例えばユビキチン、または野生型タンパク質分解配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性を有する修飾された細胞質タンパク質分解配列を含む供給源またはコンドソームにおけるミトコンドリアの組成物を含む。
いくつかの実施形態において、フソゲンは、特定のタンパク質、例えば、プロテアーゼの過剰発現、例えばプロテアーゼ活性を有する操作された融合タンパク質を認識するプロテアーゼドメインで修飾され得る。例えば、ＭＭＰ、ミトコンドリア処理ペプチダーゼ、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、内膜ペプチダーゼなどのプロテアーゼまたはプロテアーゼからのプロテアーゼドメイン。
Ａｌｆｏｎｚｏ，Ｊ．Ｄ．＆ Ｓｏｌｌ，Ｄ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔＲＮＡ
ｉｍｐｏｒｔ － ｔｈｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｈａｓ ｊｕｓｔ ｂｅｇｕｎ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９０：７１７－７２２．２００９、Ｌａｎｇｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．Ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．４．２６９１－２６９９，２００５、Ｖｌｉｅｇｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｒｋｅｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ．１５（１／２）．２０１０、Ｑｕｉｒｏｓ Ｐ．Ｍ．ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ，ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖ１６，２０１５、Ｗｅｂｅｒ－Ｌｏｔｆｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ ｉｍｐｏｒｔ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌ．３０．Ｎ １．７１－７３，２０１４を参照のこと。
フソソームの生成
細胞から生成されたフソソーム
フソソームの組成物は、培養中の細胞、例えば培養された哺乳動物細胞、例えば、培養されたヒト細胞から生成され得る。細胞は、前駆細胞または非前駆（例えば、分化）細胞であり得る。細胞は、初代細胞または細胞株（例えば、本明細書に記載の哺乳動物、例えばヒトの細胞株）であり得る。実施形態において、培養細胞は、前駆細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯で形成された中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉性幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋肉前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経前駆細胞、肝芽細胞である。
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、内皮細胞、線維芽細胞、血液細胞（例えば、マクロファージ、好中球、顆粒球、白血球）、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、例えば、対象の細胞に由来する人工多能性幹細胞）、胚性幹細胞（例えば、胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児の皮膚、思春期の皮膚、血液、骨髄、脂肪組織、赤血球生成組織、造血組織からの幹細胞）、筋芽細胞、実質細胞（例えば肝細胞）、肺胞細胞、ニューロン（例えば、網膜神経細胞）前駆細胞（例えば、網膜前駆細胞、骨髄芽球、骨髄前駆細胞、胸腺細胞、減数細胞、巨核芽細胞、前巨核芽球、メラニン芽細胞、リンパ芽球、骨髄前駆細胞、正常細胞、または血管芽細胞）、前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、衛星細胞、放射線膠細胞、骨髄間質細胞、膵臓前駆細胞、内皮前駆細胞、芽球細胞）、または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＦＦ－１、ＭＲＣ－５、ＷＩ－３８、ＩＭＲ ９０、ＩＭＲ ９１、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＴ－１０８０、またはＢＪ細胞）である。
培養細胞は、上皮、結合、筋肉、または神経組織もしくは細胞、およびそれらの組み合わせからのものであり得る。フソソームは、例えば、心臓血管系（心臓、血管系）、消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、および肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体もしくは松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄系（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃、アデノイド、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、輸精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、およびそれらの組み合わせからの任意の真核生物（例えば、哺乳動物）臓器系からの培養細胞から生成され得る。実施形態において、細胞は、高度に有糸分裂した組織（例えば、上皮、胚組織、骨髄、腸陰窩などの高度に有糸分裂した健康な組織）からのものである。実施形態において、組織試料は、高度に代謝性の組織（例えば、骨格組織、神経組織、心筋細胞）である。
いくつかの実施形態において、細胞は、若いドナー、例えば、２５歳、２０歳、１８歳、１６歳、１２歳、１０歳、８歳、５歳、１歳未満のドナーからのものである。いくつかの実施形態において、細胞は、胎児組織からのものである。
いくつかの実施形態において、細胞は、対象に由来し、同じ対象、または同様の遺伝的特徴（例えば、ＭＨＣ適合）を有する対象に投与される。
特定の実施形態において、細胞は、長さが３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、または１００００ヌクレオチドを超える（例えば、長さが４，０００～１０，０００ヌクレオチド、長さが６，０００～１０，０００ヌクレオチドの）平均サイズのテロマーを有する。
フソソームは、当該技術分野で公知の方法に従って、一般的に培養された細胞から生成され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、培養のバイオマスを増殖および増加させる条件下で、「産生」期で、細胞を培養される場合、細胞の表現型を変更する（例えば、ミトコンドリアの表現型を最大化する、ミトコンドリアの数またはサイズを増加させる、酸化的リン酸化状態を増加させる）条件下で、細胞を培養する場合、２つ以上の「期」、例えば成長期において培養され得る。細胞膜上のタンパク質フソゲンまたは外因性薬剤の発現を最大にし、他の期における望ましくない融合を制限する条件下で、細胞を培養する場合、「発現」期もあり得る。
いくつかの実施形態において、フソソームは、例えば、成長期または産生期の間に同期された細胞から生成される。例えば、培養培地から血清を除去することによって（例えば、約１２～２４時間）、またはチミジン、アミノプテリン、ヒドロキシ尿素、およびシトシンアラビノシドなどのＤＮＡ合成阻害剤の培養培地で使用することによって、細胞をＧ１期に同期され得る。哺乳動物の細胞周期同期のためのさらなる方法が、知られており、例えば、Ｒｏｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：６０２－６２６（具体的にはＲｏｓｎｅｒの表１）に開示されている。
いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書に記載のフソソーム組成物の供給源として使用するための望ましい表現型または遺伝子型について評価され、任意に濃縮することができる。例えば、細胞は、例えば、膜電位（例えば、－５～－２００ｍＶの膜電位、カルジオリピン含量（例えば、総脂質の１～２０％）、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジグリセリド（ＤＡＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、または脂肪酸（ＦＡ）含有量；遺伝的品質＞８０％、＞８５％、＞９０％；フソゲンの発現または含有量；カーゴの発現または含有量のうちの１つ以上について、例えば、培養前、培養中（例えば、成長期もしくは産生期）、または培養後であるがフソソーム産生前に、評価され、任意に濃縮することができる。
いくつかの実施形態において、フソソームは、本明細書に記載のフソソーム組成物のための供給源として使用するための望ましい表現型または遺伝子型に基づいて特定され、選ばれ、または選択された細胞クローンから生成される。例えば、細胞クローンは、低いミトコンドリア変異負荷、長いテロメア長、分化状態、または特定の遺伝子シグネチャー（例えば、レシピエントに一致する遺伝子シグネチャー）に基づいて特定され、選ばれ、または選択される。
本明細書に記載のフソソーム組成物は、１つの細胞もしくは組織の供給源、または供給源の組み合わせからのフソソームからなり得る。例えば、フソソーム組成物は、異種源（例えば、動物、前述の種の細胞の組織培養）、同種異系、自己から、異なるタンパク質濃度および分布（肝臓、骨格、神経、脂肪など）をもたらす特定の細胞から、異なる代謝状態（例えば、解糖、呼吸）の細胞からフソソームを含み得る。組成物はまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、異なる代謝状態、例えば、結合または非結合のフソソームも含み得る。
いくつかの実施形態において、フソソームは、フソゲン、例えば、本明細書に記載のフソゲンを発現する供給源細胞から生成される。いくつかの実施形態において、フソゲンは、供給源細胞の膜、例えば脂質二重層膜、例えば細胞表面膜、または細胞内膜（例えばリソソーム膜）内に配置される。いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞表面膜内に配置されたフソゲンを有する供給源細胞から生成される。
いくつかの実施形態において、フソソームは、エキソソーム、微小胞、膜小胞、細胞外膜小胞、原形質膜小胞、巨大原形質膜小胞、アポトーシス体、ミト粒子、ピレノサイト、リソソーム、または他の膜封入小胞の出芽を誘導することによって生成される。
いくつかの実施形態において、フソソームの産生は、供給源細胞にとって異種または内因性であるタンパク質の発現を上方調節することを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、原形質膜からのフソソーム放出を上方調節する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ウイルス構造タンパク質、例えば、ウイルスＧａｇタンパク質、マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質、またはヌクレオカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ウイルス後期タンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ヒトゲノムによってコードされるタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＥＳＣＲＴ経路に関与する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＥＳＣＲＴ－１に関与する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、Ｔｓｇ１０１に関与する。いくつかの実施形態において、タンパク質は、フソソームに組み込まれる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、フソソームに組み込まれない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、アレスチンである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＡＲＲＤＣ１である。いくつかの実施形態において、ＴＳＧ１０１は、親細胞またはエキソソームよりもフソソーム中により高いレベルで存在する。いくつかの実施形態において、総タンパク質含有量の割合としてＴＳＧ１０１のレベルは、フソソームにおいて少なくとも約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、または０．００７％である。いくつかの実施形態において、ＡＲＲＤＣ１は、親細胞またはエキソソームよりもフソソーム中により高いレベルで存在する。いくつかの実施形態において、総タンパク質含有量の割合としてＡＲＲＤＣ１のレベルは、フソソームにおいて少なくとも約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、または０．０５％であるだろう。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＥＳＣＲＴ－１、ＷＷＰ２などのＮｅｄｄ４ファミリーユビキチンリガーゼ、またはＡｌｉｘを補充する、ＰＳＡＰ、ＰＴＡＰ、ＰＰｘＹ、またはＹＰｘＬモチーフを含有する。例えば、そのようなタンパク質は、ＵＳ９７３７４８０Ｂ２、Ｓｃｏｕｒｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２０１７、Ｚｈａｄｉｎａ ａｎｄ Ｂｉｅｎｉａｓｚ，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ２０１０に記載されており、これらのすべては、参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞核の除去を誘導することによって生成される。除核は、遺伝的、化学的などのアッセイ（例えば、アクチノマイシンＤを使用、Ｂａｙｏｎａ－Ｂａｆａｌｕｙｅｔ ａｌ．，“Ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡ ｔｏ ρ° ｃｅｌｌｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ａｕｇ １５；３１（１６）：ｅ９８を参照のこと）、機械的方法（例えば、圧搾または吸引、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｗｏ ｅｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｉｇ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．” Ａｎｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；１９（２）：７１－９を参照のこと）、またはこれらの組み合わせを使用して、実施され得る。除核とは、核の完全な除去だけでなく、細胞が核を含むが機能しないようにその典型的な位置からの核の変位も指す。
実施形態において、フソソームを作製することは、細胞ゴースト、巨大な原形質膜小胞、またはアポトーシス体を生成することを含む。実施形態において、フソソーム組成物は、細胞ゴースト、巨大な原形質膜小胞、およびアポトーシス体のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、細胞断片化を誘導することによって生成される。いくつかの実施形態において、細胞断片化は、化学的方法、機械的方法（例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離、または密度遠心分離）、凍結融解、または超音波処理）、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、方法を使用して実施され得る。
一実施形態において、フソソームは、例えば、本明細書に記載されるように、以下の方法のうちのいずれか１つ、すべて、またはこれらの組み合わせによって、フソゲンを発現する供給源細胞から生成することができる：
ｉ）ミト粒子、エキソソーム、または他の膜封入小胞の出芽を誘導すること、
ｉｉ）
ａ）遺伝的方法、
ｂ）例えばアクチノマイシンＤを使用する化学的方法、または
ｃ）例えば、圧搾または吸引などの機械的方法、のうちのいずれかまたはこれらの組み合わせによる核の不活性化、例えば除核を誘導すること、あるいは
ｉｉｉ）例えば、以下の方法のいずれかまたはそれらの組み合わせにより、細胞の断片化を誘導する：例えば、
ａ）化学的方法、
ｂ）機械的方法、例えば、遠心分離（例えば、超遠心分離または密度遠心分離）、凍結融解、または超音波処理、の方法のうちのいずれかまたはこれらの組み合わせによって細胞断片化を誘導すること。
疑念を避けるために、多くの場合、フソソームを作製するために実際に使用された供給源細胞は、フソソームが作製された後の試験に利用することができないことを理解されたい。したがって、供給源細胞とフソソームとの比較は、フソソームを作製するために実際に修飾された（例えば、除核された）供給源細胞をアッセイする必要はない。むしろ、例えば同じ培養物、同じ遺伝子型、同じ組織型、またはそれらの任意の組み合わせからの、そうでなければ供給源細胞に類似する細胞を代わりにアッセイすることができる。
フソソームの生成前の細胞への修飾
一態様では、対象、組織、または細胞の修飾などの修飾が、フソソームの生成前に、細胞に対して行われる。そのような修飾は、例えば、融合、フソゲンの発現もしくは活性、カーゴの構造もしくは機能、または標的細胞の構造もしくは機能を改善するのに効果的であり得る。
物理的修飾
いくつかの実施形態において、細胞は、フソソームを生成する前に、物理的に修飾される。例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、フソゲンは、細胞の表面に結合してもよい。
いくつかの実施形態において、細胞は、フソソームを生成する前に、化学薬剤で処理される。例えば、細胞は、化学的または脂質フソゲンが細胞の表面と非共有的または共有的に相互作用するか、または細胞の表面内に埋め込むために、化学的または脂質フソゲンで処理され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞膜中の脂質の融合特性を増強する薬剤で処理される。
いくつかの実施形態において、細胞は、フソソームの臓器、組織、または細胞型への標的化を強化する細胞表面上の合成または内因性小分子または脂質における１つ以上の共有または非共有結合部位でフソソームを生成する前に、物理的に修飾される。
実施形態において、フソソームは、増加または減少されたレベルの内因性分子を含む。例えば、フソソームは、天然に存在する供給源細胞にも天然に存在するが、フソソームよりも高いまたは低いレベルの内因性分子を含み得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、供給源細胞またはフソソーム内の外因性核酸から発現される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、供給源から単離され、供給源細胞またはフソソームに負荷されるか、またはコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内の内因性フソゲンの発現または活性を増加させるために、フソソームを生成する前に化学薬剤で処理される。一実施形態において、小分子は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。別の実施形態において、小分子は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を低下させ得る。さらに別の実施形態において、小分子は、内因性フソゲンの発現を増加させる後成的修飾因子である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、融合阻止化合物、例えばリゾホスファチジルコリンで処理された細胞から生成される。いくつかの実施形態において、フソソームは、フソゲンを切断しない解離試薬、例えば、アキュターゼで処理された細胞から生成される。
いくつかの実施形態において、細胞は、フソゲンの濃度を追加または増加させるために、フソソームを生成する前に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化因子で物理的に修飾される。
いくつかの実施形態において、細胞は、ミトコンドリア、ゴルジ装置、小胞体、細胞内小胞（リソソーム、オートファゴソームなど）のオルガネラの量を増加または減少させるか、あるいはその構造または機能を高めるために物理的に修飾される。
遺伝子修飾
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内の内因性フソゲンの発現を増加させるために、フソソームを生成する前に遺伝的に修飾される。一実施形態において、遺伝子修飾は、内因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。別の実施形態において、遺伝子修飾は、内因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を低下させ得る。いくつかの実施形態において、活性化因子または抑制因子は、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンを標的とする転写活性化因子または抑制因子に結合したヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾は、内因性フソゲン遺伝子を後成的に修飾して、その発現を増加させる。いくつかの実施形態において、後成的活性化因子は、ガイドＲＮＡによって内因性フソゲンを標的とする後成的修飾因子に結合したヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内の外因性フソゲンの発現、例えば導入遺伝子の送達を増加させるために、フソソームを生成する前に遺伝的に修飾される。いくつかの実施形態において、核酸、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡは、例えば、臓器、組織、または細胞標的化のために使用された細胞表面分子（タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量分子）の発現を増加または減少させるために、フソソームを生成する前に、細胞に移される。いくつかの実施形態において、核酸は、フソゲンの抑制因子、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ構築物を標的とする。いくつかの実施形態において、核酸は、フソゲン抑制因子の阻害剤をコードする。
いくつかの実施形態において、本方法は、フソゲンをコードする外因性核酸を供給源細胞に導入することを含む。外因性核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態において、外因性ＤＮＡは、線状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、または人工染色体であり得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、後成的に維持される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。外因性ＲＮＡは、化学的に修飾されたＲＮＡであってもよく、例えば、１つ以上の骨格修飾、糖修飾、非正準塩基、またはキャップを含み得る。骨格修飾には、例えば、ホスホロチオエート、Ｎ３’ホスホロアミダイト、ボラノホスフェート、ホスホノアセテート、チオ－ＰＡＣＥ、モルホリノホスホロアミダイト、またはＰＮＡが含まれる。糖修飾には、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’Ｆ、２’Ｆ－ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＵＮＡ、および２’－Ｏ－ＭＯＥが含まれる。非標準塩基には、例えば、５－ブロモ－Ｕ、および５－ヨード－Ｕ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ－５プロピニルピリミジン、ジフルオロトルエン、ジフルオロベンゼン、ジクロロベンゼン、２－チオウリジン、プソイドウリジン、およびジヒドロウリジンが含まれる。キャップには、例えば、ＡＲＣＡが含まれる。追加の修飾は、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ” Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ８，２４
Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，Ｐａｇｅｓ ９３７－９５４（これは、その全体が参照により組み込まれる）において論じられている。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内の外因性フソゲンの発現または活性を増加させるために、フソソームを生成する前に化学薬剤で処理される。一実施形態において、小分子は、外因性フソゲンの転写活性化因子の発現または活性を増加させ得る。別の実施形態において、小分子は、外因性フソゲンの転写抑制因子の発現または活性を低下させ得る。さらに別の実施形態において、小分子は、外因性フソゲンの発現を増加させる後成的修飾因子である。
いくつかの態様では、核酸は、修飾されたフソゲンをコードする。例えば、調節可能な融合活性、例えば、特定の細胞型、組織型、または局所微小環境活性を有するフソゲン。そのような調節可能な融合活性には、低ｐＨ、高ｐＨ、熱、赤外線、細胞外酵素活性（真核生物または原核生物）、または小分子、タンパク質、もしくは脂質の曝露による融合活性の活性化および／または開始が含まれ得る。いくつかの実施形態において、小分子、タンパク質、または脂質は、標的細胞上に提示される。
いくつかの実施形態において、細胞は、シグナル伝達経路（例えば、Ｗｎｔ／ベータカテニン経路）の発現を変化させる（すなわち、上方調節または下方調節する）ために、フソソームを生成する前に遺伝的に修飾される。いくつかの実施形態において、細胞は、対象となる遺伝子（複数可）の発現を変化させる（例えば、上方調節または下方調節する）ために、フソソームを生成する前に遺伝的に修飾される。いくつかの実施形態において、細胞は、対象となる核酸（例えば、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡ）（複数可）の発現を変化させる（例えば、上方調節または下方調節する）ために、フソソームを生成する前に遺伝的に修飾される。いくつかの実施形態において、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡは、例えば、シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸の発現を増加または減少させるために、フソソームを生成する前に、細胞に移される。いくつかの実施形態において、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸の抑制因子を標的とするか、あるいはシグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を抑制する。いくつかの実施形態において、核酸は、シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を上方調節または下方調節する転写因子をコードする。いくつかの実施形態において、活性化因子または抑制因子は、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を標的とする転写活性化因子または抑制因子に結合したヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾は、内因性シグナル伝達経路、遺伝子、または核酸をその発現に後成的に修飾する。いくつかの実施形態において、後成的活性化因子は、ガイドＲＮＡによってシグナル伝達経路、遺伝子、または核酸を標的とする後成的修飾因子に結合したヌクレアーゼ不活性ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。いくつかの実施形態において、細胞のＤＮＡは、シグナル経路（例えば、Ｗｎｔ／ベータカテニン経路）、遺伝子、または核酸の発現を変化させる（例えば、上方調節または下方調節する）ために、フソソームを生成する前に編集される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１または他の遺伝子編集技術を使用して編集される。
細胞は、組換え法を使用して、遺伝的に修飾され得る。所望の遺伝子をコードする核酸配列は、組換え法を使用して、例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによって、同じものを含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって、または同じものを含む細胞および組織から直接単離することによって、標準技術を使用して、得ることができる。あるいは、対象となる遺伝子は、クローン化するのではなく、合成的に生成することができる。
天然または合成核酸の発現は、典型的に、対象となる遺伝子をコードする核酸をプロモーターに機能的に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。このベクターは、真核生物における複製および組み込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現に有用な転写および翻訳のターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上の発現領域、例えば遺伝子で遺伝的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、外因性遺伝子（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド産物などの外因性遺伝子産物を発現することができる）および／または外因性調節核酸で遺伝的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、標的細胞に内因性である遺伝子産物をコードする外因性配列および／または内因性遺伝子の発現を調節することができる外因性調節核酸で遺伝的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、外因性遺伝子および／または外因性遺伝子の発現を調節する調節核酸で遺伝的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、外因性遺伝子および／または内因性遺伝子の発現を調節する調節核酸で遺伝的に修飾され得る。本明細書に記載の細胞は、例えば、標的細胞の内因性または外因性ゲノムの遺伝子産物に作用し得るタンパク質または調節分子をコードする様々な外因性遺伝子を発現するように遺伝的に修飾され得ることを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態において、そのような遺伝子は、フソソームに特徴を付与し、例えば、標的細胞との融合を調節する。いくつかの実施形態において、細胞は、内因性遺伝子および／または調節核酸を発現するように遺伝的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、内因性遺伝子または調節核酸は、他の内因性遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態において、細胞は、他の染色体上の内因性遺伝子および／または調節核酸のバージョンとは異なって（例えば、誘導的に、組織特異的に、構成的に、またはより高いレベルまたはより低いレベルで）発現する、内因性遺伝子および／または調節核酸を発現するように遺伝的に修飾され得る。
エンハンサーなどのプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０～１１０ ｂｐ上流の領域に位置しているが、近年、多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能性エレメントを同様に含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は頻繁に柔軟性があることがしばしばであるため、プロモーターの機能は、エレメントが互いに対して反転または移動しても保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐまで広げても、活性の低下は見られない。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化させるために、協調してまたは独立して機能し得る。
適切なプロモーターの一例は、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、そこに機能的に連結した任意のポリヌクレオチド配列を高いレベルで発現させることができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成的プロモーター配列、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるが、これらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターはまた、使用され得る。
さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合に機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、組織特異的プロモーター、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、フソゲンの発現は、フソソームが生成される前に、例えば、フソソームが生成される３、６、９、１２、２４、２６、４８、６０、または７２時間前に上方調節される。
供給源に導入される発現ベクターは、トランスフェクションまたはウイルスベクターによる感染が求められている細胞の集団から発現細胞を特定および選択するのを促進するために、選択可能なマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれか、またはその両方も含み得る。他の態様では、選択可能なマーカーは、ＤＮＡの別個の断片上で運ばれ、同時トランスフェクション手順で使用され得る。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子は両方とも、宿主細胞における発現を可能にするために適切な調節配列に隣接されてもよい。有用な選択可能マーカーには、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定するため、および調節配列の機能を評価するために使用され得る。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント供給源に存在しないか、またはレシピエント供給源によって発現されず、その発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって明らかにされるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後に適切な時間でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現系は、周知であり、既知の技術を使用して調製されても、商業的に入手してもよい。一般的に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’隣接領域を持つ構築物が、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーターによって引き起こされる転写を調整する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のタンパク質の発現を変化させるように遺伝的に修飾され得る。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の時間、例えば、供給源の発生または分化状態のために修飾され得る。一実施形態において、本発明は、融合活性、構造、または機能に影響を与える、１つ以上のタンパク質、例えば、フソゲンタンパク質または非フソゲンタンパク質の発現を変化させるように遺伝的に修飾された細胞の供給源から生成されるフソソームを含む。１つ以上のタンパク質の発現は、特定の位置（複数可）に制限されているか、供給源全体に広まっている。
いくつかの実施形態において、フソゲンタンパク質の発現は、修飾される。一実施形態において、本発明は、フソソームタンパク質の修飾された発現、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれ以上のフソゲンの発現の増加または減少を有する細胞から生成されたフソソームを含む。
いくつかの実施形態において、細胞は、フソゲンタンパク質を標的とする細胞質内酵素（例えば、プロテアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、デメチラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ）を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態において、細胞質内酵素は、翻訳後修飾を改変することによって１つ以上のフソゲンに影響を与える。タンパク質の翻訳後タンパク質修飾は、栄養素利用性および酸化還元条件、およびタンパク質間相互作用への応答性に影響を与え得る。一実施形態において、本発明は、翻訳後修飾の改変、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれ以上の翻訳後修飾の増加または減少を有するフソゲンを含むフソソームを含む。
修飾を細胞に導入する方法には、物理的、生物学的、および化学的方法が含まれる。例えば、Ｇｅｎｇ．＆ Ｌｕ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｌａｂ
ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ．１３（１９）：３８０３－２１．２０１３、Ｓｈａｒｅｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｖｅｃｔｏｒ－ｆｒｅｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１１０ ｎｏ．６．２０１３、Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１５：５４１－５５５．２０１４を参照のこと。本明細書に記載のフソソームの生成に使用するための細胞を修飾するための適切な方法には、例えば、拡散、浸透、浸透圧パルス、浸透圧ショック、低張溶解、低張透析、イオン泳動、電気穿孔、音波処理、マイクロインジェクション、カルシウム沈殿、膜インターカレーション、脂質媒介性トランスフェクション、デタージェント処理、ウイルス感染、受容体媒介性エンドサイトーシス、タンパク質伝達ドメインの使用、粒子発火、膜融合、凍結融解、機械的破壊、および濾過が含まれる。
遺伝子修飾の存在の確認には、様々なアッセイが含まれる。このようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲなどの分子生物学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）による、または本明細書のアッセイによる特定のペプチドの有無の検出などの生化学的アッセイが含まれる。
ミトコンドリア生合成への修飾
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、
（ａ）ミトコンドリア生合成の調節剤と接触した複数の供給源細胞を提供することと、例えば、複数の供給源細胞をミトコンドリア生合成の調節剤（例えば、（ｉ）ｍｔＤＮＡ増幅を調節する薬剤、（ｉｉ）ミトコンドリアの脂質合成を調節する薬剤、または（ｉｉｉ）核コード化ミトコンドリアタンパク質またはそれらの組み合わせの産生を調節する薬剤）と接触させることと、
（ｂ）複数の細胞からフソソームを分離することと、を含む。
実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、ミトコンドリア生合成を上方調節または刺激する。他の実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、ミトコンドリア生合成を下方調節または阻害する。
実施形態において、ｍｔＤＮＡ増幅を調節する薬剤は、ｍｔＤＮＡ増幅を促進または阻害する薬剤である。実施形態において、ミトコンドリア脂質合成を調節する薬剤は、ミトコンドリア脂質合成を促進または阻害する薬剤である。実施形態において、核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を調節する薬剤は、核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を促進または阻害する薬剤である。
実施形態において、ｍｔＤＮＡ増幅を促進する薬剤は、ｍｔＤＮＡ増幅に関与するタンパク質、ｍｔＤＮＡ複製に関与するタンパク質を上方調節するタンパク質、またはデオキシリボヌクレオチドもしくはその前駆体を含む。実施形態において、ミトコンドリア脂質合成を促進する薬剤は、脂質合成遺伝子である。実施形態において、核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を促進する薬剤は、転写因子である。
実施形態において、ｍｔＤＮＡ増幅を阻害する薬剤は、ｍｔＤＮＡ増幅に関与するタンパク質の阻害剤（例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、挿入剤、ｍｔＤＮＡ増幅に関与するタンパク質を下方調節するｓｉＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ増幅に関与するタンパク質を下方調節する標的化ヌクレアーゼ、ｍｔＤＮＡ増幅に関与するタンパク質の遺伝子に干渉するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子）、ｍｔＤＮＡ複製に関与するタンパク質を下方調節するタンパク質、またはデオキシリボヌクレオチドアナログもしくはその前駆体を含む。実施形態において、ミトコンドリア脂質合成を阻害する薬剤は、脂質合成遺伝子の阻害剤である。実施形態において、核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を阻害する薬剤は、転写抑制因子である。
実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節は、表４のタンパク質を調節することを含む。実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節は、直接制御遺伝子（例えば、マスターレギュレーターまたはＤＮＡ結合因子）の上方調節、下方調節、刺激、または阻害を調節することを含む。実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節は、表４の直接制御遺伝子（例えば、表４のマスターレギュレーターまたは表４のＤＮＡ結合因子）を上方調節、下方調節、刺激、または阻害することを含む。実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節は、間接制御遺伝子（例えば、活性化因子または阻害剤）を上方調節、下方調節、刺激、または阻害することを含む。実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節は、表４の間接制御遺伝子（例えば、表４の活性化因子または表４の阻害剤）を上方調節、下方調節、刺激、または阻害することを含む。実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節は、代謝産物、例えば、表４の代謝産物を上方調節または下方調節することを含む。
実施形態において、ミトコンドリア脂質の合成を促進または阻害する薬剤は、ミトコンドリア膜中の脂質の割合の変化を引き起こすことができるか、またはそれをもたらす。実施形態において、ミトコンドリア脂質の合成を調節する薬剤は、ミトコンドリア脂質：カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ＣＤＰ－ジアシルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、コレステロール、またはセラミド、のうちの１つの割合、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の増加または減少をもたらす。
いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または３つすべてを提供することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの２つ、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）、（ｉ）および（ｉｉｉ）、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を提供することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ミトコンドリア生合成を刺激するのに十分なレベルで、（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のうちの１つ、２つ、または３つすべてのうちの１つを提供することを含む。
実施形態において、本方法は、ｍｔＤＮＡ増幅を（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）調節する（例えば、刺激する）ことを含む。実施形態において、ｍｔＤＮＡ増幅の調節は、脂質合成および核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生の一方または両方の検出可能な調節（例えば、刺激）なしに起こる。実施形態において、本方法は、脂質合成を（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）調節する（例えば、刺激する）ことを含む。実施形態において、調節は、ｍｔＤＮＡ増幅および核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生の一方または両方の検出可能な調節（例えば、刺激）なしに起こる。実施形態において、本方法は、核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）調節する（例えば、刺激する）ことを含む。実施形態において、核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生の調節は、脂質合成およびｍｔＤＮＡ増幅の一方または両方の検出可能な調節（例えば、刺激）なしに起こる。
実施形態において、本方法は、ｍｔＤＮＡ増幅および脂質合成を（例えば、それぞれ独立して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）調節する（例えば、刺激する）ことを含む。実施形態において、ｍｔＤＮＡ増幅および脂質合成の調節は、核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生の検出可能な調節（例えば、刺激）なしに起こる。実施形態において、本方法は、ｍｔＤＮＡ増幅および核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を（例えば、それぞれ独立して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）調節する（例えば、刺激する）ことを含む。実施形態において、ｍｔＤＮＡ増幅の調節および核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生の調節は、脂質合成の検出可能な調節（例えば、刺激）なしに起こる。実施形態において、本方法は、脂質合成および核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を（例えば、それぞれ独立して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）調節する（例えば、刺激する）ことを含む。実施形態において、脂質合成および核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生は、ｍｔＤＮＡ増幅の検出可能な調節（例えば、刺激）なしに起こる。
実施形態において、本方法は、ｍｔＤＮＡ増幅、脂質合成、および核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生を（例えば、それぞれ独立して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）調節する（例えば、刺激する）ことを含む。
実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、ミトコンドリア生合成の刺激因子である。実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、褐色化の刺激因子である。実施形態において、褐色化の刺激因子は、ＰＧＣ１ａである。実施形態において、褐色化の刺激因子は、キノン、ＦＧＦ２１、イリシン、アペリン、またはイソプロテレノールである。実施形態において、複数の供給源細胞または複数の供給源細胞に由来するフソソーム組成物は、例えば、Ｓｐａｅｔｈｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ “Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏｗｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．” ｉｎ： ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．３０，Ｉｓｓｕｅ １，ｐｐ．８１－９２，２０１６に記載されるように、ＵＣＰ１発現のためのＥＬＩＳＡによって、褐色化についてアッセイされる。
実施形態において、複数の供給源細胞または複数に由来するフソソーム組成物は、ｍｔＤＮＡ増幅、ミトコンドリア脂質合成、または核コード化ミトコンドリアタンパク質の産生、またはそれらの任意の組み合わせの存在またはレベルについてアッセイされる。
供給源細胞は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分な量および時間（例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれ以上）、ミトコンドリア生合成の調節剤と接触させられ得る。ミトコンドリア生合成のこのような調節剤は、例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｔｈａｔ Ｉｎｄｕｃｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｕｔｅ ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｊｍｅｄｃｈｅｍ．６ｂ００６６９に記載されている。実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、成長期および／または産生期の間に供給源細胞培養に加えられる。実施形態において、ミトコンドリア細胞発生の調節剤は、供給源細胞培養物が所定の標的密度を有するときに加えられる。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分な天然産物またはその合成等価体から抽出された薬剤である。そのような薬剤の例には、レスベラトロール、エピカテキン、クルクミン、フィトエストロゲン（例えば、ゲニステイン、ダイゼイン、ピロロキノリン、キノン、クメストロール、およびエクオール）が含まれる。
別の実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞、供給源細胞のミトコンドリアにおけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分な代謝産物、例えば、一次または二次代謝産物である。このような代謝産物、例えば、一次代謝産物には、エタノール、乳酸などのアルコールが含まれ、ある特定のアミノ酸および二次代謝産物には、一次代謝産物の修飾により生成される有機化合物が含まれ、“Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ
Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．” Ｂｏｕｎｄｌｅｓｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂｏｕｎｄｌｅｓｓ，２６ Ｍａｙ，２０１６に記載されている。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞、または供給源細胞のミトコンドリア生合成を増加させるのに十分なエネルギー源、例えば、糖、ＡＴＰ、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２としてのレドックス補因子である。そのようなエネルギー源、例えば、ピルベートまたはパルミテートは、Ｍｅｈｌｍａｎ，Ｍ．Ｅｎｅｒｇｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７２に記載されている。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分な転写因子調節剤である。そのような転写因子調節剤の例には、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、およびシグリタゾン）、エストロゲン（例えば、１７β－エストラジオール、プロゲステロン）、およびエストロゲン受容体アゴニスト；ＳＩＲＴ１活性化因子（例えば、ＳＲＴ１７２０、ＳＲＴ１４６０、ＳＲＴ２１８３、ＳＲＴ２１０４）が含まれる。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分なキナーゼ調節剤である。例には、ＡＩＣＡＲ、メトホルミン、フェンホルミン、Ａ７６９６６２などのＡＭＰＫおよびＡＭＰＫ活性化剤、およびＵ０１２６、トラメチニブなどのＥＲＫ１／２阻害剤が含まれる。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分な環状ヌクレオチド調節剤である。例には、ＮＯ－ｃＧＭＰ－ＰＫＧ経路の調節剤（例えば、ニトロプルシドナトリウムなどの酸化窒素（ＮＯ）ドナー、（±）Ｓ－ニトロソ－Ｎ－アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、ジエチルアミンＮＯＮＯａｔｅ（ＤＥＡ－ＮＯＮＯａｔｅ）、ジエチレントリアミン－ＮＯＮＯａｔｅ（ＤＥＴＡ－ＮＯＮＯａｔｅ）；シナシグアト、リオシグアト、およびＢＡＹ ４１－２２７２などのｓＧＣ刺激剤および活性化剤；およびザプリナスト、シルデナフィル、ウデナフィル、タダラフィル、バルデナフィルなどのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤、およびｃＡＭＰ－ロリプラムなどのホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害剤などのＰＫＡ－ＣＲＥＢ軸。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分なＧＰＣＲリガンドなどのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の調節剤である。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分なカンナビノイド－１受容体の調節剤である。例には、タラナバントおよびリモノバントが含まれる。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分な５－ヒドロキシトリプタミン受容体の調節剤である。例には、アルファ－メチル－５－ヒドロキシトリプタミン、ＤＯＩ、ＣＰ８０９１０１、ＳＢ２４２０８４、フルオキセチンなどのセロトニン再取り込み阻害剤、アルファ－メチル５ＨＴ、１－（２，５－ジメトキシ－４－ヨードフェニル）－２－アミノプロパン、ＬＹ３３４３７０、およびＬＹ３４４８６４が含まれる。
一実施形態において、ミトコンドリア生合成の調節剤は、供給源細胞におけるミトコンドリア生合成を増加させるのに十分なベータアドレナリン受容体の調節剤である。例には、エピネフリン、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、メトプロロール、ホルモテロール、フェノテロール、およびプロカテロールが含まれる。
一実施形態において、供給源細胞は、ミトコンドリア生合成の転写活性化因子、例えば、転写因子、またはＰＧＣ１αなどの転写共活性化因子を発現するように、修飾、例えば、遺伝的に修飾される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＰＧＣ１αを発現する（例えば、内因性を過剰発現する、または外因性のＰＧＣ１αを発現する）。
表４．ミトコンドリア生合成の転写制御例えば、Ｓｃａｒｐｕｌｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ” Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｖｏｌｕｍｅ ２３，Ｉｓｓｕｅ ９，ｐ４５９－４６６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２、Ｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ．“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．” Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９；７１：１７７－２０３．Ｓａｎｔｒａ ｅｔ ａｌ．，“Ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｄｕｃｅｓ Ｄｅｌｅｔｅｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＤＮＡｓ ｉｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ” Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４ Ｎｏｖ；５６（５）：６６２－９．Ｋａｎａｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｉ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｅｉｇｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ” Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．２０１６ Ｍａｙ；３９（３）：４１５－２６を参照されたく、これらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2023153260000008
Figure 2023153260000009
Figure 2023153260000010
フソソームの修飾
一態様では、修飾は、フソソームに対して行われる。そのような修飾は、例えば、標的化、機能、または構造を改善するのに効果的であり得る。
いくつかの実施形態において、フソソームは、膜の表面に非共有結合または共有結合し得るフソゲン、例えば本明細書に記載の化学フソゲンで処理される。いくつかの実施形態において、フソソームは、膜に非共有結合または共有結合またはそれ自体を埋め込むことができるフソゲン、例えば、タンパク質または脂質フソゲンで処理される。
いくつかの実施形態において、リガンドは、フソソームの表面上に存在する官能化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリル、およびヒドロキシル）を介してフソソームの表面にコンジュゲートされる。
そのような反応性基には、マレイミド基が含まれるが、これに限定されない。一例として、フソソームは、ＤＳＰＥ－ＭａＬ－ＰＥＧ２０００などであるが、これに限定されない、マレイミドでコンジュゲートしたリン脂質を含むように合成され得る。
いくつかの実施形態において、合成または天然の小分子または脂質は、フソソームの表面に共有結合しても、共有結合しなくてもよい。いくつかの実施形態において、フソソーム中の膜脂質は、融合特性を促進、誘導、または増強するために修飾され得る。
いくつかの実施形態において、フソソームは、修飾タンパク質をロードする（例えば、新規機能を可能にする、翻訳後修飾を改変する、ミトコンドリア膜および／またはミトコンドリア膜タンパク質に結合する、異種機能を有する切断可能なタンパク質を形成する、タンパク質分解を目的とするタンパク質を形成する、薬剤の位置およびレベルを分析する、または担体として薬剤を送達する）ことによって修飾される。一実施形態において、本発明は、修飾タンパク質をロードするフソソームを含む。
いくつかの実施形態において、外因性タンパク質は、フソソームに非共有結合している。タンパク質は、放出のために切断可能なドメインを含み得る。一実施形態において、本発明は、切断可能なドメインを有する外因性タンパク質を含むフソソームを含む。
いくつかの実施形態において、フソソームは、タンパク質分解を目的とするタンパク質で修飾される。様々なプロテアーゼが、特定のタンパク質のアミノ酸配列を認識し、分解のためのタンパク質を標的とする。これらのタンパク質分解酵素は、タンパク質分解配列を有するタンパク質を特異的に分解するために使用することができる。一実施形態において、本発明は、１つ以上のタンパク質分解酵素の調節したレベル、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％またはそれ以上のタンパク質分解酵素の増加または減少を含むフソソームを含む。
本明細書に記載されるように、非フソゲン添加剤をフソソームに添加して、それらの構造および／または特性を修飾することができる。例えば、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかを膜に加えて、構造を安定させ、内部カーゴの漏れを防ぐことができる。さらに、膜は、水素化卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびリン酸ジセチルから調製することができる。（例えば、総説についてはＳｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、フソソームは、特定の細胞または組織タイプ（例えば、心筋細胞）を標的とするために、外面上に１つ以上の標的化グループ（例えば、標的化タンパク質）を含む。これらの標的化グループには、受容体、リガンド、抗体などが含まれるが、これらに限定されない。これらの標的化グループは、標的細胞の表面上でパートナーと結合する。実施形態において、標的化タンパク質は、本明細書に記載の標的細胞、例えば、皮膚細胞、心筋細胞、肝細胞、腸細胞（例えば、小腸の細胞）、膵臓細胞、脳細胞、前立腺細胞、肺細胞、結腸細胞、または骨髄細胞の細胞表面マーカーに特異的である。
いくつかの実施形態において、標的化タンパク質は、標的細胞上の細胞表面マーカーに結合する。実施形態において、細胞表面マーカーは、タンパク質、糖タンパク質、受容体、細胞表面リガンド、クラスＩ膜貫通タンパク質、クラスＩＩ膜貫通タンパク質、またはクラスＩＩＩ膜貫通タンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、標的化部分は、フソゲンとは別個のポリペプチドであるポリペプチドに含まれる。いくつかの実施形態において、標的化部分を含むポリペプチドは、膜貫通ドメインおよび細胞外標的化ドメインを含む。実施形態において、細胞外標的化ドメインは、ｓｃＦｖ、ＤＡＲＰｉｎ、ナノボディ、受容体リガンド、または抗原を含む。いくつかの実施形態において、細胞外標的化ドメインは、抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線形抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、またはラクダ科ＶＨＨドメイン）、フィブロネクチンポリペプチドミニボディなどの抗原結合フィブロネクチンタイプＩＩＩ（Ｆｎ３）足場、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソームは、診断剤で機能化されている。診断剤の例には、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピューター支援断層撮影（ＣＡＴ）、単一光子放出コンピューター断層撮影、Ｘ線、蛍光透視法、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、およびコントラスト剤で使用される市販の造影剤が含まれるが、これらに限定されない。ＭＲＩにおいてコントラスト剤として使用するのに適した材料の例には、ガドリニウムキレート、ならびに鉄、マグネシウム、マンガン、銅、およびクロムが含まれる。
官能基をフソソームに導入する別の例は、調製後、ホモまたはヘテロ二官能性架橋剤でフソソームおよびリガンドを直接架橋することによるものである。この手順では、適切な化学およびクラスの架橋剤（本明細書に論じられるように、ＣＤＩ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒドなど）、または調製後のフソソーム表面の化学修飾を介してリガンドをフソソーム表面に結合する任意の他の架橋剤を使用し得る。これには、脂肪酸、脂質、または官能性の安定剤などの両親媒性分子を受動的に吸着して、フソソーム表面に付着させ、それによってリガンドに係留するための官能末端基を導入するプロセスも含まれる。
カーゴ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソームは、カーゴ、例えば、細胞内カーゴを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソームは、カーゴ、例えば治療剤、例えば、内因性治療剤または外因性治療剤を含む。
いくつかの実施形態において、カーゴは、フオソームが由来する細胞において自然に発現されない。いくつかの実施形態において、カーゴは、フソソームが由来する細胞において自然に発現される。いくつかの実施形態において、カーゴは、フソソームが由来する細胞において自然に発現される野生型核において自然に発現される野生型の変異体である。
いくつかの実施形態において、カーゴは、フソソームが由来する細胞における発現（例えば、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションを介して導入されるＤＮＡまたはｍＲＮＡからの発現）を介してフソソームにロードされる。いくつかの実施形態において、カーゴは、ゲノムに組み込まれた、またはエピソームに維持されたＤＮＡから発現される。いくつかの実施形態において、カーゴの発現は、構成的である。いくつかの実施形態において、カーゴの発現が、誘導される。いくつかの実施形態において、カーゴの発現が、フソソームを生成する直前に誘導される。いくつかの実施形態において、カーゴの発現が、フソゲンの発現と同時に誘導される。
いくつかの実施形態において、カーゴは、フソソーム自体またはフソソームが由来する細胞へのエレクトロポレーションを介してフソソームにロードされる。いくつかの実施形態において、カーゴは、フソソーム自体またはフソソームが由来する細胞へのトランスフェクションを介して（例えば、カーゴをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの）フソソームにロードされる。
いくつかの態様では、本開示は、
（ｉ）１つ以上のコンドリソーム（例えば、国際出願、ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１に記載されるように）、ミトコンドリア、オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、リソソーム、核、細胞膜、細胞質、小胞体、リボソーム、液胞、エンドソーム、スプライセオソーム、ポリメラーゼ、カプシド、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、筋原線維、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、およびオルガネラのネットワーク）、または除核細胞、例えば、前述のいずれかを含む除核細胞、ならびに（ｉｉ）フソゲン、例えば、ミオメーカータンパク質、を含むフソソーム組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。
実施形態において、フソゲンは、ミトコンドリアまたはコンドリソームの外部の脂質二重層に存在する。実施形態において、コンドリソームは、例えば、国際出願、ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１に記載されるように、特性のうちの１つ以上を有し、これは、実施例および本発明の概要を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、カーゴは、１つ以上の核酸配列、１つ以上のポリペプチド、核酸配列および／またはポリペプチドの組み合わせ、１つ以上のオルガネラ、ならびにそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、カーゴは、１つ以上の細胞成分を含んでもよい。いくつかの実施形態において、カーゴは、１つ以上の細胞質成分および／または核成分を含む。
いくつかの実施形態において、カーゴは、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、タンパク質コードＤＮＡ、遺伝子、オペロン、染色体、ゲノム、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ウイルスゲノム、イントロン、エクソン、修飾ＤＮＡ、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、修飾ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｔｍＲＮＡ（トランスファーメッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ ＲＮＡ（ｍＲＮＡトランススプライシングＲＮＡ）、ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、ＴＥＲＣ（テロメラーゼＲＮＡ成分）、ａＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）、ｃｉｓ－ＮＡＴ（シス天然アンチセンス転写物）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖ノンコーディングＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（短ヘアピンＲＮＡ）、ｔａｓｉＲＮＡ（トランス作用ｓｉＲＮＡ）、ｅＲＮＡ（エンハンサーＲＮＡ）、衛星ＲＮＡ、ｐｃＲＮＡ（タンパク質コーディングＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ＲＮＡｉ（干渉ＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡ（環状ＲＮＡ）、リプログラミングＲＮＡ、アプタマー、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、野生型核酸である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、変異体核酸である。いくつかの実施形態において、核酸は、複数の核酸配列の融合またはキメラである。
いくつかの実施形態において、フソソームが由来する細胞中のフソソームまたはＤＮＡは、遺伝子編集技術、例えば、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１を使用して、または異なる標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））を使用して、遺伝子変異を修正するために編集される。いくつかの実施形態において、遺伝子変異は、対象における疾患に関連している。ＤＮＡの編集の例には、小さな挿入／欠失、大きな欠失、テンプレートＤＮＡによる遺伝子修正、またはＤＮＡの大きな挿入が含まれる。いくつかの実施形態において、遺伝子編集は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）により達成される。いくつかの実施形態において、編集は、ノックアウトである。いくつかの実施形態において、編集は、ノックインである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡの両方の対立遺伝子が、編集される。いくつかの実施形態において、単一の対立遺伝子が、編集される。いくつかの実施形態において、複数の編集が、行われる。いくつかの実施形態において、フソソームまたは細胞は、対象に由来するか、または対象と遺伝的に一致するか、または（例えば、同様のＭＨＣを有する）対象と免疫学的に適合している。
いくつかの実施形態において、カーゴは、核酸を含み得る。例えば、カーゴは、内在性タンパク質の発現を増強するＲＮＡ、または内在性タンパク質のタンパク質発現を阻害するｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡを含み得る。例えば、内因性タンパク質は、標的細胞の構造または機能を調節し得る。いくつかの実施形態において、カーゴは、標的細胞の構造または機能を調節する人工タンパク質をコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、カーゴは、標的細胞の構造または機能を調節する転写活性化因子を標的とする核酸である。
いくつかの実施形態において、カーゴは、ポリペプチド、例えば、酵素、構造ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、調節ポリペプチド、輸送ポリペプチド、感覚ポリペプチド、モーターポリペプチド、防御ポリペプチド、貯蔵ポリペプチド、転写因子、抗体、サイトカイン、ホルモン、異化ポリペプチド、タンパク同化ポリペプチド、タンパク質分解ポリペプチド、代謝ポリペプチド、キナーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、酵素調節剤ポリペプチド、タンパク質結合ポリペプチド、脂質結合ポリペプチド、膜融合ポリペプチド、細胞分化ポリペプチド、後成的ポリペプチド、細胞死ポリペプチド、核輸送ポリペプチド、核酸結合ポリペプチド、再プログラミングポリペプチド、ＤＮＡ編集ポリペプチド、ＤＮＡ修復ポリペプチド、ＤＮＡ組換えポリペプチド、トランスポザーゼポリペプチド、ＤＮＡ組み込みポリペプチド、標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｃａｓ９およびそのホモログ）、リコンビナーゼ、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質をプロテアソームに局在化させることによって、分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、タンパク質は、野生型タンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、変異体タンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、融合またはキメラタンパク質である。
いくつかの実施形態において、カーゴには、小分子、例えば、イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｃｌ－、Ｆｅ２＋）、炭水化物、脂質、反応性酸素種、反応性窒素種、イソプレノイド、シグナル伝達分子、ヘム、ポリペプチド補因子、電子受容化合物、電子供与化合物、代謝産物、リガンド、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態において、小分子は、細胞内の標的と相互作用する医薬品である。いくつかの実施形態において、小分子は、分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、小分子は、タンパク質をプロテアソームに局在化させることによって、分解のために細胞内のタンパク質を標的とする。いくつかの実施形態において、その小分子は、キメラ分子を標的とするタンパク質分解（ＰＲＯＴＡＣ）である。
いくつかの実施形態において、カーゴには、タンパク質、核酸、または代謝産物の混合物、例えば、複数のポリペプチド、複数の核酸、複数の小分子；核酸、ポリペプチド、および小分子の組み合わせ；リボ核タンパク質複合体（例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体）；複数の転写因子、複数の後成的因子、再プログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４）；複数の調節ＲＮＡ；ならびにそれらの任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態において、カーゴには、１つ以上のオルガネラ、例えば、コンドソーム、ミトコンドリア、リソソーム、核、細胞膜、細胞質、小胞体、リボソーム、液胞、エンドソーム、スプライセオソーム、ポリメラーゼ、カプシド、アクロソーム、オートファゴソーム、中心小体、グリコソーム、グリオキシソーム、ヒドロゲノソーム、メラノソーム、マイトソーム、筋原線維、刺胞、ペルオキシソーム、プロテアソーム、小胞、ストレス顆粒、オルガネラのネットワークス、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態において、カーゴは、フソソームまたは細胞膜で濃縮されている。いくつかの実施形態において、カーゴは、ペプチドシグナル配列を介して膜を標的とすることによって濃縮されている。いくつかの実施形態において、カーゴは、膜結合タンパク質、脂質、または小分子と結合することによって濃縮されている。いくつかの実施形態において、カーゴは、膜結合タンパク質、脂質、または小分子に共有結合する。いくつかの実施形態において、共有結合は、プロテアーゼによって切断可能である。いくつかの実施形態において、カーゴは、膜結合タンパク質、脂質、または小分子との非共有相互作用を介して結合する。いくつかの実施形態において、膜タンパク質は、フソゲンである。いくつかの実施形態において、カーゴは、二次メディエーターを介して濃縮されている。例えば、いくつかの実施形態において、カーゴは、中間タンパク質によって結合される核酸であり、中間タンパク質は、膜結合タンパク質、脂質、または小分子に結合し、それにより核酸カーゴを膜に局在化させる。いくつかの実施形態において、核酸と中間タンパク質の間の相互作用は、共有結合または非共有結合である。いくつかの実施形態において、中間タンパク質と膜結合タンパク質、脂質、または小分子の間の相互作用は、共有結合性、またはプロテアーゼによって共有結合性および切断可能であるか、または非共有結合性である。例えば、ＵＳ２０１７０１７５０８６Ａ１およびＵＳ９８１６０８０Ｂ２は、カーゴタンパク質の断片と膜結合タンパク質の間の非共有結合によるカーゴタンパク質の濃縮について説明している。いくつかの実施形態において、カーゴは、膜結合タンパク質、脂質、または小分子で二量体化することによって濃縮されている。いくつかの実施形態において、カーゴは、キメラ（例えば、キメラタンパク質、または核酸）であり、膜結合タンパク質、脂質、または小分子との結合または二量体化を媒介するドメインを含む。対象となる膜結合タンパク質には、例えば、細胞膜（すなわち、膜結合ドメイン）に安定して結合する、例えば、結合する、組み込む、ドメインを有する任意のタンパク質が含まれるが、これらに限定されず、そのようなドメインは、ミリストイル化ドメイン、ファルネシル化ドメイン、膜貫通ドメインなどを含み得る。対象となる特定の膜結合タンパク質には、ミリストイル化タンパク質、例えば、ｐ６０ ｖ－ｓｒｃなど；ファルネシル化タンパク質、例えば、Ｒａｓ、Ｒｈｅｂ、およびＣＥＮＰ－Ｅ、Ｆ、ホスファチジルセリンへの結合によるタンパク質結合特異的脂質二重層成分、例えばアネキシンＶ、細胞膜二重層の脂質成分など；膜アンカータンパク質；膜貫通タンパク質、例えば、トランスフェリン受容体およびそれらの一部；ならびに膜融合タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、膜結合タンパク質は、第１の二量体化ドメインを含む。第１の二量体化ドメインは、例えば、カーゴの第２の二量体化ドメインに直接結合するか、または二量体化メディエーターを介して第２の二量体化ドメインに結合するドメインであり得る。いくつかの実施形態において、カーゴは、第２の二量体化ドメインを含む。第２の二量体化ドメインは、例えば、膜結合タンパク質の第１の二量体化ドメインと直接または二量化メディエーターを介して二量体化する（例えば、非共有結合相互作用により直接またはメディエーターを通して安定して結合する）ドメインであり得る。二量体化ドメインに関して、これらのドメインは、直接または二量体化メディエーターを介して結合事象に関与するドメインであり、この結合事象は、所望の多量体、例えば、膜結合タンパク質および標的タンパク質の二量体の複合体をもたらす。第１および第２の二量体化ドメインは、アミノ酸の同じ配列で構成されるようなホモ二量体であっても、アミノ酸の異なる配列で構成されるようなヘテロ二量体であってもよい。対象となるドメインには、ＳＨ２ドメイン、Ｐａｚドメイン、ＲＩＮＧドメイン、転写活性化因子ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、酵素触媒ドメイン、酵素調節ドメイン、酵素サブユニット、定義された細胞位置への局在化のためのドメイン、局在化ドメインのための認識ドメイン、ＵＲＬ：ｐａｗｓｏｎｌａｂ．ｍｓｈｒｉ．ｏｎ．ｃａ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｏｐｔｉｏｎ＝ｃｏｍ＿ｃｏｎｔｅｎｔ＆ｔａｓｋ＝ｖｉｅｗ＆ｉｄ＝３０＆Ｉｔｅｍｉｄ＝６３／に列挙されるドメインなど、対象となる特定のタンパク質に特異的に結合するリガンド（例えば、タンパク質：タンパク質相互作用ドメイン）などの標的生体分子のリガンドが含まれますが、これらに限定されない場合、二量体化ドメインは、異なり得る。いくつかの実施形態において、第１の二量体化ドメインは、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ）に結合し、第２の二量体化ドメインは、カーゴ上に存在する核酸配列である（例えば、第１の二量体化ドメインは、ＭＳ２であり、第２の二量体化ドメインは、ＭＳ２ ＲＮＡの高親和性結合ループである）。二量化メディエーターとして機能する任意の便利な化合物が、使用され得る。天然に存在する物質および合成物質の両方を含む多種多様な化合物は、二量化メディエーターとして使用され得る。二量体化メディエーターを選択するための適用可能かつ容易に観察可能なまたは測定可能な基準には、（Ａ）リガンドが生理学的に許容される（すなわち、それが使用される細胞または動物に対して過度の毒性を欠いている）、（Ｂ）適切な治療用量範囲を有する、（Ｃ）必要に応じて、細胞膜および他の膜を通過することができる（場合によっては、細胞の外側から二量体化を媒介可能であり得る）、ならびに（Ｄ）所望の適用のために適切な親和性で設計されているキメラタンパク質の標的ドメインに結合する、が含まれる。第１の望ましい基準は、この化合物の二量化メディエーター活性がなかったら、比較的生理学的に不活性であることである。場合によっては、リガンドは、非ペプチドおよび非核酸であろう。さらなる二量体化ドメインは、例えば、ＵＳ２０１７００８７０８７およびＵＳ２０１７０１３０１９７（これらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）において記載されている。
コンドリソームの特徴
一態様では、フソソーム、例えば、フソソームの薬学的組成物、またはフソソームの組成物は、ミトコンドリアの細胞源に由来する単離されたコンドリソーム（例えば、コンドリソーム調製物）を含む。
別の態様では、フソソーム、例えば、フソソームの薬学的組成物、またはフソソームの組成物は、ミトコンドリアの細胞源に由来する単離された修飾コンドリソーム（例えば、修飾コンドリソーム調製物）を含む。
別の態様では、フソソーム、例えば、フソソームの薬学的組成物、またはフソソームの組成物は、外因性タンパク質を発現するコンドリソーム（例えば、コンドリソーム調製物）を含む。
本明細書に開示されるコンドリソーム（例えば、コンドリソーム調製物）、方法、および使用を含む、さらなる特徴および実施形態は、以下のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、コンドリソーム（または組成物中のコンドリソーム）は、以下の特徴のうちの１つ以上（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたはそれ以上、例えばすべて）を有する：
組成物が２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満）を示す外側のコンドリソーム膜の完全性が、還元シトクロムｃの添加後、酸素消費速度において状態４の速度を超えて増加する、
表５に記載されたすべての遺伝子座について、コンドリソーム調製物の「遺伝子の質」は、意味する、配列決定の割合が、野生型対立遺伝子へのマッピングを読み取ることを意味する場合、遺伝子の質が、８０％超、例えば、８５％超、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超である、
グルタメート／マレートのＲＣＲが、１～１５、例えば、２～１５、５～１５、２～１０、２～５、１０～１５の３／２、
グルタメート／マレートのＲＣＲが、１～３０、１～２０、２～２０、５～２０、３～１５、１０～３０の３／４ｏ、
スクシナート／ロテノンのＲＣＲが、１～１５、２～１５、５～１５、１～１０、１０～１５の３／２、
スクシナート／ロテノンのＲＣＲが、１～３０、１～２０、２～２０、５～２０、３～１５、１０～３０の３／４ｏ、
パルミトイルカルニチンおよびマレートのＲＣＲが、１～１０（例えば、１～５）の３／２状態３／２状態の呼吸制御比（ＲＣＲの３／２）、
カルジオリピン含有量０．０５～２５（０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、５～２５、１～２５、１０～２５、１５～２５）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ総脂質、
ゲノム濃度０．００１～２（例えば、０．００１～１、０．０１～１、０．０１～０．１、０．０１～０．０５、０．１～０．２）ｍｔＤＮＡ ｕｇ／ｍｇタンパク質、または
１０００超（例えば、１，５００超、２０００超、２，５００超、３，０００超、４，０００超、５０００超、１０，０００超、２５，０００超、５０，０００超、１００，０００超、２００，０００超、５００，０００）のｍｔＤＮＡ／核ＤＮＡの相対比。
いくつかの実施形態において、コンドリソーム（または組成物中のコンドリソーム）は、以下の特徴のうちの１つ以上（２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上）を有する：
組成物中のコンドリソームは、１５０～１５００ｎｍ、例えば２００～１２００ｎｍ、例えば５００～１２００ｎｍ、例えば１７５～９５０ｎｍの中間の平均サイズを有する、
組成物中のコンドリソームは、１．１～６、例えば１．５～５の多分散性（Ｄ９０／Ｄ１０）を有する、実施形態において、培養細胞源（例えば、培養線維芽細胞）からの組成物中のコンドリソームは、２～５、例えば２．５～５の多分散性（Ｄ９０／Ｄ１０）を有する、
組成物が２０％未満（例えば、１５％未満、１０％未満、５％未満、４＾未満、３％未満、２％未満、１％未満）を示す外側のコンドリソーム膜の完全性が、還元シトクロムｃの添加後、酸素消費速度において状態４の速度を超えて増加する、
１～８ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質、例えば３～７ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質、１～５ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質の複合体Ｉレベル、実施形態において、培養細胞供給源（例えば、培養線維芽細胞）からの調製物のコンドリソームは、１～５ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質の複合体Ｉレベル、
０．０５～５ｍＯＤ／μｇ総タンパク質、例えば０．１～４ｍＯＤ／μｇ総タンパク質、例えば０．５～３ｍＯＤ／μｇ総タンパク質の複合体ＩＩレベル、を有する。実施形態において、培養細胞供給源（例えば、培養線維芽細胞）からの調製物のコンドリソームは、０．０５～１ｍＯＤ／μｇ総タンパク質の複合体ＩＩレベル、
１～３０ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質、例えば、２～３０、５～１０、１０～３０ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質の複合体ＩＩＩレベルを有する。実施形態において、培養細胞源（例えば、培養線維芽細胞）からのコンドリソームは、１～５ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質の複合体ＩＩＩレベル、
４～５０ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質、例えば、５～５０、例えば、１０～５０、２０～５０ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質の複合体ＩＶレベルを有する。実施形態において、培養細胞源（例えば、培養線維芽細胞）からのコンドリソームは、３～１０ｍＯＤ／ｕｇ総タンパク質、
ゲノム濃度０．００１～２（例えば、０．００１～１、０．０１～１、０．０１～０．１、０．０１～０．０５、０．１～０．２）ｍｔＤＮＡ ｕｇ／ｍｇタンパク質、を有し、
調製物の膜電位は、－５～－２００ｍＶ、例えば、－１００～－２００ｍＶ、－５０～－２００ｍＶ、－５０～－７５ｍＶ、－５０～－１００ｍＶである。いくつかの実施形態において、調製物の膜電位は、－１５０ｍＶ未満、－１００ｍＶ未満、－７５ｍＶ未満、－５０ｍＶ未満、例えば－５～－２０ｍＶであり、
１００ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質（例えば、９０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質未満、８０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、７０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、６０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、５０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、４０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、３０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、２５ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、２０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、１５ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリアソームタンパク質、１０ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリアソームタンパク質、５ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、４ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドソーム以上、３ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇコンドリソームタンパク質、のタンパク質カルボニルレベル、
２０モル％未満／モル ＥＲタンパク質（例えば、１５モル％超、１０モル％超、５モル％超、３モル％超、２モル％超、１％モル％超）／モル ＥＲタンパク質、
５モル％超／モル ミトコンドリアタンパク質（ＭｉｔｏＣａｒｔａデータベース（Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２０１５ｌ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ１００３）においてミトコンドリアとして特定されたタンパク質）、例えば、１０モル％超、１５モル％超、２０モル％超、２５モル％超、３０モル％超、３５モル％超、４０モル％超、５０モル％超、５５モル％超、６０モル％超、６５モル％超、７０モル％超、７５モル％超、８０モル％超、９０モル％超／モル ミトコンドリアタンパク質）、
０．０５モル％超／モルのＭＴ－ＣＯ２、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＮＤ５、およびＭＴ－ＮＤ６タンパク質（組み合わせ）（例えば、０．１モル％超、０５モル％超、１モル％超、２モル％超、３モル％超、４モル％超、５モル％超、７モル超、８モル％超、９モル％超、１０モル超、１５モル％超／モルのＭＴ－ＣＯ２、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＮＤ５、およびＭＴ－ＮＤ６タンパク質）、
遺伝的の質 ８０％超、例えば、８５％超、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超、９９％超、
ｍｔＤＮＡ／核ＤＮＡの相対比は、１０００超（例えば、１，５００超、２０００超、２，５００超、３，０００超、４，０００超、５０００超、１０，０００超、２５，０００超、５０，０００超、１００，０００超、２００，０００超、５００，０００超）であり、
エンドトキシンレベル ０．２未満のＥＵ／ｕｇ タンパク質（例えば、０．１未満、０．０５未満、０．０２未満、０．０１未満のＥＵ／ｕｇ タンパク質）、
外因性の非ヒト血清が実質的に存在しない、
グルタメート／マレートのＲＣＲが、１～１５、例えば、２～１５、５～１５、２～１０、２～５、１０～１５の３／２、
グルタメート／マレートのＲＣＲが、１～３０、１～２０、２～２０、５～２０、３～１５、１０～３０の３／４ｏ、
スクシナート／ロテノンのＲＣＲが、１～１５、２～１５、５～１５、１～１０、１０～１５の３／２、
スクシナート／ロテノンのＲＣＲが、１～３０、１～２０、２～２０、５～２０、３～１５、１０～３０の３／４ｏ、
０．０５～１００ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質（例えば、０．０５～５０、０．０５～２０、０．５～１０、０．１～５０、１～５０、２～５０、５～１００、１～２０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質）の複合体Ｉの活性、
０．０５～５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質（例えば、０．０５～５０、０．０５～２０、０．５～１０、０．１～５０、１～５０、２～５０、５～５０、１～２０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質）の複合体ＩＩの活性、
０．０５～２０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質（例えば、０．０５～５０、０．０５～２０、０．５～１０、０．１～５０、１～５０、２～５０、５～１００、１～２０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質）の複合体ＩＩＩの活性、
０．１～５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質（例えば、０．０５～５０、０．０５～２０、０．５～１０、０．１～５０、１～５０、２～５０、５～５０、１～２０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質）の複合体ＩＶ活性、
１～５００ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質（例えば、１０～５００、１０～２５０、１０～２００、１００～５００ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質）の複合体Ｖ活性、
０．０１～５０ｐｍｏｌ Ｈ２Ｏ２／ｕｇ タンパク質／時間の活性酸素種（ＲＯＳ）生産レベル（例えば、０．０５～４０、０．０５～２５、１～２０、２～２０、０．０５～２０、１～２０ｐｍｏｌ Ｈ２Ｏ２／ｕｇ タンパク質／時間）、
０．０５～５（例えば、０．５～５、０．５～２、１～５、１～４）ｍＯＤ／分／ｕｇ
総タンパク質のクエン酸シンターゼ活性、
０．０５～１０（例えば、０．１～１０、０．１～８、０．５～８、０．１～５、０．５～５、０．５～３、１～３）ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のアルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性、
０．１～１００（例えば、０．５～５０、１～１００、１～５０、１～２５、１～１５、５～１５）ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のクレアチンキナーゼ活性、
０．１～１０（例えば、０．５～１０、０．５～８、１～１０、１～８、１～５、２～３）ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性、
０．１～５０（例えば、５～５０、０．１～２、０．１～２０、０．５～３０）ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のアコニターゼ活性である。実施形態において、血小板からのコンドリソーム調製物中のアコニターゼ活性は、０．５～５ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質である。実施形態において、培養細胞、例えば、線維芽細胞からのコンドリソーム調製物中のアコニターゼ活性は、５～５０ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質であり、
０．０５～５０（例えば、０．０５～４０、０．０５～３０、０．０５～１０、０．５～５０、０．５～２５、０．５～１０、１～５）ｐｍｏｌ Ｏ２／分／ｕｇ コンドリソームタンパク質の最大脂肪酸酸化レベル、
パルミトイルカルニチンおよびマレートのＲＣＲが、１～１０（例えば、１～５）の３／２状態３／２状態の呼吸制御比（ＲＣＲの３／２）、
１～１０００（例えば、１０～１０００、１０～８００、１０～７００、５０～１０００、１００～１０００、５００～１０００、１０～４００、１００～８００）ｎｍｏｌ Ｏｍ／分／ｍｇ タンパク質／ΔＧＡＴＰ（ｋｃａｌ／モル）の電子伝達鎖効率、
５０，０００～２，０００，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ（例えば、５０，０００～１，０００，０００、５０，０００～５００，０００ｐｍｏｌ／ｍｇ）の総脂質含有量、
０．８～８（例えば、１～５、２～５、１～７、１～６）ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌの二重結合／総脂質比、
５０～１００（例えば、６０～８０、７０～１００、５０～８０）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌのリン脂質／総脂質比、
０．２～２０（例えば、０．５～１５、０．５～１０、１～１０、０．５～１０、１～５、５～２０）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌのリンスフィンゴ脂質／総脂質比、
セラミド含有量０．０５～５（例えば、０．１～５、０．１～４、１～５、０．０５～３）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
カルジオリピン含有量０．０５～２５（０．１～２０、０．５～２０、１～２０、５～２０、５～２５、１～２５、１０～２５、１５～２５）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）含有量０．０５～５（例えば、０．１～５、１～５、０．１～３、１～３、０．０５～２）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）含有量０．００５～２（例えば、０．００５～１、０．０５～２、０．０５～１）１００ ＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）含有量１０～８０（例えば、２０～６０、３０～７０、２０～８０、１０～６０ｍ ３０～５０）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルコリンエーテル（ＰＣ Ｏ－）含有量０．１～１０（例えば、０．５－１０、１～１０、２～８、１～８）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）含有量１～３０（例えば、２～２０、１～２０、５～２０）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルエタノールアミン－エーテル（ＰＥ Ｏ－）含有量０．０５～３０（例えば、０．１～３０、０．１～２０、１～２０、０．１～５、１～１０、５～２０）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有量０．０５～１５（例えば、０．１～１５、０．１～１０、１～１０、０．１～５、１～１０、５～１５）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルセリン（ＰＳ）含有量０．０５～２０（例えば、０．１～１５、０．１～２０、１～２０、１～１０、０．１～５、１～１０、５～１５）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
スフィンゴミエリン（ＳＭ）含有量０．０１～２０（例えば、０．０１～１５、０．０１～１０、０．５～２０、０．５～１５、１～２０、１～１５、５～２０）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量０．００５～５０（例えば、０．０１～５０、０．１～５０、１～５０、５～５０、１０～５０、０．００５～３０、０．０１～２５、０．１～３０）１００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ＰＥ：ＬＰＥ比 ３０～３５０（例えば、５０～２５０、１００～２００、１５０～３００）、
ＰＣ：ＬＰＣ比 ３０～７００（例えば、５０～３００、５０～２５０、１００～３００、４００～７００、３００～５００、５０～６００、５０～５００、１００～５００、１００～４００）、
ＰＥ １８：ｎ（ｎ＞０）含有量０．５～２０％（例えば、１～２０％、１～１０％、５～２０％、５～１０％、３～９％）ｐｍｏｌ ＡＡ／ｐｍｏｌ 脂質クラス、
ＰＥ ２０：４含有量０．０５～２０％（例えば、１～２０％、１～１０％、５～２０％、５～１０％）ｐｍｏｌ ＡＡ／ｐｍｏｌ 脂質クラス、
ＰＣ １８：ｎ（ｎ＞０）含有量５～５０％（５～４０％、５～３０％、２０～４０％、２０～５０％）ｐｍｏｌ ＡＡ／ｐｍｏｌ 脂質クラス、
ＰＣ ２０：４含有量１～２０％（例えば、２～２０％、２～１５％、５～２０％、５～１５％）ｐｍｏｌ ＡＡ／ｐｍｏｌ 脂質クラスである。
ある特定の実施形態において、コンドリソーム（または組成物中のコンドリソーム）は、レシピエント細胞、組織、もしくは対象（対照は、陰性対照（例えば、組成物を投与していない対照組織もしくは対象）、または投与前のベースライン、例えば、組成物の投与前の細胞、組織、もしくは対象であり得る）への投与時に、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、
レシピエント細胞の基底呼吸を、対照と比較して、少なくとも１０％（例えば、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
組成物中のコンドリソームは、レシピエント細胞の少なくとも１％（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％）取り込まれる、
組成物中のコンドリソームが取り込まれ、レシピエント細胞の膜電位を維持する、
組成物中のコンドリソームは、レシピエント細胞中の少なくとも６時間、例えば、少なくとも１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、１週間、２週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、６カ月間持続する、
レシピエント細胞、組織、または対象中のＡＴＰレベルを（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）増加させる、
レシピエント細胞、組織、または対象のアポトーシスを（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）減少させる、
レシピエント細胞、組織、または対象中の細胞脂質レベルを（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）減少させる、
レシピエント細胞、組織、または対象の膜電位を（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）増加させる、
レシピエント細胞、組織、または対象の脱共役呼吸を（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０９％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）増加させる、
レシピエント細胞、組織、または対象のＰＩ３Ｋ活性を（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０９％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）増加させる、
レシピエント細胞、組織、または対象の還元ストレスを（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０９％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）増加させる、
対象（例えば、標的対象の血清中）の細胞、組織中の反応性酸素種（例えば、Ｈ２Ｏ２）を（例えば参照値、例えば対照値、例えば未処理の対照と比較して、例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０９％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）減少させる、
レシピエント細胞の細胞脂質レベルを、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
レシピエント細胞の脱共役呼吸を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
レシピエント細胞中でのミトコンドリア透過性移行孔（ＭＰＴＰ）形成を、対照と比較して、少なくとも５％減少させ、１０％超増加しない、
レシピエント細胞のＡｋｔレベルを、対照と比較して、少なくとも１０％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
レシピエント細胞の総ＮＡＤ／ＮＡＤＨ比を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
レシピエント細胞のＲＯＳレベルを、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
心虚血に罹患している対象における短縮率を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
心虚血に罹患している対象における心臓拡張末期容積を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
心虚血に罹患している対象における収縮末期容積を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
虚血性心臓の梗塞領域を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
心虚血に罹患している対象における１回拍出量を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
心虚血に罹患している対象における駆出率を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
心虚血に罹患している対象における心拍出量を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
心虚血に罹患している対象における心係数を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）増加させる、
心虚血に罹患している対象における血清ＣＫＮＢレベルを、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
心虚血に罹患している対象における血清ｃＴｎＩレベルを、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
心虚血に罹患している対象における過酸化水素を、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる、
対象における血清コレステロールレベルおよび／またはトリグリセリドを、対照と比較して、少なくとも５％（例えば、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超）減少させる。
いくつかの実施形態において、フソソームは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、コンドドリソーム、例えば、ミトコンドリア源からの単離されたコンドソームを含む：
組成物中のコンドリソームは、１５０～１５００ｎｍの中間の平均サイズを有する、
組成物中のコンドリソームは、１．１～６の多分散性（Ｄ９０／Ｄ１０）を有する、
組成物中のコンドリソームの外側コンドリソーム膜の完全性は、還元シトクロムｃの添加後、酸素消費速度において状態４の速度を上回る酸素消費速度の２０％未満の増加を示す、
１～８ｍＯＤ／ｕｇ 総タンパク質の複合体Ｉレベル、
０．０５～５ｍＯＤ／ｕｇ 総タンパク質の複合体ＩＩレベル、
１～３０ｍＯＤ／ｕｇ 総タンパク質の複合体ＩＩＩレベル、
４～５０ｍＯＤ／ｕｇ 総タンパク質の複合体ＩＶレベル、
ゲノム濃度０．００１～２ｍｔＤＮＡ ｕｇ／ｍｇ タンパク質、および／または
組成物中のコンドリソームの膜電位は、－５～－２００ｍＶである。
いくつかの実施形態において、フソソームは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、コンドドリソーム、例えば、ミトコンドリア源からの単離されたコンドソームを含む：
１００ｎｍｏｌ未満のカルボニル／ｍｇ コンドリソームタンパク質のタンパク質カルボニルレベル。
２０モル％未満／モル ＥＲタンパク質
５モル％超／モル ミトコンドリアタンパク質（ＭｉｔｏＣａｒｔａ）、
０．０５モル％超／モルのＭＴ－ＣＯ２、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＮＤ５、およびＭＴ－ＮＤ６タンパク質、
遺伝的の質 ８０％超、
相対比 ｍｔＤＮＡ／核ＤＮＡ １０００超、
エンドトキシンレベル ０．２ＥＵ未満／ｕｇ タンパク質、および／または
外因性の非ヒト血清が実質的に存在しない。
いくつかの実施形態において、フソソームは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、コンドドリソーム、例えば、ミトコンドリア源からの単離されたコンドソームを含む：
グルタメート／マレートのＲＣＲが、１～１５の３／２、
グルタメート／マレートのＲＣＲが、１～３０の３／４ｏ、
スクシナート／ロテノンのＲＣＲが、１～１５の３／２、
スクシナート／ロテノンのＲＣＲが、１～３０の３／４ｏ、
０．０５～１００ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質の複合体Ｉ活性、
０．０５～５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質の複合体ＩＩ活性、
０．０５～２０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質の複合体ＩＩＩ活性、
０．１～５０ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質の複合体ＩＶ活性、
１～５００ｎｍｏｌ／分／ｍｇ 総タンパク質の複合体Ｖ活性、
０．０１～５０ｐｍｏｌ Ｈ２Ｏ２／ｕｇ タンパク質／時間の活性酸素種（ＲＯＳ）生産レベル、
０．０５～５ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のクエン酸シンターゼ活性、
０．０５～１０ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のアルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性、
０．１～１００ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のクレアチンキナーゼ活性、
０．１～１０ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性、
０．１～５０ｍＯＤ／分／ｕｇ 総タンパク質のアコニターゼ活性、
０．０５～５０ｐｍｏｌ Ｏ２／分／ｕｇ コンドリソームタンパク質の最大脂肪酸酸化レベル、
パルミトイルカルニチンおよびマレートのＲＣＲが、１～１０の３／２状態３／２状態の呼吸制御比（ＲＣＲの３／２）、および／または
１～１０００ｎｍｏｌ Ｏ２／分／ｍｇ タンパク質／ΔＧＡＴＰ（ｋｃａｌ／モル単位）の電子伝達鎖効率。
いくつかの実施形態において、フソソームは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、コンドドリソーム、例えば、ミトコンドリア源からの単離されたコンドソームを含む：
５０，０００～２，０００，０００ｐｍｏｌ／ｍｇの総脂質含有量、
０．８～８ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌの二重結合／総脂質比、
５０～１００ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌのリン脂質／総脂質比、
０．２～２０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌのリンスフィンゴ脂質／総脂質比、
セラミド含有量０．０５～５ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
カルジオリピン含有量０．０５～２５ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）含有量０．０５～５ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）含有量０．００５～２ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルコリン（ＰＣ）含有量１０～８０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルコリンエーテル（ＰＣ Ｏ－）含有量０．１～１０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ総脂質、
ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）含有量１～３０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルエタノールアミン－エーテル（ＰＥ Ｏ－）含有量０．０５～３０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ総脂質、
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）含有量０．０５～１５ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ホスファチジルセリン（ＰＳ）含有量０．０５～２０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
スフィンゴミエリン（ＳＭ）含有量０．０１～２０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量０．００５～５０ １００＊ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌ 総脂質、
ＰＥ：ＬＰＥ比 ３０～３５０、
ＰＣ：ＬＰＣ比 ３０～７００、
ＰＥ １８：ｎ（ｎ＞０）含有量０．５～２０％ｐｍｏｌ ＡＡ／ｐｍｏｌ 脂質クラス、
ＰＥ ２０：４含有量０．０５～２０％ｐｍｏｌ ＡＡ／ｐｍｏｌ 脂質クラス、
ＰＣ １８：ｎ（ｎ＞０）含有量５～５０％ｐｍｏｌ ＡＡ／ｐｍｏｌ 脂質クラス、および／または
ＰＣ ２０：４含有量１～２０％。
いくつかの実施形態において、フソソームは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、コンドドリソーム、例えば、ミトコンドリア源からの単離されたコンドソームを含む：
レシピエント細胞の基礎呼吸を、少なくとも１０％増加させる、
組成物中のコンドリソームは、レシピエント細胞の少なくとも１％に取り込まれる、
組成物中のコンドリソームが取り込まれ、レシピエント細胞の膜電位を維持する、
組成物中のコンドリソームは、レシピエント細胞に少なくとも６時間持続する、
レシピエント細胞の細胞脂質レベルを、少なくとも５％減少させる、
レシピエント細胞の脱共役呼吸を、少なくとも５％増加させる、
レシピエント細胞のミトコンドリア透過性移行孔（ＭＰＴＰ）形成を、少なくとも５％減少させ、１０％超増加しない、
レシピエント細胞のＡｋｔレベルを、少なくとも１０％増加させる、
レシピエント細胞の総ＮＡＤ／ＮＡＤＨ比を、少なくとも５％減少させる、および／または
レシピエント細胞のＲＯＳレベルを少なくとも５％減少させる。
いくつかの実施形態において、コンドリソームを含むフソソームは、以下の特徴のうちの１つ以上をさらに有する：
心虚血に罹患している対象における短縮率を、少なくとも５％増加させる、
心虚血に罹患している対象における心臓拡張末期容積を、少なくとも５％増加させる、
心虚血に罹患している対象における収縮末期容積を、少なくとも５％減少させる、
虚血性心臓の梗塞領域を、少なくとも５％減少させる、
心虚血に罹患している対象における１回拍出量を、少なくとも５％増加させる、
心虚血に罹患している対象における駆出率を、少なくとも５％増加させる、
心虚血に罹患している対象における心拍出量を、少なくとも５％増加させる、
心虚血に罹患している対象における心係数を、少なくとも５％増加させる、
心虚血に罹患している対象における血清ＣＫＮＢレベルを、少なくとも５％減少させる、
心虚血に罹患している対象における血清ｃＴｎＩレベルを、少なくとも５％減少させる、および／または
心虚血に罹患している対象における血清過酸化水素を、少なくとも５％減少させる。
実施形態において、コンドリソームを含むフソソームは、少なくとも６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、５日間、７日間、１０日間、１４日間、２１日間、３０日間、４５日間、６０日間、９０日間、１２０日間、１８０日間、またはそれ以上（例えば、４℃、０℃、－４℃、または－２０℃、－８０℃で）安定である。
実施形態において、薬剤（例えば、コンドリソーム）を含むフソソームは、例えば、脂質ベースの材料などの天然、合成、もしくは操作されたカプセル封入材料、小胞、エキソソーム、脂質ラフト、クラスリン被覆小胞、または血小板（マイト粒子）、ＭＳＣもしくは星状細胞微小胞膜を含み得る。
実施形態において、コンドリソームを含むフソソームは、１５０～２０，０００μｇ タンパク質／ｍｌ、１５０～１５，０００ｕｇ／ｍｌ、２００～１５，０００ｕｇ／ｍｌ、３００～１５，０００ｕｇ／ｍｌ、５００～１５，０００ｕｇ／ｍｌ、２００～１０，０００ｕｇ／ｍｌ、２００－５，０００ｕｇ／ｍｌ、３００～１０，０００ｕｇ／ｍｌ、２００ｕｇ／ｍｌ超、２５０ｕｇ／ｍｌ超、３００ｕｇ／ｍｌ超、３５０ｕｇ／ｍｌ超、４００ｕｇ／ｍｌ超、４５０ｕｇ／ｍｌ超、５００ｕｇ／ｍｌ超、６００ｕｇ／ｍｌ超、７００ｕｇ／ｍｌ超、８００ｕｇ／ｍｌ超、９００ｕｇ／ｍｌ超、１ｍｇ／ｍｌ超、２ｍｇ／ｍｌ超、３ｍｇ／ｍｌ超、４ｍｇ／ｍｌ超、５ｍｇ／ｍｌ超、６ｍｇ／ｍｌ超、７ｍｇ／ｍｌ超、８ｍｇ／ｍｌ超、９ｍｇ／ｍｌ超、１０ｍｇ／ｍｌ超、１１ｍｇ／ｍｌ超、１２ｍｇ／ｍｌ超、１４ｍｇ／ｍｌ超、１５ｍｇ／ｍｌ超（および、例えば、２０ｍｇ／ｍｌ以下）で組成物中に存在する。
実施形態において、コンドリソームを含むフソソームは、レシピエント動物、例えば、ヒトなどのレシピエント哺乳動物において望ましくない免疫応答を生じない（例えば、レシピエントにおけるＩＬ－１－ベータ、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－アルファのレベル、またはリンパ節サイズを著しく増加させない）。
カーゴへの修飾には、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／６４２５１に記載されるように、コンドリソームまたはコンドリソームの供給源への修飾が含まれる。いくつかの実施形態において、フソソームは、本明細書に記載の薬学的組成物を作製する方法を使用して作製されたコンドリソームを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソーム組成物、例えば、ミトコンドリアまたはコンドリソームを含むフソソーム組成物は、以下のうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、または４つ）が可能である：
ａ）標的細胞における最大呼吸を増加させることであって、例えば、最大呼吸の増加が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％ ８０％、９０％ ２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、または１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、１倍～２倍、２倍～３倍、３倍～４倍、または４倍～５倍である、標的細胞における最大呼吸を増加させること、
ｂ）標的細胞における予備呼吸能を増加させることであって、例えば、予備呼吸能の増加が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、１倍～２倍、２倍～３倍、３倍～４倍、または４倍～５倍である、標的細胞における予備呼吸能を増加させること、
ｃ）標的細胞におけるミトコンドリア生合成を刺激させることであって、例えば、ミトコンドリア生合成の刺激は、ミトコンドリアバイオマスを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、または１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、１倍～２倍、２倍～３倍、３倍～４倍、または４倍～５倍増加させることを含む、標的細胞におけるミトコンドリア生合成を刺激させること、または
ｄ）標的細胞における核遺伝子の転写を調節（例えば、刺激または阻害）することであって、例えば、核遺伝子の転写レベルの変化は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、９０％～１００％、１倍～２倍、２倍～３倍、３倍～４倍、または４倍～５倍である、標的細胞における核遺伝子の転写を調節（例えば、刺激または阻害）すること。
免疫原性
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化され得る。
いくつかの実施形態において、フソソームは、標的細胞と融合して、レシピエント細胞を生成する。いくつかの実施形態において、１つ以上のフソソームに融合したレシピエント細胞は、免疫原性について評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、例えば、抗ＩｇＭ抗体で染色することによって、細胞表面上の抗体の存在について分析される。他の実施形態において、免疫原性は、ＰＢＭＣ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とインキュベートされ、次いで、ＰＢＭＣによる細胞の溶解について評価される。他の実施形態において、免疫原性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、ＮＫ細胞とインキュベートされ、次いで、ＮＫ細胞による細胞の溶解について評価される。他の実施形態において、免疫原性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞溶解アッセイによって評価される。実施形態において、レシピエント細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とインキュベートされ、次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞の溶解について評価される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性であるか、または既知である細胞、例えば、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞の膜対称性を有する。いくつかの実施形態において、フソソームは、本明細書に記載のアッセイによって測定されるように、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞の免疫原性よりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下よりも高い免疫原性を有する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、上昇したレベルの免疫抑制剤を含む。いくつかの実施形態において、上昇レベルは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍である。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照細胞には存在しない免疫抑制剤を含む。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、低下したレベルの免疫活性化剤を含む。いくつかの実施形態において、低下したレベルは、参照細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態において、免疫活性化剤は、フソソームに実質的に存在しない。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、例えば、プロテオミクスによって測定されるように、供給源細胞、例えば実質的に非免疫原性の供給源細胞の組成物と実質的に類似の組成物を有する膜を含む。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、供給源細胞の膜タンパク質の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を含む膜を含む。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、供給源細胞の膜上の膜タンパク質の発現レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％で発現される膜タンパク質を含む膜を含む。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物、またはフソソーム組成物が由来する供給源細胞は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、またはそれ以上を有する：
ａ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｂ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞または本明細書に記載の参照細胞と比較して、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、またはＢ７－Ｈ４を含むが、これらに限定されない、１つ以上の共刺激タンパク質の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｃ．マクロファージの貪食作用を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７の発現、例えば本明細書に記載の方法による検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、マクロファージの貪食作用を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上より高い発現、
ｄ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ－１０の発現、例えば本明細書に記載の方法による検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ－１０の発現の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上より高い発現、
ｅ．可溶性免疫抑制タンパク質、例えばＰＤ－Ｌ１の発現、例えば本明細書に記載の方法による検出可能な発現、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、可溶性免疫抑制性タンパク質、例えばＰＤ－Ｌ１の発現の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上より高い発現、
ｆ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＵ－２６６細胞と比較して、可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ－ガンマまたはＴＮＦ－ａの発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｇ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞、またはＡ５４９細胞もしくはＳＫ－ＢＲ－３細胞と比較して、内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｈ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、例えば、本明細書に記載の方法による検出可能な発現、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇの発現、
ｉ．例えば、ＮＫ細胞の活性化を抑制するように作用する、例えばシアル酸を含む表面グリコシル化プロファイル、
ｊ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＴＣＲα／βの発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｋ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＡＢＯ血液型の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｌ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、副組織適合抗原（ＭＨＡ）の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｍ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、未修飾細胞などの参照細胞と比較して、ミトコンドリアＭＨＡが１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下より少ないか、または検出可能なミトコンドリアＭＨＡを有しない。
実施形態において、共刺激タンパク質は、４－１ＢＢ、Ｂ７、ＳＬＡＭ、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭ、またはＬＩＧＨＴであり、参照細胞は、ＨＤＬＭ－２である。いくつかの実施形態において、共刺激タンパク質は、ＢＹ－Ｈ３であり、参照細胞は、ＨｅＬａである。いくつかの実施形態において、共刺激タンパク質は、ＩＣＯＳＬまたはＢ７－Ｈ４であり、参照細胞は、ＳＫ－ＢＲ－３である。いくつかの実施形態において、共刺激タンパク質は、ＩＣＯＳまたはＯＸ４０であり、参照細胞は、ＭＯＬＴ－４である。いくつかの実施形態において、共刺激タンパク質は、ＣＤ２８であり、参照細胞は、Ｕ－２６６である。いくつかの実施形態において、共刺激タンパク質は、ＣＤ３０ＬまたはＣＤ２７であり、参照細胞は、Ｄａｕｄｉである。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫系、例えば先天性免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。実施形態において、免疫原性応答は、例えば本明細書に記載されるように定量化され得る。いくつかの実施形態において、先天性免疫系による免疫原性応答は、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、樹状細胞、肥満細胞、またはガンマ／デルタＴ細胞を含むが、これらに限定されない、先天性免疫細胞による応答を含む。いくつかの実施形態において、先天性免疫系による免疫原性応答は、可溶性血液成分および膜結合成分を含む補体系による応答を含む。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫系、例えば適応免疫系による免疫原性応答を実質的に誘発しない。実施形態において、免疫原性応答は、例えば本明細書に記載されるように定量化され得る。いくつかの実施形態において、適応免疫系による免疫原性応答は、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、またはガンマ－デルタＴ細胞）、またはＢリンパ球の数または活性の変化、例えば、増加を含むが、これらに限定されない、適応免疫細胞による免疫原性応答を含む。いくつかの実施形態において、適応免疫系による免疫原性応答は、サイトカインまたは抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ）の数または活性の変化、例えば、増加を含むが、これらに限定されない、可溶性血液成分のレベルの増加を含む。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫原性が減少するように修飾される。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化され得る。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞の免疫原性よりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満より低い免疫原性を有する。
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、例えば本明細書に記載の方法を使用して改変された、例えば免疫原性を減少させる、例えば、低減するように改変ゲノムを有する供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来する。免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように定量化され得る。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上のノックアウトなどで枯渇した哺乳動物細胞に由来する：
ａ．ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、またはＭＨＡ、
ｂ．ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、またはＢ７－Ｈ４を含むが、これらに限定されない、１つ以上の共刺激タンパク質、
ｃ．可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ－ガンマまたはＴＮＦ－ａ、
ｄ．内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１、
ｅ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、
ｆ．ＡＢＯ血液型をコードする遺伝子、例えばＡＢＯ遺伝子、
ｇ．免疫の活性化を駆動する転写因子、例えばＮＦｋＢ、
ｈ．ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えば、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、またはＲＦＸアンキリン反復（ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＢとしても知られている）、あるいは
ｉ．ＭＨＣクラスＩ発現を低下させるＴＡＰタンパク質、例えば、ＴＡＰ２、ＴＡＰ１、またはＴＡＰＢＰ。
いくつかの実施形態において、フソソームは、免疫抑制剤の発現の増加、例えば、以下のうちの１つ、２つ、３つまたはそれ以上（例えば、遺伝子修飾の前に、細胞は因子を発現しなかった）をもたらす遺伝子修飾を伴う供給源細胞に由来する：
ａ．マクロファージの貪食作用を抑制する表面タンパク質、例えばＣＤ４７、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＣＤ４７の発現の増加、
ｂ．可溶性免疫抑制性サイトカイン、例えばＩＬ－１０、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＩＬ－１０の発現の増加、
ｃ．可溶性免疫抑制タンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはＢＴＬＡ、例えば、参照細胞、例えば、細胞供給源と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、免疫抑制タンパク質の発現の増加、
ｄ．寛容原性タンパク質、例えば、ＩＬＴ－２もしくはＩＬＴ－４アゴニスト、例えばＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇまたは任意の他の内因性ＩＬＴ－２もしくはＩＬＴ－４アゴニスト、例えば、参照細胞、例えば、細胞供給源と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２、またはＩＬＴ－４の発現の増加、あるいは
ｅ．補体活性を抑制する表面タンパク質、例えば補体調節タンパク質、例えば崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えば因子Ｈ（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、例えばＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えばプロフェクチン（ＣＤ５９）、例えば、古典的および代替補体経路ＣＤ／Ｃ５変換酵素を阻害するタンパク質、例えば、参照細胞、例えば、細胞供給源と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、補体調節タンパク質の発現の増加。
いくつかの実施形態において、発現レベルの増加は、参照細胞と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍高い。
いくつかの実施形態において、フソソームは、免疫活性化剤の発現が低下するように修飾された供給源細胞、例えば、以下の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれ以上に由来する：
ａ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｂ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞または本明細書に記載の参照細胞と比較して、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＯＳ、Ｏｘ４０Ｌ、ＯＸ４０、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴ、Ｂ７－Ｈ３、またはＢ７－Ｈ４を含むが、これらに限定されない、１つ以上の共刺激タンパク質の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｃ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＵ－２６６細胞と比較して、可溶性免疫刺激サイトカイン、例えば、ＩＦＮ－ガンマまたはＴＮＦ－ａの発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｄ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞、またはＡ５４９細胞もしくはＳＫ－ＢＲ－３細胞と比較して、内因性免疫刺激抗原、例えば、Ｚｇ１６またはＨｏｒｍａｄ１の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｅ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｆ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＡＢＯ血液型の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｇ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、免疫の活性化を駆動する転写因子、例えば、ＮＦｋＢの発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない、
ｈ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、ＭＨＣ発現を制御する転写因子、例えばクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、Ｘｂｏｘ ５の調節因子（ＲＦＸ５）、ＲＦＸ関連タンパク質（ＲＦＸＡＰ）、またはＲＦＸアンキリン反復（ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＢとしても知られている）の発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ないか、あるいは
ｉ．参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞またはＨｅＬａ細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩの発現を減少させる、ＴＡＰタンパク質、例えば、ＴＡＰ２、ＴＡＰ１、またはＴＡＰＢＰの発現が５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％以下より少ない。
いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩの発現を減少させるために、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスを使用して修飾された哺乳動物細胞、例えば間葉幹細胞に由来するフソソーム組成物は、非修飾細胞、例えば修飾されていない間葉幹細胞と比較して、ＭＨＣクラスＩの発現が少ない。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｇの発現を増加させるために、ＨＬＡ－Ｇを発現するレンチウイルスを使用して修飾された哺乳動物細胞、例えば間葉幹細胞に由来するフソソーム組成物は、哺乳動物細胞、例えば間葉幹細胞に由来するフソソーム組成物は、非修飾細胞、例えば修飾されていない間葉幹細胞と比較して、ＨＬＡ－Ｇの発現を増加している。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、実質的に免疫原性ではない、供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来し、供給源細胞は、例えば、ＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってインビトロでアッセイされるように、０ｐｇ／ｍＬからの０ｐｇ／ｍＬ超のレベルでＴ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌を刺激、例えば誘導する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、またはイムノフィリン調節剤（例えば、シクロスポリンまたはラパマイシン）で処理した細胞培養物からのものである。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、外因性薬剤、例えば治療剤を含む。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、供給源細胞、例えば哺乳動物細胞に由来し、哺乳動物細胞は、組換え細胞である。
いくつかの実施形態において、フソソームは、ウイルスイムノエバシン、例えば、ｈＣＭＶ ＵＳ２またはＵＳ１１を発現するように遺伝子修飾された哺乳動物細胞に由来する。
いくつかの実施形態において、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、ポリマー、例えば、免疫原性および免疫介在性クリアランスを低下させる生体適合性ポリマー、例えばＰＥＧで共有結合または非共有結合的に修飾される。
いくつかの実施形態において、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、シアル酸、例えば、ＮＫ抑制グリカンエピトープを含む糖ポリマーを含むシアル酸で共有結合または非共有結合的に修飾される。
いくつかの実施形態において、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、ＡＢＯ血液型を除去するために、例えばグリコシダーゼ酵素、例えばα－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼで酵素処理される。
いくつかの実施形態において、フソソームの表面、またはフソソームが由来する哺乳動物細胞の表面は、レシピエントの血液型と一致するＡＢＯ血液型の発現を引き起こす、例えば発現を誘発するために、酵素処理される。
免疫原性を評価するためのパラメーター
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫原性の低下を有するように、実質的に免疫原性ではない、または修飾、例えば本明細書に記載の方法を使用して修飾された、供給源細胞、例えば、哺乳動物細胞に由来する。供給源細胞およびフソソーム組成物の免疫原性は、本明細書に記載のアッセイのいずれかによって決定することができる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、インビボでの移植片生着の増加、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のインビボでの移植片生着の増加を有する。いくつかの実施形態において、移植片生着は、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルにおける、本明細書に記載のインビボでの移植片生着を測定するアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、奇形腫の形成の増加、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の奇形腫の形成の増加を有する。いくつかの実施形態において、奇形腫の形成は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおける、本明細書に記載の奇形腫の形成を測定するアッセイによって決定される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、奇形腫の生存の増加、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の奇形腫の生存の増加を有する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、奇形腫の生存のアッセイにおいて１日以上生存する。いくつかの実施形態において、奇形腫の生存は、適切な動物モデル、例えば、本明細書に記載の動物モデルにおける、本明細書に記載の奇形腫の生存を測定するアッセイによって決定される。一実施形態において、奇形腫の形成は、実施例に記載されるように、固定組織、例えば、凍結またはホルマリン固定の画像解析、例えば、ＩＨＣ染色、蛍光染色、またはＨ＆Ｅによって測定される。いくつかの実施形態において、固定組織は、抗ヒトＣＤ３、抗ヒトＣＤ４、または抗ヒトＣＤ８の抗体のうちのいずれか１つまたはすべてで染色され得る。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、移植片または奇形腫へのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の低下、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、例えば、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有する。一実施形態において、ＣＤ８ Ｔ細胞浸潤は、本明細書に記載のＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルにおける組織学的分析によって判定される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学組織切片の５０倍の画像フィールドの０％、０．１％、１％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％ ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を有する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、移植片または奇形腫へのＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤の減少、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、ＣＤ４Ｔ細胞浸潤は、本明細書に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルにおける組織学的分析によって判定される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学組織切片の５０倍の画像フィールドの０％、０．１％、１％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％ ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を有する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、移植片または奇形腫へのＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤の減少、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を有する。一実施形態において、ＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤は、本明細書に記載のＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤を測定するアッセイ、例えば、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルにおける組織学的分析によって判定される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物に由来する奇形腫は、組織学組織切片の５０倍の画像フィールドの０％、０．１％、１％ ５％、１０％、２０％、３０％、４０％ ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のＣＤ３＋ＮＫ細胞浸潤を有する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルへの、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞の１つ以上の移植後の体液性応答と比較して、適切な動物モデル、例えば本明細書に記載の動物モデルに由来するフソソームの１つ以上の移植後の体液性応答の減少によって測定される、免疫原性の減少を有する。いくつかの実施形態において、体液性応答の減少は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、抗細胞抗体力価、例えば抗フソソーム抗体力価によって血清試料で測定される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物が投与された動物からの血清試料は、非修飾細胞を投与した動物からの血清試料と比較して、抗細胞抗体価の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の減少を有する。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物が投与された動物からの血清試料は、抗細胞抗体力価が増加しており、例えば、ベースラインから１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％増加しており、例えば、ベースラインは、フソソーム組成物の投与前の同じ動物からの血清試料を指す。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、マクロファージ食作用の低下、例えば、マクロファージ食作用の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の減少を有し、マクロファージ食作用の低下は、例えば、実施例８２に記載されるように、インビトロで食作用指数をアッセイすることによって判定される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、マクロファージ食作用のインビトロアッセイにおいてマクロファージとインキュベートした場合、例えば、実施例８２のアッセイによって測定されるように、０、１、１０、１００、またはそれ以上の食作用指数を有する。
いくつかの実施形態において、供給源細胞は、例えば、実施例８３のアッセイを使用して、ＰＢＭＣによる細胞毒性媒介性細胞溶解の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞または間葉系幹細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の細胞溶解の低下を有する。実施形態において、供給源細胞は、外因性ＨＬＡ－Ｇを発現する。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ＮＫ媒介性細胞溶解の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＮＫ媒介性細胞溶解の低下を有し、ＮＫ媒介性細胞溶解は、クロム放出アッセイまたはユーロピウム放出によってインビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞溶解の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＣＤ８ Ｔ細胞媒介性細胞溶解の低下を有し、ＣＤ８ Ｔ細胞媒介性細胞溶解は、クロム放出アッセイまたはユーロピウム放出によってインビトロでアッセイされる。実施形態において、活性化および／または増殖は、実施例８５に記載されるように測定される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖および／または活性化の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の低下を有し、ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖は、例えば、実施例８６に記載されるように、インビトロでアッセイされる（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いた、修飾または非修飾哺乳動物供給源細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養アッセイ）。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、Ｔ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＴ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌の低下を有し、Ｔ細胞ＩＦＮ－ガンマ分泌は、例えば、ＩＦＮ－ガンマＥＬＩＳＰＯＴによって、インビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫原性サイトカインの分泌の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の免疫原性サイトカインの分泌の低下を有し、免疫原性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用して、インビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫抑制性サイトカインの分泌の増加、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の免疫抑制性サイトカインの分泌の増加をもたらし、免疫抑制性サイトカインの分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴを使用して、インビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現の増加、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現の増加を有し、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用して、インビトロでアッセイされる。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現の増加、例えば、非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現の増加を有するように修飾された供給源細胞に由来し、ＨＬＡ－ＧまたはＨＬＡ－Ｅの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用して、インビトロでアッセイされる。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｇ発現の増加を伴う修飾された細胞に由来するフソソーム組成物は、奇形腫形成アッセイ、例えば本明細書に記載の奇形腫形成アッセイにおいて、例えば、免疫細胞浸潤の減少によって測定されるように、免疫原性の低下を示す。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、Ｔ細胞阻害剤リガンド（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１）の発現の増加、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＴ細胞阻害剤リガンドの発現の増加を有し、Ｔ細胞阻害剤リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用して、インビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、共刺激リガンドの発現の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の共刺激リガンドの発現の低下を有し、共刺激リガンドの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用して、インビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現の低下、例えば、参照細胞、例えば、供給源細胞またはＨｅＬａ細胞と他の類似の非修飾細胞と比較して、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現の低下を有し、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現は、フローサイトメトリー、例えばＦＡＣＳを使用して、インビトロでアッセイされる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、実質的に非免疫原性である、細胞源、例えば哺乳動物細胞源に由来する。いくつかの実施形態において、免疫原性は、例えば、本明細書に記載されるように、定量化され得る。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞源は、以下の特徴のうちのいずれか１つ、すべて、またはそれらの組み合わせを含む：
ａ．供給源細胞は、自己細胞源から得られ、例えば、細胞が、フソソーム組成物を受容する、例えば投与されるレシピエントから得られる、
ｂ．供給源細胞は、レシピエント、例えば、フソソーム組成物を受容する、例えば投与される本明細書に記載のレシピエントと、例えば、同様の性別が一致する、同種異系細胞源から得られる、
ｃ．供給源細胞は、例えば、１つ以上の対立遺伝子においてレシピエントのＨＬＡと一致するＨＬＡである同種異系細胞源から得られる、
ｄ．供給源細胞は、ＨＬＡホモ接合体である同種異系細胞源から得られる、
ｅ．供給源細胞は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを欠いている（または参照細胞と比較してレベルが低下した）同種異系細胞源から得られるか、または
ｆ．供給源細胞は、幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、または網膜色素上皮細胞を含むが、これらに限定されない、実質的に非免疫原性であることが知られている細胞源から得られる。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物を投与される対象は、フソソームと反応する既存の抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有するか、有することが知られているか、または試験される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物を投与される対象は、フソソームと反応する既存の抗体の検出可能なレベルを有さない。抗体の試験は、例えば、実施例７８に記載されている。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物を受容している対象は、フソソームと反応する抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を有するか、有することが知られているか、または試験される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物を受容した対象（例えば、少なくとも、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上）は、フソソームと反応する抗体の検出可能なレベルを有さない。実施形態において、抗体のレベルは、２つの時点間で１％、２％、５％、１０％、２０％、または５０％を超えて上昇せず、最初の時点はフソソームの第１の投与前であり、第２の時点はフソソームの１回以上の投与後である。抗体の試験は、例えば、実施例７９に記載されている。
さらなる治療剤
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、さらなる薬剤、例えば治療剤と、対象、例えばレシピエント、例えば本明細書に記載のレシピエントに同時投与される。いくつかの実施形態において、同時投与される治療剤は、免疫抑制剤、例えば、グルココルチコイド（例えば、デキサメタゾン）、細胞増殖抑制剤（例えば、メトトレキサート）、抗体（例えば、ムロモナブ－ＣＤ３）、またはイムノフィリン調節剤（例えば、シクロスポリンまたはラパマイシン）である。実施形態において、免疫抑制剤は、フソソームの免疫介在性クリアランスを減少させる。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫賦活剤、例えばアジュバント、インターロイキン、サイトカイン、またはケモカインと同時投与される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物および免疫抑制剤は、同時に投与され、例えば同時に投与される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫抑制剤の投与前に投与される。いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、免疫抑制剤の投与後に投与される。
いくつかの実施形態において、免疫抑制剤は、イブプロフェン、アセトアミノフェン、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、シクロホスファミド、グルココルチコイド、シロリムス、アザトリオピン、またはメトトレキサートなどの小分子である。
いくつかの実施形態において、免疫抑制剤は、ムロノマブ（抗ＣＤ３）、ダクリズマブ（抗ＩＬ１２）、バシリキシマブ、インフリキシマブ（抗ＴＮＦａ）、またはリツキシマブ（抗ＣＤ２０）を含むが、これらに限定されない、抗体分子である。
いくつかの実施形態において、免疫抑制剤とフソソーム組成物の同時投与は、フソソーム組成物の単独での投与と比較して、対象におけるフソソーム組成物の持続性の向上をもたらす。いくつかの実施形態において、同時投与におけるフソソーム組成物の持続性の向上は、単独で投与した場合のフソソーム組成物の持続性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、同時投与におけるフソソーム組成物の持続性の向上は、単独で投与した場合のフソソーム組成物の生存率と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、または３０日もしくはそれ以上である。
送達
いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーは、フソソームの送達の前に、同時に、またはその後に、標的細胞または組織に送達される。
いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーは、フソソームの送達の前、同時に、またはその後に、非標的細胞または組織に送達される。
いくつかの実施形態において、フソゲン（例えば、タンパク質もしくは脂質フソゲン）またはフソゲン結合パートナーをコードする核酸は、フソソームの送達の前に、同時に、またはその後に、標的細胞または組織に送達される。
いくつかの実施形態において、ポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質、またはフソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーの発現を上方調節または下方調節する小分子は、フソソームの送達の前に、同時に、またはその後に、標的細胞または組織に送達される。
いくつかの実施形態において、ポリペプチド、核酸、リボ核タンパク質、またはフソゲン（例えば、タンパク質、脂質、もしくは化学的フソゲン）またはフソゲン結合パートナーの発現を上方調節または下方調節する小分子は、フソソームの送達の前に、同時に、またはその後に、非標的細胞または組織に送達される。
いくつかの実施形態において、標的細胞または組織は、フソソームの送達の前、同時、またはその後に、融合速度を増加させるために、（例えば、ストレスを誘発するまたは細胞分裂によって）修飾される。いくつかの非限定的な例には、虚血の誘発、化学療法、抗生物質、照射、毒素、炎症、炎症性分子、抗炎症性分子、酸傷害、塩基性傷害、火傷、ポリエチレングリコール、神経伝達物質、骨髄毒性薬、成長因子、またはホルモンによる治療、組織切除、飢餓、および／または運動が含まれる。
いくつかの実施形態において、標的細胞または組織は、標的組織へのフソソームの輸送速度を増加させるために、血管拡張剤（例えば、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化炭素、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、ニトログリセリン、フェントラミン）または血管収縮剤（例えば、アンジオテンシン（ＡＧＴ）、エンドセリン（ＥＤＮ）、ノルエピネフリン）で処置される。
いくつかの実施形態において、標的細胞または組織は、化学薬剤、例えば化学療法剤で処置される。そのような実施形態において、化学療法剤は、標的細胞または組織の融合活性を高める標的細胞または組織への損傷を誘発する。
いくつかの実施形態において、標的細胞または組織は、物理的ストレス、例えば電気融合で処置される。そのような実施形態において、物理的ストレスは、標的細胞または組織の膜を不安定化し、標的細胞または組織の融合活性を高める。
いくつかの実施形態において、標的細胞または組織は、フソソームとの融合を強化するために、薬剤で処置され得る。例えば、特定のニューロン受容体は、融合特性を強化するために、抗うつ薬で刺激され得る。
本明細書に記載のフソソームを含む組成物は、循環系、肝臓系、腎臓系、心肺系、中枢神経系、末梢神経系、筋骨格系、リンパ系、免疫系、感覚神経系（視覚、聴覚、嗅覚、触覚、味覚）、消化器系、内分泌系（脂肪組織代謝調節を含む）、および生殖器系に投与され得るか、または標的化され得る。
実施形態において、本明細書に記載のフソソーム組成物は、細胞または組織、例えばヒト細胞または組織にエクスビボで送達される。いくつかの実施形態において、組成物は、（例えば、外傷、疾患、低酸素症、虚血または他の損傷からの）損傷状態にあるエクスビボ組織に送達される。
いくつかの実施形態において、フソソーム組成物は、エクスビボ移植（例えば、組織外植片または移植のための組織、例えば、ヒトの静脈、骨または腱などの筋骨格移植片、角膜、皮膚、心臓弁、神経；または、単離もしくは培養された臓器、例えば、ヒトに移植される臓器、例えば、ヒトの心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、眼）に送達される。組成物は、移植の生存率、呼吸、または他の機能を改善する。組成物は、移植前、移植中、および／または移植後に、組織または臓器に送達され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソーム組成物は、対象に由来する細胞または組織にエクスビボで送達される。いくつかの実施形態において、細胞または組織は、対象に再投与される（すなわち、細胞または組織は、自己移植である）。
フソソームは、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）組織、例えば、上皮、結合、筋肉、または神経組織もしくは細胞、およびそれらの組み合わせからの細胞と融合し得る。フソソームは、例えば、心臓血管系（心臓、血管系）、消化器系（食道、胃、肝臓、胆嚢、膵臓、腸、結腸、直腸、および肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体もしくは松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排泄系（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃、アデノイド、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖器系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、輸精管、精嚢、前立腺）；呼吸器系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）、およびそれらの組み合わせからの任意の真核生物（例えば、哺乳動物）臓器系に送達され得る。
実施形態において、フソソームは、組織、例えば、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、胃腸管、腎臓、精巣、卵巣、脳、生殖器官、中枢神経系、末梢神経系、骨格筋、内皮、内耳、脂肪組織（例えば、茶色脂肪組織または白色脂肪組織）、または眼を標的とし、対象、例えば、マウスに投与される場合、投与されたフソソームの集団中のフソソームの少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、例えば、実施例８７または１００のアッセイによって、２４、４８、または７２時間後、標的組織中に存在する。
実施形態において、フソソームは、幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄間質細胞、骨髄由来成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、芽細胞、脳室下帯で形成された中間前駆細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、衛星細胞、肝臓幹細胞、造血幹細胞、骨髄間質細胞、表皮幹細胞、胚性幹細胞、間葉性幹細胞、臍帯幹細胞、前駆細胞、筋肉前駆細胞、筋芽細胞、心筋芽細胞、神経前駆細胞、グリア前駆細胞、神経前駆細胞、肝芽細胞の供給源からの細胞と融合し得る。
実施形態において、標的細胞は、がん細胞ではなく、例えば、膠芽腫細胞ではない。実施形態において、標的細胞は、幹細胞または完全に分化した細胞である。
ランディングパッドの実施形態などのためのフソゲン結合パートナー
ある特定の態様では、本開示は、対象における標的細胞に膜封入調製物を送達する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、対象に、フソソーム、例えば、フソゲン、例えば、ミオメーカータンパク質をコードする核酸を含む膜封入調製物を投与することを含み、核酸は、対象におけるフソソームの表面上にフソゲンを発現させる条件下で、細胞内で存在しないまたは発現しない（例えば、存在するが、転写または翻訳されない）。いくつかの実施形態において、本方法は、対象に、薬剤、例えば治療剤、およびフソゲン結合パートナーを含み、任意に担体、例えば膜を含む組成物を、フソソームにおけるフソゲンおよびフソゲン結合パートナーの融合を可能にする条件下で投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、担体は、膜、例えば脂質二重層を含み、例えば、薬剤は、脂質二重層内に配置される。いくつかの実施形態において、脂質二重層は、標的細胞と融合し、それによって、対象における薬剤を標的細胞に送達する。
一実施形態において、フソゲン結合パートナーは、例えば、標的細胞、例えば、本明細書に開示される標的細胞の膜（例えば脂質二重層）内に配置されている部分、例えばタンパク質分子である。一実施形態において、膜は、細胞表面膜、またはオルガネラの細胞内膜、例えば、ミトコンドリア、リソソーム、またはゴルジ装置であり得る。一実施形態において、フソゲン結合パートナーは、（例えば、本明細書に記載の方法によって）内因的に発現され得るか、または外因的に発現され得る。一実施形態において、フソゲン結合パートナーは、膜で他のフソゲン結合パートナーとクラスター化することができる。
一実施形態において、標的細胞の膜におけるフソゲン結合パートナーまたは複数のフソゲン結合パートナーの存在は、標的細胞（例えば、本明細書に記載の細胞）上のフソゲン結合パートナーと、フソソーム（例えば、本明細書に記載のフソソーム）におけるフソゲンとの間の相互作用、例えば結合を促進することができる界面を作り出す。いくつかの実施形態において、フソソームにおけるフソゲンは、例えば、標的細胞上の、例えば、標的細胞の膜（例えば、脂質二重層）上のフソゲン結合パートナーと相互作用、例えば結合して、標的膜とのフソソームの融合を誘導する。いくつかの実施形態において、フソゲンは、ミトコンドリアを含む細胞内オルガネラ上のランディングパッド上のフソゲン結合パートナーと相互作用、例えば結合して、細胞内オルガネラとのフソソームの融合を誘導する。
フソゲン結合パートナーは、以下で議論される方法のいずれかによって、標的細胞、例えば本明細書に開示される標的細胞に導入され得る。
一実施形態において、フソゲン結合パートナーを標的細胞に導入する方法は、対象（例えば、本明細書に記載の対象）からの（例えば、アフェレーシスまたは生検を介して）標的細胞の除去、例えば、抽出、および例えば、フソゲン結合パートナーが標的細胞の膜上で発現することを可能にする条件下でのフソゲン結合パートナーの投与、例えば、それへの曝露を含む。一実施形態において、本方法は、エクスビボでフソゲン結合パートナーを発現する標的細胞を、フソゲンを含むフソソームと接触させて、フソソームの標的細胞膜との融合を誘導することをさらに含む。一実施形態において、フソソームに融合した標的細胞は、対象に、例えば静脈内で再導入される。
一実施形態において、フソゲン結合パートナーを発現する標的細胞は、対象に、例えば静脈内で再導入される。一実施形態において、本方法は、対象に、フソゲンを含むフソソームを投与して、フソソームにおけるフソゲンと標的細胞におけるフソゲン結合パートナーとの相互作用、例えば結合、およびフソソームの標的細胞との融合を可能にすることをさらに含む。
いくつかの実施形態において、標的細胞は、内因性細胞表面分子、例えば、フソゲン結合パートナー、例えば、臓器、組織、または細胞標的化分子の発現を増加または減少させるために、後成的修飾因子、例えば、小分子後成的修飾因子で処置され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質または低分子量分子である。一実施形態において、標的細胞は、内因性細胞表面分子、例えば、フソゲン結合パートナー、例えば、臓器、組織、または細胞標的化分子の発現を増加させるために、遺伝的に修飾され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質または低分子量分子である。一実施形態において、遺伝子修飾は、内因性細胞表面分子、例えば、フソゲン結合パートナーの転写活性化因子の発現を減少させ得る。
一実施形態において、標的細胞は、外因性細胞表面分子、例えば、フソゲン結合パートナーを発現させる、例えば過剰発現させるために、遺伝的に修飾され、細胞表面分子は、タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量分子である。
いくつかの実施形態において、標的細胞は、細胞内の外因性フソゲンの発現、例えば導入遺伝子の送達を増加させるために、遺伝的に修飾される。いくつかの実施形態において、核酸、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡは、例えば、細胞表面分子（タンパク質、グリカン、脂質、または低分子量分子）の発現を増加または減少させるために、標的細胞に移される。いくつかの実施形態において、核酸は、フソゲン結合パートナー、例えば、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ構築物のリプレッサーを標的とする。いくつかの実施形態において、核酸は、フソゲン結合パートナーリプレッサーの阻害剤をコードする。
使用方法
本明細書に記載の薬学的組成物の投与は、経口、吸入、経皮または非経口（静脈内、腫瘍内、腹腔内、筋肉内、腔内、および皮下を含む）投与によるものであり得る。フソソームは、単独で投与され得るか、または薬学的組成物として製剤化され得る。
フソソームは、単位用量の経口、非経口、経皮、または吸入組成物などの単位用量組成物の形態で投与され得る。そのような組成物は、混合によって調製され、経口、吸入、経皮、または非経口投与に適切に適応し、それ自体、錠剤、カプセル、経口液体製剤、粉末、顆粒、ロゼンジ、再構成可能な粉末、注射可能および注入可能な溶液もしくは懸濁液、または座薬もしくはエアロゾルの形態であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソーム組成物の送達は、細胞の分化、脱分化、または分化転換を誘導またはブロックし得る。標的哺乳動物細胞は、前駆細胞であり得る。あるいは、標的哺乳動物細胞は、分化細胞であってもよく、細胞運命の変化には、多能性前駆細胞への脱分化の促進、またはそのような脱分化の遮断が含まれる。細胞運命の変化が望まれる状況では、細胞運命誘導分子またはシグナルをコードする本明細書に記載のフソソームの有効量が、細胞運命の変化が誘導されるような条件下で標的細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のフソソームは、細胞の亜集団を第１の表現型から第２の表現型に再プログラムするのに有用である。このような再プログラミングは、一時的または永続的であり得る。任意に、再プログラミングは、標的細胞に中間表現型を採用するように誘導する。
標的細胞集団における細胞分化を減少させる方法も提供される。例えば、１つ以上の前駆細胞タイプを含む標的細胞集団は、組成物が前駆細胞の分化を低減するような条件下で、本明細書に記載のフソソーム組成物と接触する。ある特定の実施形態において、標的細胞集団は、哺乳動物対象の損傷組織、または外科的処置の影響を受ける組織を含む。前駆細胞は、例えば、間質前駆細胞、神経前駆細胞、または間葉前駆細胞である。
カーゴを含む本明細書に記載のフソソーム組成物は、細胞組織または対象にそのようなカーゴを送達するために使用してもよい。本明細書に記載のフソソーム組成物の投与によるカーゴの送達は、細胞タンパク質発現レベルを修正してもよい。ある特定の実施形態において、投与される組成物は、ポリペプチドが送達される細胞中で実質的に存在しないまたは減少する機能的活性を提供する１つ以上のカーゴ（例えば、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ）の上方調節（細胞中の発現、細胞中の送達、または細胞内での誘導を介して）を導く。例えば、欠損している機能的活性は、本質的には酵素的、構造的、または調節的であり得る。関連する実施形態において、投与される組成物は、ポリペプチドが上方調節される細胞に存在するが、実質的に欠損する機能的活性を（例えば相乗的に）増加させる１つ以上のポリペプチドの上方調節を導く。ある特定の実施形態において、投与される組成物は、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡが送達される細胞に存在するか、または上方調節される機能的活性を抑制する１つ以上のカーゴ（例えば、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ）の下方調節（細胞中の発現、細胞中の送達、または細胞内での誘導を介して）を導く。例えば、上方調節された機能的活性は、本質的には酵素的、構造的、または調節的であり得る。関連する実施形態において、投与される組成物は、ポリペプチドが下方調節される細胞に存在するか、または上方調節される機能的活性を（例えば相乗的に）減少加させる１つ以上のポリペプチドの下方調節を導く。ある特定の実施形態において、投与される組成物は、ある特定の機能的活性の上方調節および他の機能的活性の下方調節を導く。
実施形態において、フソソーム組成物（例えば、ミトコンドリアまたはＤＮＡを含むもの）は、標的細胞への効果を媒介し、この効果は、少なくとも１、２、３、４、５、６、もしくは７日間、２、３、もしくは４週間、または１、２、３、６、もしくは１２カ月持続する。いくつかの実施形態（例えば、フソソーム組成物が外因性タンパク質を含む）において、この効果は、１、２、３、４、５、６、もしくは７日間、２、３、もしくは４週間、または１、２、３、６、もしくは１２カ月未満持続する。
エクスビボ適用
実施形態において、本明細書に記載のフソソーム組成物は、細胞または組織、例えばヒト細胞または組織にエクスビボで送達される。実施形態において、組成物は、エクスビボで細胞または組織の機能を改善し、例えば、細胞生存率、呼吸、または他の機能（例えば、本明細書に記載の別の機能）を改善する。
いくつかの実施形態において、組成物は、（例えば、外傷、疾患、低酸素症、虚血または他の損傷からの）損傷状態にあるエクスビボ組織に送達される。
いくつかの実施形態において、組成物は、エクスビボ移植（例えば、組織外植片または移植のための組織、例えば、ヒトの静脈、骨または腱などの筋骨格移植片、角膜、皮膚、心臓弁、神経；または、単離もしくは培養された臓器、例えば、ヒトに移植される臓器、例えば、ヒトの心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、眼）に送達される。組成物は、移植前、移植中、および／または移植後に、組織または臓器に送達され得る。
いくつかの実施形態において、組成物は、細胞、例えば細胞調製物と送達、投与、または接触される。細胞調製物は、細胞療法調製物（ヒト対象への投与を意図した細胞調製物）であり得る。実施形態において、細胞調製物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、例えば、組換えＣＡＲを発現する細胞を含む。ＣＡＲを発現する細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞であり得る。実施形態において、細胞調製物は、神経幹細胞調製物である。実施形態において、細胞調製物は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）調製物である。実施形態において、細胞調製物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）調製物である。実施形態において、細胞調製物は、膵島細胞調製物である。
インビボでの使用
本明細書に記載のフソソーム組成物は、対象、例えば哺乳動物、例えばヒトに投与することができる。そのような実施形態において、対象は、特定の疾患または状態（例えば、本明細書に記載の疾患または状態）のリスクがあり得るか、その症状を有し得るか、あるいはそれを有すると診断または特定され得る。
いくつかの実施形態において、フソソームの供給源は、フソソーム組成物を投与される同じ対象からのものである。他の実施形態において、それらは、異なる。例えば、フソソームの供給源およびレシピエント組織は、自己（同じ対象から）または異種（異なる対象から）であり得る。いずれの場合でも、本明細書に記載のフソソーム組成物のドナー組織は、レシピエント組織とは異なる組織タイプであってもよい。例えば、ドナー組織は、筋肉組織であってもよく、レシピエント組織は、結合組織（例えば脂肪組織）であってもよい。他の実施形態において、ドナー組織およびレシピエント組織は、同じまたは異なるタイプであってもよいが、異なる器官系からのものであってもよい。
本明細書に記載のフソソーム組成物は、がん、自己免疫疾患、感染症、代謝性疾患、神経変性疾患、または遺伝病（例えば、酵素欠乏症）を有する対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、対象は、再生を必要としている。
いくつかの実施形態において、フソソームは、膜融合を阻害するタンパク質の阻害剤と同時投与される。例えば、サプレシン（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｙｎ）は、細胞間融合を阻害するヒトタンパク質である（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ” Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３：１４６２ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１４６２）。したがって、いくつかの実施形態において、フソソームは、サプレシン、例えばｓｉＲＮＡまたは阻害抗体の阻害剤と同時投与される。
非ヒト適用
本明細書に記載の組成物はまた、農場または作業動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）、ペットまたは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、トリ、ライオン、トラ、およびクマなど）、水産養殖動物（サカナ、カニ、エビ、カキなど）、植物種（木、作物、観賞用の花など）、発酵種（サッカロミセスなど）を含むが、これらに限定されない、様々な他の生物の細胞または組織機能または生理学を同様に調節するために使用してもよい。本明細書に記載のフソソーム組成物は、そのような非ヒト供給源から作製され、非ヒト標的細胞または組織または対象に投与され得る。
フソソーム組成物は、標的に対して自己由来、同種異系、または異種であり得る。
本明細書に引用されるすべての参考文献および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、当業者に知られている他の手順、方法論、または技術を代わりに使用され得る、それらの例示的な性質によって理解されるであろう。
実施例１．化学的処置（ＰＥＧ）を介して除核融合細胞の生成
ドナーＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄ（ミトコンドリア特異的標的色素）を、０．２５％トリプシンでトリプシン処理し、収集し、５００ｘｇで５分間回転させ、ＰＢＳで１回洗浄し、計数した。続いて、１０×１０＾６細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのサイトカラシン－Ｂが追加される完全ＭＥＭ－アルファ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）中の３ｍｌの１２．５％フィコールに１５分間再懸濁した。細胞を除核するために、それらを、以下のフィコール画分からなる不連続フィコール勾配に移した（上から下へ）：２ｍｌの１２．５％フィコール、０．５ｍｌの１５％フィコール、０．５ｍｌの１６％フィコール、２ｍｌの１７％フィコール勾配、２ｍｌの２５％フィコール。すべてのフィコール勾配画分は、１０ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンＢが対かされる完全なＤＭＥＭで作製した。勾配を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ－４０超遠心機、Ｔｉ－７０ローターで１０７９７１ｘｇ、３７℃で１時間回転させた。遠心分離後、除核されたＨｅＬａ細胞を、１２．５％、１５％、１６％、および１７％フィコール画分の１／２から収集し、完全なＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）に再懸濁し、５００ｘｇで５分間回転してペレットにする。除核したＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー細胞を、ＤＭＥＭ中で２回洗浄した。同時に、レシピエントＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＧＦＰ（ミトコンドリア特異的標的化色素）をトリプシン処理し、計数し、融合のために調製した。
融合のために、除核されたＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナーＨｅＬａ細胞を、５０％ポリエチレングリコール溶液（１０％ＤＭＳＯでＤＭＥＭ完全で調製された、５０ｗ／ｖ％ＰＥＧ）中で、３７℃で１分間、Ｍｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞（各２００，０００個）と１：１の比で混合した。続いて、細胞を、１０ｍｌの完全ＤＭＥＭで３回洗浄し、３５ｍｍのガラス底の象限イメージング皿に５０ｋ細胞／象限の密度で播種し、各象限は１．９ｃｍ２の面積を有した。
実施例２．化学処理（ＰＥＧ）による有核融合細胞の生成
ドナーＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＤｓＲｅｄ（ミトコンドリア特異的標的色素）を０．２５％トリプシンでトリプシン処理し、収集し、５００ｘｇで５分間回転させ、ＰＢＳで１回洗浄し、計数した。続いて、２×１０＾６細胞を、完全なＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン、＋グルタミン）に再懸濁し、計数し、融合のために調製した。
Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー細胞を、ＤＭＥＭで３回洗浄した。同時に、レシピエントＨｅＬａ細胞を発現するＭｉｔｏ－ＧＦＰ（ミトコンドリア特異的標的化色素）をトリプシン処理し、計数し、融合のために調製した。
融合のために、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナーＨｅＬａ細胞を、５０％ポリエチレングリコール溶液（１０％ＤＭＳＯでＤＭＥＭ完全で調製された、５０ｗ／ｖ％ＰＥＧ）中で、３７℃で１分間、Ｍｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞（各２００，０００個）と１：１の比で混合した。続いて、細胞を、１０ｍｌの完全ＤＭＥＭで３回洗浄し、３５ｍｍのガラス底の象限イメージング皿に５０ｋ細胞／象限の密度で播種し、各象限は１．９ｃｍ２の面積を有した。
実施例３．外因性フソゲンを発現するＨｅＬａ細胞の作製
この実施例は、外因性フソゲンを発現する組織培養細胞の作製について説明する。次の実施例は、任意のタンパク質ベースのフソゲンに等しく適用でき、初代細胞（懸濁液または付着）および組織での産生にも等しく適用できる。ある特定の場合によっては、（フソゲンおよびフソゲン結合パートナーとして表される）融合を誘発するために必要なフソゲンペアを使用することができる。
フソゲン遺伝子、融合障害１（ＥＦＦ－１）を、ｐＩＲＥＳ２－ＡｃＧＦＰ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化し、次いで、この構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ－２（商標）、ＡＴＣＣ）にトランスフェクトする。フソゲン結合パートナー遺伝子であるアンカー細胞融合障害１（ＡＦＦ－１）を、ｐＩＲＥＳ２ ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ ２ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化し、次いで、この構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＨｅＬａ細胞（ＣＣＬ－２（商標）、ＡＴＣＣ）にトランスフェクトする。トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、および５００ｍｇ／ｍＬのゼオシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２で維持される。ＥＦＦ－１発現細胞は、ＥＦＦ－１フソゲンを発現するＧＦＰ＋Ｈｅｌａ細胞の純粋な集団を得るために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を選別することによって単離される。ＡＦＦ－１発現細胞は、ＡＦＦ－１フソゲン結合パートナーを発現するＤＳＲＥＤ＋Ｈｅｌａ細胞の純粋な集団を得るために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を選別することによって単離される。
実施例４．化学的に強化された融合性除核細胞を介したオルガネラ送達
実施例１に記載のように産生および融合された融合性細胞（Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー除核細胞およびＭｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞）を、イメージング皿への堆積から２４時間後、６３倍の倍率でＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０倒立共焦点顕微鏡で画像化した。Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄのみおよびＭｉｔｏ－ＧＦＰのみを発現する細胞を、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびＭｉｔｏ－ＧＦＰの両方が存在し、同時に取得される条件下で、２つのチャネル間でシグナルの重複がないことを確保するような方法で、取得設定を構成するために、別々に画像化した。対象となる１０個の領域は、完全に公平な方法で選択され、最低１００個の細胞が下流分析に使用可能であるように、唯一の基準が、最低１０個の細胞が各ＲＯＩ内に含まれた。これらの画像中の所与のピクセルは、いずれかのチャネル（ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰ）の強度が３つのＲＯＩ全体のそれぞれのチャネルの最大強度値の１０％を超える場合、ミトコンドリアが陽性であると判断された。
細胞内のミトコンドリアの５０％超（ｍｉｔｏ－ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ－Ｄｓ－Ｒｅｄ＋であるすべてのピクセルによって特定される）が、上記の閾値に基づいて、ｍｉｔｏＤｓ－Ｒｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰの両方で陽性であるという基準に基づいて特定され、これらのタンパク質を含むオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が送達され、融合され、それらの内容が混ざり合っていることを示す。２４時間の時点で、図７に示すように、複数の細胞は、融合を介してオルガネラの陽性送達を示した。これは、ドナーＨｅＬａ細胞とレシピエントのＨｅＬａ細胞との間での融合を介した陽性オルガネラ送達の画像である。白で示された細胞内領域は、ドナーのミトコンドリアとレシピエントのミトコンドリアとの間での重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重複しない場所を示す。
実施例５．化学的に強化された融合性有核細胞を介したオルガネラ送達
実施例２に記載のように産生および組み合わされた融合性細胞（Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄドナー細胞およびＭｉｔｏ－ＧＦＰレシピエントＨｅＬａ細胞）を、イメージング皿への堆積から２４時間後、６３倍の倍率でＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０倒立共焦点顕微鏡で画像化した。Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄのみおよびＭｉｔｏ－ＧＦＰのみを発現する細胞を、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびＭｉｔｏ－ＧＦＰの両方が存在し、同時に取得される条件下で、２つのチャネル間でシグナルの重複がないことを確保するような方法で、取得設定を構成するために、別々に画像化した。対象となる１０個の領域は、完全に公平な方法で選択され、最低１００個の細胞が下流分析に使用可能であるように、唯一の基準が、最低１０個の細胞が各ＲＯＩ内に含まれた。これらの画像中の所与のピクセルは、いずれかのチャネル（ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰ）の強度が３つのＲＯＩ全体のそれぞれのチャネルの最大強度値の２０％を超える場合、ミトコンドリアが陽性であると判断された。
細胞内のミトコンドリアの５０％超（ｍｉｔｏ－ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ－Ｄｓ－Ｒｅｄ＋であるすべてのピクセルによって特定される）が、上記の閾値に基づいて、ｍｉｔｏＤｓ－Ｒｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰの両方で陽性であるという基準に基づいて特定され、これらのタンパク質を含むオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が送達され、融合され、それらの内容が混ざり合っていることを示す。２４時間の時点で、図８に示すように、複数の細胞は、融合を介してオルガネラの陽性送達を示した。これは、ドナーＨｅＬａ細胞とレシピエントのＨｅＬａ細胞との間での融合を介した陽性オルガネラ送達の画像である。白で示された細胞内領域は、ドナーのミトコンドリアとレシピエントのミトコンドリアとの間での重複を示す。灰色の細胞内領域は、ドナーおよびレシピエントのオルガネラが重複しない場所を示す。
実施例６．タンパク質強化された融合性除核細胞を介したミトコンドリアの送達
実施例３に記載のように産生および組み合わされた融合性細胞を、イメージング皿への堆積から２４時間後、６３倍の倍率でＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０倒立共焦点顕微鏡で画像化する。Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄのみおよびＭｉｔｏ－ＧＦＰのみを発現する細胞を、Ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびＭｉｔｏ－ＧＦＰの両方が存在し、同時に取得される条件下で、２つのチャネル間でシグナルの重複がないことを確保するような方法で、取得設定を構成するために、別々に画像化する。対象となる１０個の領域は、完全に公平な方法で選択され、最低の細胞の数が下流分析に使用可能であるように、唯一の基準が、最低１０個の細胞が各ＲＯＩ内に含まれる。これらの画像中の所与のピクセルは、いずれかのチャネル（ｍｉｔｏ－ＤｓＲｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰ）の強度が３つのＲＯＩ全体のそれぞれのチャネルの最大強度値の１０％を超える場合、ミトコンドリアが陽性であると判断される。
細胞内のミトコンドリアの５０％超（ｍｉｔｏ－ＧＦＰ＋またはｍｉｔｏ－Ｄｓ－Ｒｅｄ＋であるすべてのピクセルによって特定される）が、上記の閾値に基づいて、ｍｉｔｏＤｓ－Ｒｅｄおよびｍｉｔｏ－ＧＦＰの両方で陽性であるという基準に基づいて特定され、これらのタンパク質を含むオルガネラ（この場合、ミトコンドリア）が送達され、融合され、それらの内容が混ざり合っていることを示すであろう。２４時間の時点で、複数の細胞は、融合を介してオルガネラの陽性送達を示すと予想される。
実施例７：核酸のエレクトロポレーションによるフソソームの生成
この実施例は、フソゲンをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）を用いた細胞または小胞のエレクトロポレーションによるフソソームの生成について説明する。
クローン断片（例えば、水疱性口内炎ウイルス［ＶＳＶ－Ｇ］からの糖タンパク質、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ番号ＯＧ５９２）のオープンリーディングフレームと一緒にピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含むトランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２９３Ｔにエレクトロポレーションされる。
２０％ウシ胎児血清および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で３～５日間１μｇ／μＬのピューロマイシンで選択した後、細胞を、１×ＰＢＳ、氷冷溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１１１７））で洗浄し、１回当たり１０～１５秒間、３回超音波処理し、１６，０００ｘｇで２０分間遠心分離する。ＶＳＶ－Ｇに特異的なプローブを使用して、回収された上清画分に対してウエスタンブロットを行い、安定にトランスフェクトされた細胞もしくは対照細胞から調製されたフソソームからＶＳＶ－Ｇの非膜特異的濃度を決定し、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の標準と比較する。
実施形態において、安定にトランスフェクトされた細胞からのフソソームは、安定してトランスフェクトされなかった細胞から生成されたフソソームよりも多くのＶＳＶ－Ｇを有するであろう。
実施例８：タンパク質のエレクトロポレーションによるフソソームの生成
この実施例は、フソソームを生成するためのフソゲンのエレクトロポレーションについて説明する。
約５×１０６個の細胞または小胞は、エレクトロポレーショントランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、エレクトロポレーションのために使用される。マスターミックスを設定するために、２４μｇの精製タンパク質フソゲンを、再懸濁緩衝液（キットに提供される）に添加する。混合物を、室温で１０分間インキュベートする。それと同時に、細胞または小胞を、滅菌試験管に移し、５００×ｇで５分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレットを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない１ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。次いで、フソゲンを含む緩衝液を使用して、細胞または小胞のペレットを再懸濁する。細胞または小胞の懸濁液はまた、パルス電圧、パルス幅、およびパルスの数が異なる最適化条件にも使用される。エレクトロポレーション後、フソゲンを含むエレクトロポレーションした細胞または小胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上に保持する。
例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５を参照のこと。
実施例９：小胞形成および遠心分離によるフソソームの生成および単離
この実施例は、小胞形成および遠心分離を介したフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームが単離され得る方法のうちの１つである。
フソソームは、以下のように調製される。約４×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中の１０ｃｍ皿に播種する。播種から１日後、１５μｇのフソゲン発現プラスミドまたはウイルスを、細胞に送達する。フソゲンの発現に十分な時間が経過した後、培地を、１００μＭのＡＴＰを補充した新鮮な培地によって慎重に置き換える。上清を、フソゲンの発現から４８～７２時間後に回収し、０．４５μｍのフィルターで濾過することによって清澄化し、１５０，０００ｘｇで１時間超遠心分離する。ペレット化した材料を、氷冷ＰＢＳに一晩再懸濁する。フソソームを、実験のために所望の緩衝液に再懸濁する。
例えば、Ｍａｎｇｅｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９ ｎｏ．９，１６５６－１６６６，Ｓｅｐｔ．２０１１を参照のこと。
実施例１０：巨大原形質膜フソソームの生成および単離
この実施例は、小胞形成および遠心分離を介したフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームが単離され得る方法のうちの１つである。フソソームは、以下のように調製される。
簡単に説明すると、フソゲンを発現するＨｅＬａ細胞を、緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、溶液（ＧＰＭＶ緩衝液中の１ｍＭのＤＴＴ、１２．５ｍＭのパラホルムアルデヒド、１ｍＭのＮ－エチルマレイミド）に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートする。フソソームは、まず、１００ｘｇで１０分間の遠心分離により細胞を除去し、次いで、２０，０００ｘｇで、４℃で１時間、フソソームを回収することによって、細胞から清澄化される。フソソームを、実験のために所望の緩衝液に再懸濁する。
例えば、Ｓｅｚｇｉｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｕｓｉｎｇ ｇｉａｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｌａｓｍａ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．７（６）：１０４２－５１ ２０１２を参照のこと。
実施例１１：フソソームゴーストの生成および単離
この実施例は、低張処理および遠心分離を介したフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームが生成され得る方法のうちの１つである。
第１に、フソソームは、主に細胞破裂およびフソソームが形成されるように低張処理を使用することによって、フソゲンを発現する間葉系幹細胞（１０９個の細胞）から単離される。特定の実施形態によれば、細胞を、低張液、トリスマグネシウム緩衝液（ＴＭ、例えば、４℃でｐＨ７．４またはｐＨ８．６、ＨＣｌで行われたｐＨ調整）に再懸濁する。細胞膨張は、位相差顕微鏡法によってモニタリングされる。細胞が膨張してフソソームが形成されたら、懸濁液を、ホモジナイザーに入れる。典型的には、約９５％の細胞破裂は、細胞計数および標準のＡＯＰＩ染色を通して測定するのに十分である。次いで、膜／フソソームを、保存のためにスクロース（０．２５Ｍ以上）に入れる。あるいは、フソソームは、軽度の超音波処理（Ａｒｋｈｉｖ ａｎａｔｏｍｉｉ、ｇｉｓｔｏｌｏｇｉｉ ｉ
ｅｍｂｒｉｏｌｏｇｉｉ；１９７９，Ａｕｇ，７７（８） ５－１３；ＰＭＩＤ：４９６６５７）、凍結融解（ Ｎａｔｕｒｅ．１９９９，Ｄｅｃ ２；４０２（６７６１）：５５１－５；ＰＭＩＤ：１０５９１２１８）、Ｆｒｅｎｃｈ－ｐｒｅｓｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ５４１，２０１４，Ｐａｇｅｓ １６９－１７６；ＰＭＩＤ：２４４２３２６５）、針通過（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｎｕｃｌｅａｒ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）、または洗剤含有溶液への可溶化（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／８９９００）などの細胞を溶解するために、当該技術分野で周知の他のアプローチによって形成され得る。
付着を避けるために、フソソームを、プラスチックチューブに入れて、遠心分離する。最上部のより明るい灰色の薄層がほとんどフソソームを含む、積層ペレットが生成される。しかしながら、収穫を高めるために、ペレット全体が処理される。遠心分離（例えば、４℃で１５分間３，０００ｒｐｍ）および洗浄（例えば、２０容量のトリスマグネシウム／ＴＭ－スクロースｐＨ７．４）は、繰り返してもよい。
次のステップでは、フソソーム画分を、不連続スクロース密度勾配での浮遊によって分離する。洗浄したペレットには少量の過剰な上清が残っており、これには、フソソーム、核、および不完全に破裂した全細胞を含む。ＴＭ、ｐＨ８．６中のさらなる６０ｗ／ｗ％のスクロースを、懸濁液に添加して、屈折計で４５％のスクロースの読み取り値を得る。このステップ後、すべての溶液は、ＴＭ ｐＨ８．６である。１５ｍｌの懸濁液を、ＳＷ－２５．２硝酸セルロースチューブに入れ、それぞれ、４０ｗ／ｗ％および３５ｗ／ｗ％のスクロースの１５ｍｌの層を追加し、次いで、５ｍｌのＴＭ－スクロース（０．２５Ｍ）を追加することによって、懸濁液に不連続勾配を形成する。次いで、試料を、２０，０００ｒｐｍで、４℃で１０分間遠心分離する。核沈殿物は、ペレットを形成し、不完全に破壊した全細胞を、４０％～４５％の界面で収集し、フソソームを、３５％～４０％の界面で収集する。複数のチューブからフソソームを、収集し、プールする。
例えば、国際特許公開ＷＯ２０１１０２４１７２Ａ２を参照のこと。
実施例１２：押し出しによるフソソームの生成
この実施例は、膜を通して押し出すことによるフソソームの製造について説明する。
簡単に説明すると、フソゲンを発現する造血幹細胞は、プロテアーゼ阻害剤カクテル（セットＶ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ５３９１３７－１ＭＬ）を含む無血清培地中に１×１０６個の細胞／ｍＬの密度で３７℃の懸濁液中にある。細胞を、ルアーロックシリンジで吸引し、使い捨ての５ｍｍのシリンジフィルターを１回通過させて滅菌チューブに入れる。膜が汚れて目詰まりした場合、取り外して新しいフィルターを取り付ける。全細胞懸濁液がフィルターを通過した後、５ｍＬの無血清培地を、プロセスで使用されるすべてのフィルターに通過させて、フィルター（複数可）を通して任意の残りの物質を洗浄する。次いで、溶液を、濾液中の押し出されたフソソームと組み合わせる。
フソソームは、５ｍｍ～０．２ｍｍの範囲内でますます小さいフィルターの細孔サイズを有する同じ方法に従って押し出しを続けることでさらに小さくすることができる。最終的な押し出しが完了すると、懸濁液は、遠心分離によってペレット化され（必要な時間および速度はサイズによって異なる）、培地に再懸濁される。
さらに、このプロセスは、既存の細胞骨格構造が押し出しに与える影響を減らすために、アクチン細胞骨格阻害剤を使用して補充することができる。簡単に説明すると、１×１０６個の細胞／ｍＬ懸濁液を、５００ｎＭのラトランキュリンＢ（ａｂ１４４２９１，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む無血清培地でインキュベートし、５％ＣＯ２の存在下で、３７℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、細胞をルアーロックシリンジに吸引し、前述のように押し出しを行う。
フソソームをペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄して、培地に再懸濁する前に、細胞骨格阻害剤を除去する。
実施例１３：タンパク質による化学処理によるフソソームの生成
この実施例は、フソソームを生成するための化学物質を媒介したフソゲンの送達について説明する。約５×１０６個の細胞または小胞は、化学物質を媒介したフソゲンの送達のために使用される。細胞または小胞を、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に懸濁する。マスターミックスを設定するために、２４μｇの精製タンパク質フソゲンを、２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合し、２μｌの脂質トランスフェクション試薬３０００を含む２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加する。細胞または小胞およびフソゲン溶液は、フソゲンが細胞または小胞膜に組み込まれるように、プレートを静かに回転させ、３７℃で６時間インキュベートすることによって混合される。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で保持する。
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照のこと。
実施例１４：フソゲン含有リポソームによる処理によるフソソームの生成
この実施例は、フソソームを生成するための供給源細胞へのリポソームを媒介したフソゲンの送達について説明する。約５×１０６個の細胞または小胞は、リポソームを媒介したフソゲンの送達のために使用される。細胞または小胞を、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に懸濁する。フソゲンタンパク質は、ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドの存在下で細胞から精製される。ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドは、内在性膜タンパク質を可溶化するのに使用される軽度の洗剤である。次いで、フソゲンタンパク質は、Ｔｏｐ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２４：２９８０－２９８８，２００５に記載されるように、ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシド－懸濁タンパク質をｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドで予め飽和させたＬＵＶと混合し、続いて、ｎ－オクチルｂ－Ｄ－グルコピラノシドを除去することによって、大きな（直径４００ｎｍ）単層小胞（ＬＵＶ）に再構成される。マスターミックスを設定するために、２４μｇの総融合タンパク質を含む多量のリポソームを、５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合する。次いで、リポソームおよび供給源細胞またはベシクルの溶液は、フソゲンタンパク質が供給源細胞または小胞膜に組み込まれるように、プレートを静かに回転させ、フソゲン含有リポソームおよび供給源細胞または小胞の融合を可能にする条件下で、３７℃で６時間インキュベートすることによって混合される。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で保持する。
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照のこと。
実施例１５：細胞から自由に放出される融合性微小胞の単離
この実施例は、遠心分離によるフソソームの分離について説明する。これは、フソソームが単離され得る方法のうちの１つである。
フソソームは、示差遠心分離によってフソゲンを発現する細胞から単離される。培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）は、まず、超遠心分離によって、１００，０００ｘｇ超で１時間、小粒子を清澄化する。次いで、清澄化した培養培地を使用して、フソゲンを発現するマウス胚線維芽細胞を成長させる。２００ｘｇで１０分間の遠心分離によって、細胞を、培養培地から分離する。上清を収集し、５００ｘｇで１０分間で２回、２，０００ｘｇで１５分間で１回、１０，０００ｘｇで３０分間で１回、および７０，０００ｘｇで６０分間で１回、連続して遠心分離する。自由に放出されたフソソームを、最後の遠心分離ステップでペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、７０，０００ｘｇで再ペレット化する。最終ペレットを、ＰＢＳに再懸濁する。
Ｗｕｂｂｏｌｔｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１０９６３－１０９７２ ２００３も参照のこと。
実施例１６：フソソームの物理的除核
この実施例は、細胞骨格の不活性化および遠心分離によるフソソームの除核について説明する。これは、フソソームが修飾され得る方法のうちの１つである。
フソソームは、フソゲンを発現する哺乳動物の初代または不死化細胞株から単離される。細胞は、アクチン骨格阻害剤による処理および超遠心分離によって除核される。簡単に説明すると、Ｃ２Ｃ１２細胞を収集し、ペレット化し、１２．５％Ｆｉｃｏｌｌ ４００（Ｆ２６３７、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）および５００ｎＭのラトランキュリンＢ（ａｂ１４４２９１、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を含むＤＭＥＭに再懸濁し、３７℃＋５％ＣＯ２で３０分間インキュベートする。懸濁液を、５％ＣＯ２の存在下で、３７℃で一晩平衡化したＤＭＥＭに溶解したＦｉｃｏｌｌ ４００の増加する濃度（１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、１層当たり３ｍＬ）を含む超遠心分離チューブに慎重に層にする。Ｆｉｃｏｌｌ勾配を、Ｔｉ－７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）で３２，３００ＲＰＭ、３７℃で６０分間回転させる。超遠心分離後、１６～１８％のＦｉｃｏｌｌの間に見られるフソソームを取り除き、ＤＭＥＭで洗浄し、ＤＭＥＭに再懸濁する。
実施例３５に記載されるように、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２による核内容物の染色、続いて、フローサイトメトリーおよび／または画像の使用を実施して、核の放出を確認する。
実施例１７：照射によるフソソームの修飾
次の実施例は、ガンマ線照射によるフソソームの修飾について説明する。理論によって拘束されることなく、ガンマ線照射は、ＤＮＡの二本鎖切断を引き起こし、細胞にアポトーシスを誘導し得る。
まず、フソゲンを発現している細胞を、（例えば、細胞を培養または播種することによって）コンフルエントな密度を下回る組織培養フラスコまたはプレート上で単層で培養する。次いで、コンフルエントなフラスコから培地を除去し、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳですすぎ、トリプシン処理して、培養マトリックスから細胞を除去する。次いで、細胞ペレットを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まない１０ｍｌの組織培養培地に再懸濁し、１００ｍｍのペトリ皿に移す。ペレット中の細胞の数は、１５０ｃｍ２のフラスコで１０～１５個のコンフルエントなＭＥＦ培養から得られ得るものと同等でなければならない。次いで、細胞を、γ線源から４０００ラドに照射して、フソソームを生成する。次いで、フソソームを洗浄し、使用した最終緩衝液または培地に再懸濁する。
実施例１８：化学処理によるフソソームの修飾
次の実施例は、マイトマイシンＣ処理によるフソソームの修飾について説明する。いかなる特定の理論によって拘束されることなく、マイトマイシンＣ処理は、細胞周期を不活性化することによってフソソームを修飾する。
まず、フソゲンを発現している細胞を、（例えば、細胞を培養または播種することによって）コンフルエントな密度で組織培養フラスコまたはプレート上で単層から培養する。１ｍｇ／ｍｌのマイトマイシンＣストック溶液を培地に加えて、最終濃度を１０μｇ／ｍｌにする。次いで、プレートをインキュベーターに２～３時間戻す。次いで、コンフルエントなフラスコから培地を除去し、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＨＢＳＳですすぎ、トリプシン処理して、培養マトリックスから細胞を除去する。次いで、細胞を洗浄し、使用する最終緩衝液または培地に再懸濁する。
例えば、Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＭＥＦ） Ｆｅｅｄｅｒ
Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｄａｖｉｄ Ａ．Ｃｏｎｎｅｒ ２００１を参照のこと。
実施例１９：フソソームにおける転写活性の欠如
この実施例は、フソソームの生成に使用される親細胞、例えば供給源細胞と比較したフソソームにおける転写活性を定量化する。一実施形態において、転写活性は、親細胞、例えば供給源細胞と比較して、フソソームでは低いか、または存在しないであろう。
フソソームは、治療剤を送達するための筐体である。高効率で細胞または局所組織環境に送達され得るｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および／またはオルガネラなどの治療剤は、通常は、レシピエント組織中で病理学的に低いまたは高いレベルで活性ではない経路または活性のある経路を調節するために使用することができる。一実施形態において、フソソームが転写することができない、またはフソソームがそれらの親細胞よりも低い転写活性を有するという観察は、核物質の除去が十分に起こったことを実証するであろう。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。十分な数のフソソームおよびフソソームを生成するために使用される親細胞を、２０％ウシ胎児血清、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、および蛍光標識可能なアルキン－ヌクレオシドＥＵを含むＤＭＥＭ中の６ウェル低付着マルチウェルプレートに、３７℃および５％ＣＯ２で１時間播種する。陰性対照の場合、十分な数のフソソームおよび親細胞はまた、２０％ウシ胎児血清、１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むが、アルキン－ヌクレオシドＥＵを含まないＤＭＥＭ中のマルチウェルプレートにも播種する。
１時間のインキュベーション後、画像キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の製造業者の取扱説明書に従って、試料を処理する。陰性対照を含む細胞およびフソソーム試料を、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、４８８ｎｍの励起用アルゴンレーザーおよび５３０＋／－３０ｎｍの発光を使用してフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって分析する。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを、取得および分析のために使用した。光散乱チャネルは、線形利得に設定され、蛍光チャネルは、対数尺度で設定され、最低１０，０００個の細胞が各条件で分析される。
一実施形態において、陰性対照の５３０＋／－３０ｎｍ発光により測定されるように、転写活性は、アルキン－ヌクレオシドＥＵの排除によりヌルになるであろう。いくつかの実施形態において、フソソームは、親細胞よりも約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下より少ない転写活性を有する。
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００８，Ｏｃｔ １４；１０５（４１）：１５７７９－８４．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０８４８０１０５．Ｅｐｕｂ ２００８ Ｏｃｔ ７も参照のこと。
実施例２０：ＤＮＡ複製または複製活性の欠如
この実施例は、フソソームにおけるＤＮＡ複製を定量化する。一実施形態において、フソソームは、細胞と比較して低い割合でＤＮＡを複製するであろう。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームおよび親細胞のＤＮＡ複製活性は、蛍光標識可能なヌクレオチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃Ｃ１０６３２）の取り込みによって評価される。ジメチルスルホキシドを含むＥｄＵストック溶液の調製後、フソソームおよび同等数の細胞を、１０μＭの最終濃度のＥｄＵで２時間インキュベートする。次いで、試料を、３．７％ＰＦＡを使用して１５分間固定し、１×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４の０．５％洗剤溶液で１５分間透過処理する。
透過処理後、０．５％洗剤を含むＰＢＳ緩衝液に懸濁したフソソームおよび細胞を、１×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄し、反応カクテル、１×ＰＢＳ緩衝液、ＣｕＳＯ４（成分Ｆ）、アジド蛍光４８８、１×反応緩衝液添加剤で２１℃で３０分間インキュベートする。
フソソームおよび細胞ＤＮＡ複製活性の陰性対照は、上記と同じように処理された試料で作製されるが、１×反応カクテルにはアジド蛍光４８８は含まれない。
次いで、細胞およびフソソームの試料を洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析する。フローサイトメトリーは、４８８ｎｍの励起用アルゴンレーザーで、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行い、５３０＋／－ ３０ｎｍの発光スペクトルを収集する。ＦＡＣＳ分析ソフトウェアは、取得および分析のために使用される。光散乱チャネルは、線形利得に設定され、蛍光チャネルは、対数尺度で設定され、最低１０，０００個の細胞が各条件で分析される。相対的なＤＮＡ複製活性は、各試料中のアジド蛍光４８８の中央値強度に基づいて計算される。すべての事象は、前方および側方散乱チャネルで獲得される（あるいは、ゲートは、フソソーム集団のみを選択するためにゲートを適用され得る）。フソソームのために正規化された蛍光強度値は、フソソームの中央値蛍光強度値からそれぞれの陰性対照試料の中央値蛍光強度値を減じることによって決定される。次いで、フソソーム試料のために正規化された相対的なＤＮＡ複製活性は、ＤＮＡ複製活性の定量的測定値を生成するために、それぞれの有核細胞試料に対して正規化される。
一実施形態において、フソソームは、親細胞よりも少ないＤＮＡ複製活性を有する。
Ｓａｌｉｃ，２４１５－２４２０，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７１２１６８１０５も参照のこと。
実施例２１：核酸カーゴでフソソームを修飾するためのエレクトロポレーション
この実施例は、核酸カーゴによるフソソームのエレクトロポレーションについて説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。約１０９個のフソソームおよび１μｇの核酸、例えばＲＮＡを、エレクトロポレーション緩衝液（水中の１．１５ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．２、２５ｍＭの塩化カリウム、６０ｗ／ｖ％イオジキサノール）中で混合する。フソソームは、エレクトロポレーションシステム（ＢｉｏＲａｄ、１６５－２０８１）を使用して、単一の４ｍｍキュベットを使用してエレクトロポレーションされる。フソソームおよび核酸は、４００Ｖ、１２５μＦ、∞オームでエレクトロポレーションされ、キュベットは、すぐに氷に移される。エレクトロポレーション後、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で保持する。
例えば、Ｋａｍｅｒｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ
ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ＫＲＡＳ
ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７を参照のこと。
実施例２２：タンパク質カーゴでフソソームを修飾するためのエレクトロポレーション
この実施例は、タンパク質カーゴによるフソソームのエレクトロポレーションについて説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。約５×１０６個のフソソームは、エレクトロポレーショントランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、エレクトロポレーションのために使用される。マスターミックスを設定するために、２４μｇの精製タンパク質カーゴを、再懸濁緩衝液（キットに提供される）に添加する。混合物を、室温で１０分間インキュベートする。その間に、フソソームを、滅菌試験管に移し、５００×ｇで５分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレットを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない１ｍｌのＰＢＳに再懸濁する。次いで、タンパク質カーゴを含む緩衝液を使用して、フソソームのペレットを再懸濁する。次いで、フソソーム懸濁液は、パルス電圧、パルス幅、およびパルスの数が異なる最適化条件に使用される。エレクトロポレーション後、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で保持する。
例えば、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５を参照のこと。
実施例２３：核酸カーゴで修飾するためのフソソームの化学処理
この実施例は、化学処理を介したフソソームへの核酸カーゴのローディングについて説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。約１０６個のフソソームを、１０，０００ｇ、４℃で５分間の遠心分離によってペレット化する。次いで、ペレット化したフソソームを、２０μｇのＤＮＡを含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁する。フソソーム：ＤＮＡ溶液を、穏やかな洗剤で処理して、フソソーム膜にわたってＤＮＡ透過性を高める（試薬Ｂ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ，カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。溶液を、再び遠心分離し、ペレットを、硫酸プロタミンなどの正電荷ペプチドを含む緩衝液に再懸濁して、ＤＮＡをローディグしたフソソームと標的レシピエント細胞との間の親和性を増加させる（試薬Ｃ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ，カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。ＤＮＡをローディグした後、ローディグしたフソソームを、使用前に氷上に保持する。
Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ，２００３も参照のこと。
実施例２４：タンパク質カーゴで修飾するためのフソソームの化学処理
この実施例は、化学処理を介したフソソームへのタンパク質カーゴのローディングについて説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。約１０６個のフソソームを、１０，０００ｇ、４℃で５分間の遠心分離によってペレット化する。次いで、ペレット化したフソソームを、硫酸プロタミンなどの正電荷ペプチドを含む緩衝液に再懸濁して、フソソームとカーゴタンパク質との間の親和性を増加させる（試薬Ａ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ，カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。次に、１０μｇのカーゴタンパク質を、フソソーム溶液に添加し、続いて、穏やかな潜在を添加して、フソソーム膜にわたってタンパク質透過性を高める（試薬Ｂ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ、カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。溶液を、再び遠心分離し、ペレットを、硫酸プロタミンなどの正電荷ペプチドを含む緩衝液に再懸濁して、タンパク質をローディグしたフソソームと標的レシピエント細胞との間の親和性を増加させる（試薬Ｃ、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，ＬＴＤ，カタログ番号ＩＳＫ－ＧＮ－００１－ＥＸ）。タンパク質をローディグした後、ローディグしたフソソームを、使用前に氷上に保持する。
Ｙａｓｏｕｋａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ
ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＶＪ－Ｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｌｅｒｇｅｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｈｉｎｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００７も参照のこと。
実施例２５：核酸カーゴで修飾するためのフソソームのトランスフェクション
この実施例は、フソソームへの核酸カーゴ（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）のトランスフェクションについて説明する。フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。
５×１０６個のフソソームが、Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍで維持される。０．５μｇの核酸を、２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合し、２μｌの脂質トランスフェクション試薬２０００を含む２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加する。核酸、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、および脂質トランスフェクション試薬の混合物を、室温で１５分間維持し、次いで、フソソームに添加する。全溶液は、プレートを静かに回転させ、３７℃で６時間インキュベートすることによって混合される。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で保持する。
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照のこと。
実施例２６：タンパク質カーゴで修飾するためのフソソームのトランスフェクション
この実施例は、フソソームへのタンパク質カーゴのトランスフェクションについて説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。５×１０６個のフソソームが、Ｏｐｔｉ－Ｍｅｍで維持される。０．５μｇの精製したタンパク質を、２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地と混合し、２μｌの脂質トランスフェクション試薬３０００を含む２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加する。タンパク質、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、および脂質トランスフェクション試薬の混合物を、室温で１５分間維持し、次いで、フソソームに添加する。全溶液は、プレートを静かに回転させ、３７℃で６時間インキュベートすることによって混合される。次いで、フソソームをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で保持する。
Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０８：４４－５３，２０１５も参照のこと。
実施例２７：脂質二重層構造を有するフソソーム
この実施例は、フソソームの組成について説明する。一実施形態において、フソソーム組成物は、中心に内腔を有する脂質二重層構造を含む。
理論に拘束されることを望まないが、フソソームの脂質二重層構造は、標的細胞との融合を促進し、フソソームが異なる治療剤のローディグを可能にする。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法を使用して新たに調製される。陽性対照は、陰性細胞株（ＨＥＫ２９３）であり、陰性対照は、冷ＤＰＢＳおよび膜破壊ＨＥＫ２９３細胞調製物であり、３６ゲージの針に５０回通過させている。
試料を、エッペンドルフチューブ中でスピンダウンし、上清を慎重に除去する。次いで、事前に温めた固定液（０．１ＭのＮａＣｌを含む０．０５Ｍのカコジル酸緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド、ｐＨ７．５；使用前に３７℃で３０分間維持する）を、試料ペレットに添加し、室温で２０分間保持する。固定後、試料をＰＢＳで２回洗浄する。四酸化オスミウム溶液を、試料ペレットに添加し、３０分間インキュベートする。ＰＢＳで１回すすいだ後、３０％、５０％、７０％、および９０％のヘキシレングリコールを添加し、それぞれ１５分間回転させながら洗浄する。次いで、１００％ヘキシレングリコールを、それぞれ、１０分間、３回回転させながら添加する。
樹脂を、ヘキシレングリコールと１：２の比率で混合し、試料に添加して、室温で２時間インキュベートする。インキュベーション後、溶液を、１００％樹脂に置き換え、４～６時間インキュベートする。このステップは、新たな１００％樹脂でもう１回繰り返される。次いで、１００％新たな樹脂と交換し、このレベルを深さ約１～２ｍｍに調整し、８～１２時間焼く。エッペンドルフチューブを切断し、試料を含むエポキシキャストの切片を、さらに１６～２４時間焼く。次いで、エポキシキャストを、細胞を有する側面に留意する小片に切断する。市販の５分間のエポキシ接着剤を使用して、セクショニングのためのブロックにピースを接着する。透過型電子顕微鏡（ＪＯＥＬ、米国）を使用して、８０ｋＶの電圧で試料を画像化する。
一実施形態において、フソソームは、陽性対照（ＨＥＫ２９３細胞）と同様の脂質二重層構造を示し、ＤＰＢＳ対照では明らかな構造は観察されない。一実施形態において、内腔構造は、破壊された細胞調製物において観察されないであろう。
実施例２８：フソゲン発現の検出
この実施例は、フソソームにおけるフソゲンの発現を定量化する。
クローン断片（例えば、水疱性口内炎ウイルス［ＶＳＶ－Ｇ］からの糖タンパク質、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ番号＃ＯＧ５９２）のオープンリーディングフレームと一緒にピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含むトランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２９３Ｔにエレクトロポレーションされる。
２０％ウシ胎仔血清および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで、１μｇ／μＬピューロマイシンで３～５日間選択した後、フソソームは、前述の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって、安定発現した細胞株または対照細胞から調製される。
次いで、フソソームを、１×ＰＢＳ、氷冷溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルＩＩＩ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１１１７））で洗浄し、毎回１０～１５秒間、３回超音波処理し、１６，０００ｘｇで２０分間遠心分離する。ＶＳＶ－Ｇに特異的なプローブを使用して、回収された上清画分に対してウエスタンブロットを行い、安定にトランスフェクトされた細胞もしくは対照細胞から調製されたフソソームからＶＳＶ－Ｇの非膜特異的濃度を決定し、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の標準と比較する。
一実施形態において、安定にトランスフェクトされた細胞からのフソソームは、安定してトランスフェクトされなかった細胞から生成されたフソソームよりも多くのＶＳＶ－Ｇを有するであろう。
実施例２９：フソゲンの定量化
この実施例は、フソソーム当たりのフソゲンの絶対数の定量化について説明する。
フソソームは、ＧＦＰでタグ付けされたフソゲン（ＶＳＶ－Ｇ）を発現するように前述の実施例に記載されるようにフソゲンが操作されることを除いて、前述の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって生成される。さらに、陰性対照のフソソームは、フソゲン（ＶＳＶ－Ｇ）またはＧＦＰが存在しないで操作される。
次いで、ＧＦＰでタグ付けされたフソゲンおよび陰性対照（複数可）を含むフソソームを、以下のようにフソゲンの絶対数についてアッセイする。市販の組換えＧＦＰを段階希釈して、タンパク質濃度の較正曲線を作成する。次いで、較正曲線のＧＦＰ蛍光および既知量のフソソームの試料を、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光光度計で測定して、フソソーム調製物におけるＧＦＰ分子の平均モル濃度を計算する。次いで、モル濃度を、ＧＦＰ分子の数に変換し、１試料当たりのフソソームの数で除算して、１フソソーム当たりのＧＦＰでタグ付けされたフソゲン分子の平均数を得、１フソソーム当たりのフソゲンの数の相対的評価を提供する。
一実施形態において、ＧＦＰ蛍光は、フソゲンまたはＧＦＰが存在しない陰性対照と比較して、ＧＦＰタグを有するフソソームにおいてより高いであろう。一実施形態において、ＧＦＰ蛍光は、存在するフソゲン分子の数に対して相対的である。
あるいは、個々のフソソームを、製造業者の取扱説明書によって単一細胞調製システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）を使用して単離し、市販のプローブセット（Ｔａｑｍａｎ）およびＣｔ値に基づいてフソゲンまたはＧＦＰ ｃＤＮＡレベルを定量化するように設計されたマスターミックスを使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施する。フソゲン遺伝子またはＧＦＰ遺伝子のクローニングされた断片と同じ配列のＲＮＡ標準は、合成（Ａｍｓｂｉｏ）によって生成され、次いで、Ｃｔの標準曲線対フソゲンまたはＧＦＰ ＲＮＡの濃度を構築するために、連続希釈法における単一細胞調製システムｑＲＴ－ＰＣＲ実験反応に添加される。
フソソームからのＣｔ値を、標準曲線と比較して、１フソソーム当たりのフソゲンまたはＧＦＰ ＲＮＡの量を決定する。
一実施形態において、フソゲンおよびＧＦＰ ＲＮＡは、フソゲンまたはＧＦＰが存在しない陰性対照と比較して、フソゲンを発現するように操作されたフソソームにおいてより高くなるであろう。
フソゲンは、前述のように脂質二重層構造を分析し、本明細書の他の実施例に記載されるようにＬＣ－ＭＳによって脂質二重層中のフソゲンを定量化することによって、脂質二重層中でさらに定量化され得る。
実施例３０：フソソームの平均サイズの測定
この実施例は、フソソームの平均サイズの測定について説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。市販のシステム（ｉＺＯＮ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して平均サイズを決定するために測定されたフソソーム。このシステムは、製造業者の取扱説明書に従ってソフトウェアと、４０ｎｍ～１０μｍのサイズ範囲内の粒子を分析するために設計されたナノ細孔とともに使用される。フソソームおよび親細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、最終濃度範囲を０．０１～０．１μｇのタンパク質／ｍＬにする。他の機器設定は、以下の表に示すように調整される。
Figure 2023153260000011
すべてのフソソームは、単離から２時間以内に分析される。一実施形態において、フソソームは、親細胞よりも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内、またはそれより大きいサイズを有する。
実施例３１：フソソームの平均サイズ分布の測定
この実施例は、フソソームのサイズ分布の測定について説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成され、前述の実施例で説明されたような市販のシステムを使用して粒子の平均サイズを決定するために試験される。一実施形態において、中央値を中心とするフソソームの１０％、５０％、および９０％のサイズ閾値を親細胞と比較して、フソソームのサイズ分布を評価する。
一実施形態において、フソソームは、試料の１０％、５０％、または９０％以内に、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満またはそれより少ない親細胞のサイズ分布の変動を有するであろう。
実施例３２：フソソームの平均体積
この実施例は、フソソームの平均体積の測定について説明する。理論に拘束されることを望まないが、フソソームのサイズ（例えば、体積）を変えることにより、異なるカーゴローディング、治療設計、または用途に対して万能であり得る。
フソソームは、前述の実施例で説明したように調製される。陽性対照は、既知のサイズのＨＥＫ２９３細胞またはポリスチレンビーズである。陰性対照は、３６ゲージの針に約５０回通過されているＨＥＫ２９３細胞である。
前述の実施例で説明されたように、透過型電子顕微鏡による分析を使用して、フソソームのサイズを決定する。フソソームの直径を測定し、体積を計算する。
一実施形態において、フソソームは、直径が約５０ｎｍ以上の平均サイズを有するであろう。
実施例３３：フソソームの平均密度
フソソーム密度は、Ｔｈｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｐｒ；Ｃｈａｐｔｅｒ ３：Ｕｎｉｔ ３．２２に記載されるように、連続的なショ糖勾配遠心分離アッセイを介して測定される。フソソームは、前述の実施例で説明したように得られる。
まず、ショ糖勾配が調製される。２Ｍおよび０．２５スクロース溶液は、それぞれ、４ｍｌのＨＥＰＥＳ／スクロースストック溶液および１ｍｌのＨＥＰＥＳストック溶液または０．５ｍｌのＨＥＰＥＳ／スクロースストック溶液および４．５ｍｌのＨＥＰＥＳストック溶液を混合することによって生成される。これらの２つの画分を、すべてのシャッターを閉じた状態で勾配マーカーに、磁気撹拌棒を用いて、近位コンパートメント中に２Ｍのスクロース溶液を、そして遠位コンパートメント中に０．２５Ｍのスクロース溶液をローディングする。勾配マーカーを、磁気撹拌プレート上に置き、近位コンパートメントと遠位コンパートメントの間のシャッターを開き、磁気撹拌プレートをオンにする。ＨＥＰＥＳストック溶液は、以下のように作製される：２．４ｇのＮ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；２０ｍＭ最終）、３００ Ｈ２Ｏ、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整し、最終的にＨ２Ｏを用いて容積を５００ｍｌに調整する。ＨＥＰＥＳ／ショ糖ストック溶液は、以下のように作製される：２．４ｇのヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；２０ｍＭ最終）、４２８ｇのプロテアーゼフリーショ糖（ＩＣＮ；２．５Ｍ最終）、１５０ｍｌのＨ２Ｏ、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整し、最終的にＨ２Ｏを用いて容積を５００ｍｌに調整する。
フソソームを、２ｍｌのＨＥＰＥＳ／スクロースストック溶液に再懸濁し、ＳＷ ４１遠心分離チューブの底に注ぐ。外側のチューブを、２ｍｌのフソソームのすぐ上にあるＳＷ ４１チューブに配置される。外側のシャッターを開き、連続した２Ｍ（下）から０．２５Ｍ（上）のショ糖勾配を、フソソームの上にゆっくりと注ぐ。勾配が注がれるとＳＷ
４１チューブが下がり、そのため、チューブは、常に液体の上部よりわずかに上になる。
勾配のあるすべてのチューブは、互いに、または同じ重量のショ糖溶液を含む他のチューブと釣り合いをとる。勾配は、ブレーキをローに設定したＳＷ ４１スイングバケットローターで、２１０，０００ｘｇ、４℃で一晩（１４時間以上）遠心分離する。
マイクロピペッターを使用して、上から下に１１個の１ｍｌの画分を収集し、ＴＬＡ－１００．３ローター用の３ｍｌチューブに入れる。試料を脇に置き、９６ウェルプレートの別々のウェルで、各画分の５０μｌを使用して屈折率を測定する。プレートは、蒸発を防ぐために粘着ホイルで覆われており、室温で１時間以下保管される。屈折計を使用して、９６ウェルプレートに保存された材料からの各画分の１０～２０μｌの屈折率（したがって、ショ糖濃度および密度）を測定する。
屈折率をｇ／ｍｌに変換するための表は、Ｂｅｃｋｍａｎのウェブサイトからダウンロード可能な超遠心分離カタログ内にある。
次いで、各画分は、タンパク質含有量分析用に調製される。２ミリリットルの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を、各１ｍｌの勾配画分に加え、２～３回ピペッティングすることによって混合する。各チューブの片側には、永久マーカーでマークが付けられ、チューブはＴＬＡ－１００．３ローターでマークされた側を上にして配置される。
希釈画分を含む３ｍｌのチューブを、１１０，０００ｘｇ、４℃で１時間遠心分離する。ＴＬＡ－１００．３ローターは、６本のチューブを保持するため、各勾配に対して２回の遠心分離が実行され、他のチューブは遠心分離することができるまで４℃に保たれる。
上清を、各３ｍｌのチューブから吸引し、ペレットの上に一滴を残す。ペレットはほとんど見えないが、その位置は、チューブのマークから推測され得る。目に見えないペレットを再懸濁し、微量遠心管に移す。各再懸濁画分の半分は、別の実施例に記載されているビシンコニン酸アッセイによるタンパク質含有量分析に使用される。これは、フソソーム調製物の様々な勾配画分にわたる分布が提供する。この分布は、フソソームの平均密度を決定するために使用される。タンパク質分析により画分にわたるフソソーム分布が明らかになったら、後半の体積画分を－８０℃で保存し、他の目的（例えば、機能分析、または免疫分離によるさらなる精製）のために使用する。
一実施形態において、このアッセイを使用して、フソソームの平均密度は、１．２５ｇ／ｍｌ＋／－０．０５標準偏差になる。一実施形態において、フソソームの平均密度は、１～１．１、１．０５～１．１５、１．１～１．２、１．１５～１．２５、１．２～１．３、または１．２５～１．３５の範囲にある。一実施形態において、フソソームの平均密度は、１未満または１．３５を超える。
実施例３４：フソソーム中のオルガネラ含有量の測定
この実施例は、フソソーム中のオルガネラの検出について説明する。
フソソームは、本明細書に記載されるように調製された。小胞体（ＥＲ）およびミトコンドリアの検出のために、フソソームまたはＣ２Ｃ１２細胞を、１μＭのＥＲ染色（Ｅ３４２５１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）および１μＭのミトコンドリア染色（Ｍ２２４２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。リソソームの検出のために、フソソームまたは細胞を、５０ｎＭのリソソーム染色（Ｌ７５２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。
染色したフソソームを、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で泳動し、以下の表に従って各色素の蛍光強度を測定した。オルガネラの存在の検証は、染色したフソソームの蛍光強度を非染色のフソソーム（陰性対照）および染色された細胞（陽性対照）と比較することによって行われた。
除核から５時間後、小胞体（図１）、ミトコンドリア（図２）、およびリソソーム（図３）に陽性である、フソソームを染色した。
Figure 2023153260000012
実施例３５：フソソームの核含有量の測定
この実施例は、フソソームの核含有量を測定する一実施形態を説明する。フソソームは核を含まないことを検証するために、フソソームを、１μｇ・ｍＬ－１ Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２および１μＭのＣａｌｃｅｉｎＡＭ（Ｃ３１００ＭＰ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で染色し、染色したフソソームを、Ａｔｔｕｎｅ ＮＸＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で作動させ、以下の表に従って各色素の蛍光強度を決定する。一実施形態において、サイトゾル（ＣａｌｃｅｉｎＡＭ）の存在および核の不在（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）の検証は、染色したフソソームの平均蛍光強度を非染色のフソソームおよび染色した細胞と比較することによって行われる。
Figure 2023153260000013
実施例３６：核エンベロープ含有量の測定
この実施例は、除核されたフソソーム中の核エンベロープ含有量の測定を説明する。核エンベロープは、細胞の細胞質からＤＮＡを分離する。
一実施形態において、精製フソソーム組成物は、本明細書に記載のように除核されたＨＥＫ－２９３Ｔ（２９３［ＨＥＫ－２９３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））などの哺乳動物細胞を含む。この実施例は、フソソーム生成後に残る無傷の核膜の量を測定するためのプロキシとして、異なる核膜タンパク質の定量化について説明する。
この実施例は、１０×１０６ ＨＥＫ－２９３Ｔおよび１０×１０６ ＨＥＫ－２９３Ｔから調製したフソソームの等量を、１×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄し、３．７％ＰＦＡを用いて１５分間固定し、同時に透過処理し、次いで、１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ７．４を含む１×ＰＢＳ緩衝液を使用して１５分間ブロックする。透過処理後、フソソームおよび細胞を、１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ７．４を含む１×ＰＢＳ緩衝液で希釈されたメーカー推奨濃度で、異なる一次抗体、例えば（抗ＲａｎＧＡＰ１抗体［ＥＰＲ３２９５］（Ａｂｃａｍ－ａｂ９２３６０）、抗ＮＵＰ９８抗体［ＥＰＲ６６７８］－核膜孔マーカー（Ａｂｃａｍ－ａｂ１２４９８０）、抗核孔複合体タンパク質抗体［Ｍａｂ４１４］－（Ａｂｃａｍ－ａｂ２４６０９）、抗インポーチン７抗体（Ａｂｃａｍ－ａｂ２１３６７０）を使用して、４℃で１２時間インキュベートする。次いで、フソソームおよび細胞を、１×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンおよび０．５％洗剤、ｐＨ７．４を含む１×ＰＢＳ緩衝液で希釈されたメーカー推奨濃度で、これまでに特定された一次抗体を検出する適当な蛍光二次抗体を使用して、２１℃で２時間インキュベートする。次いで、フソソームおよび細胞を、１×ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を含む３００μＬの１×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁し、２０μｍのＦＡＣＳチューブで濾過し、フローサイトメトリーによって分析する。
陰性対照は、同じ染色手順を使用して生成されるが、一次抗体は、添加されない。フローサイトメトリーは、４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起で、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行い、５３０＋／－３０ｎｍの発光スペクトルを収集する。ＦＡＣＳ取得ソフトウェアは、取得および分析のために使用される。光散乱チャネルは、線形利得に設定され、蛍光チャネルは、対数尺度で設定され、最低１０，０００個の細胞が各条件で分析される。相対的な無傷の核膜含有量は、各試料の蛍光強度の中央値に基づいて計算される。すべての事象は、前方および側方散乱チャネルで獲得される。
フソソームのために正規化された蛍光強度値は、フソソームの中央値蛍光強度値からそれぞれの陰性対照試料の中央値蛍光強度値を減じることによって決定される。次いで、フソソーム試料のために正規化された蛍光は、無傷の核膜含有量の定量的測定値を生成するために、それぞれの有核細胞試料に対して正規化される。
一実施形態において、除核されたフソソームは、有核親細胞と比較して、蛍光強度または核エンベロープ含有量を１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満含む。
実施例３７：クロマチンレベルの測定
この実施例は、除核されたフソソームのクロマチンの測定について説明する。
ＤＮＡをクロマチンに凝縮して、核内に収めることができる。一実施形態において、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって生成された精製フソソーム組成物は、低レベルのクロマチンを含む。
前述の方法のうちのいずれかによって調製された除核されたフソソームおよび陽性対照細胞（例えば、親細胞）を、ヒストンタンパク質Ｈ３またはヒストンタンパク質Ｈ４に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡを使用して、クロマチン含有量についてアッセイする。ヒストンは、クロマチンの主要なタンパク質成分であり、Ｈ３およびＨ４が主要なヒストンタンパク質である。
ヒストンは、市販のキット（例えば、Ａｂｃａｍ Ｈｉｓｔｏｎｅ抽出キット（ａｂ１１３４７６））または当該技術分野で知られている他の方法を使用して、フソソーム調製物および細胞調製物から抽出される。これらのアリコートは、使用するまで－８０℃で保存される。標準の連続希釈液は、精製ヒストンタンパク質（Ｈ３またはＨ４のいずれか）をアッセイ緩衝液の溶液で１～５０ｎｇ／μｌに希釈することによって調製される。アッセイ緩衝液は、メーカーによって供給されるキット（Ａｂｃａｍ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ４
Ｔｏｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ａｂ１５６９０９）またはＡｂｃａｍ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３ ｔｏｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ａｂ１１５０９１））から取得され得る。アッセイ緩衝液を、４８ウェルまたは９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、抗ヒストンＨ３抗体または抗Ｈ４抗体でコーティングし、試料または標準対照をウェルに添加して、各ウェルの総容量を５０μｌにする。次いで、プレートを覆い、３７℃で９０～１２０分間インキュベートする。
インキュベーション後、プレートに付着した抗ヒストン抗体に結合したヒストンは、検出用に調製される。上清を吸引し、このプレートを１５０μｌの洗浄緩衝液で洗浄する。次いで、抗ヒストンＨ３または抗Ｈ４捕捉抗体を含む捕捉緩衝液を、５０μｌの容量で１μｇ／ｍＬの濃度でプレートに添加する。次いで、プレートをオービタルシェーカー上で室温で６０分間インキュベートする。
次いで、プレートを吸引し、洗浄緩衝液を使用して６回洗浄する。次いで、捕捉抗体によって活性化可能なシグナルレポーター分子を、各ウェルに添加する。プレートを覆い、室温で３０分間インキュベートする。次いで、プレートを吸引し、洗浄緩衝液を使用して４回洗浄する。停止液を添加することによって、反応を停止する。プレートの各ウェルの吸光度は、４５０ｎｍで読み取られ、各試料のヒストン濃度は、４５０ｎｍの吸光度対標準試料中のヒストン濃度の標準曲線に従って計算される。
一実施形態において、フソソーム試料は、有核親細胞のヒストン濃度を１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満含む。
実施例３８：フソソームのＤＮＡ含有量の測定
この実施例は、有核の対照物と比較した、フソソーム内のＤＮＡ量の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、有核の対照物よりも少ないＤＮＡを有するであろう。核酸レベルは、総ＤＮＡまたは特定のハウスキーピング遺伝子のレベルを測定することによって決定される。一実施形態において、ＤＮＡ含有量が減少したか、またはＤＮＡを実質的に欠いているフソソームは、遺伝子を複製、分化、または転写することができず、このことは、対象に投与されたときに、それらの用量および機能が変化しないことを保証する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームおよび供給源細胞のタンパク質によって測定されるのと同じ質量の調製物を使用して、総ＤＮＡを単離し（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙカタログ番号６９５０４などのキットを使用して）、続いて、ＤＮＡによる吸光度を評価するための標準分光法を使用して、ＤＮＡ濃度を決定する（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して）。
一実施形態において、除核されたフソソーム中のＤＮＡの濃度は、親細胞よりも約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下より少ない。
あるいは、ＧＡＰＤＨなどの特定のハウスキーピング遺伝子の濃度は、半定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて有核細胞とフソソームの間で比較することができる。総ＤＮＡは、親細胞およびフソソームから単離され、ＤＮＡ濃度は、本明細書に記載されるように測定される。ＲＴ－ＰＣＲは、以下の反応テンプレートを使用して、ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３０９１５５）で実行される。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：１０μＬ
０．４５μＭの順方向プライマー：１μＬ
０．４５μＭの逆方向プライマー：１μＬ
ＤＮＡテンプレート：１０ｎｇ
ＰＣＲグレード水：可変
順方向および逆方向プライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られる。以下の表は、プライマー対いおよびそれに関連する配列を詳述する。
Figure 2023153260000014
リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、以下のプロトコルで増幅および検出を実行する。
変性、９４℃ ２分
次の配列の４０サイクル：
変性、９４℃ １５秒
アニーリング、伸長、６０℃ １分
Ｃｔ対ＤＮＡ濃度の標準曲線は、ＧＡＰＤＨ ＤＮＡの連続希釈液で作成され、フソソームＰＣＲ結果からＣｔ核値を特定量（ｎｇ）のＤＮＡに正規化するために使用される。
一実施形態において、除核されたフソソーム中のＧＡＰＤＨ ＤＮＡの濃度は、親細胞中よりも約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下より少ない。
実施例３９：フソソームのｍｉＲＮＡ含有量の測定
この実施例は、フソソーム内のｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、ｍｉＲＮＡを含む。
ＭｉＲＮＡは、他の活性の中でも、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がタンパク質に翻訳される速度を制御する調節要素である。一実施形態において、ｍｉＲＮＡを運ぶフソソームを使用して、ｍｉＲＮＡを標的部位に送達することができる。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームまたは親細胞からのＲＮＡは、前述のように調製される。少なくとも１つのｍｉＲＮＡ遺伝子は、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｍ／ｍｉｒｎａ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌのＳａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｍｉＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙから選択される。 ｍｉＲＮＡは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（２０），２００５に記載されるように調製される。すべてのＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡアッセイは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ａ２５５７６、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を通して入手できる。
ｑＰＣＲは、ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡに関する製造業者の仕様に従って実行され、ＣＴ値は、本明細書に記載のリアルタイムＰＣＲシステムを使用して、生成および分析される。
一実施形態において、フソソームのｍｉＲＮＡ含有量は、親細胞のｍｉＲＮＡ含有量よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。
実施例４０：フソソームの内因性ＲＮＡまたは合成ＲＮＡの発現の定量化
この実施例は、発現が変化した内因性ＲＮＡ、またはフソソームで発現する合成ＲＮＡのレベルの定量化について説明する。
フソソームまたは親細胞は、細胞機能をフソソームに媒介する内因性または合成ＲＮＡの発現を変えるように操作されている。
トランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、タンパク質剤のクローン断片のオープンリーディングフレームと一緒にピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含む。ベクターは、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２９３Ｔにエレクトロポレーションされる。
２０％ウシ胎児血清および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで、ピューロマイシンで３～５日間選択した後、フソソームは、前述の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって、安定発現した細胞株から調製される。
前述の実施例に記載されるように、個々のフソソームを単離し、１フソソーム当たりのタンパク質剤またはＲＮＡを定量化する。
実施形態において、フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６またはそれ以上のＲＮＡを有する。
実施例４１：フソソーム中の脂質組成の測定
この実施例は、フソソームの脂質組成の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞と同様である。脂質組成は、サイズ、静電相互作用、およびコロイド挙動などのフソソームおよび細胞の重要な生物物理学的パラメーターに影響する。
脂質の測定は、質量分析に基づいている。フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。
質量分析に基づいた脂質分析は、記載されるように、脂質分析サービス（Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行される（Ｓａｍｐａｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２０１１，Ｆｅｂ １；１０８（５）：１９０３－７）。脂質は、２段階のクロロホルム／メタノール手順を使用して抽出される（Ｅｊｓｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，２００９，Ｍａｒ １７；１０６（７）：２１３６－４１）。試料に、カルジオリピン１６：１／１５：０／１５：０／１５：０（ＣＬ）、セラミド１８：１；２／１７：０（Ｃｅｒ）、ジアシルグリセロール１７：０／１７：０（ＤＡＧ）、ヘキソシルセラミド１８：１；２／１２：０（ＨｅｘＣｅｒ）、リゾホスファチデート１７：０（ＬＰＡ）、リゾ－ホスファチジルコリン１２：０（ＬＰＣ）、リゾ－ホスファチジルエタノールアミン１７：１（ＬＰＥ）、リゾ－ホスファチジルグリセロール１７：１（ＬＰＧ）、リゾ－ホスファチジルイノシトール１７：１（ＬＰＩ）、リゾ－ホスファチジルセリン１７：１（ＬＰＳ）、ホスファチデート１７：０／１７：０（ＰＡ）、ホスファチジルコリン１７：０／１７：０（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン１７：０／１７：０（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール１７：０／１７：０（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール１６：０／１６：０（ＰＩ）、ホスファチジルセリン１７：０／１７：０（ＰＳ）、コレステロールエステル２０：０（ＣＥ）、スフィンゴミエリン１８：１；２／１２：０；０（ＳＭ）、およびトリアシルグリセロール１７：０／１７：０／１７：０（ＴＡＧ）の内部脂質標準混合物をスパイクする。
抽出後、有機相を注入プレートに移し、速度真空濃縮機で乾燥させる。第１のステップの乾燥抽出物を、クロロホルム／メタノール／プロパノール（１：２：４、Ｖ：Ｖ：Ｖ）中の７．５ｍＭの酢酸アンモニウムに再懸濁し、第２のステップの乾燥抽出物を、クロロホルム／メタノールのメチルアミン（０．００３：５：１；Ｖ：Ｖ：Ｖ）の３３％エタノール溶液に再懸濁する。すべての液体処理ステップは、ピペッティング用の抗液滴制御特性（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ）を備えた有機溶媒用ロボットプラットフォームを使用して実行される。
試料は、イオン源（Ａｄｖｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えた質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）直接注入することによって分析される。試料は、１回の取り込みで、ＭＳの場合はＲｍ／ｚ＝２００＝２８００００、タンデムＭＳ／ＭＳ実験の場合はＲｍ／ｚ＝２００＝１７５００の解像度で、陽性および陰性イオンモードの両方で分析される。ＭＳ／ＭＳは、１Ｄａ単位でスキャンされた対応するＭＳ質量範囲を含む包含リストによって引き起こされる（Ｓｕｒｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ ｌｉｐｉｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５，Ｏｃｔ；１１７（１０）：１５４０－９）。ＭＳデータおよびＭＳ／ＭＳデータの両方を組み合わせて、アンモニウム付加物としてＣＥ、ＤＡＧ、およびＴＡＧイオン、アセテート付加物としてＰＣ、ＰＣ Ｏ－、ならびに脱プロトン化アニオンとしてＣＬ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＥ Ｏ－、ＰＧ、ＰＩ、およびＰＳをモニタリングする。ＭＳのみを使用して、脱プロトン化アニオンとしてＬＰＡ、ＬＰＥ、ＬＰＥ Ｏ－、ＬＰＩ、およびＬＰＳ、アセテートとしてＣｅｒ、ＨｅｘＣｅｒ、ＳＭ、ＬＰＣ、およびＬＰＣ Ｏ－をモニタリングする。
以下の参考文献に記載されるように、社内で開発された脂質同定ソフトウェアを使用してデータを分析する（Ｈｅｒｚｏｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ，２０１１，Ｊａｎ １９；１２（１）：Ｒ８、Ｈｅｒｚｏｇ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１２，Ｊａｎ；７（１）：ｅ２９８５１）。シグナル対ノイズ比が５を超え、対応する空試料よりも５倍高いシグナル強度を持つ脂質の同定のみに対して、さらなるデータ分析が考慮される。
フソソームの脂質組成は、親細胞の脂質組成と比較される。一実施形態において、親細胞の同定された脂質の５０％超がフソソームに存在する場合、フソソームおよび親細胞は、同様の脂質組成を有し、これらの同定された脂質のフソソームのレベルは、親細胞の対応する脂質レベルの２５％超である。
実施例４２：フソソーム中のプロテオーム組成の測定
この実施例は、フソソームのタンパク質組成の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する細胞に同様である。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームを、溶解緩衝液（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０中の４ｗ／ｖ％ Ｃｈａｐｓ）に再懸濁し、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートする。次いで、混合物を氷浴で５分間超音波処理して溶解し、１３，０００ＲＰＭで５分間遠心分離する。タンパク質含有量は、比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定され、各試料のタンパク質は、新しいチューブに移され、体積は、５０ｍＭのトリスｐＨ８で均等化される。
タンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴを使用して６５℃で１５分間還元し、暗所で室温で３０分間、１５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化する。６容量の冷（－２０℃）アセトンを徐々に加えてタンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩インキュベートする。タンパク質ペレットを、冷（－２０℃）メタノールで３回洗浄する。タンパク質を、５０ｍＭのトリスｐＨ８．３に再懸濁する。
次いで、撹拌しながら３７℃で消化の最初の４時間、トリプシン／ｌｙｓＣをタンパク質に添加する。試料を、５０ｍＭのトリスｐＨ８で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムを追加のトリプシン／ｌｙｓＣと共に添加して、撹拌しながら３７℃で一晩消化する。消化が停止し、２ｖ／ｖ％ギ酸の添加によってデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１３，０００ＲＰＭで１分間の遠心分離によって透明にする。ペプチドを、逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって精製し、乾燥させる。試料を、２０μｌの３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸水溶液で再構成し、ＬＣ－ＭＳによって分析される。
定量的測定を行うために、タンパク質標準も機器で実行される。標準ペプチド（Ｐｉｅｒｃｅ、等モル、ＬＣ－ＭＳグレード、番号８８３４２）を、４、８、２０、４０、および１００ｆｍｏｌ／ｕｌに希釈し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析される。１タンパク質当たり５つの最高ペプチド（３ ＭＳ／ＭＳトランジション／ペプチド）の平均ＡＵＣ（曲線下面積）を、各濃度について計算し、標準曲線を作成する。
２５μｍの内径キャピラリーを有するエレクトロスプレーインターフェースを備え、マイクロ超高速液体クロマトグラフィー（μＵＨＰＬＣ）（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）と連結した高分解能質量分析計（ＡＢＳｃｉｅｘ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で、取得を実行する。分析ソフトウェアは、機器を制御し、データの処理および取得のために使用される。電源電圧は、５．２ｋＶに設定され、２２５℃に維持され、カーテンガスは、２７ｐｓｉ、ガス１は１２ｐｓｉ、ガス２は１０ｐｓｉに設定される。取得は、タンパク質データベースでは情報依存性取得（ＩＤＡ）モードで、試料ではＳＷＡＴＨ取得モードで実行される。分離は、逆相カラムで内径０．３μｍ、粒子２．７μｍ、長さ１５０ｍｍ（Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）で行われ、６０℃に維持される。試料は、５μＬのループにループを埋めることによって注入される。１２０分間（試料）ＬＣ勾配の場合、移動相には、３μＬ／分の流速で、溶媒Ａ（０．２ｖ／ｖ％ギ酸および３ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ水溶液）および溶媒Ｂ（０．２ｖ／ｖ％ギ酸およびＥｔＯＨ中３％のＤＭＳＯが含まれる。
タンパク質の絶対定量では、１タンパク質当たり５つの最良ペプチド（１ペプチド当たり３ ＭＳ／ＭＳイオン）のＡＵＣの合計を使用して、標準曲線（５ポイント、Ｒ２＞０．９９）が生成される。試料分析用のデータベースを生成するために、ＤＩＡＵｍｐｉｒｅアルゴリズムが１２個の試料のそれぞれで実行され、出力ＭＧＦファイルと組み合わされて１つのデータベースになる。このデータベースは、ソフトウェア（ＡＢＳｃｉｅｘ）で使用され、最大５つのトランジション／ペプチドおよび５つのペプチド／タンパク質を使用して、各試料のタンパク質を定量化する。計算されたスコアが１．５を上回るか、またはＦＤＲが１％未満である場合、ペプチドは適切に測定されたと見なされる。適切に測定されたペプチドの各々のＡＵＣの合計は、標準曲線にマッピングされ、ｆｍｏｌとして報告される。
次いで、得られたタンパク質定量データを分析して、次のようにタンパク質レベルおよび既知のタンパク質クラスの割合を決定する：酵素は、酵素委員会（ＥＣ）番号で注釈されるタンパク質として特定され、ＥＲ関連タンパク質は、ミトコンドリアではなくＥＲの遺伝子オントロジー（ＧＯ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ）細胞コンパートメント分類を持つタンパク質として特定され、エキソソーム関連タンパク質は、ミトコンドリアではなくエキソソームの遺伝子オントロジー細胞内コンパートメント分類を持つタンパク質として特定され、ミトコンドリアタンパク質は、ＭｉｔｏＣａｒｔａデータベースでミトコンドリアとして特定されるタンパク質として特定される（Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２０１５ｌ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ１００３）。これらのカテゴリーの各々のモル比は、各クラスのすべてのタンパク質のモル量の合計を、各試料ですべての同定されたタンパク質のモル量の合計で除算することによって決定される。
フソソームのプロテオーム組成は、親細胞のプロテオーム組成と比較される。一実施形態において、特定されたタンパク質の５０％超がフソソームに存在し、それらの同定されたタンパク質のレベルが親細胞の対応するタンパク質レベルの２５％超である場合、フソソームと親細胞の間の同様のプロテオーム組成が観察される。
実施例４３：１フソソーム当たりの内因性または合成タンパク質レベルの定量化
この実施例は、フソソーム内の内因性または合成タンパク質カーゴの定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、内因性または合成タンパク質カーゴを含む。
フソソームまたは親細胞は、内因性タンパク質の発現を変化させるか、または治療的もしくは新規の細胞機能を媒介する合成カーゴを発現するように操作されている。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のオープンリーディングフレームに任意に翻訳融合された、タンパク質薬剤のクローン断片のオープンリーディングフレームと一緒にピューロマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを含むトランスポザーゼベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）。ベクターは、エレクトロポレーター（Ａｍａｘａ）および２９３Ｔ細胞株特異的核トランスフェクションキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、２９３Ｔにエレクトロポレーションされる。
２０％ウシ胎児血清および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで、ピューロマイシンで３～５日間選択した後、フソソームは、前述の実施例に記載の方法のうちのいずれか１つによって、安定発現した細胞株から調製される。
内因性タンパク質の発現レベルの変化、またはＧＦＰに融合されていない合成タンパク質の発現レベルは、上記のように質量分析によって定量化される。実施形態において、フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６またはそれ以上のタンパク質薬剤を有する。
あるいは、精製ＧＦＰを、２０％ウシ胎児血清および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで連続希釈して、タンパク質濃度の標準曲線を作成する。標準曲線のＧＦＰ蛍光およびフソソームの試料を、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用して蛍光計（ＢｉｏＴｅｋ）で測定して、フソソームにおけるＧＦＰ分子の平均モル濃度を計算する。次いで、モル濃度を、ＧＦＰ分子の数に変換し、１試料当たりのフソソームの数で除算して、１フソソーム当たりのタンパク質薬剤の数の平均数に達する。
実施形態において、フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０３、５．０×１０３、１０４、５．０×１０４、１０５、５．０×１０５、１０６、５．０×１０６またはそれ以上のタンパク質薬剤を有する。
実施例４４：フソソーム中のエキソソームタンパク質のマーカーの測定
このアッセイでは、試料調製のプロテオミクス構造の定量化について説明し、エキソソームの特異的マーカーであることが知られているタンパク質の割合を定量化する。
フソソームはペレット化され、標準的な生物学的試料の取り扱い手順に従ってプロテオミクス分析センターに冷凍されて出荷される。
フソソームは、タンパク質の抽出および分析のために解凍される。まず、フソソームを、溶解緩衝液（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０中の４ｗ／ｖ％ Ｃｈａｐｓ）に再懸濁し、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートする。次いで、混合物を氷浴で５分間超音波処理して溶解し、１３，０００ＲＰＭで５分間遠心分離する。総タンパク質含有量は、比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定され、各試料の１００μｇのタンパク質は、新しいチューブに移され、体積は、５０ｍＭのトリスｐＨ８で均等化される。
タンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴを使用して６５℃で１５分間還元し、暗所で室温で３０分間、１５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化する。次いで、６容量の冷（－２０℃）アセトンを徐々に加えてタンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩インキュベートする。
タンパク質をペレット化し、冷（－２０℃）メタノールで３回洗浄し、５０ｍＭのトリスｐＨ８に再懸濁する。撹拌しながら３７℃で消化の最初の４時間、３．３３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣをタンパク質に添加する。試料を、５０ｍＭのトリスｐＨ８で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムをさらに３．３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣと共に添加して、撹拌しながら３７℃で一晩消化する。消化が停止し、２ｖ／ｖ％ギ酸の添加によってデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１３，０００ＲＰＭで１分間の遠心分離によって透明にする。
タンパク質は、逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって精製され、乾燥される。試料を、３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸水溶液で再構成し、前述のようにＬＣ－ＭＳによって分析される。
得られたタンパク質定量データを分析して、既知のエキソソームマーカータンパク質のタンパク質レベルおよび割合を決定する。具体的には、テトラスパニンファミリータンパク質（ＣＤ６３、ＣＤ９、またはＣＤ８１）、ＥＳＣＲＴ関連タンパク質（ＴＳＧ１０１、ＣＨＭＰ４Ａ－Ｂ、またはＶＰＳ４Ｂ）、Ａｌｉｘ、ＴＳＧ１０１、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＧＰ９６、アクチニン－４、ミトフィリン、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＡＤＡＭ１０、ＥＨＤ４、シンテニン－１、ＴＳＧ１０１、ＥＨＤ１、フロチリン－１、熱ショック７０ｋＤａタンパク質（ＨＳＣ７０／ＨＳＰ７３、ＨＳＰ７０／ＨＳＰ７２）。測定されたすべてのタンパク質に対するこれらのエキソソームマーカータンパク質のモル比は、各試料ですべての同定されたタンパク質のモル量の合計で除算した上記の各特定のエキソソームマーカータンパク質のモル量として決定され、割合として表す。
同様に、測定されたすべてのタンパク質に対するすべてのエキソソームマーカータンパク質のモル比は、各試料ですべての同定されたタンパク質のモル量の合計で除算した上記のすべての特定のエキソソームマーカータンパク質のモル量の合計として決定され、合計の割合として表す。
一実施形態において、このアプローチを使用すると、試料は、任意の個々のエキソソームマーカータンパク質の５％未満および総エキソソームマーカータンパク質の１５％未満含む。
一実施形態において、任意の個々のエキソソームマーカータンパク質は、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、または１０％未満で存在する。
一実施形態において、すべてのエキソソームマーカータンパク質の合計は、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％未満である。
実施例４５：フソソーム中のＧＡＰＤＨの測定
このアッセイでは、フソソームのグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベル、および親細胞と比較したフソソームのＧＡＰＤＨの相対レベルの定量化について説明する。
ＧＡＰＤＨは、製造業者の取扱説明書に従って、ＧＡＰＤＨの標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ａｂ１７６６４２、Ａｂｃａｍ）を使用して、親細胞およびフソソームで測定される。
総タンパク質レベルは、ＧＡＰＤＨを測定するために使用した同じ体積の試料において前述したように、ビシンコニン酸アッセイによって同様に測定される。実施形態において、このアッセイを使用して、フソソーム中の総タンパク質当たりのＧＡＰＤＨのレベルは、１００ｎｇ未満のＧＡＰＤＨ／μｇ総タンパク質である。同様に、実施形態において、親細胞からフソソームへの総タンパク質と比較したＧＡＰＤＨレベルの減少は、１０％の減少よりも大きい。
一実施形態において、ｎｇ ＧＡＰＤＨ／μｇ総タンパク質における調製中のＧＡＰＤＨ含有量は、５００未満、２５０未満、１００未満、５０未満、２０未満、１０未満、５未満、または１未満である。
一実施形態において、親細胞から調製物へのｎｇ／μｇ単位の総タンパク質当たりのＧＡＰＤＨの減少は、１％超、２．５％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超である。
実施例４６：フソソーム中のカルネキシンの測定
このアッセイは、フソソーム中のカルネキシン（ＣＮＸ）のレベル、および親細胞と比較したフソソーム中のＣＮＸの相対レベルの定量化について説明する。
カルネキシンは、製造業者の取扱説明書に従って、カルネキシンの標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ＭＢＳ７２１６６８、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を使用して、出発細胞および調製物で測定される。
総タンパク質レベルは、カルネキシンを測定するために使用した同じ体積の試料において前述したように、ビシンコニン酸アッセイによって同様に測定される。実施形態において、このアッセイを使用して、フソソーム中の総タンパク質当たりのカルネキシンのレベルは、１００ｎｇ未満のカルネキシン／μｇ総タンパク質である。同様に、実施形態において、親細胞からフソソームまでの総タンパク質と比較したカルネキシンレベルの増加は、１０％の増加よりも大きい。
一実施形態において、ｎｇ カルネキシン／μｇ総タンパク質における調製中のカルネキシン含有量は、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５、または１未満である。
一実施形態において、親細胞から調製物へのｎｇ／μｇ単位の総タンパク質当たりのカルネキシンの減少は、１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％超である。
実施例４７：可溶性タンパク質質量と不溶性タンパク質質量の比較
この実施例は、フソソーム中の可溶性タンパク質質量：不溶性タンパク質質量の比の定量化について説明する。一実施形態において、フソソーム中の可溶性タンパク質質量：不溶性タンパク質質量の比は、有核細胞に類似するであろう。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソーム調製物は、標準的なビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（例えば、市販のＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡプロテインアッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ製品番号２３２２５を使用）を使用して、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を決定するために試験を行った。可溶性タンパク質試料は、ＰＢＳ中の１×１０＾７個の細胞またはフソソーム／ｍＬの濃度で調製したフソソームまたは親細胞を懸濁し、１６００ｇで遠心分離して、フソソームまたは細胞をペレット化する。上清は、可溶性タンパク質画分として収集される。
ペレット中のフソソームまたは細胞は、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含むＰＢＳで激しくピペッティングおよびボルテックスすることによって溶解される。溶解画分は、不溶性タンパク質画分を表す。
１ウェル当たり０～２０μｇのＢＳＡの供給されたＢＳＡを（３重に）使用して、標準曲線を作成する。測定した量が標準の範囲内になるように、フソソームまたは細胞調製物を希釈する。フソソーム調製物を３重に分析し、平均値を使用する。可溶性タンパク質濃度を、不溶性タンパク質濃度で除算して、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を得る。
一実施形態において、フソソームの可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比は、親細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以内、またはそれより大きい。
実施例４８：フソソーム中のＬＰＳの測定
この実施例は、親細胞と比較したフソソーム中のリポ多糖（ＬＰＳ）のレベルの定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して低レベルのＬＰＳを有するであろう。
ＬＰＳは、細菌膜の成分であり、先天性免疫応答の強力な誘導因子である。
ＬＰＳ測定は、前述の実施例で説明した質量分析に基づいている。
一実施形態において、フソソームの脂質含有量の５％、１％、０．５％、０．０１％、０．００５％、０．０００１％、０．００００１％未満またはそれより低いのはＬＰＳである。
実施例４９：フソソーム中の脂質とタンパク質の比
この実施例は、フソソーム中の脂質質量とタンパク質質量の比の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、有核細胞に類似する脂質質量とタンパク質質量の比を有するであろう。
総脂質含有量は、前述の実施例で概説したリピドミクスデータセットで特定されたすべての脂質のモル含有量の合計として計算される。フソソームの総タンパク質含有量は、本明細書に記載のビシンコニン酸アッセイによって測定される。
あるいは、脂質とタンパク質の比率は、特定の脂質種と特定のタンパク質の比率として説明され得る。特定の脂質種は、前述の実施例において生成されたリピドミクスデータから選択される。特定のタンパク質は、前述の実施例において生成されたプロテオミクスデータから選択される。選択した脂質種とタンパク質の様々な組み合わせを使用して、特定の脂質：タンパク質の比を定義する。
実施例５０：フソソーム中のタンパク質とＤＮＡの比
この実施例は、フソソーム中のタンパク質質量とＤＮＡ質量の比の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、細胞よりもはるかに大きい、タンパク質質量とＤＮＡ質量の比を有するであろう。
フソソームおよび細胞の総タンパク質含有量は、前述の実施例で説明したように測定される。フソソームおよび細胞のＤＮＡ質量は、前述の実施例で説明したように測定される。次いで、タンパク質と総核酸の比は、総タンパク質含有量を総ＤＮＡ含有量で除算することによって決定され、典型的なフソソーム調製物の所定の範囲内の比が得られる。
あるいは、タンパク質と核酸の比は、半定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、ＧＡＰＤＨなどの特定のハウスキーピング遺伝子のレベルとして核酸レベルを定義することによって決定される。
次いで、タンパク質とＧＡＰＤＨ核酸の比は、典型的なフソソーム調製物におけるタンパク質：核酸の比の特定の範囲を定義するために、総タンパク質含有量を総ＧＡＰＤＨ ＤＮＡ含有量で除算することによって決定される。
実施例５１：フソソーム中の脂質とＤＮＡの比
この実施例は、親細胞と比較したフソソーム中の脂質とＤＮＡの比の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して脂質とＤＮＡの比がより大きい。
この比率は、総脂質含量（上記の実施例で概説）または特定の脂質種として定義される。特定の脂質種の場合、範囲は、選択された特定の脂質種に応じて異なる。特定の脂質種は、前述の実施例において生成されたリピドミクスデータから選択される。核酸含量は、前述の実施例で説明されているように決定される。
核酸含有量に正規化された選択された脂質種の異なる組み合わせを使用して、特定のフソソーム調製物に特有である特定の脂質：核酸の比を定義する。
実施例５２：フソソーム上の表面マーカーの分析
このアッセイは、フソソーム上の表面マーカーの特定について説明する。
フソソームはペレット化され、標準的な生物学的試料の取り扱い手順に従ってプロテオミクス分析センターに冷凍されて出荷される。
フソソーム上の表面マーカーの有無を特定するために、それらを、ホスファチジルセリンおよびＣＤ４０リガンドに対するマーカーで染色し、ＦＡＣＳシステム（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用したフローサイトメトリーによって分析する。表面ホスファチジルセリンの検出のために、製造業者によって記載されるように、生成物を、アネキシンＶアッセイ（５５６５４７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。
簡単に説明すると、フソソームを、冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１×１０＾６個のフソソーム／ｍｌの濃度で１倍の結合緩衝液に再懸濁する。再懸濁液の１０％を、５ｍｌの培養チューブに移し、５μｌのＦＩＴＣアネキシンＶを添加する。細胞を穏やかにボルテックスし、室温（２５℃）で１５分間、暗所でインキュベートする。
並行して、再懸濁液の別の１０％を、非染色対照の役割を果たすように、異なるチューブに移す。１倍の結合緩衝液を、各チューブに添加する。試料は、１時間以内にフローサイトメトリーで分析する。
いくつかの実施形態において、このアッセイを使用して、染色したフソソームの集団の平均は、非染色細胞の平均を超えると判定され、これは、フソソームがホスファチジルセリンを含むことを示す。
同様に、ＣＤ４０リガンドについては、製造業者の取扱説明書に従って、ＰＥ－ＣＦ５９４マウス抗ヒトＣＤ１５４クローンＴＲＡＰ１（５６３５８９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）のモノクローナル抗体を、さらに１０％の洗浄したフソソームを添加する。簡単に説明すると、飽和量の抗体が、使用される。並行して、フソソームの別の１０％を、非染色対照の役割を果たすように、異なるのチューブに移す。チューブを、４００×ｇで５分間、室温で遠心分離する。上清をデカントし、ペレットをフローサイトメトリー洗浄液で２回洗浄する。０．５ｍｌの１％パラホルムアルデヒド固定剤を、各チューブに添加する。それぞれを短時間ボルテックスし、フローサイトメーターで分析するまで４℃で保存する。
一実施形態において、このアッセイを使用して、染色したフソソームの集団の平均は、非染色細胞の平均を超え、これは、フソソームがＣＤ４０リガンドを含むことを示す。
実施例５３：フソソーム中のウイルスカプシドタンパク質の分析
このアッセイは、試料調製の構成の分析について説明し、ウイルスカプシド源に由来するタンパク質の割合を評価する。
フソソームはペレット化され、標準的な生物学的試料の取り扱い手順に従ってプロテオミクス分析センターに冷凍されて出荷される。
フソソームは、タンパク質の抽出および分析のために解凍される。まず、フソソームを、溶解緩衝液（７Ｍ 尿素、２Ｍ チオ尿素、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０中の４ｗ／ｖ％ Ｃｈａｐｓ）に再懸濁し、時々ボルテックスしながら室温で１５分間インキュベートする。次いで、混合物を氷浴で５分間超音波処理して溶解し、１３，０００ＲＰＭで５分間遠心分離する。総タンパク質含有量は、比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定され、各試料の１００μｇのタンパク質は、新しいチューブに移され、体積は、５０ｍＭのトリスｐＨ８で均等化される。
タンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴを使用して６５℃で１５分間還元し、暗所で室温で３０分間、１５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化する。次いで、６容量の冷（－２０℃）アセトンを徐々に加えてタンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩インキュベートする。
タンパク質をペレット化し、冷（－２０℃）メタノールで３回洗浄し、５０ｍＭのトリスｐＨ８に再懸濁する。撹拌しながら３７℃で消化の最初の４時間、３．３３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣをタンパク質に添加する。試料を、５０ｍＭのトリスｐＨ８で希釈し、０．１％デオキシコール酸ナトリウムをさらに３．３μｇのトリプシン／ｌｙｓＣと共に添加して、撹拌しながら３７℃で一晩消化する。消化が停止し、２ｖ／ｖ％ギ酸の添加によってデオキシコール酸ナトリウムを除去する。試料をボルテックスし、１３，０００ＲＰＭで１分間の遠心分離によって透明にする。
タンパク質は、逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって精製され、乾燥される。試料を、３％ＤＭＳＯ、０．２％ギ酸水溶液で再構成し、前述のようにＬＣ－ＭＳによって分析される。
測定されたすべてのタンパク質に対するウイルスカプシドタンパク質のモル比は、各試料ですべての同定されたタンパク質のモル量の合計で除算したすべてのウイルスカプシドタンパク質のモル量として決定され、割合として表す。
一実施形態において、このアプローチを使用すると、試料は、１０％未満のウイルスカプシドタンパク質を含む。一実施形態において、試料は、０．５％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％未満のウイルスカプシドタンパク質を含む。
実施例５４：標的細胞による融合の測定
この実施例は、非標的細胞と比較した標的細胞によるフソソーム融合の定量化について説明する。
一実施形態において、標的細胞によるフソソーム融合は、フソソームの内腔内に運ばれたカーゴのレシピエント細胞のサイトゾルへの細胞特異的送達を可能にする。本明細書に記載の方法によって生成されたフソソームは、以下のように標的細胞との融合率についてアッセイされる。
この実施例では、フソソームは、その原形質膜上でミオメーカーを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む。さらに、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ミオメーカーおよびミオミキサーの両方を発現する筋芽細胞であり、非標的細胞は、ミオメーカーまたはミオミキサーのいずれも発現しない線維芽細胞である。ミオメーカーを発現するフソソームは、ミオメーカーおよびミオミキサーの両方を発現するが、非標的細胞では発現しない標的細胞と融合すると予測される（Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８，１５６６５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５６６５）（Ｍｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ，４９９（７４５８），３０１－３０５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２３４３）。標的細胞および非標的細胞の両方がマウスから分離され、ＣＭＶプロモーターの下で「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを安定的に発現し、Ｃｒｅによる組換え時に、融合体を示すｔｄＴｏｍａｔｏ発現を引き起こす。
標的または非標的レシピエント細胞を、黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種する。標的細胞および非標的細胞の両方を、異なる融合群のために播種する。次いで、レシピエント細胞を播種してから２４時間後に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質およびミオメーカーを発現するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中で標的または非標的のレシピエント細胞に適用する。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関する。フソソームを適用した後、細胞プレートを、４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞の接触を開始するのに役立つ。
フソソームを適用した４時間後に開始して、細胞ウェルを画像化して、フィールドまたはウェル内のＧＦＰ陽性細胞に対してＲＦＰ陽性細胞を明確に特定する。
この実施例では、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化する。所定のウェル中の総細胞集団は、まず、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定される。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を、通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔは、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化される。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、一方、ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化される。標的細胞および非標的細胞のウェルの画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られる。
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定される。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化される。ウェルは、４時間毎に画像化され、融合活性の速度の時間経過データを得る。
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの分析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）で実施される。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理される。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定される。バックグラウンド強度を大幅に上回るＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞は、閾値処理され、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外される。
総細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞は、バックグラウンドを大幅に上回る細胞の閾値を再度設定し、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含めることによって特定される。標的または非標的レシピエント細胞を含む対照ウェルで特定されたＲＦＰ陽性細胞の数は、フソソームを含むウェル内のＲＦＰ陽性細胞の数から減算するため（非特異的Ｌｏｘｐ組換えを減算するため）に使用される。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（融合レシピエント細胞）の数を、各時点でＧＦＰ陽性細胞（融合していないレシピエント細胞）およびＲＦＰ陽性細胞の合計で除算して、レシピエント細胞集団内のフソソーム融合速度を定量化する。この速度は、レシピエント細胞に適用される所定の用量のフソソームに正規化される。標的融合速度（標的細胞へのフソソーム融合）の場合、非標的細胞への融合速度は、標的融合速度を定量化するために、標的細胞への融合速度から除算する。
一実施形態において、標的細胞とのフソソームの平均融合速度は、標的細胞融合の場合、１時間当たり０．０１～４．０ ＲＦＰ／ＧＦＰ細胞の範囲内であるか、またはフソソームを有する非標的レシピエント細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより大きい。一実施形態において、フソソームが適用されていない群は、１時間当たり０．０１未満のＲＦＰ／ＧＦＰ細胞のバックグラウンド速度を示す。
実施例５５：膜タンパク質を送達するためのインビトロ融合
この実施例は、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態において、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞に対して活性な膜タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、フソソームは、センダイウイルスＨＶＪ－Ｅタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成される（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２）。一実施形態において、フソソームは、主に筋肉および脂肪組織に見られ、細胞へのグルコースのインスリン調節輸送に関与する膜タンパク質、ＧＬＵＴ４を発現するために生成される。ＧＬＵＴ４を伴うおよび伴わないフソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製される。
次いで、Ｃ２Ｃ１２細胞などの筋肉細胞を、ＧＬＵＴ４を発現するフソソーム、ＧＬＵＴ４を発現しないフソソーム、ＰＢＳ（陰性対照）、またはインスリン（陽性対照）で処理する。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＧＬＵＴ４の活性は、蛍光２－デオキシグルコース類似体、２－［Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアキソール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース（２－ＮＢＤＧ）の取り込みによって測定される。Ｃ２Ｃ１２細胞の蛍光は、前述の実施例で説明された方法を使用して顕微鏡検査により評価される。
一実施形態において、ＧＬＵＴ４およびインスリンを発現するフソソームで処理されたＣ２Ｃ１２細胞は、ＰＢＳまたはＧＬＵＴ４を発現しないフソソームで処理されたＣ２Ｃ１２細胞と比較して蛍光の増加を示すと予想される。
また、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９，１６０５６０４，２０１７も参照のこと。
実施例５６：膜タンパク質のインビボ送達
この実施例は、インビボでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態において、インビボでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞に対して活性な膜タンパク質の送達をもたらす。
この実施例では、フソソームは、前述の実施例と同様に、センダイウイルスＨＶＪ－Ｅタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成される。一実施形態において、フソソームは、膜タンパク質ＧＬＵＴ４を発現するために生成される。ＧＬＵＴ４を伴うおよび伴わないフソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製される。
ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕマウスに、ＧＬＵＴ４を発現するフソソーム、ＧＬＵＴ４を発現しないフソソーム、またはＰＢＳ（陰性対照）を投与する。マウスに、フソソームまたはＰＢＳを前脛骨筋に筋肉内注射する。フソソーム投与の直前に、マウスを１２時間絶食させ、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ画像）を可能にするグルコースの類似体である［１８Ｆ］２－フルオロ－２デオキシ－ｄ－グルコース（１８Ｆ－ＦＤＧ）を注射する。マウスに、麻酔（２％イソフルラン）下で尾静脈を介して１８Ｆ－ＦＤＧを注射する。ＰＥＴ画像は、ナノスケール画像システム（１Ｔ、Ｍｅｄｉｓｏ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して実行される。画像は、フソソームの投与から４時間後に行われる。画像直後に、マウスを殺処分し、前脛骨筋の重さを量る。ＰＥＴ画像は、完全検出モードで３Ｄ画像システムを使用して再構成され、すべての補正がオンになり、高度に正則化され、８回反復される。再構成画像の３次元関心体積（ＶＯＩ）分析は、画像ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｄｉｓｏ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を使用して、標準摂取率（ＳＵＶ）分析を適用して実行される。直径２ｍｍの球で固定されたＶＯＩは、前脛骨筋の部位に描かれている。各ＶＯＩ部位のＳＵＶは、次の式を使用して計算される：ＳＵＶ＝（Ｂｑ／ｃｃ×体重として測定される、関心体積の放射能）／注入された放射能。
一実施形態において、ＧＬＵＴ４を発現するフソソームを投与されたマウスは、ＰＢＳまたＧＬＵＴ４を発現しないはフソソームを投与したマウスと比較して、ＶＯＩにおける放射性シグナルの増加を示すと予想される。
また、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２９，１６０５６０４，２０１７も参照のこと。
実施例５７：血管からの溢出の測定
この実施例は、インビトロでの微小流体システムで試験された内皮単層にわたるフソソームの溢出の定量化について説明する（Ｊ．Ｓ Ｊｏｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３，ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５６９１０）。
細胞は、血管系から周囲組織に溢出する。理論に拘束されることを望まないが、溢出は、フソソームが血管外組織に達するための１つの方法である。
このシステムには、ＥＣＭ模倣ゲルを注入することができるチャンバーで区切られた、独立してアドレス指定可能な３つのメディアチャネルが含まれる。簡単に説明すると、マイクロ流体システムは、ＰＤＭＳ（ポリ－ジメチルシロキサン；Ｓｉｌｇａｒｄ １８４；Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＭＩ）を成形し、アクセスポートを開けてカバーガラスに接着し、マイクロ流体チャネルを形成する。チャネルの断面寸法は、１ｍｍ（幅）×１２０μｍ（高さ）である。マトリックス接着を強化するために、ＰＤＭＳチャネルは、ＰＤＬ（ポリ－Ｄ－リジン臭化水素酸塩；１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液でコーティングされる。
次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）およびＮａＯＨを含むＩ型コラーゲン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）溶液（２．０ｍｇ／ｍｌ）を、４つの別個の充填ポートを介してデバイスのゲル領域に注入し、３０分間インキュベートして、ヒドロゲルを形成する。ゲルが重合すると、内皮細胞培地（ＬｏｎｚａまたはＳｉｇｍａなどの供給業者から入手）を、チャネルに直ちにピペッティングして、ゲルの脱水を防止する。培地を吸引すると、希釈されたヒドロゲル（ＢＤ ｓｃｉｅｎｃｅ）溶液（３．０ｍｇ／ｍｌ）を細胞チャネルに導入し、過剰なヒドロゲル溶液を、冷たい培地を使用して洗い流す。
内皮細胞を、中間チャネルに導入し、定着して内皮を形成することができる。内皮細胞を播種してから２日後、フソソームまたはマクロファージ細胞（陽性対照）を、内皮細胞が完全な単層を形成したのと同じチャネルに導入する。フソソームを、単層に付着し、単層を横切ってゲル領域に移動するように導入する。培養物は、３７℃および５％ＣＯ２で加湿インキュベーターで保管される。ＧＦＰ発現バージョンのフソソームは、蛍光顕微鏡を介して生細胞画像を可能にするために使用される。翌日、細胞を固定し、チャンバー内でＤＡＰＩ染色を使用して核を染色し、共焦点顕微鏡を使用して複数の対象となる領域を画像化し、内皮単層を通過したフソソームの数を決定する。
一実施形態において、ＤＡＰＩ染色は、フソソームおよび陽性対照細胞が播種後に内皮障壁を通過することができることを示す。
実施例５８：走化性細胞の可動性の測定
この実施例は、フソソームの走化性の定量化について説明する。細胞は、走化性を介して化学勾配に向かってまたは化学勾配から離れて移動することができる。一実施形態において、走化性は、フソソームが損傷部位に存在するか、または病原体を追跡することが可能になる。前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成された精製フソソーム組成物は、以下のようにその走化性能力についてアッセイされる。
十分な数のフソソームまたはマクロファージ細胞（陽性対照）が、ＤＭＥＭ培地（ｉｂｉｄｉ．ｃｏｍ／ｉｍｇ／ｃｍｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌａｂｗａｒｅ／ｃｈａｎｎｅｌ＿ｓｌｉｄｅｓ／Ｓ＿８０３２Ｘ＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ／ＩＮ＿８０３２Ｘ＿Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．ｐｄｆ）中の製造業者が提供したプロトコルに従って、マイクロスライドウェルにロードされる。フソソームは、３７℃および５％ＣＯ２で１時間放置して付着させる。細胞付着後、ＭＣＰ１化学誘引物質を含むＤＭＥＭ（陰性対照）またはＤＭＥＭを、中央チャネルの隣接するリザーバーにロードし、フソソームを、Ｚｅｉｓｓ倒立広視野顕微鏡を使用して連続的に２時間画像化する。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を分析する（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）。観測された各フソソームまたは細胞の移行連携データは、手動追跡プラグイン（Ｆａｂｒｉｃｅ Ｃｏｒｄｅｌｉｅｒｅｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃｕｒｉｅ、Ｏｒｓａｙ、Ｆｒａｎｃｅ）で取得される。走化性プロットおよび移動速度は、走化性および移行ツール（ｉｂｉｄｉ）で決定される。
一実施形態において、フソソームの平均累積距離および移動速度は、ケモカインに対する陽性対照細胞の応答よりも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれより大きい。ケモカインに対する細胞の応答は、例えば、Ｈｏｗａｒｄ Ｅ．Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４（１）：４７－５９，２００９に記載されている。
実施例５９：ホーミングポテンシャルの測定
この実施例は、損傷部位へのフソソームのホーミングについて説明する。細胞は、遠位部位から移動し、および／または特定の部位を蓄積する、例えば部位に帰着させることができる。典型的には、部位は、損傷部位である。一実施形態において、フソソームは、損傷部位に帰着させる、例えば、損傷部位に移動するか、または損傷部位に蓄積する。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、右前脛骨筋（ＴＡ）への３０Ｇ針を使用した筋肉内（ＩＭ）注射による滅菌生理食塩水中のノテキシン（ＮＴＸ）（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｃｏｒｐ）、ミオトキシンを２μｇ／ｍＬの濃度で投与する。前脛骨筋（ＴＡ）筋肉上の皮膚を、４５秒間化学脱毛剤を使用して領域を脱毛し、続いて、水で３回すすぐことによって調製する。この濃度は、筋線維の変性を最大限にし、衛星細胞、運動性軸索、および血管への損傷を最小限に抑えるために選択される。
ＮＴＸ注射後の１日目に、マウスは、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは細胞のＩＶ注射を受容する。フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって、ホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞から生成される。生物発光画像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、注入から０、１、３、７、２１、および２８後の生物発光の動物全体の画像を取得する。
画像化する５分前に、ルシフェラーゼを視覚化するために、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇの用量で生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を腹腔内注射する。画像システムは、すべてのデバイス設定を補正するために較正される。生物発光シグナルは、Ｒａｄｉａｎｃｅ Ｐｈｏｔｏｎｓを使用して、測定値として使用された全フラックスで測定される。関心領域（ＲＯＩ）は、光子／秒の値を得るために、ＲＯＩのシグナルを囲むことによって生成される。ＲＯＩは、ＮＴＸで処理されたＴＡ筋肉と対側ＴＡ筋肉の両方で評価され、ＮＴＸ処理されたＴＡ筋肉とＮＴＸ未処理のＴＡ筋肉間の光子／秒の比率は、ＮＴＸ処理された筋肉へのホーミングの尺度として計算される。
一実施形態において、フソソームおよび細胞中のＮＴＸ処理されたＴＡ筋肉とＮＴＸ未処理のＴＡ筋肉間の光子／秒の比率は、１より大きくなり、損傷でのルシフェラーゼ発現フソソームの部位特異的蓄積を示す。
例えば、Ｐｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ３４（５）Ｌ ５７７－８５，２００６を参照のこと。
実施例６０：食作用活性の測定
この実施例は、フソソームの食作用活性を実証する。一実施形態において、フソソームは、食作用活性を有し、例えば食作用が可能である。細胞は、食作用に関与し、粒子を貪食し、細菌および死細胞などの外来侵入者の隔離および破壊を可能にする。
部分的または完全な核不活性化を有する哺乳動物マクロファージからのフソソームを含む前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成された精製フソソーム組成物は、病原体生体粒子を介して食作用アッセイが可能であった。この推定は、以下のプロトコルに従って蛍光食作用アッセイを使用することによって行われた。
マクロファージ（陽性対照）およびフソソームを、採取直後に別の共焦点ガラス底皿に播種した。マクロファージおよびフソソームを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させた。フルオレセイン標識大腸菌Ｋ１２および非フルオレセイン標識大腸菌Ｋ－１２（陰性対照）を、製造業者のプロトコルに示されているようにマクロファージ／フソソームに添加し、２時間インキュベートした、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆ。２時間後、遊離蛍光粒子は、トリパンブルーを添加することによって消光された。取り込まれた粒子から放出された細胞内蛍光は、４８８励起での共焦点顕微鏡によって画像化された。食作用陽性のフソソームの数は、ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して定量化された。
食作用性フソソームの平均数は、生体粒子導入から２時間後、少なくとも３０％であり、陽性対照マクロファージでは３０％よりも多かった。
実施例６１：細胞膜または血液脳関門を通過する能力の測定
この実施例は、血液脳関門を通過するフソソームの定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、例えば、中枢神経系への送達のために、血液脳関門を通過し、例えば、出入りするであろう。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは白血球（陽性対照）を静脈内注射する。フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって、ホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から生成される。生物発光画像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、フソソームまたは細胞の注入から１、２、３、４、５、６、８、１２、および２４時間後の生物発光の動物全体の画像を取得する。
画像化する５分前に、ルシフェラーゼを視覚化するために、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇの用量で生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を腹腔内注射する。画像システムは、すべてのデバイス設定を補正するために較正される。生物発光シグナルは、測定値として使用された全フラックスで測定される関心領域（ＲＯＩ）は、光子／秒の値を得るために、ＲＯＩのシグナルを囲むことによって生成される。選択されたＲＯＩは、脳を含む領域周辺のマウスの頭部である。
一実施形態において、ＲＯＩの光子／秒は、ルシフェラーゼを発現しない陰性対照のフソソームよりもルシフェラーゼを発現する細胞またはフソソームを注射した動物において多く、これは、脳内または脳周辺のルシフェラーゼを発現するフソソームの蓄積を示す。
実施例６２：タンパク質分泌の可能性の測定
この実施例は、フソソームによる分泌の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、分泌、例えばタンパク質分泌が可能である。細胞は、分泌物を介して物質を廃棄または排出することができる。一実施形態において、フソソームは、分泌を介してそれらの環境内で化学的に相互作用し、連通する。
所定の速度でタンパク質を分泌するフソソームの能力は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号１６１５８）からのガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイを使用して決定される。前述の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成されたマウス胚線維芽細胞（陽性対照）またはフソソームを、成長培地でインキュベートし、培地の試料は、まず、フソソームを１６００ｇで５分間ペレット化し、次いで、上清を収集することによって１５分ごとに収集する。収集した試料を、透明な底の９６ウェルプレートにピペッティングする。次いで、アッセイ緩衝液の作業溶液は、製造業者の取扱説明書に従って調製される。
簡単に説明すると、ルシフェリンまたは発光分子であるコレンテラジンをフラッシュアッセイ緩衝液と混合し、試料を含む９６ウェルプレートの各ウェルにピペッティングする。細胞またはフソソームを欠いている陰性対照ウェルには、バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを決定するための成長培地またはアッセイ緩衝液が含まれる。さらに、発光シグナルを１時間当たりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子に変換するために、精製ガウシアルシフェラーゼ（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）の標準曲線を調製する。
プレートは、５００ｍｓｅｃの積分を使用して、発光についてアッセイされる。バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを、すべての試料から減じた後、線形最適曲線を、ガウシアルシフェラーゼ標準曲線に対して計算する。試料の測定値が標準曲線内に適合しない場合、それらを、適切に希釈して、再アッセイする。このアッセイを使用して、所定の範囲内の速度（分子／時間）でガウシアルシフェラーゼを分泌するフソソームの能力が決定される。
一実施形態において、フソソームは、陽性対照細胞よりも、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれより大きい速度でタンパク質を分泌することができる。
実施例６３：シグナル伝達電位の測定
この実施例は、フソソームにおけるシグナル伝達の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、シグナル伝達が可能である。細胞は、シグナル伝達として知られるプロセスで、リン酸化などのシグナル伝達カスケードを通じて細胞外環境からの分子シグナルを送受信することができる。部分的または完全な核不活性化を有する哺乳動物細胞からのフソソームを含む前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成された精製フソソーム組成物は、インスリンによって誘導されるシグナル伝達を可能にする。インスリンによって誘導されるシグナル伝達は、ＡＫＴリン酸化レベル、インスリン受容体シグナル伝達カスケードの重要な経路、およびインスリンに応答するグルコース取り込みを測定することによって評価される。
ＡＫＴリン酸化を測定するために、細胞、例えばマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（陽性対照）およびフソソームを、４８ウェルプレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに２時間放置する。細胞の接着後、インスリン（例えば、１０ｎＭで）、またはインスリンを含まない陰性対照溶液を、細胞またはフソソームを含むウェルに３０分間添加する。３０分後、タンパク質溶解物はフソソームまたは細胞から作製され、リン酸化ＡＫＴレベルは、インスリンで刺激した試料および対照で刺激されていない試料中でウエスタンブロッティングによって測定される。
インスリンまたは陰性対照溶液に応答したグルコース取り込みは、標識グルコース（２－ＮＢＤＧ）を使用することによって、グルコース取り込みの項で説明されているように測定される（Ｓ．Ｇａｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５（２）：８１９－８２９，２００５）。
一実施形態において、フソソームは、陰性対照よりもインスリンに応答してＡＫＴリン酸化およびグルコース取り込みを、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれ以上増強する。
実施例６４：細胞膜を横断してグルコースを輸送する能力の測定
この実施例は、生細胞でのグルコース取り込みをモニタリングし、脂質二重層を横断する能動輸送を測定するために使用することができる、２－ＮＢＤＧ（２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアキソール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース）の蛍光グルコース類似体のレベルの定量について説明する。一実施形態において、このアッセイを使用して、グルコース取り込みのレベルおよびフソソームの脂質二重層を横断する能動輸送を測定することができる。
フソソーム組成物は、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。次いで、十分な数のフソソームを、グルコースを含まず、２０％ウシ胎児血清、および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。２時間のグルコース飢餓期間の後、グルコースを含まず、２０％ウシ胎児血清、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、および２０ｕＭの２－ＮＢＤＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭを含むように交換し、３７℃および５％ＣＯ２でさらに２時間インキュベートする。
等量のＤＭＳＯを２－ＮＢＤＧの代わりに添加することを除いて、陰性対照フソソームも同じように処理される。
次いで、フソソームを１×ＰＢＳで３回洗浄し、適切な緩衝液に再懸濁し、９６ウェル画像プレートに移す。次いで、２－ＮＢＤＧ蛍光を、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用した蛍光光度計で測定して、フソソーム膜を横断して輸送され、１時間の装填期間、フソソームに蓄積された２－ＮＢＤＧの量を定量化する。
一実施形態において、２－ＮＢＤＧ蛍光は、陰性（ＤＭＳＯ）対照と比較して、２－ＮＢＤＧ処理を伴うフソソームにおいてより高いであろう。５２５／３９発光フィルターを使用した蛍光測定は、存在する２－ＮＢＤＧ分子の数と相関する。
実施例６５：フソソームの内腔は、水溶液と混和する
この実施例は、フソソームの内腔と水などの水溶液との混和性を評価する。
フソソームは、前述の実施例で説明したように調製される。対照は、低張溶液、高浸透圧溶液、または通常の浸透圧溶液のいずれかを備えた透析膜である。
フソソーム、陽性対照（通常の浸透圧溶液）および陰性対照（低張溶液）を、低張溶液（１５０ｍＯｓｍｏｌ）でインキュベートする。各試料を水溶液にさらした後、細胞サイズを、顕微鏡下で測定する。一実施形態において、低張溶液中のフソソームおよび陽性対照のサイズは、陰性対照と比較して増加する。
フソソーム、陽性対照（通常の浸透圧溶液）、および陰性対照（高浸透圧溶液）を、高浸透圧溶液（４００ｍＯｓｍｏｌ）でインキュベートする。各試料を水溶液にさらした後、細胞サイズを、顕微鏡下で測定する。一実施形態において、高浸透圧溶液中のフソソームおよび陽性対照のサイズは、陰性対照と比較して減少するだろう。
フソソーム、陽性対照（低張または高浸透圧溶液）、および陰性対照（通常の浸透圧）を、通常の浸透圧溶液（２９０ｍＯｓｍｏｌ）でインキュベートする。各試料を水溶液にさらした後、細胞サイズを、顕微鏡下で測定する。一実施形態において、通常の浸透溶液中のフソソームおよび陽性対照のサイズは、依然として、陰性対照と比較して実質的に同じであろう。
実施例６６：サイトゾルにおけるエステラーゼ活性の測定
この実施例は、フソソームにおける代謝活性の代理としてのエステラーゼ活性の定量化について説明する。フソソームにおけるサイトゾルエステラーゼ活性は、カルセイン－ＡＭ染色の定量的評価によって決定される（Ｂｒａｔｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ６６（１）：７８－８４，２００５）。
膜透過性色素であるカルセイン－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ ＵＳＡ）は、ジメチルスルホキシド中の１０ｍＭのストック溶液として、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中の１００ｍＭの作業溶液として調製される。前述の実施例で説明した方法のうちのいずれか１つによって生成されたフソソームまたは陽性対照の親マウス胚線維芽細胞を、ＰＢＳ緩衝液に懸濁し、３７℃でカルセイン－ＡＭ作業溶液（カルセイン－ＡＭの最終濃度：５ｍＭ）で暗所で３０分間インキュベートし、次いで、カルセイン蛍光保持の即時フローサイトメトリー分析のためにＰＢＳ緩衝液で希釈する。
フソソームおよび対照の親マウス胚性線維芽細胞は、（Ｊａｃｏｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １２（６）：５５０－５５８，１９９１）に記載されるように、サポニンによるゼロエステラーゼ活性の陰性対照として実験的に透過処理される。フソソームおよび細胞を、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４の１％サポニン溶液で１５分間インキュベートする。細胞膜透過処理の可逆性により、サポニンは、さらに染色および洗浄ステップに使用されるすべての緩衝液に含まれる。サポニン透過処理後、フソソームおよび細胞を、０．１％サポニンおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液に懸濁し、カルセイン－ＡＭで５ｍＭの最終濃度で（暗所で、３７℃で４５分間）インキュベートし、０．１％サポニンおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含む同じＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析する。フローサイトメトリー分析は、４８８ｎｍのアルゴンレーザー励起で、ＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行い、５３０＋／－３０ｎｍで発光を収集する。ＦＡＣＳソフトウェアは、取得および分析のために使用される。光散乱チャネルは、線形利得に設定され、蛍光チャネルは、対数尺度で設定され、最低１０，０００個の細胞が各条件で分析される。相対エステラーゼ活性は、各試料のカルセイン－ＡＭの強度に基づいて計算される。すべての事象は、前方および側方散乱チャネルで獲得される（あるいは、ゲートは、フソソーム集団のみを選択するためにゲートを適用され得る）。フソソームのための蛍光強度（ＦＩ）値は、それぞれの陰性対照サポニン処理試料のＦＩ値を減じることによって決定される。フソソーム試料のために正規化されたエステラーゼ活性は、サイトゾルエステラーゼ活性のために定量的測定値を生成するために、それぞれの陽性対照細胞試料に対して正規化される。
一実施形態において、フソソーム調製物は、陽性対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれより大きいエステラーゼ活性を有するであろう。
Ｂｒａｔｏｓｉｎ Ｄ，Ｍｉｔｒｏｆａｎ Ｌ，Ｐａｌｉｉ Ｃ，Ｅｓｔａｑｕｉｅｒ
Ｊ，ＭｏｎｔｒｅｕｉｌＪ．Ｎｏｖｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ
ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｇｉｎｇ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２００５ Ｊｕｌ；６６（１）：７８－８４、およびＪａｃｏｂ
ＢＣ，Ｆａｖｒｅ Ｍ，Ｂｅｎｓａ ＪＣ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １９９１；１２：５５０－５５８も参照のこと。
実施例６７：フソソームにおけるアセチルコリンエステラーゼ活性の測定
アセチルコリンエステラーゼ活性は、前述の手順（Ｅｌｌｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７，８８，１９６１）および製造業者の推奨事項に従って、キット（ＭＡＫ１１９、ＳＩＧＭＡ）を使用して測定される。
簡単に説明すると、フソソームを、ＰＢＳ、ｐＨ８中の１．２５ｍＭのアセチルチオコリンに懸濁し、ＰＢＳ、ｐＨ７中の０．１ｍＭの５，５－ジチオ－ビス（２－ニトロ安息香酸）と混合する。インキュベーションは、室温で行われるが、光学密度の読み取りを開始する前に、フソソームおよび基質溶液を３７℃で１０分間予熱する。
吸収の変化は、プレートリーダー分光光度計（ＥＬＸ８０８、ＢＩＯ－ＴＥＫ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）で４５０ｎｍで１０分間モニタリングされる。別々に、試料は、正規化のためのビシンコニン酸アッセイを介してフソソームのタンパク質含有量を決定するために使用される。このアッセイを使用して、フソソームは、１００未満のＡＣｈＥ活性単位／μｇタンパク質であると判断される。
一実施形態において、ＡＣｈＥ活性単位／μｇタンパク質値は、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、または１０００未満である。
実施例６８：代謝活性レベルの測定
この実施例は、フソソームにおけるクエン酸シンターゼ活性の測定の定量化について説明する。
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）とアセチルＣｏＡの反応を触媒してクエン酸を生成する、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル内の酵素である。アセチル－ＣｏＡの加水分解により、チオール基（ＣｏＡ－ＳＨ）を有するＣｏＡの放出がある。チオール基は、化学試薬５，５－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応して、４１２ｎｍで分光光度法で測定され得る黄色生成物である、５－チオ－２－ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成する（Ｇｒｅｅｎ ２００８）。Ａｂｃａｍ Ｈｕｍａｎ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙアッセイキット（製品番号ａｂ１１９６９２）などの市販のキットには、この測定に必要なすべての試薬が得られる。
アッセイは、製造業者の推奨に従って実行される。フソソーム試料溶解物は、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成されたフソソームを収集し、抽出緩衝液（Ａｂｃａｍ）で氷上で２０分間可溶化することによって調製される。遠心分離後に上清を収集し、タンパク質含有量をビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって評価し、次の定量プロトコルが開始されるまで調製物を氷上に保持する。
簡単に説明すると、フソソーム溶解物試料は、提供されたマイクロプレートウェルの１倍のインキュベーション緩衝液（Ａｂｃａｍ）で希釈され、１セットのウェルは、１倍のインキュベーション緩衝液のみを受容する。プレートを密封し、３００ｒｐｍで振盪しながら室温で４時間インキュベートする。次いで、緩衝液をウェルから吸引し、１倍の洗浄緩衝液を添加する。この洗浄ステップをもう一度繰り返す。次いで、１倍の活性溶液を各ウェルに添加し、プレートを、読み取りと読み取りの間で振とうしながら、２０秒毎に３０分間、４１２ｎｍで吸光度を測定することによってマイクロプレートリーダー上で分析する。
バックグラウンド値（１倍のインキュベーション緩衝液のみを有するウェル）は、すべてのウェルから減じ、クエン酸シンターゼ活性は、装填されたフソソーム溶解物試料１μｇ当たりの１分当たりの吸光度の変化として表される（４１２ｎｍ／分／ｕｇタンパク質でΔｍＯＤ）。１００～４００秒の反応速度測定の線形部分のみを使用して、活性を計算する。
一実施形態において、フソソーム調製物は、対照細胞と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれより大きいシンターゼ活性を有するであろう。
例えば、Ｇｒｅｅｎ ＨＪ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｕｓｃｌｅ
ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｄａｙｓ ｏｆ ｅｘｅｒｃｉｓｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５：Ｒ１２３８－Ｒ１２５０，２００８を参照のこと。
実施例６９：呼吸レベルの測定
この実施例は、フソソームにおける呼吸レベルの測定の定量化について説明する。細胞の呼吸レベルは、代謝を促進する酸素消費量の尺度であり得る。フソソーム呼吸は、タツノオトシゴ細胞外フラックス分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって酸素消費率を測定する（Ｚｈａｎｇ ２０１２）。
前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成されたフソソームまたは細胞を、９６ウェルのタツノオトシゴマイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）に播種する。マイクロプレートを短時間遠心分離して、ウェルの底にあるフソソームおよび細胞をペレット化する。酸素消費アッセイは、成長培地を除去し、２５ｍＭのグルコースおよび２ｍＭのグルタミン（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含む低緩衝ＤＭＥＭ最小培地と交換し、温度およびｐＨの平衡を保つためにマイクロプレートを３７℃で６０分間インキュベートすることによって開始する。
次いで、付着したフソソームおよび細胞を直接取り巻く培地の細胞外酸素およびｐＨの変化を測定する細胞外フラックス分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）でマイクロプレートをアッセイする。定常状態の酸素消費量（基礎呼吸速度）および細胞外酸性化速度を取得した後、ＡＴＰシンターゼを阻害するオリゴマイシン（５μＭ）、およびミトコンドリアを脱共役するプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）を、マイクロプレートの各ウェルに添加して、最大酸素消費速度の値を得る。
最後に、５μＭのアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を添加して、呼吸の変化が主にミトコンドリア呼吸によるものであることを確認する。アンチマイシンＡの添加後の最小酸素消費速度をすべての酸素消費量測定値から減じて、非ミトコンドリア呼吸成分を除去する。オリゴマイシン（基礎からの酸素消費速度の少なくとも２５％の減少）またはＦＣＣＰ（オリゴマイシン後の酸素消費速度の少なくとも５０％の増加）に適切に応答しない細胞試料は、分析から除外される。フソソームの呼吸レベルは、ｐｍｏｌ Ｏ２／分／１ｅ４のフソソームとして測定される。
次いで、この呼吸レベルを、それぞれの細胞呼吸レベルに正規化する。一実施形態において、フソソームは、それぞれの細胞試料と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれより大きい呼吸レベルを有するであろう。
例えば、Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｎｕｅｂｅｌ Ｅ，Ｗｉｓｉｄａｇａｍａ ＤＲＲ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２０１２；７（６）：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０４８を参照のこと。
実施例７０：フソソームのホスファチジルセリンレベルの測定
この実施例は、フソソームの表面へのアネキシン－Ｖ結合のレベルの定量化について説明する。
瀕死の細胞は、プログラムされた細胞死経路のアポトーシスのマーカーである、細胞表面上にホスファチジルセリンを表示することができる。アネキシン－Ｖは、ホスファチジルセリンに結合するため、アネキシン－Ｖの結合は、細胞内の生存率の代理である。
フソソームは、本明細書に記載されるように生成された。アポトーシスシグナルの検出のために、フソソームまたは陽性対照細胞を、５％アネキシンＶ蛍光５９４（Ａ１３２０３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。各群（下の表に詳述される）には、アポトーシス誘導物質であるメナジオンで処理された実験的アームが含まれた。メナジオンを、１００μＭのメナジオンで４時間添加した。すべての試料を、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で実行し、蛍光強度を、波長５６１ｎｍのＹＬ１レーザーおよび５８５／１６ｎｍの発光フィルターで測定した。細胞外ホスファチジルセリンの存在は、すべての群におけるアネキシンＶの蛍光強度を比較することによって定量化された。
陰性対照の非染色フソソームは、アネキシンＶ染色では陽性ではなかった。
一実施形態において、フソソームは、メナジオンに応答して細胞表面上のホスファチジルセリンディスプレイを上方調節することができ、非メナジオンで刺激したフソソームがアポトーシスを受けていないことを示している。一実施形態において、メナジオンで刺激した陽性対照細胞は、メナジオンで刺激されていないフソソームよりも高レベルのアネキシンＶ染色を示した。
Figure 2023153260000015
実施例７１：ジュスタクリンシグナル伝達レベルの測定
この実施例は、フソソームにおけるジャスタクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
細胞は、ジュスタクリンシグナル伝達を介して細胞接触依存性シグナル伝達を形成することができる。一実施形態において、フソソームにおけるジャクタクリンシグナル伝達の存在は、フソソームがそれらのすぐ近くの細胞を刺激し、抑制し、一般に連通することができることを実証するであろう。
部分的または完全な核不活性化を有する哺乳動物骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）から前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成されたフソソームは、マクロファージのジャクスタリンシグナル伝達を介してＩＬ－６分泌を引き起こす。一次マクロファージおよびＢＭＳＣを、共培養する。骨髄由来マクロファージを、まず、６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートし、次いで、初代マウスＢＭＳＣ由来フソソームまたはＢＭＳＣ細胞（陽性対照親細胞）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中のマクロファージに置く。上清を、異なる時点（２、４、６、２４時間）で収集し、ＥＬＩＳＡアッセイによってＩＬ－６分泌について分析する。（ＣｈａｎｇＪ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
一実施形態において、ＢＭＳＣフソソームによって誘導されるジュスタクリンシグナル伝達のレベルは、培地中のマクロファージ分泌ＩＬ－６レベルの増加によって測定される。一実施形態において、ジュスタクリンシグナル伝達のレベルは、陽性対照骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）によって誘導されるレベルよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはそれより大きい。
実施例７２：パラクリンシグナルレベルの測定
この実施例は、フソソームにおけるパラクリンシグナル伝達の定量化について説明する。
細胞は、パラクリンシグナル伝達を介して、局所微小環境内の他の細胞と連通することができる。一実施形態において、フソソームは、例えば、それらの局所環境内の細胞と連通するために、パラクリンシグナル伝達が可能である。一実施形態において、以下のプロトコルでパラクリン由来の分泌を介して内皮細胞でＣａ２＋シグナル伝達を引き起こすフソソームの能力は、カルシウム指示薬、ｆｌｕｏ－４ ＡＭを介してＣａ２＋シグナル伝達を測定する。
実験プレートを準備するために、マウス肺微小血管内皮細胞（ＭＰＭＶＥＣ）を、０．２％ゼラチンでコーティングした２５ｍｍのガラス底共焦点皿（８０％コンフルエンス）に播種する。ＭＰＭＶＥＣを、室温で３０分間、２％ＢＳＡおよび０．００３％プルロン酸を含むＥＣＭ中で５μＭのｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の最終濃度でインキュベートし、ｆｌｕｏ－４ ＡＭを装填することができる。装填後、ＭＰＭＶＥＣを、スルフィンピラゾンを含む実験的画像溶液（０．２５％ＢＳＡを含むＥＣＭ）で洗浄して、色素の損失を最小限に抑える。ｆｌｕｏ－４を装填した後、５００μｌの予熱した実験用画像溶液をプレートに添加し、Ｚｅｉｓｓ共焦点画像システムによって画像化する。
別のチューブで、新たに単離したマウスマクロファージは、培養培地中の１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で処理されたか、またはＬＰＳで処理されない（陰性対照）。刺激後、フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによってマクロファージから生成される。
次いで、フソソームまたは親マクロファージ（陽性対照）を、２％ＢＳＡおよび０．００３％プルロン酸を含むＥＣＭで、細胞追跡レッドＣＭＴＰＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識する。次いで、フソソームおよびマクロファージを洗浄し、実験用画像溶液に再懸濁する。標識されたフソソームおよびマクロファージを、共焦点プレートのｆｌｕｏ－４
ＡＭ装填したＭＰＭＶＥＣに添加する。
緑および赤の蛍光信号は、それぞれ、ｆｌｕｏ－４ ＡＭおよび細胞追跡レッドの蛍光に対して４８８ｎｍおよび５６１ｎｍで励起するアルゴンイオンレーザー光源を備えたＺｅｉｓｓ共焦点画像システムを使用して、１０～２０分間３秒毎に記録される。Ｆｌｕｏ－４蛍光強度の変化は、画像ソフトウェアを使用して分析される（Ｍａｌｌｉｌａｎｋａｒａｍａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（５８）：３５１１，２０１１）。陰性対照フソソームおよび細胞群で測定されたＦｌｕｏ－４強度のレベルは、ＬＰＳで刺激したフソソームおよび細胞群から減じる。
一実施形態において、フソソーム、例えば活性化フソソームは、陽性対照細胞群よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれより大きいＦｌｕｏ－４蛍光強度の増加を誘発する。
実施例７３：可動性のためにアクチンを重合する能力の測定
この実施例は、フソソームにおけるアクチンなどの細胞骨格成分の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、アクチンなどの細胞骨格成分を含み、アクチン重合が可能である。
細胞は、運動性および他の細胞質プロセスのために、細胞骨格成分であるアクチンを使用する。細胞骨格は、運動推進力を作り出し、運動のプロセスを調整するために不可欠である。
Ｃ２Ｃ１２細胞を、本明細書に記載されるように摘出した。１２．５％および１５％のＦｉｃｏｌｌ層から得られたフソソームは、プールされ、「Ｌｉｇｈｔ」というラベルが付けられたが、１６～１７％の層からのフソソームは、プールされ、「Ｍｅｄｉｕｍ」というラベルが付けられた。フソソームまたは細胞（親のＣ２Ｃ１２細胞、陽性対照）を、ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に再懸濁し、２４ウェルの超低付着プレート（番号３４７３、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に３７℃ ＋５％ＣＯ２で播種した。試料を、定期的に採取し（５．２５時間、８．７５時間、２６．５時間）、１６５μＭのローダミンファロイジンで染色し（陰性対照は染色せず）、ＦＣレーザーＹＬ１（５８５／１６フィルターを用いて５６１ｎｍ）を使用してフローサイトメーター（番号Ａ２４８５８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定し、Ｆ－アクチン細胞骨格含有量を測定した。フソソーム中のローダミンファロイジンの蛍光強度を、非染色のフソソームおよび染色した親Ｃ２Ｃ１２細胞とともに測定した。
フソソームの蛍光強度は、すべての時点で陰性対照よりも大きく（図４）、フソソームは、親Ｃ２Ｃ１２細胞と同様の速度でアクチンを重合することができた。
下の表に列挙されているようなさらなる細胞骨格成分は、製造業者の取扱説明書に従って、市販のＥＬＩＳＡシステム（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を介して測定される。
Figure 2023153260000016
次いで、１００μＬの適切に希釈した溶解物を、マイクロウェルストリップからの適切なウェルに添加する。マイクロウェルを、テープで密封し、３７℃で２時間インキュベートする。インキュベーション後、シールテープを取り除き、内容物を廃棄する。各マイクロウェルを、２００ｕＬの１倍の洗浄緩衝液で４回洗浄する。それぞれ個々の洗浄の後、プレートを、吸収布に当てて、残留洗浄液を各ウェルから除去する。しかしながら、ウェルは、実験中のどの時点でも完全に乾燥しているわけではない。
次いで、１００ｕｌの再構成検出抗体（緑色）を各ウェルに添加する（陰性対照ウェルを除く）。次いで、ウェルを密閉し、３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーションが完了した後、洗浄手順を繰り返す。１００ｕＬの再構成されたＨＲＰ結合二次抗体（赤）を、各ウェルに添加する。ウェルをテープで密封し、３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、シールテープを取り除き、洗浄手順を繰り返す。次いで、１００ｕＬのＴＭＢ基質を各ウェルに添加する。ウェルをテープで密封し、３７℃で１０分間インキュベートする。この最終インキュベーションが完了したら、１００μＬの停止溶液を各ウェルに添加し、プレートを数秒間穏やかに振とうする。
アッセイの分光光度分析は、停止溶液を添加してから３０分以内に行われる。ウェルの下側を柔らかいティッシュで拭き、次いで、４５０ｎｍで吸光度を読み取る。一実施形態において、検出抗体で染色したフソソーム試料は、陰性対照のフソソーム試料よりも４５０ｎｍでより多くの光を吸収し、検出抗体で染色された細胞試料よりも少ない光を吸収する。
実施例７４：平均膜電位の測定
この実施例は、フソソームのミトコンドリア膜電位の定量化について説明する。一実施形態において、ミトコンドリア膜を含むフソソームは、ミトコンドリア膜電位を維持するであろう。
ミトコンドリアの代謝活性は、ミトコンドリアの膜電位によって測定することができる。ミトコンドリア膜電位を評価するために、フソソーム調製物の膜電位を、市販の色素ＴＭＲＥ（ＴＭＲＥ：テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩、Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ｔ６６９）を使用して定量化する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームまたは親細胞を、成長培地（１０％ウシ胎児血清を含むフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ）で６アリコート（未処理およびＦＣＣＰ処理の３重）に希釈する。試料の１つのアリコートを、ミトコンドリア膜電位を除去し、ＴＭＲＥ染色を防ぐ脱共役剤であるＦＣＣＰでインキュベートする。ＦＣＣＰ処理試料の場合、２μＭのＦＣＣＰを試料に添加し、分析前に５分間インキュベートする。次いで、フソソームおよび親細胞を、３０ｎＭのＴＭＲＥで染色する。各試料に対して、非染色（ＴＭＲＥなし）試料も並行して調製する。試料を、３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、試料を、４８８ｎｍのアルゴンレーザーを備えたフローサイトメーターで分析し、５３０＋／－３０ｎｍで励起および発光を収集する。
膜電位値（ミリボルト、ｍＶ）は、ＴＭＲＥの強度に基づいて計算される。すべての事象は、前方および側方散乱チャネルで獲得される（あるいは、ゲートは、小さな破片を排除するためにゲートを適用され得る）。未処理試料およびＦＣＣＰ処理試料の両方の蛍光強度（ＦＩ）値は、未処理試料およびＦＣＣＰ処理試料の幾何平均から非染色試料の蛍光強度の幾何平均を減じることによって正規化される。各調製物の膜電位状態は、（ＴＭＲＥがＮｅｒｎｓｔｉａｎ様式でミトコンドリアに蓄積するとき）ＴＭＲＥ蛍光に基づいてフソソームまたは細胞のミトコンドリア膜電位を決定するために使用することができる修正されたネルンスト方程式（下記参照）で正規化された蛍光強度値を使用して計算される。
フソソームまたは細胞膜電位は、次の式で計算される：（ｍＶ）＝－６１．５＊ｌｏｇ（ＦＩ処理－正規化／ＦＩＦＣＣＰ処理－正規化）。一実施形態において、Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞からのフソソーム調製物にこのアッセイを使用して、フソソーム調製物の膜電位状態は、親細胞よりも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以内、またはそれより大きい。一実施形態において、膜電位の範囲は、約－２０～－１５０ｍＶである。
実施例７５：対象における持続性半減期の測定
この実施例は、フソソーム半減期の測定について説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成されたガウシアルシフェラーゼを発現する細胞に由来し、緩衝液での純粋な１：２、１：５、および１：１０希釈が行われる。フソソームを欠いている緩衝液は、陰性対照として使用される。
各用量は、３匹の８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与される。フソソームの静脈内投与から１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、および７２時間後に、血液を、眼窩後静脈から採血する。動物は、実験終了時にＣＯ２吸入により殺処分される。
血液を、室温で２０分間遠心分離する。血清試料は、生体分析まで－８０℃で直ちに凍結される。次いで、各血液試料を使用して、試料をガウシアルシフェラーゼ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、Ｐｉｎｅｔｏｐ、ＡＺ）と混合した後、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイを実行する。簡単に説明すると、ルシフェリンまたは発光分子であるコレンテラジンをフラッシュアッセイ緩衝液と混合し、混合物を９６ウェルプレートの血液試料を含むウェルにピペッティングする。血液を欠いている陰性対照ウェルには、バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを決定するためのアッセイ緩衝液が含まれる。
さらに、発光シグナルを１時間当たりのガウシアルシフェラーゼ分泌分子に変換するために、陽性対照の精製ガウシアルシフェラーゼ（Ａｔｈｅｎａ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号０３０８）の標準曲線を調製する。プレートは、５００ｍｓｅｃの積分を使用して、発光についてアッセイされる。バックグラウンドのガウシアルシフェラーゼシグナルを、すべての試料から減じた後、線形最適曲線を、ガウシアルシフェラーゼ標準曲線に対して計算する。試料の測定値が標準曲線内に適合しない場合、それらを、適切に希釈して、再アッセイする。１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、および７２時間で採取した試料からのルシフェラーゼシグナルを、標準曲線に補間する。消失速度定数ｋｅ（ｈ－１）は、１コンパートメントモデルの方程式：Ｃ（ｔ）＝Ｃ０ｘｅ－ｋｅｘｔ（式中、Ｃ（ｔ）（ｎｇ／ｍＬ）は、時間ｔ（ｈ）でのフソソームの濃度であり、Ｃ０は時間＝０（ｎｇ／ｍＬ）でのフソソームの濃度である）を使用して計算される。消失半減期ｔ１／２，ｅ（ｈ）は、ｌｎ（２）／ｋｅとして計算される。
一実施形態において、フソソームは、陰性対照細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれより大きい半減期を有するであろう。
実施例７６：循環中のフソソームの保持の測定
この実施例は、循環へのフソソームの送達および臓器での保持の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、循環中に送達され、臓器部位では捕捉されず、保持されない。
一実施形態において、末梢循環に送達されたフソソームは、高効率で標的部位に到達するために、細網内皮系（ＲＥＳ）による捕捉および保持を回避する。ＲＥＳは、脾臓、リンパ節、および肝臓などの固形臓器に存在する、細胞系、主にマクロファージを含む。これらの細胞は、通常、赤血球などの「古い」細胞の除去を課せられる。
フソソームは、ＣＲＥリコンビナーゼを発現する細胞（薬剤）、またはＣＲＥを発現しない細胞（陰性対照）に由来する。これらのフソソームは、実施例６２のようにインビボ注射用に調製される。
レシピエントマウスは、ルシフェラーゼの発現を除去するために、フソソームによって送達されたｍＲＮＡから作製されたＣＲＥタンパク質によって修飾されたｌｏｘｐ－ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を保有する（ＪＡＸ番号００５１２５）。ルシフェラーゼは、生きている動物における生物発光イメージングによって検出することができる。この実施例の陽性対照は、その独自のゲノムからマクロファージおよび単球細胞でのみ同じタンパク質を発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫である（Ｃｘ３ｃｒ１－ＣＲＥ ＪＡＸ番号０２５５２４）。この交配からの子孫は、各対立遺伝子のうちの１つ（ｌｏｘｐ－ルシフェラーゼ、Ｃｘ３ｃｒ１－ＣＲＥ）を保有する。
フソソームは、ＣＲＥタンパク質によって作用される場合、ルシフェラーゼの発現を引き起こす遺伝子座を保有するマウスに、尾静脈注射（ＩＶ、実施例４８）を介して末梢循環に注射される。ＲＥＳの非特異的な捕捉メカニズムは、本来は貪食性であり、フソソームからのある割合のＣＲＥタンパク質を、ゲノム組換えをもたらすマクロファージに放出する。ＩＶＩＳ測定（実施例６２で説明された）は、非フソソーム対照が蓄積および融合する場所を特定する。脾臓、リンパ節、および肝臓への蓄積は、フソソームの非特異的ＲＥＳ媒介捕捉の指標を示す。ＩＶＩＳは、フソソーム注射から２４、４８、９６時間後に実行される。
マウスを殺処分し、腸内の脾臓、肝臓、および主要なリンパ鎖を採取する。
ゲノムＤＮＡは、これらの臓器から単離され、組換えゲノムＤＮＡの残りに対して定量的なポリメラーゼ連鎖反応を受ける。別のゲノム遺伝子座（ＣＲＥの標的ではない）も定量化され、試料中の細胞の数の測定値を提供する。
実施形態において、動物全体、具体的には肝臓および脾臓部位で、薬剤および陰性対照の両方について低い生物発光シグナルが観察されるであろう。実施形態において、陽性対照は、肝臓におけるシグナルの増加（陰性対照および薬剤を上回る）および脾臓における高シグナル、ならびにリンパ節と一致する分布を示す。
一実施形態において、これらの組織のゲノムＰＣＲ定量化は、検査されたすべての組織における陽性対照の代替遺伝子座を上回る組換えシグナルの割合が高いことを示し、一方、薬剤および陰性対照の場合、組換えのレベルは、すべての組織で無視できる。
一実施形態において、この実施例の結果は、非フソゲン対照がＲＥＳによって保持されず、広範な分布を達成し、高い生物学的利用能を示すことができることを示すであろう。
実施例７７：免疫抑制によるフソソームの寿命
この実施例は、免疫抑制薬と同時投与される場合のフソソーム組成物の免疫原性の定量化について説明する。
免疫応答を刺激する治療法は、治療効果を低下させ得る、またはレシピエントに毒性を引き起こし得る。一実施形態において、フソソームは、実質的に非免疫原性である。
前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成された精製フソソーム組成物は、免疫抑制薬と同時投与され、免疫原性は、インビボでのフソソームの寿命によってアッセイされる。ルシフェラーゼで標識された十分な数のフソソームを、タクロリムス（ＴＡＣ、４ｍｇ／ｋｇ／日；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはビヒクル（陰性対照）で、またはいかなる薬剤も含まない（陽性対照）正常マウスの腓腹筋に局所注射する。次いで、マウスは、注射から１、２、３、４、５、６、１２、２４、４８、および７２時間後、インビボイメージングに供される。
簡単に説明すると、マウスをイソフルランで麻酔し、Ｄ－ルシフェリンを体重１キログラム当たり３７５ｍｇの用量で腹腔内投与する。イメージング時に、動物を遮光チャンバーに入れ、動物に移植したルシフェラーゼ発現フソソームから放出された光子を、生物発光の強度に応じて５秒から５分の積分時間で収集する。上記の様々な時点で、同じマウスを、繰り返しスキャンする。ＢＬＩシグナルは、１秒当たりの光子数（全光束）の単位で定量化され、ｌｏｇ［１秒当たりの光子数］として表示される。データは、ＴＡＣを使用した場合と使用しない場合の強度およびフソソーム注射を比較することによって分析される。
実施形態において、アッセイは、最終時点でのフソソームのみおよびビヒクル群と比較して、ＴＡＣ同時投与群におけるフソソームの寿命の増加を示すであろう。いくつかの実施形態において、フソソームの寿命の増加に加えて、各時点でのフソソームとビヒクルまたはフソソームのみに対するフソソームとＴＡＣアームからのＢＬＩシグナルの増加が観察される。
実施例７８：フソソームに対して反応する既存のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の測定
この実施例は、フローサイトメトリーを使用して測定された既存の抗フソソーム抗体価の定量化について説明する。
フソソームにおける免疫原性の基準は、抗体応答である。フソソームを認識する抗体は、フソソームの活性または寿命を制限することができる方法で結合することができる。一実施形態において、本明細書に記載のフソソームの一部のレシピエントは、フソソームに結合し、それを認識する既存の抗体を有するであろう。
この実施例において、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって、調前述の実施例に記載された方法のいずれかにより異種供給源細胞を使用して生成されたフソソームを使用して、抗フソソーム抗体力価を試験する。この実施例において、フソソームナイーブマウスを、抗フソソーム抗体の存在について評価する。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに対する最適化を備えたヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。
陰性対照は、ＩｇＭおよびＩｇＧが枯渇したマウス血清であり、陽性対照は、異種供給源細胞から生成されたフソソームの複数回注射を受けたマウスに由来する血清である。
フソソームに結合する既存の抗体の存在を評価するために、フソソームナイーブマウスからの血清は、まず、５６℃で３０分間加熱することによって補完されず、続いて、３％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳで３３％に希釈される。等量の血清およびフソソーム（１ｍＬ当たり１×１０２～１×１０８個のフソソーム）懸濁液を、４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッションを通してＰＢＳで洗浄する。
ＩｇＭ異種反応性抗体は、４℃で４５分間、マウスＩｇＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＦｃ部分に特異的なＰＥ結合ヤギ抗体で細胞をインキュベートすることによって染色される。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用してもよい。すべての群からの細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。
一実施形態において、陰性対照血清は、無血清または二次単独対照に匹敵する無視できる蛍光を示す。一実施形態において、陽性対照は、陰性対照よりも多くの蛍光を示し、無血清または二次単独対照よりも多くを示す。一実施形態において、免疫原性が生じる場合、フソソームナイーブマウスからの血清は、陰性対照よりも多くの蛍光を示す。一実施形態において、免疫原性が生じない場合、フソソームナイーブマウスからの血清は、陰性対照と比較して同様の蛍光を示す。
実施例７９：フソソームの複数回投与後のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答の測定
この実施例は、修飾フソソームの複数回投与後の修飾フソソームの体液性応答の定量化について説明する。一実施形態において、例えば、本明細書に記載の方法によって修飾された修飾フソソームは、修飾フソソームの複数（例えば、１つを超える、例えば２つ以上）の投与後に体液性応答が低下する（例えば、非修飾フソソームの投与と比較して低下する）。
フソソームにおける免疫原性の基準は、抗体応答である。一実施形態において、フソソームの反復注射は、抗フソソーム抗体、例えば、フソソームを認識する抗体の開発をもたらし得る。一実施形態において、フソソームを認識する抗体は、フソソームの活性または寿命を制限することができる方法で結合することができる。
この実施例において、フソソームの１回以上の投与後に抗フソソーム抗体力価を試験した。フソソームは、前述の実施例のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、非修飾間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクターのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣの空ベクター）から生成される。血清は、異なるコホート：ビヒクル（フソソームナイーブ群）、ＭＳＣフソソーム、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇフソソーム、またはＭＳＣの空ベクターフソソームで、１、２、３、５、１０回の注射で全身的および／または局所的に注射されたマウスから引き出される。
抗フソソーム抗体の存在および存在量を評価するために、マウスからの血清は、まず、５６℃で３０分間加熱することによって補完されず、続いて、３％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳで３３％に希釈される。等量の血清およびフソソーム（１ｍＬ当たり１×１０２～１×１０８個のフソソーム）を、４℃で３０分間インキュベートし、仔ウシ血清クッションを通してＰＢＳで洗浄する。
フソソーム反応性ＩｇＭ抗体は、４℃で４５分間、マウスＩｇＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＦｃ部分に特異的なＰＥ結合ヤギ抗体で細胞をインキュベートすることによって染色される。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用してもよい。すべての群からの細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。
一実施形態において、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇフソソームは、ＭＳＣフソソームまたはＭＳＣ－空ベクターフソソームと比較して、注射後、（ＦＡＣＳでの蛍光強度によって測定されたように）抗フソソームＩｇＭ（またはＩｇＧ１／２）抗体力価が低下する。
実施例８０：免疫原性を低下させる寛容原性タンパク質を発現するためのフソソーム供給源細胞の修飾
この実施例は、修飾細胞源に由来するフソソームにおける免疫原性の定量化について説明する。一実施形態において、修飾細胞源に由来するフソソームは、非修飾細胞源に由来するフソソームと比較して免疫原性が低下する。
免疫応答を刺激する治療法は、治療効果を低下させ得る、またはレシピエントに毒性を引き起こし得る。一実施形態において、実質的に非免疫原性のフソソームは、対象に投与される。一実施形態において、細胞供給源の免疫原性は、フソソーム免疫原性の代用物としてアッセイすることができる。
ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介性発現を使用して修飾されるか、または空ベクターを発現するｉＰＳ細胞（陰性対照）を、免疫原性について以下のようにアッセイする。潜在的なフソソーム細胞供給源として十分な数のｉＰＳ細胞を、Ｃ５７／Ｂ６マウスの後ろ腹部に皮下注射し、奇形腫を形成させるのに適切な時間を与える。
奇形腫が形成されると、組織が採取される。蛍光染色のために準備された組織は、ＯＣＴで凍結され、免疫組織化学およびＨ＆Ｅ染色のために準備された組織は、１０％緩衝ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋される。組織切片を、一般的な免疫組織化学プロトコルに従って、抗体、ポリクローナルウサギ抗ヒトＣＤ３抗体（ＤＡＫＯ）、マウス抗ヒトＣＤ４ ｍＡｂ（ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、マウス抗ヒトＣＤ８ ｍＡｂ（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色する。これらは、適切な検出試薬、すなわち、抗マウス二次ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）または抗ウサギ二次ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用することによって検出される。
検出は、ペルオキシダーゼベースの可視化システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して達成される。データは、光学顕微鏡を使用して２０倍の視野で試験された２５、５０、または１００の組織切片に存在する浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＮＫ細胞の平均数をとることによって分析される。一実施形態において、修飾されていないｉＰＳＣまたは空ベクターを発現するｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ｇを発現するｉＰＳＣと比較して試験された視野に存在する浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ３＋ＮＫ細胞の数が多い。
一実施形態において、フソソームの免疫原性特性は、供給源細胞の免疫原性特性と実質的に同等であろう。一実施形態において、ＨＬＡ－Ｇで修飾されたｉＰＳ細胞に由来するフソソームは、それらの修飾されていない対応物と比較して免疫細胞浸潤が低減されている。
実施例８１：免疫原性を低下させる免疫原性タンパク質をノックダウンするためのフソソーム供給源細胞の修飾
この実施例は、免疫原性である分子の発現を低減するように修飾されている、細胞供給源に由来するフソソーム組成物の生成の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、免疫原性である分子の発現を低減するように修飾された細胞供給源に由来し得る。
免疫応答を刺激する治療法は、治療効果を低下させ得る、またはレシピエントに毒性を引き起こし得る。したがって、免疫原性は、安全かつ効果的な治療フソソームにとって重要な特性である。ある特定の免疫活性化剤の発現は、免疫応答を引き起し得る。ＭＨＣクラスＩは、免疫活性化剤の一例を表す。
この実施例において、フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、非修飾間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＭＨＣクラスＩを標的とするｓｈＲＮＡのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩ）、および非標的化スクランブルｓｈＲＮＡのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ－スクランブル、陰性対照）から生成される。
フソソームは、フローサイトメトリーを使用してＭＨＣクラスＩの発現についてアッセイされる。適切な数のフソソームを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、ＭＨＣクラスＩに対する蛍光結合モノクローナル抗体（Ｈａｒｌａｎ Ｓｅｒａ－Ｌａｂ、Ｂｅｌｔｏｎ，ＵＫ）の１：１０～１：４０００希釈液で３０分間氷上に保持する。フソソームをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁する。非特異的蛍光は、同等の希釈度で適切に蛍光結合したアイソタイプ対照抗体とインキュベートした等アリコートのフソソーム調製物を使用して決定される。フソソームを、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｏｒｔ、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でアッセイし、データを、フロー分析ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する。
ＭＳＣ、ＭＳＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩ、ＭＳＣスクランブルに由来するフソソームの平均蛍光データが、比較される。一実施形態において、ＭＳＣ－ｓｈＭＨＣクラスＩに由来するフソソームは、ＭＳＣおよびＭＳＣ－スクランブルと比較して、ＭＨＣクラスＩのより低い発現を有するであろう。
実施例８２：マクロファージによる食作用を回避するためのフソソーム供給源細胞の修飾
この実施例は、修飾されたフソソームによる食作用の回避の定量化について説明する。一実施形態において、修飾されたフソソームは、マクロファージによる食作用を回避するであろう。
細胞は、食作用に関与し、粒子を貪食し、細菌および死細胞などの外来侵入者の隔離および破壊を可能にする。いくつかの実施形態において、マクロファージによるフソソームの食作用は、それらの活性を低下させ得る。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、ＣＤ４７を欠いているＣＳＦＥ標識哺乳動物細胞（以下、ＮＭＣ、陽性対照）、ＣＤ４７ ｃＤＮＡのレンチウイルス媒介性発現を使用してＣＤ４７を発現するように操作されたＣＳＦＥ標識細胞（以下、ＮＭＣ－ＣＤ４７）、および空ベクター対照のレンチウイルス媒介性発現を使用して操作されたＣＳＦＥ標識細胞（以下、ＮＭＣ空ベクター、陰性対照）から生成される。
マクロファージ媒介の免疫クリアランスの減少は、以下のプロトコルに従って食作用アッセイで決定される。マクロファージを、共焦点ガラス底皿に収穫直後に播種する。マクロファージを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させる。ＮＭＣ、ＮＭＣ－ＣＤ４７、ＮＭＣ－空ベクターに由来する適切な数のフソソームを、プロトコルに示されているようにマクロファージに追加し、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄｆで２時間インキュベートする。
２時間後、皿を静かに洗浄し、細胞内蛍光を試験する。取り込まれた粒子から放出された細胞内蛍光は、４８８励起での共焦点顕微鏡によって画像化される。食作用陽性のマクロファージの数は、イメージングソフトウェアを使用して定量化される。データは、食細胞指数＝（取り込まれた細胞の総数／計数されたマクロファージの総数）×（取り込まれた細胞を含むマクロファージの数／計数されたマクロファージの総数）×１００として表される。
一実施形態において、マクロファージがＮＭＣ－ＣＤ４７に由来するフソソームとインキュベートされる場合、ＮＭＣまたはＮＭＣ－空ベクターに由来するものと比べて、食細胞指数が低下する。
実施例８３：ＰＢＭＣ細胞溶解により媒介される細胞毒性の減少のためのフソソーム供給源細胞の修飾
この実施例は、ＰＢＭＣによる細胞溶解により細胞毒性が低下するように修飾された細胞に由来するフソソームの生成について説明する。
一実施形態において、溶解はフソソームの活性を低下させる、例えば阻害または停止するので、ＰＢＭＣによる供給源細胞またはフソソームの細胞毒性媒介性細胞溶解は、フソソームの免疫原性の基準である。
この実施例において、フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、非修飾間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクターのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣの空ベクター、陰性対照）から生成される。
フソソームのＰＭＢＣ媒介溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２およびｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００において記載されるようにユーロピウム放出アッセイによって決定される。ＰＢＭＣ（以下、エフェクター細胞）を、適切なドナーから単離し、同種ガンマ線を照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、丸底９６ウェルプレート中で３７℃で７日間刺激する。フソソームは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で標識される。
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイは、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲内のエフェクター／標的の比で播種後から１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、９６ウェルプレート中で、エフェクター細胞で６３Ｅｕ標識フソソームをインキュベートすることによって行われる。インキュベーション後、プレートを、遠心分離し、上清の試料を、低バックグラウンドの９６ウェルプレートに移す（フルオロ免疫プレート、Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。
続いて、強化溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、各ウェルに添加する。放出されたユーロピウムは、時間分解蛍光計（Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ－Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定される。蛍光は、１秒当たりの計数（ＣＰＳ）で表される。標的フソソームによるユーロピウムの最大パーセント放出は、適切な数（１×１０２～１×１０８）のフソソームを１％トリトン（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的フソソームによるユーロピウムの自然放出は、エフェクター細胞なしで標識された標的フソソームのインキュベーションによって測定される。次いで、漏出率は、（自然放出／最大放出）×１００％、のように計算される。最後に、細胞傷害性媒介溶解の割合は、溶解（％）＝［（測定された溶解－自然溶解－自然放出）／（最大放出－自然放出）］×１００％、のように計算される。データは、異なるエフェクター標的の比率の関数として溶解の割合を調べることによって分析される。
一実施形態において、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたフソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣスクランブル生成フソソームと比較して、特定の時点で標的細胞による溶解の割合が減少するであろう。
実施例８４：ＮＫ溶解活性の低下のためのフソソーム供給源細胞の修飾
この実施例は、ＮＫ細胞による細胞毒性媒介性細胞溶解を低減するように修飾されている、細胞供給源に由来するフソソーム組成物の生成について説明する。一実施形態において、ＮＫ細胞による供給源細胞またはフソソームの細胞毒性媒介性細胞溶解は、フソソームの免疫原性の基準である。
この実施例において、フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、非修飾間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクターのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣの空ベクター、陰性対照）から生成される。
フソソームのＮＫ細胞媒介性溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２およびｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００において記載されるようにユーロピウム放出アッセイによって決定される。ＮＫ細胞（以下、エフェクター細胞）は、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ （２０）：１５４７－１５５９；２０１１における方法に従って適切なドナーから単離され、同種ガンマ線を照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、丸底９６ウェルプレート中、３７℃で７日間刺激する。フソソームは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で標識される。
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイは、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲内のエフェクター／標的の比で播種後から１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、９６ウェルプレート中で、エフェクター細胞で６３Ｅｕ標識フソソームをインキュベートすることによって行われる。インキュベーション後、プレートを、遠心分離し、上清の試料を、低バックグラウンドの９６ウェルプレートに移す（フルオロ免疫プレート、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）。
続いて、強化溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、各ウェルに添加する。放出されたユーロピウムは、時間分解蛍光計（Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ－Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定される。蛍光は、１秒当たりの計数（ＣＰＳ）で表される。標的フソソームによるユーロピウムの最大パーセント放出は、適切な数（１×１０２～１×１０８）のフソソームを１％トリトン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的フソソームによるユーロピウムの自然放出は、エフェクター細胞なしで標識された標的フソソームのインキュベーションによって測定される。次いで、漏出率は、（自然放出／最大放出）×１００％、のように計算される。最後に、細胞傷害性媒介溶解の割合は、溶解（％）＝［（測定された溶解－自然溶解－自然放出）／（最大放出－自然放出）］×１００％、のように計算される。データは、異なるエフェクター標的の比率の関数として溶解の割合を調べることによって分析される。
一実施形態において、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたフソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣスクランブル生成フソソームと比較して、適切な時点で溶解の割合が減少するであろう。
実施例８５：ＣＤ８キラーＴ細胞溶解の減少のためのフソソーム供給源細胞の修飾
この実施例は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞毒性媒介性細胞溶解を低減するように修飾されている、細胞供給源に由来するフソソーム組成物の生成について説明する。一実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞による供給源細胞またはフソソームの細胞毒性媒介性細胞溶解は、フソソームの免疫原性の基準である。
この実施例において、フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、非修飾間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクターのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣの空ベクター、陰性対照）から生成される。
フソソームのＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性溶解は、Ｂｏｕｍａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５（２）：８５－９２；１９９２およびｖａｎ Ｂｅｓｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７０（１）：１３６－１４３；２０００において記載されるようにユーロピウム放出アッセイによって決定される。ＣＤ８＋Ｔ細胞（以下、エフェクター細胞）は、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ （２０）：１５４７－１５５９；２０１１における方法に従って適切なドナーから単離され、同種ガンマ線を照射したＰＭＢＣおよび２００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２（プロロイキン、Ｃｈｉｒｏｎ ＢＶ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で、丸底９６ウェルプレート中、３７℃で７日間刺激する。フソソームは、ユーロピウム－ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）（ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で標識される。
７日目に、細胞毒性媒介溶解アッセイは、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲内のエフェクター／標的の比で播種後から１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、９６ウェルプレート中で、エフェクター細胞で６３Ｅｕ標識フソソームをインキュベートすることによって行われる。インキュベーション後、プレートを、遠心分離し、２０ｕｌの上清を、低バックグラウンドの９６ウェルプレートに移す（フルオロ免疫プレート、Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）。
続いて、強化溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、各ウェルに添加する。放出されたユーロピウムは、時間分解蛍光計（Ｖｉｃｔｏｒ １４２０マルチラベルカウンター、ＬＫＢ－Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定される。蛍光は、１秒当たりの計数（ＣＰＳ）で表される。標的フソソームによるユーロピウムの最大パーセント放出は、適切な数（１×１０２～１×１０８）のフソソームを１％トリトン（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）と適切な時間インキュベートすることによって決定される。標的フソソームによるユーロピウムの自然放出は、エフェクター細胞なしで標識された標的フソソームのインキュベーションによって測定される。次いで、漏出率は、（自然放出／最大放出）×１００％、のように計算される。最後に、細胞傷害性媒介溶解の割合は、溶解（％）＝［（測定された溶解－自然溶解－自然放出）／（最大放出－自然放出）］×１００％、のように計算される。データは、異なるエフェクター標的の比率の関数として溶解の割合を調べることによって分析される。
一実施形態において、ＭＳＣ－ＨＬＡ－Ｇ細胞から生成されたフソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣスクランブル生成フソソームと比較して、適切な時点で溶解の割合が減少するであろう。
実施例８６：Ｔ細胞活性化の低下のためのフソソーム供給源細胞の修飾
この実施例は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって評価されるＴ細胞の活性化および増殖が低下した修飾フソソームの生成について説明する。
Ｔ細胞の増殖および活性化は、フソソームの免疫原性の評価基準である。フソソーム組成物によるＭＬＲ反応におけるＴ細胞の増殖の刺激は、インビボでのＴ細胞の増殖の刺激を示唆し得る。
一実施形態において、修飾された供給源細胞から生成されたフソソームは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によって評価されるように、Ｔ細胞の活性化および増殖が低下する。一実施形態において、修飾された供給源細胞から生成されたフソソームは、インビボで免疫応答を生成せず、したがって、フソソーム組成物の有効性を維持する。
この実施例において、フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、非修飾間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ、陽性対照）、ＩＬ－１０のレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣ－ＩＬ－１０）、および空ベクターのレンチウイルス媒介性発現で修飾された間葉性幹細胞（以下、ＭＳＣの空ベクター、陰性対照）から生成される。
ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６脾細胞は、刺激細胞または応答細胞として使用される。特に、これらの細胞の供給源は、一般的に使用されているヒト由来の刺激／応答細胞と交換することができる。さらに、任意の哺乳動物精製同種ＣＤ４＋Ｔ細胞集団、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、またはＣＤ４－／ＣＤ８－は、応答集団として使用してもよい。
マウス脾細胞は、完全に凍結したスライドを使用した機械的解離、続いて、溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ－Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）による赤血球溶解によって単離される。実験前に、刺激細胞に、２０Ｇｙのγ線を照射して、応答細胞に対する応答を防ぐ。次いで、完全なＤＭＥＭ－１０培地中で丸底９６ウェルプレートに同数の刺激細胞および応答細胞（または、１：１の比を維持しながら代替の濃度）を添加することによって共培養を行う。適切な数のフソソーム（１×１０１～１×１０８の範囲からいくつかの濃度で）を、異なる時間間隔、ｔ＝０、６、１２、２４、３６、４８時間で、共培養に添加する。
増殖は、取り込みを可能にする１μＣｉの［３Ｈ］－チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を添加することによって評価される。［３Ｈ］－チミジンを、ｔ＝２、６、１２、２４、３６、４８、７２時間、ＭＬＲに添加し、長期培養から２、６、１２、１８、２４、３６、および４８時間後、９６ウェル細胞採取器（Ｉｎｏｔｅｃｋ、Ｂｅｒｔｏｌｄ、Ｊａｐａｎ）を使用してガラス繊維フィルター上に細胞を採取する。Ｔ細胞増殖実験はすべて、３重に行われる。［３Ｈ］－チミジンの取り込みは、マイクロベータ発光カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を使用して測定する。これらの結果は、１分当たりの計数（ｃｐｍ）として表すことができる。
一実施形態において、ＭＳＣ－ＩＬ１０フソソームは、ＭＳＣ－空ベクターまたはＭＳＣ非修飾フソソーム対照と比較して、Ｔ細胞の増殖の減少を示すであろう。
実施例８７：対象における標的電位の測定
この実施例は、特定の身体部位を標的とするフソソームの能力を評価する。一実施形態において、フソソームは、特定の身体部位を標的とすることができる。標的化は、１つ以上の関連する治療部位に対して治療剤の活性を制限する方法である。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、ホタルルシフェラーゼを発現するフソソームまたは細胞を静脈内注射する。フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって、ホタルルシフェラーゼを安定して発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から生成される。マウスの群は、フソソームまたは細胞注射の１、２、３、４、５、６、８、１２、および２４時間後に殺処分する。
殺処分する５分前に、ルシフェラーゼを視覚化するために、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇの用量で生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）をＩＰ注射する。生物発光画像システムは、すべてのデバイス設定を補正するために較正される。次いで、マウスを殺処分し、肝臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、ＧＩ、および腎臓を収集する。画像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、これらのエクスビボで臓器の生物発光の画像を取得する。生物発光シグナルは、Ｒａｄｉａｎｃｅ Ｐｈｏｔｏｎｓを使用して、測定値として使用された全フラックスで測定される。関心領域（ＲＯＩ）は、光子／秒の値を得るために、エクスビボで臓器を囲むことによって生成される。標的臓器（例えば肝臓）と非標的臓器（例えば、肺、心臓、脾臓、膵臓、ＧＩ、および腎臓からの光子／秒の合計）の光子／秒の比率は、肝臓への標的化の評価基準として計算される。
一実施形態において、フソソームおよび細胞の両方において、肝臓と他の臓器との間の光子／秒の比率は、１より大きくなり、これはフソソームが肝臓を標的とすることを示し得る。一実施形態において、陰性対照動物は、すべての臓器ではるかに低い光子／秒を表す。
実施例８８：対象における外因性因子の送達の測定
この実施例は、対象における外因性因子を含むフソソームの送達の定量化について説明する。フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって、ガウシアルシフェラーゼを発現する細胞またはルシフェラーゼを発現しない細胞（陰性対照）から調製される。
陽性対照細胞またはフソソームを、マウスに静脈内注射する。フソソームまたは細胞は、２６ゲージのインスリン注射針を使用して５～８秒以内に送達される。インビボでの生物発光イメージングは、インビボイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用して、注射から１、２、または３日後にマウスで実行される。
使用直前に、セレンテラジン、ルシフェリン、または発光分子（５ｍｇ／ｍｌ）を、酸性化メタノールで調製し、マウスの尾静脈に直ちに注入する。マウスは、ＸＧＩ－８ガス麻酔システムを使用した加熱ステージ上で連続麻酔下にある。
生物発光イメージングは、セレンテラジン（４μｇ／ｇ体重）の静脈内尾静脈注射の直後に５分間にわたって光子数を取得することによって得られる。取得したデータは、ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用してライトビュー画像にオーバーレイして分析される。関心領域（ＲＯＩ）は、自動シグナル強度等高線ツールを使用して作成され、同じ動物のバックグラウンド減算で正規化される。マウス内の生物発光光源の位置を特定するために、露光時間３～１０分の５８０、６００、および６２０ｎｍの波長で３つのフィルターを使用した連続データ収集が行われる。
さらに、各時点で、尿試料が腹部の触診によって収集される。
血液試料（５０μｌ）を、各マウスの尾静脈からヘパリン化またはＥＤＴＡチューブに採取する。血漿単離のために、血液試料を、４℃で１．３×ｇで２５分間遠心分離する。
次いで、５μｌの血液、血漿、または尿試料を使用して、試料を５０μＭのガウシアルシフェラーゼ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ、Ｐｉｎｅｔｏｐ、ＡＺ）と混合した後、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイを実行する。
一実施形態において、陰性対照試料は、ルシフェラーゼに対して陰性であり、陽性対照試料は、細胞を投与された動物からのものである。一実施形態において、ガウシアルシフェラーゼを発現するフソソームを投与した動物からの試料は、各試料のルシフェラーゼに対して陽性であろう。
例えば、Ｅｌ－Ａｍｏｕｒｉ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５３（１）：６３－７３，２０１３を参照のこと。
実施例８９：フソソームの脂質二重層を横断する能動輸送
この実施例は、生細胞でのグルコース取り込みをモニタリングし、脂質二重層を横断する能動輸送を測定するために使用することができる、２－ＮＢＤＧ（２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアキソール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース）、蛍光グルコース類似体のレベルの定量について説明する。一実施形態において、このアッセイを使用して、グルコース取り込みのレベルおよびフソソームの脂質二重層を横断する能動輸送を測定することができる。
フソソーム組成物は、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。次いで、十分な数のフソソームを、グルコースを含まず、２０％ウシ胎児血清、および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。２時間のグルコース飢餓期間の後、グルコースを含まず、２０％ウシ胎児血清、１倍のペニシリン／ストレプトマイシン、および２０ｕＭの２－ＮＢＤＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭを含むように交換し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートする。等量の２－ＮＢＤＧのためのビヒクルであるＤＭＳＯを２－ＮＢＤＧの代わりに添加することを除いて、陰性対照フソソームも同じように処理される。
次いで、フソソームを１×ＰＢＳで３回洗浄し、適切な緩衝液に再懸濁し、９６ウェル画像プレートに移す。次いで、２－ＮＢＤＧ蛍光を、ＧＦＰライトキューブ（４６９／３５励起フィルターおよび５２５／３９発光フィルター）を使用した蛍光光度計で測定して、フソソーム膜を横断して輸送され、１時間の装填期間、フソソームに蓄積された２－ＮＢＤＧの量を定量化する。
一実施形態において、２－ＮＢＤＧ蛍光は、陰性（ＤＭＳＯ）対照と比較して、２－ＮＢＤＧ処理を伴うフソソームにおいてより高いであろう。５２５／３９発光フィルターを使用した蛍光測定は、存在する２－ＮＢＤＧ分子の数と相対的である。
実施例９０：非エンドサイトーシス経路を介したフソソームの送達
この実施例は、非エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達について説明する。
一実施形態において、フソソームは、フソソーム媒介性の非エンドサイトーシス経路を介して薬剤を送達する。理論によって拘束されることを望まないが、フソソームの内腔内に、フソソームのエンドサイトーシス媒介性の取り込みのためにいかなる要件もなく、レシピエント細胞のサイトゾルに直接運ばれる薬剤、例えばＣｒｅの送達は、フソソーム媒介性の非エンドサイトーシス経路送達を通じて起こるであろう。
この実施例において、フソソームは、その原形質膜上にセンダイウイルスＨおよびＥタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２３）。さらに、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定的に発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換え時に、ＧＦＰ発現からＲＦＰ発現に切り替わり、マーカーとして、融合およびＣｒｅの送達を示す。
本明細書に記載の方法によって生成されたフソソームは、以下のように非エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイされる。レシピエント細胞を、黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種する。次いで、レシピエント細胞を播種してから２４時間後に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中でレシピエント細胞に適用する。非エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達のレベルを決定するために、フソソームを受け取るレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処理する。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関する。フソソームを適用した後、細胞プレートを、４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞の接触を開始するのに役立つ。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、薬剤送達であるＣｒｅを、イメージングを介して評価する。
細胞を画像化して、フィールドまたはウェル内のＧＦＰ陽性細胞に対してＲＦＰ陽性細胞を明確に特定する。この実施例において、自動蛍光顕微鏡を使用して、細胞プレートを画像化する。所定のウェル中の総細胞集団は、まず、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定される。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を、通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔは、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化される。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化される。異なる細胞群の画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られる。
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定される。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化される。
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの分析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，１９９７－２００７）で実施される。画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理される。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定される。バックグラウンド強度を大幅に上回るＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞は、閾値を設定するために使用され、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外される。
総細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞は、バックグラウンドを大幅に上回る細胞の閾値を再度設定し、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含めることによって特定される。
レシピエント細胞を含む対照ウェルで特定されたＲＦＰ陽性細胞の数は、フソソームを含むウェル内のＲＦＰ陽性細胞の数から減算するため（非特異的Ｌｏｘｐ組換えを減算するため）に使用される。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容していないレシピエント細胞）およびＲＦＰ陽性細胞の合計で除算して、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの画分を定量化する。このレベルは、レシピエント細胞に適用される所定の用量のフソソームに正規化される。非エンドサイトーシス経路を介して送達されたフソソームＣｒｅの値を計算するために、クロロキンの非存在（ＦｕｓＬ－ＣＱ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルと同様に、クロロキンの存在（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルが決定される。非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの正規化された値を決定するために、次の式を使用する：［（ＦｕｓＬ－ＣＱ）－（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）］／（ＦｕｓＬ－ＣＱ）。
一実施形態において、所定のフソソームについて非エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．１～０．９５の範囲内であるか、またはクロロキンで処理されたレシピエント細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより大きい。
実施例９１：エンドサイトーシス経路を介したフソソームの送達
この実施例は、エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達について説明する。
一実施形態において、フソソームは、フソソーム媒介性エンドサイトーシス経路を介して薬剤を送達する。理論によって拘束されることを望まないが、エンドサイトーシス依存性の取り込みの経路によるレシピエント細胞へのフソソームの内腔内に運ばれる薬剤、例えばカーゴの送達は、フソソーム媒介性のエンドサイトーシス経路送達を通じて起こるであろう。
この実施例において、フソソームは、２μｍのフィルターを通してその原形質膜上にフソゲンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を押し出すことによって生成された微小胞を含む（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１８（３）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１０５４４－０１６－００６６－ｙ）（Ｒｉｅｄｅｌ，Ｋｏｎｄｏｒ－Ｋｏｃｈ，＆ Ｇａｒｏｆｆ，１９８４，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３（７），１４７７－８３．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ｆｒｏｍ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／６０８６３２６から検索される）。さらに、フソソームは、ｍＴａｇＢＦＰ２蛍光タンパク質およびＣｒｅリコンビナーゼを発現する。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定的に発現するＰＣ３細胞であり、Ｃｒｅによる組換え時に、ＧＦＰ発現からＲＦＰ発現に切り替わり、マーカーとして、融合およびＣｒｅの送達を示す。
本明細書に記載の方法によって生成されたフソソームは、以下のようにエンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイされる。レシピエント細胞を、使用した画像システムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートに播種する（この実施例において、細胞を、黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種する）。次いで、レシピエント細胞を播種してから２４時間後に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中でレシピエント細胞に適用する。エンドサイトーシス経路を介したＣｒｅの送達のレベルを決定するために、フソソームを受け取るレシピエント細胞の並行群を、エンドソーム酸性化の阻害剤であるクロロキン（３０μｇ／ｍＬ）で処理する。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関する。フソソームを適用した後、細胞プレートを、４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞の接触を開始するのに役立つ。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、薬剤送達であるＣｒｅを、イメージングを介して評価する。
細胞を画像化して、フィールドまたはウェル内のＧＦＰ陽性細胞に対してＲＦＰ陽性細胞を明確に特定する。この実施例では、自動蛍光顕微鏡を使用して、細胞プレートを画像化する。所定のウェル中の総細胞集団は、まず、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定される。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を、通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔは、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化される。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化される。異なる細胞群の画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られる。
取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定される。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化される。
ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性ウェルの分析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，１９９７－２００７）で実施される。画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理される。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定される。バックグラウンド強度を大幅に上回るＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞は、閾値処理され、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外される。
総細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞は、バックグラウンドを大幅に上回る細胞の閾値を再度設定し、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含めることによって特定される。
レシピエント細胞を含む対照ウェルで特定されたＲＦＰ陽性細胞の数は、フソソームを含むウェル内のＲＦＰ陽性細胞の数から減算するため（非特異的Ｌｏｘｐ組換えを減算するため）に使用される。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容していないレシピエント細胞）およびＲＦＰ陽性細胞の合計で除算して、レシピエント細胞集団に送達されたフソソームＣｒｅの画分を定量化する。このレベルは、レシピエント細胞に適用される所定の用量のフソソームに正規化される。エンドサイトーシス経路を介して送達されたフソソームＣｒｅの値を計算するために、クロロキンの非存在（ＦｕｓＬ－ＣＱ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルと同様に、クロロキンの存在（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルが決定される。エンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの正規化された値を決定するために、次の式を使用する：（ＦｕｓＬ＋ＣＱ）／（ＦｕｓＬ－ＣＱ）。
一実施形態において、所定のフソソームについてエンドサイトーシス経路を介して送達されるフソソームＣｒｅの平均レベルは、０．０１～０．６の範囲内であるか、またはクロロキンで処理したレシピエント細胞よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより大きい。
実施例９２：ダイナミン媒介経路、マクロピノサイトーシス経路、またはアクチン媒介経路を介したフソソームの送達
この実施例は、ダイナミン媒介経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達について説明する。微小胞を含むフソソームは、前述の実施例で説明したように生成され得る。フソソームは、フソソームを受容する一連のレシピエント細胞がダイナミンの阻害剤であるＤｙｎａｓｏｒｅ（１２０μＭ）で処理したことを除いて、前述の実施例に従ってダイナミン媒介経路を介したＣｒｅの送達についてアッセイされる。ダイナミン媒介経路を介して送達されたフソソームＣｒｅの値を計算するために、Ｄｙｎａｓｏｒｅの非存在（ＦｕｓＬ－ＤＳ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルと同様に、Ｄｙｎａｓｏｒｅの存在（ＦｕｓＬ＋ＤＳ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルが決定される。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値は、前述の実施例で説明したように計算され得る。
この実施例はまた、マクロピノサイトーシスを介したレシピエント細胞へのＣｒｅの送達についても説明する。微小胞を含むフソソームは、前述の実施例で説明したように生成され得る。フソソームは、フソソームを受容する一連のレシピエント細胞がマクロピノサイトーシスの阻害剤である５－（Ｎ－エチル－Ｎ－イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ）（２５μＭ）で処理したことを除いて、前述の実施例に従ってマクロピノサイトーシスを介したＣｒｅの送達についてアッセイされる。マクロピノサイトーシスを介して送達されたフソソームＣｒｅの値を計算するために、ＥＰＩＡの非存在（ＦｕｓＬ－ＥＩＰＡ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルと同様に、ＥＩＰＡの存在（ＦｕｓＬ＋ＥＰＩＡ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルが決定される。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値は、前述の実施例で説明したように計算され得る。
この実施例はまた、アクチン媒介性経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソーム送達についても説明する。微小胞を含むフソソームは、前述の実施例で説明したように生成され得る。フソソームは、フソソームを受容する一連のレシピエント細胞がアクチン重合の阻害剤であるラトランクリンＢ（６μＭ）で処理したことを除いて、前述の実施例に従ってマクロピノサイトーシスを介したＣｒｅの送達についてアッセイされる。アクチン媒介経路を介して送達されたフソソームＣｒｅの値を計算するために、ラトランクリンＢの非存在（ＦｕｓＬ－ＬａｔＢ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルと同様に、ラトランクリンＢの存在（ＦｕｓＬ＋ＬａｔＢ）下でのフソソームＣｒｅ送達のレベルが決定される。送達されたフソソームＣｒｅの正規化された値は、前述の実施例で説明したように計算され得る。
実施例９３：オルガネラの送達
この実施例は、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態において、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのフソソームミトコンドリアカーゴの送達をもたらし得る。
本明細書に記載の方法により記載された方法により生成されたフソソームを、以下のように、レシピエント細胞にそのミトコンドリアを送達する能力についてアッセイした。
この特定の実施例において、フソソームは、ミトコンドリアを標識するミトコンドリア標的ＤｓＲＥＤ（ｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤ）タンパク質と同様に、その膜上にフソゲンタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞であった。レシピエント細胞を、使用した画像システムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートに播種した（この実施例において、細胞を、ガラス底のイメージング皿に播種した）。レシピエント細胞は、細胞質ＧＦＰを安定して発現した。
次いで、レシピエント細胞を播種してから２４時間後に、ｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤを発現し、特定の融合タンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中でレシピエント細胞に適用した。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関した。フソソームを適用した後、細胞プレートを、４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞の接触を開始するのに役立った。次いで、細胞を４時間インキュベートし、ＶＳＶＧ媒介性融合を、ｐＨ６．０のリン酸緩衝生理食塩水への１分間の曝露によって誘導した（または対照細胞を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水に曝露する）。融合の誘導後、細胞を、さらに１６時間インキュベートし、ミトコンドリア送達を、イメージングを介して評価した。
この実施例において、細胞は、３７℃および５％ＣＯ２に維持しながら、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡上に画像化した。ＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザー励起に供し、４９５～５３０ｎｍの帯域通過フィルターを通して発光を記録した。ＤｓＲＥＤを、５４３ｎｍのレーザー励起に供し、５６０～６１０ｎｍの帯域通過フィルターを通して発光を記録した。細胞をスキャンして、細胞質ＧＦＰ蛍光およびｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤ蛍光が陽性の細胞を明確に特定した。
細胞質ＧＦＰおよびｍｉｔｏ－ＤｓＲＥＤミトコンドリアの両方の存在が、同じ細胞中で見出され、細胞がＶＳＶＧ媒介性融合を受けているため、ミトコンドリアがフソソームからレシピエント細胞に送達されたことを示す。
実施例９４：ＤＮＡのインビトロ送達
この実施例は、インビトロでのフソソームを使用した細胞へのＤＮＡの送達について説明する。この実施例は、外因性遺伝子をコードするプラスミド、ＧＦＰ、代替治療用カーゴを使用して、フソソームがＤＮＡを送達する能力を定量化する。
フソソームがＣｒｅのオープンリーディングフレームとインフレームであるように操作されていることを除いて、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成された細胞由来の小胞または細胞由来の細胞生物学から生じる、フソソーム組成物。フソソームの生成後、ＧＦＰをコードする配列を有するプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）でさらにヌクレオフェクションされる。
例えば、Ｃｈｅｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｉｓ．２０１５ Ｍａｒ；２（１）：９６－ １０５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｇｅｎｄｉｓ．２０１４．１２．００１を参照のこと。
陰性対照として、フソソームは、ベータアクチンをコードする配列を有するプラスミドでヌクレオフェクションされる。
次いで、十分な数のフソソームを、２０％ウシ胎児血清および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、ｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有するレシピエントＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞株とともに、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。４８時間のインキュベーション後、５６１ｎｍのレーザー励起でＦＡＣＳサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞をＦＡＣＳを介して単離し、５９０＋／－２０ｎｍで発光を収集する。次いで、ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、全ＤＮＡを単離し、６００ｂｐ断片を増幅するＧＦＰに特異的なプライマー（表１２を参照）を使用して、ＰＣＲを実行する。ゲル電気泳動後にゲル上に存在する６００ｂｐ断片は、レシピエント細胞へのＤＮＡデリバリーの存在を実証し得る。
Figure 2023153260000017
一実施形態において、インビトロでのフソソームを含む核酸カーゴの送達は、陰性対照と比較して、ＧＦＰプラスミドを含むフソソームにおいてより高い。ごくわずかなＧＦＰ蛍光が、陰性対照中で検出される。
実施例９５：ＤＮＡのインビボ送達
この実施例は、フソソームを介したインビボでの細胞へのＤＮＡの送達について説明する。インビボでの細胞へのＤＮＡの送達は、レシピエント細胞内にタンパク質の発現をもたらす。
インビボでのフソソームＤＮＡの送達は、生物（マウス）内のレシピエント細胞におけるＤＮＡおよびタンパク質発現の送達を実証する。
肝臓指向性フソゲンを発現するフソソームは、本明細書に記載されるように調製される。フソソームの生成後、それは、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする配列を有するプラスミドでさらにヌクレオフェクションされる。
フソソームは、インビボ送達用に調製される。フソソーム懸濁液は、遠心分離に供される。フソソームのペレットは、注射用の滅菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁される。
フソソームは、核酸検出法、例えばＰＣＲを使用してＤＮＡを含有することが確認されている。
レシピエントマウスは、ルシフェラーゼの発現を除去するために、フソソームによって送達されたＤＮＡから作製されたＣＲＥタンパク質によって修飾されたｌｏｘｐ－ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を保有する（ＪＡＸ番号００５１２５）。この実施例の陽性対照は、その独自のゲノムから肝臓でのみ同じタンパク質を発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫である（アルブミン－ＣＲＥ ＪＡＸ番号００３５７４）。この交配からの子孫は、各対立遺伝子のうちの１つ（ｌｏｘｐ－ルシフェラーゼ、アルブミン－ＣＲＥ）を保有する。陰性対照は、フソゲンを発現しないフソソームまたはフソゲンを含むが、Ｃｒｅ ＤＮＡを含まないフソソームでレシピエントマウスを注射することによって実施される。
フソソームは、静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によってマウスに送達される。マウスを、市販のマウス拘束具（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に入れる。拘束する前に、動物は、循環水浴にケージを乗せて温める。拘束具の中に入ると、動物は順応させることができる。３０Ｇ針の先端、３インチの長さのＰＥ－１０チューブ、２８Ｇ針で構成されるＩＶカテーテルを準備し、ヘパリン添加生理食塩水で洗い流す。尾は７０％のアルコール準備パッドできれいにする。次いで、カテーテルの針を鉗子で保持し、血液がチューブ内で見えるようになるまで外側尾静脈にゆっくりと導入する。フソソーム溶液（約５００Ｋ～５Ｍフソソーム）を、１ｃｃのツベルクリンシリンジに吸引し、注入ポンプに接続する。フソソーム溶液は、用量に応じて３０秒～５分間、毎分２０ｕＬの速度で送達される。注入が完了すると、カテーテルを取り除き、出血が止まるまで注射部位に圧力を加える。マウスをケージに戻し、回復させる。
融合後、ＤＮＡは転写され、ＣＲＥタンパク質に翻訳され、核に移行して組換えを行い、ルシフェラーゼの構成的発現をもたらす。Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により、生物発光の生成を介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になる。動物を、動物の動きを防ぐためにコーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（パーキンエルマー）に配置する。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態的クリアランスによる生物発光の最大値を観察するために、注入後８～２０分間に光子収集が行われる。肝臓の特定の領域をソフトウェアで作成し、収集露光時間は、計数率が（この領域内で）６００を超えて、解釈可能な放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）の測定値を得るように設定する。生物発光輝度の最大値は、生物発光分布の画像として記録される。肝臓組織は、バックグラウンドを上回る放射輝度測定（未処理動物）および陰性対照の放射輝度測定のために特にモニタリングされる。ルシフェラーゼ活性を観察するために、注射から２４時間後に測定が行われる。次いで、マウスを殺処分し、肝臓を収集する。
収集したばかりの組織を、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に４℃で１～３時間浸漬し、固定および包埋する。次いで、組織を、４℃で滅菌１５％スクロース／１×ＰＢＳに浸漬する（３時間から一晩）。次いで、組織を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｂａｘｔｅｒ番号Ｍ７１４８－４）に包埋する。組織を、セクショニング（断面）に適したブロック内に配置する。次いで、次の方法を使用して、組織を、液体窒素で凍結する：ブロックの下部３分の１を液体窒素に入れ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．の中心を除くすべてが凍結するまで凍結させ、ドライアイスで凍結させる。ブロックを、スライド上に置いた５～７ミクロンの切片にクライオスタットで切片化し、染色のために再凍結する。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、（標準的な方法を使用して）ジゴキシゲニン標識核酸プローブ（ＣＲＥ ＤＮＡおよびルシフェラーゼｍＲＮＡ検出用）を使用して組織切片で実行され、抗ジゴキシゲニン蛍光抗体によって標識され、共焦点顕微鏡によって観察される。
実施形態において、陽性対照動物（フソソーム注射なしの繁殖を介した組換え）は、未処理動物（ＣＲＥおよびフソソームなし）および陰性対照と比較して、肝臓で生物発光強度を示し、一方、薬剤を注射した動物は、陰性対照（フソゲンを含まないフソソーム）および未処理の動物と比較して、肝臓で生物発光を示す。
実施形態において、薬剤を注射した動物の組織切片における核酸の検出は、組織中の細胞における陰性対照および未処理動物と比較して、ＣＲＥリコンビナーゼおよびルシフェラーゼｍＲＮＡの検出を示し、一方、陽性対照は、組織全体にわたってルシフェラーゼｍＲＮＡおよびＣＲＥリコンビナーゼＤＮＡの両方のレベルを示す。
フソソームによるＤＮＡ送達の証拠は、ＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションベースの検出および動物のレシピエント組織におけるその共局在化によって検出される。ＤＮＡから発現したタンパク質の活性は、生物発光イメージングによって検出される。実施形態において、フソソームは、タンパク質の生成および活性をもたらすＤＮＡを送達する。
実施例９６：ｍＲＮＡのインビトロ送達
この実施例は、インビトロでの細胞とのフソソーム融合について説明する。一実施形態において、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞に対して特定のｍＲＮＡの送達をもたらす。
本明細書に記載の方法により記載された方法により生成されたフソソームを、以下のように、レシピエント細胞に特定のｍＲＮＡを送達する能力についてアッセイした。この特定の実施例において、フソソームは、ＣｒｅおよびＧＦＰを発現する３Ｔ３マウス線維芽細胞から生成された細胞生物（核を欠いている）であった。次いで、細胞生物を、ＨＶＪ－Ｅフソゲンタンパク質で処理して、フソソームを生成した。
レシピエントマウスマクロファージ細胞を、使用した画像システムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートに播種した（この実施例において、細胞を、ガラス底のイメージング皿に播種した）。レシピエント細胞は、ＣＭＶプロモーターの下で「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを安定的に発現し、Ｃｒｅによる組換え時にｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導し、レシピエント細胞へのＣｒｅタンパク質の送達を示す。
次いで、レシピエント細胞を播種してから２４時間後に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中でレシピエント細胞に適用した。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関した。フソソームを適用した後、細胞プレートを、４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞の接触を開始するのに役立った。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、ｍＲＮＡ送達をイメージングにより評価した。
細胞を、イメージング前に１０分間、ＤＭＥＭ培地中の１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ
３３３４２で染色した。この実施例において、細胞は、３７℃および５％ＣＯ２に維持しながら、６３倍の油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡上に画像化した。Ｈｏｅｃｈｓｔを、４０５ｎｍのレーザー励起に供し、４３０～４６０ｎｍの帯域通過フィルターを通して発光を記録した。ＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザー励起に供し、４９５～５３０ｎｍの帯域通過フィルターを通して発光を記録した。ｔｄＴｏｍａｔｏを、５４３ｎｍのレーザー励起に供し、５６０～６１０ｎｍの帯域通過フィルターを通して発光を記録した。
まず、細胞をスキャンして、単核のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を明確に特定した。ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の存在は、融合を受けた細胞を示し、単一の核は、融合が細胞生物学的フソソームドナーによるものであることを示した。これらの特定した細胞を、まず、画像化し、次いで、４８８ｎｍのレーザーを使用してＧＦＰ蛍光を部分的に消光するために光退色した。次いで、ＧＦＰ蛍光の回復を評価するために、細胞を経時的にイメージングし、新しいＧＦＰタンパク質の翻訳を示し、ドナーフソソームによって送達されたＧＦＰ ｍＲＮＡの存在を示し得る。
対象となる細胞のＨｏｅｃｈｓｔ、ＧＦＰ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の分析は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を実施する（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）。まず、画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。光退色した細胞内で、ＧＦＰ蛍光を閾値処理して、バックグラウンドを除去した。次いで、光退色細胞のＧＦＰ平均蛍光強度を、光退色の前後の異なる時点で分析した。
この特定の実施例では、ＣｒｅおよびＧＦＰを発現し、適用したフソゲンＨＶＪ－Ｅ（＋フソゲン）のいずれかを有する３Ｔ３マウス線維芽細胞の細胞生物を、「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを発現するレシピエントマウスマクロファージ細胞に適用した。代表的な画像およびデータを、図５に示す。この特定の実施例では、ＧＦＰ蛍光強度は、光退色から１０時間後に、元の強度の２５％まで回復し、レシピエント細胞において能動的に翻訳されたｍＲＮＡの送達を示した。
実施例９７：ｓｉＲＮＡのインビトロ送達
この実施例は、フソソームを介したインビトロでの細胞への短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達について説明する。インビトロでの細胞へのｓｉＲＮＡの送達は、レシピエント細胞内にタンパク質の発現の抑制をもたらす。これは、発現が細胞にとって有害であるタンパク質の活性を阻害するために使用することができ、それにより細胞が正常に挙動することを可能にする。
本明細書に記載の方法により記載された方法により生成されたフソソームを、以下のように、レシピエント細胞に特定のｓｉＲＮＡを送達する能力についてアッセイする。フソソームは、本明細書に記載されるように調製される。フソソームの生成後、それは、ＧＦＰを特異的に阻害する配列を有するｓｉＲＮＡでさらにエレクトロポレーションする。ＧＦＰを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの配列は、５’ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＵＵＣ３’およびその相補体３’ＣＧＣＵＧＣＡＵＵＵＧＣＣＧＧＵＧＵＵＣＡ５’である（ｓｉＲＮＡ配列の３’末端には２塩基対長のオーバーハングがあることに留意する）。陰性対照として、フソソームを、ルシフェラーゼを特異的に阻害する配列を有するｓｉＲＮＡでエレクトロポレーションする。ルシフェラーゼを標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡの配列は、５’ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ３’およびその相補体３’ＴＴＧＡＡＵＧＣＧＡＣＵＣＡＵＧＡＡＧＣＵ５’である（ｓｉＲＮＡ配列の３’末端に２塩基対長のオーバーハングがあることに留意する）。
次いで、フソソームを、ＧＦＰを構成的に発現するレシピエント細胞に適用する。レシピエント細胞を、黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種する。次いで、レシピエント細胞を播種してから２４時間後に、発現しているフソソームを、ＤＭＥＭ培地中でレシピエント細胞に適用する。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関する。フソソームを適用した後、細胞プレートを、４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞の接触を開始するのに役立つ。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、薬剤送達であるｓｉＲＮＡを、イメージングを介して評価する。
細胞を画像化して、フィールドまたはウェル内のＧＦＰ陽性細胞を明確に特定する。この実施例において、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化する。所定のウェル中の総細胞集団は、まず、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定される。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を、通常のＤＭＥＭ培地に交換する。
Ｈｏｅｃｈｓｔは、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化される。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化される。異なる細胞群の画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、いかなるフソソームでも処理されなかったレシピエント細胞上のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られる。
取得設定は、ＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定される。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化される。
ＧＦＰ陽性ウェルの分析は、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアまたは他のソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）で実施される。画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理される。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定される。バックグラウンド強度を大幅に上回るＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞は、閾値処理され、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外される。
総細胞マスク内で、ＧＦＰ陽性細胞は、バックグラウンドを大幅に上回る細胞の閾値を再度設定し、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰ細胞蛍光全体を含めることによって特定される。全細胞のうちＧＦＰ陽性細胞の割合が、計算される。
実施形態において、ＧＦＰに対してｓｉＲＮＡを含有するフソソームで処理したウェル中のＧＦＰ陽性細胞の割合は、ルシフェラーゼに対してｓｉＲＮＡを含有するフソソームで処理したウェル中のＧＦＰ陽性細胞の割合よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％未満である。
実施例９８：ｍＲＮＡのインビボ送達
この実施例は、フソソームを介したインビボでの細胞へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達について説明する。一実施形態において、インビボでの細胞へのｍＲＮＡの送達は、レシピエント細胞内にタンパク質の発現をもたらす。一実施形態において、この送達方法を使用して、遺伝子突然変異のために存在しないタンパク質を補充し、細胞が正常に挙動することを可能にするか、または細胞の活性を再指向して機能、例えば治療機能を実行することができる。
一実施形態において、インビボでのフソソームｍＲＮＡ送達は、生物（例えば、マウス）内のレシピエント細胞におけるメッセンジャーＲＮＡおよびタンパク質発現の送達を実証する。
一実施形態において、肝臓指向性フソゲンを発現し、Ｃｒｅを発現するｍＲＮＡを生成するフソソームは、インビボ送達のために調製される。
フソソームは、本明細書に記載されるように調製される。フソソーム懸濁液は、遠心分離に供される。フソソームのペレットは、注射用の滅菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁される。
フソソームは、核酸検出法、例えばＰＣＲを使用してｍＲＮＡを発現することが確認されている。
レシピエントマウスは、ルシフェラーゼの発現を除去するために、フソソームによって送達されたｍＲＮＡから作製されたＣＲＥタンパク質によって修飾されたｌｏｘｐ－ルシフェラーゼゲノムＤＮＡ遺伝子座を保有する（ＪＡＸ番号００５１２５）。この実施例の陽性対照は、その独自のゲノムから肝臓でのみ同じタンパク質を発現するマウス系統と交配したレシピエントマウスの子孫である（アルブミン－ＣＲＥ ＪＡＸ番号００３５７４）。この交配からの子孫は、各対立遺伝子のうちの１つ（ｌｏｘｐ－ルシフェラーゼ、アルブミン－ＣＲＥ）を保有する。陰性対照は、フソゲンを発現しないフソソームまたはフソゲンを含むが、Ｃｒｅ ｍＲＮＡを含まないフソソームでレシピエントマウスを注射することによって実施される。
フソソームは、静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によってマウスに送達される。マウスを、市販のマウス拘束具（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に入れる。拘束する前に、動物は、循環水浴にケージを乗せて温める。拘束具の中に入ると、動物は順応させることができる。３０Ｇ針の先端、３インチの長さのＰＥ－１０チューブ、２８Ｇ針で構成されるＩＶカテーテルを準備し、ヘパリン添加生理食塩水で洗い流す。尾は７０％のアルコール準備パッドできれいにする。次いで、カテーテルの針を鉗子で保持し、血液がチューブ内で見えるようになるまで外側尾静脈にゆっくりと導入する。フソソーム溶液（約５００Ｋ～５Ｍフソソーム）を、１ｃｃのツベルクリンシリンジに吸引し、注入ポンプに接続する。フソソーム溶液は、用量に応じて３０秒～５分間、毎分２０ｕＬの速度で送達される。注入が完了すると、カテーテルを取り除き、出血が止まるまで注射部位に圧力を加える。マウスをケージに戻し、回復させる。
融合後、ｍＲＮＡは、レシピエント細胞質においてＣＲＥタンパク質に翻訳され、核に移行して組換えを行い、ルシフェラーゼの構成的発現をもたらす。Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により、生物発光の生成を介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になる。動物を、動物の動きを防ぐためにコーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（パーキンエルマー）に配置する。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態的クリアランスによる生物発光の最大値を観察するために、注入後８～２０分間に光子収集が行われる。肝臓の特定の領域をソフトウェアで作成し、収集露光時間は、計数率が（この領域内で）６００を超えて、解釈可能な放射輝度（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）の測定値を得るように設定する。生物発光輝度の最大値は、生物発光分布の画像として記録される。肝臓組織は、バックグラウンドを上回る放射輝度測定（未処理動物）および陰性対照の放射輝度測定のために特にモニタリングされる。ルシフェラーゼ活性を観察するために、注射から２４時間後に測定が行われる。次いで、マウスを殺処分し、肝臓を収集する。
収集したばかりの組織を、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に４℃で１～３時間浸漬し、固定および包埋する。次いで、組織を、４℃で滅菌１５％スクロース／１×ＰＢＳに浸漬する（３時間から一晩）。次いで、組織を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（Ｂａｘｔｅｒ番号Ｍ７１４８－４）に包埋する。組織を、セクショニング（断面）に適したブロック内に配置する。次いで、次の方法を使用して、組織を、液体窒素で凍結する：ブロックの下部３分の１を液体窒素に入れ、Ｏ．Ｃ．Ｔ．の中心を除くすべてが凍結するまで凍結させ、ドライアイスで凍結させる。ブロックを、スライド上に置いた５～７ミクロンの切片にクライオスタットで切片化し、染色のために再凍結する。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、（標準的な方法を使用して）ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブ（ＣＲＥ ｍＲＮＡおよびルシフェラーゼｍＲＮＡ検出用）を使用して組織切片で実行され、抗ジゴキシゲニン蛍光抗体によって標識され、共焦点顕微鏡によって観察される。
一実施形態において、陽性対照動物（例えば、フソソーム注射なしの繁殖を介した組換え）は、未処理動物（例えば、ＣＲＥおよびフソソームなし）ならびに陰性対照と比較して、肝臓で生物発光強度を示す。一実施形態において、フソソームを注射した動物は、陰性対照（例えば、フソゲンを含まないフソソーム）および未処理動物と比較して、肝臓で生物発光を示す。
実施形態において、フソソーム投与した動物の組織切片におけるｍＲＮＡの検出は、組織中の細胞における陰性対照および未処理動物と比較して、ＣＲＥリコンビナーゼおよびルシフェラーゼｍＲＮＡの検出を示す。一実施形態において、陽性対照は、組織全体にわたってルシフェラーゼｍＲＮＡおよびＣＲＥリコンビナーゼｍＲＮＡの両方のレベルを示す。
一実施形態において、フソソームによるｍＲＮＡ送達の証拠は、ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションベースの検出および動物のレシピエント組織におけるその共局在化によって検出される。一実施形態において、フソソームによって送達されたｍＲＮＡから発現したタンパク質の活性は、生物発光イメージングによって検出される。一実施形態において、フソソームは、タンパク質の生成および活性をもたらすｍＲＮＡを送達する。
実施例９９：タンパク質のインビトロ送達
この実施例は、インビトロでの細胞とのフソソーム融合を実証する。この実施例において、インビトロでの細胞とのフソソーム融合は、レシピエント細胞へのＣｒｅタンパク質の送達をもたらす。
この実施例は、フソソームは、センダイウイルスＨＶＪ－Ｅタンパク質を発現する３Ｔ３マウス線維芽細胞から生成された（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４），１－８．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．１２）。さらに、フソソームは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現した。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定的に発現する一次ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であり、Ｃｒｅによる組換え時に、ＧＦＰ発現からＲＦＰ発現に切り替わり、マーカーとして、融合およびＣｒｅの送達を示した。
本明細書に記載の方法により生成されたフソソームを、以下のように、レシピエント細胞にＣｒｅタンパク質を送達する能力についてアッセイした。レシピエント細胞を、使用した画像システムと互換性のある細胞培養マルチウェルプレートに播種した（この実施例において、細胞を、黒色の透明底の９６ウェルプレートに播種した）。次いで、レシピエント細胞を播種してから２４時間後に、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現し、特定のフソゲンタンパク質を保有するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中でレシピエント細胞に適用した。フソソームの用量は、ウェルに播種したレシピエント細胞の数と相関した。フソソームを適用した後、細胞プレートを、４００ｇで５分間遠心分離して、フソソームとレシピエント細胞の接触を開始するのに役立った。次いで、細胞を１６時間インキュベートし、タンパク質送達をイメージングにより評価した。
これらの細胞を画像化して、フィールドまたはウェル内のＧＦＰ陽性細胞に対してＲＦＰ陽性細胞を明確に特定した。この実施例において、自動顕微鏡を使用して細胞プレートを画像化した。所定のウェル中の総細胞集団は、まず、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定された。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用される。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を、通常のＤＭＥＭ培地に交換した。Ｈｏｅｃｈｓｔは、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化された。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、一方、ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。異なる細胞群の画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理された細胞上のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。取得設定は、ＲＦＰおよびＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。
Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＧＦＰ、およびＲＦＰ陽性ウェルの分析は、ＬｉｏｎＨｅａｒｔ ＦＸに付属のＧｅｎ５ソフトウェアまたはＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｒａｓｂａｎｄ，Ｗ．Ｓ．，ＩｍａｇｅＪ，Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／，１９９７－２００７）で実施された。まず、画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。次いで、総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞は、閾値処理され、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。総細胞マスク内で、ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞は、バックグラウンドを大幅に上回る細胞の閾値を再度設定し、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＧＦＰおよびＲＦＰ細胞蛍光全体を含めることによって特定された。
レシピエント細胞のみを含む対照ウェルで特定されたＲＦＰ陽性細胞の数は、フソソームを含むウェル内のＲＦＰ陽性細胞の数から減算するため（非特異的Ｌｏｘｐ組換えを減算するため）に使用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（薬剤を受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞（薬剤を受容していないレシピエント細胞）およびＲＦＰ陽性細胞の合計で除算して、レシピエント細胞集団に送達されたフソソーム薬剤の画分を定量化する。
この特定の実施例では、Ｃｒｅを発現し、適用したフソゲンＨＶＪ－Ｅ（＋フソゲン）を有するかまたは有しない（－フソゲン）のいずれかを有する３Ｔ３マウス線維芽細胞を、「ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ」カセットを発現するレシピエント２９３Ｔ細胞に適用した。Ｃｒｅタンパク質の送達は、レシピエント細胞におけるＲＦＰ発現の誘導により評価される。図６のグラフは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性に染色された全細胞（各ペアの最左のバー）のうち、ＲＦＰ陽性細胞（各ペアの最右のバー）の定量化を示す。この特定の実施例について、レシピエント細胞へのフソソーム送達の画分は、ＨＶＪ－Ｅフソゲンを有する３Ｔ３ Ｃｒｅ細胞について０．４４である。
実施例１００：タンパク質のインビボ送達
この実施例は、フソソームによる眼への治療剤の送達について説明する。
フソソームは、前述の実施例で説明した方法のうちのいずれかを使用して、造血幹細胞および前駆細胞に由来し、マウスノックアウトが欠けているタンパク質をローディングする。
フソソームを、タンパク質を欠いているマウスの右眼に網膜下に注射し、ビヒクル対照を、マウスの左眼に注射する。マウスのサブセットは、２月齢に達すると殺処分される。
収集した網膜組織の組織学およびＨ＆Ｅ染色を行って、マウスの各網膜で救助された細胞の数を計数する（Ｓａｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２６（８）：３１０４－３１１６，２０１６に記載）。
注射したタンパク質のレベルは、ＰＤＥ６Ｂタンパク質に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットを介して、２月齢で殺処分したマウスから収集した網膜で測定される。
一実施形態において、フソソームを投与したマウスの左眼は、ビヒクルで処置したマウスの右眼と比較して、網膜の外側核レベルに存在する核の数が増加する。増加したタンパク質は、変異ＰＢＥ６Ｂタンパク質の相補性を示唆する。
実施例１０１：レシピエントＤＮＡを編集するための送達
この実施例は、インビトロでの細胞へのゲノムＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集機構の送達のためのフソソームについて説明する。一実施形態において、フソソームを介したインビトロでの細胞へのゲノムＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集機構の送達は、レシピエント細胞内で特定のタンパク質の機能の喪失をもたらす。この実施例において参照されるゲノム編集機構は、ＧＦＰに特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質である。
一実施形態において、フソソームは、治療剤の送達のための筐体である。一実施形態において、高い特異性および効率で細胞に送達することができるゲノム編集機構などの治療剤を使用して、遺伝子、ひいては高レベルまたは誤った細胞型で発現した場合に病的になる、その後の遺伝子産物（例えばタンパク質）を不活性化することができる。
フソソームがＡ．Ｖｉｃｔｏｒｉａ ＥＧＦＰの配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列と複合化したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質も含むように操作されていることを除いて、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成された、フソソーム組成物。これは、Ｐ２Ａ切断配列によって分離されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９のオープンリーディングフレームとのインフレーム融合であるネオマイシン耐性遺伝子のオープンリーディングフレームを有するＰｉｇｇｙＢａｃベクターを同時ヌクレオフェクションすることによって達成される。さらなる同時ヌクレオフェクションしたＰｉｇｇｙＢａｃベクターには、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ配列（ＧＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣ）も含まれる。陰性対照として、フソソームは、マウスゲノムのいずれの標的にも特異的ではないスクランブルｇＲＮＡ（ＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡ）配列と複合化したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質を含むように操作されている。
十分な数のフソソームを、２０％ウシ胎児血清および１倍のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で、ＮＩＨ／３Ｔ３ ＧＦＰ＋細胞とともに、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。４８時間のインキュベーション後、ゲノムＤＮＡを調製し、ＧＦＰ遺伝子の予測したｇＲＮＡ切断部位から５００ｂｐ以内の領域に特異的なプライマーとともにテンプレートとして使用する（表１３を参照のこと）。
Figure 2023153260000018
次いで、ＰＣＲアンプリコンを精製し、キャピラリシークエンシングによって配列決定し、ガイドＲＮＡによって決定されるウェブツールであるＴｉｄｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒにアップロードする。２つの標準的なキャピラリシークエンシング反応からの定量的配列トレースデータに基づいて、ソフトウェアは、編集の有効性を定量化する。ＧＦＰ遺伝子座を有する予測されたｇＲＮＡ切断部位でのインデル（挿入または欠失）は、細胞内のＧＦＰ発現の喪失をもたらし、４８８ｎｍの励起アルゴンレーザーでＦＡＣＳ分析を使用して、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で定量化され、５３０＋／－３０ｎｍで発光を収集する。ＦＡＣＳソフトウェアは、取得および分析のために使用される。光散乱チャネルは、線形利得に設定され、蛍光チャネルは、対数尺度で設定され、最低１０，０００個の細胞が各条件で分析される。ＧＦＰ機能のインデルおよびその後の喪失は、各試料のＧＦＰシグナルの強度に基づいて計算される。
一実施形態において、陰性対照と比較して、細胞内のＧＦＰ遺伝子座およびＧＦＰ蛍光の喪失を伴う予測されたｇＲＮＡ切断部位でのインデル（挿入または欠失）は、ＤＮＡを編集するフソソームの能力を示し、インビトロでのタンパク質機能の喪失をもたらす。一実施形態において、スクランブルｇＲＮＡ配列を有するフソソームは、インデルもタンパク質機能のその後の喪失も示さないであろう。
実施例１０２：フソソーム投与後の奇形腫の形成の評価
この実施例は、フソソームによる奇形腫の形成の欠如について説明する。一実施形態において、フソソームは、対象に投与されたときに奇形腫の形成をもたらさないであろう。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって生成される。フソソーム、腫瘍細胞（陽性対照）、またはビヒクル（陰性対照）を、マウス（１２～２０週齢）の左脇腹にＰＢＳで皮下注射する。奇形腫、例えば腫瘍の成長は、フソソーム、腫瘍細胞、またはビヒクル注射後の８週間のキャリパー測定による腫瘍体積の決定により、週に２～３回分析される。
一実施形態において、フソソームまたはビヒクルを投与されたマウスは、キャリパー測定を介して、測定可能な腫瘍形成、例えば奇形腫を有さないであろう。一実施形態において、腫瘍細胞で処置された陽性対照動物は、８週間の観察にわたってキャリパーによって測定される、かなりの腫瘍、例えば奇形腫の大きさを実証するであろう。
実施例１０３：フソソームは、インビボで対象のレシピエント細胞に活性タンパク質を送達する
この実施例は、フソソームがインビボで対象にタンパク質を送達することができることを実証する。これは、核編集タンパク質Ｃｒｅの送達によって例示される。細胞内に入ると、Ｃｒｅは核に移行し、２つのＬｏｘＰ部位の間でＤＮＡを再結合および切除する。２つのＬｏｘＰ部位間のＤＮＡが停止コドンであり、赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏなどの遠位蛍光タンパク質の上流にある場合、Ｃｒｅを媒介した組換えを顕微鏡で測定することができる。
Ｔａｋａｒａ（Ｃｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｇｅｓｉｃｌｅｓ、Ｔａｋａｒａ製品６３１４４９）から購入したＣＲＥおよびフソゲンＶＳＶ－Ｇを含むフソソームを、Ｂ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ９（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ系統００７９０９）に注射した。表１４に記載されるように、動物に、解剖学的部位、注射量、および注射部位で注射した。ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ／Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ系統００５１２５）を有さず、フソソームを注射したマウスおよびフソソームを注射しなかったＢ６．Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ －ｔｄＴｏｍａｔｏ）／Ｊマウスを、陰性対照として使用した。
Figure 2023153260000019
注射から２日後、動物を殺処分し、試料を収集した。試料を、２％ＰＦＡで８時間固定し、３０％スクロースで一晩固定し、ＯＣＴへの即時包埋およびスライドへのセクショニングのために出荷した。スライドは、ＤＡＰＩを用いて核を染色した。ＤＡＰＩおよびｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を、顕微鏡で画像化した。
表１４に列挙されているすべての解剖学的部位は、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を示した（図９）。さらに、ｔｄＴｏｍａｔｏのために蛍光顕微鏡を使用して、筋肉組織への送達を確認した（図１１）。陰性対照マウスは、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を有するいかなる組織も有さなかった。この結果は、フソソームが様々な解剖学的部位のマウスの細胞でｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光をオンにできることと、マウスがフソソームで処理されていない場合、またはマウスがそれらのゲノムにｔｄＴｏｍａｔｏを有さない場合、これが発生しないことと、を示す。したがって、フソソームは、インビボでマウス細胞の核に、活性なＣｒｅリコンビナーゼを送達する。
異なる投与経路により、インビボで組織にフソソームを送達送達することができることも示された。Ｔａｋａｒａ（Ｃｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｇｅｓｉｃｌｅｓ、Ｔａｋａｒａ製品６３１４４９）から購入したＣＲＥおよびフソゲンＶＳＶ－Ｇを含むフソソームを、ＦＶＢ．１２９Ｓ６（Ｂ６）－ＧＴ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（Ｌｕｃ）Ｋａｅｌ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ系統００５１２５）に筋肉注射で（右前脛骨筋に５０ｕｌ）、腹腔内で（腹膜腔に５０ｕｌ）、および皮下に（背面皮膚下で５０ｕｌ）注射した。
脚、腹側、および背面皮膚を、４５秒間化学脱毛剤を使用して領域を脱毛し、続いて、水で３回すすぐことによって、それぞれ、筋肉内、腹腔内、および皮下注射用に調製した。
注射後３日目に、インビボ画像システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、生物発光の動物全体の画像を取得した。画像化する５分前に、ルシフェラーゼを視覚化するために、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇの用量で生物発光基質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を腹腔内注射した。画像システムは、すべてのデバイス設定を補正するために較正された。
３つすべての経路による投与は、インビボでのマウス細胞への活性Ｃｒｅリコンビナーゼの成功した送達を示す発光をもたらした（図１０）。
結論として、フソソームは、インビボで対象の細胞に活性なタンパク質を送達することができる。
実施例１０４：フソソームにおける核酸の超音波処理を媒介したローディング
この実施例は、超音波処理を介したフソソームへの核酸ペイロードのローディングについて説明する。超音波処理方法は、例えば、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ
ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に開示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。約１０６個のフソソームを、５～２０μｇの核酸と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、フソソーム／核酸の混合物を、４０ｋＨｚで操作した水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理する。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間２回目の超音波処理を行う。次いで、混合物を４℃で５分間、１６，０００ｇで遠心分離して、核酸を含むフソソームをペレット化する。組み込まれていない核酸を含む上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。ＤＮＡをローディングした後、フソソームを、使用前に氷上に保持する。
実施例１０５：フソソームにおける超音波処理を媒介したタンパク質のローディング
この実施例は、超音波処理を介したフソソームへのタンパク質ペイロードのローディングについて説明する。超音波処理方法は、例えば、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に開示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。約１０６個のフソソームを、５～２０μｇのタンパク質と混合し、室温で３０分間インキュベートする。次いで、フソソーム／タンパク質の混合物を、４０ｋＨｚで操作した水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理する。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間２回目の超音波処理を行う。次いで、混合物を４℃で５分間、１６，０００ｇで遠心分離して、タンパク質を含むフソソームをペレット化する。組み込まれていないタンパク質を含む上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁する。タンパク質をローディグした後、フソソームを、使用前に氷上に保持する。
実施例１０６：フソソームにおける核酸の疎水性担体を媒介したローディング
この実施例は、疎水性担体を介したフソソームへの核酸ペイロードのローディングについて説明する。疎水性ローディングの例示的な方法は、例えば、Ｄｉｄｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｉＲＮＡ ｆｏｒ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｍＲＮＡ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（１０）：１８３６－１８４７，（２０１６）に開示されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。ＲＮＡ分子の３’末端は、生物活性疎水性複合体（トリエチレングリコール－コレステロール）にコンジュゲートされる。５００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で９０分間インキュベートすることによって、約１０６個のフソソームを、１ｍｌのＰＢＳ中の１０μｍｏｌ／ｌのｓｉＲＮＡ複合体と混合する。疎水性担体は、ＲＮＡとフソソームの膜との結合を媒介する。いくつかの実施形態において、いくつかのＲＮＡ分子は、フソソームの内腔に組み込まれ、いくつかは、フソソームの表面上に存在する。ＴＬＡ－１１０ローターを使用して、卓上型超遠心機で１００，０００ｇで、４℃で１時間超遠心分離することによって、ＲＮＡをローディングしたフソソームからローディングしていないフソソームを分離する。ローディングしていないフソソームは、上清に残り、ＲＮＡをローディングしたフソソームは、ペレットを形成する。ＲＮＡをローディングしたフソソームを、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、使用前に氷上で保持する。
実施例１０７：フソソームの処理
この実施例は、フソソームの処理について説明する。前述の実施例で説明した方法のうちのいずれかを介して生成されたフソソームは、さらに処理され得る。
いくつかの実施形態において、フソソームは、まず、例えば、超音波処理によって均質化される。例えば、超音波処理プロトコルには、８の振幅設定でマイクロプローブを備えたＭＳＥソニケーターを使用した５秒間の超音波処理が含まれる（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｎ．Ｙ．）。いくつかの実施形態において、この短期間の超音波処理は、フソソームの原形質膜を均一なサイズのフソソームに分解させるのに十分である。これらの条件下では、オルガネラ膜は、破壊されず、遠心分離（３，０００ ｒｐｍ、１５分間４℃）によって除去される。次いで、実施例１６に記載されるように、フソソームを分画遠心法によって精製する。
（例えば、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎから）市販のポリカーボネート膜またはＰａｌｌ Ｅｘｅｃｉａ、Ｆｒａｎｃｅから市販の非対称セラミック膜（例えば、Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ）を通したフソソームの押出は、フソソームサイズを比較的明確なサイズ分布に縮小するための効果的な方法である。典型的には、懸濁液は、所望のフソソームサイズ分布が達成されるまで膜を通して１回以上循環する。フソソームは、連続的により小さい細孔膜（例えば、４００ｎｍ、１００ｎｍ、および／または５０ｎｍの細孔サイズ）を通して押し出され、サイズの漸進的な減少および均一な分布を達成し得る。
いくつかの実施形態において、典型的には、均質化、超音波処理、および／または押出ステップの前に、フソソーム生成の任意のステップで、得られたフソソームが医薬品をカプセル化するように、医薬品（治療剤など）を反応混合物に添加し得る。
実施例１０８：フソソームおよび供給源細胞における総ＲＮＡの測定
この実施例は、供給源細胞と比較した、フソソーム中のＲＮＡの量を定量化するための方法について説明する。一実施形態において、フソソームは、供給源細胞と同様のＲＮＡレベルを有するであろう。このアッセイでは、ＲＮＡレベルは、総ＲＮＡを測定することによって決定される。
フソソームは、前述の実施例で説明された方法のうちのいずれか１つによって調製される。フソソームおよび供給源細胞のタンパク質によって測定されるのと同じ質量の調製物を使用して、総ＲＮＡを単離し（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカタログ番号７４１０４などのキットを使用して）、続いて、ＲＮＡによる吸光度を評価するための標準分光法を使用して、ＲＮＡ濃度を決定する（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して）。
一実施形態において、フソソーム中のＲＮＡの濃度は、タンパク質の質量当たり供給源細胞の濃度の５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％であろう。
実施例１０９．外因性フソゲンを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の作製
この実施例は、外因性フソゲンを発現する組織培養細胞の作製について説明する。フソゲン遺伝子、ＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質）を、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にクローニングした。次いで、ＶＳＶ－Ｇ構築物を、Ｘｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔａｋａｒａ）を使用して、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－３２１６）にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（ＧＩＢＣＯ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ２で、さらなる実験に利用する前の適切な期間培養した。
実施例１１０．タンパク質強化された融合性除核細胞を介したミトコンドリアの送達
細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、ミトコンドリアを標的とするＤｓＲＥＤ蛍光タンパク質（ｍｔＤｓＲＥＤ）を発現することによってタンパク質が強化されたＨｅＬａ細胞を含む融合性除核細胞が生成された。ＶＳＶ－Ｇを発現するＨｅＬａ細胞を、フィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って、除核して、除核細胞を得た（例えば、実施例１に記載のとおり）。レシピエント細胞は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤であるザルシタビンでのＨｅＬａ細胞の長期間（６週間超）の培養によってミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を欠くように生成されたＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞であった。ＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞は、ｍｔＤＮＡが欠損しており（ｑＰＣＲで評価）、ミトコンドリア酸素消費量が著しく不足していることを示す（タツノオトシゴ細胞外フラックスアッセイで測定される）。レシピエントのＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞はまた、２日間アデノウイルス形質導入を介してミトコンドリア標的ＧＦＰ（ｍｔＧＦＰ）を発現するように操作された。
レシピエントＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞を、６ウェル皿に播種し、１時間後に除核したＶＳＶ－Ｇ ＨｅＬａ細胞を、レシピエント細胞に適用した。次いで、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＳＯＲＰ細胞選別機を使用した蛍光支援細胞選別を介して、細胞を二重陽性（融合）細胞用に選別した。ｍｔＧＦＰおよびｍｔＤｓＲＥＤに対して二重陽性の細胞集団を評価して、除核したＶＳＶ－Ｇ ＨｅＬａ細胞からミトコンドリア提供（ｍｔＤｓＲＥＤ）を受けたレシピエントＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞を選別した。 ｍｔＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザーで励起し、５１３±２６ｎｍで、発光を獲得した。ｍｔＤｓＲＥＤを、５４３ｎｍのレーザーで励起し、５７０±２６ｎｍで、発光を獲得した。前方および側方散乱ゲーティングは、まず、細胞サイズの事象を捕捉し、小さな破片を廃棄するために使用した。ｍｔＧＦＰおよびｍｔＤｓＲＥＤに対する二重陽性の事象は、適切に各陰性対照試料が特定の蛍光マーカーに陽性の１％未満の事象を示す（すなわち、未染色および単一のｍｔＧＦＰ陽性試料は、ｍｔＤｓＲＥＤに陽性の１％未満の事象を示す）最小レベルでゲーティングすることによって決定された。次いで、二重陽性の事象、ならびに単一陽性ｍｔＧＦＰ（ミトコンドリア送達のないレシピエント細胞）および単一陽性ｍｔＤｓＲＥＤ（レシピエント細胞に融合しなかったドナー除核ＶＳＶ－Ｇ ＨｅＬａ細胞）の事象を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ培地に選別した。選別した細胞を計数し、９６ウェルタツノオトシゴプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）に１ウェル当たりに２５，０００個の細胞を（各群で６反復で）播種した。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
酸素消費アッセイは、成長培地を除去し、２５ｍＭのグルコースおよび２ｍＭのグルタミン（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含む低緩衝ＤＭＥＭ最小培地と交換し、温度およびｐＨの平衡に達するために３７℃で６０分間インキュベートすることによって開始した。次いで、付着した細胞を直接取り巻く培地中の酸素およびｐＨの細胞外フラックス変化を測定するために、ＸＦ９６細胞外フラックス分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）でマイクロプレートをアッセイした。定常状態の酸素消費量および細胞外酸性化速度を取得した後、ＡＴＰシンターゼを阻害するオリゴマイシン（５μＭ）、およびミトコンドリアを脱共役するプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）を、マイクロプレートの各細胞ウェルに試薬送達チャンバーを通して連続的に注射して、最大酸素消費速度の値を得る。最後に、５μＭのアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を注射して、呼吸の変化が主にミトコンドリア呼吸によるものであることを確認した。基礎非結合（オリゴマイシン耐性）、および最大（ＦＣＣＰ誘発）のミトコンドリア呼吸速度を決定するために、アンチマイシンＡ呼吸速度を他の３つの呼吸速度から減じた。
このアッセイを使用して、ドナーＶＳＶ－Ｇ ＨｅＬａ細胞は、活性な基礎および最大酸素消費速度を示し、一方、送達のない標的細胞は、ミトコンドリアの酸素消費の３つの状態すべての低い速度を示すことが決定された。レシピエントＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞へのタンパク質が増強された除核ＶＳＶ－Ｇ ＨｅＬａ細胞を含むミトコンドリアの送達は、ドナーＶＳＶ－Ｇ ＨｅＬａ細胞速度に近いミトコンドリア酸素消費速度への戻りを示した（図１２）。
実施例１１１：小胞形成および遠心分離によるフソソームの生成および単離
この実施例は、小胞形成および遠心分離を介したフソソームの生成および単離について説明する。これは、フソソームが単離される方法のうちの１つである。フソソームは、以下のように調製された。９．２×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－３２１６）を、１００ｍｍのコラーゲンコーティング皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、Ｘｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１３１７）を使用して、ＶＳＶｇのオープンリーディングフレームを含有する１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド、ならびに７．５ｍＬの完全培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）））中のＳＶ４０核局在化配列を有するバクテリオファージＰ１
Ｃｒｅリコンビナーゼのオープンリーディングフレームを含有する１５ｕｇのｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドで、逆トランスフェクトした。播種から１２時間後、培地を吸引し、１００μＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を添加した１５ｍＬの新鮮な完全培地と慎重に交換した。次いで、トランスフェクションから４８時間後に上清を収集し、遠心分離（２０００ｘｇ、１０分）で清澄化し、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（ＣｅｌｌＴｒｅａｔ）で濾過し、１２０，０００ｘｇで１．５時間超遠心分離した。次いで、ペレット化した材料を、５０％１×ＰＢＳ／５０％完全培地の氷冷混合液に再懸濁し、最大速度で２分間ボルテックスし、さらなる実験に利用するまで－８０℃で凍結した。
実施例１１２：巨大原形質膜フソソームの生成および単離
この実施例は、細胞小胞形成および遠心分離を介したフソソームの生成、ローディング、および単離について説明する。これは、フソソームがカーゴで生成し、単離し、カーゴをローディングする方法のうちの１つである。
フソソームは、以下のように調製された。９．２×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔを、１００ｍｍのコラーゲンコーティング皿に、ポリマートランスフェクション試薬を使用して、ＶＳＶｇのオープンリーディングフレームを含有する１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド、ならびに７．５ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中のＳＶ４０核局在化配列を有するバクテリオファージＰ１ Ｃｒｅリコンビナーゼのオープンリーディングフレームを含有する１５ｕｇのｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドで、逆トランスフェクトした。
カーゴをローディングしたフソソームを生成するために、トランスフェクションから２４時間後に、細胞を洗浄緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２）中で２回、形成緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＰＦＡ、２ｍＭのＤＴＴ、１２５ｍＭのグリシン）中で１回洗浄した。次いで、細胞を、形成緩衝液中で、３７℃で最低６時間インキュベートした。フソソームを含む上清を収集し、２，０００ｘｇで５分間の遠心分離により細胞および細胞破片からフソソームを清澄化した。最後に、フソソームを、１７，０００ｘｇで２０分間の遠心分離により濃縮し、実験用の所望の緩衝液に再懸濁した。フソソームがレシピエント細胞と融合して、それらのカーゴを配達することができるかどうかを試験するために、再懸濁したフソソームを、所望の用量でレシピエント２９３Ｔ ＬｏｘＰグリーン／レッドスイッチレポーター細胞に添加した。小胞の融合およびカーゴの送達を検証するために、レシピエント細胞のＬｏｘＰ組換えを、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して画像化した。視野中のＲＦＰ陽性細胞を明確に特定するために、各ウェル中の総細胞集団は、まず、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定された。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用され得る。染色後、Ｈｏｅｃｈｓｔ培地を、通常のＤＭＥＭ培地に交換し、ＲＦＰ＋細胞を特定した。
Ｈｏｅｃｈｓｔ染色は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化された。ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。異なる細胞群の画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、いかなるフソソームでも処理されなかったレシピエント細胞上のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。取得設定は、ＲＦＰ強度が最大ピクセル強度値であったが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。
ＲＦＰ陽性ウェルの分析は、蛍光顕微鏡に付属のＧｅｎ ５ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ）で実施された。画像は、幅１０μｍ（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２）、幅２０μｍ（ＲＦＰ）のローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。総細胞マスクは、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞に設定された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＨｏｅｃｈｓｔ強度を有する細胞は、閾値処理され、Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。
総細胞マスク内で、ＲＦＰ陽性細胞は、バックグラウンドを大幅に上回る細胞の閾値を再度設定し、細胞領域全体のＨｏｅｃｈｓｔ（核）マスクを拡張して、ＲＦＰ細胞蛍光全体を含めることによって特定された。視野毎の合計のうち、ＲＦＰ陽性細胞の総数を計算した。一実施形態において、フソソーム処理レシピエント細胞は、未処理細胞よりも視野当たりのＲＦＰ＋細胞がより多かった（図１３）。
実施例１１３：押し出しによるフソソームの生成
この実施例は、膜を通して押し出すことによるフソソームの製造について説明する。
ＶＳＶ－ＧおよびＣｒｅリコンビナーゼを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＴｒｙｐｌｅＥでトリプシン処理し、収集し、５００ｘｇで５分間回転させて計数した。続いて、３０×１０６個の細胞を、５００ｎＭのラトランキュリンＢを補充したＤＭＥＭ培地中の１ｍＬの１２．５％フィコールに３７℃で３０分間再懸濁した。細胞を除核するために、それらを、以下のフィコール画分からなる不連続フィコール勾配に移した（上から下へ）：５ｍＬの１２．５％フィコール、６ｍＬの１６％フィコール、１０ｍＬの１８％フィコール。すべてのフィコール勾配画分は、５００ｎＭのラトランキュリンＢを添加したＤＭＥＭ培地中で作製した。勾配を、Ｔｉ－７０ローター付きのＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ－４０超遠心機で、３２，３００ＲＰＭで、３７℃で１時間回転させた。遠心分離後、除核したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２．５％と１６％フィコール層の間の勾配から収集し、ＰＢＳで希釈し、３，０００ｘｇで５分間回転させた。次いで、除核細胞を、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。
簡単に説明すると、押出のために、融合性除核ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＰＢＳ中のビシンコニン酸アッセイによってアッセイされるように、１～５ｍｇ／ｍＬのタンパク質の密度に再懸濁した。細胞を１ｍＬの気密シリンジで吸引し、５μｍ、０．８μｍ、または０．４μｍの膜を１～２０回通過した。濾液を収集し、ｌｏｘＰ：ＧＦＰ／ＲＦＰレポーター構築物を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む９６ウェルプレートに添加した。１６～２４時間後、プレートを画像化し、ＲＦＰの発現について分析した（図１４）。
実施例１１４：細胞から自由に放出される融合性微小胞の単離
この実施例は、細胞から自由に放出される融合性微小胞の単離について説明する。融合性微小胞を、以下のように単離した。９．２×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－３２１６）を、１００ｍｍのコラーゲンコーティング皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、Ｘｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１３１７）を使用して、ＶＳＶｇのオープンリーディングフレームを含有する１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド、ならびに７．５ｍＬの完全培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）））中のＳＶ４０核局在化配列を有するバクテリオファージＰ１ Ｃｒｅリコンビナーゼのオープンリーディングフレームを含有する１５ｕｇのｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドで、逆トランスフェクトした。播種から１２時間後、追加の７．５ｍＬの完全培地を、慎重に添加した。２００ｘｇで１０分間の遠心分離によって、細胞を、培養培地から分離した。上清を収集し、５００ｘｇで１０分間で２回、２，０００ｘｇで１５分間で１回、１０，０００ｘｇで３０分間で１回、および７０，０００ｘｇで６０分間で１回、連続して遠心分離した。自由に放出されたフソソームを、最後の遠心分離ステップでペレット化し、ＰＢＳに再懸濁し、７０，０００ｘｇで再ペレット化した。最終ペレットを、ＰＢＳに再懸濁した。
Ｗｕｂｂｏｌｔｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１０９６３－１０９７２ ２００３も参照のこと。
実施例１１５：フソソームにおける転写活性の欠如
この実施例は、フソソームの生成に使用される親細胞、例えば供給源細胞と比較したフソソームにおける転写活性の定量化について説明する。転写活性は、親細胞、例えば供給源細胞と比較して、フソソームでは低いか、または存在し得ない。
フソソームは、治療剤を送達するための筐体として使用することができる。高効率で細胞または局所組織環境に送達され得るｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および／またはオルガネラなどの治療剤は、通常は、レシピエント組織中で病理学的に低いまたは高いレベルで活性ではない経路または活性のある経路を調節するために使用することができる。フソソームが転写することができない、またはフソソームがそれらの親細胞よりも低い転写活性を有し得るという観察は、核物質の除去が十分に起こったことを実証し得る。
フソソームは、本明細書に記載されるように調製された。対照粒子（非融合フソソーム）を、ｐｃＤＮＡ３．１が空のベクターで一過性に逆トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成した。次いで、フソソームの転写活性を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥＵイメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用することによって、フソソームの生成に使用される、親細胞、例えば供給源細胞と比較した。
簡単に説明すると、６０μＬの標準のＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約３×１０６個のフソソーム、およびフソソームを生成するために使用される１×１０６個の親細胞を、１ｍＭの蛍光標識可能なアルキンヌクレオシドＥＵを含む完全な６ウェルの低付着マルチウェルの１ｍＬの完全培地中に、３７℃、５％ＣＯ２で４時間、３重に播種した。陰性対照のために、３×１０６個のフソソームを、完全培地中でアルキンヌクレオシドＥＵを含まない６ウェル低付着マルチウェルプレートに播種した。４時間のインキュベーション後、製造業者の取扱説明書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、試料を処理した。簡単に説明すると、陰性対照を含む細胞およびフソソーム試料を、下の表に示すように、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、４８８ｎｍの励起アルゴンレーザーおよび５３０＋／－３０ｎｍのフィルター発光を使用してフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって分析する。
フローサイトメーターの設定
Figure 2023153260000020
Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴソフトウェアを、取得およびＦｌｏｗＪｏを使用した分析のために使用した。データ取得のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、５３０＋／－３０ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。細胞またはフソソームゲート内の最小１０，０００の事象が、各条件で収集された。データ分析のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、５３０＋／－３０ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。陰性対照５３０＋／－３０ｎｍの発光を使用して、ゲートが１％未満の陽性を含むようにヒストグラム上にゲートを配置する場所を決定した。上記の分析基準を使用して、フソソームが７０．１７％±７．６０ ＡＦ４８８事象を示した場合に、新規に転写したｍＲＮＡ転写物にＥｕを含めることによる転写活性の代替的測定値として、親細胞は、９９．１７％±０．２０ Ｅｕ：ＡＦ４８８事象を示した（図１４Ｂ）。ＡＦ４８８の蛍光強度の中央値、したがって、Ｅｕの取り込み量についての測定値、したがって、新規に合成されたｍＲＮＡ転写物の数は、親細胞では９８６７±３１２１の事象であり、フソソームでは１８８３±３６６．３の事象であった（図１４Ｂ）。この実施例は、フソソームが親細胞と比較して転写活性がないことを示す。
実施例１１６：ＤＮＡ複製または複製活性の欠如
この実施例は、フソソームの生成に使用される親細胞、例えば供給源細胞と比較したフソソームにおけるＤＮＡ複製の定量化について説明する。ＤＮＡ複製活性は、親細胞、例えば供給源細胞と比較して、フソソームでは低いか、または存在し得ない。
フソソームは、治療剤を送達するための筐体として使用することができる。高効率で細胞または局所組織環境に送達され得るｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、および／またはオルガネラなどの治療剤は、通常は、レシピエント組織中で病理学的に低いまたは高いレベルで活性ではない経路または活性のある経路を調節するために使用することができる。フソソームがＤＮＡ複製をすることができない、またはフソソームがそれらの親細胞よりも低いＤＮＡ複製活性を有し得るという観察は、核物質の除去が十分に起こったことを実証し得る。
フソソームは、本明細書に記載されるように調製された。対照粒子（非融合フソソーム）を、ｐｃＤＮＡ３．１が空のベクターで一過性に逆トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成した。次いで、フソソームの翻訳活性を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵイメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用することによって、フソソームの生成に使用される、親細胞、例えば供給源細胞と比較した。
簡単に説明すると、６０μＬの標準のＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約３×１０６個のフソソーム、およびフソソームを生成するために使用される１×１０６個の親細胞を、１ｍＭの蛍光標識可能なアルキンヌクレオシドＥｄＵを含む完全な６ウェルの低付着マルチウェルの１ｍＬの完全培地中に、３７℃、５％ＣＯ２で４時間、３重に播種した。陰性対照のために、３×１０６個のフソソームを、完全培地中でアルキンヌクレオシドＥｄＵを含まない６ウェル低付着マルチウェルプレートに播種した。４時間のインキュベーション後、製造業者の取扱説明書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、試料を処理した。簡単に説明すると、陰性対照を含む細胞およびフソソーム試料を、下の表に示すように、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、６３８ｎｍの励起アルゴンレーザーおよび６７０＋／－１４ｎｍのフィルター発光を使用してフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって分析する。
フローサイトメーターの設定
Figure 2023153260000021
Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴソフトウェアを、取得およびＦｌｏｗＪｏを使用した分析のために使用した。データ取得のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、６７０＋／－１４ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。細胞またはフソソームゲート内の最小１０，０００の事象が、各条件で収集された。データ分析のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、６７０＋／－１４ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。陰性対照６７０＋／－１４ｎｍの発光を使用して、ゲートが１％未満の陽性を含むようにヒストグラム上にゲートを配置する場所を決定した。上記の分析基準を使用して、フソソームが６．２３％±４．６５ ＡＦ４８８事象を示した場合に、新規に合成したＤＮＡにＥｄｕを含めることによる翻訳活性の代替的測定値として、親細胞は、５６．１７％±８．１３ Ｅｄｕ：６４７事象を示した（図１４Ｃ）。ＡＦ６４７の蛍光強度の中央値、したがって、Ｅｄｕの取り込みの測定値、したがって、新規に合成したＤＮＡは、親細胞では１３１１±４２６．２であり、フソソームでは１１６．６±４０．７４であった（図１４Ｃ）。この実施例は、フソソームが親細胞と比較してＤＮＡ複製がないことを示す。
実施例１１７：脂質二重層構造を有するフソソーム
この実施例は、フソソームの組成について説明する。一実施形態において、フソソーム組成物は、中心に内腔を有する脂質二重層構造を含む。理論に拘束されることを望まないが、フソソームの脂質二重層構造は、標的細胞との融合を促進し、フソソームが異なる治療剤のローディグを可能にする。
フソソームは、ＶＳＦ－Ｇによる２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクション、続いて、トランスフェクションから４８時間後、馴化培地の濾過および超遠心分離によって、前述の実施例に記載されるように調製された。各試料について、小分子量の汚染物質は、製造業者の取扱説明書に従って、エキソソームスピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ番号４４８４４４９）で除去した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬの遠心分離フィルターＵｌｔｒａｃｅｌ １００Ｋ １００，０００ ＮＭＷＬユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＵＦＣ５１００２４）を使用して、大量のタンパク質の除去、脱塩、および緩衝液の交換を行った。フソソームは、ＰＢＳで再構成された。試料毎に３つのホーリーカーボングリッド（電子顕微鏡サービス番号Ｑ２１００ＣＲ１．３）を、２５秒間グロー放電させて、表面を親水性にした。試料を、短時間ボルテックスし、３μＬのフソソームを、各グリッドの上部に置き、１～２分間インキュベートした。フソソームを、製造業者の取扱説明書に従って、Ｇａｔａｎ Ｃｒｙｏｐｌｕｎｇｅ３半自動プランジ凍結装置を使用して、プランジ凍結した。凍結した水和グリッドを、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ａｒｃｔｉｃａ Ｃｒｙｏ－ＴＥＭの凍結移送ホルダーに装填した。次いで、フソソームを、低用量検索モードでスキャンし、２３，５００Ｘおよび３９，０００Ｘの倍率で２００ｋＶで画像化した（図１５）。
実施例１１８：フソゲン発現の検出
この実施例は、フソソームにおけるフソゲン発現の定量化について説明する。フソソームは、１０ｃｍ皿でＶＳＶ－Ｇ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、およびｍｉＲＦＰ６７０を使用したＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、続いて、トランスフェクションから４８時間後、馴化培地の濾過および超遠心分離によって、本明細書に記載されるように調製された。陽性対照は、未処理の一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞であった。陰性対照は、トランスフェクトされていない２９３Ｔ細胞であった。
フソソームを、ＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、その後、タンパク質を上清から回収した。試料を、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に移した。各膜は、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で３０分間ブロックした。次いで、膜を、ブロッキング溶液中の抗ＶＳＶＧタグ（ａｂ１８７４、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）一次抗体で４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で、それぞれ５分間３回洗浄した。次いで、膜を、ブロッキング溶液中のＨＲＰ結合二次抗体（番号７０７４Ｐ２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）で４℃で４時間インキュベートした。ＨＲＰ基質を添加し、化学発光シグナルを、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅ３で記録した（図１６）。
実施例１１９：フソソームの平均サイズの測定
この実施例は、フソソームの平均サイズの測定について説明する。
フソソームは、ＶＳＶ－Ｇを使用したＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、続いて、除核、およびその後のフィコールによる画分によって、本明細書に記載されるように調製された。フソソームは、市販のサブミクロン（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）および超ミクロン（Ｚｅｉｓｓ ７８０ Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｃｏｎｆｏｃａｌ、Ｚｅｉｓｓ）測定システムを使用して測定して、平均サイズを決定した。各システムは、製造業者の取扱説明書に従ってソフトウェアとともに使用された。フソソームおよび親細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、１μＭのカルセインＡＭで染色して、約１ｍｇのタンパク質／ｍＬの最終濃度にした。次いで、フソソームおよび親細胞は、測定前にＰＢＳ中で１００倍に希釈した。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ
ＮＳ３００でのサブミクロン測定には、図１７Ａに示すパラメーターを使用した。７８０倒立共焦点顕微鏡での超ミクロン測定には、図１７Ｂに示すパラメーターを使用した。
すべてのフソソームは、単離から８時間以内に分析された。５００ｎｍ未満の粒子の測定値は、ＮＴＡから取得し、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡の粒子の５００ｎｍ以上の測定値に追加して、５０～２０，０００ｎｍの完全な測定値を得た。フソソームおよび親細胞のサイズ分布を、図１７Ｃに示す。図１７Ｄに示すように、すべての粒子の分布を平均化して、フソソームの平均サイズを得た。フソソームは、親細胞よりも小さいサイズを有することができると企図される。フソソームは、親細胞の約７３％以内のサイズを有することができると企図される。
実施例１２０：フソソームの平均サイズ分布の測定
この実施例は、フソソームのサイズ分布の測定について説明する。
フソソームは、ＶＳＶ－Ｇを使用したＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、続いて、除核、およびその後のフィコールによる画分によって、本明細書に記載されるように調製された。図１８に示すように、フソソームは、実施例３０の方法を使用して測定して、サイズ分布を決定した。フソソームは、試料の９０％以内に、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％未満またはそれより少ない親細胞のサイズ分布の変動を有し得ると企図される。フソソームは、試料の９０％以内に、５８％より少なく親細胞のサイズ分布の変動を有し得ると企図される。
実施例１２１：フソソームの平均体積
この実施例は、フソソームの平均体積の測定について説明する。フソソームのサイズ（例えば、体積）を変えることにより、異なるカーゴローディング、治療設計、または用途に対して万能であり得る。
フソソームは、ＶＳＶ－Ｇを使用したＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、続いて、除核、およびその後のフィコールによる画分によって、本明細書に記載されるように調製された。陽性対照は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞であった。
実施例３０に記載されるように、ＮＴＡと共焦点顕微鏡の組み合わせによる分析を使用して、フソソームのサイズを決定した。図１９に示すように、フソソームの直径を測定し、体積を計算した。フソソームは、直径が５０ｎｍを超える平均サイズを有し得ると企図される。フソソームは、直径が１２９ｎｍの平均サイズを有し得ると企図される。
実施例１２２：フソソーム中のオルガネラ含有量の測定
この実施例は、フソソーム中のオルガネラの検出について説明する。
フソソームは、ＶＳＶ－Ｇを使用したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション、続いて、除核、およびその後のフィコールによる画分によって、本明細書に記載されるように調製された。小胞体（ＥＲ）、リソソーム、およびミトコンドリアの検出のために、フソソームまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１μＭのＥＲ染色（Ｅ３４２５１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、５０ｎＭのリソソーム染色（Ｌ７５２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、または１００ｎＭのミトコンドリア染色（Ｍ２２４２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。
染色したフソソームを、フローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で泳動し、以下の表に従って各色素の蛍光強度を測定した。オルガネラの存在の検証は、染色したフソソームの蛍光強度を非染色のフソソーム（陰性対照）および染色された細胞（陽性対照）と比較することによって行われた。表Ｙに示す顕微鏡設定を使用して、フソソーム染色を実施した：
表Ｙ：
Figure 2023153260000022
図２０に示すように、核除去から４時間後、フソソームは、小胞体（図２０Ａ）、ミトコンドリア（図２０Ｂ）、およびリソソーム（図２０Ｃ）に陽性に染色した。
実施例１２３：可溶性タンパク質質量と不溶性タンパク質質量の比較
この実施例は、フソソームにおける可溶性タンパク質質量：不溶性タンパク質質量の比の定量化について説明する。フソソームにおける可溶性タンパク質質量：不溶性タンパク質質量の比は、場合によっては、有核細胞のその比に類似し得る。
フソソームは、ＶＳＶ－Ｇを使用したＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクション、続いて、除核、およびその後のフィコールによる画分によって、本明細書に記載されるように調製された。フソソーム調製物は、標準的なビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡプロテインアッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ製品番号２３２２５）を使用して、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を決定するために試験を行った。可溶性タンパク質試料は、ＰＢＳ中の１×１０７個の細胞または約１ｍｇ／ｍＬの総フソソームの濃度で調製したフソソームまたは親細胞を懸濁し、１，５００ｘｇで遠心分離して、細胞をペレット化するか、または１６，０００ｘｇで遠心分離して、フソソームをペレット化することによって調製された。上清は、可溶性タンパク質画分として収集した。
次いで、フソソームまたは細胞を、ＰＢＳに再懸濁した。この懸濁液は、不溶性タンパク質画分を表す。
１ウェル当たり０～１５μｇのＢＳＡの供給されたＢＳＡを（２重に）使用して、標準曲線を作成した。測定した量が標準の範囲内になるように、フソソームまたは細胞調製物を希釈した。フソソーム調製物を２重に分析し、平均値を使用した。可溶性タンパク質濃度を、不溶性タンパク質濃度で除算して、可溶性タンパク質：不溶性タンパク質の比を得た（図２１）。
実施例１２４：標的細胞による融合の測定
麻疹ウイルス（ＭｖＨ）の操作されたヘマグルチニン糖タンパク質および細胞表面上の融合タンパク質（Ｆ）を発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含有するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームを、本明細書に記載されるように生成した。ＭｖＨは、その天然の受容体結合が除去され、標的細胞特異性が細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）によって提供されるように操作され、この場合、ｓｃＦｖは、Ｔ細胞受容体に対して共受容体であるＣＤ８を標的にするように設計される。フソゲンＶＳＶ－Ｇをその表面上に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含有するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来した対照フソソームを、使用した。標的細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作され、共受容体ＣＤ８ａおよびＣＤ８ｂを過剰発現するように操作された、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であった。非標的細胞は、「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するが、ＣＤ８ａ／ｂを過剰発現しない、同じＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であった。標的または非標的レシピエント細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で３７℃および５％ＣＯ２で培養した。レシピエント細胞を播種してから４～６時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質およびＭｖＨ＋Ｆを発現するフソソームを、ＤＭＥＭ培地中で標的または非標的のレシピエント細胞に適用した。レシピエント細胞を、１０μｇのフソソームで処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化した。所定のウェル中の総細胞集団は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定された。Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用される。Ｈｏｅｃｈｓｔは、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化された。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、一方、ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。標的細胞および非標的細胞のウェルの画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、Ｈｏｅｓｃｈｔ、ＲＦＰ、およびＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値にあるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。Ｈｏｅｓｃｈｔチャネルでオートフォーカスし、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＧＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、ＲＦＰチャネルに適用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞（送達を示さなかったレシピエント細胞）およびＲＦＰ陽性細胞の合計で除算して、標的および非標的レシピエント細胞集団内のフソソーム融合の量を記載するＲＦＰ変換の割合を定量化した。標的融合（標的レシピエント細胞へのフソソーム融合）の量について、ＲＦＰ変換値の割合は、標的レシピエント細胞（すなわち、ＣＤ８を発現する）であるレシピエント細胞の割合に正規化され、フィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ８抗体を染色することによって評価し、フローサイトメトリーによって分析した。最後に、標的融合の絶対量は、標的細胞融合量から非標的細胞融合量を減じることによって決定した（０未満のいかなる値も０と見なされた）。
このアッセイでは、操作されたＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆをその表面上に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含有するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、レシピエント細胞が「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現する標的ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であった場合、２５．２＋／－６．４％のＲＦＰ変換の割合を示し、これらのレシピエント細胞の５１．１％がＣＤ８陽性であることが観察された。これらの結果から、ＲＦＰ変換の正規化された割合または標的融合の量は、標的融合では、４９．３＋／－１２．７％であると決定された。同じフソソームは、レシピエントが「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」を発現するが、ＣＤ８を発現しない非標的ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞であった場合、０．５＋／－０．１％のＲＦＰ変換の割合を示した。上記に基づいて、ＭｖＨ（ＣＤ８）＋Ｆフソソームの標的融合の絶対量は、４８．８％であると決定され、対照ＶＳＶ－Ｇフソソームの標的融合の絶対量は、０％であると決定された（図２２）。
実施例１２５：膜タンパク質を送達するためのインビトロ融合
細胞表面上に、胎盤細胞間融合タンパク質シンシチン－１（Ｓｙｎ１）および膜タンパク質、ヒトＯｘ４０リガンド（ｈＯｘ４０Ｌ、ＣＤ１３４のリガンド）を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように作製した。ｈＯｘ４０Ｌを発現するが、Ｓｙｎ１を発現しない同じ細胞からの対照粒子（非融合フソソーム）もまた、レシピエント細胞へのｈＯｘ４０Ｌの非融合媒介性送達を制御するように作製した。レシピエント細胞は、ヒト前立腺がん細胞（ＰＣ－３）であり、フソソームで処理する４～６時間前に、２４ウェル組織培養プレートに１２０，０００個の細胞／ウェルで播種した。レシピエント細胞を、ｔ＝０で４０ｕｇのＳｙｎ１フソソームまたは対照粒子で処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
フソソームまたは粒子で２４時間インキュベートした後、レシピエント細胞を、トリプシン処理してプレートから剥離し、５００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡに１５分間再懸濁して、細胞を固定した。固定後、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、続いて、１％ウシ血清アルブミン中（ＰＢＳ中）で室温で３０分間インキュベートした。次いで、ｈＯｘ４０Ｌに対する一次抗体であり、ブリリアントバイオレット４２１色素（ＢＶ４２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号７４４８８１）にコンジュゲートした一次抗体を、０．０１ｕｇ／ｕＬの濃度で細胞に添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、最後に、ヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳに再懸濁した。ヨウ化プロピジウムは、ＤＮＡに挿入することによって固定した／透過性細胞の細胞核を染色するため、個々の細胞と小さな破片またはフソソーム／粒子（ヨウ化プロピジウム陰性）を特定するために使用される。
次いで、細胞は、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、ＢＶ４２１およびヨウ化プロピジウムの蛍光について分析し、以下の表Ｚに従って各フルオロフォアの蛍光強度を決定した。
表Ｚ．フローサイトメーターの設定
Figure 2023153260000023
陰性対照は、同じ染色手順を使用して生成されるが、一次抗体は、添加されない。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ取得ソフトウェアは、取得のために使用され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアは、分析のために使用される。光散乱チャネルは、線形利得に設定され、蛍光チャネルは、対数尺度で設定され、最低１０，０００個の細胞が各条件で分析される。細胞事象は、まず、前方および側方散乱チャネルでゲートされて、小さな破片事象を除去し、次いで、ヨウ化プロピジウム陽性細胞が、「すべての細胞」ゲートとしてゲートされる（ヨウ化プロピジウム陽性ゲートは、ヨウ化プロピジウムで染色しない細胞が０．５％未満の陽性細胞を示すように設定される）。次いで、「すべての細胞」ゲートに基づいてＢＶ４２１蛍光の強度を調べ、ＢＶ４２１陽性細胞ゲートは、フソソーム／粒子で処理しないＰＣ－３細胞が０．５％未満のＢＶ４２１陽性細胞を示すように設定される（図２３中の黒線ゲートを参照）。次いで、ＢＶ４２１陽性細胞値の割合を、各群に対して計算し、ｈＯｘ４０Ｌの送達による細胞の定量化率（％）として使用した。
このアッセイで、Ｓｙｎ１およびｈＯｘ４０Ｌを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、ＰＣ－３レシピエント細胞への４３．６％のｈＯｘ４０Ｌの送達を伴う細胞の割合を示した。Ｓｙｎ１を発現しない対照粒子は、１１．４％のｈＯｘ４０Ｌの送達を伴う細胞の割合を示した。対照粒子で観察されたｈＯｘ４０Ｌの送達の量は、非フソソーム媒介性の送達によって生じるｈＯｘ４０Ｌの送達のバックグラウンドレベルを表した。したがって、フオソーム媒介性のｈＯｘ４０Ｌの送達を伴う細胞の割合を計算するために、対照粒子処理条件下でのｈＯｘ４０Ｌの送達を伴う細胞の割合を、フソソーム処理条件下でのｈＯｘ４０Ｌの送達を伴う細胞の割合から減じた。フソソーム媒介性のｈＯｘ４０Ｌの送達を伴う細胞の割合は、３２．２％であり（図２３）、これは膜タンパク質のインビトロでのフソソーム媒介性の送達を実証した。
実施例１２６：細胞膜を横断してグルコースを輸送する能力の測定
細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように、小粒子フソソームを得るためのフィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って作製した。細胞膜を横断してグルコースを輸送するフソソームの能力を測定するために、生細胞でのグルコース取り込みをモニタリングするために使用することができる２－ＮＢＤＧ（２－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアキソール－４－イル）アミノ］－２－デオキシグルコース）の蛍光グルコース類似体のレベルを定量化して、脂質二重層を横断する能動輸送を評価した。Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．（カタログ番号Ｋ６８２）から市販のキットを、製造業者の取扱説明書に従ってアッセイに使用した。
簡単に説明すると、フソソーム試料は、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上型遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離し、続いて、０．５％ウシ胎児血清を補充した４００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁することによって、４０ｕｇのフソソーム総タンパク質をペレット化した。これは各試料について２重に行われ、２重の１つは、グルコース取り込み阻害の対照として、グルコース取り込みを阻害する天然フェノールである４ｕＬのフロレチン（キットに付属）で処理した。次いで、試料を、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、フソソーム試料をペレット化し、これまでに調製した４００ｕＬのグルコース取り込みミックスに再懸濁した（製剤については、下の表Ａを参照のこと）。フロレチンで前処理した試料は、フロレチンとのグルコース取り込みミックスに再懸濁し、前処理されていない試料は、フロレチンの代わりに２０ｕＬのＰＢＳを含むグルコース取り込みミックスに再懸濁した。また、フソソーム試料の並行セットを、フローサイトメトリー分析の陰性対照として、０．５％ＦＢＳのみを含むＤＭＥＭ培地中に再懸濁した。
表Ａ：グルコース取り込みミックス製剤
Figure 2023153260000024
次いで、試料を、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をペレット化し、１ｍＬの１倍の分析緩衝液（キットに付属）で１回洗浄し、再度ペレット化し、４００ｕＬの１倍の分析緩衝液に再懸濁した。
次いで、試料を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ音響集束サイトメーターを使用したフローサイトメトリー分析によって２－ＮＢＤＧ取り込みについて測定した。２－ＮＢＤＧを、４８８ｎｍのレーザーで励起し、５１３±２６ｎｍで、発光を獲得した。前方および側方散乱ゲーティングは、まず、フソソームサイズの事象を獲得し、小さな破片を廃棄するために使用した。２－ＮＢＤＧ陽性の事象は、２－ＮＢＤＧ陰性対照試料が２－ＮＢＤＧ染色陽性の０．５％未満の事象を示す最小レベルでゲーティングすることによって決定された。次いで、フロレチン処理の有無によるフソソームのグルコース取り込みの値を計算するために、２－ＮＢＤＧ蛍光陽性のゲート細胞を、２－ＮＢＤＧの平均蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）について評価した。
このアッセイでは、ＶＳＶ－ＧおよびＣｒｅを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、フロレチン治療なしで６３１．０＋／－１．４の２－ＮＢＤＧ平均Ｆ．Ｉ．を示し、フロレチン治療ありで５６５．５＋／－４．９の平均Ｆ．Ｉ．を示した（図２４）。
実施例１２７：サイトゾルにおけるエステラーゼ活性の測定
Ｃ２Ｃ１２細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように、小粒子フソソームを得るためのフィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って作製した。フソソームのサイトゾルのエステラーゼ活性を測定するために、試料を、カルセインＡＭ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、カタログ番号５６４０６１）、フルオレセイン誘導体、および生細胞の細胞膜を受動的に通過し、無傷の膜および不活性な多剤耐性タンパク質を含む細胞によって保持される緑色蛍光カルセインに、サイトゾルエステラーゼによって変換される非蛍光生体色素で染色した。
簡単に説明すると、フソソーム試料は、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上型遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離し、続いて、０．５％ウシ胎児血清を補充した４００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁することによって、２０ｕｇのフソソーム総タンパク質をペレット化した。膜透過性色素であるカルセイン－ＡＭは、ジメチルスルホキシド中の１０ｍＭのストック溶液として、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中の１ｍＭの作業溶液として調製された。ＶＳＶ－Ｇフソソームを、ＤＭＥＭ培地中で希釈した１μＭのカルセインＡＭ溶液で染色した。試料を、３７℃の暗所で３０分間インキュベートし、次いで、遠心分離によってペレット化した。ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、フソソームを、ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
試料を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ音響集束サイトメーターを使用してカルセイン蛍光の保持について測定した。カルセインＡＭを、４８８ｎｍのレーザーで励起し、５１３±２６ｎｍで、発光を獲得した。前方および側方散乱ゲーティングは、まず、フソソームサイズの事象を獲得し、小さな破片を廃棄するために使用した。カルセイン陽性の事象は、カルセイン陰性対照試料がカルセイン染色陽性の０．５％未満の事象を示す最小レベルでゲーティングすることによって決定された。次いで、フソソームのサイトゾルのエステラーゼ活性の値を計算するために、カルセインの平均蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）について評価した。
このアッセイでは、Ｃ２Ｃ１２細胞に由来するフソソームは、６３１．０＋／－１．４のエステラーゼ活性（平均カルセインＦ．Ｉ．）を示した（図２５）。
実施例１２８：フソソームにおけるアセチルコリンエステラーゼ活性の測定
細胞表面上に胎盤細胞間融合タンパク質シンシチン－１（Ｓｙｎ１）を発現し、Ｃｒｅリコビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように作製した。アセチルコリンエステラーゼ活性は、製造業者の推奨に従って、ＦｌｕｏｒｏＣｅｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＦＣＥＴ９６Ａ－１）を使用して測定した。
簡単に説明すると、フソソームを、１２０，０００ｇで９０分間超遠心分離してペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に慎重に再懸濁した。次に、フソソームは、製造業者の取扱説明書に従って、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について定量化した。タンパク質濃度のＢＣＡ定量化後、１０００ｎｇの総フソソームタンパク質を、ＰＢＳで６０ｕＬの体積に希釈し、６０ｕＬの溶解緩衝液を添加して、粒子を溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、試料を、ＦｌｕｏｒｏＣｅｔアッセイで実行するように準備した。
９６ウェルプレートの２重のウェルで、５０μＬの溶解フソソーム試料を、５０μＬの緩衝液Ａの作業ストックおよび５０μＬの緩衝液Ｂの作業ストックと混合した。並行して、２ｕＬの提供された標準液を１２６ｕＬの１倍の反応緩衝液にピペッティングすることによって、標準曲線を作成した。次いで、この標準溶液を、５倍に段階希釈して、アセチルコリンエステラーゼ活性の２．０Ｅ＋０８、１．０Ｅ＋０８、５．０Ｅ＋０７、２．５Ｅ＋０７、１．２５Ｅ＋０７、および６．２５Ｅ＋０６のエキソソーム等価物からなる６点標準曲線を作成した。次いで、５０μＬの各ウェルを、９６ウェルプレートの２重のウェルで、５０ｕＬの緩衝液Ａの作業ストックおよび５０ｕＬの緩衝液Ｂの作業ストックと混合した。５０ｕＬの１倍の反応緩衝液を、ブランクとして使用した。プレートを、側面を軽くたたいて混合し、続いて、室温で２０分間暗所でインキュベートした。次いで、励起：５３０～５７０ｎｍおよび発光：５９０～６００ｎｍに設定された蛍光プレートリーダーを使用して、プレートを直ちに測定した。プレートは、読む前に３０秒間振とうした。
次いで、ブランクウェルからＲＦＵ値を減じた後、アセチルコリンエステラーゼ活性の既知のエキソソーム等価物に対して、相対蛍光単位（ＲＦＵ）をプロット化した。次いで、線形回帰線を計算し、式を使用して、測定されたＲＦＵ値からフソソーム試料のアセチルコリンエステラーゼ活性（エキソソーム等価物における）を決定した。Ｓｙｎ１フソソームの測定したアセチルコリンエステラーゼ活性を、表Ｂに示す。
Figure 2023153260000025
実施例１２９：代謝活性レベルの測定
細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように作製した。フソソーム調製物の代謝活性レベルを決定するために、必要な試薬のすべてを提供するＳｉｇｍａの市販キット（カタログ番号ＣＳ０７２０）を使用して、クエン酸シンターゼ活性を評価した。クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）とアセチルＣｏＡの反応を触媒してクエン酸を生成する、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル内の酵素である。アセチル－ＣｏＡの加水分解により、チオール基（ＣｏＡ－ＳＨ）を有するＣｏＡの放出がある。チオール基は、化学試薬５，５－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応して、４１２ｎｍで分光光度法で測定され得る黄色生成物を有する、５－チオ－２－ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）を形成する。
アッセイは、製造業者の推奨に従って実行された。簡単に説明すると、フソソーム試料は、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上型遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離することによって、４００ｕｇのフソソーム総タンパク質をペレット化した。フソソームを再度ペレット化し、氷冷ＰＢＳに再懸濁することによって１回洗浄した。フソソームを再びペレット化し、上清を除去した。ペレットを、１倍のプロテアーゼ阻害剤を含む１００μＬのＣｅｌｌＬｙｔｉｃ Ｍ緩衝液に溶解した。ピペッティングによる混合後、溶解した試料を、室温で１５分間インキュベートして溶解を完了した。次いで、試料を、１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を新しい微量遠心管に移し、次のアッセイが実行されるまで－８０℃で保存した。
クエン酸シンターゼ活性アッセイを開始するために、すべてのアッセイ溶液を、使用前に室温まで加温した。溶解したフソソーム試料を、下の表Ｃに従ってアッセイ溶液と混合した：
Figure 2023153260000026
表Ｃ中の体積は、９６ウェルプレートの１つのウェルの体積を表す。試料を、２重に測定した。反応物のすべての成分を混合し、９６ウェルプレートの１つのウェルにピペッティングした。次いで、ベースライン反応を測定するために、４１２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで１．５分間分析した。次いで、１０ｕＬの１０ｍＭのＯＡＡ溶液を、各ウェルに添加して反応を開始した。プレートを、マイクロプレートリーダーで１０秒間振とうした後、１０秒毎に測定しながら４１２ｎｍでの吸光度を１．５分間読み取った。
クエン酸シンターゼ活性を計算するために、４１２ｎｍでの吸光度を、各反応の時間に対してプロット化した。ＯＡＡ添加前（内因性活性）およびその後（総活性）のプロットの線形範囲について、１分当たりの吸光度の変化を計算した。次いで、試料の総活性から内因性活性を減じることによって、正味のクエン酸シンターゼ活性を計算した。次いで、この値を使用して、製造業者によって提供された式および定数値に基づいてクエン酸シンターゼ活性を計算した。ＶＳＶ－Ｇフソソームに対して測定されたクエン酸シンターゼ活性は、１．５７Ｅ－０２＋／－１．８６Ｅ－０３ｕｍｏｌ／ｕｇフソソーム／分であった。
実施例１３０：呼吸レベルの測定
細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように、小粒子フソソームを得るためのフィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って作製した。フソソーム呼吸は、タツノオトシゴ細胞外フラックス分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってミトコンドリア酸素消費率を測定することによって決定した。
簡単に説明すると、フソソーム試料は、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次に、卓上型遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離し、続いて、２５ｍＭのグルコースおよび２ｍＭのグルタミン（ｐＨ７．４）を補充した１５０μＬのＸＦ Ａｓｓａｙ培地（Ａｇｉｌｅｎｔカタログ番号１０３５７５－１００）に再懸濁することによって、２０μｇのフソソーム総タンパク質をペレット化した。次いで、再懸濁した試料を、９６ウェルのタツノオトシゴプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）の１つのウェルに添加した。
酸素消費アッセイは、温度およびｐＨの平衡に達するために、９６ウェルプレートタツノオトシゴプレートを３７℃で６０分間試料とインキュベートすることによって開始した。次いで、フソソームを直接取り巻く培地中の酸素およびｐＨの細胞外フラックス変化を測定するために、ＸＦ９６細胞外フラックス分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）で、マイクロプレートをアッセイした。定常状態の酸素消費量および細胞外酸性化速度を取得した後、ＡＴＰシンターゼを阻害するオリゴマイシン（５μＭ）、およびミトコンドリアを脱共役するプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）を、マイクロプレートの各ウェルに試薬送達チャンバーを通して連続的に注射して、最大酸素消費速度の値を得る。最後に、５μＭのアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を注射して、呼吸の変化が主にミトコンドリア呼吸によるものであることを確認した。基礎非結合（オリゴマイシン耐性）、および最大（ＦＣＣＰ誘発）のミトコンドリア呼吸速度を決定するために、アンチマイシンＡ呼吸速度を他の３つの呼吸速度から減じた。
このアッセイを使用して、下の表Ｄに従って、ドナーＶＳＶ－Ｇフソソームが基底、脱共役、および最大酸素消費（呼吸）速度を示すことを決定した。
Figure 2023153260000027
実施例１３１：フソソームのホスファチジルセリンレベルの測定
細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように、小粒子フソソームを得るためのフィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って作製した。フソソームのホスファチジルセリンレベルを測定するために、製造業者の取扱説明書に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素とコンジュゲートした市販のアネキシンＶ（カタログ番号Ａ２３２０４）を使用して、アネキシンＶ染色を実施した。アネキシンＶは、ホスファチジルセリンが細胞膜の外葉に露出するときにホスファチジルセリンに結合することができる細胞タンパク質であり、したがって、試料へのアネキシンＶ結合の読み出しは、試料中のホスファチジルセリンレベルの評価を提供することができる。
簡単に説明すると、フソソーム試料は、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次いで、卓上型遠心分離機で３０００ｇで５分間遠心分離し、続いて、２％ウシ胎児血清を補充した４００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁することによって、４０μｇのフソソーム総タンパク質をペレット化した。１つの試料を、４０μＭのアンチマイシンＡで処理した。次いで、試料を、３７Ｃで１時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、再度遠心分離によりペレット化し、１００μＬのアネキシン結合緩衝液（ＡＢＢ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）に再懸濁した。次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートした５μＬのアネキシンＶを、（アネキシンＶ染色のない陰性対照を除く）各試料に添加した。試料を、室温で１５分間インキュベートした後、４００μＬのＡＢＢを添加した。
次いで、試料を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ音響集束サイトメーターを使用したフローサイトメトリー分析によってアネキシンＶについて測定した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７とコンジュゲートしたアネキシンＶを、６３８ｎｍのレーザーで励起し、６７０±１４ｎｍで、発光を獲得した。前方および側方散乱ゲーティングは、まず、フソソームサイズの事象を獲得し、小さな破片を廃棄するために使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（アネキシンＶ）染色に陽性の事象は、染色されていないアネキシンＶ陰性対照試料がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色に陽性の０．５％未満の事象を示す最小レベルでゲーティングすることによって決定された。次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７染色に陽性のゲート事象を、親母集団全体のアネキシンＶ陽性事象の割合（前方／側方散乱ゲートのフソソームサイズの事象）について評価し、この値を、フソソーム試料中のホスファチジルセリンレベルの定量化として使用した。
このアッセイでは、ＶＳＶ－ＧおよびＣｒｅを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、アンチマイシンＡ治療なしで６３．３±２．３％のアネキシンＶ陽性フソソームの割合を示し、アンチマイシンＡ治療ありで６７．６±５．７％のアネキシンＶ陽性フソソームの割合を示した。
実施例１３２：平均ミトコンドリア膜電位の測定
細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように、小粒子フソソームを得るためのフィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って作製した。フソソームの平均ミトコンドリア膜電位レベルを測定するために、ミトコンドリア膜電位に感受性を持つ市販の色素、テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩（ＴＭＲＥ；Ａｂｃａｍ、カタログ番号Ｔ６６９）を使用して、ミトコンドリア膜電位を評価した。試料中のミトコンドリアの量へのＴＭＲＥ蛍光強度（ＦＩ）を正規化するために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ色素（ＭＴＧ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｍ７５１４）を使用して試料を共染色して、ＭＴＧ ＦＩ、ひいては試料中のミトコンドリアの量へのＴＭＲＥ ＦＩを正規化した。さらに、カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ２９２０）を使用して並行セットの試料を処理して、ミトコンドリア膜電位を完全に脱分極し、そのため、ＴＭＲＥ ＦＩの減少に基づいてミトコンドリア膜電位（ミニボルト）の定量化を可能にした。
簡単に説明すると、フソソーム試料は、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。次いで、卓上型遠心分離機で３０００ｇで５分間（処理されていないおよびＦＣＣＰ処理した複製に対して４重の試料中で）遠心分離し、続いて、２％ウシ胎児血清を補充し、それぞれ、３０ｎＭおよび２００ｎＭの最終濃度でＴＭＲＥおよびＭＴＧ色素を含む１００ｕＬのＤＭＥＭに再懸濁することによって、４０μｇのフソソーム総タンパク質をペレット化した。フソソーム試料の並行セットは、陰性対照として染色しないままであった。試料を、３７℃で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、遠心分離によりペレット化し、３０ｎｍのＴＭＲＥを含む、４００μＬのフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地に再懸濁した。フローサイトメトリーによる評価前に５分間、１組の複製を２０μＭのＦＣＣＰで処理した。
次いで、試料を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ音響集束サイトメーターを使用したフローサイトメトリー分析によってアネキシンＶについて測定した。ＭＴＧを、４８８ｎｍのレーザーで励起し、５３０±３０ｎｍで、発光を獲得した。ＴＭＲＥを、５６１ｎｍのレーザーで励起し、５８５±１６ｎｍで、発光を獲得した。前方および側方散乱ゲーティングは、まず、フソソームサイズの事象を獲得し、小さな破片を廃棄するために使用した。ＭＴＧおよびＴＭＲＥ染色に陽性の事象は、非染色の対照試料がＭＴＧまたはＴＭＲＥ染色に陽性の０．５％未満の事象を示す最小レベルでゲーティングすることによって決定された。次いで、ＭＴＧおよびＴＭＲＥ染色に陽性のゲート事象を、ＭＴＧおよびＴＭＲＥの平均ＦＩについて評価した。
膜電位値（ミリボルト、ｍＶ）は、ＭＴＧ ＦＩ値へのＴＭＲＥ ＦＩ値を正規化した後のＴＭＲＥの強度に基づいて計算される。このＴＭＲＥ／ＭＴＧ比の値により、試料中のミトコンドリアの量へのＴＭＲＥ強度を正規化することができる。未処理試料およびＦＣＣＰ処理試料の両方のＴＭＲＥ／ＭＴＧ比の値は、（ＴＭＲＥがＮｅｒｎｓｔｉａｎ様式でミトコンドリアに蓄積するとき）ＴＭＲＥ蛍光に基づいてミトコンドリア膜電位を決定することができる修正されたネルンスト方程式（下記参照）を使用して膜電位（ミリボルトで）を決定するために計算し、使用する。フソソーム膜電位は、次の式で計算される：（ｍＶ）＝－６１．５＊ｌｏｇ（ＦＩ（未処理）／ＦＩ（ＦＣＣＰ処理））。この式を使用すると、ＶＳＶ－Ｇフソソーム試料の計算されたミトコンドリア膜電位は、－２９．６±１．５ミリボルトであった。
実施例１３３：対象における持続性半減期の測定
この実施例は、フソソーム半減期の測定について説明する。フソソームは、調製前に２時間急性トランスフェクションを受け、それらは、本明細書に記載の方法を使用して得られ、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡがロードされた。
調製後、フソソームを、遠心分離によってペレット化し、フソソーム粒子を、注射用の滅菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。フソソームを欠いている緩衝液を、陰性対照として使用した。
フソソームは、前脛骨筋への筋肉内（ＩＭ）投与を介して、９週齢のＦＶＢ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、００１８００）マウスに送達された。溶液は、内容物の継続的な無菌性を確保する方法で処理された。麻酔は、誘導チャンバーで行われ（約４％イソフルラン、効果を得るまで）、ノーズコーンを介して維持され（約２％イソフルラン、効果を得るまで）、動物を温めた（３５℃）手術台に置いた。前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の中央腹部の皮膚を、その領域を脱毛する（４５秒間Ｎａｉｒ Ｈａｉｒ Ｒｅｍｏｖｅｒクリーム、続いて７０％エタノールで領域を洗浄する）ことによって調製した。ツベルクリン注射器を使用して、５０μＬのフソソーム溶液１５μｇのタンパク質／μＬ、平均値（標準誤差））を、ＴＡの腹部に筋肉内注射した。注射が完了したら、注射器を取り外し、注射部位に圧力を加えた。対照と同じ方法を利用して、対側脚を、ＰＢＳで治療した。
送達後、ｍＲＮＡルシフェラーゼは、レシピエント細胞質でルシフェラーゼタンパク質に翻訳する。Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与により、インビボ生物発光イメージングを介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になった。動物を、動物の動きを防ぐためにコーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に配置した。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態的クリアランスによる最大の生物発光シグナルを観察するために、注入後３～３５分間に光子収集が行われた。最大放射輝度は、光子／秒／ｃｍ２／ラジアンで記録された。領域全体の放射輝度を積分する全光束は、Ｌｉｖｉｎｇ
Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内の関心領域（ＲＯＩ）ツールを使用して定量化され、光子／秒で報告された。フソソーム処理およびＰＢＳ処理した前脛骨筋組織を、陰性対照（陰性対照のスレッドなし（胸部）および病期）と比較して、特に放射輝度測定のためにモニタリングした。ホタルルシフェラーゼの存在を観察するために、注射から１、６、１２、２４、および４８時間後に測定が行われた。
図２６Ａ～２６Ｂに示すように、ホタルルシフェラーゼの存在の証拠は、動物のレシピエント組織における生物発光イメージングによって検出された。
実施例１３４：対象における標的電位の測定（ＢｉＶｓ－Ｃｒｅ Ｇｅｓｉｃｌｅｓ）
この実施例は、特定の身体部位を標的とするフソソームの能力を評価する。フソソームは、本明細書に記載の方法を使用して得られ、ｃｒｅ－リコンビナーゼタンパク質がロードされた。
２用量のフソソーム（１倍および３倍）を、Ｌｏｘｐルシフェラーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、００５１２５）に送達し、マウスに尾静脈を介して静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射した。マウスを、約５分間（またはマウスがひげを過度に手入れし始めるまで）加熱ランプ（２５０Ｗ（赤外線）加熱ランプ電球を使用）の下に置き、尾静脈を拡張した。マウスを拘束具の上に置き、尾部を７０％エタノールで拭き取り、静脈をより良好に視覚化した。
ツベルクリン注射器を使用して、２００μＬのフソソーム１倍溶液（８．５ｅ８±１．４ｅ８粒子／μＬ、平均値（標準誤差））または３倍溶液（２．５５ｅ９±１．４ｅ８粒子／μＬ、平均値（標準誤差））をＩＶ注射した。注射が完了したら、注射器を取り外し、注射部位に圧力を加えた。
融合後、ＣＲＥタンパク質は、核に移動して組換えを実行し、ルシフェラーゼの構成的発現をもたらした。処置から３日後、対象の腹部領域を、その領域を脱毛する（４５秒間Ｎａｉｒ Ｈａｉｒ Ｒｅｍｏｖｅｒクリーム、続いて７０％エタノールで領域を洗浄する）ことによって調製した。次いで、対象を、腹腔内投与を介してＤ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。これにより、インビボ生物発光イメージングを介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になった。動物を、動物の動きを防ぐためにコーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に配置した。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態的クリアランスによる最大の生物発光シグナルを観察するために、注入後３～１５分間に光子収集が行われた。最大放射輝度は、光子／秒／ｃｍ２／ラジアンで記録された。領域全体の放射輝度を積分する全光束は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内の関心領域（ＲＯＩ）ツールを使用して定量化され、光子／秒で報告された。
図２７Ａ～２７Ｂに示すように、フソソームによるタンパク質（Ｃｒｅリコンビナーゼ）送達の証拠は、動物のレシピエント組織での生物発光イメージングによって検出された。シグナルは、主に脾臓および肝臓で見られ、３倍の群が最高のシグナルを示した。
全身イメージングの後、マウスを頸部脱臼させ、殺処分から５分以内に肝臓、心臓、肺、腎臓、小腸、膵臓、および脾臓を収集し、イメージングした。フソソームによる肝臓および脾臓へのタンパク質（Ｃｒｅリコンビナーゼ）送達の証拠は、動物の抽出されたレシピエント組織の生物発光イメージングによって検出された。これは、図２８Ａ～２８Ｂにおいて見出され得る。シグナルは、脾臓で最も高く、心臓で最も低く、３倍の群は、最も有意なシグナルを示した（心臓と比較して、ｐ＝０．０００４）。
実施例１３５：リソソーム酸性化に無関係である経路を介したフソソームの送達
多くの場合、標的細胞への複雑な生物学的カーゴの侵入は、エンドサイトーシスによって達成される。エンドサイトーシスは、カーゴがエンドソームに入ることを必要とし、エンドソームは酸性化されたリソソームに成熟する。不都合なことに、エンドサイトーシスを介して細胞に入るカーゴは、エンドソームまたはリソソームに閉じ込められ、細胞質に到達できなくなり得る。カーゴはまた、リソソームの酸性条件によって損傷し得る。一部のウイルスは、標的細胞への非エンドサイトーシス侵入が可能であるが、このプロセスは、完全には理解されていない。この実施例は、ウイルスフソゲンが残りのウイルスから単離され、他のウイルスタンパク質を欠いているフソソームに非エンドサイトーシス侵入を付与できることを示す。
細胞表面上にニパウイルス受容体結合Ｇタンパク質および融合Ｆタンパク質（ＮｉｖＧ＋Ｆ）を発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように、小粒子フソソームを得るためのフィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って作製した。非エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのフソソームの送達を実証するために、ＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを使用して、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を処理した。ＮｉｖＦタンパク質は、ｐＨ非依存性エンベロープ糖タンパク質であり、活性化およびその後の融合活性のために環境酸性化を必要としないことが示されている（Ｔａｍｉｎ，２００２）。
レシピエント細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞を播種してから４～６時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを、ＤＭＥＭ培地中で標的または非標的のレシピエント細胞に適用した。フソソーム試料は、まず、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。レシピエント細胞を、１０μｇのフソソームで処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＮｉｖＧ＋Ｆフソソームを介したＣｒｅ送達が非エンドサイトーシス経路によって行われたことを実証するために、ＮｉｖＧ＋Ｆフソソーム処理を受けているレシピエント細胞の並行ウェルを、エンドソーム／リソソーム酸性化の阻害剤、バフィロマイシンＡ１（Ｂａｆ；１００ｎＭ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ１７９３）で同時処理した。
自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化した。所定のウェル中の総細胞集団は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定された。Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用された。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化された。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、一方、ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。標的細胞および非標的細胞のウェルの画像は、まず、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞を含む陽性対照ウェルのＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、Ｈｏｅｓｃｈｔ、ＲＦＰ、およびＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値にあるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。Ｈｏｅｓｃｈｔチャネルでオートフォーカスし、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＧＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、ＲＦＰチャネルに適用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞（送達を示さなかったレシピエント細胞）およびＲＦＰ陽性細胞の合計で除算して、レシピエント細胞によるフソソーム融合の量を示すＲＦＰ変換の割合を定量化した。
このアッセイでは、ＮｉｖＧ＋Ｆをその表面上に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、リソソーム非依存性経路を介した有意な送達を示し、レシピエント細胞をＢａｆで同時処理し、エンドサイトーシスを媒介した取り込みを阻害する場合にでさえ、ＮｉｖＧ＋ＦフソソームによるＣｒｅカーゴの有意な送達からも明らかなように、非エンドサイトーシス経路を介した侵入と一致する（図２９）。この場合、Ｂａｆでの同時処理によるカーゴ送達の阻害は、２３．４％であった。
実施例１３６：リソソーム酸性化を伴う経路を介したフソソームの送達
細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からのフソソームを、本明細書に記載されるように、小粒子フソソームを得るためのフィコール勾配による超遠心分離の標準手順に従って作製した。エンドサイトーシス経路を介したレシピエント細胞へのフソソームの送達を実証するために、ＶＳＶ－Ｇフソソームを使用して、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を処理した。ＶＳＶ－Ｇは、後期エンドソームまたはリソソームの低ｐＨ環境（ｐＨ約６）で活性化されることが示されているｐＨ依存性エンベロープ糖タンパク質である（Ｙａｏ，２００３）。レシピエント細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞を播種してから４～６時間後、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を発現するＶＳＶ－Ｇフソソームを、ＤＭＥＭ培地中で標的または非標的のレシピエント細胞に適用した。フソソーム試料は、まず、製造業者の取扱説明書に従って、ビソコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２３２２５）によって総タンパク質含有量について測定した。レシピエント細胞を、１０μｇのフソソームで処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＶＳＶ－Ｇフソソームを介したＣｒｅ送達がエンドサイトーシス経路によって行われたことを実証するために、ＶＳＶ－Ｇフソソーム処理を受けているレシピエント細胞の並行ウェルを、エンドソーム／リソソーム酸性化の阻害剤、バフィロマイシンＡ１（Ｂａｆ；１００ｎＭ；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｂ１７９３）で同時処理した。
自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化した。所定のウェル中の総細胞集団は、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２でＤＭＥＭ培地中の細胞を１０分間染色することによって決定された。Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２は、ＤＮＡに挿入することによって細胞核を染色するため、個々の細胞を特定するために使用された。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＤＡＰＩフィルターキューブを使用して画像化された。ＧＦＰは、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、一方、ＲＦＰは、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。細胞のウェルの画像は、まず、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞を含む陽性対照ウェルのＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、Ｈｏｅｓｃｈｔ、ＲＦＰ、およびＧＦＰ強度が最大ピクセル強度値にあるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。Ｈｏｅｓｃｈｔチャネルでオートフォーカスし、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＧＦＰおよびＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／を参照）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＧＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、ＲＦＰチャネルに適用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞（送達を示さなかったレシピエント細胞）およびＲＦＰ陽性細胞の合計で除算して、レシピエント細胞によるフソソーム融合の量を示すＲＦＰ変換の割合を定量化した。
このアッセイでは、ＶＳＶ－Ｇをその表面上に発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質を含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に由来するフソソームは、レシピエント細胞をＢａｆで同時処理し、エンドサイトーシスを媒介した取り込みを阻害する場合に、ＶＳＶ－ＧフソソームによるＣｒｅカーゴ送達の有意な阻害からも明らかなように、エンドサイトーシス経路を介した有意な送達を示した（図３０）。この場合、Ｂａｆでの同時処理によるカーゴ送達の阻害は、９５．７％であった。
実施例１３７：オルガネラの送達
細胞表面上に胎盤細胞間融合タンパク質シンシチン－１（Ｓｙｎ１）を発現し、ミトコンドリアを標的とするＤｓＲＥＤ蛍光タンパク質（ｍｔＤｓＲＥＤ）を発現するＨｅＬａ細胞を含むフソソームが、作製された。レシピエント細胞は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤であるザルシタビンでのＨｅＬａ細胞の長期間（６週間超）の培養によってミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を欠くように生成されたＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞であった。ＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞は、ｍｔＤＮＡが欠損しており（ｑＰＣＲで評価）、ミトコンドリア酸素消費量が著しく不足していることを示す（タツノオトシゴ細胞外フラックスアッセイで測定される）。レシピエントのＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞はまた、２日間アデノウイルス形質導入を介してミトコンドリア標的ＧＦＰ（ｍｔＧＦＰ）を発現するように操作された。
レシピエントＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞を、６ウェル皿に播種し、１時間後にＳｙｎ１ ＨｅＬａ細胞フソソームを、レシピエント細胞に適用した。次いで、細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＳＯＲＰ細胞選別機を使用した蛍光支援細胞選別を介して、細胞を二重陽性（融合）細胞用に選別した。ｍｔＧＦＰおよびｍｔＤｓＲＥＤに対して二重陽性の細胞集団を評価して、Ｓｙｎ１ ＨｅＬａ細胞フソソームからミトコンドリア提供（ｍｔＤｓＲＥＤ）を受けたレシピエントＨｅＬａ Ｒｈｏ０細胞を選別した。ｍｔＧＦＰを、４８８ｎｍのレーザーで励起し、５１３±２６ｎｍで、発光を獲得した。ｍｔＤｓＲＥＤを、５４３ｎｍのレーザーで励起し、５７０±２６ｎｍで、発光を獲得した。前方および側方散乱ゲーティングは、まず、細胞サイズの事象を獲得し、小さな破片を廃棄するために使用した。ｍｔＧＦＰおよびｍｔＤｓＲＥＤに対する二重陽性の事象は、適切に各陰性対照試料が特定の蛍光マーカーに陽性の１％未満の事象を示す（すなわち、未染色および単一のｍｔＧＦＰ陽性試料は、ｍｔＤｓＲＥＤに陽性の１％未満の事象を示す）最小レベルでゲーティングすることによって決定された。次いで、二重陽性の事象、および単一陽性ｍｔＧＦＰ（フソソーム送達のないレシピエント細胞）および単一陽性ｍｔＤｓＲＥＤ（レシピエント細胞に融合しなかったドナーフソオーム）の事象を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭ培地に選別した。選別した細胞を計数し、９６ウェルタツノオトシゴプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ）に１ウェル当たりに２５，０００個の細胞を（各群で６反復で）播種した。プレートを、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
酸素消費アッセイは、成長培地を除去し、２５ｍＭのグルコースおよび２ｍＭのグルタミン（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含む低緩衝ＤＭＥＭ最小培地と交換し、温度およびｐＨの平衡に達するために３７℃で６０分間インキュベートすることによって開始した。次いで、付着した細胞を直接取り巻く培地中の酸素およびｐＨの細胞外フラックス変化を測定するために、ＸＦ９６細胞外フラックス分析器（Ａｇｉｌｅｎｔ）でマイクロプレートをアッセイした。定常状態の酸素消費量および細胞外酸性化速度を取得した後、ＡＴＰシンターゼを阻害するオリゴマイシン（５μＭ）、およびミトコンドリアを脱共役するプロトンイオノフォアＦＣＣＰ（カルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン；２μＭ）を、マイクロプレートの各細胞ウェルに試薬送達チャンバーを通して連続的に注射して、最大酸素消費速度の値を得る。最後に、５μＭのアンチマイシンＡ（ミトコンドリア複合体ＩＩＩの阻害剤）を注射して、呼吸の変化が主にミトコンドリア呼吸によるものであることを確認した。基礎非結合（オリゴマイシン耐性）、および最大（ＦＣＣＰ誘発）のミトコンドリア呼吸速度を決定するために、アンチマイシンＡ呼吸速度を他の３つの呼吸速度から減じた。
このアッセイを使用して、ドナーＳｙｎ１ ＨｅＬａ細胞は、活性な基礎および最大酸素消費速度を示し、一方、フソソーム送達のないレシピエント細胞は、ミトコンドリアの酸素消費の３つの状態すべての低い速度を示すことが決定された。レシピエントＨｅＬａ
Ｒｈｏ０細胞へのＳｙｎ１ ＨｅＬａ細胞フソソームによるミトコンドリアの送達は、ドナーＳｙｎ１ ＨｅＬａ細胞速度に近いミトコンドリア酸素消費速度への戻りを示した（図３１）。
実施例１３８：ＤＮＡのインビトロ送達
フソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。対照粒子（非融合フソソーム）を、ｐｃＤＮＡ３．１が空のベクターで一過性に逆トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成した。次いで、ペイロードを、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に概説されるように、超音波処理によってＶＳＶ－Ｇフソソームにローディングした。この実験では、核酸ペイロードは、ＳＶ４０核局在化配列（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を持つバクテリオファージＰ１ ＣｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドＤＮＡであった。次いで、ＤＮＡをローディングしたフソソームを使用して、ＣＭＶプロモーターの制御下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞へのペイロード送達を処理し、示した。
簡単に説明すると、８０μｇの標準的なＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約４０６個のフソソームまたは対照粒子（非融合フソソーム）を、１４０μｇのＤＮＡと混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、フソソーム（または対照粒子）／核酸混合物を、４０ｋＨｚで操作した水浴ソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理した。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間の２回目の超音波処理を行った。次いで、混合物を４℃で５分間１６，０００ｇで遠心分離して、核酸を含むフソソームをペレット化した。組み込まれていない核酸を含む上清を除去し、ペレットを３０μＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。ＤＮＡをローディグした後、ローディグしたフソソーム／対照粒子を、使用前に氷上に保持した。
「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで完全培地中の黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞を播種してから２４時間後、ＤＮＡをローディングしたフソソームを、ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に適用した。レシピエント細胞を、８μＬのＤＮＡをローディングしたフソソームまたは８μＬのＤＮＡをローディングした対照粒子（非融合フソソーム）で処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞プレートを、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して画像化される前に、完全培地中で希釈された１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で、３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。レシピエント細胞のＨｏｅｃｈｓｔ蛍光は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＢＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、レシピエント細胞のＧＦＰ蛍光は、４８８ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。レシピエント細胞のＲＦＰ蛍光は、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。ウェル内の細胞の画像は、まず、１．２５ｕＬのＣｒｅリコンビナーゼゲシクル（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１４４９）で処理したレシピエント細胞を含む陽性対照ウェルのＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、ＲＦＰ、ＧＦＰ、およびＲＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。ＢＦＰチャネルでオートフォーカスし、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＧＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、ＲＦＰチャネルに適用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅ ＤＮＡを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞の合計（総レシピエント細胞）で除算して、超音波処理を介してフソソームにローディングしたＣｒｅ ＤＮＡペイロードを受容したレシピエント細胞の量を示す、Ｃｒｅ ＤＮＡ送達を受けた細胞の割合を定量化した。
このアッセイで、Ｃｒｅ ＤＮＡをローディングしたフソソームは、総ＧＦＰ陽性レシピエント細胞の１０．７±３．３％のＲＦＰ陽性細胞に相当する観察可能なレベルのＣｒｅ ＤＮＡ送達を示した（図３２）。未処理のレシピエント細胞またはフソソームのみで処理した細胞、またはＤＮＡをローディングした対照粒子は、いかなる感知できるほどのＲＦＰ陽性細胞も示さなかった。
実施例１３９：ｍＲＮＡのインビトロ送達
フソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。対照粒子（非融合フソソーム）を、ｐｃＤＮＡ３．１が空のベクターで一過性に逆トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成した。次いで、ペイロードを、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に概説されるように、超音波処理によってＶＳＶ－Ｇフソソームにローディングした。この実験では、核酸ペイロードは、ＳＶ４０核局在化配列（ＴｒｉＬｉｎｋ、カタログ番号Ｌ－７２１１）を持つバクテリオファージＰ１ Ｃｒｅリコンビナーゼをコードするインビトロで転写したメッセンジャーＲＮＡであった。次いで、ｍＲＮＡをロードしたフソソームを使用して、ＣＭＶプロモーターの制御下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞へのペイロード送達を処理し、示した。
簡単に説明すると、２０μｇの標準的なＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約１０６個のフソソームまたは対照粒子（非融合フソソーム）を、１０μｇのｍＲＮＡと混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、フソソーム（または対照粒子）／核酸混合物を、４０ｋＨｚで操作した水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理した。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間の２回目の超音波処理を行った。次いで、混合物を４℃で５分間１６，０００ｇで遠心分離して、核酸を含むフソソームをペレット化した。組み込まれていない核酸を含む上清を除去し、ペレットを３０μＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。ｍＲＮＡをローディングした後、ローディングしたフソソーム／対照粒子を、使用前に氷上に保持した。
「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで完全培地中の黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、ｍＲＮＡをローディングしたフソソームを、ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に適用した。レシピエント細胞を、８μＬのｍＲＮＡをローディングしたフソソームまたは８μＬのｍＲＮＡをローディングした対照粒子（非融合フソソーム）で処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞プレートを、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して画像化される前に、完全培地中で希釈された１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で、３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。レシピエント細胞のＨｏｅｃｈｓｔ蛍光は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＢＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、レシピエント細胞のＧＦＰ蛍光は、４８８ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。レシピエント細胞のＲＦＰ蛍光は、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。ウェル内の細胞の画像は、まず、Ｃｒｅリコンビナーゼゲシクル（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１４４９）で処理したレシピエント細胞を含む陽性対照ウェルのＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、ＲＦＰ、ＧＦＰ、およびＲＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。ＢＦＰチャネルでオートフォーカスし、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＧＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、ＲＦＰチャネルに適用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅ ｍＲＮＡを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞の合計（総レシピエント細胞）で除算して、超音波処理を介してフソソームにローディングしたＣｒｅ ｍＲＮＡペイロードを受容したレシピエント細胞の量を示す、Ｃｒｅ ｍＲＮＡ送達を受けた細胞の割合を定量化した。
このアッセイで、Ｃｒｅ ｍＲＮＡをローディングしたフソソームは、総ＧＦＰ陽性レシピエント細胞の５２．８±７．８％のＲＦＰ陽性細胞に相当する観察可能なレベルのＣｒｅ ｍＲＮＡ送達を示した（図９６）。ｍｉＲＦＰ６７０ ＤＮＡのみ、フソソームのみ、または超音波処理したフソソームのみで処理したレシピエント細胞は、いかなる感知できるほどのｍｉＲＦＰ６７０陽性細胞も示さなかった。
実施例１４０：ｍＲＮＡのインビボ送達
この実施例は、フソソームを介したインビボでの細胞へのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達について説明する。インビボでの細胞へのｍＲＮＡの送達は、レシピエント細胞内にタンパク質の発現をもたらした。この送達方法を使用して、存在しないタンパク質を導入し、これにより、ｌｏｘｐ部位の切断、その後の非内在性分子の発現が可能になり得る。フソソームは、調製前に２時間急性トランスフェクションを受け、それらは、本明細書に記載の方法を使用して得られ、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡがロードされた。
調製後、フソソームを、遠心分離によってペレット化し、フソソーム粒子を、注射用の滅菌リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。フソソームを欠いている緩衝液を、陰性対照として使用した。
フソソームは、前脛骨筋への筋肉内（ＩＭ）投与を介して、９週齢のＦＶＢ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、００１８００）マウスに送達された。溶液は、内容物の継続的な無菌性を確保する方法で処理された。麻酔は、誘導チャンバーで行われ（約４％イソフルラン、効果を得るまで）、ノーズコーンを介して維持され（約２％イソフルラン、効果を得るまで）、動物を温めた（３５℃）手術台に置いた。前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の中央腹部の皮膚を、その領域を脱毛する（４５秒間Ｎａｉｒ Ｈａｉｒ Ｒｅｍｏｖｅｒクリーム、続いて７０％エタノールで領域を洗浄する）ことによって調製した。ツベルクリン注射器を使用して、５０μＬのフソソーム溶液１５μｇのタンパク質／μＬ、平均値（標準誤差））を、ＴＡの腹部に筋肉内注射した。注射が完了したら、注射器を取り外し、注射部位に圧力を加えた。対照と同じ方法を利用して、対側脚を、ＰＢＳで治療した。
送達後、ｍＲＮＡルシフェラーゼは、レシピエント細胞質でルシフェラーゼタンパク質に翻訳する。Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与により、インビボ生物発光イメージングを介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になった。動物を、動物の動きを防ぐためにコーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に配置した。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態的クリアランスによる最大の生物発光シグナルを観察するために、注入後３～３５分間に光子収集が行われた。最大放射輝度は、光子／秒／ｃｍ２／ラジアンで記録される。領域全体の放射輝度を積分する全光束は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内の関心領域（ＲＯＩ）ツールを使用して定量化され、光子／秒で報告される。フソソーム処理およびＰＢＳ処理した前脛骨筋組織を、陰性対照（陰性対照のスレッドなし（胸部）および病期）と比較して、特に放射輝度測定のためにモニタリングした。ホタルルシフェラーゼの存在を観察するために、注射から１、６、１２、２４、および４８時間後に測定が行われた。
図１５Ａ～１５Ｂに示すように、ホタルルシフェラーゼの存在の証拠は、動物のレシピエント組織における生物発光イメージングによって検出された。（Ａ）ＦＶＢマウスのフソソームで処置した（右脚）とＰＢＳで処置した（左脚）の腹部画像および発光シグナル。左側は、画像および発光シグナルのオーバーレイであり、右側は、発光シグナルのみである。（Ｂ）フソソームで処置したＴＡ（黒四角）、ＰＢＳで処置したＴＡ（白丸）、マウスバックグラウンド（黒六角形）、およびステージバックグラウンド（白六角形）の全磁束シグナル。ｙスケールは、ｌｏｇ１０スケールである。フソソームで処置した脚は、処置から１時間後（ｐ＜０．０００１）、６時間後（ｐ＜０．０１）、および１２時間後（ｐ＜０．０１）、著しく大きなシグナルを有した。
実施例１４１：タンパク質のインビトロ送達
フソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。対照粒子（非融合フソソーム）を、ｐｃＤＮＡ３．１が空のベクターで一過性に逆トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成した。次いで、ペイロードを、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に概説されるように、超音波処理によってＶＳＶ－Ｇフソソームにローディングした。この実験では、核酸ペイロードは、ＳＶ４０核局在化配列組換えタンパク質（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２９８Ｍ）を持つバクテリオファージＰ１ Ｃｒｅリコンビナーゼであった。次いで、タンパク質をローディングしたフソソームを使用して、ＣＭＶプロモーターの制御下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞へのペイロード送達を処理し、示した。
簡単に説明すると、２０μｇの標準的なＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約１０６個のフソソームまたは対照粒子（非融合フソソーム）を、５μｇのタンパク質（ＮＥＢ
番号Ｍ０２９８Ｍ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、フソソーム（または対照粒子）／タンパク質混合物を、４０ｋＨｚで操作した水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理した。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間の２回目の超音波処理を行った。次いで、混合物を４℃で５分間１６，０００ｇで遠心分離して、核酸を含むフソソームをペレット化した。組み込まれていないタンパク質を含む上清を除去し、ペレットを３０μＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。タンパク質をローディングした後、ローディングしたフソソーム／対照粒子を、使用前に氷上に保持した。
「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで完全培地中の黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞をプレーティングしてから２４時間後、タンパク質をローディングしたフソソームを、ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に適用した。レシピエント細胞を、８μＬのタンパク質をローディングしたフソソームまたは８μＬのタンパク質をローディングした対照粒子（非融合フソソーム）で処理し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞プレートを、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して画像化される前に、完全培地中で希釈された１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で、３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。レシピエント細胞のＨｏｅｃｈｓｔ蛍光は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＢＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、レシピエント細胞のＧＦＰ蛍光は、４８８ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。レシピエント細胞のＲＦＰ蛍光は、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。ウェル内の細胞の画像は、まず、Ｃｒｅリコンビナーゼゲシクル（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１４４９）で処理したレシピエント細胞を含む陽性対照ウェルのＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、ＲＦＰ、ＧＦＰ、およびＲＦＰ強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。ＢＦＰチャネルでオートフォーカスし、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／を参照）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＧＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、ＲＦＰチャネルに適用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅタンパク質を受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞の合計（総レシピエント細胞）で除算して、超音波処理を介してフソソームにローディングしたＣｒｅタンパク質ペイロードを受容したレシピエント細胞の量を示す、Ｃｒｅタンパク質送達を受けた細胞の割合を定量化した。
このアッセイで、Ｃｒｅタンパク質をローディングしたフソソームは、総ＧＦＰ陽性レシピエント細胞の２７．４±６．８％ＲＦＰの陽性細胞に相当する統計学的に有意なレベルのＣｒｅタンパク質送達を示した（図３５）。未処理のレシピエント細胞またはフソソームのみで処理した細胞、またはタンパク質をローディングした対照粒子は、いかなる感知できるほどのＲＦＰ陽性細胞も示さなかった。
実施例１４２：タンパク質のインビボ送達（ＢｉＶｓ－Ｃｒｅゲシクル）
この実施例は、フソソームによる筋肉への治療剤の送達について説明する。フソソームは、本明細書に記載の方法を使用して得られ、ＣＲＥ－リコンビナーゼタンパク質がロードされた。
フソソームは、前脛骨筋への筋肉内（ＩＭ）投与を介して、Ｌｏｘｐルシフェラーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、００５１２５）マウスに送達された。溶液は、内容物の継続的な無菌性を確保する方法で処理された。麻酔は、誘導チャンバーで誘導され（約４％イソフルラン、効果を得るまで）、ノーズコーンを介して維持され（約２％イソフルラン、効果を得るまで）、動物を温めた（３５℃）手術台に置いた。前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の中央腹部の皮膚を、その領域を脱毛する（４５秒間Ｎａｉｒ Ｈａｉｒ Ｒｅｍｏｖｅｒクリーム、続いて７０％エタノールで領域を洗浄する）ことによって調製した。ツベルクリン注射器を使用して、５０μＬのフソソーム溶液（８．５ｅ８±１．４ｅ８粒子／μＬ、平均値（標準誤差））を、ＴＡの腹部に筋肉内注射した。注射が完了したら、注射器を取り外し、注射部位に圧力を加えた。対側脚は、処置しなかった。
融合後、ＣＲＥタンパク質は、核に移動して組換えを実行し、ルシフェラーゼの構成的発現をもたらした。Ｄ－ルシフェリン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、１５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与により、インビボ生物発光イメージングを介したルシフェラーゼ発現の検出が可能になった。動物を、動物の動きを防ぐためにコーン麻酔器（イソフルラン）を収容するインビボ生物発光イメージングチャンバー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に配置した。Ｄ－ルシフェリンの薬物動態的クリアランスによる最大の生物発光シグナルを観察するために、注入後３～３５分間に光子収集が行われた。最大放射輝度は、光子／秒／ｃｍ２／ラジアンで記録される。領域全体の放射輝度を積分する全光束は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）内の関心領域（ＲＯＩ）ツールを使用して定量化され、光子／秒で報告される。フソソーム処理した前脛骨筋組織を、陰性対照（陰性対照のスレッドなし（胸部）、対側後肢、および病期）と比較して、特に放射輝度測定のためにモニタリングした。ホタルルシフェラーゼの存在を観察するために、注射から１４日目に測定が行われた。
図３６Ａ～３６Ｂに示すように、フソソームによるタンパク質（Ｃｒｅリコンビナーゼ）送達の証拠は、動物のレシピエント組織での生物発光イメージングによって検出された。
実施例１４３：フソソームにおける核酸の超音波処理を媒介したローディング
フソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。次いで、核酸ペイロードを、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に概説されるように、超音波処理によってＶＳＶ－Ｇフソソームにローディングした。この実験では、核酸ペイロードは、蛍光タンパク質ｍｉＲＦＰ６７０をコードするＤＮＡプラスミドであった。次いで、核酸をローディングしたフソソームを使用して、ＣＭＶプロモーターの制御下で「Ｌｏｘｐ－ＢＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－Ｃｌｏｖｅｒ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞へのペイロード送達を処理し、示した。
簡単に説明すると、５０μｇの標準的なＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約１０６個のフソソームを、１０μｇの核酸と混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、フソソーム／核酸の混合物を、４０ｋＨｚで操作した水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理した。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間の２回目の超音波処理を行った。次いで、混合物を４℃で５分間１６，０００ｇで遠心分離して、核酸を含むフソソームをペレット化した。組み込まれていない核酸を含む上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。ＤＮＡをローディグした後、ローディグしたフソソームを、使用前に氷上に保持した。
「Ｌｏｘｐ－ＢＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－Ｃｌｏｖｅｒ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞を播種してから４～６時間後、ＤＮＡをローディングしたフソソームを、ＤＭＥＭ培地中で標的または非標的のレシピエント細胞に適用した。レシピエント細胞を、４μｇのＤＮＡをローディングしたフソソームで処理し、３７℃および５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化した。レシピエント細胞のＢＦＰ蛍光は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＢＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。レシピエント細胞のクローバー蛍光は、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、一方、ｍｉＲＦＰ６７０は、６２３ｎｍのＬＥＤおよびＣｙ５フィルターキューブを使用して画像化された。細胞のウェルの画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、ＢＦＰ、クローバー、およびｍｉＲＦＰ６７０強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。ＢＦＰチャネルでオートフォーカスし、クローバーおよびｍｉＲＦＰ６７０チャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ｍｉＲＦＰ６７０陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／を参照）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＢＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＢＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、クローバーおよびｍｉＲＦＰ６７０チャネルに適用された。次いで、ｍｉＲＦＰ６７０陽性細胞（ｍｉＲＦＰ６７０ ＤＮＡプラスミドを受容したレシピエント細胞）の数を、ＢＦＰ陽性細胞の合計（総レシピエント細胞）で除算して、超音波処理を介してフソソームにローディングしたｍｉＲＦＰ６７０ペイロードを受容したレシピエント細胞の量を示す、ｍｉＲＦＰ６７０ ＤＮＡ送達の割合を定量化した。
このアッセイで、ｍｉＲＦＰ６７０ ＤＮＡをローディングしたフソソームは、総ＢＦＰ陽性レシピエント細胞の２．９±０．４％のｍｉＲＦＰ６７０陽性細胞に相当する観察可能なレベルのｍｉＲＦＰ６７０送達を示した（図３７）。ｍｉＲＦＰ６７０ ＤＮＡのみ、フソソームのみ、または超音波処理したフソソームのみで処理したレシピエント細胞は、（０．５％未満と定義）いかなる感知できるほどのｍｉＲＦＰ６７０陽性細胞も示さなかった。
実施例１４４：フソソームにおける超音波処理を媒介したタンパク質のローディング
フソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現し、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。次いで、タンパク質ペイロードを、Ｌａｍｉｃｈｈａｎｅ，ＴＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｖｉａ Ａｃｔｉｖｅ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｉｎｔｏ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，（２０１６）に概説されるように、超音波処理によってＶＳＶ－Ｇフソソームにローディングした。この実験では、タンパク質ペイロードは、蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＢＳＡ－ＡＦ６４７；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ３４７８５）にコンジュゲートしたウシ血清アルブミンタンパク質であった。次いで、タンパク質をローディングしたフソソームを使用して、ＣＭＶプロモーター下で「Ｌｏｘｐ－ＢＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－Ｃｌｏｖｅｒ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞へのペイロード送達を処理し、示した。
簡単に説明すると、５０μＬの標準的なＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約１０６個のフソソームを、１０μｇのＢＳＡ－ＡＦ６４７と混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、フソソーム／タンパク質の混合物を、４０ｋＨｚで操作した水浴ソニケーター（Ｂｒａｓｏｎモデル番号１５１０Ｒ－ＤＴＨ）を使用して、室温で３０秒間超音波処理した。次いで、混合物を氷上に１分間置き、続いて４０ｋＨｚで３０秒間の２回目の超音波処理を行った。次いで、混合物を４℃で５分間１６，０００ｇで遠心分離して、ＢＳＡ－ＡＦ６４７を含むフソソームをペレット化した。組み込まれていないタンパク質を含む上清を除去し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。タンパク質をローディグした後、ローディグしたフソソームを、使用前に氷上に保持した。
「Ｌｏｘｐ－ＢＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－Ｃｌｏｖｅｒ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞を播種してから４～６時間後、ＢＳＡ－ＡＦ６４７をローディングしたフソソームを、ＤＭＥＭ培地中で標的または非標的のレシピエント細胞に適用した。レシピエント細胞を、４μＬのＢＳＡ－ＡＦ６４７をローディングしたフソソームで処理し、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞プレートを画像化した。レシピエント細胞のＢＦＰ蛍光は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＢＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。レシピエント細胞のクローバー蛍光は、４６５ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化され、一方、ＢＳＡ－ＡＦ６４７は、６２３ｎｍのＬＥＤおよびＣｙ５フィルターキューブを使用して画像化された。細胞のウェルの画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、フソソームの代わりにＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスで処理されたレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、ＢＦＰ、クローバー、およびＢＳＡ－ＡＦ６４７強度が最大ピクセル強度値であるが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。ＢＦＰチャネルでオートフォーカスし、クローバーおよびＢＳＡ－ＡＦ６４７チャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＢＳＡ－ＡＦ６４７陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／を参照）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＢＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＢＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、クローバーおよびＢＳＡ－ＡＦ６４７チャネルに適用された。次いで、ＢＳＡ－ＡＦ６４７陽性細胞（ＢＳＡ－ＡＦ６４７タンパク質を受容したレシピエント細胞）の数を、ＢＦＰ陽性細胞の合計（総レシピエント細胞）で除算して、超音波処理を介してフソソームにローディングしたＢＳＡ－ＡＦ６４７タンパク質を受容したレシピエント細胞の量を示す、ＢＳＡ－ＡＦ６４７送達の割合を定量化した。
このアッセイで、ＢＳＡ－ＡＦ６４７をローディングしたフソソームは、総ＢＦＰ陽性レシピエント細胞の４３．２±０．２％ＢＳＡ－ＡＦ６４７の陽性細胞に相当する観察可能なレベルのＢＳＡ－ＡＦ６４７送達を示した（図３８）。ＢＳＡ－ＡＦ６４７タンパク質のみ、フソソームのみ、または超音波処理したフソソームのみで処理したレシピエント細胞は、（０．５％未満と定義された）いかなる感知できるほどのＢＳＡ－ＡＦ６４７陽性細胞も示さなかった。
実施例１４５：フソソームゴーストの生成および単離
この実施例は、低張処理および遠心分離を介したフソソームゴーストの生成および単離について説明する。これは、フソソームが生成され得る方法のうちの１つである。
フソソームゴーストは、本明細書に記載されるように、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から作製された。フソソームゴーストは、作製され、蛍光ナノ粒子追跡分析（ｆＮＴＡ）によって分析された。
フソソームは、以下のように調製された。９．２×１０６個のＨＥＫ－２９３Ｔを、１００ｍｍのコラーゲンコーティング皿に、ポリマートランスフェクション試薬を使用して、ＶＳＶｇのオープンリーディングフレームを含有する１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド、ならびに７．５ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋１倍のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中の１５μｇのｐｃＤＮＡ３．１が空の発現プラスミドで、逆トランスフェクトした。フソソームゴーストを生成するために、トランスフェクションから２４時間後に、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＴｒｙＰＬＥで解離し、５００ｘｇで５分間遠心分離し、培地に再懸濁した。１×１０７個の細胞を、７ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、５００ｘｇで５分間の遠心分離を介してペレット化した。細胞を、冷ＴＭ緩衝液（１０ｍＭのトリス、１．６ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）に再懸濁し、２７％振幅で５秒間超音波処理した（ＣｏｌｅＰａｒｍｅｒカタログ番号ＣＰＸ１３０）。超音波処理の直後に、スクロース（６０ｗ／ｖ％）を含むＴＭ緩衝液を、０．２５Ｍのスクロースの最終濃度で溶液に添加した。次いで、溶液を、６，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを０．２５ＭのスクロースＴＭ緩衝液、ｐＨ７．４で２回洗浄した。次いで、ペレットを、０．２５ＭのスクロースＴＭ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁し、再懸濁したペレットを、２７％振幅で５秒間超音波処理した（ＣｏｌｅＰａｒｍｅｒカタログ番ＣＰＸ１３０）。次いで、溶液を、６，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを０．２５ＭのスクロースＴＭ緩衝液、ｐＨ７．４で２回洗浄した。次いで、ペレットを、０．２５ＭのスクロースＴＭ緩衝液、ｐＨ７．４に再懸濁し、再懸濁したペレットを、２７％振幅で２分間超音波処理した（ＣｏｌｅＰａｒｍｅｒカタログ番ＣＰＸ１３０）。次いで、溶液を、８００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過した。
最後に、フソソームゴーストを濃縮するために、溶液を、１５０，０００ｘｇ、４℃で４５分間超遠心分離し、フソソームゴーストを含むペレットを、ＰＢＳに再懸濁した。ｆＮＴＡを介してフソソームゴースト組成物を分析するために、フソソームゴーストを、ＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と１：１でインキュベートし、追跡機にローディングする前に１：１０００に希釈して、製造業者の取扱説明書に従って分析した。フソソームゴーストのサイズ分布を、図３９に示す。フソソームは、ＶＳＶ－Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞からゴーストを調製することによって作製が成功した。
実施例１４６：フソソームにおける翻訳活性の欠如
フソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。対照粒子（非融合フソソーム）を、ｐｃＤＮＡ３．１が空のベクターで一過性に逆トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成した。次いで、フソソームの翻訳活性を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵイメージングキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用することによって、フソソームの生成に使用される、親細胞、例えば供給源細胞と比較した。
簡単に説明すると、６０μＬの標準のＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約３×１０６個のフソソーム、およびフソソームを生成するために使用される１×１０６個の親細胞を、１ｍＭの蛍光標識可能なアルキンヌクレオシドＥｄＵを含む完全な６ウェルの低付着マルチウェルの１ｍＬの完全培地中に、３７℃、５％ＣＯ２で４時間、３重に播種した。陰性対照のために、３×１０６個のフソソームを、完全培地中でアルキンヌクレオシドＥｄＵを含まない６ウェル低付着マルチウェルプレートに播種した。４時間のインキュベーション後、製造業者の取扱説明書（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、試料を処理した。簡単に説明すると、陰性対照を含む細胞およびフソソーム試料を、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、６３８ｎｍの励起レーザーおよび６７０＋／－１４ｎｍのフィルター発光を使用してフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって分析した（表Ｍ）。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴソフトウェアを、取得およびＦｌｏｗＪｏを使用した分析のために使用した。データ取得のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、６７０＋／－１４ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。細胞またはフソソームゲート内の最小１０，０００の事象が、各条件で収集された。
データ分析のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、６７０＋／－１４ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。陰性対照６７０＋／－１４ｎｍの発光を使用して、ゲートが１％未満の陽性を含むようにヒストグラム上にゲートを配置する場所を決定した。上記の分析基準を使用して、新規に合成したＤＮＡにＥｄｕを含めることによる翻訳活性の代替的測定値として、親細胞は、５６．１７％±８．１３ Ｅｄｕ：６４７事象を示し、一方、フソソームは、６．２３％±４．６５ ＡＦ４８８事象を示した（図４０、左パネル）。Ｅｄｕの取り込みの測定値である、ＡＦ６４７の蛍光強度の中央値、したがって、新規に合成したＤＮＡの相対的測定値は、親細胞では１３１１±４２６．２の事象であり、フソソームでは１１６．６±４０．７４であった（図４０、右パネル）。これは、フソソームが親細胞と比較して翻訳活性がないことを示す。
Figure 2023153260000028
実施例１４７：可動性のためにアクチンを重合する能力の測定
フソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。対照粒子（非融合フソソーム）を、ｐｃＤＮＡ３．１が空のベクターで一過性に逆トランスフェクトしたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成した。次いで、フソソームおよび親細胞を、ローダミンファロイジンフローサイトメトリーアッセイおよびチューブリンＥＬＩＳＡを使用して、アクチンを重合する能力について（経時的に）アッセイした。簡単に説明すると、６０μＬの標準のＶＳＶ－Ｇフソソーム調製物に対応する約１×１０６個のフソソーム、およびフソソームを生成するために使用される１×１０５個の親細胞を、完全な９６ウェルの低付着マルチウェルの１ｍＬの完全培地中に、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。播種してから３時間、５時間、および２４時間後に、試料を、定期的に採取した。試料を、２１，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水中の２００ｕＬの４（ｖ／ｖ）％ＰＦＡに１０分間再懸濁し、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２１，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、再度洗浄し、さらに使用するまで４℃で保存した。
ローダミン－ファロイジン染色では、試料を、２１，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水中の１００ｕＬの０．１（ｖ／ｖ）％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で２０分間インキュベートした。２０分間のインキュベーション後、１６５μＭのローダミン－ファロイジンを含有するリン酸緩衝生理食塩水中の追加の１００ｕＬの０．１（ｖ／ｖ）％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を試料に添加し、ピペット混合し、陰性対照を得、１００ｕＬの０．１（ｖ／ｖ）％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（リン酸緩衝生理食塩水のみ）を添加した。試料を４５分間インキュベートした後、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２１，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、再度洗浄し、３００ｕＬのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、下表に示すように、５６１ｎｍの励起レーザーおよび５８５＋／－１６ｎｍのフィルター発光を使用してフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって分析した。
フローサイトメーターの設定
Figure 2023153260000029
Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴソフトウェアを、取得およびＦｌｏｗＪｏを使用した分析のために使用した。データ取得のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、５８５＋／－１６ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。細胞またはフソソームゲート内の最小１０，０００の事象が、各条件で収集された。データ分析のために、細胞またはフソソームを示す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、このゲート内の事象のみを使用して、５８５＋／－１６ｎｍの発光チャネルの事象を対数スケールで表示した。陰性対照５８５＋／－１６ｎｍの発光を使用して、ゲートが１％未満の陽性を含むようにヒストグラム上にゲートを配置する場所を決定した。上記の分析基準を使用して、親細胞は、３時間、５時間、および２４時間の時点で、それぞれ、１９．９％、２４．８％、および８２．５％のローダミン－ファロイジン陽性事象を示した。フソソームは、３時間、５時間、および２４時間の時点で、それぞれ、４４．６％、４１．９％、および３４．９％のローダミン－ファロイジンであった（図１４Ｄ）。この実施例は、フソソームは経時的にアクチンの量が増加しないが、一方、親細胞はその量が増加することを示す。
実施例１４８：レシピエント細胞組成物の免疫原性
１．ＩｇＧおよびＩｇＭ応答
この実施例は、フローサイトメトリーを使用してレシピエント細胞（フソソームと融合した細胞）に対する抗体価の定量化について説明する。レシピエント細胞の免疫原性の基準は、抗体応答である。レシピエント細胞を認識する抗体は、細胞の活性または寿命を制限することができる方法で結合することができる。一実施形態において、レシピエント細胞は、抗体応答によって標的化されないか、または抗体応答は参照レベル未満であろう。
この実施例では、対象（例えば、ヒト、ラット、またはサル）における抗レシピエント細胞抗体力価が、試験される。さらに、プロトコルは、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させ得る。この実施例では、標的レシピエント細胞は、ＣＤ３＋細胞である。
マウスは、この出願に記載される方法のうちのいずれかを介して生成されたフソソームまたはＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処置される。最終処置から２８日後、フソソームを施したマウスおよびＰＢＳ処置を施したマウスから末梢血を採血する。血液を、５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに収集し、凝固を防ぐために直ちに混合する。チューブを、氷上に保持し、緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して赤血球を除去する。細胞を、ウシ血清アルブミンで１０分間ブロックした後、マウスＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：１１－００３２－８２）で、４℃で３０分間暗所で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、４８８ｎｍの励起レーザーおよび５３０＋／－３０ｎｍで収集した発光を用いて、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行する。ＣＤ３＋細胞を、選別する。
次いで、選別したＣＤ３＋細胞は、４℃で４５分間、マウスＩｇＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のＦｃ部分に特異的なＰＥ共役ヤギ抗体で反応混合物をインキュベートすることによってＩｇＭ抗体で染色される。特に、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２二次抗体も使用してもよい。すべての群からの細胞を、２％ＦＣＳを含むＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析する。蛍光データは、対数増幅を使用して収集され、平均蛍光強度として表される。平均蛍光強度は、フソソームで処置したマウスおよびＰＢＳで処置したマウスからの選別したＣＤ３細胞について計算される。
低い平均蛍光強度は、レシピエント細胞に対する体液性応答が低いことを示す。ＰＢＳで処置したマウスは、平均蛍光強度が低いと予想される。一実施形態において、平均蛍光強度は、フソソームで処置したマウスおよびＰＢＳで処置したマウスからのレシピエント細胞と同様であろう。
２．マクロファージの食作用
この実施例は、貪食アッセイによるレシピエント細胞に対するマクロファージ応答の定量化について説明する。
レシピエント細胞の免疫原性の基準は、マクロファージ応答である。マクロファージは、食作用に関与し、細胞を貪食し、細菌または死細胞などの外来侵入者の隔離および破壊を可能にする。いくつかの実施形態において、マクロファージによるレシピエント細胞の食作用は、それらの活性を低下させ得る。
一実施形態において、レシピエント細胞は、マクロファージによって標的化されない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するマクロファージ応答が、試験される。さらに、プロトコルは、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させ得る。この実施例では、標的レシピエント細胞は、ＣＤ３＋細胞である。
マウスは、この出願に記載される方法のうちのいずれかを介して生成されたフソソームまたはＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処置される。最終処置から２８日後、フソソームを施したマウスおよびＰＢＳ処置を施したマウスから末梢血を採血する。血液を、５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに収集し、凝固を防ぐために直ちに混合する。チューブを、氷上に保持し、緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して赤血球を除去する。
細胞を、ウシ血清アルブミンで１０分間ブロックした後、マウスＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号：１１－００３２－８２）で、４℃で３０分間暗所で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、４８８ｎｍの励起レーザーおよび５３０＋／－３０ｎｍで収集した発光を用いて、ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行する。次いで、ＣＤ３＋細胞を、選別する。
食作用アッセイは、以下のプロトコルに従ってマクロファージ媒介性免疫クリアランスを評価するために実行される。マクロファージを、共焦点ガラス底皿に収穫直後に播種する。マクロファージを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓで１時間インキュベートして付着させる。フソソームおよびＰＢＳを施したマウスに由来する適切な数の選別およびＦＩＴＣ染色ＣＤ３＋細胞を、プロトコルに示されているようにマクロファージに添加し、例えば、ｔｏｏｌｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｍｐ０６６９４．ｐｄに記載されるように２時間インキュベートする。
２時間後、皿を静かに洗浄し、細胞内蛍光を試験する。マクロファージを特定するために、細胞を、まず、Ｆｃ受容体ブロッキング抗体（ｅＢｉｏｓｃｅｎｃｅカタログ番号１４－０１６１－８６、クローン９３）で氷上で１５分間インキュベートして、マクロファージに豊富に発現されるＦｃ受容体への標識ｍＡｂの結合をブロックする。このステップの後、抗Ｆ４／８０－ＰＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１２－４８０１－８２、クローンＢＭ８）および抗ＣＤ１１ｂ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５０９９３、クローンＭ１／７０）コンジュゲート抗体を添加して、マクロファージ表面抗原を染色する。細胞を、４℃で３０分間、暗所でインキュベートし、続いて、遠心分離し、ＰＢＳで洗浄する。次いで、細胞を、ＰＢＳに再懸濁する。次いで、試料のフローサイトメトリーを実行し、５３３ｎｍおよび６４７ｎｍの励起レーザーをそれぞれ使用して、Ｆ４／８０－ＰＥおよびＣＤ１１ｂ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５の陽性蛍光シグナルを介してマクロファージを特定する。マクロファージのゲーティング後、飲み込まれたレシピエント細胞から発光される細胞内蛍光は、４８８ｎｍのレーザー励起によって評価される。食作用陽性のマクロファージの数は、イメージングソフトウェアを使用して定量化される。データは、食細胞指数＝（取り込まれた細胞の総数／計数されたマクロファージの総数）×（取り込まれた細胞を含むマクロファージの数／計数されたマクロファージの総数）×１００として表される。
食作用指数が低いことは、食作用が低いことと、マクロファージによる標的化を示す。ＰＢＳで処置したマウスは、食作用指数が低いと予想される。一実施形態において、食作用指数は、フソソームで処置したマウスおよびＰＢＳで処置したマウスに由来するレシピエント細胞と同様であろう。
３．ＰＢＭＣ溶解により測定された細胞毒性
この実施例は、細胞溶解アッセイによるレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答の定量化について説明する。
レシピエント細胞の免疫原性の基準は、ＰＢＭＣ応答である。一実施形態において、溶解はフソソームの活性を低下させる、例えば阻害または停止するので、ＰＢＭＣによるレシピエント細胞の細胞毒性媒介性細胞溶解は、免疫原性の基準である。
一実施形態において、レシピエント細胞は、ＰＢＭＣ応答を引き起こさない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するＰＢＭＣ応答が、試験される。
さらに、プロトコルは、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させ得る。この実施例では、標的レシピエント細胞は、ＣＤ３＋細胞である。
マウスは、この出願に記載される方法のうちのいずれかを介して生成されたフソソームまたはＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処置される。最終処置から２８日後、フソソームを施したマウスおよびＰＢＳ処置を施したマウスから末梢血を採血する。血液を、５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに収集し、凝固を防ぐために直ちに混合する。チューブを、氷上に保持し、緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して赤血球を除去する。細胞を、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号４２０２０１）でＦｃで１０分間ブロック（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号：１０１３１９）した後、マウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号１００３３０）またはアイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７）抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号４００２３０）で、４℃で３０分間暗所で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、６４０ｎｍのレーザー励起および７８０＋／－６０ｎｍで収集した発光を用いて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行して、アイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体標識細胞を使用して陰性ゲートを設定し、ＡＰＣ－Ｃｙ７陽性細胞を選別し、収集する。次いで、選別したＣＤ３＋細胞は、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎ（ＣＭＧ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｃ３７６０８）、または陰性対照としてＤＭＳＯで標識される。
フソームまたはＰＢＳで処置したマウスからＣＤ３＋細胞を単離する７日前に、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ （２０）：１５４７－１５５９；２０１１の方法に従って、フソソームまたはＰＢＳで処置したマウスからＰＢＭＣを単離し、ＩＬ－２組換えマウスタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４０２－ＭＬ－０２０）およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１４５６Ｄ）の存在下で、丸底９６ウェルプレート中で、３７℃で７日間模擬実験した。７日目に、模擬実験したＰＢＭＣを、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲内のＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞の播種比で、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＣＤ３＋／ＤＭＳＯ９６対照細胞で同時インキュベートする。一連のウェルの陰性対照は、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋およびＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞のみを受容し、ＰＢＭＣは受容し得ない。インキュベーション後、プレートを、遠心分離して処理し、そのため、上記のようにマウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体またはＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体のいずれかで標識する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＡＰＣ－Ｃｙ７：６４０ｎｍのレーザー励起／７８０－／＋６０ｎｍで収集した発光、およびＣＭＧ ５６１ｎｍのレーザー励起／５８５－／＋１６ｎｍで収集した発光）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行する。次いで、ＦＳＣ／ＳＳＣ事象データは、まず、「細胞」というラベルを付けた事象のゲートを設定するために使用され得る。次いで、この「細胞」ゲートを使用して、事象を示し、ＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７／ＤＭＳＯのみでラベルを付けた試料を分析する６４０ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザーのＰＭＴ電圧を設定する。この試料はまた、ＡＰＣ－Ｃｙ７およびＣＭＧの両方の陰性細胞のゲートを設定するためにも使用され得る。次いで、いかなるＰＢＭＣも施さなかっ
たＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞を使用して、ＣＤ３＋およびＣＭＧ＋細胞の陽性ゲートを設定し得る。
データは、総細胞集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合を調べることによって分析される。処置群を比較すると、ＰＢＭＣ：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所与のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞の溶解を示す。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋の割合は、フソソームで処置したマウスおよびＰＢＳで処置したマウスに由来するレシピエント細胞と同様であろう。
４．ＮＫ細胞の標的化
この実施例は、細胞溶解アッセイによるレシピエント細胞に対するナチュラルキラー細胞応答の定量化について説明する。
レシピエント細胞の免疫原性の基準は、ナチュラルキラー細胞の応答である。一実施形態において、溶解はフソソームの活性を低下させる、例えば阻害または停止するので、ナチュラルキラー細胞によるレシピエント細胞の細胞毒性媒介性細胞溶解は、免疫原性の基準である。
一実施形態において、レシピエント細胞は、ナチュラルキラー細胞の応答を引き起こさない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するナチュラルキラー応答が、試験される。さらに、プロトコルは、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させ得る。この実施例では、標的レシピエント細胞は、ＣＤ３＋細胞である。
マウスは、この出願に記載される方法のうちのいずれかを介して生成されたフソソームまたはＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処置される。最終処置から２８日後、フソソームを施したマウスおよびＰＢＳ処置を施したマウスから末梢血を採血する。血液を、５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに収集し、凝固を防ぐために直ちに混合する。チューブを、氷上に保持し、緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して赤血球を除去する。細胞を、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号４２０２０１）でＦｃで１０分間ブロック（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号１０１３１９）した後、マウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号１００３３０）またはアイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号４００２３０）で、４℃で３０分間暗所で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、６４０ｎｍのレーザー励起および７８０＋／－６０ｎｍで収集した発光を用いて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行して、アイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体標識細胞を使用して陰性ゲートを設定し、ＡＰＣ－Ｃｙ７陽性細胞を選別し、収集する。選別したＣＤ３＋細胞は、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎ（ＣＭＧ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｃ３７６０８）で標識される。
フソームまたはＰＢＳで処置したマウスからＣＤ３＋細胞を単離する７日前に、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ （２０）：１５４７－１５５９；２０１１の方法に従って、フソソームまたはＰＢＳで処置したマウスからＮＫ細胞を単離し、ＩＬ－２組換えマウスタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４０２－ＭＬ－０２０）およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１４５６Ｄ）の存在下で、丸底９６ウェルプレート中で、３７℃で７日間模擬実験した。７日目に、模擬実験したＮＫ細胞を、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲内のＮＫ細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＮＫ細胞：ＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞の播種比で、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＣＤ３＋／ＤＭＳＯ９６対照細胞で同時インキュベートする。一連のウェルの陰性対照は、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋およびＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞のみを受容し、ＮＫ細胞は受容し得ない。インキュベーション後、プレートを、遠心分離して処理し、そのため、上記のようにマウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体またはＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体のいずれかで標識する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＡＰＣ－Ｃｙ７：６４０ｎｍのレーザー励起／７８０－／＋６０ｎｍで収集した発光、およびＣＭＧ ５６１ｎｍのレーザー励起／５８５－／＋１６ｎｍで収集した発光）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行する。次いで、ＦＳＣ／ＳＳＣ事象データは、まず、「細胞」というラベルを付けた事象のゲートを設定するために使用され得る。次いで、この「細胞」ゲートを使用して、事象を示し、ＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７／ＤＭＳＯのみでラベルを付けた試料を分析する６４０ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザーのＰＭＴ電圧を設定する。この試料はまた、ＡＰＣ－Ｃｙ７およびＣＭＧの両方の陰性細胞のゲートを設定するためにも使用され得る。次いで、いかなるＮＫ細胞も施さなかったＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞を使用して、ＣＤ３＋およびＣＭＧ＋細胞の陽性ゲートを設定し得る。
データは、総細胞集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合を調べることによって分析される。処置群を比較すると、ＮＫ細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所与のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞の溶解を示す。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋の割合は、フソソームで処置したマウスおよびＰＢＳで処置したマウスに由来するレシピエント細胞と同様であろう。
５．ＣＤ８ Ｔ細胞溶解
この実施例は、細胞溶解アッセイによるレシピエント細胞（フソソームと融合した細胞）に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の定量化について説明する。
レシピエント細胞の免疫原性の基準は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答である。一実施形態において、溶解はフソソームの活性を低下させる、例えば阻害または停止するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるレシピエント細胞の細胞毒性媒介性細胞溶解は、免疫原性の基準である。
一実施形態において、レシピエント細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を引き起こさない。この実施例では、対象におけるレシピエント細胞に対するＣＤ８＋Ｔ応答が、試験される。さらに、プロトコルは、適切な表面マーカーが存在する任意の細胞型に適合させ得る。この実施例では、標的レシピエント細胞は、ＣＤ３＋細胞である。
マウスは、この出願に記載される方法のうちのいずれかを介して生成されたフソソームまたはＰＢＳ（陰性対照）で５日間毎日処置される。最終処置から２８日後、フソソームを施したマウスおよびＰＢＳ処置を施したマウスから末梢血を採血する。血液を、５μＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのＰＢＳに収集し、凝固を防ぐために直ちに混合する。チューブを、氷上に保持し、緩衝塩化アンモニウム（ＡＣＫ）溶液を使用して赤血球を除去する。細胞を、細胞染色緩衝液（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号４２０２０１）でＦｃで１０分間ブロック（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号１０１３１９）した後、マウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号１００３３０）またはアイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄカタログ番号４００２３０）で、４℃で３０分間暗所で染色する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、６４０ｎｍのレーザー励起および７８０＋／－６０ｎｍで収集した発光を用いて、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行して、アイソタイプ対照ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体標識細胞を使用して陰性ゲートを設定し、ＡＰＣ－Ｃｙ７陽性細胞を選別し、収集する。選別したＣＤ３＋細胞は、ＣｅｌｌＭａｓｋ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎ（ＣＭＧ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号Ｃ３７６０８）で標識される。
フソームまたはＰＢＳで処置したマウスからＣＤ３＋細胞を単離する７日前に、Ｃｒｏｐ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０）：１５４７－１５５９；２０１１の方法に従って、フソソームまたはＰＢＳで処置したマウスからＣＤ８＋細胞を単離し、ＩＬ－２組換えマウスタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４０２－ＭＬ－０２０）およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１４５６Ｄ）の存在下で、丸底９６ウェルプレート中で、３７℃で７日間模擬実験した。７日目に、模擬実験したＣＤ８＋細胞を、１０００：１～１：１および１：１．２５～１：１０００の範囲内のＣＤ８＋細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＣＤ８＋細胞：ＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞の播種比で、１、２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、２４、４８時間、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋またはＣＤ３＋／ＤＭＳＯ９６対照細胞で同時インキュベートする。一連のウェルの陰性対照は、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋およびＣＤ３＋／ＤＭＳＯ対照細胞のみを受容し、ＣＤ８＋細胞は受容し得ない。インキュベーション後、プレートを、遠心分離して処理し、そのため、上記のようにマウスＣＤ３：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体またはＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７抗体のいずれかで標識する。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＡＰＣ－Ｃｙ７：６４０ｎｍのレーザー励起／７８０－／＋６０ｎｍで収集した発光、およびＣＭＧ ５６１ｎｍのレーザー励起／５８５－／＋１６ｎｍで収集した発光）で分析し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を実行する。次いで、ＦＳＣ／ＳＳＣ事象データは、まず、「細胞」というラベルを付けた事象のゲートを設定するために使用され得る。次いで、この「細胞」ゲートを使用して、事象を示し、ＩＣ：ＡＰＣ－Ｃｙ７／ＤＭＳＯのみでラベルを付けた試料を分析する６４０ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザーのＰＭＴ電圧を設定する。この試料はまた、ＡＰＣ－Ｃｙ７およびＣＭＧの両方の陰性細胞のゲートを設定するためにも使用され得る。次いで、いかなるＣＤ８＋細胞も施さなかったＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞を使用して、ＣＤ３＋およびＣＭＧ＋細胞の陽性ゲートを設定し得る。
データは、総細胞集団におけるＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合を調べることによって分析される。処置群を比較すると、ＣＤ８＋細胞：ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の任意の所与のアッセイ比でのＣＤ３＋／ＣＭＧ＋細胞の割合が比較的低いことは、レシピエント細胞の溶解を示す。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＭＧ＋の割合は、フソソームで処置したマウスおよびＰＢＳで処置したマウスに由来するレシピエント細胞と同様であろう。
実施例１４９：フソソーム中のＧＡＰＤＨの測定
この実施例は、フソソームのグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベル、および親細胞と比較したフソソームのＧＡＰＤＨの相対レベルの定量化について説明する。フソソームは、実施例１１４および１５４に記載されるように調製された。
ＧＡＰＤＨは、製造業者の取扱説明書に従って、ＧＡＰＤＨの標準的な市販のＥＬＩＳＡ（ａｂ１７６６４２、Ａｂｃａｍ）を使用して、親細胞およびフソソームで測定された。総タンパク質レベルは、ビシンコニン酸アッセイを介して同様に測定された。測定されたＧＡＰＤＨおよびタンパク質レベルを、以下の表に示す。
Figure 2023153260000030
 ＧＡＰＤＨ：総タンパク質の比も、図４１に示す。
実施例１５０：フソソーム中の脂質とタンパク質の比
この実施例は、フソソーム中の脂質質量とタンパク質質量の比の定量化について説明する。フソソームが、有核細胞の脂質質量とタンパク質質量の比が類似する脂質質量とタンパク質質量の比を有し得ると企図される。フソソームおよび親細胞は、本明細書の実施例１１４および１５４に記載されるように調製された。
脂質含有量は、製造業者の取扱説明書に従って、市販のリン脂質アッセイキット（ＭＡＫ１２２ Ｓｉｇｍａ Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、総脂質のサブセットとしてコリン含有リン脂質を使用して計算された。フソソームの総タンパク質含有量は、本明細書に記載のビシンコニン酸アッセイを介して測定された。測定したリン脂質レベル、タンパク質レベル、およびリン脂質とタンパク質の比率を、図４２および下の表に示す。
Figure 2023153260000031
実施例１５１：フソソーム中のタンパク質とＤＮＡの比
この実施例は、フソソーム中のタンパク質質量とＤＮＡ質量の比の定量化について説明する。フソソームが、細胞のタンパク質質量とＤＮＡ質量の比よりもはるかに大きいタンパク質質量とＤＮＡ質量の比を有し得ると企図される。フソソームは、実施例１１４および１５４に記載されるように調製された。
フソソームおよび細胞の総タンパク質含有量は、本明細書に記載のビシンコニン酸を介して測定された。フソソームおよび細胞のＤＮＡ質量は、製造業者の取扱説明書に従って市販の単離キット（番号６９５０４ Ｑｉａｇｅｎ Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して全ＤＮＡを抽出した後、２８０ｎｍでの吸収によって測定された。タンパク質と総核酸の比は、総タンパク質含有量を総ＤＮＡ含有量で除算することによって決定され、典型的なフソソーム調製物の所定の範囲内の比が得られた。測定したタンパク質レベル、ＤＮＡレベル、およびタンパク質とＤＮＡの比率を、図４３および下の表に示す。
Figure 2023153260000032
実施例１５２：フソソーム中の脂質とＤＮＡの比
この実施例は、親細胞と比較したフソソーム中の脂質とＤＮＡの比の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して脂質とＤＮＡの比がより大きい。フソソームは、実施例１１４および１５４に前述されたように調製された。
この比率は、実施例４９に概説されている脂質含有量として定義され、核酸含有量は、実施例５０に記載されるように決定される。測定した脂質レベル、ＤＮＡレベル、および脂質とＤＮＡの比率を、図４４および下の表に示す。
Figure 2023153260000033
実施例１５３：ダイナミン媒介経路を介したフソソームの送達
この実施例は、ダイナミン媒介経路を介したレシピエント細胞へのＣｒｅのフソソームベースの送達について説明する。簡単に説明すると、Ｃｒｅを封入するフソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）からのエンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。次いで、ダイナミン媒介経路におけるＣｒｅ送達の依存性を、次のように決定した。
「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで完全培地中の黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞を播種してから２４時間後、Ｃｒｅを封入しているフソソームを、レシピエントＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に適用した。
Ｃｒｅ送達がダイナミン媒介経路に依存する程度を定量化するために、フソソーム適用時に、レシピエント細胞の１つの群を、ダイナミンを介したエンドサイトーシスを部分的に阻害するのに十分な濃度である１２０μＭのダイナミン阻害剤Ｄｙｎａｓｏｒｅで処理した。フソソームを、レシピエント細胞で、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を、完全培地中で希釈し、細胞で、に３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。Ｈｏｅｓｃｈｔの添加後、自動顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｍａｇｉｎｇ－ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒｓ／ｌｉｏｎｈｅａｒｔ－ｆｘ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ－ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ－ｉｍａｇｅｒ／）を使用して、細胞を画像化した。レシピエント細胞のＨｏｅｃｈｓｔ蛍光は、４０５ｎｍのＬＥＤおよびＢＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。レシピエント細胞のＧＦＰ蛍光は、４８８ｎｍのＬＥＤおよびＧＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。レシピエント細胞のＲＦＰ蛍光は、５２３ｎｍのＬＥＤおよびＲＦＰフィルターキューブを使用して画像化された。ウェル内の細胞の画像は、まず、陽性対照ウェル、すなわち、１．２５ｕＬのゲシクルリコンビナーゼゲシクル（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１４４９）で処理したレシピエント細胞のＬＥＤ強度および積分時間を確立することによって得られた。
取得設定は、ＢＦＰ、ＧＦＰ、およびＲＦＰ強度が最大ピクセル強度値であったが飽和しないように設定された。次いで、対象となるウェルは、確立された設定を使用して画像化された。ＢＦＰチャネルでオートフォーカスし、ＧＦＰおよびＲＦＰチャネルに確立された焦点面を使用することによって、各ウェルに焦点を設定した。ＲＦＰ陽性細胞の分析は、自動蛍光顕微鏡（ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｏｆｔｗａｒｅ－ｒｏｂｏｔｉｃｓ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎ５－ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ－ａｎｄ－ｉｍａｇｅｒ－ｓｏｆｔｗａｒｅ／を参照）に付属のＧｅｎ５ソフトウェアを使用して実行された。
画像は、幅６０μｍのローリングボールのバックグラウンド減算アルゴリズムを使用して前処理された。バックグラウンド強度を大幅に上回るＧＦＰ強度を有する細胞は、閾値処理され、ＧＦＰ陽性細胞には小さすぎるまたは大きすぎる領域は除外された。同じ分析手順が、ＲＦＰチャネルに適用された。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅリコンビナーゼを受容したレシピエント細胞）の数を、ＧＦＰ陽性細胞の合計（総レシピエント細胞））で除算して、Ｃｒｅ送達の指標としてＲＦＰ陽性細胞の割合を定量化した。
Ｄｙｎａｓｏｒｅの不在下で、Ｃｒｅをローディングしたフソソームは、総ＧＦＰ陽性レシピエント細胞の８２．１±４．５％のＲＦＰ陽性細胞に相当する観察可能なレベルのＣｒｅ送達を示した（図４５）。上記のように、使用したＤｙｎａｓｏｒｅ濃度は、エンドサイトーシスを部分的に阻害するのに十分であった。これと一致して、この実施例で使用されるＶＳＶ－Ｇフソソームは、エンドサイトーシス経路を通って動作することが知られており、１２０μＭのＤｙｎａｓｏｒｅの存在下で部分的に阻害され、Ｃｒｅ送達レベルは、６８．５±５．５％のＲＦＰ陽性細胞に相当した（図４５）。未処理のレシピエント細胞は、いかなる感知できるほどのＲＦＰ陽性細胞も示さなかった。総合すると、これらのデータは、フソソームベースのＣｒｅ送達のダイナミン依存性を示す。
実施例１５４：フソソーム中の脂質組成の測定
この実施例は、フソソームの脂質組成の定量化について説明する。フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞と同様であり得ると企図される。脂質組成は、サイズ、静電相互作用、およびコロイド挙動などのフソソームおよび細胞の重要な生物物理学的パラメーターに影響する。
脂質の測定は、質量分析に基づいた。フソソームは、１０ｃｍ皿でＶＳＶ－ＧおよびＧＦＰの一過性トランスフェクション、続いて、トランスフェクションから４８時間後、馴化培地の濾過および超遠心分離によって、本明細書に記載されるように調製された。トランスフェクトした細胞を、馴化培地と並行して収集し、分析に提出した。エキソソームはまた、ＶＳＶ－ＧまたはＧＦＰでトランスフェクトされなかった細胞からも収集された。
質量分析に基づいた脂質分析は、記載されるように、Ｌｉｐｏｔｙｐｅ ＧｍｂＨ（Ｄｒｅｓｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実行された（Ｓａｍｐａｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１１）。脂質は、２段階のクロロホルム／メタノール手順を使用して抽出された（Ｅｊｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２００９）。試料に、カルジオリピン１６：１／１５：０／１５：０／１５：０（ＣＬ）、セラミド１８：１；２／１７：０（Ｃｅｒ）、ジアシルグリセロール１７：０／１７：０（ＤＡＧ）、ヘキソシルセラミド１８：１；２／１２：０（ＨｅｘＣｅｒ）、リゾホスファチデート１７：０（ＬＰＡ）、リゾ－ホスファチジルコリン１２：０（ＬＰＣ）、リゾ－ホスファチジルエタノールアミン１７：１（ＬＰＥ）、リゾ－ホスファチジルグリセロール１７：１（ＬＰＧ）、リゾ－ホスファチジルイノシトール１７：１（ＬＰＩ）、リゾ－ホスファチジルセリン１７：１（ＬＰＳ）、ホスファチデート１７：０／１７：０（ＰＡ）、ホスファチジルコリン１７：０／１７：０（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン１７：０／１７：０（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール１７：０／１７：０（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール１６：０／１６：０（ＰＩ）、ホスファチジルセリン１７：０／１７：０（ＰＳ）、コレステロールエステル２０：０（ＣＥ）、スフィンゴミエリン１８：１；２／１２：０；０（ＳＭ）、トリアシルグリセロール１７：０／１７：０／１７：０（ＴＡＧ）、およびコレステロールＤ６（Ｃｈｏｌ）を含有する内部脂質標準混合物をスパイクした。
抽出後、有機相を注入プレートに移し、速度真空濃縮機で乾燥させた。第１のステップの乾燥抽出物を、クロロホルム／メタノール／プロパノール（１：２：４、Ｖ：Ｖ：Ｖ）中の７．５ｍＭの酢酸アンモニウムに再懸濁し、第２のステップの乾燥抽出物を、クロロホルム／メタノールのメチルアミン（０．００３：５：１；Ｖ：Ｖ：Ｖ）の３３％エタノール溶液に再懸濁した。すべての液体処理ステップは、有機溶媒ピペッティング用の液垂れ防止制御（Ａｎｔｉ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ）機能を備えたＨａｍｉｌｔｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ ＳＴＡＲｌｅｔロボットプラットフォームを使用して実行された。
試料は、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅイオン源（Ａｄｖｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）直接注入することによって分析された。試料は、１回の取り込みで、ＭＳの場合はＲｍ／ｚ＝２００＝２８００００、ＭＳＭＳ実験の場合はＲｍ／ｚ＝２００＝１７５００の解像度で、陽性および陰性イオンモードの両方で分析された。ＭＳＭＳは、１Ｄａ単位でスキャンされた対応するＭＳ質量範囲を含む包含リストによって引き起こされた（Ｓｕｒｍａ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ＭＳデータおよびＭＳＭＳデータの両方を組み合わせて、アンモニウム付加物としてＣＥ、ＤＡＧ、およびＴＡＧイオン、アセテート付加物としてＰＣ、ＰＣ Ｏ－、ならびに脱プロトン化アニオンとしてＣＬ、ＰＡ、ＰＥ、ＰＥ Ｏ－、ＰＧ、ＰＩ、およびＰＳをモニタリングした。ＭＳのみを使用して、脱プロトン化アニオンとしてＬＰＡ、ＬＰＥ、ＬＰＥ Ｏ－、ＬＰＩ、およびＬＰＳ、アセテート付加物としてＣｅｒ、ＨｅｘＣｅｒ、ＳＭ、ＬＰＣ、およびＬＰＣ Ｏ－、ならびにアセチル化誘導体のアンモニウム付加物としてコレステロールをモニタリングした（Ｌｉｅｂｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２００６）。
ＬｉｐｉｄＸｐｌｏｒｅｒに基づいた社内で開発された脂質同定ソフトウェアを使用して、データを分析した（Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．２０１２）。社内で開発されたデータ管理システムを使用して、データの後処理および正規化を実行した。シグナル対ノイズ比が５を超え、対応する空試料よりも５倍高いシグナル強度を持つ脂質の同定のみに対して、さらなるデータ分析が考慮された。
フソソームの脂質組成は、親細胞の脂質組成と比較され、検出されない脂質種には、ゼロの値が割り当てられた。フソソームおよび親細胞で同定された脂質種を、下の表に示す。
Figure 2023153260000034
親細胞の任意の複製試料中で同定された脂質の７０％以上がフソソームの任意の複製試料中に存在する場合、フソソームおよび親細胞は、同様の脂質組成を有し得、これらの同定された脂質のフソソームの平均レベルは、親細胞の対応する平均脂質種レベルの２５％超であり得ることが企図される。
実施例１５５：フソソーム中のプロテオーム組成の測定
この実施例は、フソソームのタンパク質組成の定量化について説明する。フソソームのタンパク質組成は、それらが由来する親細胞と同様であり得ると企図される。
フソソームおよび親細胞は、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。
各試料を、溶解緩衝液（６Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭのトリスｐＨ８．０）に再懸濁し、氷浴で超音波処理し、小型ゲージ注射器を通過させた。タンパク質を、１０ｍＭのＤＴＴを使用して６５℃で１５分間還元し、暗所で室温で３０分間、１５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でアルキル化した。過剰なＩＡＡを、追加の１０ｍＭのＤＴＴで反応停止した。次いで、８体積の氷冷アセトンおよび１体積の氷冷メタノールを添加して、タンパク質を沈殿させ、－８０℃で一晩静置した。沈殿したタンパク質を、遠心分離によってペレット化した。残りの溶解緩衝液を、２００μｌの氷冷メタノールで３回洗浄した。タンパク質を、０．７５Ｍの尿素＋５０ｍＭのトリスｐＨ８．０＋１μｇのトリプシン／ＬｙｓＣに再懸濁し、撹拌しながら３７℃で４時間前消化した。追加の１μｇのトリプシン／ＬｙｓＣを、タンパク質に添加し、消化を一晩持続した。ペプチドは、逆相ＳＰＥによって精製し、ＬＣ－ＭＳで分析した。
各条件の複製試料を溶解し、１つのチューブ中で合わせた。次いで、このプールを、試料と同じ調製プロトコルに供し、情報依存性取得でＬＣ－ＭＳによって分析するか、または下述のようにゲルで分離した。
合計１００μｇのプールしたタンパク質を、２倍のＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液に入れ、１２．５％ＳＤＳ ＰＡＧＥで分離した。タンパク質を、クマシーブルーで簡単に染色し、タンパク質レーンを、１２の画分に分けた。次いで、各画分を、５０％アセトニトリルで脱水し、還元のために１０ｍＭのＤＴＴで再水和した。ゲル切片を、６５℃で１５分間置き、暗所で室温で３０分間、１５ｍＭのＩＡＡでアルキル化した。ゲルを、５０％アセトニトリルでさらに脱水し、１μｇのトリプシン／ＬｙｓＣを含む５０ｍＭのトリスｐＨ８で３７℃で一晩再水和した。ペプチドを、脱水および超音波処理によってゲルから抽出した。ペプチドを、逆相ＳＰＥで精製し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した（１画分当たり１×ＩＤＡ）。
２５μｍの内径キャピラリーを有するエレクトロスプレーインターフェースを備え、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ μＵＨＰＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）と連結しているＡＢＳｃｉｅｘ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ５６００（ＡＢＳｃｉｅｘ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、 ＵＳＡ）を使用して、取得を実行した。Ａｎａｌｙｓｔ ＴＦ １．７ソフトウェアは、機器を制御し、データの処理および取得のために使用された。ゲルまたは未分画プールからの１２の画分に対して、情報依存性取得（ＩＤＡ）モードで取得を実行した。試料は、ＳＷＡＴＨ取得モードで分析された。ＩＤＡモードでは、電源電圧は、５．２ｋＶに設定され、２２５℃に維持され、カーテンガスは、２７ｐｓｉ、ガス１は１２ｐｓｉ、ガス２は１０ｐｓｉに設定された。ＳＷＡＴＨモードでは、電源電圧は、５．５ｋＶに設定され、２２５℃に維持され、カーテンガスは、２５ｐｓｉ、ガス１は１６ｐｓｉ、ガス２は１５ｐｓｉに設定された。分離は、逆相ＨＡＬＯ Ｃ１８－ＥＳカラムで内径０．３μｍ、粒子２．７μｍ、長さ１５０ｍｍ（Ａｄｖａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）で行われ、６０℃に維持された。試料は、５μＬのループにループを過剰充填することによって注入された。６０分間ＬＣ勾配の場合、移動相は、３μＬ／分の流速で、溶媒Ａ（０．２ｖ／ｖ％ギ酸および３ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ水溶液）および溶媒Ｂ（０．２ｖ／ｖ％ギ酸およびＥｔＯＨ中３％のＤＭＳＯ）からなった。
試料分析用のイオンライブラリを生成するために、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェアを、ＩＤＡ実行によって生成されたｗｉｆｆファイルで実行した。このデータベースは、３つのトランジション／ペプチドおよび１５のペプチド／タンパク質を使用して、各試料のタンパク質を定量化するために、Ｐｅａｋｖｉｅｗソフトウェア（ＡＢＳｃｉｅｘ）で使用した。定量化されたタンパク質の数を最大化するために、同じパラメーターを使用して、公的に入手可能なヒトＳＷＡＴＨデータベース（Ａｔｌａｓ）で、試料を定量化した。Ｐｅａｋｖｉｅｗによって計算されたスコアが１．５を上回り、かつＦＤＲが１％未満である場合、ペプチドは適切に測定されたと見なされた。各データベースからの定量を、両方のデータベースからのタンパク質名を使用して、１つの最終定量に組み合わせた。補正率は、すべての試料の合計シグナルの平均と比較したときに、その試料のすべてのタンパク質の合計シグナルを考慮して、すべての試料に対して計算された。
フソソームのプロテオーム組成物は、親細胞のプロテオーム組成と比較した。同定されたタンパク質の３３％超がフソソーム中に存在する場合、フソソームと親細胞の類似のプロテオーム組成が観察され、これらの同定されたタンパク質のレベルは、下の表に示すように、親細胞の対応するタンパク質レベルの２５％超であった。
Figure 2023153260000035
実施例１５６：１フソソーム当たりの内因性または合成タンパク質レベルの定量化
この実施例は、フソソーム内の内因性または合成タンパク質カーゴの定量化について説明する。いくつかの例では、フソソームは、内因性または合成タンパク質カーゴを含み得る。この実施例に記載されるフソソームまたは親細胞は、内因性タンパク質の発現を変化させるか、または治療的もしくは新規の細胞機能を媒介する合成カーゴを発現するように操作された。
ＧＦＰを発現するフソソームおよび親細胞は、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。フソソーム中のＧＦＰの定量化は、製造業者の取扱説明書に従って市販のＥＬＩＳＡキット（ａｂ１７１５８１ Ａｂｃａｍ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して達成された。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用したナノ粒子追跡分析によって、フソソームの定量化を実行した。結果を、下の表に示す。
Figure 2023153260000036
フソソームは、１フソソーム当たり少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、またはそれ以上のタンパク質薬剤分子を有し得ると企図される。一実施形態において、フソソームは、１フソソーム当たり１６６個のタンパク質薬剤分子を有する。
実施例１５７：フソソーム中のエキソソームタンパク質のマーカーの測定
このアッセイは、エキソソームの特異的マーカーであることが知られているタンパク質の割合の定量化について説明する。
フソソームは、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。エキソソームは、親細胞にＶＳＶ－ＧまたはＧＦＰをトランスフェクトされなかったことを除いて、実施例１１４および１５４の方法によって、フソソームについて本明細書に記載されるように調製された。フソソームおよびエキソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例４２に記載されるように行った。
得られたタンパク質定量データを分析して、既知のエキソソームマーカーＣＤ６３のタンパク質レベルおよび割合を決定した。群当たりの平均ログ強度は、質量分析からの強度値に１を加算し、ログ１０で変換し、複製全体の平均を計算することによって計算された。結果を、図４６に示す。
実施例１５８：フソソーム中のカルネキシンの測定
このアッセイは、フソソーム中のカルネキシン（ＣＮＸ）のレベル、および親細胞と比較したフソソーム中のＣＮＸの相対レベルの定量化について説明する。
フソソームおよび親細胞は、本明細書の実施例１１４および１５４に記載されるように調製された。カルネキシンおよび総タンパク質は、実施例４２の方法に従って行われた質量分析を使用して測定された。親細胞およびフソソームについて決定されたカルネキシンシグナル強度を、図４７に示す。
実施形態において、このアッセイを使用すると、フソソーム中のＣＮＸの平均分率含有量（本明細書の実施例４２に記載されるように計算される）は、２．４３×１０－４未満であろう。
一実施形態において、親細胞から調製物へのｎｇ／μｇ単位の総タンパク質当たりのカルネキシンの減少は、８８％であろう。
実施例１５９：フソソーム中の脂脂質とＤＮＡの比
この実施例は、親細胞と比較したフソソーム中の脂質とＤＮＡの比の定量化について説明する。一実施形態において、フソソームは、親細胞と比較して脂質とＤＮＡの比がより大きい。フソソームは、実施例１１４および１５４に前述されたように調製された。
この比率は、実施例４９に概説されている脂質含有量として定義され、核酸含有量は、実施例５０に記載されるように決定される。図４８および下の表に示すように、フソソームは、親細胞よりも高い脂質：ＤＮＡ比を示すことが見出された。
Figure 2023153260000037
実施例１６０：フソソーム上の表面マーカーの分析
このアッセイは、フソソーム上の表面マーカーの特定について説明する。
フソソームは、本明細書の実施例１１４および１５４に記載されるように調製された。ホスファチジルセリンは、本明細書の実施例１１４および１５４に記載されるように質量分析により測定された。下の表に示すように、フソソームの総脂質に対するホスファチジルセリンの量は、親細胞の総脂質に対するホスファチジルセリンの量よりも１２１％多いと決定された。
Figure 2023153260000038
実施例１６１：フソソーム中のウイルスカプシドタンパク質の分析
この実施例では、試料調製の構成を分析し、ウイルスカプシド源に由来するタンパク質の割合を評価した。
フソソームは、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。フソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例４２に記載されるように行った。本明細書の実施例４２に記載されるように、ウイルスカプシドタンパク質の画分含有量を計算し、フソソーム試料にわたって平均化し、割合として表した。
このアプローチを使用すると、下の表に示すように、試料は、０．０５％のウイルスカプシドタンパク質を含むことが見出された。検出された唯一のウイルスカプシドタンパク質は、ウサギ内因性レンチウイルス（ＲＥＬＩＫ）カプシドとシクロフィリンＡ（ＰＤＢ
２ＸＧＹ Ｂ）との複合体であった。
Figure 2023153260000039
実施例１６２：フソソーム中のフソゲンタンパク質比の定量化
この実施例は、フソソーム中のフソゲンタンパク質と総タンパク質または対象となる他のタンパク質の比の定量化について説明する。対象となる他のタンパク質には、ＥＧＦＰ、ＣＤ６３、ＡＲＲＤＣ１、ＧＡＰＤＨ、カルネキシン（ＣＮＸ）、およびＴＳＧ１０１が含まれるが、これらに限定されない。フソソームは、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。フソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例４２に記載されるように行った。本明細書の実施例４２に記載されるように、すべてのタンパク質の定量化を計算し、フソソーム試料にわたって平均化し、割合として表した。
下の表に示すように、フソゲンは、ＥＧＦＰに対する比率が１５６．９、ＣＤ６３に対する比率が２９１２．０、ＡＲＲＤＣ１に対する比率が６６４．９、ＧＡＰＤＨに対する比率が６９．０、ＣＮＸに対する比率が５５８．４、およびＴＳＧ１０１に対する比率が３０６４．１を有すると見出された。
Figure 2023153260000040
実施例１６３：フソソーム中の内因性および合成タンパク質比の定量化
この実施例は、フソソーム中の総タンパク質または対象となる他のタンパク質と比較して内因性または合成タンパク質カーゴの定量化について説明する。対象となる他のタンパク質には、ＶＳＶ－Ｇ、ＣＤ６３、ＡＲＲＤＣ１、ＧＡＰＤＨ、カルネキシン（ＣＮＸ）、またはＴＳＧ１０１が含まれるが、これらに限定されない。フソソームは、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。フソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例４２に記載されるように行った。本明細書の実施例４２に記載されるように、すべてのタンパク質の定量化を計算し、フソソーム試料にわたって平均化し、割合として表した。
下の表に示すように、合成タンパク質カーゴは、ＶＳＶ－Ｇに対する比率が６．３７×１０－３、ＣＤ６３に対する比率が１８．６、ＡＲＲＤＣ１に対する比率が４．２４、ＧＡＰＤＨに対する比率が０．４４、ＣＮＸに対する比率が３．５６、およびＴＳＧ１０１に対する比率が１９．５２を有すると見出された。
Figure 2023153260000041
実施例１６４：フソソーム中の濃縮脂質組成
この実施例は、フソソーム、親細胞、およびエキソソームの脂質組成の定量化について説明する。フソソームの脂質組成は、それらが由来する細胞と比較して特定の脂質について濃縮および／または枯渇させ得ると企図される。脂質組成は、サイズ、静電相互作用、およびコロイド挙動などのフソソームおよび細胞の重要な生物物理学的パラメーターに影響する。
脂質組成は、実施例１１４および１５４に記載されるように測定された。フソソームは、１０ｃｍ皿でＶＳＶ－ＧおよびＧＦＰの一過性トランスフェクション、続いて、トランスフェクションから４８時間後、馴化培地の濾過および超遠心分離によって、本明細書に記載されるように調製された。トランスフェクトした細胞を、馴化培地と並行して収集し、分析に提出した。エキソソームは、親細胞にＶＳＶ－ＧまたはＧＦＰをトランスフェクトされなかったことを除いて、フソソームについて本明細書に記載されるように調製された。
フソソーム、エキソソーム、および親細胞の脂質組成を、図４９Ａ～４９Ｂに示す。親細胞と比較して、フソソームは、コレステリルエステル、遊離コレステロール、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、ホスファチジン酸塩、エーテル結合ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびスフィンゴミエリンが濃縮された。親細胞と比較して、フソソームは、セラミド、カルジオリピン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルイノシトール、エーテル結合ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、およびトリアシルグリセロールが枯渇している。エキソソームと比較して、フソソームは、コレステリルエステル、セラミド、ジアシルグリセロール、リゾホスファチデート、およびホスファチジルエタノールアミン、トリアシルグリセロールが濃縮された。エキソソームと比較して、フソソームは、遊離コレステロール、ヘキソシルセラミド、リゾホスファチジルコリン、エーテル結合リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、エーテル結合リゾホスファチジルエタノールアミン、およびリゾホスファチジルが枯渇している。
実施例１６５：フソソームの区画特異的なプロテオーム含有量の測定
この実施例は、フソソーム、フソソーム親細胞、およびエキソソームの特定の細胞内区画に由来することが知られているタンパク質の割合の定量化について説明する。
フソソームおよび親細胞は、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。エキソソームは、親細胞にＶＳＶ－ＧまたはＧＦＰをトランスフェクトされなかったことを除いて、実施例１１４および１５４の方法によって、フソソームについて本明細書に記載されるように調製された。フソソームおよびエキソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例４２に記載されるように行った。得られたタンパク質定量データを分析して、証拠コードＩＤＡ（直接アッセイによって推定される）を用いて、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔの注釈用語（エキソソーム：ＧＯ：００７００６２、小胞体：ＧＯ：０００５７８３、リボソーム：ＧＯ：０００５８４０、ＧＯ：００２２６２５、ＧＯ：００２２６２６、ＧＯ：００２２６２７、ＧＯ：００４４３９１、ＧＯ：００４２７８８、ＧＯ：００００３１３）によって注釈されるように、既知のエキソソーム、小胞体、リボソーム、核、およびミトコンドリアタンパク質のタンパク質レベルおよび割合を決定した。各試料の総タンパク質に対する区画特異的なタンパク質の割合は、フソソーム試料、エキソソーム試料、および親細胞について決定された。
図５０に示すように、フソソームは、親細胞およびエキソソームと比較して、小胞体タンパク質が枯渇していることが見出された。フソソームはまた、エキソソームと比較して、エキソソームのタンパク質が枯渇していることが見出された。フソソームは、親細胞と比較して、ミトコンドリアタンパク質が枯渇した。フソソームは、親細胞と比較して、核タンパク質が濃縮された。フソソームは、親細胞およびエキソソームと比較して、リボソームタンパク質が濃縮された。
実施例１６６：フソソーム中のＴＳＧ１０１およびＡＲＲＤＣ１含有量の測定
この実施例は、細胞からのフソソーム放出において重要であることが知られているタンパク質の割合の定量化について説明する。
フソソームおよび親細胞は、実施例１１４および１５４の方法によって、本明細書に記載されるように調製された。エキソソームは、親細胞にＶＳＶ－ＧまたはＧＦＰをトランスフェクトされなかったことを除いて、実施例１１４および１５４の方法によって、フソソームについて本明細書に記載されるように調製された。フソソームおよびエキソソームの質量分析によるタンパク質の定量化は、本明細書の実施例４２に記載されるように行った。得られたタンパク質定量データを分析して、タンパク質ＴＳＧ１０１およびＡＲＲＤＣ１のタンパク質レベルおよび割合を決定した。群当たりの平均ログ強度は、質量分析からの強度値に１を加算し、ログ１０で変換し、複製全体の平均を計算することによって計算された。エキソソームまたは親細胞と比較した、フソソーム中のＴＳＧ１０１またはＡＲＲＤＣ１の総タンパク質含有量の割合は、同じ試料中のすべてのタンパク質の強度の合計で除算し、複製にわたって平均化し、割合として表して、各試料のＴＳＧ１０１またはＡＲＲＤＣ１の平均対数強度として決定された。
図５１に示すように、ＡＲＲＤＣ１は、親細胞またはエキソソームよりもフソソーム中の総タンパク質含有量の割合としてより高いレベルで存在することが見出された。総タンパク質含有量の割合としてＡＲＲＤＣ１のレベルは、フソソームにおいて少なくとも０．０２％であった。ＴＳＧ１０１は、親細胞またはエキソソームよりもフソソーム中の総タンパク質含有量の割合として高いレベルで存在することが見出された。総タンパク質含有量の割合としてＴＳＧ１０１のレベルは、フソソームにおいて少なくとも０．００４％であった。
実施例１６７：フソソームの既存の血清の不活性化の測定
この実施例は、インビトロ送達アッセイを使用してフソソームの既存の血清の不活性化の定量化について説明する。
フソソームにおける免疫原性の基準は、血清の不活性化である。フソソームの血清の不活性化は、抗体媒介中和または補体媒介分解によるものであり得る。一実施形態において、本明細書に記載のフソソームの一部のレシピエントは、フソソームに結合し、それを不活化する血清中の因子を有するであろう。
この実施例は、フソソームナイーブマウスを、血清中のフソソームを不活性化する因子の存在について評価する。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに対する最適化を備えたヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。陰性対照は、熱不活性化マウス血清であり、陽性対照は、異種供給源細胞から生成されたフソソームの複数回注射を受けたマウスに由来する血清である。新鮮な全血を採血し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから血清を収集する。凝固物を、遠心分離によってペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照試料は、摂氏５６度で１時間加熱される。血清は、アリコートで凍結され得る。
フソソームは、レシピエント集団中の細胞の５０％がフソソーム中のペイロードを受け取る用量について試験される。フソソームは、本明細書に記載される他の実施例のいずれかを介して生成され得、本明細書に記載されるペイロードのいずれかを含み得る。レシピエント細胞へのペイロードのフソソーム送達をアッセイするための多くの方法も、本明細書に記載されている。この特定の実施例では、ペイロードは、Ｃｒｅタンパク質であり、レシピエント細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定的に発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換え時に、ＧＦＰ発現からＲＦＰ発現に切り替わり、マーカーとして、融合およびＣｒｅの送達を示す。レシピエント細胞の５０％がＲＦＰ陽性であると特定された用量は、さらなる実験に使用される。他の実施形態において、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取る特定された用量は、さらなる実験に使用される。好ましい実施形態において、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取る特定の用量は、フソソーム全体で同様である。
フソソームの血清の不活化を評価するために、フソソームを、通常または熱不活化血清（または無血清対照として１０％熱不活化ＦＢＳを含む培地）に１：５で希釈し、混合物を、３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を、さらに１：５で希釈し、１：１０の比率で２回連続希釈するために反応物に添加する。このステップ後、フソソームは、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取った（例えば、ＲＦＰ陽性である）これまでに特定された用量で存在しなければならない。
次いで、血清にさらされたフソソームを、レシピエント細胞でインキュベートする。ペイロードを受け取り、ＲＦＰ陽性である細胞の割合が、計算される。いくつかの実施形態において、ペイロードを受け取る細胞の割合は、フソソームナイーブマウスからの血清およびフソソームナイーブマウスからの熱不活化血清でインキュベートしたフソソーム試料との間で異なり、これは、フソソームの血清の不活化がないことを示す。いくつかの実施形態において、ペイロードを受け取る細胞の割合は、フソソームナイーブマウスからの血清でインキュベートしたフソソーム試料と無血清対照インキュベーションとの間で異なり、これは、フソソームの血清の不活性化がないことを示す。いくつかの実施形態において、ペイロードを受け取る細胞の割合は、フソソームナイーブマウスからの血清でインキュベートしたフソソーム試料中よりも陽性対照血清でインキュベートしたフソソーム試料中よりも少なく、これは、フソソームの血清の不活性化がないことを示す。
実施例１６８：複数回投与後のフソソームの血清の不活性化の測定
この実施例は、フソソームの複数回投与後のインビトロ送達アッセイを使用した、フソソームの血清の不活性化の定量化について説明する。例えば、本明細書に記載の方法によって修飾された修飾フソソームは、修飾フソソームの複数回（例えば、１回を超える、例えば２回以上）の投与後に血清の不活性化が低下し得る（例えば、非修飾フソソームの投与と比較して低下し得る）ことが企図される。場合によっては、本明細書に記載のフソソームは、複数回投与後に血清によって不活性化されないだろう。
フソソームにおける免疫原性の基準は、血清の不活性化である。一実施形態において、フソソームの反復注射は、抗フソソーム抗体、例えば、フソソームを認識する抗体の開発をもたらし得る。一実施形態において、フソソームを認識する抗体は、フソソームの活性または寿命を制限し、補体分解を媒介することができる方法で結合することができる。
この実施例において、フソソームの１回以上の投与後に血清の不活性化を試験する。フソソームは、前述の実施例のうちのいずれか１つによって生成される。この実施例において、フソソームは、ＨＬＡ－Ｇのレンチウイルス媒介性発現で修飾されたＨＥＫ２９３細胞（以下、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇ）、および空ベクターのレンチウイルス媒介性発現で修飾されたＨＥＫ２９３（以下、ＨＥＫ２９３）から生成される。いくつかの実施形態において、フソソームは、他の免疫調節タンパク質を発現している細胞に由来する。
血清は、異なるコホート：ビヒクル（フソソームナイーブ群）、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソーム、またはＨＥＫ２９３フソソームで、１、２、３、５、１０回の注射で全身的および／または局所的に注射されたマウスから引き出される。新鮮な全血を採血し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから血清を収集する。凝固物を、遠心分離によってペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照は、熱不活化マウス血清である。陰性対照試料は、摂氏５６度で１時間加熱される。血清は、アリコートで凍結され得る。
フソソームは、レシピエント集団中の細胞の５０％がフソソーム中のペイロードを受け取る用量について試験される。フソソームは、本明細書に記載される他の実施例のいずれかを介して生成され得、本明細書に記載されるペイロードのいずれかを含み得る。レシピエント細胞へのペイロードのフソソーム送達をアッセイするための多くの方法も、本明細書に記載されている。この特定の実施例では、ペイロードは、Ｃｒｅタンパク質であり、レシピエント細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定的に発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換え時に、ＧＦＰ発現からＲＦＰ発現に切り替わり、マーカーとして、融合およびＣｒｅの送達を示す。レシピエント細胞の５０％がＲＦＰ陽性であると特定された用量は、さらなる実験に使用される。他の実施形態において、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取る特定された用量は、さらなる実験に使用される。
フソソームの血清の不活化を評価するために、フソソームを、通常または熱不活化血清（または無血清対照として１０％熱不活化ＦＢＳを含む培地）に１：５で希釈し、混合物を、３７℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を、さらに１：５で希釈し、１：１０の比率で２回連続希釈するために反応物に添加する。このステップ後、フソソームは、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取った（例えば、ＲＦＰ陽性である）これまでに特定された用量で存在しなければならない。レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取る特定の用量は、フソソーム全体で同様であり得ることが企図される。
次いで、血清にさらされたフソソームを、レシピエント細胞でインキュベートする。ペイロードを受け取り、ＲＦＰ陽性である細胞の割合が、計算される。ペイロードを受け取る細胞の割合は、血清でインキュベートしたフソソーム試料と、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームで処置したマウスからの熱不活化血清との間で異なり得、これは、フソソームの血清の不活化または適応免疫応答がないことを示す。ペイロードを受け取る細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームで１、２、３、５、または１０回処置したマウスからインキュベートしたフソソーム試料間で異なり得ず、これは、フソソームの血清の不活化または適応免疫応答がないことを示す。場合によっては、ペイロードを受け取る細胞の割合は、ビヒクルで処置したマウスからの血清およびＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームで処置したマウスからの血清でインキュベートしたフソソーム試料の間で異なり得ず、これは、フソソームの血清の不活化または適応免疫応答がないことを示す。場合によっては、ペイロードを受け取る細胞の割合は、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームに対してよりもＨＥＫ２９３に由来するフソソームに対してより少なく、これは、ＨＥＫ２９３－ＨＬＡ－Ｇフソソームの血清不活性化または適応免疫応答がないことを示す。
実施例１６９：フソソームの補体標的化の測定
この実施例は、インビトロアッセイを使用したフソソームに対する補体活性の定量化について説明する。本明細書に記載の修飾フソソームは、対応する非修飾フソソームと比較して、低下した補体活性を誘導し得ると企図される。
この実施例は、マウスからの血清を、フソソームに対する補体活性について評価する。この実施例は、すべての補体経路の中心ノードである補体Ｃ３ａのレベルを測定する。特に、本明細書に記載の方法は、プロトコルに対する最適化を備えたヒト、ラット、サルに等しく適用可能であり得る。
この実施例では、フソソームは、前述の実施例のうちのいずれか１つによって生成される。フソソームは、補体調節タンパク質ＤＡＦ（ＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソーム）のレンチウイルス媒介性発現で修飾されたＨＥＫ２９３細胞、または相補的な調節タンパク質を発現しないＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３フソソーム）から生成される。他の補体調節タンパク質はまた、例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ、ＣＤ５５）に結合するタンパク質、例えば因子Ｈ（ＦＨ）様タンパク質－１（ＦＨＬ－１）、例えばＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、例えば補体受容体１（ＣＤ３５）、例えば膜補因子タンパク質（ＭＣＰ、ＣＤ４６）、例えばプロフェクチン（ＣＤ５９）、例えば、古典的および代替補体経路ＣＤ／Ｃ５変換酵素を阻害するタンパク質、例えば、ＭＡＣを調節するタンパク質を使用してもよい。
血清は、ナイーブマウス、ＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームを投与したマウス、またはＨＥＫ２９３フソソームを投与したマウスから回収される。新鮮な全血を採血し、数時間完全に凝固させることによって、マウスから血清を収集する。凝固物を、遠心分離によってペレット化し、血清上清を除去する。陰性対照は、熱不活化マウス血清である。陰性対照試料は、摂氏５６度で１時間加熱される。血清は、アリコートで凍結され得る。
異なるフソソームは、レシピエント集団中の細胞の５０％がフソソーム中のペイロードを受け取る用量について試験される。フソソームは、本明細書に記載される他の実施例のいずれかを介して生成され得、本明細書に記載されるペイロードのいずれかを含み得る。レシピエント細胞へのペイロードのフソソーム送達をアッセイするための多くの方法も、本明細書に記載されている。この特定の実施例では、ペイロードは、Ｃｒｅタンパク質であり、レシピエント細胞は、ＣＭＶプロモーター下で「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを安定的に発現するＲＰＭＩ８２２６細胞であり、Ｃｒｅによる組換え時に、ＧＦＰ発現からＲＦＰ発現に切り替わり、マーカーとして、融合およびＣｒｅの送達を示す。レシピエント細胞の５０％がＲＦＰ陽性であると特定された用量は、さらなる実験に使用される。他の実施形態において、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取る特定された用量は、さらなる実験に使用される。好ましい実施形態において、レシピエント細胞の５０％がペイロードを受け取る特定の用量は、フソソーム全体で同様である。
レシピエント細胞の５０％がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）でペイロードを受け取るフソソームの用量から始まるフソソームの２倍希釈液を、同じフソソームで処置したマウスまたはナイーブマウスからの血清の１：１０希釈液（アッセイ量、２０μｌ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートする。試料は、１：５００にさらに希釈し、Ｃ３ａに特異的な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で使用される。ＥＬＩＳＡは、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃにより販売されているマウス補体Ｃ３ａ ＥＬＩＳＡキット製品ＬＳ－Ｆ４２１０であり、試料中のＣ３ａの濃度を測定する。２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量を、マウスから単離した血清全体で比較する。
場合によっては、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量は、ＨＥＫ２９３マウス血清でインキュベートしたＨＥＫ２９３フソソームに対してよりもＨＥＫ－２９３ ＤＡＦマウス血清でインキュベートしたＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームに対しての方が大きく、これは、フソソームを標的とする補体活性がＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームよりもＨＥＫ２９３フソソームで処置したマウスにおいてより大きいことを示す。場合によっては、２００ｐｇ／ｍｌのＣ３ａが存在するフソソームの用量は、ナイーブマウス血清でインキュベートしたＨＥＫ２９３フソソームに対してよりもナイーブマウス血清でインキュベートしたＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームに対しての方が大きく、これは、フソソームを標的とする補体活性がＨＥＫ２９３－ＤＡＦフソソームよりもＨＥＫ２９３フソソームで処置したマウスにおいてより大きいことを示す。
実施例１７０：フソソーム生成プロトコルへのＡＲＲＤＣ１の取り込み
この実施例は、フソソーム生成プロトコルへのアレスチンドメイン含有タンパク質１（ＡＲＲＤＣ１）の使用について説明し、フソソーム数および得られたフソソームによるＣｒｅの送達へのＡＡＲＤＣ１の効果について説明する。Ｃｒｅを封入するフソソームを、本明細書に記載されるように、細胞表面上にニパウイルス付着（ＮｉＶ－Ｇ）および融合（ＮｉＶ－Ｆ）エンベロープ糖タンパク質Ｇを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成されたフソソームを収集し、調製する標準手順によって作製した。対照フソソームは、ＣｒｅおよびＮｉＶ－ＧおよびＮｉＶ－Ｆ糖タンパク質のみを発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞から生成された。次いで、Ｃｒｅおよびフソソーム数を送達するフソソームの能力へのＡＲＲＤＣ１の効果を、以下のように決定した。
「ＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ」カセットを発現するように操作されたレシピエントＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、３０，０００個の細胞／ウェルで完全培地中の黒色の透明な底の９６ウェルプレートに播種した。レシピエント細胞を播種してから２４時間後、Ｃｒｅを封入している様々な範囲のフソソーム量を、レシピエントＬｏｘＰ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ－ＲＦＰ ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に適用した。
Ｃｒｅ送達が生成プロトコルへのＡＲＲＤＣ１の取り込みによって強化された程度を定量化するために、レシピエント細胞の１つの群を、ＡＲＲＤＣ１（ＮｉＶ－Ｇ＋ＮｉＶ－Ｆ＋ＮＬＳ－Ｃｒｅ＋ＡＲＲＤＣ１）でトランスフェクトされた細胞から生成されたフソソームで処理し、細胞の１つの群を、対照フソソーム（ＮｉＶ－Ｇ＋ＮｉＶ－Ｆ＋ＮＬＳ－Ｃｒｅ）で処理した。フソソームを、レシピエント細胞で、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。対照として、レシピエント細胞の追加群も、１．２５ｕＬのｃｅｒリコンビナーゼゲシクル（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号６３１４４９）で処理した。２４時間後、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を、完全培地中で希釈し、細胞で、に３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。
Ｈｏｅｓｃｈｔの添加後、細胞を、フローサイトメトリーを介して分析した。簡単に説明すると、レシピエント細胞試料を解離し、収集し、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、および５６１ｎｍの励起用レーザー、ならびに４４０／５０ＢＰ（Ｈｏｅｓｃｈｔ）、５３０／３０ＢＰ（ＧＦＰ）、および５８５／１６ＢＰ（ＲＦＰ）の取得用発光フィルターセットをそれぞれ使用して、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって分析した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴソフトウェアを、取得のために使用し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを、分析のために使用した。データの取得および分析のために、レシピエント細胞を表す集団を決定するために、ＦＳＣおよびＳＳＣチャネルを線形軸に設定した。次いで、この集団をゲートし、細胞ゲート内の最小１０，０００の事象が、各条件で収集された。次いで、Ｈｏｅｓｃｈｔ（４４０／５０ＢＰ）発光チャネル中のレシピエント細胞を表す集団をゲートし、このゲートを使用して、ＧＦＰ（５３０／３０ＢＰ）の事象を表示した。次いで、ＧＦＰ＋レシピエント細胞を表す集団をゲートし、このゲートを使用して、ＲＦＰ（５８５／１６ＢＰ）の事象を表示した。次いで、ＲＦＰ陽性細胞（Ｃｒｅを受容したレシピエント細胞）は、まず、未処理細胞に基づいて陰性ゲートおよびＣｒｅリコンビナーゼゲシクルで処理したＲＦＰ陽性細胞に基づいて陽性ゲートを設定することによって、Ｃｒｅ送達の計量として定量化された。最高用量で、ＡＲＲＤＣ１でトランスフェクトした細胞から生成されたＣｒｅをローディングしたフソソームは、総ＧＦＰ陽性レシピエント細胞の９．２％ＲＦＰ陽性細胞に相当する観察可能なレベルのＣｒｅ送達を示した（図５２Ａ）。しかしながら、ＡＲＲＤＣ１の不在下で、Ｃｒｅの送達は、１．８％ＲＦＰ陽性細胞に相当する送達のレベルに伴って実質的に減少した（図５２Ａ）。未処理のレシピエント細胞は、いかなる感知できるほどのＲＦＰ陽性細胞も示さなかった。総合すると、これらのデータは、フソソームベースのＣｒｅ送達を増強するＡＲＲＤＣ１の能力を示す。
蛍光ナノ粒子追跡分析（ｆＮＴＡ）を使用して、ＡＲＲＤＣ１でトランスフェクトした細胞から生成されたフソソームは、２．８×１０１１個の粒子／ｍＬの濃度を示したが、一方、ＡＲＲＤＣ１の不在下で生成されたフソソームは、１．２×１０１１個の粒子／ｍｌの濃度を示し（図５２Ｂ）、これは、プロデューサー細胞中のＡＲＲＤＣ１の存在が、さらなるＣｅｌｌＭａｓｋ Ｏｒａｎｇｅ＋（ｆＮＴＡ）粒子の生成をもたらすことを示す。

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  1. 明細書に記載の発明。
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