JP2023134829A

JP2023134829A - 改良されたウイルス検出方法

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Publication number: JP2023134829A
Application number: JP2023122166A
Authority: JP
Inventors: 峻史吉兼; Takashi Yoshikane
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2023-07-27
Publication date: 2023-09-27
Also published as: JP7392309B2; JP2020018295A

Abstract

【課題】試料から核酸の単離や試料の事前の加熱処理を行うことなく、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液と試料とを直接混合し、１ステップＲＴ－ＰＣＲを実施することによりウイルスの有無の検出を可能とする方法およびキットを提供する。【解決手段】試料中のＲＮＡウイルスの検査方法として、以下の工程：（１）核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料と、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程、及び、（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程、を包含することを特徴とする試料中のＲＮＡウイルスの存在の有無を検査するための方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、核酸増幅によるＲＮＡウイルスの検出法に関する。より具体的には、試料からの核酸の単離や試料の加熱を含む前処理をすることなく、試料に一酵素系のリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）の反応液を加えることによるＲＮＡウイルスの検出に関する。本発明の方法は、例えば、糞便試料、血液試料、環境拭き取り試料等におけるＲＮＡウイルスを検出することが可能である。本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等にも利用できる。

核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。アニーリングと伸長を同温度で、２ステップで行う場合もある。

ＲＮＡを分析する場合、このＰＣＲの前段として、鋳型ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する逆転写（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；ＲＴ）を実施する。これをＲＴ－ＰＣＲという。このＲＴ－ＰＣＲは、（１）ＲＴ、ＰＣＲを非連続に実施する２ステップＲＴ－ＰＣＲ、（２）ＲＴ、ＰＣＲを、単一酵素を利用して連続して実施する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ、（３）逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２種類の酵素を利用して、ＲＴ、ＰＣＲを連続的に実施する二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの３つに大別される。

ＲＴ－ＰＣＲのうち、遺伝子検査やウイルス検査では、処理能力の高さや、反応途中での反応容器の開閉によるコンタミネーションを回避するため、１ステップＲＴ－ＰＣＲが好まれる。二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの少なくとも２種類の酵素が使用される。一方で、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼなどの逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが利用される。しかし、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性は一般に、レトロウイルス由来の逆転写酵素の逆転写効率には劣ることから、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲの方が、一酵素系ＲＴ－ＰＣＲに比べて感度が高いとされている（非特許文献１）。従って、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲは、二酵素系ＲＴ－ＰＣＲに比べて高感度化が難しいと考えられてきた。

ウイルス検査の代表例として、病原性ＲＮＡウイルスの一つであるノロウイルスが挙げられる。ノロウイルスは、急性胃腸炎の原因となる１本鎖ＲＮＡウイルスである。感染力が強く、集団食中毒や集団感染を引き起こすことから、公衆衛生上関心の高いウイルスである。ノロウイルスはＧｅｎｏｇｒｏｕｐI（ＧI）及びＧｅｎｏｇｒｏｕｐII（ＧII）の２つの遺伝子群に分類される。ノロウイルスの病原体検査では、組織培養法が確立できておらず、電子顕微鏡法、ＥＬＩＳＡによる免疫学的抗原検出法、または核酸増幅技術を利用したウイルス遺伝子の検出法が開発されてきた。このうち、日本においては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に基づくＲＴ－ＰＣＲ法が公定法として普及している。

ノロウイルスの感染の原因として主にノロウイルスに汚染された食品を飲食することによるが、ヒトの手を介した感染が多いため、調理施設、医療現場、老人介護施設及び保育園などでは定期的な検便検査が求められている。大量調理施設衛生管理マニュアルには、調理従事者等の検便検査に、月に１回以上又は必要に応じノロウイルスの流行期である１０月から３月についてノロウイルスの検査を含めることが追加されている。これはウイルスに感染していても症状がでない人（健康保因者）が少なからず存在し、これらの人たちが知らず知らずのうちに感染を広げる可能性があるためである。さらに、下痢や嘔吐などの症状がある調理従事者は医療機関を受診し、ノロウイルスに感染していることが判明した場合はリアルタイムＰＣＲ等の高感度検査を実施し、ノロウイルスを保有していないことが確認されるまでは食品に直接触れる調理作業を控えるなどの適切な処置をとることが望まれている。

ノロウイルスは、ウイルスＲＮＡゲノムが約３０ｎｍのキャプシドタンパク質からなる正二十面体の内部に封入された、キャプシド構造を有する。キャプシド構造は、ウイルスが消化管などの過酷な環境でも生存できるように、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性を持つ。通常の界面活性剤や７０％エタノールに代表されるウイルス不活化剤では、このキャプシド構造を破壊できず、ウイルスの感染能が維持される。キャプシド構造を破壊するには、少なくとも８５℃以上、１分以上の過酷な条件での熱処理が必要とされている（非特許文献２）。

従来、糞便試料からのノロウイルスの検出は、例えば糞便の１０％懸濁液を作製し、遠心上清から市販のウイルスＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出・精製し、このＲＮＡ抽出液を用いてノロウイルスの検出が行われてきた（食安監１１０５００１号）。しかし、短時間で多数の検体を検査するには、このＲＮＡ抽出作業は煩雑である。

そこで、近年、糞便試料中のノロウイルスのキャプシドを前処理によって破壊し、ウイルスＲＮＡを露出させた処理液をＲＴ－ＰＣＲに供することでウイルスの有無を検出する手法がとられるようになった（特許文献１）。この手法では、試料に前処理液を添加後、熱処理を加えることで、糞便試料や拭き取り検査の濃縮試料から事前にＲＮＡの単離を実施せずにウイルスキャプシドを破壊し、効率よくウイルスＲＮＡの有無を検出できる。

この際、ＲＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中に含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。これらの影響を低減するような工夫がＰＣＲ反応液になされている。便試料にスパイクされたＤＮＡを検出する際のＰＣＲ阻害は、マグネシウム存在下で夾雑耐性を持つｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの使用によって、改善されることが報告されている（非特許文献３）。特許文献１に記載の方法では、前記ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを使用して、夾雑耐性を強化した二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ系を利用している。

しかしながら、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲに用いられるレトロウイルス由来の逆転写酵素は、好熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼに比べ、耐熱性の面で大幅に劣るとも言われている(非特許文献４)。このため、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲでは、逆転写酵素を含む反応液に対して、ウイルス破砕のための熱処理を高温で実施することができない。従って、未処理の試料を直接ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加し、熱処理によってウイルスのキャプシド構造を破壊してＲＮＡを検出することができない。

特許文献１に記載の方法では、逆転写酵素の失活を避けるために、前処理において予め熱処理を施した試料に対して、ＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加する。この手法では、試料に前処理液を加えて熱処理を実施する作業と、その後のＲＴ－ＰＣＲ反応液を新たに添加する作業の２ステップを要することとなり、ウイルスキャプシドを破壊する前処理ステップに多少の手間と労力を要する。また、これらの試薬を添加する作業は、反応容器の蓋の開閉を含み、コンタミネーションを引き起こす可能性が完全には否定できない。

そこで、堅いキャプシド構造を有するＲＮＡウイルスであっても、核酸の単離も事前の加熱処理も行われておらず夾雑物質を含み得る試料（いわゆるクルードサンプル）を、直接ＲＴ－ＰＣＲ反応液に添加してＲＴ－ＰＣＲを行う、迅速で簡便なウイルスＲＮＡの検出法が求められている。

特開２０１８－０００１３８号公報

ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２５巻，１９９８年、第２３０－２３４頁食品衛生学雑誌、第４６巻、２００５年、第２３５－２４５頁Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第３８巻、２０００年、第４４６３－４４７０頁ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，第３７巻、２００９年、第４７３－４８１頁

事前に精製されたノロウイルス合成ＲＮＡに対する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲによる低コピーＲＮＡの検出において、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ量による影響を検討した結果を示す図である。

本発明の目的は、試料からウイルスＲＮＡの単離や、試料の事前の前処理を行うことなく、１ステップＲＴ－ＰＣＲにより、従来知られている手法以上の簡便な手法を用いてウイルスＲＮＡの有無の検出を可能とすることである。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、ウイルスＲＮＡの精製や事前の熱処理を行っていない試料を一酵素系の１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液と混合後、直接１ステップＲＴ－ＰＣＲに供することで、ウイルスＲＮＡの検出が可能であることを見出した。
さらに本発明者らは、ウイルスの変性に必要な熱処理ステップ、及び/またはホットスタート酵素を不活化する熱処理工程を１ステップＲＴ－ＰＣＲサイクルに含むことができる反応液組成の検討を進め、従来知られていたマグネシウム存在下だけでなく、マンガン存在下においても、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ等の逆転写活性を有する耐熱性ポリメラーゼが夾雑耐性を持つことを見出した。また、従来ＲＴ－ＰＣＲ反応中の非特異増幅を引き起こすために、ＤＮＡポリメラーゼ量の増加は望ましくないとされてきたが、全く予想外のことに、核酸の単離や事前の加熱処理等の前処理を行っていない試料の存在下であえて逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ量を増量させることにより、夾雑耐性が付与され、非特異増幅を抑制できることを見出した。その結果、同一反応容器内において反応液と前記のような前処理を行っていない試料とを混合し反応容器を密閉後、ＲＴ－ＰＣＲのための温度サイクルで反応を行うだけで、ウイルスＲＮＡを直接検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

代表的な本願発明は、以下の通りである。
［項１］試料中のＲＮＡウイルスの検査方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする試料中のＲＮＡウイルスの存在の有無を検査するための方法。
（１）核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料と、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
［項２］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液における前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量が４．２ｎｇ/μＬ以上である項１に記載の方法。
［項３］前記工程（１）及び（２）が同一容器で行われることを特徴とする項１又は２に記載の方法。
［項４］工程（２）において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施することを特徴とする項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］工程（２）において、サイクル反応の前及び／又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び／又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む項１から４のいずれかに記載の方法。
［項６］前記熱処理が、６０℃以上であり、かつ１秒以上の加熱を行うことを特徴とする項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］工程（２）のＲＴ－ＰＣＲ反応サイクルにおいて、ＰＣＲの伸長時間が１５秒以下である項１から５のいずれかに記載の方法。
［項８］試料が血液試料、糞便試料、及び／又は拭き取り検査試料である項１から７のいずれかに記載の方法。
［項９］試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項１から８のいずれかに記載の方法。
［項１０］試料が懸濁液の遠心上清である項１から９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ウイルスがエンベロープをもたないＲＮＡウイルスである項１から１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ＲＮＡウイルスがノロウイルスである項１１に記載の方法。
［項１３］ノロウイルスがＧI型かＧII型であるかの判別が可能であることを特徴とする項１２に記載の方法。
［項１４］前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙＡに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１から１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項１から１４のいずれかに記載の方法。
［項１６］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、ＲＮＡウイルス由来の核酸を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下である項１から１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、ウイルス由来の核酸を検出するための蛍光標識プローブを含み、前記蛍光標識プローブの濃度が０．０１μＭ以上１．０μＭ以下である項１から１６いずれかに記載の方法。
［項１８］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１から１７のいずれかに記載の方法。
［項１９］逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含むことを特徴とする、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料においてＲＮＡウイルスの検査を行うための検査用キットまたは組成物。
［項２０］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液における前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量が４．２ｎｇ/μＬ以上である項１９に記載の検査用キットまたは組成物。
［項２１］前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙＡに属するＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項２０に記載の検査用キットまたは組成物。
［項２２］前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする項２０または２１に記載の検査用キットまたは組成物。
［項２３］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、ウイルス由来の核酸を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下である項１９から２２のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
［項２４］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、ウイルス由来の核酸を検出するための蛍光標識プローブを含み、前記蛍光標識プローブの濃度が０．０１μＭ以上１．０μＭ以下である項１９から２３のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
［項２５］前記一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液が、更に１ｍＭ以上の２価陽イオンを含む、項１９から２４のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
［項２６］ＲＮＡウイルスがエンベロープをもたないウイルスである項１９から２５いずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
［項２７］ＲＮＡウイルスがノロウイルスである項１９から２６のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
［項２８］ノロウイルスがＧI型かＧII型であるかの判別が可能であることを特徴とする項１９から２７のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。

本発明によって、試料からＲＮＡウイルスの核酸の単離や事前の試料の熱処理を必要とせず、当該試料と１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合後、熱処理ステップを内包したＲＴ－ＰＣＲが可能となる。従って、特定の実施態様において、試料中のウイルス、中でもウイルスの破砕が難しい非エンベロープウイルスの有無を検出するのに有用である。さらに、検査業務がさらに効率化することから、ウイルス感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、感染症予防にも寄与し得る。また、熱処理工程の省略化により反応容器の蓋の開閉作業も省略が可能となる。この結果、蓋の長時間開放におけるウイルス含有サンプルの飛散リスクを低減させることができ、他のサンプルへのコンタミネーションリスクも低減することができる。これにより、偽陽性発生リスクも抑えることができ、検査業務の精度を更に高めることができる。

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。

本発明の一態様は、試料中のノロウイルスなどのＲＮＡウイルスの検査であって、試料からウイルスＲＮＡの精製や試料の事前の熱処理を行うことなく、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と、試料とを混合することからなるＲＮＡウイルスの存在の有無を検査するための方法である。ここで、ＲＮＡウイルスは、非エンベロープＲＮＡウイルスであってもよく、更に、硬いキャプシド構造にＲＮＡが保持されているＲＮＡウイルスであってもよい。

本発明の試料中のＲＮＡウイルスの存在の有無を検査するための方法は、少なくとも以下の工程が含まれることを特徴とするウイルスの存在の有無を検査するための方法である。
（１）核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料と、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程。
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。
前記工程（１）における混合する工程は、例えば、分離精製を伴うような核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料に、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を添加することによって行うことができる。前記工程（１）および（２）は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程（１）および（２）の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程（２）においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。

本発明における検査対象はＲＮＡウイルスであり、特に限定されるものではない。なかでも、脂質二重膜に由来するエンベロープを持たない、非エンベロープ性のＲＮＡウイルスである。このような非エンベロープＲＮＡウイルスとしては、アストロウイルス科ウイルス（例えば、アストロウイルス）；カリシウイルス科ウイルス（例えば、サポウイルス、ノロウイルス）；ピコルナウイルス科ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）；へぺウイルス科ウイルス（例えば、Ｅ型肝炎ウイルス）；レオウイルス科ウイルス（例えば、ロタウイルス）などが挙げられ、限定されるものではないが、好ましくはカリシウイルス科ウイルス及びレオウイルス科ウイルスの検出に有用であり、より好ましくはノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスの検出に有用であり、特にノロウイルスの検出に有用である。非エンベロープウイルスの多くが糞口感染などによって消化管に感染可能で、胃酸による不活性化や胆汁酸の界面活性作用等に耐性のある、堅いキャプシド構造にＲＮＡが保持されている。

ノロウイルスは、大きく、ＧＩ型ノロウイルス及びＧＩＩ型ノロウイルスの遺伝子型で分類されることが知られている。そして、ＧＩ型ノロウイルスとＧＩＩ型ノロウイルスを判別することが、感染経路の推定などの疫学的データを収集する観点から望まれている。本発明のＲＮＡウイルス検査法では、ノロウイルスの存在の有無を確認できるだけでなく、感染しているノロウイルスがＧＩ型であるかＧＩＩ型であるかの判別（鑑別）も可能であるという点で非常に有益である。

本発明において用いられる試料として、例えば糞便（排泄便、直腸便）、嘔吐物、唾液などが挙げられるが、限定されるものではなく、生体に由来するもの全般に用いることが可能であり、特に糞便（排泄便、直腸便）からの検出に有用である。本発明においては、これら試料を市販のＲＮＡ精製キットでＲＮＡを単離したり、あるいは熱処理でＲＮＡをウイルス構造から露出させるための事前の熱処理を実施したりする必要がないことを一つの特徴とするものである。前記試料は直接検出に供してもよいし、夾雑物の反応への影響を低減し、より安定した検査結果を得るために、水、生理食塩水または緩衝液に前記試料を懸濁した試料であってもよい。さらに、糞便など特に夾雑物の多い試料では、遠心分離し、その上清を使用してもよい。あるいは、フィルターろ過を実施してもよい。前記緩衝液としては、特に限定されるものではないが、ハンクス緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。

本発明における別の態様の試料としては、拭き取り検査試料である。汚染経路の解明や施設環境等の汚染状況の把握には、拭き取り検査が有用である。本発明において、拭き取り検査とは、特に限定されるものでないが、例えば綿棒等で該当区画や設備等を拭き取り、水や緩衝液に溶出し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱などで濃縮した試料である。具体的な拭き取り検査の要領としては、「ふきとり検体のノロウイルス検査法の改良」（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｓｃ．ｎｉｈ．ｇｏ．ｊｐ／ｉａｓｒ／３２／３８２／ｄｊ３８２４．ｈｔｍｌ）などが例示されるが、特に限定はされるものではなく、これに準ずる方法が広く含まれる。拭き取り箇所の例としては、まな板や包丁、ふきん、食器などの調理器具類、冷蔵庫の取手やトイレ、浴室のドアノブ、洗面所、厨房、トイレ、浴室などの蛇口、調理者の手や指、浴室、トイレ、洗面、手すり、居室などの施設などが挙げられる。また、拭き取り検査ではないが、環境検査として、下水試料の濃縮試料にも適用できる。これらの検査試料は、検査場所の汚れやほこりを多量含むことから、夾雑耐性を強化した本手法はこれらの検査に対して有益である。

試料の移し替えまたは加熱処理工程の際には、反応容器の開閉作業が生じる。反応容器の開閉作業は煩雑化かつ作業時間を伸ばす原因となる。これに加えて、ウイルス含有検体の入った反応容器の開閉には、ウイルス及びウイルス由来ＲＮＡの飛散リスクが生じる。ウイルスの飛散は作業者の安全及び健康を脅かすものであると同時に、検査作業環境の汚染を意味する。飛散したＲＮＡウイルスは作業場においてエアロゾル化するため、同時に検査している他のサンプルの汚染リスクが問題となっている。このため、蓋の開閉工程のないＲＴ－ＰＣＲを用いたウイルスの存在の有無を検査方法は、作業の単純化以上の意義を持っている。

前記工程（２）におけるＲＴ－ＰＣＲサイクルは、１．熱処理、２．逆転写反応、３．ＰＣＲの３ステップから成る。各ステップの前後に、ホットスタート酵素を活性化させるための熱処理工程を含んでもよい。１の熱処理工程では、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させる、及び／もしくは核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させる工程を含む。これらの熱処理工程を含むことにより、ウイルスのキャプシド構造からＲＮＡを露出（溶出）させることが可能となる。前記熱処理工程の温度及び時間は、６０℃以上であり、かつ１秒以上であればよく、好ましくは７０℃、３０秒以上、より好ましくは８０℃、３０秒以上、特に好ましくは８５℃、３０秒以上である。２の逆転写反応の温度は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性と、プライマー及びプローブのＴｍ値によって決定され、少なくとも２５℃以上であればよい。より好ましくは３７℃以上である。３のＰＣＲでは、［１］熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、［２］鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、［３］ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、の３ステップを含んでいればよく、［２］と［３］を同一の温度で実施して、２ステップとしてもよい。迅速なＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応に使用するサーマルサイクラーは、前記［２］と［３］のステップの伸長時間を合わせて１５秒以下、より好ましくは１０秒以下の測定プログラムを設定することが望ましい。なお、本明細書において「ＰＣＲの伸長時間」とは、サーマルサイクラーでの設定温度を指す。

前記混合液に添加される１ステップＲＴ－ＰＣＲ溶液は、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする。逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとは、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する能力とＤＮＡを増幅する能力を兼ね備えたＤＮＡポリメラーゼである。また、耐熱性とは、７０℃で１分以上の熱処理を実施しても、酵素活性が半分以上低下しないことをいう。由来は特に限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，Ｂｃａ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴやこれらの変異体が挙げられる。これまでに逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）、ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）やＴｈｅｒｍｕｓｓｐＺ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）などが挙げられ、これらの逆転写活性と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が失われていない変異体であってもよい。また、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ）の変異体であって、逆転写活性を有するものが知られており（例えば、ＲＴＸ：ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｘｅｎｏｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、本発明にはこのような逆転写酵素活性を併せ持つ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば、限定されるものではない。

本明細書において、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの変異体とは、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、なかでも好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものをいう。ここで、アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、当該分野で公知の任意の手段で行うことができる。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、一例として、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出することが可能である。また、本発明に用いられ得る変異体は、その由来である野生型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」ともいう）したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つ、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同様にＲＮＡをｃＤＮＡに変換する活性及びＤＮＡを増幅する活性を有するものであってもよい。ここで１又は数個とは、例えば、１～８０個、好ましくは１～４０個、よりこのましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個であり得るが、特に限定されない。

本発明に用いられる逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えＦａｍｉｌｙＡに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、特に好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｚ０５及びこれらの変異体からなる群より選択される逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量は、一例として、少なくとも４．２ｎｇ／μＬ以上あればよく、５．０ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５．８ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましい。なかでも好ましくは、８．３ｎｇ／μＬ以上である。一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの総量の上限は特に限定されないが、一例として、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができ、１６．７ｎｇ／μＬ以下であっても十分に本発明の効果を得ることができる。ポリメラーゼの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法もしくはＮａｎｏｄｒｏｐ（サーモフィッシャー社）により定量した値であり、安全データシート（ＳＤＳ）から概算してもよい。ＢＳＡなどのタンパク質を含む場合は、後者の方法で算出することが望ましい。

本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する前に、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。

本発明に用いられる１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの他、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象のウイルスＲＮＡの検出対象領域に対応するプライマー対、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。

本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～９、より好ましくはｐＨ７～９に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが挙げられる。

本発明で使用されるｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションに対する予防処置をとってもよい。クロスコンタミネーションに対する予防処置を講じる場合、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含むことが好ましい。

更に、本発明では、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＴ反応液に、２価陽イオンを含むことが好ましい。このように２価陽イオンを含むことで、より安定して高い夾雑耐性が得られ高感度な検出が可能となる。２価陽イオンとしては、特に限定されないが、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、銅イオン、鉄イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン等を挙げることができる。好ましくは、２価陽イオンとして、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含むことが好ましい。本発明において、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液にマグネシウムイオンやマンガンイオン等を添加する場合は、マグネシウムやマンガンを添加してもよいし、これらの塩を添加してもよい。マグネシウム又はその塩としては、マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等が例示され、マンガン又はその塩としては、マンガン、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示される。このようなマグネシウム、マンガン、又はこれらの塩は、ＲＴ－ＰＣＲ反応液中に１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。本発明のＲＮＡウイルス検査方法において安定的に高い感度が得られ易いという観点からは、マンガン又はその塩を含むことが好ましい。特定の実施態様では、ＲＴ－ＰＣＲ反応液において１ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、１．５ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことが好ましく、２．０ｍＭ以上のマンガン又はその塩を含むことがより好ましい。

さらに１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる添加剤として、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコール、及び界面活性剤よりなる群から選択された少なくとも１つを含んでいてもよい。

前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれるウシ血清アルブミンの濃度は特に限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍｌ以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、１０ｍｇ／ｍｌ以下とすることができる。

前記１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液に含まれる界面活性剤としては、トリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、トリトンＸ－１１４（ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４）、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０），ノニデットＰ４０、Ｂｒｉｊｉ３５、Ｂｒｉｊｉ５８、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ｅｍｕｌｇｅｎ４２０などが挙げられるが、特に限定されない。ＲＴ－ＰＣＲ反応液中の前記界面活性剤の濃度も特に限定はされないが、好ましくは０．０００１％以上、より好ましくは０．００２％以上、さらに好ましくは０．００５％以上で、良好な検出が可能となる。上限は特に限定されないが、一例として、０．１％以下とすることができる。

さらには、当該技術分野でＲＴ－ＰＣＲを促進することが知られる物質と組み合わせて使用することもできる。本発明において有用な促進物質とは、例えば、グリセロール、ポリオール、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄または酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ），塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに反応阻害を低減するように、エチレングリコール-ビス(２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のようなキレート剤を含んでいてもよい。

本発明に用いられるプライマー対としては、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが挙げられる。また、別の態様として、上記プライマーが２対以上含まれる、いわゆるマルチプレックスＰＣＲも挙げられる。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。本発明でエンベロープを持たないＲＮＡウイルスの１種であるノロウイルスを検出する場合、プライマー対の例としては、ノロウイルス検出用のプライマーとしては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー記載のプライマー（配列番号１～５）が挙げられるが、これに限るものではない。
前記記載のプライマーでは、配列番号１、２によりノロウイルスＧ１型、配列番号３～５によりノロウイルスＧ２型を検出する。検出対象のプライマー濃度としては、特に限定はされないが、ＲＴ－ＰＣＲ反応液全体に対して、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．１μＭ以上３μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、フォワードプライマーの濃度が０．１μＭ以上２μＭ以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が０．５μＭ以上２μＭ以下である。

本発明は、別の態様としては、さらに、少なくとも１種類の標識されたハイブリダイゼーションプローブまたは２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含む検出方法である。これによって、増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、コンタミネーションのリスク低減が可能である。ウイルスのサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、ウイルスのサブタイプを識別することも可能である。

２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ，ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ）などが挙げられる。

本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）、モレキュラービーコン（米国特許第５，１１８，８０１号公報）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（国際公開第９７／４６７０７号パンフレット，国際公開第９７／４６７１２号パンフレット，国際公開第９７／４６７１４号パンフレット）などが挙げられる。ノロウイルス検出用のプローブの塩基配列としては、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載の配列（配列番号６～９）が挙げられるが、これに限るものではない。前記記載のプローブ配列では、配列番号６または７によりノロウイルスＧ１型、配列番号８または９によりノロウイルスＧ２型を検出する。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重配列を含んでもよい。蛍光標識プローブの濃度としては、０．０１μＭ以上１．０μＭ以下であることが好ましい。より好ましくは、０．０１３μＭ以上０．７５μＭ以下であり、更に好ましくは、０．０２μＭ以上０．５μＭ以下である。

本発明の別の一態様は、試料中のウイルスＲＮＡの検査用キットまたは組成物であって、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含有する一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液を含むことを特徴とする、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料においてＲＮＡウイルスの検査を行うための検査用キットまたは組成物である。

この実施態様において使用される逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの種類や量、プライマー又はプローブの種類や量、検査対象となるＲＮＡウイルス等は、前記のＲＮＡ検査方法において詳述したものと同様であり得る。

以下、実施例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

試験例１．二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲによる熱処理工程の検討
（１）試料の調製
ヒト糞便１０検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２－１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおいて、糞便中のノロウイルスを検出した。
反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μＬＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２－２）試料の熱処理
（１）で調製した試料１μＬについて、条件１から条件６までの前処理を実施した。
条件１９０℃、１分間の熱処理
条件２８５℃、１分間の熱処理
条件３８０℃、１分間の熱処理
条件４７５℃、１分間の熱処理
条件５７０℃、１分間の熱処理
条件６なし
（３）反応
前記反応液、前処理液、プライマー液、プローブ液を混合して、最終液量が２４μＬとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。条件１から６までの前処理を実施した試料に対して、前記ＲＴ－ＰＣＲ反応液を加えた。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
４２℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
条件１、２において、全ての検体でノロウイルスが陽性と判定された。一方、条件６では、１８検体中１２検体においてノロウイルス検体の検出が可能であるが、まれに検出できない検体が存在することが判明した。具体的には、検体５、９、１１、１３、１４、１７である。検体１３、１７は７０℃以上、検体５は８０℃以上、検体９、１１、１４は８５℃以上の熱処理によって、ノロウイルスの検出が可能となった。従って、検体中のノロウイルスを高感度に検出するためには、少なくとも８５℃以上の熱処理によって、ノロウイルスの破砕を実施する必要がある。

試験例２．二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲによる逆転写酵素の耐熱性の確認
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ１２５０コピー（Ｎ＝２）を各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（２－１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける逆転写反応前の熱処理の有無によって、逆転写酵素の耐熱性を比較評価した。
反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（２－２）逆転写酵素
条件１０．０５ｕｎｉｔ／μＬＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）
条件２０．０５ｕｎｉｔ／μＬＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＸＬ（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＡｄｖａｎｃｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
条件３０．０５ｕｎｉｔ／μＬＥｖｏＳｃｒｉｐｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）
条件４０．０５ｕｎｉｔ／μＬＳｕｎＳｃｒｉｐｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＳＹＧＮＩＳ）
条件５０．０５ｕｎｉｔ／μＬＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
条件６Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ１μＬ／反応系（ＱＩＡＧＥＮ）
条件７Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ１μＬ／反応系（ＱＩＡＧＥＮ）
（３）反応
前記反応液、プライマー液、プローブ液を混合して、条件１から条件７までの逆転写酵素を含むＲＴ－ＰＣＲ反応液を、最終液量が２５μＬとなるように調製した。これを以下の温度サイクルＡ又はＢで反応させ、サイクルの途中でｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及び抗Ｔｔｈ抗体を添加した。サイクルＡ及びサイクルＢ共に、条件１から４は逆転写温度を６０℃、条件５から７は逆転写温度を３７℃で実施した。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して実施し、５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
サイクルＡ
８５℃ １分
ｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及び抗Ｔｔｈ抗体の添加
６０℃ １０分又は３７℃ １０分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
サイクルＢ
ＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及び抗Ｔｔｈ抗体の添加
６０℃ １０分又は３７℃ １０分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
プローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出―（東洋紡）添付品）ではＦＡＭチャネルで内部コントロール遺伝子、Ｃｙ５チャネルでノロウイルスＧ１、ＲＯＸチャネルでノロウイルスＧ２を検出する。ここでは、Ｇ１、Ｇ２ＲＮＡのＣｑ値を表２に示す。感度が低く十分には検出ができなかった場合はハイフンで示す。この結果、サイクルＡでは、全ての条件においてＧ１、Ｇ２共にＲＮＡを検出できなかったのに対して、サイクルＢでは全ての条件においてＧ１、Ｇ２共に陽性であった。すなわち、サイクルＡに含まれる８５℃、１分の熱処理工程において、全ての逆転写酵素が失活している。従って、サイクル反応の前に、ウイルスを破砕する、及び/もしくはホットスタート酵素を活性化させる手法として、熱処理を実施することを含むウイルスの検査方法において、逆転写酵素を使用する二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲは適さない。

試験例３．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ量の検討
（１）試料
事前に精製されたノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ５０コピー（Ｎ＝３）を各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。この試料は、事前に単離して精製されたＲＮＡを反応液に添加していることから、糞便や血液などの生体由来成分の夾雑物質を含んでいない試料といえる。
（２－１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（２－２）酵素量
条件１４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件２８．３ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件３１２．５ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件４１６．７ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
（３）反応
各条件において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ＲＮＡの増幅曲線を図１に示す。条件１から条件４について、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの量を増加させるに従って、Ｇ１、Ｇ２共に増幅曲線の到達蛍光強度が減少した。この傾向は、ノロウイルスＧＩＩ型の検出において顕著であった。この結果は、反応液中のポリメラーゼ量が増加するに従って、非特異増幅が増加していることを示唆している。

試験例４．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける糞便存在下での耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ量の検討
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２共に陰性のヒト糞便３検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ５０コピー（Ｎ＝３）を各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（２－１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（２－２）酵素量
条件１２．５ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件２４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件３５．０ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件４５．８ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件５６．７ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件６８．３ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件７１２．５ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
条件８１６．７ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
（３）反応
各条件において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。これらのＲＴ－ＰＣＲ反応液に、（１）で調製した便懸濁液をそれぞれ１μＬずつ添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ＲＮＡのＣｑ値を表３に示す。感度が低く十分には検出ができなかった場合はハイフンで示す。条件１では、Ｇ１、Ｇ２共にノロウイルス合成ＲＮＡ５０コピーを十分には検出できなかった。これに対して、酵素量を増加させることによって、条件４以降でノロウイルス合成ＲＮＡの検出が可能となり、とりわけ条件６以降ではＧ１、Ｇ２共に検出が安定化した。

試験例５．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける伸長時間の増加
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２共に陰性のヒト糞便３検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ５０コピー（Ｎ＝３）を各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（２－１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
各条件において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。これらのＲＴ－ＰＣＲ反応液に、（１）で調製した便懸濁液をそれぞれ１μＬずつ添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １５秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １５秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ＲＮＡのＣｑ値を表４に示す。感度が低く十分には検出ができなかった場合はハイフンで示す。実施例４における酵素量４．２ｎｇ／μＬでは、ノロウイルスＧ１／Ｇ２ＲＮＡを十分には検出できなかったが、伸長時間を伸ばすことによってノロウイルスＧ２の感度の良い検出が可能となった。従って、伸長時間を短くして迅速にＲＴ－ＰＣＲを実施するためには、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液中の酵素量を増加させる必要があることがわかる。これらの試験例４、５で認められた結果を総合考慮すると、具体的にＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを使用する場合に１０秒以内の伸長時間とするためには、少なくとも５．８ｎｇ／μＬ以上、好ましくは８．３ｎｇ／μＬ以上の逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用する必要があることが示された。

試験例６．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおけるプライマー量の検討
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２共に陰性のヒト糞便３検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ２５０コピーを各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（２－１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおけるプライマー量の検討を実施した。
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（２－２）プライマー量
ノロウイルス検出用のプライマーとして、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプライマー（配列番号１～５）を使用した。
条件１１０ｎＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、１ｎＭＡＬＰＦ
条件２２０ｎＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、２ｎＭＡＬＰＦ
条件３４０ｎＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、４ｎＭＡＬＰＦ
条件４０．１μＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、１０ｎＭＡＬＰＦ
条件５０．２μＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、２０ｎＭＡＬＰＦ
条件６０．４μＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、４０ｎＭＡＬＰＦ
条件７０．９μＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、９０ｎＭＡＬＰＦ
条件８２μＭ各ＣＯＧ１Ｆ・ＣＯＧ１Ｒ・ＣＯＧ２Ｆ・ＣＯＧ２Ｒ、０．２μＭＡＬＰＦ
（３）反応
各条件において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。これらのＲＴ－ＰＣＲ反応液に、（１）で調製した便懸濁液をそれぞれ１μＬずつ添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ＲＮＡのＣｑ値を表５に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。条件４から８までの範囲のプライマー濃度において、Ｇ１、Ｇ２共にノロウイルス合成ＲＮＡ２５０コピーを検出することが可能であった。

試験例７．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおけるプローブ量の検討
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２共に陰性のヒト糞便３検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ２５０コピーを各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（２－１）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおけるプローブ量の検討を実施した。
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（２－２）プローブ量
ノロウイルス検出用のプローブとして、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知（食安監１１０５００１号）に記載のプローブ（配列番号６～９）を使用した。
条件１１ｎＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、０．４ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
条件２３ｎＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、０．８ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
条件３５ｎＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、２ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
条件４１３ｎＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、４ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
条件５２５ｎＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、８ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
条件６５０ｎＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、１５ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
条件７０．１μＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、３０ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
条件７０．２μＭ各Ｃｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）・ＲＯＸ標識ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ、６０ｎＭＣｙ５標識プローブＲＩＮＧ１－ＴＰ（ｂ）
（３）反応
各条件において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。これらのＲＴ－ＰＣＲ反応液に、（１）で調製した便懸濁液をそれぞれ１μＬずつ添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２ＲＮＡのＣｑ値を表６に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。条件４から８までの範囲のプローブ濃度において、Ｇ１、Ｇ２共にノロウイルス合成ＲＮＡ２５０コピーを検出することが可能であった。

試験例８．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの検討
（１）試料
ノロウイルスＧ１、Ｇ２共に陰性のヒト糞便３検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスＧ１、Ｇ２合成ＲＮＡ１２５０コピー（Ｎ＝２）を各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを検討した。ここで使用した２種類の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはいずれも、逆転写活性を有することが知られている。
（２－１）ＴｈｅｒｍｕｓｓｐｅｃｉｅｓＺ０５由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
０．２０ｕｎｉｔ／μＬＨａｗｋＺ０５ＦａｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（２－２）Ｔｈｅｒｍｕｓａｃｑａｔｉｃｕｓ由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＶｏｌｃａｎｏ２ＧＲＴ－ＰＣＲ２ｘＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ｍｙＰＯＬＳＢｉｏｔｅｃｈ）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
Ｖｏｌｃａｎｏ２ＧＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｍｙＰＯＬＳＢｉｏｔｅｃｈ）
（３）反応
（２－１）において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。（２－２）において、Ｖｏｌｃａｎｏ２ＧＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付の取り扱い説明書に従い、ＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。これらのＲＴ－ＰＣＲ反応液に、（１）で調製した便懸濁液をそれぞれ１μＬずつ添加した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
条件１及び２のいずれの条件においても、Ｇ１、Ｇ２共にノロウイルス合成ＲＮＡ１２５０コピーを検出することが可能であった。

試験例９．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける不活化ノロウイルスの検出
（１）試料
不活化ノロウイルスＮＡＴｔｒｏｌＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ／ＧＩＩＰｏｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）１２５０、２５０（Ｎ＝２）、５０（Ｎ＝２）、２５（Ｎ＝２）、０コピーを各ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。ここで、本試験例で用いた不活化ノロウイルスサンプルは、糞便と類似の環境を整えるために夾雑物質を含むものである。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける不活化ノロウイルスの検出を実施した。
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
各条件において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２不活化ウイルスのＣｑ値を表７に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。１２５０コピーから２５コピーまでの不活化ノロウイルスを検出が可能であった。

試験例１０．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける拭き取り検体の検出
（１）試料
（１－１）拭き取り試料
不活化ノロウイルスＮＡＴｔｒｏｌＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ／ＧＩＩＰｏｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）１０００コピー（Ｎ＝２）をプラスチック板の１０ｃｍ×１０ｃｍ（１００ｃｍ^２）領域に塗布した。ＢＤラスパーチェック^ＴＭふき取り検査用スワブ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）と濃縮液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－ふき取り－＜３色プローブ検出＞（東洋紡）添付品）を用いて、上記の１０ｃｍ×１０ｃｍ（１００ｃｍ^２）領域から拭き取り検体の回収と濃縮を実施した。拭き取り検体の回収と濃縮は、取扱説明書（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－ふき取り－＜３色プローブ検出＞（東洋紡）添付品）に従った。濃縮後の白色沈殿を、前処理液１μＬ（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－ふき取り－＜３色プローブ検出＞（東洋紡）添付品）で懸濁して、ＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（１－２）スパイク試料（コントロール）
不活化ノロウイルスＮＡＴｔｒｏｌＮｏｒｏｖｉｒｕｓＧＩ／ＧＩＩＰｏｓｉｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ、ｉｎｔａｃｔ）１０００コピー（Ｎ＝２）をＲＴ－ＰＣＲ反応液にスパイクした。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける不活化ノロウイルスの検出を実施した。
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
各条件において、Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、２０μＬずつに分注した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２不活化ウイルスのＣｑ値を表８に示す。拭き取り試料とスパイク試料のいずれにおいても、不活化ノロウイルス１０００コピーをＮ＝２で検出可能であった。さらに、拭き取り試料はスパイク試料に比べて同等のＣｑ値、すなわち同等の感度で検出できていることがわかる。従って、本発明は、拭き取り検査試料中のノロウイルスの検出にも適応可能であることが判明した。

試験例１１．一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲによる検体の検出
（１）試料の調製
ヒト糞便１６検体を１０％（重量％）となるように懸濁した。この懸濁液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を使用した。
（２）反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、従来の二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲと本発明の一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲにおける、糞便中のノロウイルスを検出について対比検討した。
（２－１）条件１
反応液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
前処理液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東・BR>M紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
０．０５ｕｎｉｔ／μＬＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）
（２－２）条件２
２ｘ反応液（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
５０ｍＭＭｎ（ＯＡｃ）_２（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔ^ＴＭＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（東洋紡）添付品）
１０ｘプライマー液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
１０ｘプローブ液（ノロウイルス検出キットＧ１／Ｇ２－高速プローブ検出－（東洋紡）添付品）
４．２ｎｇ／μＬｒＴｔｈＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０１μｇ／μＬ抗Ｔｔｈ抗体
（３）反応
（３－１）条件１
試料１μＬに対して、前記前処理液を添加し、８５℃、１分間の熱処理を実施した。その後、反応液、プライマー液、プローブ液の混合液４５μＬを添加し、ＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製した。これをＢｉｏＲａｄ製ＣＦＸ９６ＷＥＬＬＤＥＥＰを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
４２℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（３－２）条件２
Ｍｎの終濃度が２．５ｍＭとなるようにＲＴ－ＰＣＲ反応液を調製し、１９μＬずつに分注した。これらのＲＴ－ＰＣＲ反応液に対し、試料１μＬを添加した。これを以下の温度サイクルで、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００）を用いて、リアルタイムＰＣＲ反応を実施した。５４℃、３５サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
９０℃ １分
６０℃ ３分（逆転写反応）
９５℃ １０秒
９５℃ １秒－５４℃ １０秒１０サイクル（ＰＣＲ）
９５℃ １秒－５４℃ １０秒３５サイクル（ＰＣＲ）
（４）結果
Ｇ１、Ｇ２糞便中のノロウイルスのＣｑ値を表８に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。条件１において、ノロウイルスＧ１陽性とされた検体については、全て条件２でも検出が可能であった。同様に、条件１でノロウイルスＧ２陽性とされた検体についても、全て条件２でも検出が可能であった。従って、条件２の一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、条件１の事前に加熱の前処理を施した二酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ試薬と同等に、糞便中のノロウイルスの検出が可能である。また、検体６は、条件１及び条件２共にノロウイルスＧ１、Ｇ２陽性となった。この結果から、条件２の一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液は、共感染の判別も可能であることが示された。

本発明は、分子生物学研究、さらに臨床検査や食品衛生管理などを目的とした検査において、好適に用いられる。

Claims

試料中のＲＮＡウイルスの検査方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする試料中のＲＮＡウイルスの存在の有無を検査するための方法。
（１）核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料と、逆転写活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む一酵素系１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応液とを混合する工程、及び、
（２）反応容器を密閉後、１ステップＲＴ－ＰＣＲ反応を実施する工程。