JP2020018295A - 改良されたウイルス検出方法 - Google Patents
改良されたウイルス検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020018295A JP2020018295A JP2019134503A JP2019134503A JP2020018295A JP 2020018295 A JP2020018295 A JP 2020018295A JP 2019134503 A JP2019134503 A JP 2019134503A JP 2019134503 A JP2019134503 A JP 2019134503A JP 2020018295 A JP2020018295 A JP 2020018295A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pcr
- dna polymerase
- sample
- enzyme
- reaction solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 55
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 194
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 147
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 66
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 52
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 35
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 33
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 184
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 claims description 120
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 66
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 66
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 244000309457 enveloped RNA virus Species 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 152
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 50
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 41
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 31
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 24
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 18
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 18
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 208000035217 Ring chromosome 1 syndrome Diseases 0.000 description 16
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 12
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 11
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 11
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 230000036541 health Effects 0.000 description 7
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 6
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 6
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M tetramethylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].C[N+](C)(C)C WGTYBPLFGIVFAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000532183 Norovirus GI Species 0.000 description 3
- 241000532184 Norovirus GII Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 3
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 231100000647 material safety data sheet Toxicity 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 2
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 241000369757 Sapovirus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 2
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- -1 iron ion Chemical class 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N propane-1,3-diol Chemical compound OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000015227 regulation of liquid surface tension Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N sulfluramid Chemical group CCNS(=O)(=O)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F CCEKAJIANROZEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MRYQZMHVZZSQRT-UHFFFAOYSA-M tetramethylazanium;acetate Chemical compound CC([O-])=O.C[N+](C)(C)C MRYQZMHVZZSQRT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241001533362 Astroviridae Species 0.000 description 1
- FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N BAPTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1=CC=CC=C1OCCOC1=CC=CC=C1N(CC(O)=O)CC(O)=O FTEDXVNDVHYDQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006339 Caliciviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001466953 Echovirus Species 0.000 description 1
- WQXNXVUDBPYKBA-UHFFFAOYSA-N Ectoine Natural products CC1=NCCC(C(O)=O)N1 WQXNXVUDBPYKBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010048685 Oral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150104425 T4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000868182 Thermus thermophilus HB8 Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193758 [Bacillus] caldotenax Species 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- WQXNXVUDBPYKBA-YFKPBYRVSA-N ectoine Chemical compound CC1=[NH+][C@H](C([O-])=O)CCN1 WQXNXVUDBPYKBA-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 235000021393 food security Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 235000001055 magnesium Nutrition 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 229940071125 manganese acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);diacetate Chemical compound [Mn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UOGMEBQRZBEZQT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002683 reaction inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000002563 stool test Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
さらに本発明者らは、ウイルスの変性に必要な熱処理ステップ、及び/またはホットスタート酵素を不活化する熱処理工程を1ステップRT−PCRサイクルに含むことができる反応液組成の検討を進め、従来知られていたマグネシウム存在下だけでなく、マンガン存在下においても、rTth DNAポリメラーゼ、Z05 DNAポリメラーゼ等の逆転写活性を有する耐熱性ポリメラーゼが夾雑耐性を持つことを見出した。また、従来RT−PCR反応中の非特異増幅を引き起こすために、DNAポリメラーゼ量の増加は望ましくないとされてきたが、全く予想外のことに、核酸の単離や事前の加熱処理等の前処理を行っていない試料の存在下であえて逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼ量を増量させることにより、夾雑耐性が付与され、非特異増幅を抑制できることを見出した。その結果、同一反応容器内において反応液と前記のような前処理を行っていない試料とを混合し反応容器を密閉後、RT−PCRのための温度サイクルで反応を行うだけで、ウイルスRNAを直接検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
[項1] 試料中のRNAウイルスの検査方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする試料中のRNAウイルスの存在の有無を検査するための方法。
(1)核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料と、逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを含む一酵素系1ステップRT−PCR反応液とを混合する工程、及び、
(2)反応容器を密閉後、1ステップRT−PCR反応を実施する工程。
[項2] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液における前記耐熱性DNAポリメラーゼの総量が4.2ng/μL以上である項1に記載の方法。
[項3] 前記工程(1)及び(2)が同一容器で行われることを特徴とする項1又は2に記載の方法。
[項4] 工程(2)において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく1ステップRT−PCR反応を実施することを特徴とする項1から3のいずれかに記載の方法。
[項5] 工程(2)において、サイクル反応の前及び/又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び/又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む項1から4のいずれかに記載の方法。
[項6] 前記熱処理が、60℃以上であり、かつ1秒以上の加熱 を行うことを特徴とする項1から5のいずれかに記載の方法。
[項7] 工程(2)のRT−PCR反応サイクルにおいて、PCRの伸長時間が15秒以下である項1から5のいずれかに記載の方法。
[項8] 試料が血液試料、糞便試料、及び/又は拭き取り検査試料 である項1から7のいずれかに記載の方法。
[項9] 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である項1から8のいずれかに記載の方法。
[項10] 試料が懸濁液の遠心上清である項1から9のいずれかに記載の方法。
[項11] ウイルスがエンベロープをもたないRNAウイルスである項1から10のいずれかに記載の方法。
[項12] RNAウイルスがノロウイルスである項11に記載の方法。
[項13] ノロウイルスがGI型かGII型であるかの判別が可能であることを特徴とする項12に記載の方法。
[項14] 前記耐熱性DNAポリメラーゼがFamily Aに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする項1から13のいずれかに記載の方法。
[項15] 前記耐熱性DNAポリメラーゼが、Taq、Tth、Z05およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする項1から14のいずれかに記載の方法。
[項16] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、RNAウイルス由来の核酸を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下である項1から15のいずれかに記載の方法。
[項17] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、ウイルス由来の核酸を検出するための蛍光標識プローブを含み、前記蛍光標識プローブの濃度が0.01μM以上1.0μM以下である項1から16いずれかに記載の方法。
[項18] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液が、更に1mM以上の2価陽イオンを含む、項1から17のいずれかに記載の方法。
[項19] 逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを含有する一酵素系1ステップRT−PCR反応液を含むことを特徴とする、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料においてRNAウイルスの検査を行うための検査用キットまたは組成物。
[項20] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液における前記耐熱性DNAポリメラーゼの総量が4.2ng/μL以上である項19に記載の検査用キットまたは組成物。
[項21] 前記耐熱性DNAポリメラーゼがFamily Aに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする項20に記載の検査用キットまたは組成物。
[項22] 前記耐熱性DNAポリメラーゼが、Taq、Tth、Z05およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする項20または21に記載の検査用キットまたは組成物。
[項23] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、ウイルス由来の核酸を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下である項19から22のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
[項24] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、ウイルス由来の核酸を検出するための蛍光標識プローブを含み、前記蛍光標識プローブの濃度が0.01μM以上1.0μM以下である項19から23のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
[項25] 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液が、更に1mM以上の2価陽イオンを含む、項19から24のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
[項26] RNAウイルスがエンベロープをもたないウイルスである項19から25いずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
[項27] RNAウイルスがノロウイルスである項19から26のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
[項28] ノロウイルスがGI型かGII型であるかの判別が可能であることを特徴とする項19から27のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
(1)核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料と、逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを含む一酵素系1ステップRT−PCR反応液とを混合する工程。
(2)反応容器を密閉後、1ステップRT−PCR反応を実施する工程。
前記工程(1)における混合する工程は、例えば、分離精製を伴うような核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料に、逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを含む一酵素系1ステップRT−PCR反応液を添加することによって行うことができる。前記工程(1)および(2)は、同一容器で行われることが好ましい。すなわち、工程(1)および(2)の間においては、混合液の全部または一部を別容器へ移し替えないことが好ましい。更には、工程(2)においては、反応容器を密閉後、反応容器の蓋の開閉を行わないことが好ましい。
(1)試料の調製
ヒト糞便10検体を10%(重量%)となるように懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を使用した。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、二酵素系1ステップRT−PCRにおいて、糞便中のノロウイルスを検出した。
反応液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
前処理液(ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
0.05unit/μL RevertraAce(東洋紡)
(2−2)試料の熱処理
(1)で調製した試料1μLについて、条件1から条件6までの前処理を実施した。
条件1 90℃、1分間の熱処理
条件2 85℃、1分間の熱処理
条件3 80℃、1分間の熱処理
条件4 75℃、1分間の熱処理
条件5 70℃、1分間の熱処理
条件6 なし
(3)反応
前記反応液、前処理液、プライマー液、プローブ液を混合して、最終液量が24μLとなるようにRT−PCR反応液を調製した。条件1から6までの前処理を実施した試料に対して、前記RT−PCR反応液を加えた。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
42℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
条件1、2において、全ての検体でノロウイルスが陽性と判定された。一方、条件6では、18検体中12検体においてノロウイルス検体の検出が可能であるが、まれに検出できない検体が存在することが判明した。具体的には、検体5、9、11、13、14、17である。検体13、17は70℃以上、検体5は80℃以上、検体9、11、14は85℃以上の熱処理によって、ノロウイルスの検出が可能となった。従って、検体中のノロウイルスを高感度に検出するためには、少なくとも85℃以上の熱処理によって、ノロウイルスの破砕を実施する必要がある。
(1)試料
ノロウイルスG1、G2合成RNA 1250コピー(N=2)を各RT−PCR反応液にスパイクした。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、二酵素系1ステップRT−PCRにおける逆転写反応前の熱処理の有無によって、逆転写酵素の耐熱性を比較評価した。
反応液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
前処理液(ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(2−2)逆転写酵素
条件1 0.05unit/μL RocketScriptTM(Bioneer)
条件2 0.05unit/μL AMV Reverse Transcriptase XL(Life Sciences Advanced Technologies)
条件3 0.05unit/μL EvoScript Reverse Transcriptase(Roche)
条件4 0.05unit/μL SunScript Reverse Transcriptase(SYGNIS)
条件5 0.05unit/μL RevertraAce(東洋紡)
条件6 Sensiscript 1μL/反応系(QIAGEN)
条件7 Omniscript 1μL/反応系(QIAGEN)
(3)反応
前記反応液、プライマー液、プローブ液を混合して、条件1から条件7までの逆転写酵素を含むRT−PCR反応液を、最終液量が25μLとなるように調製した。これを以下の温度サイクルA又はBで反応させ、サイクルの途中でrTth DNA polymerase及び抗Tth抗体を添加した。サイクルA及びサイクルB共に、条件1から4は逆転写温度を60℃、条件5から7は逆転写温度を37℃で実施した。リアルタイムPCR反応は、BioRad製CFX96WELL DEEPを使用して実施し、54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
サイクルA
85℃ 1分
rTth DNA polymerase及び抗Tth抗体の添加
60℃ 10分 又は 37℃ 10分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
サイクルB
Tth DNA polymerase及び抗Tth抗体の添加
60℃ 10分 又は 37℃ 10分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
プローブ液(ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出―(東洋紡)添付品)ではFAMチャネルで内部コントロール遺伝子、Cy5チャネルでノロウイルスG1、ROXチャネルでノロウイルスG2を検出する。ここでは、G1、G2 RNAのCq値を表2に示す。感度が低く十分には検出ができなかった場合はハイフンで示す。この結果、サイクルAでは、全ての条件においてG1、G2共にRNAを検出できなかったのに対して、サイクルBでは全ての条件においてG1、G2共に陽性であった。すなわち、サイクルAに含まれる85℃、1分の熱処理工程において、全ての逆転写酵素が失活している。従って、サイクル反応の前に、ウイルスを破砕する、及び/もしくはホットスタート酵素を活性化させる手法として、熱処理を実施することを含むウイルスの検査方法において、逆転写酵素を使用する二酵素系1ステップRT−PCRは適さない。
(1)試料
事前に精製されたノロウイルスG1、G2合成RNA 50コピー(N=3)を各RT−PCR反応液にスパイクした。この試料は、事前に単離して精製されたRNAを反応液に添加していることから、糞便や血液などの生体由来成分の夾雑物質を含んでいない試料といえる。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(2−2)酵素量
条件1 4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件2 8.3ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件3 12.5ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件4 16.7ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 RNAの増幅曲線を図1に示す。条件1から条件4について、耐熱性DNAポリメラーゼの量を増加させるに従って、G1、G2共に増幅曲線の到達蛍光強度が減少した。この傾向は、ノロウイルスGII型の検出において顕著であった。この結果は、反応液中のポリメラーゼ量が増加するに従って、非特異増幅が増加していることを示唆している。
(1)試料
ノロウイルスG1、G2共に陰性のヒト糞便3検体を10%(重量%)となるように懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスG1、G2合成RNA 50コピー(N=3)を各RT−PCR反応液にスパイクした。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(2−2)酵素量
条件1 2.5ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件2 4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件3 5.0ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件4 5.8ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件5 6.7ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件6 8.3ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件7 12.5ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
条件8 16.7ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これらのRT−PCR反応液に、(1)で調製した便懸濁液をそれぞれ1μLずつ添加した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 RNAのCq値を表3に示す。感度が低く十分には検出ができなかった場合はハイフンで示す。条件1では、G1、G2共にノロウイルス合成RNA 50コピーを十分には検出できなかった。これに対して、酵素量を増加させることによって、条件4以降でノロウイルス合成RNAの検出が可能となり、とりわけ条件6以降ではG1、G2共に検出が安定化した。
(1)試料
ノロウイルスG1、G2共に陰性のヒト糞便3検体を10%(重量%)となるように懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスG1、G2合成RNA 50コピー(N=3)を各RT−PCR反応液にスパイクした。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける糞便存在下での酵素量の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これらのRT−PCR反応液に、(1)で調製した便懸濁液をそれぞれ1μLずつ添加した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 15秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 15秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 RNAのCq値を表4に示す。感度が低く十分には検出ができなかった場合はハイフンで示す。実施例4における酵素量4.2ng/μLでは、ノロウイルスG1/G2 RNAを十分には検出できなかったが、伸長時間を伸ばすことによってノロウイルスG2の感度の良い検出が可能となった。従って、伸長時間を短くして迅速にRT−PCRを実施するためには、一酵素系1ステップRT−PCR反応液中の酵素量を増加させる必要があることがわかる。これらの試験例4、5で認められた結果を総合考慮すると、具体的にTth DNAポリメラーゼを使用する場合に10秒以内の伸長時間とするためには、少なくとも5.8ng/μL以上、好ましくは8.3ng/μL以上の逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを使用する必要があることが示された。
(1)試料
ノロウイルスG1、G2共に陰性のヒト糞便3検体を10%(重量%)となるように懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスG1、G2合成RNA 250コピーを各RT−PCR反応液にスパイクした。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおけるプライマー量の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(2−2)プライマー量
ノロウイルス検出用のプライマーとして、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知(食安監1105001号)に記載のプライマー(配列番号1〜5)を使用した。
条件1 10nM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、1nM ALPF
条件2 20nM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、2nM ALPF
条件3 40nM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、4nM ALPF
条件4 0.1μM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、10nM ALPF
条件5 0.2μM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、20nM ALPF
条件6 0.4μM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、40nM ALPF
条件7 0.9μM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、90nM ALPF
条件8 2μM 各COG1F・COG1R・COG2F・COG2R、0.2μM ALPF
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これらのRT−PCR反応液に、(1)で調製した便懸濁液をそれぞれ1μLずつ添加した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 RNAのCq値を表5に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。条件4から8までの範囲のプライマー濃度において、G1、G2共にノロウイルス合成RNA 250コピーを検出することが可能であった。
(1)試料
ノロウイルスG1、G2共に陰性のヒト糞便3検体を10%(重量%)となるように懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスG1、G2合成RNA 250コピーを各RT−PCR反応液にスパイクした。
(2−1)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおけるプローブ量の検討を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(2−2)プローブ量
ノロウイルス検出用のプローブとして、厚生労働省医薬食品局安全部監視安全課の通知(食安監1105001号)に記載のプローブ(配列番号6〜9)を使用した。
条件1 1nM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、0.4nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
条件2 3nM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、0.8nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
条件3 5nM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、2nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
条件4 13nM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、4nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
条件5 25nM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、8nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
条件6 50nM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、15nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
条件7 0.1μM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、30nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
条件7 0.2μM 各Cy5標識プローブRING1−TP(a)・ROX標識RING2AL−TP、60nM Cy5標識プローブRING1−TP(b)
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これらのRT−PCR反応液に、(1)で調製した便懸濁液をそれぞれ1μLずつ添加した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 RNAのCq値を表6に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。条件4から8までの範囲のプローブ濃度において、G1、G2共にノロウイルス合成RNA 250コピーを検出することが可能であった。
(1)試料
ノロウイルスG1、G2共に陰性のヒト糞便3検体を10%(重量%)となるように懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を使用した。ノロウイルスG1、G2合成RNA 1250コピー(N=2)を各RT−PCR反応液にスパイクした。
(2)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける耐熱性DNAポリメラーゼを検討した。ここで使用した2種類の耐熱性DNAポリメラーゼはいずれも、逆転写活性を有することが知られている。
(2−1)Thermus species Z05由来の耐熱性DNAポリメラーゼ
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
0.20unit/μL HawkZ05 Fast DNA Polymerase(Roche)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(2−2)Thermus acqaticus由来の耐熱性DNAポリメラーゼ
Volcano2G RT−PCR 2x Master Mix(myPOLS Biotech)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
Volcano 2G DNA Polymerase(myPOLS Biotech)
(3)反応
(2−1)において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。(2−2)において、Volcano 2G DNA Polymerase添付の取り扱い説明書に従い、RT−PCR反応液を調製した。これらのRT−PCR反応液に、(1)で調製した便懸濁液をそれぞれ1μLずつ添加した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
条件1及び2のいずれの条件においても、G1、G2共にノロウイルス合成RNA 1250コピーを検出することが可能であった。
(1)試料
不活化ノロウイルス NATtrol Norovirus GI/GII Positive Control(ZeptoMetrix、intact) 1250、250(N=2)、50(N=2)、25(N=2)、0コピーを各RT−PCR反応液にスパイクした。ここで、本試験例で用いた不活化ノロウイルスサンプルは、糞便と類似の環境を整えるために夾雑物質を含むものである。
(2)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける不活化ノロウイルスの検出を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 不活化ウイルスのCq値を表7に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。1250コピーから25コピーまでの不活化ノロウイルスを検出が可能であった。
(1)試料
(1−1)拭き取り試料
不活化ノロウイルス NATtrol Norovirus GI/GII Positive Control(ZeptoMetrix、intact) 1000コピー(N=2)をプラスチック板の10cm×10cm(100cm2)領域に塗布した。BDラスパーチェックTMふき取り検査用スワブ(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)と濃縮液(ノロウイルス検出キットG1/G2 −ふき取り− <3色プローブ検出>(東洋紡)添付品)を用いて、上記の10cm×10cm(100cm2)領域から拭き取り検体の回収と濃縮を実施した。拭き取り検体の回収と濃縮は、取扱説明書(ノロウイルス検出キットG1/G2 −ふき取り− <3色プローブ検出>(東洋紡)添付品)に従った。濃縮後の白色沈殿を、前処理液1μL(ノロウイルス検出キットG1/G2 −ふき取り− <3色プローブ検出>(東洋紡)添付品)で懸濁して、RT−PCR反応液にスパイクした。
(1−2)スパイク試料(コントロール)
不活化ノロウイルス NATtrol Norovirus GI/GII Positive Control(ZeptoMetrix、intact) 1000コピー(N=2)をRT−PCR反応液にスパイクした。
(2)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、一酵素系1ステップRT−PCRにおける不活化ノロウイルスの検出を実施した。
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(3)反応
各条件において、Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、20μLずつに分注した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 不活化ウイルスのCq値を表8に示す。拭き取り試料とスパイク試料のいずれにおいても、不活化ノロウイルス1000コピーをN=2で検出可能であった。さらに、拭き取り試料はスパイク試料に比べて同等のCq値、すなわち同等の感度で検出できていることがわかる。従って、本発明は、拭き取り検査試料中のノロウイルスの検出にも適応可能であることが判明した。
(1)試料の調製
ヒト糞便16検体を10%(重量%)となるように懸濁した。この懸濁液を12,000rpmで5分間遠心し、上清を使用した。
(2)反応液
以下に示される組成の反応液を基本組成とし、従来の二酵素系1ステップRT−PCRと本発明の一酵素系1ステップRT−PCRにおける、糞便中のノロウイルスを検出について対比検討した。
(2−1)条件1
反応液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
前処理液(ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
0.05unit/μL RevertraAce(東洋紡)
(2−2)条件2
2x 反応液 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
50mM Mn(OAc)2 (RNA−directTM Realtime PCR Master Mix(東洋紡)添付品)
10x プライマー液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
10x プローブ液 (ノロウイルス検出キットG1/G2−高速プローブ検出−(東洋紡)添付品)
4.2ng/μL rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.01μg/μL 抗Tth抗体
(3)反応
(3−1)条件1
試料1μLに対して、前記前処理液を添加し、85℃、1分間の熱処理を実施した。その後、反応液、プライマー液、プローブ液の混合液45μLを添加し、RT−PCR反応液を調製した。これをBioRad製CFX96WELL DEEPを使用して、以下の温度サイクルでリアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
42℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(3−2)条件2
Mnの終濃度が2.5mMとなるようにRT−PCR反応液を調製し、19μLずつに分注した。これらのRT−PCR反応液に対し、試料1μLを添加した。これを以下の温度サイクルで、Applied Bioscience製サーマルサイクラー(Gene Amp(登録商標)PCR System 9700)を用いて、リアルタイムPCR反応を実施した。54℃、35サイクルの伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
90℃ 1分
60℃ 3分(逆転写反応)
95℃ 10秒
95℃ 1秒−54℃ 10秒 10サイクル(PCR)
95℃ 1秒−54℃ 10秒 35サイクル(PCR)
(4)結果
G1、G2 糞便中のノロウイルスのCq値を表8に示す。感度が低く十分には検出できなかった場合はハイフンで示す。条件1において、ノロウイルスG1陽性とされた検体については、全て条件2でも検出が可能であった。同様に、条件1でノロウイルスG2陽性とされた検体についても、全て条件2でも検出が可能であった。従って、条件2の一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、条件1の事前に加熱の前処理を施した二酵素系1ステップRT−PCR試薬と同等に、糞便中のノロウイルスの検出が可能である。また、検体6は、条件1及び条件2共にノロウイルスG1、G2陽性となった。この結果から、条件2の一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、共感染の判別も可能であることが示された。
Claims (28)
- 試料中のRNAウイルスの検査方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする試料中のRNAウイルスの存在の有無を検査するための方法。
(1)核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料と、逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを含む一酵素系1ステップRT−PCR反応液とを混合する工程、及び、
(2)反応容器を密閉後、1ステップRT−PCR反応を実施する工程。 - 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液における前記耐熱性DNAポリメラーゼの総量が4.2ng/μL以上である請求項1に記載の方法。
- 前記工程(1)及び(2)が同一容器で行われることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(2)において反応容器を密閉後、一度も蓋を開閉することなく1ステップRT−PCR反応を実施することを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)において、サイクル反応の前及び/又はサイクル反応中に、ウイルスを破砕してウイルス内の核酸を露出させるため及び/又は核酸増幅反応においてホットスタート酵素を活性化させるために熱処理を実施することを含む請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記熱処理が、60℃以上であり、かつ1秒以上の加熱を行うことを特徴とする請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 工程(2)のRT−PCR反応サイクルにおいて、PCRの伸長時間が15秒以下である請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 試料が血液試料、糞便試料、及び/又は拭き取り検査試料である請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 試料が水、生理食塩水または緩衝液に懸濁された懸濁液である請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 試料が懸濁液の遠心上清である請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- ウイルスがエンベロープをもたないRNAウイルスである請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- RNAウイルスがノロウイルスである請求項11に記載の方法。
- ノロウイルスがGI型かGII型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼがFamily Aに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼが、Taq、Tth、Z05およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項1から14のいずれかに記載の方法。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、RNAウイルス由来の核酸を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下である請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、ウイルス由来の核酸を検出するための蛍光標識プローブを含み、前記蛍光標識プローブの濃度が0.01μM以上1.0μM以下である請求項1から16いずれかに記載の方法。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液が、更に1mM以上の2価陽イオンを含む、請求項1から17のいずれかに記載の方法。
- 逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを含有する一酵素系1ステップRT−PCR反応液を含むことを特徴とする、核酸の単離処理も加熱処理も行っていない試料においてRNAウイルスの検査を行うための検査用キットまたは組成物。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液における前記耐熱性DNAポリメラーゼの総量が4.2ng/μL以上である請求項19に記載の検査用キットまたは組成物。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼがFamily Aに属するDNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項20に記載の検査用キットまたは組成物。
- 前記耐熱性DNAポリメラーゼが、Taq、Tth、Z05およびそれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一種の逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項20または21に記載の検査用キットまたは組成物。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、ウイルス由来の核酸を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下であり、かつ前記リバースプライマーの濃度が0.1μM以上2μM以下である請求項19から22のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液は、ウイルス由来の核酸を検出するための蛍光標識プローブを含み、前記蛍光標識プローブの濃度が0.01μM以上1.0μM以下である請求項19から23のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
- 前記一酵素系1ステップRT−PCR反応液が、更に1mM以上の2価陽イオンを含む、請求項19から24のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
- RNAウイルスがエンベロープをもたないウイルスである請求項19から25いずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
- RNAウイルスがノロウイルスである請求項19から26のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
- ノロウイルスがGI型かGII型であるかの判別が可能であることを特徴とする請求項19から27のいずれかに記載の検査用キットまたは組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023122166A JP2023134829A (ja) | 2018-07-24 | 2023-07-27 | 改良されたウイルス検出方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018138365 | 2018-07-24 | ||
JP2018138365 | 2018-07-24 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023122166A Division JP2023134829A (ja) | 2018-07-24 | 2023-07-27 | 改良されたウイルス検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020018295A true JP2020018295A (ja) | 2020-02-06 |
JP7392309B2 JP7392309B2 (ja) | 2023-12-06 |
Family
ID=69587625
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019134503A Active JP7392309B2 (ja) | 2018-07-24 | 2019-07-22 | 改良されたウイルス検出方法 |
JP2023122166A Pending JP2023134829A (ja) | 2018-07-24 | 2023-07-27 | 改良されたウイルス検出方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023122166A Pending JP2023134829A (ja) | 2018-07-24 | 2023-07-27 | 改良されたウイルス検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (2) | JP7392309B2 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021177041A1 (ja) * | 2020-03-02 | 2021-09-10 | 東洋紡株式会社 | 非特異的な核酸増幅を抑制する方法 |
WO2022039228A1 (ja) * | 2020-08-21 | 2022-02-24 | 東洋紡株式会社 | 改良されたマルチプレックスpcrによる検査方法 |
WO2022050141A1 (ja) * | 2020-09-04 | 2022-03-10 | 東洋紡株式会社 | マルチプレックスpcrによる呼吸器感染症の検査方法 |
WO2022210122A1 (ja) * | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 東洋紡株式会社 | マルチプレックスpcrにより複数種類のウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドのセット |
CN115851925A (zh) * | 2022-07-24 | 2023-03-28 | 济南金域医学检验中心有限公司 | 一种融合基因PML-RARα检测用试剂盒及其检测方法与应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015096063A1 (en) | 2013-12-25 | 2015-07-02 | Coyote Bioscience Co., Ltd. | Methods and systems for nucleic acid amplification |
JP6642045B2 (ja) | 2016-01-28 | 2020-02-05 | 東洋紡株式会社 | 改良されたウイルス検出方法 |
-
2019
- 2019-07-22 JP JP2019134503A patent/JP7392309B2/ja active Active
-
2023
- 2023-07-27 JP JP2023122166A patent/JP2023134829A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
REGINA HOFMANN-LEHMANN ET AL.: ""Sensitive and Robust One-Tube Real-Time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction to Quantif", AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES, vol. 16, no. 13, JPN6023020765, September 2000 (2000-09-01), pages 1247 - 1257, XP000957453, ISSN: 0005070064, DOI: 10.1089/08892220050117014 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021177041A1 (ja) * | 2020-03-02 | 2021-09-10 | 東洋紡株式会社 | 非特異的な核酸増幅を抑制する方法 |
WO2022039228A1 (ja) * | 2020-08-21 | 2022-02-24 | 東洋紡株式会社 | 改良されたマルチプレックスpcrによる検査方法 |
WO2022050141A1 (ja) * | 2020-09-04 | 2022-03-10 | 東洋紡株式会社 | マルチプレックスpcrによる呼吸器感染症の検査方法 |
WO2022210122A1 (ja) * | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 東洋紡株式会社 | マルチプレックスpcrにより複数種類のウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドのセット |
CN115851925A (zh) * | 2022-07-24 | 2023-03-28 | 济南金域医学检验中心有限公司 | 一种融合基因PML-RARα检测用试剂盒及其检测方法与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7392309B2 (ja) | 2023-12-06 |
JP2023134829A (ja) | 2023-09-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7392309B2 (ja) | 改良されたウイルス検出方法 | |
JP7167913B2 (ja) | ウイルスの検査方法およびウイルスの検査用キット | |
JP6642045B2 (ja) | 改良されたウイルス検出方法 | |
JP2017209036A (ja) | 改良されたウイルス検出方法 | |
JP2020156470A (ja) | 非特異増幅が抑制された核酸増幅法 | |
WO2022050141A1 (ja) | マルチプレックスpcrによる呼吸器感染症の検査方法 | |
JP2024026545A (ja) | 改良された核酸検出方法 | |
JP2018000138A (ja) | 改良されたウイルス検出方法 | |
CN114080456A (zh) | Rna病毒检测方法 | |
JP6467829B2 (ja) | 改良されたrt−pcr反応 | |
Callens et al. | Highly sensitive detection of swine vesicular disease virus based on a single tube RT-PCR system and DIG-ELISA detection | |
JP2016019495A (ja) | 核酸増幅法 | |
TW201139687A (en) | Nucleic acid detection | |
Chhabra et al. | Molecular detection methods of foodborne viruses | |
JP2011078358A (ja) | ノロウイルスの検出方法 | |
Haegeman et al. | Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection | |
CA2718214A1 (en) | Detection of bacteria belonging to the genus campylobacter by targeting cytolethal distending toxin | |
JP2021019559A (ja) | 改良されたウイルス検出方法 | |
CN111254217A (zh) | 诺如病毒的检测方法 | |
JP2021019558A (ja) | 改良されたウイルス検出方法 | |
JP2022191442A (ja) | 非特異的な核酸増幅を抑制する方法 | |
WO2021020380A1 (ja) | 改良されたウイルス検出方法 | |
WO2022039228A1 (ja) | 改良されたマルチプレックスpcrによる検査方法 | |
WO2022059555A1 (ja) | 改良されたマルチプレックスpcrによる検査方法 | |
CN112280894A (zh) | 核酸的检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220712 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230517 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230530 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230727 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231024 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231106 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7392309 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |