JP2022112033A - マイクロ流体デバイス、そのキット、及びその使用方法 - Google Patents

マイクロ流体デバイス、そのキット、及びその使用方法 Download PDF

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G Lavieu Gregory
ワン，シャオフア
Xiaohua Wang
カルナカラン，アアサヴァン
Karunakaran Aathavan
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Abstract

【課題】生物科学及び関連分野では、マイクロ流体デバイス内で微小物体をアッセイ可能であることが有用であり得る。【解決手段】 固化ポリマー網目構造を組み込んだインサイチュー生成マイクロ流体捕捉構造、その準備及び使用方法、組成物、並びにキットが記載される。マイクロ流体捕捉構造は、有利には、マイクロ流体環境内で実行されるアッセイに使用され得、生体細胞等の微小物体のアッセイに柔軟性を提供する。アッセイ試薬及び検体は、マイクロ流体捕捉構造内に組み込まれ得る。【選択図】図１Ａ

Description

本願は、２０１５年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２６４，６６５号、２０１６年５月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３３３，８２１号、及び２０１６年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４１８，６２５号の米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく利益を主張する非仮出願であり、これらの開示のそれぞれが全体的に参照により本明細書に援用される。
発明の背景
生物科学及び関連分野では、マイクロ流体デバイス内で微小物体をアッセイ可能であることが有用であり得る。本開示の幾つかの実施形態は、マイクロ流体捕捉構造をインサイチュー生成する装置及びプロセスを含む。
発明の概要
一態様では、基板及びマイクロ流体回路材料を有するエンクロージャを含む、微小物体をアッセイするマイクロ流体デバイスが提供され、エンクロージャは、エンクロージャ内に位置するフロー領域と、エンクロージャ内に配置される少なくとも１つの捕捉構造とを画定し、少なくとも１つの捕捉構造は、固化ポリマー網目構造を含み、固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬及び／又はアッセイ検体を含む。様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、少なくとも１つの隔離ペンを含み得、及び少なくとも１つの捕捉構造は、少なくとも１つの隔離ペン内に配置され得る。少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を有し得、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有し得る。幾つかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、４つ等）の捕捉構造が隔離ペンの分離領域内に配置される。様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスはカバーを含み得る。
別の態様では、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイスにおいて微小物体をアッセイする方法が提供され、本方法は、マイクロ流体デバイス内において、固化ポリマー網目構造を含む第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置することを含み、更に、固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬を含む。生体細胞等の微小物体は、検体を解放又は生産することが許容され、検体及びアッセイ試薬は、相互作用することが許容される。検体とアッセイ試薬との相互作用が検出される。
別の態様では、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを準備する方法が提供され、本方法は、マイクロ流体デバイスを提供することであって、マイクロ流体デバイスは、基板、マイクロ流体回路材料、及び任意選択的にカバーを含むエンクロージャを含み、エンクロージャは、フロー領域を画定する、提供することと、第１の流動性官能化プレポリマーをフロー領域に導入することと、エンクロージャ内の少なくとも１つの選択されたエリアにおいて第１の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、その中に少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を形成することとを含む。インサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域に形成され得る。代替又は追加として、エンクロージャは、フロー領域に流体的に接続される少なくとも１つの隔離ペンを含むことができ、及びインサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペン（例えば、隔離ペン内の分離領域）に形成され得る。第１の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化するステップは、複数の隔離ペン内及び／又は１つ又は複数の隔離ペンのそれぞれ内の複数の選択されたエリアを含め、エンクロージャ内の複数の選択されたエリアにおいて実行することができる。
更に他の態様では、基板、マイクロ流体回路材料、及び任意選択的にカバーを含むエンクロージャであって、フロー領域を画定する、エンクロージャと、制御可能に活性化されて、固化ポリマー網目構造を形成することができる官能化プレポリマーとを有するマイクロ流体デバイスを含むキットが提供される。本キットは、アッセイ試薬を更に含むことができ、アッセイ試薬は、官能化プレポリマーの一部であり得るか、官能化プレポリマーと混合され得るか、又は官能化プレポリマーとは別個に提供され得る（例えば、別個のバイアル、管等内で）。代替的に、基板、マイクロ流体回路材料、及び任意選択的にカバーを含むエンクロージャであって、フロー領域を画定する、エンクロージャと、エンクロージャ内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造であって、固化ポリマー網目構造を含む、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造とを有するマイクロ流体デバイスを含むキットが提供される。本キットは、アッセイ試薬を更に含むことができ、アッセイ試薬は、インサイチュー生成捕捉構造と一体であり得るか若しくはそれに会合し得、又は別個に（例えば、バイアル、管内等で）提供され得る。いずれのキットでのマイクロ流体デバイスも、エンクロージャ内に少なくとも１つの隔離ペンを含むことができる。インサイチュー生成捕捉構造がマイクロ流体デバイス内に既に配置されているキットでは、インサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域、マイクロ流体デバイスの隔離ペン（例えば、隔離ペン内の分離領域）、又は両方内に位置することができる。
本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器と併用するシステムの一例を示す。 本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを示す。 本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを示す。 本開示の幾つかの実施形態による詳細な隔離ペンを示す。 本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。 本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。 本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。 本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。 本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスの被覆面を示す。 本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器と併用するシステムの特定の例を示す。 本開示の幾つかの実施形態による撮像デバイスを示す。 インサイチュー生成アッセイ構造の実施形態の図表現である。 インサイチュー生成アッセイ構造の実施形態の図表現である。 アッセイ構造をインサイチューで生成するプロセスの概略表現である。 アッセイ構造をインサイチューで生成するプロセスの概略表現である。 本開示のインサイチュー生成アッセイ構造の実施形態及び生物学的微小物体によって分泌されるサイトカインを検出するアッセイにおけるその使用の図表現である。 本開示のインサイチュー生成アッセイ構造の実施形態及び生物学的微小物体によって分泌されるサイトカインを検出するアッセイにおけるその使用の図表現である。 本開示のインサイチュー生成アッセイ構造の実施形態及び生物学的微小物体によって分泌されるサイトカインを検出するアッセイにおけるその使用の図表現である。 本開示のインサイチュー生成アッセイ構造の実施形態及び生物学的微小物体によって分泌されるサイトカインを検出するアッセイにおけるその使用の図表現である。 本開示のインサイチュー生成アッセイ構造の実施形態及び生物学的微小物体によって分泌されるサイトカインを検出するアッセイにおけるその使用の図表現である。 生物学的微小物体により分泌された低量、中間量、及び高量のサイトカインを検出するインサイチュー生成アッセイ構造の写真表現である。 生物学的微小物体によって分泌された低量、中間量、及び高量のサイトカインを検出するインサイチュー生成アッセイ構造の写真表現である。 生物学的微小物体によって分泌された低量、中間量、及び高量のサイトカインを検出するインサイチュー生成アッセイ構造の写真表現である。 生体細胞の複数のアッセイのための複数のインサイチュー生成アッセイ構造を含む隔離ペンの実施形態の図表現である。
発明の詳細な説明
本明細書は、本発明の例示的な実施形態及び用途を記載する。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び用途、又は例示的な実施形態及び用途が動作する様式若しくは本明細書に記載される様式に限定されない。更に、図は、簡易化された図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、強調されることもあれば、又は他の方法で一定の比率ではないことがある。加えて、「上」、「付着される」、「接続される」、「結合される」、又は同様の用語が本明細書において使用される場合、ある要素（例えば、材料、層、基板等）は、ある要素が他の要素の直接上にあるか、それに直接付着されるか、それに直接接続されるか、又はそれに直接結合されるか否かに関係なく、又はある要素と別の要素との間に１つ若しくは複数の介在要素があるか否かに関係なく、別の要素の「上」にあるか、別の要素に「付着される」か、それに「接続される」か、又はそれに「結合される」ことができる。また、文脈により別のことが示される場合を除き、方向（例えば、上方、下方、上部、下部、横、上、下、下の、上の、上部の、下部の、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供される場合、相対的なものであり、単に例として例示及び考察を容易にするために提供され、限定として提供されるものではない。加えて、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が言及される場合、そのような言及は、リスト自体に列挙された要素のいずれか１つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ、及び／又は列挙された全ての要素の組合せを包含することが意図される。本明細書でのセクション分割は、検討を容易にすることのみを目的とし、考察されるいかなる要素の組合せも限定しない。
本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図される目的で十分に機能することを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、全体的な性能にあまり影響しない、当業者により予期されるような絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からの小さい些細な変動を許容する。数値として表現することができる数値、パラメータ、又は特性に関して使用される場合、「実質的に」は、１０％以内を意味する。
「それぞれの１つ（ones）」という用語は、２つ以上を意味する。
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを上回るものであり得る。
本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内に「位置する」を包含する。
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」は、流体を保持するように構成される１つ又は複数の別個のマイクロ流体回路であって、各マイクロ流体回路は、領域、流路、チャネル、チャンバ、及び／又はペンを含むがこれに限定されない流体的に相互接続された回路要素で構成される、１つ又は複数の別個のマイクロ流体回路と、流体（及び任意選択的に流体中に懸濁した微小物体）をマイクロ流体デバイス内及び／又は外に流すように構成される少なくとも１つのポートとを含むデバイスである。通常、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネルを含み得るフロー領域及び少なくとも１つのチャンバを含み、約１ｍＬ未満、例えば、約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満、又は約２μＬ未満の容量の流体を保持する。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１μＬ～約２μＬ、約１μＬ～約３μＬ、約１μＬ～約４μＬ、約１μＬ～約５μＬ、約２μＬ～約５μＬ、約２μＬ～約８μＬ、約２μＬ～約１０μＬ、約２μＬ～約１２μＬ、約２μＬ～約１５μＬ、約２μＬ～約２０μＬ、約５μＬ～約２０μＬ、約５μＬ～約３０μＬ、約５μＬ～約４０μＬ、約５μＬ～約５０μＬ、約１０μＬ～約５０μＬ、約１０μＬ～約７５μＬ、約１０μＬ～約１００μＬ、約２０μＬ～約１００μＬ、約２０μＬ～約１５０μＬ、約２０μＬ～約２００μＬ、約５０μＬ～約２００μＬ、約５０μＬ～約２５０μＬ、又は約５０μＬ～約３００μＬを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスの第１のポート（例えば、流入口）に流体的に接続される第１の端部と、マイクロ流体デバイスの第２のポート（例えば、流出口）に流体的に接続される第２の端部とを有するように構成し得る。
本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１μＬ未満、例えば、約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ未満、又はそれを下回る容量の流体を保持するように構成される少なくとも１つの回路要素を含むマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１０，０００個、又はそれを超える）を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約１００ｐＬ～約１ｎＬ、約１００ｐＬ～約２ｎＬ、約１００ｐＬ～約５ｎＬ、約２５０ｐＬ～約２ｎＬ、約２５０ｐＬ～約５ｎＬ、約２５０ｐＬ～約１０ｎＬ、約５００ｐＬ～約５ｎＬ、約５００ｐＬ～約１０ｎＬ、約５００ｐＬ～約１５ｎＬ、約７５０ｐＬ～約１０ｎＬ、約７５０ｐＬ～約１５ｎＬ、約７５０ｐＬ～約２０ｎＬ、約１ｎＬ～約１０ｎＬ、約１ｎＬ～約１５ｎＬ、約１ｎＬ～約２０ｎＬ、約１ｎＬ～約２５ｎＬ、又は約１ｎＬ～約５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約２０ｎＬ～約２００ｎＬ、約１００ｎＬ～約２００ｎＬ、約１００ｎＬ～約３００ｎＬ、約１００ｎＬ～約４００ｎＬ、約１００ｎＬ～約５００ｎＬ、約２００ｎＬ～約３００ｎＬ、約２００ｎＬ～約４００ｎＬ、約２００ｎＬ～約５００ｎＬ、約２００ｎＬ～約６００ｎＬ、約２００ｎＬ～約７００ｎＬ、約２５０ｎＬ～約４００ｎＬ、約２５０ｎＬ～約５００ｎＬ、約２５０ｎＬ～約６００ｎＬ、又は約２５０ｎＬ～約７５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、横寸法及び縦寸法の両方よりも大幅に長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を指す。例えば、フローチャネルは、横寸法又は縦寸法のいずれかの長さの少なくとも５倍、例えば、長さの少なくとも１０倍、長さの少なくとも２５倍、長さの少なくとも１００倍、長さの少なくとも２００倍、長さの少なくとも５００倍、長さの少なくとも１，０００倍、長さの少なくとも５，０００倍、又はそれよりも長い長さであり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、それらの間の任意の範囲を含む約１００，０００μｍ～約５００，０００μｍの範囲である。幾つかの実施形態では、横寸法は、約１００μｍ～約１０００μｍ（例えば、約１５０μｍ～約５００μｍ）の範囲であり、縦寸法は、約２５μｍ～約２００μｍの範囲、例えば、約４０μｍ～約１５０μｍの範囲である。なお、フローチャネルは、マイクロ流体デバイスにおいて多様な異なる空間構成を有し得、したがって完全に線形の要素に限定されない。例えば、フローチャネルは、以下の構成：曲線、湾曲、螺旋、傾斜、下降、分岐（例えば、複数の異なる流路）、及びそれらの任意の組合せを有する１つ又は複数の部分であり得るか又はそれを含み得る。加えて、フローチャネルは、経路に沿って異なる断面積を有し得、広がるか又は収縮して所望の流体フローを内部に提供し得る。フローチャネルは弁を含み得、弁は、マイクロ流体の分野で既知の任意のタイプのものであり得る。弁を含むマイクロ流体チャネルの例は、米国特許第６，４０８，８７８号及び同第９，２２７，２００号に開示されており、これらのそれぞれは、全体的に参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイス内の２つの異なる領域又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（しかし、完全にではない）妨げるのに十分に大きいバンプ又は同様のタイプの構造を指す。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。
本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイス内の回路要素（又は２つの回路要素間の界面）の幅の狭まりを指す。狭窄は、例えば、本開示のマイクロ流体隔離ペンの分離領域と接続領域との界面に位置することができる。
本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、可視光が透過する際、可視光を実質的に変更せずに透過させる材料を指す。
本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本発明により分離及び／又は操作され得る任意の顕微鏡的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、微粒子；微小ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）；磁性ビーズ；微小ロッド；微小ワイヤ；量子ドット等の無生物微小物体、細胞；生物学的細胞小器官；ベシクル又は複合体；合成ベシクル；リポソーム（例えば、合成又は膜標本由来）；脂質ナノラフト（lipid nanoraft）等の生物学的微小物体、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞に付着した微小ビーズ、リポソームコーティング微小ビーズ、リポソームコーティング磁性ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、小分子シグナリング部分、又はアッセイで使用可能な他の化学／生物種等の共有結合的又は非共有結合的に付着された部分／分子を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al. (2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs”, Methods Enzymol., 464:211-231に説明されている。
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、用語「生体細胞」と同義で使用される。生体細胞の非限定的な例としては、真核細胞、植物細胞、哺乳類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞等の動物細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生細胞等、筋肉、軟骨組織、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経組織等の組織から解離された細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等の免疫細胞、胚（例えば、接合子）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、がん細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞及び／又は形質転換細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳類細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類等からの細胞であり得る。
生体細胞のコロニーは、生殖可能なコロニー内の生細胞の全てが単一の親細胞由来の娘細胞である場合、「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１４以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１７以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、２０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。「クローン細胞」という用語は、同じクローンコロニーの細胞を指す。
本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２つ以上の細胞（例えば、約２～約２０個、約４～約４０個、約６～約６０個、約８～約８０個、約１０～約１００個、約２０～約２００個、約４０～約４００個、約６０～約６００個、約８０～約８００個、約１００～約１０００個、又は１０００個を超える細胞）を指す。
本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞を生存した状態に保ち、及び／又は増殖させるのに必要な条件を提供する流体成分及びガス成分の両方並びに任意選択的に表面を含む環境を提供することを指す。
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞を指す場合、細胞数の増大を指す。
流体の媒体の「成分」は、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝産物等を含む、媒体に存在する任意の化学分子又は生化学分子である。
本明細書で使用される場合、「捕捉部分」は、微小物体の認識部位を提供する化学種、生物種、機能性、又はモチーフである。選択されたクラスの微小物体は、インサイチュー生成捕捉部分を認識し得、インサイチュー生成捕捉部分と結合し得るか、又はそれに対する親和性を有し得る。非限定的な例として、抗原、抗体、及び細胞表面結合モチーフが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「流動性ポリマー」は、流体媒体（例えば、プレポリマー溶液）内で溶解可能又は分散可能なポリマーモノマー又はマクロマーである。流動性ポリマーは、マイクロ流体フロー領域に流入し得、内部の流体媒体の他の成分と共に流れ得る。
本明細書で使用される場合、「光開始ポリマー」は、光に露出されると共有結合的に架橋するか、特定の共有結合を形成するか、硬質化化学モチーフの周囲の位置化学を変更するか、又は物理的状態を変更させるイオン対を形成し、それにより、ポリマー網目構造を形成可能なポリマー（又はポリマーの生成に使用することができる単量体分子）を指す。幾つかの場合、光開始ポリマーは、共有結合的に架橋するか、特定の共有結合を形成するか、硬質化化学モチーフの周囲の位置化学を変更するか、又は物理的状態を変更させるイオン対を形成することが可能な１つ又は複数の化学部分に結合するポリマーセグメントを含み得る。幾つかの場合、光開始ポリマーは、ポリマー網目構造の形成を開始する（例えば、ポリマーの重合化を介して）ために、光活性化可能なラジカル開始剤を必要とし得る。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指し、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、霊長類化（例えば、ヒト化）抗体、ネズミ抗体、マウス－ヒト抗体、マウス－霊長類抗体、並びにキメラ抗体を含み、完全な分子、その断片（ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ）’２断片等）、或いは完全な分子及び／又は断片の多量体若しくは凝集体であってよく、天然に存在するか、又は免疫処置、合成若しくは遺伝子操作等によって製造することができる。本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、抗原を結合する、抗体に由来するか又は抗体に関係する断片を指し、幾つかの実施形態では、例えば、ガラクトース残基の組み入れにより、クリアランス及び取り込みを容易にする構造上の特徴を示すように誘導体化し得る。これには、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、及びそれらの組合せが含まれる。
流体媒体を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」及び「拡散」は、濃度勾配を下がる流体媒体の成分の熱力学的移動を指す。
「媒体の流れ」という語句は、拡散以外の任意のメカニズムに主に起因する流体媒体のバルク移動を意味する。例えば、媒体の流れは、ポイント間の圧力差に起因する流体媒体のあるポイントから別のポイントへの移動を含むことができる。そのようなフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期的フロー、ランダムフロー、断続的フロー、又は往復フロー、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。ある流体媒体が別の流体媒体中に流れる場合、媒体の乱流及び混合が生じ得る。
「実質的に流れがない」という語句は、流体媒体内への又は流体媒体内の材料（例えば、対象となる検体）の成分の拡散率未満である、経時平均される流体媒体の流量を指す。そのような材料の成分の拡散率は、例えば、温度、成分のサイズ、及び成分と流体媒体との相互作用の強さに依存することができる。
マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体的に接続される」という語句は、異なる領域が流体媒体等の流体で実質的に充填されているとき、各領域内の流体が接続されて単一の流体を形成することを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体媒体）の組成が必ずしも同一であることを意味しない。正確に言えば、マイクロ流体デバイスの流体的に接続される異なる領域内の流体は、溶質が各濃度勾配を下に移動し、及び／又は流体がマイクロ流体を通って流れるとき、流動的である異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、又は他の分子等の異なる濃度の溶質）を有することができる。
本明細書で使用される場合、「流路」は、媒体の流れの軌道を画定し、媒体の流れの軌道を受ける１つ又は複数の流体的に接続された回路要素（例えば、チャネル、領域、チャンバ等）を指す。したがって、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路における媒体の流れを受けることなく、流路を含む回路要素に流体的に接続し得る。
本明細書で使用される場合、「微小物体の分離」は、マイクロ流体デバイス内の画定エリアに微小物体を閉じ込めることを意味する。微小物体は、それでもなおインサイチュー生成捕捉構造内で動くことが可能であり得る。
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域及び「非掃引」領域を含むことができる。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を流れているときに媒体の流れを受ける、マイクロ流体回路の１つ又は複数の流体的に相互接続された回路要素で構成される。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル、及びチャンバの全て又は一部を含むことができる。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を流れているときに流体流動を実質的に受けない、マイクロ流体回路の１つ又は複数の流体的に相互接続された回路要素で構成される。非掃引領域は、流体接続が、掃引領域と非掃引領域との間の拡散は可能であるが、実質的に媒体フローがないような構造を有する場合、掃引領域に流体的に接続することができる。したがって、マイクロ流体デバイスは、実質的に掃引領域と非掃引領域との間の拡散流通のみを可能にしながら、掃引領域内の媒体のフローから非掃引領域を実質的に分離するような構造を有することができる。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは、掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（以下に更に詳細に説明する）は、非掃引領域の例である。
そのようなマイクロ流体デバイスにおいて、特定の生物学的材料（例えば、抗体等のタンパク質）を生成する生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の能力をアッセイすることができる。アッセイの特定の実施形態では、対象となる検体の生産についてアッセイする生物学的微小物体（例えば、細胞）を含む試料材料をマイクロ流体デバイスの掃引領域に装填することができる。生物学的微小物体（例えば、ヒト細胞等の哺乳類細胞）のそれぞれは、特定の特性に関して選択することができ、非掃引領域に配置することができる。次に、残りの試料材料を掃引領域から流出させ、アッセイ材料を掃引領域に流入させることができる。選択された生物学的微小物体は非掃引領域にあるため、選択された生物学的微小物体は、残りの試料材料の流出又はアッセイ材料の流入による影響を実質的に受けない。選択された生物学的微小物体は、対象となる検体を生成することが可能であり得、検体は非掃引領域から掃引領域中に拡散することができ、掃引領域において、対象となる検体はアッセイ材料と反応して、それぞれを特定の非掃引領域に相関付けることができる局所化された検出可能反応を生成することができる。検出された反応に関連する任意の非掃引領域を分析して、非掃引領域中の生物学的微小物体のうち、対象となる検体の十分な生産者物体がある場合、それがいずれかを特定することができる。
インサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイス
マイクロ流体デバイス内で微小物体に対してアッセイを実行する場合、そのようなアッセイが、隔離ペン、トラップ、又はマイクロ流体チャネルを含むがこれに限定されないフロー領域の一部等のマイクロ流体回路の特定のエリア及び／又は特徴に付着した（例えば、アッセイ検体若しくはアッセイ試薬を付着させるか、又はアッセイ検体若しくはアッセイ試薬の移動及び／又は拡散を制限することにより）アッセイ検体又はアッセイ試薬を組み込み得ることが有利であり得る。幾つかの場合、アッセイ検体又はアッセイ試薬は、ポリマー網目構造を使用してマイクロ流体デバイスの特定の部分（例えば、隔離ペンの一部）に付着し得る。固化ポリマー網目構造は、選択された位置においてインサイチューで生成し得る。例えば、構造化光を使用して、ポリマーを架橋して網目構造にすることによりポリマーを固化する重合化／架橋反応の光誘導を通して、ポリマーの固化された網目構造を生成し得る。固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体と反応することができ（固化ポリマー網目構造の形成中又は形成後のいずれか）、それによりアッセイ試薬又はアッセイ検体を含むインサイチュー生成捕捉構造を形成することができる。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、このようにして固化ポリマー網目構造内又は少なくとも固化ポリマー網目構造の表面の近くに維持され、それによりアッセイを最適化する（例えば、アッセイ信号を１つ又は複数の予め定義された位置に集中させることにより）ことができる。
驚くべきことに、多様な捕捉構造が、本明細書に記載のようにマイクロ流体（又はナノ流体）デバイス内にインサイチューで生成可能であることが発見された。インサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイス、これらのクラスのデバイスで使用される組成物及び使用方法について本明細書に記載する。
基板及びマイクロ流体回路材料２６０を含むエンクロージャであって、それぞれエンクロージャ（図示せず）内に配置されるフロー領域（例えば、フローチャネル４１０）及び少なくとも１つの隔離ペン４３０を画定する、エンクロージャと、エンクロージャ内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４であって、固化ポリマー網目構造を含む、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４とを含むマイクロ流体デバイス４００を提供し得る。マイクロ流体回路材料２６０は、フロー領域の壁を画定し得、エンクロージャ内に他のマイクロ流体回路要素を画定し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス４００はカバー（図示せず）を含み得る。様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、それもマイクロ流体回路材料２６０で形成し得る少なくとも１つの隔離ペン４３０を含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４は、少なくとも１つの隔離ペン４３０内に配置し得る。マイクロ流体デバイスは、エンクロージャ内に複数の隔離ペンを更に含み得る。少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造は、微小物体の生物学的産物を捕捉することが可能であり、及び／又は微小物体若しくは微小物体の生物学的産物により作用されるように構成される。少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造は、アッセイ試薬若しくはアッセイ検体を含み得、又はアッセイ試薬若しくはアッセイ検体を受け入れるように構成し得る（例えば、官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体と反応するように構成される官能化部位を含み得る）。アッセイ試薬は、微小物体の生物学的産物を捕捉するように構成し得る。アッセイ検体は、微小物体の生物学的産物を捕捉するか、又は微小物体若しくは微小物体の生物学的産物により作用されるように構成し得る。
マイクロ流体デバイス４００の一部を図４Ａに示す。少なくとも１つの隔離ペン４３０は、フロー領域（例えば、フローチャネル４１０）に流体的に接続し得る。少なくとも１つの隔離ペン４３０は、分離領域及び接続領域を含み得、任意の隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、２６６に対して、上述した任意の組の寸法を有し得、接続領域は、フロー領域（例えば、フローチャネル４１０）への基端開口部と、分離領域への先端開口部とを有する。マイクロ流体デバイスのフロー領域（例えば、フローチャネル４１０）は、マイクロ流体チャネル４１０を含み得る。フロー領域（例えば、フローチャネル４１０）への隔離ペンの基端開口部は、フロー領域（図示せず）における流体媒体のフローに略平行な向きを有し得る。隔離ペンのフロー領域内の流体媒体と分離領域内の流体媒体との間での成分の交換は、実質的に拡散によってのみ行われ得る。少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４は、隔離ペン４３０の分離領域内に配置し得る。
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４は、隔離ペンの接続領域又は分離領域内に配置し得る。インサイチュー生成捕捉構造４０４は、妨げなく細胞を分離領域に搬入し得るように、隔離ペンの分離領域の位置にあるように選択的に更に形成され得る。少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４は、妨げなく細胞をインサイチュー生成捕捉構造４０４から分離領域から搬出し得るように、分離領域内に位置し得る。マイクロ流体デバイスは複数の隔離ペン４３０を含み得、隔離ペン４３０は、任意の組合せにおいて、本明細書に記載される任意の適する配置で構成し得る。１つのマイクロ流体チャネル及び複数の隔離ペンが存在する場合、複数の隔離ペンを行に位置合わせし得、複数の各隔離ペンは、マイクロ流体チャネル４１０の片側において開く。複数の各隔離ペンの基端開口部は、共通の方向においてマイクロ流体チャネル４１０に向かって開き得る。
別の実施形態では、基板及びカバーを含むエンクロージャであって、エンクロージャ（図示せず）内にそれぞれ位置するフロー領域（例えば、フローチャネル４１０）及び少なくとも１つの隔離ペン４３０を画定する、エンクロージャと、少なくとも１つの隔離ペン４３０内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０６であって、アッセイ試薬又はアッセイ検体（Ｒ／Ａ、例えば、図４Ｃ及び図４Ｄの４０６Ｂ又は４０６Ａ）を更に含む固化ポリマー網目構造を含む、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０６とを含むマイクロ流体デバイス４５０が提供され、その一部を図４Ｂに示す。
基板
マイクロ流体デバイス４００、４５０の基板は、エンクロージャ（図示せず）内で泳動誘導（ＤＥＰ）力を生成する構成を更に含み得る。ＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイス基板は、本明細書に記載される任意のＤＥＰ構成を含み得る。ＤＥＰ力は光学的に作動され得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス４００、５００の基板は、オプトエレクトロウェッティング構成（図示せず）を含むように構成し得る。幾つかの実施形態では、オプトエレクトロウェッティング基板は、光学的に作動され得る。更に他の実施形態では、マイクロ流体デバイス４００、４５０は、ＤＥＰ力を生成するように構成される基板と、エレクトロウェッティング力を生成するように構成される基板との組合せを含み得、これらは、それぞれ光学的に作動される。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス４００、４５０のカバーは、１つ又は複数のインサイチュー生成捕捉構造からの蛍光信号、比色信号、又は発光信号を実質的に透過し得る。
様々な実施形態では、少なくとも１つの捕捉構造を有するマイクロ流体デバイス４００、４５０は、上述したように、細胞の成長、生存性、可搬性、及びそれらの任意の組合せを強化する動的被覆又は調整表面を有し得る。任意の適する動的被覆又は調整表面が使用可能である。幾つかの実施形態では、調整表面は、本明細書に記載される任意の適する共有結合的に修飾された表面であり得る共有結合修飾表面を含み得る。共有結合修飾表面は、インサイチュー生成捕捉構造のポリマー網目構造を固化する前に存在し得る。動的被覆が使用される場合、共有結合修飾表面は、インサイチュー生成捕捉構造のポリマー網目構造を固化する前又はその後に導入し得る。
マイクロ流体デバイス４００、４５０は、任意の組合せにおいて、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、５００、７００について説明した任意の他の構成要素、特徴、又は構成を有し得る。
固化ポリマー網目構造を含むインサイチュー生成捕捉構造
インサイチュー生成捕捉構造４０４、４０６（図４Ａ、図４Ｂ）の固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含み得、インサイチューで固化し得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、シリコンを含まない。固化ポリマー網目構造は、任意の適するポリマーから作られ得、本明細書に記載されるような任意のポリマーであり得る。
官能化部位
マイクロ流体デバイス４００の少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４の固化ポリマー網目構造は、１つ又は複数の官能化部位を含み得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造は、２つ以上の官能化部位を含み得る。官能化部位は、固化ポリマー網目構造に付着され得る（非特異的非共有結合を含み得るか、又は特定の結合対若しくはモチーフを介する非共有結合を含み得る）。他の実施形態では、固化ポリマー網目構造の官能化部位は、固化ポリマー網目構造のポリマーに共有結合的に結合され得る。
官能化部位は、アッセイ試薬又はアッセイ検体をそこに導入させる反応部分Ｒｆｓを含み得る。反応部分Ｒｆｓは、会合（例えば、非限定的な一例では、キレート）、結合（例えば、ビオチンとストレプトアビジンとの間又は抗体／抗原結合対間等の非共有結合）、又は反応（例えば、クリック反応対間等の共有結合の形成）を含む共有又は非共有反応モードを提供し得る。簡明にするために、結合という用語は、３つ全てのタイプの相互作用の包含に使用し得るが、特定の実施形態では、これらの相互作用の１つ又は複数が好ましいことがある。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の官能化部位の反応部分Ｒｆｓは、ビオチン、アビジン、又はストレプトアビジンであり得る。他の実施形態では、１つ又は複数の官能化部位の反応部分Ｒｆｓは、キレート部分又はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション配列を含み得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造の１つ又は複数の官能化部位は、固化ポリマー網目構造を含むインサイチュー生成捕捉構造４０３から、少なくとも１つの官能化部位を有する固化ポリマー網目構造を含むインサイチュー生成捕捉構造４０４への変換について概略的に示したように、ポリマー網目構造の固化後に導入し得る（例えば、反応部分Ｒｆｓを含む非特異的に付着した種を隔離ペンに流入させ、ある時間期間にわたり固化ポリマー網目構造に接触させ、適するアッセイ条件に向けて、反応部分Ｒｆｓを含む十分な数の種を付着させ得る）。他の実施形態では、反応部分Ｒｆｓを含む１つ又は複数の官能化部位は、図４Ｃ及び図４Ｄに概略的に示されるように、ポリマー網目構造の固化前にプレポリマー４０１に導入される。
アッセイ試薬又はアッセイ検体（例えば、図４Ｂの４０６のＲ／Ａ）を含む少なくともインサイチュー生成された１つの捕捉構造４０６を有するマイクロ流体デバイス４５０は、アッセイ試薬又はアッセイ検体と既に会合、結合、又は反応した反応部分Ｒｆｓをそれぞれ有する１つ又は複数の官能化部位を含み得る。反応部分Ｒｆｓは、マイクロ流体デバイス４００及び各インサイチュー生成捕捉構造４０４について上述したような任意の反応部分から選択し得る。上記のように、結合という用語は、３つ全てのタイプの相互作用の包含に使用し得るが、特定の実施形態では、これらの相互作用の１つ又は複数が好ましいことがある。アッセイ試薬又はアッセイ検体の結合は、以下に説明され、図４Ｃに示されるように、ポリマー網目構造の固化前又は固化に続けて行い得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造４０４、４０６の固化ポリマー網目構造の１つ又は複数の官能化部位は、全て同じ反応部分Ｒｆｓを含み得る。他の実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造４０４、４０６の固化ポリマー網目構造の１つ又は複数の官能化部位は、異なるＲｆｓを含み得る。幾つかの他の実施形態では、２つ以上のタイプのポリマーを使用して固化ポリマー網目構造を形成し得、各ポリマーは、同じ又は異なる官能化部位（例えば、結合又は付着される反応部分Ｒｆｓ）を有し得る。
アッセイ試薬又はアッセイ検体
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０６の固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬及び／又はアッセイ検体（図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ）を更に含み得る。固化ポリマー網目構造に結合したアッセイ試薬又はアッセイ検体を既に含む、マイクロ流体デバイス４５０のインサイチュー生成捕捉構造４０６を提供し得る。代替的に、マイクロ流体デバイス４００は、アッセイ試薬又はアッセイ検体と会合、結合、又は反応して、アッセイ試薬又はアッセイ検体（図４ＢのＲ／Ａ）を含むインサイチュー生成捕捉構造４０６を提供するように構成され、図４Ｃにより詳細に示されるインサイチュー生成捕捉構造４０４（図４Ａ）を有し得る。更に別の代替では、固化ポリマー網目構造及びそれに会合するアッセイ試薬又はアッセイ検体は、アッセイ実験自体の開始前に導入し得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、固化ポリマー網目構造の１つ又は複数の官能化部位に共有結合的又は非共有結合的に結合されるように構成し得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、例えば、流動性ポリマー溶液（例えば、プレポリマー内に既に組み込まれている）に共有結合的に結合することにより、インサイチュー生成捕捉構造の初期形成中に導入し得る。非限定的な一例は、標的生体細胞上のインテグリンにより認識し得る、ＲＧＤモチーフ等の認識モチーフの組み込みであり得る。
代替的に、アッセイ試薬又はアッセイ検体は、１つ又は複数の官能化部位を含むインサイチュー生成捕捉構造４０４を有するマイクロ流体デバイス４００に流入し得る（例えば、固化ポリマー網目構造が固化した後のある時間において）。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０４の固化ポリマー網目構造の官能化部位のＲｆｓと会合、結合、又は反応して、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造４０６を生成するように構成される官能部分Ｍｆｓを含み得る。上記のように、結合という用語は、３つ全てのタイプの相互作用の包含に使用し得るが、特定の実施形態では、これらの相互作用の１つ又は複数が好ましいことがある。任意の適する官能部分Ｍｆｓが使用可能である。例えば、アッセイ試薬又はアッセイ検体のキレート基質Ｍｆｓを捕捉構造４０４の固化ポリマー網目構造の官能化部位のキレートリガンドＲｆｓによりキレートし得る。官能部分Ｍｆｓは、捕捉構造４０４の官能化部位の各アビジン、ストレプトアビジン、又はビオチンＲｆｓと非共有結合的に結合するビオチン又はストレプトアビジンを含み得る。代替的に、官能部分Ｍｆｓは、固化ポリマー網目構造の官能化部位のＲｆｓと共有結合的に反応するように構成し得る。例えば、官能部分Ｍｆｓはアジドであり得、インサイチュー生成捕捉構造４０４の官能化部位の対応するクリック反応対のアルキニル官能基と共有結合的に反応し得る。
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、アッセイ試薬又はアッセイ検体は検出可能な標識を含み得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体の検出可能な標識は、蛍光標識、比色標識、又は発光標識であり得る。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識であり得る。幾つかの実施形態では、アッセイ試薬又はアッセイ検体が検出可能な標識を含む場合、標識は、アッセイが進むまで検出可能ではなく、検出可能な標識は、アッセイ試薬又はアッセイ検体から生成又は解放される。
反応部分及び／又はアッセイ試薬若しくはアッセイ検体を含み得る固化ポリマー網目構造を導入する方法
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造の準備は、図４Ｃ及び図４Ｄに概略的に示されるように様々に実行し得る。図４Ｃに示される一ルートでは、１つ又は複数のプレポリマー４０１は、反応部分Ｒｆｓを含む少なくとも１つの官能化部位を含むプレポリマー４０５を提供するように修飾し得る。この非固化プレポリマー４０５は、続けてマイクロ流体デバイスのエンクロージャに流入し得、インサイチューで固化して、インサイチュー生成捕捉構造４０４を提供し得、これは、任意選択的に、流動性プレポリマーを隔離ペンに導入することを含み得る。代替的に、反応部分Ｒｆｓを含む少なくとも１つの官能化部位を有するプレポリマー４０５は、官能部分Ｍｆｓを有するアッセイ検体と反応して、アッセイ検体を既に含むプレポリマー４０７Ａを提供し得る。アッセイ検体が既に組み込まれたこのプレポリマー４０７Ａは、続けてマイクロ流体デバイス及び任意選択的に隔離ペンに流入し得、インサイチューで固化して、アッセイ検体を有するインサイチュー生成捕捉構造４０６Ａを提供し得る。
別の実施形態では、反応部分Ｒｆｓを含む少なくとも１つの官能部位を有するプレポリマー４０５は、官能部分Ｍｆｓを有するアッセイ試薬と反応して、アッセイ試薬を既に含むプレポリマー４０７Ｂを提供し得る。プレポリマー４０７Ｂは、続けてマイクロ流体デバイスのエンクロージャに流入し得、任意選択的に隔離ペンに導入されて、インサイチューで固化して、アッセイ試薬を含むインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｂを提供し得る。
更に別の実施形態では、プレポリマー４０１自体がマイクロ流体デバイスのエンクロージャ及び任意選択的に隔離ペンに流入し得、インサイチューで固化して、インサイチュー生成捕捉構造の一部を形成する固化ポリマー網目構造４０３を提供し得る。固化ポリマー網目構造は、固化ポリマー網目構造に付着又は結合する材料を流入させ、それにより、少なくとも１つの反応基Ｒｆｓ（例えば、インサイチュー生成捕捉構造４０４）を含む固化ポリマー網目構造を提供することにより、反応基Ｒｆｓを有する少なくとも１つの官能部位を導入するように修飾し得る。インサイチュー生成捕捉構造４０４は、捕捉構造４０４のＲｆｓと反応して、アッセイ検体を含むインサイチュー生成捕捉構造４０６Ａを提供する官能部分Ｍｆｓを有するアッセイ検体を流入させることにより更に修飾し得る。代替的に、インサイチュー生成捕捉構造４０４は、捕捉構造４０４のＲｆｓと反応して、アッセイ試薬を含むインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｂを提供する官能部分Ｍｆｓを有するアッセイ試薬を流入させることにより更に修飾し得る。
図４Ｄに示される更に別の実施形態では、例えば、ＲＧＤ又はプロテアーゼ基質（例えば、図４ＤにおけるＰＥＰ）モチーフを含むペプチドセグメント等のプレポリマー中に既に組み込まれたアッセイ検体又はアッセイ試薬を有するプレポリマー４０１’が準備される。プレポリマー４０１’は、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ及び任意選択的に隔離ペンに流入し、インサイチューで固化して、固化ポリマー網目構造内に組み込まれたアッセイ試薬又はアッセイ検体を有するインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｃを提供し得る。
インサイチュー生成捕捉構造を導入する方法について更に詳細に以下に説明する。
インサイチュー生成捕捉構造のアッセイ試薬
アッセイ試薬は、タンパク質、核酸、有機分子、及び／又はサッカリドを含み得る。アッセイ試薬は、対象となる核酸にハイブリダイズすることができるインサイチュー生成捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、合成して生成してもよく、又は生体細胞により生成してもよい。オリゴヌクレオチドは、生物学的生成後、サイズについて又は他の官能基を導入するように更に処理し得る。タンパク質アッセイ試薬は、抗体、構造タンパク質、細胞表面マーカ、又はサイトカインを含み得るが、これに限定されない。有機分子アッセイ試薬は、約２０００Ｄａ以下の分子重量を有する合成、半合成、又は生物学的に生成される有機分子を含み得る。有機分子は、キレート基質、キレートリガンド、ペプチド、又は非ペプチド有機分子を含み得る。幾つかの実施形態では、アッセイ試薬は、タンパク質、核酸、有機分子、又はサッカリドの２つ以上の組合せを含み得る。幾つかの実施形態では、アッセイ試薬は抗体又はその断片を含み得る。他の実施形態では、アッセイ試薬は抗原を含み得る。幾つかの実施形態では、抗原アッセイ試薬は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、又はＩＦＮγを含むがこれに限定されないサイトカインであり得る。
幾つかの実施形態では、アッセイ試薬が抗体を含む場合、アッセイ試薬抗体は腫瘍抗原に特異的に結合し得、腫瘍抗原は本明細書に記載される任意の腫瘍抗原であり得る。他の実施形態では、アッセイ試薬抗体はサイトカインに特異的に結合し得、サイトカインは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、又はＩＦＮγを含むがこれに限定されない任意の適するサイトカインであり得る。
幾つかの実施形態では、アッセイ試薬が抗原を含む場合、抗原試薬は腫瘍抗原であり得る。腫瘍抗原試薬は、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原であり得る。アッセイ試薬として使用し得る腫瘍抗原の非限定的なリストは、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ Ｅ６ Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、メランＡ／ＭＡＲＴ１、ＲＡＳ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、プロテアーゼ３（ＰＲ１）、ＢＣＲ－ＡＢＬＥ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＥＰ、ＭＬ－ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、又はＰＳＣＡを含む。
図５Ａは、マイクロ流体チャネル２６４に開いた少なくとも１つの隔離ペン５３０を有するマイクロ流体デバイス５００の一例を示す。隔離ペン５３０は、ここでは抗体として示されるアッセイ試薬５０４を含む固化ポリマー網目構造を有する１つのインサイチュー生成捕捉構造５０２を有する。
アッセイ試薬のこれらの例は、決して限定ではなく、当業者が選択し得る任意の適するアッセイ試薬であり得る。
インサイチュー生成捕捉構造のアッセイ検体
アッセイ検体は、アッセイ試薬との共有結合又は非共有結合相互作用を介してインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造に結合し得る。実施形態のいくつかでは、アッセイ検体がインサイチュー生成捕捉構造に結合／構造内に組み込まれる場合、アッセイ検体は、蛍光、比色、又は目視可能な色の染料の標識等の検出可能な標識も含む。アッセイ検体は、タンパク質、核酸、有機分子（上述したような）、及び／又はサッカリドを含み得る。幾つかの実施形態では、アッセイ検体は、タンパク質、核酸、有機分子、又はサッカリドの２つ以上の組合せを含み得る。タンパク質アッセイ検体は、抗体、構造タンパク質、細胞表面マーカ、又はサイトカインを含み得るがこれに限定されない。
幾つかの実施形態では、アッセイ検体は抗体又はその断片を含み得る。非限定的な一例では、抗体を研究する場合、第１の抗体の結合部位に結合する「抗イディオタイプ」抗体をスクリーニングすることは希ではない。抗イディオタイプ抗体は、第１の抗体が結合する抗原を模倣することができ、それにより、（１）第１の抗体が結合する抗原のモデリング又は（２）動物のワクチン接種（したがって、第１の抗体に類似する新しい抗体を生成することに使用することができる。したがって、抗イディオタイプ抗体は、これに関してアッセイ検体として見ることができ、又は代替的にアッセイ試薬と見なし得、それに従って使用し得る。
他の実施形態では、タンパク質アッセイ検体は、インサイチュー生成捕捉構造に非共有結合的に結合される抗原であり得る。有機分子アッセイ検体は、ペプチド又は非ペプチド有機分子を含み得る。アッセイ検体の非限定的な一例は、プロテアーゼの基質である。基質は、ペプチド又は非ペプチド有機分子であり得る。アッセイは、商業生産に使用し得る、対象となるプロテアーゼを効率的に生産する細胞を識別し得る。代替的に、基質は、病原体プロテアーゼ発現の標的であり得、病原性活性を有する細胞の識別に使用することができる。
例えば、プレポリマー（例えば、４０１’）内への組み込み又はインサイチュー生成捕捉構造の官能化部位への導入（例えば、架橋剤を介して、プレポリマー４０７Ａの生成、及び／又はインサイチュー生成捕捉構造４０６Ａを介して）等の任意の適する様式において、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）基質（例えば、基質配列Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｇｌｎ（例えば、ＰＥＰ）を有し得るＭＭＰ－２等）をインサイチュー生成捕捉構造に組み込み得る。特定のメタロプロテアーゼの発現は、転移能及びがん進行に関連する。ＭＭＰ基質モチーフを組み込んだインサイチュー生成捕捉構造は、ＭＭＰを発現している細胞の識別に使用し得る。ＭＭＰ基質がインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｃ（図４Ｄ参照）の固化ポリマー網目構造の一部である場合、固化ポリマー網目構造は浸食され得、網目構造の損失を監視し得る。例えば、ＭＭＰ基質モチーフを組み込んだ固化ポリマー網目構造は、プロテアーゼ活性が続くにつれて解放される蛍光標識を更に含み得る。固化ポリマー網目構造内の信号の損失を監視し得、又は隔離ペン内の液体媒体内の信号の取得を監視し得る。インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造に結合又は構造内に組み込み得る基質は、いかなる特定のタイプの基質にも限定されないが、アッセイに望ましいことがある任意の適する基質であり得る。
インサイチュー生成捕捉構造への結合又は構造内への組み込みに有用なアッセイ検体であり得る別のプロテアーゼ基質は、フューリン基質であり得る。フューリン（セリンエンドプロテアーゼ活性を有するプロタンパク質転換酵素）は、Ｔｈ１表現型へのＴ細胞の分化に関わり得る。アッセイは、本明細書に記載されるように、インサイチュー生成捕捉構造を使用して様々な方法で実行し得るが、一実施形態では、ペプチドは、インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造内の官能部位への付着を可能にするビオチン及びフューリンにより切断されると解放されるペプチド内の位置に付着したフルオロフォア等の官能部分Ｍｆｓである、フューリンの切断モチーフを組み込み得る。フューリン活性を発現する細胞は、インサイチュー生成捕捉構造から蛍光を解放し、信号の損失を検出し得、更に定量化し得る。
更に別の実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造４０６の固化ポリマー網目構造内の付着又は可能な場合には別の非共有モードのいずれかにより、蛍光標識された抗原を埋め込み得る。アッセイを実行して、Ｂ細胞により抗原抽出を測定し得る。Ｂ細胞が固化ポリマー網目構造に会合又は結合するため、Ｂ細胞が抗原に特異的な抗体を発現する場合、抗原を固化ポリマー網目構造から抽出し得る。親和性が高い抗体ほど高いレベルの抗原抽出を示し得、したがって、インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造からの蛍光信号の損失が大きくなる。
アッセイ検体のこれらの例は決して限定ではなく、アッセイ検体は、当業者が選択し得る任意の適するアッセイ検体であり得る。
検出試薬
アッセイ試薬（又は検体）とその意図される標的との相互作用の結果は、検出試薬により検出し得る。検出試薬は検出可能な標識を含み得る。検出試薬の検出可能な標識は、蛍光、比色、又は発光標識を含み得る。幾つかの実施形態では、検出試薬は、少なくとも第１の抗体を含み得る。検出試薬は、検出可能に標識される第１の抗体を含み得る。幾つかの実施形態では、検出試薬は第２の抗体を含み得、第２の抗体は検出可能な標識を組み込み得る。幾つかの実施形態では、標識された第２の抗体が二次抗体であり、少なくとも第１の抗体に結合する。第１及び／又は第２の抗体はＩｇＧ抗体であり得る。第１及び／又は第２の抗体は、抗体の断片であり得る。他の実施形態では、検出試薬は挿入染料を含み得る。更に他の実施形態では、検出試薬はＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドを含み得、これは、限定ではなく、分子ビーコン、デュアルハイブリダイゼーションプローブ、Scorpion（登録商標）プローブ、又はEclipse（登録商標）プローブを含み得る。ＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドプローブ又はプローブ対は、ハイブリダイゼーションイベントが行われるまで蛍光しない蛍光標識を含み得る。検出試薬は、限定ではなくフェナントリジン又はアクリジン染料を含む挿入染料であり得る。
多重アッセイに向けて１つ又は複数のインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイス
任意選択的にマイクロ流体デバイス４００、４５０の少なくとも１つの隔離ペン内に配置され得る、エンクロージャ内の少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造は、２つ以上の相互作用を検出するように構成し得（例えば、インサイチュー生成捕捉構造に結合した２つ、３つ、又はそれを超える異なるアッセイ試薬又は検体を有し得）、それにより、多重アッセイを行う１つのモードを提供する。幾つかの実施形態では、エンクロージャ又は少なくとも１つの隔離ペンの１つのインサイチュー生成捕捉構造は、２つの異なる検体（例えば、細胞の生物学的産物）を検出する２つのアッセイ試薬を含むように構成し得る。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス４００、４５０のエンクロージャは、その中に配置された２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造を含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス４００、４５０の少なくとも１つの隔離ペンは、その中に配置された２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造を含み得る。２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペンの分離領域内に配置し得る。マイクロ流体デバイス４５０では、第１のインサイチュー生成捕捉構造の第１の固化ポリマー網目構造は、第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得、第２のインサイチュー生成捕捉構造の第２の固化ポリマー網目構造は、第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得、少なくとも１つの隔離ペン内の追加のインサイチュー生成捕捉構造ごとに以下同様である。マイクロ流体デバイス４００では、第１のインサイチュー生成捕捉構造の第１の固化ポリマー網目構造は、第１のタイプの官能化部位を含み得、第２のインサイチュー生成捕捉構造の第２の固化ポリマー網目構造は、第２のタイプの官能化部位を含み得、官能化部位は、それぞれ異なる種類のアッセイ試薬又はアッセイ検体を受け入れることができる。エンクロージャ内又は少なくとも１つの隔離ペン内に複数のインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイス４００、４５０の実施形態では、第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体は、第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体と異なり得、追加のアッセイ試薬又はアッセイ検体ごとに以下同様である。第１のインサイチュー生成捕捉構造及び第２のインサイチュー生成捕捉構造は、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内又は代替的に少なくとも１つの隔離ペン内の異なる位置に配置し得る。第１のインサイチュー生成捕捉構造及びインサイチュー生成された第２の捕捉構造は、エンクロージャの第１の壁及び第２の壁にそれぞれ配置し得、又は同じ壁に互いに隣接して位置し得る。第１のインサイチュー生成捕捉構造及びインサイチュー生成された第２の捕捉構造は、隔離ペンの第１の壁及び第２の壁にそれぞれ配置し得、又は隔離ペンの第１の壁に互いに隣接して配置し得る。
隔離ペンが２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造を含む少なくとも１つの隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの例を図７に示す。マイクロ流体デバイス７００の一部を示し、１つの隔離ペン７３０を示す。マイクロ流体デバイス７００は、当業者により選択され得る、任意の適する組合せでのマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、４００、４５０、５００の任意のデバイスの構成要素及び特徴の任意の組合せを有し得る。隔離ペン７３０は、チャネル２６４も画定する同じマイクロ流体回路材料２６０で構築し得る。第１の流体媒体（図示せず）は、マイクロ流体チャネル２６４内でフロー２７８と共に流れ得る。隔離ペン７３０は、ペン７３０内の３つの物理的に区別可能な位置に配置された３つの捕捉構造７０２、７０４、７０８を有する。この実施形態では、生物学的産物７１６、７１８、及び７２０を生成している、ペン７３０に装填される２つの微小物体７０６がある。選択されたアッセイに適し得るように、わずか１つの微小物体７０６が存在してもよく、又は複数の微小物体７０６が存在してもよい。生物学的産物７１６、７１８、７２０は、全て異なる生物学的産物であってもよく、又は図４Ｂのインサイチュー生成捕捉構造４０６若しくは図４Ｃのインサイチュー生成捕捉構造４０６Ａ及び／若しくは４０６Ｂと均等であるインサイチュー生成捕捉構造（７０２及び７１０）、（７０４及び７１２）、並びに（７０８及び７１４）を形成する捕捉構造７０２、７０４、７０８内及び／又はその上にそれぞれ含まれるアッセイ試薬７１０、７１２、７１４（代替的に、任意の選択されたアッセイ試薬及び／又はアッセイ検体であり得る）により、３つの異なる特性についてアッセイされる同じ生物学的産物であってもよい。アッセイ試薬７１０、７１２、７１４は、それぞれ互いに異なり、異なる生物学的産物又は生物学的産物の異なる特性のいずれかについてテストされる。図７に示されるように、アッセイ試薬７１０、７１２、７１４は、見やすくするために抗体として示されているが、インサイチュー生成捕捉構造における多重化は抗体アッセイ試薬のみの包含に限定されず、本明細書に記載されるようなアッセイ試薬（又はアッセイ検体）の任意の適する組合せであり得る。
少なくとも１つの捕捉構造の他の特性
インサイチュー生成捕捉構造がエンクロージャ内及び任意選択的にフロー領域内に位置する場合、インサイチュー生成捕捉構造のサイズは、フロー領域を流体媒体が流れ得る任意の適するサイズを有し得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域の幅の８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、又はそれを下回る、フロー領域（マイクロ流体チャネルであり得る）にわたる寸法を有し得る。マイクロ流体デバイスの隔離ペンの分離領域は、約５０μｍ～約２５０μｍの幅を有し得、その中に生成されるインサイチュー生成捕捉構造の幅は、分離領域の幅の約１／８～約３／４の範囲又はそれらの間の任意の値であり得る。分離領域にわたるインサイチュー生成捕捉構造の幅は、約５０μｍの幅を有する分離領域では約５μｍ～約３５μｍの範囲（又はそれらの間の任意の値）又は約２５０μｍの幅を有する分離領域では約６０μｍ～約１９０μｍの範囲（又はそれらの間の任意の値）であり得る。様々な実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造は、生物学的微小物体（例えば、生体細胞又は胚）又は微小ビーズを含むがこれに限定されない微小物体が隔離ペンから出られるようにするように構成され得る。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造は、流体媒体の流れに対して浸透性を有し得る。固化ポリマー網目構造は、複数の微小物体の少なくともサブセットに対して浸透性を有さない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、約１ｎｍ以上、約２ｎｍ以上、約１０ｎｍ以上、約１００ｎｍ以上、約２５０ｎｍ以上、約５００ｎｍ以上、約６００ｎｍ以上、約７００ｎｍ以上、約８００ｎｍ以上、約９００ｎｍ以上、約１μｍ以上、約２μｍ以上、約３μｍ以上、約４μｍ以上、約５μｍ以上、約６μｍ以上、約７μｍ以上、約８μｍ以上、約９μｍ以上、約１０μｍ以上、約１１μｍ以上、約１２μｍ以上、約１３μｍ以上、約１４μｍ以上、約１５μｍ以上、又はそれを超える直径を有する微小物体に対して実質的に浸透性を有さない。
幾つかの実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造の少なくとも一部は除去可能であり得る。インサイチュー生成捕捉構造は、後述するように、加水分解、タンパク質分解、浸透圧変更、温度変更、又は光学照明により少なくとも部分的に除去可能であり得る。
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイスの他の特徴
マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイスであり得、以下に説明する任意の構成要素、特徴、又は寸法を任意の組合せで含み得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、選択セクタを更に含み得る。選択領域は、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造及びフロー領域の少なくとも一部を含み得る。選択セクタは、アッセイが本明細書に記載されるように実行されるマイクロ流体デバイスのエンクロージャの別個の領域であり得る。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、分離セクタを更に含み得る。分離セクタは、アッセイセクタで得られるアッセイ結果に基づいて、選択された微小物体を維持し、成長させ、及び／又は増殖させるのに使用し得る。分離セクタは、上述したような選択セクタの隔離ペンのように構成し得るが、隔離ペン内に位置するいかなる捕捉構造も有さない少なくとも１つの隔離ペンを含み得る。分離セクタは複数の隔離ペンを含み得る。分離セクタは、選択セクタに流体的に接続されたマイクロ流体デバイスのエンクロージャ内の別個の領域であり得る。分離セクタは、フロー領域の一部であるマイクロ流体チャネルを更に含み得、少なくとも１つの隔離ペンのそれぞれはマイクロ流体チャネルに向かって開く。分離セクタの少なくとも１つの隔離ペンの開口部は、マイクロ流体チャネルから側方に開き得る。
インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造で使用されるポリマー
インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造の様々な実施形態では、固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は光若しくは温度活性化可能な生体ポリマーであり得る。固化ポリマー網目構造の形成に使用される官能化プレポリマーは、固化ポリマー網目構造内での使用について本明細書に記載される任意のポリマーであり得る。生体ポリマーは、温度又は光により活性化可能であり、それにより固化ポリマー網目構造を形成するように構成し得る。幾つかの実施形態では、生体ポリマーは、温度又は光活性化可能である能力を提供する部分を組み込むように修飾し得る。合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含み得る。
インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造の幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ゼラチン、修飾ゼラチン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。他の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。更に他の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、シリコーンポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）又は修飾ポリ乳酸ポリマーを含まない。他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）又は修飾ポリグリコール酸ポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリアクリルアミド又は修飾ポリアクリルアミドポリマーを含まない。更に他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又は修飾ポリビニルアルコールポリマーを含まない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）又は修飾ポリアクリル酸ポリマーを含まない。幾つかの他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）又は修飾ポリカプロラクトンポリマーを含まない。他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、フィブロネクチン又は修飾フィブロネクチンポリマーから形成されない。幾つかの他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、コラーゲン又は修飾コラーゲンポリマーから形成されない。幾つかの他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ラミニン又は修飾ラミニンポリマーから形成されない。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は、１種類のみのポリマーを含み得る。様々な実施形態では、１種類のみのポリマーを含む固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む。
固化ポリマー網目構造に使用されるポリマーの適性を決める物理的特性及び化学的特性は、分子量、疎水性、溶解性、拡散速度、粘度（例えば、媒体の）、励起及び／又は放射範囲（例えば、その中で不動化される蛍光試薬の）、既知の背景蛍光、重合化に影響する特性、及び固化ポリマー網目構造の孔サイズを含み得る。固化ポリマー網目構造は、流動性ポリマー（例えば、プレポリマー溶液）の重合化又は熱ゲル化により形成される。
使用し得る多くのポリマーの中でも特に、１つのタイプのポリマーは、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）であり、これは、修飾ポリエチレングリコールポリマーのグループのメンバである。光開始重合化のメカニズムを式１に示す。非常に効率的であり、無黄変ラジカルであり、αヒドロキシケトン光開始剤である遊離基開始剤Igracure（登録商標）2959（ＢＡＳＦ）は、通常、ＵＶ領域（例えば、３６５ｎｍ）の波長での開始に使用されるが、他の開始剤を使用することも可能である。重合化反応に有用な別の光開始剤クラスの例は、リチウムアシルホスフィン酸塩（lithium acyl phosphinate salt）のグループであり、そのリチウムフェニル２，４，６，－トリメチルベンゾイルホスフィン酸塩は、αヒドロキシケトンクラスよりも長い波長（例えば、４０５ｎｍ）でのより効率的な吸収に起因して、特定の有用性を有する。
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光重合化し得る他のタイプのＰＥＧとしては、ＰＥＧジメチルアクリラート及び／又はマルチアームＰＥＧ（ｎ－ＰＥＧ）アクリラート（ｎ－ＰＥＧ－Ａｃｒ）が挙げられる。使用し得る他のポリマークラスとしては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）が挙げられる。
ポリマーの分子量範囲は、開示されるインサイチュー捕捉構造の性能の必要性に応じて様々であり得る。ポリマーの構造に応じて広範囲の分子量の流動性ポリマーが適し得る。有用な星型ポリマーは、約５００Ｄａ～約２０ｋＤａ（例えば、４アームポリマー）の範囲のＭｗ（重量平均分子量）、又は各アーム若しくは線状ポリマーに最高で約５ｋＤａ、又はそれらの間の任意の値を有し得る。
限定ではなく、上記列挙したポリマー又はフィブロネクチン、コラーゲン、若しくはラミニン等の生体ポリマーを含め、様々なコポリマークラスが使用可能である。デキストラン又は修飾コラーゲン等のポリサッカリドが使用可能である。重合化に光活性化可能な官能基を有する生体ポリマーを使用することも可能である。
架橋は、線状又は分岐ＰＥＧポリマーの放射、ＰＲＧアクリラートの遊離基重合化、及びマイケル付加、凝縮、クリック化学、ネイティブケミカルライゲーション、及び／又は酵素反応等の特に適合された化学反応により実行し得る。
ポリマーは、ポリマーの性質（星型、マルチアーム、又は櫛形ポリマー等の流動性ポリマーの構成、架橋可能な官能基間のポリマーセグメント長）及び重合化条件（温度又は光開始の程度、存在する光活性化開始剤の量、存在するラジカル停止種の量等）に基づいて、所望の範囲の架橋を有するように選択し得る。
幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造のポリマーは修飾ＰＥＧポリマーであり得る。このポリマーは、星型、４アーム、又は２アームＰＥＧジアクリレートポリマーであり得る。
膨張可能ポリマー
ＰＥＧポリマーは、様々な条件下で膨張可能であり得、元の媒体／温度に戻すことにより元に戻し得る。ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）は、温度を上げることにより膨張し、冷却により収縮し得る。
サイズ変更モチーフ
ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）又はポリアクリルアミド（ＰＡＭ）を含む幾つかのヒドロゲルは、官能化ポリマーの表面が光に露出されると、シス／トランス配向を変化させるアゾベンゼン等の特定の部分を組み込むこともできる。このシフトは、ペン内のインサイチュー生成捕捉構造等のポリマーの部分のサイズの大幅な変更を提供することができる。これらのポリマーは、代替的に、ＵＶ光に露出されると架橋する桂皮酸官能基を含み得、これは光をなくすと元に戻すことができる。架橋ポリマーは、非架橋状態と比較して細長い。これらのポリマーに導入し得る別の部分は、トリフェニルロイコメタン（triphenyl leucomethane）を含み、これは、光の適用時、光に露出されると可逆的にイオン対を形成する。活性化光の波長は、三ナトリウム銅クロロフィリンがポリマーに組み込まれる場合、可視範囲にすることができる。
官能化のための他の修飾
ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、（ＰＥＧ）ポリマーの末端の一方又は両方に官能基を組み込むことにより修飾し得、これは、チオール、マレイミド、カルボキシル、アミン、メトキシ、アジド、ビニルスルホン、アセチレン、又はアクリレート官能基を含み得る。導入される官能基は同じであっても又は異なってもよい。部分がポリマー上の対応する官能基と特定的に反応可能なように、所望のペプチドモチーフ、抗体、又は適切な化学的技巧による他の定義された分子官能化を導入し得る。ビオチン化を導入して、ストレプトアビジンにリンクされた別の種と後に反応し得、又はこの逆を行い得る。
ポリマーは、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含め、様々なモチーフを含み得る。切断モチーフは、限定ではなく、マトリクスメタロプロテアーゼ、コラーゲン分解酵素、又はカスパーゼ若しくはカテプシン等のシステインプロテアーゼを含む１つ又は複数のプロテアーゼの基質であるポリマーに挿入されるペプチド配列を含み得る。別のカテゴリの切断モチーフは、プレポリマーの選択された位置に挿入し得るニトロベンジル光切断可能リンカー等の光切断可能モチーフを含み得る。切断モチーフは、インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造の除去に使用し得るか、又は記載されるように、インサイチュー生成捕捉構造内に組み込まれた場合、アッセイ検体自体として使用し得る。ポリマーは、上述したように、アッセイ試薬又はアッセイ検体をインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造に導入するのに使用し得る、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）、ビオチン、アルキニル、又はアジド部分等であるがこれに限定されない化学反応モチーフを組み込むように修飾し得る。他の実施形態では、ポリマーは、限定ではなく、インテグリンにより認識されるＲＧＤペプチドモチーフ又はアッセイ検体若しくはアッセイ試薬として使用し得る上述したフューリン基質を含む細胞認識モチーフを含み得る。
インサイチュー生成捕捉構造の逆化／除去／最小化
インサイチュー生成捕捉構造に関する更なる目的がない場合、インサイチュー生成捕捉構造を除去又は縮小する幾つかのメカニズムを使用し得る。例えば、アッセイが完了し、望ましい生体細胞が識別されると、望ましい活動又は特性を示している生体細胞を引き続き培養し増殖させるために、インサイチュー生成捕捉構造を除去することが有用であり得る。
機械力。インサイチュー生成捕捉構造の少なくとも一部が、ペンの分離領域とは対照的にフロー領域内に配置される場合、フローの増大を使用することができる。例えば、インサイチュー生成捕捉構造がエンクロージャのフロー領域内に配置される場合、フロー領域を通る流体フローの流量を増大させ得、これは、少なくとも１つの捕捉構造を、限定されないが、基板、フロー領域の壁（マイクロ流体回路材料から形成し得る）、又はカバーを含め、その構造が取り付けられた表面から切り離し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペンの分離領域内に位置し得、アッセイが完了した後、隔離ペン又はその内部の分離領域は、分離領域を通る流れを生じさせるように変更し得、同様に、インサイチュー生成捕捉構造が取り付けられた表面からインサイチュー生成捕捉構造を切り離す。
加水分解への感受性：インサイチュー生成捕捉構造形成時、光開始ポリマーに化学的に結合することができないポリマーを含み得る粒子集合体が含まれ得る。形成されたヒドロゲル内の開口部の程度／サイズは、インサイチュー生成捕捉構造内のアクセス可能性を介して加水分解速度をカスタマイズすることができる）。他の実施形態では、形成された孔を利用して、インサイチュー生成捕捉構造に分泌材料又は化学試薬を透過させるが、インサイチュー生成捕捉構造を透過する細胞の移動を阻止し得る。他の実施形態では、ポリエステル、アセタール、フマル酸塩、ポリ（フマル酸プロピレン）、又はポリヒドロキシ酸等の分解可能なセグメントをポリマー（例えば、ＰＥＧポリマー）に導入することにより、これらのポリマーの分解性を上げることができる。
還元剤：ＰＥＧは、ランダム又は所定であり得る、マクロマーに沿った間隔でジスルフィド結合を用いて形成し得る。ジスルフィド結合は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、又はＴＣＥＰにより破り得る。
熱：ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）又は他の適するＬＣＳＴポリマーを使用して、加熱して捕捉構造を導入し得る。これらは、形成されたポリマー捕捉構造の温度を下げることにより除去し得る。ポリマーは、加水分解又はタンパク質分解等の他のメカニズムによる除去も可能にするＥＬＰ又は他のモチーフを含み得る。特に、ＰＮＩＰＡｍを使用して付着細胞への表面を作製し得るが、次に搬出を可能にするように切り替え得る。他のポリマーは、温度に応じてサイズ変更を示すこともできる。例えば、インサイチュー生成捕捉構造内に組み込まれるＰＥＧＤＡヒドロゲルは、約４０℃から約２０℃に温度が下がると、約２０％だけ膨張し得る。ＰＥＧＤＡヒドロゲルインサイチュー生成捕捉構造のサイズは、インサイチュー生成捕捉構造の下にある基板、又は例えばＩＴＯであり得るインサイチュー生成捕捉構造にわたる透明カバーに向けられたレーザ照明を使用することにより、局所的に上げ得る。
タンパク質分解への感受性：ヒドロゲルは、選択されたプロテアーゼによる選択されたモチーフへの選択的タンパク質分解が、ヒドロゲル捕捉構造を除去／逆化／又は最小化することができるように改変された任意の種類のペプチド配列を有し得る。幾つかのクラスの修飾ＰＥＧは、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）モチーフを有し、及び／又は様々なプロテアーゼに対する感受性のペプチドモチーフ（酵素感受性ペプチドＥＳＰ）を有するＰＥＧを含む。多数のこれらのモチーフが既知である。１つの有用なモチーフは、環式であるように制約し得るＲＧＤである。
浸透圧変化感受性：カルシウム濃度／他の浸透圧方策を利用してインサイチュー生成捕捉構造を分解及び除去することができる。上記のように、媒体変更を使用して捕捉構造を寸法的に膨張又は縮小させる。
光開始の光切断：上述したように、ニトロベンジル光切断可能なリンカー等の光切断可能モチーフをインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造内に組み込み得る。光切断可能モチーフを含むインサイチュー生成捕捉構造は、光切断可能モチーフの切断を開始するのに適する波長を有する少なくとも幾つかの光を含む光への露出により、除去又はサイズ縮小を受けやすいことができる。
幾つかの用途では、インサイチュー生成捕捉構造は除去されず、光又は媒体／溶媒の変更を使用して単に膨張又は縮小し得る。幾つかのタイプのヒドロゲルは、光に対して可逆的に応答する（例えば、剛性結合周囲の位置化学の変更、ポリマー内での可逆的架橋の形成、又はイオン対の形成／破断）部分を組み込み得る。
マイクロ流体デバイス支援の加熱
マイクロ流体デバイスは、基板のインサイチュー生成捕捉構造の位置に配置された金属パッドを更に含み得る。金属パッドは、連続金属形状又は金属形状のパターンを基板上に堆積させることにより作製し得る。熱パッドは、光源により励起して、発熱することができる任意のタイプの金属を含むことができる。適する金属としては、クロム、金、銀、アルミニウム、インジウムスズ酸化物、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。複数の金属、例えば、クロムの層、チタンの層、金の層は、多層熱パッドにおいて組み合せ得る。他の金属（及び合金）も当技術分野で既知である。熱パッドは、連続金属表面を含むこともでき、又は金属のパターン（例えば、ドット、正方形、線、円錐、不規則形等の金属形状）を含むこともできる。幾つかの実施形態では、金パッドを基板のインサイチュー生成捕捉構造が生成されることになる／生成された位置に配置し得る。熱パッドを使用して、インサイチュー生成捕捉構造をゲル化、膨張、縮小、又は除去するための熱を生成し得る。熱は、そのようなゲル化、膨張、縮小、又は除去が望まれるマイクロ流体デバイスの位置に光を向けることにより生成し得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造は感熱性ポリマーを含み得る。インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造が感熱性ポリマーを含む場合、デバイスは、基板の、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造が導入されることになる位置の下に配置された熱パッドを更に含み得る。
官能化捕捉構造を使用して微小物体をアッセイする方法
少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイスにおいて、微小物体（例えば、生体細胞若しくは胚）又は微小物体によって生成される生物学的産物をアッセイする方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイス内において、第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置するステップであって、インサイチュー生成捕捉構造は、固化ポリマー網目構造を含み、更に、固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含む、ステップと、アッセイ試薬又はアッセイ検体を微小物体又は微小物体の生物学的産物に接触させるステップと、アッセイ試薬又はアッセイ検体と微小物体又は生物学的産物との相互作用を検出するステップとを含む。様々な実施形態では、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイスにおいて、微小物体（例えば、生体細胞）をアッセイする方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイス内において、インサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置するステップであって、インサイチュー生成捕捉構造は、固化ポリマー網目構造を含み、更に、固化ポリマー網目構造は、アッセイ検体を含む、ステップと、アッセイ検体を微小物体の生物学的産物に接触させるステップと、アッセイ検体と生物学的産物との相互作用を検出するステップとを含む。
更に他の実施形態では、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイスにおいて、微小物体（例えば、生体細胞）をアッセイする別の方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイス内において、第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置するステップであって、インサイチュー生成捕捉構造は、固化ポリマー網目構造を含み、更に、固化ポリマー網目構造は、アッセイ検体を含む、ステップと、アッセイ検体を微小物体に接触させるステップと、アッセイ検体と微小物体との相互作用を検出するステップとを含む。更に他の実施形態では、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を有するマイクロ流体デバイスにおいて、微小物体（例えば、生体細胞）をアッセイする方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイス内において、第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置するステップであって、インサイチュー生成捕捉構造は、固化ポリマー網目構造を含み、更に、固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬を含む、ステップと、アッセイ試薬を微小物体又は微小物体の生物学的産物に接触させるステップと、アッセイ試薬と微小物体又は生物学的産物との相互作用を検出するステップとを含む。
任意の上記方法のアッセイ試薬又はアッセイ検体は、本明細書に記載される任意のアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれるアッセイ試薬又はアッセイ検体は、上述した任意の方法でインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造に共有結合的又は非共有結合的に付着され得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、有機分子、又はサッカリドを含み得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、それぞれ上述した任意のアッセイ試薬又はアッセイ検体であり得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、微小物体の生物学的産物は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、有機分子、又はサッカリドを含み得る。微小物体の生物学的産物は、本明細書に記載される任意の生物学的産物であり得、方法において、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれるアッセイ試薬により測定される検体として機能し得る。代替的に、微小物体の生物学的産物は、インサイチュー生成捕捉物体内及び／又はその上に含まれるアッセイ検体に結合し、アッセイ検体と反応し、及び／又はアッセイ検体を切断し得、それにより、生物学的産物は、アッセイ方法において試薬として機能する。
微小物体（例えば、生体細胞又は胚）をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、基板、マイクロ流体回路材料、及びエンクロージャ内に配置されるフロー領域を含むエンクロージャを含み、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造がエンクロージャ内に配置される。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、少なくとも１つの隔離ペンを更に含み、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造は、少なくとも１つの隔離ペン内に配置し得る。隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有し得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペンの分離領域内に配置し得る。フロー領域はチャネルを含み得る。少なくとも１つの捕捉構造は、隔離ペンの第１の壁に隣接する第１の位置に配置し得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、エンクロージャは複数の隔離ペンを含み得る。複数の隔離ペンは行に位置合わせし得、複数の各隔離ペンの基端開口部は、フロー領域内で共通する方向に開き得る。幾つかの実施形態では、フロー領域はチャネルを含み得、複数の各隔離ペンの基端開口部は、マイクロ流体チャネルの片側に開き得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの基板は、エンクロージャ内の流体媒体中の微小物体に対して誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成し得る。マイクロ流体デバイス内において、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体（例えば、生体細胞）を配置するステップは、誘電泳動力を使用して微小物体を移動させることを含み得る。誘電泳動力は光学的に作動され得る。代替的に、マイクロ流体デバイスの基板は、エンクロージャ内の液滴に対してエレクトロウェッティング力を生成するように構成し得る。マイクロ流体デバイス内において、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置するステップは、エレクトロウェッティング力を使用して微小物体を移動させることを含み得る。エレクトロウェッティング力は光学的に作動され得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内で誘電泳動力及びエレクトロウェッティング力の両方を生成するように構成され得る１つ又は複数の基板を含み得、これらの力は、それぞれ光作動され得る。代替的に、フロー領域（例えば、マイクロ流体チャネル）内の流体及び／又は重力を使用して、微小物体をマイクロ流体デバイス内に配置し得る。幾つかの実施形態では、誘電泳動力、エレクトロウェッティング力、重力、及び／又は流体フローの組合せを使用して微小物体を配置し得る。様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、被覆材料を含む少なくとも１つの表面を有し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、少なくとも１つの表面を共有結合的に修飾して、細胞の成長、生存性、可搬性、及びそれらの任意の組合せを強化する調整表面を提供し得る。調整表面は、本明細書に記載される任意の適する調整表面であるように選択し得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれるアッセイ試薬又はアッセイ検体は、微小物体（例えば、生体細胞若しくは胚）又は微小物体の生物学的産物と相互作用することが許容される。幾つかの実施形態では、相互作用は、非共有結合、例えば、微小物体の生物学的産物である抗原又はサイトカイン（例えば、検体）等のタンパク質と、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれる抗体（例えば、アッセイ試薬）との結合であり得る。非共有結合的な相互作用の別の例では、インサイチュー生成捕捉構造は、微小物体の表面に発現するタンパク質の結合認識モチーフを含み得、ここで、微小物体が対象となるタンパク質を発現する場合、微小物体はインサイチュー生成捕捉構造に結合し得る。他の実施形態では、例えば、インサイチュー生成捕捉構造がプロテアーゼ認識モチーフを含み、それにより、インサイチュー生成捕捉構造に結合されたアッセイ検体を提供する場合、相互作用により化学結合を切断し得る。この実施形態では、相互作用は、認識モチーフと相互作用して、インサイチュー生成捕捉構造内に組み込まれた基質を切断する、微小物体により分泌されるか、又は微小物体の表面上に発現するプロテアーゼの相互作用であり得る。更に他の実施形態では、相互作用は共有結合的な相互作用を含み得る。例えば、インサイチュー生成捕捉構造は、生物学的産物（例えば、抗原、サイトカイン、又は任意の分泌された生物学的産物）に特異的に結合するように構成される抗体等のアッセイ試薬を含み得、インサイチュー生成捕捉構造又は抗体は、抗体アッセイ試薬に非共有結合的に結合する生物学的産物に共有結合的に結合する、架橋部分（例えば、カルボン酸、アミノ部分、チオール部分、又はその活性種）等の反応部分も含む。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、検出するステップは、少なくとも１つの捕捉構造から信号を検出することを含む。方法の様々な実施形態では、検出可能な信号は、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれるアッセイ試薬又はアッセイ検体内に組み込まれ得る。検出可能な信号は、少なくとも１つの捕捉構造の表面に集中され得、又はエンクロージャ内又は代替的に隔離ペン内でインサイチュー生成捕捉構造に直接隣接する領域において検出してもよい。更に他の実施形態では、検出可能な信号は、インサイチュー生成捕捉構造の内部に集中され得、これは、固化ポリマー網目構造全体を通した拡散を介して生じ得る。検出可能な信号は、蛍光性、発光性、又は比色性であり得る。幾つかの実施形態では、信号は蛍光性であり得る。幾つかの実施形態では、蛍光信号を検出するステップは、蛍光信号を定量化することを更に含み得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの幾つかの実施形態では、少なくとも１つの捕捉構造から信号を検出するステップは、少なくとも１つの捕捉構造の初期蛍光信号の損失を検出することを含み得る。例えば、インサイチュー生成捕捉構造は、アッセイ検体等のプロテアーゼ基質モチーフを含む固化ポリマー網目構造を含み得、基質モチーフは蛍光標識等の検出可能な信号を含む。アッセイ検体と、アッセイ検体を切断可能なプロテアーゼとの相互作用を検出することは、蛍光プロテアーゼ基質モチーフを組み込んだインサイチュー生成捕捉構造からの蛍光信号の損失の程度を検出することを含み得る。別の実施形態では、方法は、アッセイ検体としてプロテアーゼ基質モチーフを組み込んだインサイチュー生成捕捉構造が、消光蛍光対（例えば、挿入された基質モチーフにおいて適宜離間された異なるアミノ酸上に二重標識を有し得るか、又は分子ビーコン若しくは他のＦＲＥＴプローブ構造を含み得るＦＲＥＴ対）を含む場合、蛍光信号の取得を検出することを含み得る。この実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造のプロテアーゼ基質モチーフと、微小物体によって生成されるプロテアーゼ（例えば、生物学的産物）との相互作用により、プロテアーゼによる基質の切断が消光蛍光対の空間間隔を増大させる場合、信号の増大を検出し得る。１つ又は複数の蛍光信号が検出可能である。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの他の実施形態では、蛍光信号は、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれるアッセイ試薬又はアッセイ検体と相互作用する生物学的産物又は微小物体内に組み込まれ得る。例えば、微小物体により分泌される、対象となるタンパク質（例えば、生物学的産物）も緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の信号を含むことができ、したがって、対象となるタンパク質に特異的に結合するインサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれる抗体と相互作用するとき、直接検出可能であり得る。他の実施形態では、表面に対象となるタンパク質を発現している微小物体も、微小物体内に含まれる検出可能な信号を有し得（イソギンチャク（Discoma sp.）に関連する配列を有する挿入タンパク質であるmCherry等）、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれる抗体（例えば、アッセイ試薬）と結合すると、細胞内タンパク質の蛍光を直接検出し得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの更に他の実施形態では、検出するステップは、検出可能な標識を有する検出試薬を、インサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に導入することを更に含む。本明細書に記載される任意の適する検出試薬が使用可能である。検出試薬の導入は、マイクロ流体デバイスのフロー領域を通して、検出試薬を含む溶液を流入させることを含み得る。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造が隔離ペン内に位置する場合、検出試薬は、マイクロ流体デバイスのエンクロージャに流入した後、実質的に拡散により又は拡散のみにより、インサイチュー生成捕捉構造を含む隔離ペンに入り得る。検出試薬の導入は、微小物体をエンクロージャ又は代替的に隔離ペンに配置するステップが実行された後に実行し得る。幾つかの実施形態では、検出試薬は、微小物体がエンクロージャ又は隔離ペンに導入される前に導入し得る。幾つかの実施形態では、検出試薬を導入するステップは、検出するステップを実行する直前に実行し得る。様々な実施形態では、検出試薬は、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれるアッセイ試薬が生物学的産物又は微小物体自体（例えば、アッセイの検体）と相互作用するとき、インサイチュー生成捕捉構造に集中するように構成される。検出試薬は、結合対の形成、標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、それ自体がアッセイ試薬若しくはアッセイ検体／微小物体又はその生物学的産物の相互作用によりインサイチュー生成捕捉構造の直近領域に拘束される、生物学的産物又は微小物体の挿入又は共有結合的反応等の任意の適するメカニズムにより、インサイチュー生成捕捉構造に集中され得る（例えば、インサイチュー生成捕捉構造の直近領域に拘束される）。幾つかの実施形態では、検出試薬／微小物体又はその生物学的産物／アッセイ試薬又はアッセイ検体／インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造間の相互作用は、検出試薬の検出可能な信号を集中させるように機能し得る複合体を形成し得る。幾つかの実施形態では、検出試薬の検出可能な標識は、インサイチュー生成捕捉構造に集中されるまで検出されない。例えば、検出試薬がインターカレーター染料又は分子ビーコン（ＦＲＥＴ消光ヘアピンプローブ）、Scorpion（ＦＲＥＴ消光プローブ／プライマー組合せ）、又はオリゴヌクレオチドの任意の他のＦＲＥＴ標識である場合、信号の検出は、検出試薬が微小物体の生物学的産物又は微小物体自体に結合するまで実行されず、幾つかの実施形態では、生物学的産物又は微小物体は、インサイチュー生成捕捉構造に固定し得る。様々な実施形態では、検出試薬の検出可能な標識は、アッセイ試薬又はアッセイ検体に非共有結合的に付着される。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの幾つかの実施形態では、検出試薬は少なくとも第１の抗体を含む。１つ又は複数の抗体を使用して、インサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれるアッセイ試薬又はアッセイ検体と、微小物体の生物学的産物又は微小物体自体との相互作用を検出し得る。幾つかの実施形態では、方法は、アッセイ検体／（生物学的産物又は微小物体）対又はアッセイ試薬／（生物学的産物又は微小物体）対への特異性を有する第１の検出抗体を導入し、その後、標識され、アッセイ検体／（生物学的産物又は微小物体）対又はアッセイ試薬／（生物学的産物又は微小物体）対の少なくとも一部に結合することができる第２の抗体を導入することを含み得る。幾つかの実施形態では、方法は、第１の検出抗体への特異性を有する第２の抗体を導入することを含み得る。他の実施形態では、標識された第２の抗体は、アッセイ検体／（生物学的産物又は微小物体）対の複合体又はアッセイ試薬／（生物学的産物又は微小物体）対の複合体への特異性を有し得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、方法は、マイクロ流体デバイスから微小物体を搬出するステップを更に含み得る。微小物体は、アッセイの結果（例えば、検出ステップにおいて所望レベルの信号を示す）に基づいて搬出し得る。方法の様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスから微小物体を搬出することは、マイクロ流体デバイスの基板の別の部分に微小物体を移動させることを更に含み得る。例えば、アッセイするステップは、本明細書に記載されるように選択セクタ内で実行し得、アッセイする方法により識別された、選択された特性を示す微小物体は、ＤＥＰ力、エレクトロウェッティング力、重力、又は流体フローにより、更なる処理のためにマイクロ流体デバイスの分離セクタに移動させ得る。
微小物体をアッセイする方法のいずれかの様々な実施形態では、方法は、加水分解剤の導入、タンパク質分解剤の導入、フロー領域及び／又は隔離ペン内の流体媒体の浸透圧を増減する流体媒体の導入、インサイチュー生成捕捉構造の温度の変更、又はインサイチュー生成捕捉構造の光学的照明を行い、それによって少なくとも１つの捕捉構造を縮小又は除去することにより、インサイチュー生成捕捉構造を縮小又は除去するステップを更に含み得る。温度を変更するステップは、インサイチュー生成捕捉構造に隣接するか、又はインサイチュー生成捕捉構造の下の基板上において熱パッドを光学的に照明することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造を縮小（例えば、インサイチュー生成捕捉構造のサイズ又は官能化部位数を低減する）又は除去することは、微小物体をインサイチュー生成捕捉構造への集中／拘束から解放し得る。
他の実施形態では、微小物体を搬出するステップは、上述したように、微小物体が結合されたアッセイ試薬／アッセイ検体の競合結合パートナーを導入することを含み得る。アッセイ試薬／アッセイ検体の競合結合パートナーは、アレイ試薬／アッセイ検体との結合相互作用から微小物体を解放させ、微小物体の搬出を可能にし得る。
図５Ａ～図５Ｅは、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造をエンクロージャ内に有するマイクロ流体デバイスにおいて微小物体（例えば、生体細胞又は胚）をアッセイする方法の一実施形態を示す。この実施形態では、エンクロージャは、その中に配置された少なくとも第１の捕捉構造を含む隔離ペンを含み、インサイチュー生成捕捉構造は、予め選択されたアッセイ領域として機能する。インサイチュー生成捕捉構造は、例えば、図５Ａに示されるように、アッセイ試薬を用いて官能化し得る。方法はそのように限定されず、インサイチュー生成捕捉構造は、代わりにアッセイ検体を含むように官能化されてもよい。
図５Ａでは、インサイチュー生成捕捉構造５０２が示され、この構造は、例えば、固化ポリマー網目構造に導入されたストレプトアビジンを有する。構造ポリマーのプレポリマー溶液（例えば、ストレプトアビジン修飾反応プレポリマー）及び可溶性開始剤は、マイクロ流体デバイスに流入し得る。インサイチュー生成捕捉構造の精密で選択的な固化は、インサイチュー生成捕捉構造４０４へのプレポリマー４０５の変換について図４Ｃに示された概略化プロセスと同様に、隔離ペン５３０の１つの角を照明することにより達成することができる。この実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造５０２は、流体媒体が流れる（２７８）マイクロ流体チャネル２６４への隔離ペン５３０の開口部への先端にある分離領域の角において、マイクロ流体回路材料２６０で形成される壁の近傍／壁に位置するように生成される。インサイチュー生成捕捉構造の形成後、マイクロ流体チャネル２６４を洗い流し、使用されなかった試薬を隔離ペン５３０から拡散により出すことにより、余分なポリマー溶液及び開始剤をシステムから除去し得る。インサイチュー生成捕捉構造５０２は、インサイチュー生成捕捉構造の表面上及び固化ポリマー網目構造全体の両方を通してストレプトアビジンを提示し得る。
官能化抗体は、隔離ペン５３０の分離領域に導入し得る。官能化抗体はビオチン官能基を有し得、ビオチン官能基は、インサイチュー生成捕捉構造５０２の表面上又はインサイチュー生成捕捉構造５０２内のストレプトアビジン部位に結合し、それにより、インサイチュー生成捕捉構造５０２の表面又は内部に含まれる抗体５０４を提供し、図４Ｂの捕捉構造４０６（これはまた、図４Ｃの概略的なインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｂと均等である）と均等なインサイチュー生成捕捉構造（５０２＋５０４）を提供し得る。抗体５０４は、分泌された生物学的産物に特異的な任意の抗体であり得る。幾つかの実施形態では、抗体５０４は、ＩＬ－２、ＩＦＮα／β、ＴＮＦα等のサイトカインであり得る。抗体５０４を使用して、対象となるサイトカインを分泌する細胞を検出し得る。ビオチン化抗体５０４の全てが少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造内及び／又はその上に含まれる必要があるわけではない。ビオチン化抗体５０４の幾つかの部分は、溶液中を自由に浮遊することもできる。逆の対を使用することもでき、例えば、インサイチュー生成捕捉構造５０２は、ポリマー網目構造の光開始固化により組み込まれたビオチン化部位を有し得、抗体５０４は、ストレプトアビジンを含むように修飾し得る。ストレプトアビジン官能基は、インサイチュー生成捕捉構造５０２上のビオチン部位に結合することができ、それによりまた、インサイチュー生成捕捉構造５０２の表面又は内部に含まれる抗体５０４を提供する。
図５Ａ～図５Ｅでは、アッセイ試薬は、便宜上及び簡明にするために抗体として示されているが、方法はそのように限定されない。アッセイ試薬は、本明細書に記載される任意の適するアッセイ試薬であり得る。
生体細胞５０６は、マイクロ流体チャネル２６４に流入し、本明細書に記載される任意の適する方法により隔離ペン５３０の分離領域に配置することができる。対象となる細胞５０６は、ストレプトアビジン官能化抗体が導入される前又は後に、ストレプトアビジン官能化捕捉構造を有するペンに導入し得る。対象となる１つ又は複数の細胞５０６が存在し得る。幾つかの実施形態では、１つの細胞５０６があり得る。
細胞は、培養することができ、生物学的産物を分泌し得る。生物学的産物はタンパク質であり得る。細胞のタンパク性生物学的産物の非限定的な一例は、サイトカインであり得る。サイトカインを生成し得る細胞の非限定的な一例はＴ細胞であり得る。
図５Ｂに示されるように、細胞の培養が続くにつれて、細胞５０６は、抗体アッセイ試薬５０４に結合することができる生物学的産物５０８を生成し得る。生物学的産物５０８は、インサイチュー生成捕捉構造５０２上のアッセイ試薬５０４との相互作用により捕捉され、例えば、インサイチュー生成捕捉構造内又はその上に組み込まれた抗体により捕捉される。図５Ｃは、図５Ｂのインサイチュー生成捕捉構造５０２の拡大図を示し、生物学的産物５０８とインサイチュー生成捕捉構造５０２のアッセイ試薬５０４（例えば、抗体）との相互作用（例えば、結合）により形成された複合体５１０を示す。インサイチュー生成捕捉構造５０２は、ペン内のマイクロ流体チャネルへの基端開口部の近傍に位置することもでき、又はペンの接続領域のより先端のセクション内若しくは分離領域内に位置することもできる。
インサイチュー生成捕捉構造５０２の表面又は内部に含まれるアッセイ試薬５０４である抗体は、対象となる生物学的産物５０８（例えば、検体）を捕捉し集中させる。複合体５１０の集中された捕捉された生物学的産物５０８／抗体５０４は、図５Ｄに示されるように、蛍光標識し得る標識抗体５１２の導入により検出可能になり得る。インサイチュー生成捕捉構造５０２／５０４の固化ポリマー網目構造に集中された不動化された抗体／サイトカイン／抗体複合体５１４の蛍光信号の検出により、分泌している生体細胞を検出し、分泌の積極性の高／低をランク付けすることができる。図５Ｅは、インサイチュー生成捕捉構造５０２が位置する隔離ペンの領域の拡大図を示す。不動化された抗体５０４／サイトカイン（例えば、生物学的産物５０８）／標識抗体５１２の複合体５１４を示す。ここでは、簡明にするために、検出試薬は抗体として示されているが、検出試薬はそのように限定されず、本明細書に記載される任意の適する検出試薬であり得る。
幾つかの他の実施形態では、生物学的産物５０８は、それ自体、限定ではなく、緑色蛍光タンパク質等である検出可能な標識を含み得る。生物学的産物５０８が検出可能な標識を含む場合、検出試薬による追加の標識は実行されなくてもよく、生物学的産物５０８の検出可能な標識の量を直接検出し得る。したがって、方法の幾つかの実施形態では、検体（例えば、生物学的産物５０８）は、検出可能な検体であり得、アッセイ試薬５０４と相互作用し、アッセイ試薬５０４により捕捉されて、検出可能な複合体５１０’（図示せず）を形成し得、この複合体が検出され得る。
多重アッセイ方法
１つ又は複数の微小物体（例えば、生体細胞又は胚）をアッセイする方法の様々な実施形態では、多重アッセイを実行し得る。一実施形態では、エンクロージャ内又は任意選択的に隔離ペン内に位置する少なくとも１つの捕捉構造は、２つ以上のアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る。他の実施形態では、エンクロージャ又は任意選択的にその内部の隔離ペンは、第１の捕捉構造及び第２の捕捉構造を含み得る。第１の捕捉構造は、上述したようなものであり得、第１のアッセイ試薬又は第１のアッセイ検体を含み得る。第２の捕捉構造は、第２の固化ポリマー網目構造を含み得、第２の固化ポリマー網目構造は、第２のアッセイ試薬又は第２のアッセイ検体を含み得る。第２の固化ポリマー網目構造及び第２のアッセイ試薬又は第２のアッセイ検体は、上述した任意の特徴を任意の組合せで含み得る。幾つかの実施形態では、第１及び第２の捕捉構造のそれぞれは、異なるアッセイ試薬又はアッセイ検体を含む。幾つかの実施形態では、第１及び第２の捕捉構造は、互いに異なる第１のアッセイ試薬及び第２のアッセイ試薬を含み得る。他の実施形態では、第１及び第２の捕捉構造は、互いに異なる第１のアッセイ検体及び第２のアッセイ検体を含み得る。更に他の実施形態では、第１の捕捉構造及び第２の捕捉構造は、一方の捕捉構造にアッセイ試薬を含み、第２の捕捉構造にアッセイ検体を含み得る。多重アッセイの幾つかの実施形態では、第１の捕捉構造及び第２の捕捉構造は、エンクロージャ又は代替的に隔離ペン内の区別可能な位置に配置し得る。第１及び第２の捕捉構造の区別可能な位置は、エンクロージャの同じ壁若しくはその内部の隔離ペンの同じ壁に隣接してもよく、又はエンクロージャの異なる壁若しくはその内部の隔離ペンの異なる壁に隣接してもよい。
多重アッセイの様々な実施形態では、検出するステップは、第１の検体及び第２の検体を検出することを含み、第１の検体は第２の検体と異なる。第１の検体及び第２の検体は、微小物体により分泌される第１の生物学的産物及び第２の生物学的産物であり得る。他の実施形態では、第１の検体及び第２の検体は、微小物体から分泌される生物学的産物であり得、及び第２の検体は、微小物体の表面に存在する生物学的産物であり得、互いに異なり得る。他の実施形態では、検出するステップは、第１の捕捉構造上の第１のアッセイ検体と相互作用する第１の生物学的産物を検出し、且つ第２の捕捉構造上の第２のアッセイ検体と相互作用する第２の生物学的検体を検出することを含み得る。更に他の実施形態では、検出するステップは、第１のアッセイ試薬と相互作用する第１の生物学的産物を検出し、且つ第２のアッセイ試薬と相互作用する第２の生物学的検体を検出することを含み得る。
相互作用を検出するステップは、第１及び第２の捕捉構造への基端にある領域に第１の検出試薬及び第２の検出試薬を導入することを更に含み得、第１及び第２の検出試薬は、それぞれ検出可能な標識を含む。第１の検出試薬及び第２の検出試薬の検出可能な標識は、それぞれ独立して蛍光性、比色性、又は発光性であり得る。検出するステップは、第１の検出可能な標識の第１の蛍光信号及び第２の検出可能な標識の第２の蛍光信号を検出することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、第１の蛍光信号及び第２の蛍光信号は、物理的に区別可能であり得、例えば、エンクロージャ内の異なる位置又は代替的にその内部の隔離ペン内の異なる位置に位置し得る。他の実施形態では、第１の蛍光信号及び第２の蛍光信号は、スペクトルで区別可能であり得る。他の実施形態では、第１又は第２の検出可能な信号の一方は、蛍光性であり得、第１又は第２の検出可能な信号の他方は、蛍光性ではない。
多重方法の様々な実施形態では、第１及び第２の検出可能な試薬のそれぞれは、第１又は第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体にそれぞれ非共有結合的に付着され得る。幾つかの実施形態では、第１及び第２の検出試薬のそれぞれは抗体を含み得る。幾つかの実施形態では、第１及び第２の検出試薬のそれぞれは、第３及び第４の抗体をそれぞれ含み、各抗体は検出可能な標識を有し得、第３の抗体は、第１のアッセイ試薬又は第１のアッセイ検体／（生物学的産物又は微小物体）対に特異的に結合し、第４の抗体は、第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体／（生物学的産物又は微小物体対に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、第１のアッセイ試薬が抗体である場合、第３の抗体は、第１のアッセイ試薬への二次抗体であり得る。幾つかの実施形態では、第２のアッセイ試薬が抗体である場合、第４の抗体は第２のアッセイ試薬への二次抗体であり得る。
多重アッセイの様々な実施形態では、第１及び／又は第２の蛍光信号は定量化され得る。
方法の様々な実施形態では、多重アッセイは、生物学的産物の３つ以上の特性、３つ以上の異なる微小物体の生物学的産物若しくは微小物体自体、又はそれらの任意の組合せに対して実行し得る。エンクロージャ内又は代替的にその内部の少なくとも１つの隔離ペン内に第３以上の捕捉構造が存在し得る。第３以上の捕捉構造のそれぞれは、固化ポリマー網目構造を含み得、第３以上の固化ポリマー網目構造のそれぞれの固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る。第３以上の捕捉構造のそれぞれのアッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の捕捉構造の第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体と異なり得、及び／又は第２の捕捉構造の第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体と異なり得る。第３以上の捕捉構造のアッセイ試薬又はアッセイ検体のそれぞれは、互いと異なり得る。他の実施形態では、第１及び第２の捕捉構造の一方又は両方は、代替的に、第１の捕捉構造の第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体から区別可能であり、且つ第２の捕捉構造の第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体から区別可能な２つ以上のアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る。
１つ又は複数の微小物体をアッセイする多重方法の様々な実施形態では、検出するステップは、少なくとも隔離ペン内で位置が別個であるか、検出可能にスペクトルが別個であるか、又はそれらの組合せである第１、第２、又は第３以上の検出可能な信号を検出することを更に含む。
多重方法は、エンクロージャ内若しくはその内部の隔離ペン内の２つ以上の特性をアッセイするように構成される少なくとも１つの捕捉構造を含むか、又は代替的にエンクロージャ内に２つ以上の捕捉構造若しくは少なくとも１つの隔離ペン内に２つ以上の捕捉構造を含み、２つ以上の捕捉構造のそれぞれが１つの特性をアッセイするように構成されるマイクロ流体デバイス内に１つ又は複数の微小物体を配置すること、微小物体に１つ又は複数の生物学的産物（それらの任意の組合せを、上述した任意の多重アッセイ試薬及び／又はアッセイ検体のアッセイ試薬又はアッセイ検体と任意の組合せで使用し得る）を解放又は生成させること、アッセイ検体又はアッセイ試薬を生物学的産物又は微小物体自体と相互作用させること、及び相互作用を検出する任意の態様を含むがこれに限定されない、シングルプレックス方法について上述した任意のステップを含み得る。
図７は、本明細書に記載される方法による多重アッセイを示すと共に、エンクロージャ（図示せず）内のフロー領域（マイクロ流体チャネル２６４）及びチャネル２６４を画定する壁を形成するマイクロ流体回路材料２６０を示す。マイクロ流体デバイス７００内の１つの隔離ペン７３０が示され、上述したように、マイクロ流体回路材料２６０で作られた、隔離ペンを囲む壁を有する。隔離ペン７３０は、ペン７３０内の３つの物理的に区別可能な位置に配置された３つの捕捉構造７０２、７０４、７０８を有する。ペン７３０に装填された２つの微小物体７０６があり、微小物体は、この実施形態では、生物学的産物７１６、７１８、及び７２０を生成している。生物学的産物７１６、７１８、７２０は全て異なってもよく、又は捕捉構造７０２、７０４、７０８内及び／又はその上にそれぞれ含まれるアッセイ試薬７１０、７１２、７１４により３つの異なる特性についてアッセイされる同じ生物学的産物であってもよい。アッセイ試薬７１０、７１２、７１４は、それぞれ互いから異なり、異なる生物学的産物又は生物学的産物の異なる特性のいずれかについてテストされる。図７に示されるように、アッセイ試薬７１０、７１２、７１４は、見やすくするために抗体として示されているが、方法は抗体アッセイ試薬に限定されず、本明細書に記載されるアッセイ試薬及び／又はアッセイ検体の任意の適する組合せであり得る。図７に示される時点は、微小物体７０６が生物学的産物７１６、７１８、７２０を生成することが許容され、生物学的産物７１６、７１８、７２０が、各捕捉構造７０２、７０４、７０８にそれぞれ不動化されたアッセイ試薬７１０、７１２、７１４と既に相互作用した後及び検出試薬７２２、７２４、７２６が既に隔離ペン７３０に導入され、それぞれの標的７１６、７１８、７２０に特異的に結合した時点後の時点である。見やすくするために、検出試薬７２２、７２４、７２６は抗体として表されるが、方法は、上述したような抗体検出試薬に限定されない。また、見やすくするために、検出試薬７２２、７２４、７２６は、それぞれ標識（図示せず）を含み、標識は、検出試薬７２２、７２４、７２６に直接結合する検出可能な標識であってもよく、又は代替的に、標識は、抗体７２２、７２４、７２６に特異的に結合する二次抗体（図示せず）に結合してもよい。検出試薬７２２、７２４、７２６に直接結合する検出可能な各標識は、スペクトルで区別可能であることにより他の検出可能な標識のそれぞれから検出可能に区別可能であり得、又は検出試薬の検出可能な標識が結合するインサイチュー生成捕捉構造の位置により検出可能に区別可能であり得る。捕捉構造、アッセイ試薬又はアッセイ検体（例えば、実行中のアッセイに応じて）、微小物体又は生物学的産物（例えば、アッセイ試薬又はアッセイ検体が微小物体と相互作用するか、それとも微小物体の生物学的産物と相互作用するか）、及び検出試薬の組合せを含み得、図７では、（７０２／７１０／７１６／７２２）、（７０４／７１２／７１８／７２４）、及び／又は（７０８／７１４／７２０／７２６）として示される各アッセイ複合体は、独立して検出し得、又は同時に検出し得る。各複合体からの検出可能な信号は、インサイチュー標準化信号との比較により、互いへの正規化により、及び／又は任意の適する定量化により定量化し得る。
準備方法
マイクロ流体デバイス内に少なくとも１つの捕捉構造を準備する方法が提供される。インサイチュー生成捕捉構造は、細胞をマイクロ流体（又はナノ流体）デバイスに導入する前又は後に導入し得る。インサイチュー生成捕捉構造は、一時的であるように設計してもよく、又は実験／アッセイ／ソート／培養プロセスの終わりまで定位置に維持し得る。
インサイチュー生成捕捉構造は、マイクロ流体内に存在するポリマー溶液に、生体細胞又はビーズがインサイチュー生成捕捉構造を超えないようにすることが可能なインサイチュー生成捕捉構造を形成させることができる光活性化、温度変更、又は浸透圧変更により導入し得る。インサイチュー生成捕捉構造のメッシュサイズに応じて、異なるカテゴリの化学種にインサイチュー生成捕捉構造を透過させ得る。メッシュサイズが約２ｎｍであるように選択される場合、小分子成分のみを透過させ得るが、タンパク質等はインサイチュー生成捕捉構造により隔離し得る。インサイチュー生成捕捉構造は、タンパク質、核酸、細胞小器官、又はシグナリング分子等のより小さい物質がインサイチュー生成捕捉構造を超えることを阻止しないより大きいメッシュサイズを有する架橋ポリマーを含み得る。インサイチュー生成捕捉構造は、媒体を透過させながら、細胞又はビーズがインサイチュー生成捕捉構造を透過しないようにし得る。
光活性化重合化を導入するプロセスは、マイクロ流体デバイス内で実行することができる。拡散が重合化プロセスと競合し、したがって遊離基を迅速に生成する能力が有用であり得る。更に、遊離基は遊離酸素と迅速に結合することができる。光重合化は、媒体中に酸素がない場合、非常に効率的で高速であるが、生体細胞が存在する（したがって酸素の存在が必要とされる）場合、開始ラジカル数への調整を行い、補償し得る。実際には、特に、小さい制限された量のポリマーを導入して、ペン又はチャネルへの流入又は流出を全体的にはブロックしない小さい捕捉構造を形成する場合、連鎖停止がより高速に生じ、形成される無関係なポリマー量を制限するため、酸素の制限効果は有用である。
幾つかの実施形態では、流動性ポリマーの固化を開始するステップは、フロー領域の少なくとも１つの選択されたエリアを光学的に照明することを含み得、更に、流動性ポリマーを固化するステップは、流動性ポリマーのポリマーを重合化して、固化ポリマー網目構造を形成することを含み得る。流動性ポリマーを導入するステップは、光活性化可能な重合化開始剤を導入することを更に含み得る。
幾つかの他の実施形態では、流動性ポリマーの固化を開始するステップは、基板の少なくとも１つの選択されたエリアにおける温度を変更することを含み得る。ポリマーを固化するステップは、ポリマーをゲル化して、ポリマー網目構造を形成することを更に含み得る。基板の選択されたエリアにおいて温度を変更するステップは、基板上の熱パッドを光学的に照明することを更に含み得る。
インサイチュー生成捕捉構造は、例えば、一方がＲＧＤペプチドモチーフを有する２つのポリマーを共重合化することにより形成することができる。他の実施形態では、前駆体であるプレポリマー（図４Ｄのプレポリマー４０１’のような）は、そのようなモチーフを有するように修飾し得、インサイチュー重合化は、アッセイ検体を含むインサイチュー生成捕捉構造を提供する（例えば、図４Ｄのインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｃを形成する）。別の代替は、プレポリマー内に抗体を組み込む（図４Ｃの４０７Ｂのように）ことであり、ポリマー網目構造のインサイチューでの固化により、抗体アッセイ試薬を既に含むインサイチュー生成捕捉構造を提供する（図４Ｃの４０６Ｂのように）。更に別の代替は、インサイチュー生成捕捉構造が形成された後、抗体を導入することである（インサイチュー生成捕捉構造４０４を図４Ｃのインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｂに変換するのと同様に）。一例では、ビオチン化又はストレプトアビジン部位をインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造全体を通して又は表面のみに導入することができ、ストレプトアビジン又はビオチン標識抗体を各結合対に会合し得る。代替的に、インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造の表面への光開始挿入をインサイチュー生成捕捉構造の形成と同時に又はその後に受け得る、ベンゾフェノン等の光活性化可能官能基を含む修飾抗体を考案し得、これは、固化ポリマー網目構造を含むインサイチュー生成構造４０３の、捕捉構造の固化ポリマー網目構造が図４Ｃ（プロセスは図示せず）の官能化部位に結合したアッセイ試薬を含むインサイチュー生成捕捉構造４０６Ｂへの直接変換と同様のプロセスを提供する。同じタイプの変換戦略を実行して、アッセイ検体を含むインサイチュー生成捕捉構造を等しく導入することができる。
ポリマー捕捉構造をマイクロ流体デバイスに導入するプロセスの一例では、１０％ｗ／ｖＰＥＧＤＡ（６Ｋｄ）及び１％光開始剤（IRGACURE 2959、２００Ｄａ）を含む溶液をマイクロ流体デバイスに流入させ得る。１０分未満にわたり平衡させた後、所望の領域を、４００ｍＷ／ｃｍ２の電力を有する約３４０ｎｍ（＋／－２０ｎｍ）のＵＶ光を用いて１秒間照明して、図４～図７に示される等のインサイチュー生成捕捉構造を作製する重合化を開始し得る。
少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを準備する方法が提供され、この方法は、マイクロ流体デバイスを提供することであって、マイクロ流体デバイスは、基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャを含み、エンクロージャは、フロー領域を画定する、提供することと、第１の流動性官能化プレポリマーをフロー領域に導入することと、エンクロージャの少なくとも１つの選択されたエリアにおいて第１の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を形成することとを含む。第１の流動性官能化プレポリマーを導入するステップは、光活性化可能な重合化開始剤をフロー領域に導入することを更に含み得、光活性化可能な重合化開始剤を導入するステップは、第１の流動性プレポリマーを導入するステップの前に、それと同時に、又はその後に実行し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、フロー領域に流体的に接続された少なくとも１つの隔離ペンを更に含み、固化を活性化するステップは、少なくとも１つの隔離ペンの少なくとも１つの選択されたエリアにおいて第１の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化することを含む。少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造は、１つ又は複数の官能化部位を含む固化ポリマー網目構造を含み得る。１つ又は複数の官能化部位は、ビオチン部分、アビジン部分、又はストレプトアビジン部分を含み得る。１つ又は複数の官能化部位は、第１の流動性官能化プレポリマーの少なくとも１つの成分に共有結合的に結合され得る。固化しなかった流動性官能化プレポリマーは、マイクロ流体デバイスから流出し得る。実施形態では、流動性官能化プレポリマーが少なくとも１つの隔離ペンに導入された場合、固化しなかった流動性官能化プレポリマーは、ペン外に拡散し得、次にマイクロ流体デバイスから流出し得る。
方法は、マイクロ流体デバイスのフロー領域を通して第１の容量の第１の流体媒体を流し、それにより、固化しなかった第１の流動性官能化プレポリマーを少なくとも１つの隔離ペン外に拡散させることを更に含み得る。方法は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体をエンクロージャ内又は代替的に少なくとも１つの隔離ペン内の少なくとも第１の捕捉構造に導入することと、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位に会合させることとを更に含み得る。第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、抗体、抗原、有機分子、又はオリゴヌクレオチドを含み得る。第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体の有機分子は、酵素、抗原、細胞表面マーカ、サイトカイン、又は本明細書に記載される任意の適するアッセイ試薬若しくはアッセイ検体への基質を含み得る。第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位に会合させるように構成される部分を更に含み得る。様々な実施形態では、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体に会合するように構成される部分は、少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位へのビオチン結合パートナー、アビジン結合パートナー、又はストレプトアビジン結合パートナーを含み得る。様々な実施形態では、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１のアッセイ試薬であり得る。方法は、マイクロ流体デバイスを通して第２の容量の第１の流体媒体を流し、それにより、会合しなかった第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を少なくとも１つの隔離ペン外に拡散させることを更に含み得る。会合しなかった官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、ペン外に拡散すると、マイクロ流体デバイスから流出し得る。
方法は、第２以上の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を導入するステップを更に含み得る。第２以上の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の第２以上の官能化部位に会合し得る。第２以上の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体と異なり得、及び／又は第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体から検出可能に区別可能であり得る。第２以上の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体と併用される検出試薬から区別可能な検出試薬を用いて検出されるように構成し得る。第２以上の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、エンクロージャ内又は代替的に少なくとも１つの隔離ペン内の第２以上の捕捉構造上の第２以上の官能化部位に会合し得る。
方法は、エンクロージャ内又は代替的に少なくとも１つの隔離ペン内に第２以上の捕捉構造を導入するステップを更に含み得、第２以上の捕捉構造を導入することは、更なる容量の第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのフロー領域に導入するステップと、第２の流動性官能化プレポリマーをフロー領域に導入するステップと、エンクロージャの又は代替的に少なくとも１つの隔離ペン内の少なくとも第２の選択されたエリアにおいて第２の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、第２のインサイチュー生成捕捉構造を形成するステップと、更なる容量の第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのフロー領域に流すステップとを含み得る。第２の流動性官能化プレポリマーを導入するステップは、光活性化可能な重合化開始剤をフロー領域に導入することを更に含み得、光活性化可能な重合化開始剤を導入するステップは、第２の流動性プレポリマーの導入の前に、それと同時に、又はその後に実行し得る。第２の捕捉構造が形成された後、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体と同様に、第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を流入させ、第２の捕捉構造に会合し得る。第２の官能化アッセイ試薬及びアッセイ検体の会合が完了した後、余分な会合しなかった官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、隔離ペン外に拡散され得、任意選択的にマイクロ流体デバイスから流出し得る。
方法は、第３以上の捕捉構造を少なくとも１つの隔離ペンに導入するステップを更に含み得、第３以上の捕捉構造を導入することは、更なる容量の第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのフロー領域に導入することと、第３の流動性官能化プレポリマーをフロー領域に導入することと、エンクロージャの又は代替的に少なくとも１つの隔離ペン内の少なくとも第３の選択されたエリアにおいて第３の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、第３のインサイチュー生成捕捉構造を形成することと、更なる容量の第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのフロー領域に流すこととを含み得る。第３の流動性官能化プレポリマーを導入するステップは、光活性化可能な重合化開始剤をフロー領域に導入することを更に含み得、光活性化可能な重合化開始剤を導入するステップは、第３の流動性プレポリマーを導入するステップの前に、それと同時に、又はその後に実行し得る。第３の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１及び／又は第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体について上述したように、同様に第３の捕捉構造に導入し得る。第３の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１又は第２の官能化アッセイ試薬と異なり得、及び／又は第１又は第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体から検出可能に区別可能であり得る。
幾つかの実施形態では、第１の流動性官能化プレポリマーは、第２の流動性官能化プレポリマーと異なり得る。他の実施形態では、第１の流動性官能化プレポリマーは、第２の流動性官能化プレポリマーと同じであり得る。様々な実施形態では、第１、第２、及び第３の流動性官能化プレポリマーのそれぞれは、互いに異なり得る。他の実施形態では、第１、第２、及び第３の流動性官能化プレポリマーのそれぞれは、同じ官能化プレポリマーであり得る。方法の様々な実施形態では、第１、第２、又は第３のインサイチュー生成捕捉構造のいずれかの固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含む。固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。更に他の実施形態では、固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造のポリマーは修飾ＰＥＧポリマーであり得る。ポリマーは、星型、４アーム、又は２アームＰＥＧジアクリレートポリマーであり得る。
キット
更に別の態様では、基板、マイクロ流体回路材料、及び任意選択的にカバーを含むエンクロージャであって、フロー領域を画定する、エンクロージャと、制御可能に活性化されて、固化ポリマー網目構造を形成することができる官能化プレポリマーとを有するマイクロ流体デバイスを含むキットが提供される。キットはアッセイ試薬又はアッセイ検体を更に含むことができ、アッセイ試薬又はアッセイ検体は、官能化プレポリマーの一部であり得るか、官能化プレポリマーと混合され得るか、又は官能化プレポリマーとは別個に提供され得る（例えば、別個のバイアル、管等内で）。代替的に、基板、マイクロ流体回路材料、及び任意選択的にカバーを含むエンクロージャであって、フロー領域を画定する、エンクロージャと、エンクロージャ内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造であって、固化ポリマー網目構造を含む（例えば、マイクロ流体デバイス４００、７００）、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造とを有するマイクロ流体デバイスを含むキットが提供される。キットはアッセイ試薬を更に含むことができ、アッセイ試薬は、インサイチュー生成捕捉構造と一体であり得るか若しくはそれに会合し得、又は別個に（例えば、バイアル、管内等で）提供され得る。いずれのキットでのマイクロ流体デバイスも、エンクロージャ内に少なくとも１つの隔離ペンを含むことができる。インサイチュー生成捕捉構造がマイクロ流体デバイス内に既に配置されているキットでは、インサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域、マイクロ流体デバイスの隔離ペン（例えば、隔離ペン内の分離領域）、又は両方内に位置することができる。固化ポリマー網目構造は、１つ又は複数の官能化部位を更に含み得る。固化ポリマー網目構造の官能化部位は、本明細書に記載される任意の官能化部位であり得、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又はそれらの任意の組合せを含み得る。
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを含むキットの様々な実施形態では、固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含み得る。官能化プレポリマーが提供されるキットの実施形態では、官能化プレポリマーは、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含む。固化ポリマー網目構造又は官能化プレポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。更に他の実施形態では、固化ポリマー網目構造又は官能化プレポリマーは、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る。幾つかの実施形態では、固化ポリマー網目構造又は官能化プレポリマーのポリマーは修飾ＰＥＧポリマーであり得る。ポリマーは、星型、４アーム、又は２アームＰＥＧジアクリレートポリマーであり得る。様々な実施形態では、エンクロージャ又は少なくとも１つの隔離ペンが２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造を含む場合、各捕捉構造は、同じポリマーを含むか、又は代替的に第１のインサイチュー生成捕捉構造、第２のインサイチュー生成捕捉構造、第３のインサイチュー生成捕捉構造等のそれぞれで異なるポリマーを含み得る。官能化プレポリマーを提供するキットでは、２つ以上の官能化プレポリマーを提供し得る。キットは２つ以上のポリマーを含み得、ポリマーは、少なくとも第１の官能化ポリマーと一緒に組み合わせられて、固化して固化ポリマー網目構造を形成するように構成される流動性ポリマー溶液を形成することができる。少なくとも第１の官能化ポリマーは、流動性ポリマー溶液として提供してもよく、又はゲル、脱水、若しくは凍結乾燥された形態として提供されてもよく、これらのいずれも、流体媒体を用いて希釈することにより流動性ポリマー溶液としてエンドユーザにより調合されるように構成し得る。インサイチュー生成捕捉構造の形成に使用し得るキットにおいて提供される他のポリマーは、少なくとも第１の官能化ポリマーとは別個の１つ又は複数の容器において提供し得る。
キットのアッセイ試薬又はアッセイ検体は、本明細書に記載される任意のアッセイ試薬又はアッセイ検体であり得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、少なくとも１つの捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位に会合するように構成される官能部分を含み得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、マイクロ流体デバイスのフロー領域に導入可能な状態であるように構成される調合で提供し得る。代替的に、アッセイ試薬又はアッセイ検体は、マイクロ流体デバイスに導入し、続けてインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位に会合させるために適切な媒体に溶解するための指示と共に、固体又は凍結乾燥された形態で提供し得る。キットの幾つかの実施形態では、任意の適する組合せでの２つ以上のアッセイ試薬又は２つ以上のアッセイ検体を多重実験に提供し得、以下の段落に記載される任意のアッセイ試薬又は検体であり得る。
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを含むキットの様々な実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を既に含み得る（例えば、アッセイ試薬又はアッセイ検体が、供給されたマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの捕捉構造の固化ポリマー網目構造内／上に既に存在するマイクロ流体デバイス４５０）。アッセイ試薬又はアッセイ検体は、固化ポリマー網目構造の１つ又は複数の官能化部位に共有結合的又は非共有結合的に結合され得る。幾つかの実施形態では、アッセイ試薬又はアッセイ検体は、ビオチン／ストレプトアビジン又はビオチン／アビジン複合体を介して固化ポリマー網目構造の１つ又は複数の官能化部位に非共有結合的に結合され得る。
アッセイ試薬又はアッセイ検体が、インサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造の一部として提供され既に組み込まれているか、それともそのようなアッセイ試薬又はアッセイ検体を有するインサイチュー生成捕捉構造を準備するキットの構成要素として提供され既に組み込まれているか否かに関係なく、アッセイ試薬又はアッセイ検体は、本明細書に記載される任意の適する部分であり得る。インサイチュー生成捕捉構造内に組み込まれているか又は組み込まれるアッセイ試薬又はアッセイ検体は、タンパク質、核酸、有機分子、又はサッカリドであり得る。少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを含むキットの幾つかの実施形態では、アッセイ試薬又はアッセイ検体は抗体であり得、本明細書に記載される任意の種類の抗体であり得る。他の実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造内に組み込まれているか又は組み込まれるアッセイ試薬又はアッセイ検体は、抗原であり得る。抗原であるアッセイ試薬又はアッセイ検体は、本明細書に記載される任意の適する抗原であり得る。更に他の実施形態では、インサイチュー生成捕捉構造内に組み込まれているか又は組み込まれるアッセイ試薬、オリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドアッセイ試薬は、本明細書に記載される任意の適するオリゴヌクレオチドであり得る。
キットの幾つかの実施形態では、アッセイ試薬又はアッセイ検体は、検出可能な標識を含み得る。アッセイ試薬又はアッセイ検体の検出可能な標識は、蛍光標識、比色標識、又は発光標識であり得る。幾つかの実施形態では、アッセイ試薬又はアッセイ検体が検出可能な標識を含む場合、標識は、アッセイプロセスが実行されるまで検出可能ではなく、検出可能な標識は、アッセイ試薬又はアッセイ検体から生成又は解放される。
キットの他の実施形態では、キットは検出試薬を更に含み得る。検出試薬は検出可能な標識を含み得る。検出試薬の検出可能な標識は、蛍光標識、比色標識、又は発光標識を含み得る。幾つかの実施形態では、検出試薬の検出可能な標識は蛍光性であり得る。幾つかの実施形態では、検出試薬は少なくとも第１の抗体を含む。幾つかの実施形態では、検出試薬は第２の抗体を含み得、第２の抗体はアッセイプロセスの二次抗体であり、検出試薬を含む第１及び第２の抗体の組合せへの検出可能な標識を組み込む。他の実施形態では、検出試薬はインターカレーター染料を含み得る。更に他の実施形態では、検出試薬はＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドを含み得、これは、本明細書に記載される任意のＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドであり得る。
キットの様々な実施形態では、２つ以上の検出試薬を提供し得る。２つ以上の検出試薬の第１の検出試薬は、第２の検出試薬からスペクトルが別個であり得、異なる各アッセイ試薬又はアッセイ検体について以下同様である。
キットの他の実施形態では、マイクロ流体デバイスは、エンクロージャ内又は代替的にその内部の隔離ペン内に配置される２つ以上の捕捉構造を含み得、第１の捕捉構造の第１の固化ポリマー網目構造は、第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体を既に含み／それを組み込むように設計され、第２の捕捉構造の第２の固化ポリマー網目構造は、第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体を既に含む／又はそれを組み込むように設計され、エンクロージャ内又は代替的に少なくとも１つの隔離ペン内の追加の捕捉構造ごとに以下同様である。第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体は、第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体と異なり得、少なくとも１つの隔離ペン内の追加の各捕捉構造内に組み込まれているか又は組み込まれるように設計される追加のアッセイ試薬又はアッセイ検体ごとに以下同様である。第１の捕捉構造及び第２の捕捉構造は、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ又は、その内部の少なくとも１つの隔離ペン内の異なる位置に配置し得る。
第１の捕捉構造が第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体を組み込むか又は組み込むように設計され、第２の捕捉構造が第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体を組み込むか又は組み込むように設計される場合、キットは、第１の検出試薬及び第２の検出試薬のそれぞれを更に含み得、第１の検出試薬は第２の検出試薬と異なり得る。捕捉構造上に組み込まれているか又は組み込まれるように構成される任意の追加のアッセイ試薬又は検体の第１の検出試薬及び第２の検出試薬等は、本明細書に記載される任意の検出試薬を含み得、独立して選択され得る。幾つかの実施形態では、第１の検出試薬は少なくとも第１の一次抗体を含み得、第２の検出試薬は、各アッセイの各生物学的標的に向けられた少なくとも第２の一次抗体を含む。一次抗体を含む各検出試薬は二次抗体を更に含み得、二次抗体は、それ自体、実行中の各アッセイの検出可能な標識を含み得る。２つ以上の捕捉構造がエンクロージャ又は代替的にその内部の少なくとも１つの隔離ペンに提供される場合、各検出試薬の各標識は、スペクトル的に別個であるか、又は各検出試薬の標識は、空間的に別個である。幾つかの実施形態では、標識はスペクトル的及び空間的の両方で別個である。
少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを含むキットの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは複数の隔離ペンを更に含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、固化ポリマー網目構造を含む少なくとも１つの捕捉構造を含み得る。複数の隔離ペンは、本明細書に記載される任意の隔離ペンについて記載されたように、任意の組合せで構成し得る。キットのマイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００の任意の構成要素又は特徴を任意の組合せで更に含み得る。
キットの幾つかの実施形態では、１つ又は複数の流体媒体が含まれ得、１つ又は複数の流体媒体は、マイクロ流体デバイス内の動的被覆用の添加剤を含め、本明細書に記載される１つ又は複数の添加剤を更に含み、成長、生存性、又は可搬性の強化を提供し得る。キットの他の実施形態では、エンクロージャの表面の１つ又は複数は被覆を含み得る。被覆は、本明細書に記載される任意の被覆であり得る。幾つかの実施形態では、被覆は、調整表面を提供する共有結合被覆である。共有結合被覆は、マイクロ流体デバイスのエンクロージャの全ての内面に存在し得る。幾つかの実施形態では、調整表面を提供する共有結合被覆は親水性であり得る。
キットの様々な実施形態では、キットは光活性化可能な重合化開始剤を更に含み得る。光活性化可能な重合化開始剤は、流体媒体及び／又は官能化プレポリマーとは別個の容器で提供し得る。
例１．ヒドロゲルサイトカインアッセイ
Ｔ細胞。１ビーズ／１細胞の割合で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズ（Dynabeads（登録商標）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１４５３Ｄ）と混合した、AllCells Inc.からのＣＤ３＋細胞。混合物を培養実験自体と同じ媒体中で４８時間にわたり５％ＣＯ２培養器内において３７℃で培養した。培養後、Ｔ細胞／ビーズ混合物を使用に向けて再懸濁した。
培養媒体。ＲＰＭＩ－１６４０（GIBCO（登録商標）、ThermoFisher Scientific、カタログ番号１１８７５－１２７）１０％ＦＢＳ、２％ヒトＡＢ血清（５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ２；R&D Systems）。
プライミング手順：１００％二酸化炭素２５０μＬを１２μＬ／秒の流量で流入させた。この後、０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含有するＰＢＳ２５０μＬを１２μＬ／秒で流入させた。プライミングの最後のステップは、１２μＬ／秒でＰＢＳ２５０μＬを流入させることを含んだ。続いて、培養媒体を導入した。
灌流方式（チップ上での細胞培養中）：灌流方法は以下の２つの方法のいずれかであった。
１．０．０１μＬ／秒で２時間灌流し、２μＬ／秒で６４秒間灌流し、及び繰り返す。
２．０．０２μＬ／秒で１００秒間灌流し、フローを５００秒間停止し、２μＬ／秒で６４秒間灌流し、及び繰り返す。
システム及びマイクロ流体デバイス：システム及びマイクロ流体デバイス：Berkeley Lights, Inc.製。システムは、少なくとも、フローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化ＤＥＰ構成用の光源、マイクロ流体デバイス、マウントステージ、及びカメラを含んだ。隔離ペンは約７×１０５立方μｍの容積を有する。
ヒドロゲル準備。Ｎ－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）中のストレプトアビジン（Nanocs）を０．１Ｍ炭酸塩－重炭酸塩（ｐＨ９．０のＣＢＢ緩衝剤）で希釈し、最終濃度１０ｍｇ／２００μＬで５重量％を提供するように計算された比率でＡｃ－ＰＥＧ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させた。反応を４℃で少なくとも一晩にわたり継続した。
脱イオン限外濾過水（ＤＩＵＦ）中の０．６０６重量％溶液のIgracure光開始剤の溶液を作製した。
Ａｃ ＰＥＧ星型固体（Laysan Bioからの４アームＰＥＧアクリレート（１０ｋ ＭＷ）（＃４アーム－ＰＥＧ－アクリル－１０ｋ－１ｇ））の５重量％溶液を０．６０６％光開始剤溶液中に溶解させることにより、官能ヒドロゲルのプレポリマーを作製した。
ＮＨＳ－ＰＥＧ－ストレプトアビジン共役２８μＬと、Ａｃ ＰＥＧ星型アクリレート／光開始剤溶液１３２μＬとを化合させることにより、１６０μＬプレポリマーロットを作製した。
プライミングされたマイクロ流体デバイスにプレポリマー溶液を０．５μＬ／秒で装填し、光開始前に少なくとも１時間培養して、マイクロ流体デバイスのペン中にプレポリマーを拡散させる。培養が完了した後、光に１０秒間露出させて、ペンの下角部においてポリマー固化を開始した。
固化が開始された後、８μＬ／秒で２×２５０μＬのＰＢＳ、０．２μＬ／秒で２５０μＬのＰＢＳ、及びＰＢＳ中で一晩のリンス（０．００５μＬ／秒で２５０μＬ）を含むリンス液の組を使用して、余分な可溶性ポリマー及び開始剤を除去した。
ヒドロゲル官能化。ヒドロゲルが準備されたマイクロ流体デバイスに１μｇ／ｍＬの捕捉抗体（R&D Systemsからのビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα（＃ＢＡＦ２１０）を装填し、ここで、インサイチュー生成捕捉抗体溶液を５μＬ／秒において２５０μＬ以内で流入させ、その後、２５０μＬのインサイチュー生成捕捉抗体溶液を０．０７５μＬ／秒で流入させる第２のフロー期間が続いた。インサイチュー生成捕捉抗体の導入を完了した後、マイクロ流体デバイスをＰＢＳ（５μＬ／秒で２５０μＬ）で５回洗い流した。
Ｔ細胞の導入及びＴＮＦαの検出。Ｔ細胞を導入し、３７℃で一晩培養した。培養期間が終了した後、Abcamからのウサギ抗ヒトＴＮＦα（＃ａｂ９６３５）溶液を５μＬ／秒において２５０μＬ以内で流し、その後、０．０７５μＬ／秒での２５０μＬの第１の検出抗体溶液の第２の流入期間が続くことにより、第１の検出抗体を導入した。第１の検出抗体の導入を完了した後、マイクロ流体デバイスをＰＢＳ（５μＬ／秒で２５０μＬ）で５回洗い流した。
次に、２５０μＬの溶液を５μＬ／秒で流し、続けて０．０７５μＬ／秒での２μｇ／ｍＬ溶液の第２の２５０μＬフローが続くことにより、二次検出抗体（Life Technologiesからのアレクサ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（＃Ａ１１０５３））を２μｇ／ｍＬの濃度で導入した。
図６Ａ～図６Ｃは、高分泌Ｔ細胞、中分泌Ｔ細胞、及び低分泌Ｔ細胞を区別する能力を示した。図６Ａでは、蛍光は、低分泌Ｔ細胞を含むこのペンでのみ検出可能である。左側の画像は明視野であり、４個の細胞を見ることができ、一方、右側の画像は、同じペンの蛍光画像を示し、官能化ヒドロゲルはペンの左下角においてかすかに見える。
図６Ｂは、中分泌組のＴ細胞を示す。左側の画像は、異なるペン中の１～３個のＴ細胞の画像であり、それと同じペンの右側の蛍光画像は、ペンの左下角における官能化ヒドロゲルの表面に集中された著しい蛍光を明らかに示している。
図６Ｃは、第３のペン中の高分泌組のＴ細胞を示す。図６Ｃの左側の画像は明視野であり、塊になった約４～５個のＴ細胞のグループ及び１つの単独の細胞を示す。右側の画像は、蛍光検出下の同じ第３のペンを示し、官能化ヒドロゲル及びペン内の細胞の塊は両方とも良好に照明される。
この例は、マイクロ流体ペン内で異なるレベルのＴＮＦαサイトカイン産出が検出され且つランク付けられ得ることを明らかに示した。
マイクロ流体デバイス及びそのようなデバイスを操作し観測するシステム
図１Ａは、卵子、及び／又は卵母細胞、及び／又は精子の選択及び評価を含め、インビトロでの胚の生成に使用することができるマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示す。カバー１１０を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス１００内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス１００の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６を通って流体培地１８０が流れることができ、任意選択的に１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送する。１つのマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２又は３個）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス１００はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み得、ここで、各隔離ペンは、流路１０６に流体接続する１つ又は複数の開口部を有し得る。図１Ａのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路１０６と流通する１つのみの開口部を有し得る。更に以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）を更に含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、フロー領域（１つ又は複数のフローチャネルを含み得る）、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料 － したがって、マイクロ流体回路材料１１６ － は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極を更に含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム－錫－酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス１９４（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、デバイス１９４自体は図１Ａに示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、デバイス１９０は図１Ａに示されていない）を含む。
電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（以下で述べられる傾斜モジュール１６６の一部）を更に含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
システム１５０は培地源１７８を更に含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２を更に含むことができる。
マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度を更に計算することができる。
傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離ペンの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２へのペンの開口部は、フロー１０６がペン内に向けられないように、フロー１０６に対して傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内に物理的に囲い入れるように構成される。本開示による隔離ペンは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、及び／又は重力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。５つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、ある卵子の隣接卵子からの分離等の胚を生成するに当たり有用な１つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。テスト、シミュレーション、及び受精は、全て個々単位で実行し得、幾つかの実施形態では、個々のタイムスケールで実行し得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペンを含み、その場合、隔離ペンの２つ以上は、胚の生成において異なる利点を提供する異なる構造及び／又は特徴を含む。非限定的な一例として、あるタイプのペン内に卵子を維持しながら、異なるタイプのペン内に精子を維持することを挙げることができる、別の実施形態では、隔離ペンの少なくとも１つは、卵子に電気活性化を提供するのに適した電気接点を有するように構成される。更に別の実施形態では、異なるタイプの細胞（例えば、子宮細胞、子宮内膜細胞、卵管（uterine tube）（例えば、卵管（oviduct）若しくはファローピウス管）等）由来のＰＥＧ（介在）細胞、卵丘細胞、又はそれらの組合わせ）は、卵子を含む隔離ペンに隣接する隔離ペンに配置し得、それにより、周囲の隔離ペンからの分泌物は各ペンから出て、卵子を含むペン中に拡散し得、これは、マクロスケールでのインビトロ培養及び受精では不可能である。胚の生成に有用なマイクロ流体デバイスは、隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０又はそれらの変形形態のいずれかを含み得、及び／又は後述するように、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆに示されるように構成されるペンを含み得る。
図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７を更に含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、隔離ペンが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２を更に含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、マイクロ流体チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離ペンにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離ペンの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本開示の形態により前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。
幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。更に他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
図１Ｂ、図１Ｃ及び図２Ａ～図２Ｈは、本開示の形態に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスの更に別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
卵母細胞、卵子、又は胚を配置し、培養し、及び／又は監視することができる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号１４／０６０，１１７、２０１３年１０月２２日出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号１４／５２０，５６８、２０１４年１０月２２日出願）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号１４／５２１，４４７、２０１４年１０月２２日出願）に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスを更に記載している。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
原動マイクロ流体デバイス構成
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図２１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、開放領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。更に、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることを更に理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ－Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ－Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ－Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％～４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ－Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ～約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）に記載されており（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、この内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。更に、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、以下に記載するように、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ～約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム～約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３－ジフルオロメチレニル－ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ～約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５～３．０ｎｍ）を有する。
幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。更に、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ－Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ－Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ－Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％～４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ－Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ～約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ－Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
隔離ペン。一般的な隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ～図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
図２Ａ～図２Ｃの隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、マイクロ流体チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離ペンの開口部は、マイクロ流体チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がマイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離ペンのフロアを形成する、隔離ペンのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離ペンの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００にも当てはまる。
したがって、マイクロ流体チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ～図２Ｂに示される例では、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。
図２Ｃは、本開示による隔離ペン２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
既知のように、隔離ペン２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離ペン２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離ペン２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離ペン２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤｐは、マイクロ流体チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにマイクロ流体チャネル１２２及びマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル１２２及び開口部２３４の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離ペン２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
更に、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をマイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある隔離ペン２２４の、マイクロ流体チャネル１２２又は別の隔離ペン（例えば、図２Ｄの隔離ペン２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、マイクロ流体チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域とフロー領域との間での流体媒体交換の程度は、流体交換の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％よりも高い割合である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。更に、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。
マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのマイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の寸法は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：マイクロ流体チャネル幅Ｗｃｈ（又はマイクロ流体チャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２３６の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。更に、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。更に、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。
図２Ｄ～図２Ｆは、図１Ａの各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形形態であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離ペン２６６も有する。特に、図２Ｄ～図２Ｆに示されるデバイス２５０の隔離ペン２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００での上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
図２Ｄ～図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ～図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｆ～図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離ペン２６６が流体接続される。
各隔離ペン２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。マイクロ流体チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はマイクロ流体チャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、マイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。
図２Ｅに示されるように、各隔離ペン２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をマイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からマイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は、第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は、第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
図２Ｅに示されるように、マイクロ流体チャネル２６４内のマイクロ流体チャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち、図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の任意の範囲内の角度を含む：約３０°～約９０°、約４５°～約９０°、約６０°～約９０°等。
隔離ペンの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：約５０～１０００μｍ、約５０～５００μｍ、約５０～４００μｍ、約５０～３００μｍ、約５０～２５０μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１５０μｍ、約５０～１００μｍ、約７０～５００μｍ、約７０～４００μｍ、約７０～３００μｍ、約７０～２５０μｍ、約７０～２００μｍ、約７０～１５０μｍ、約９０～４００μｍ、９０～３００μｍ、約９０～２５０μｍ、約９０～２００μｍ、約９０～１５０μｍ、約１００～３００μｍ、約１００～２５０μｍ、約１００～２００μｍ、約１００～１５０μｍ、及び約１００～１２０μｍ。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００～８００μｍ、約２００～７００μｍ、又は約２００～６００μｍの範囲であり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。更に、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約３０～約２００μｍ又は約５０～約１５０μｍの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約１×１０４～約３×１０６平方μｍ、約２×１０４～約２×１０６平方μｍ、約４×１０４～約１×１０６平方μｍ、約２×１０４～約５×１０５平方μｍ、約２×１０４～約１×１０５平方μｍ、又は約２×１０５～約２×１０６平方μｍの断面積を有する。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：２０～１００μｍ、２０～９０μｍ、２０～８０μｍ、２０～７０μｍ、２０～６０μｍ、２０～５０μｍ、３０～１００μｍ、３０～９０μｍ、３０～８０μｍ、３０～７０μｍ、３０～６０μｍ、３０～５０μｍ、４０～１００μｍ、４０～９０μｍ、４０～８０μｍ、４０～７０μｍ、４０～６０μｍ、又は４０～５０μｍ。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。マイクロ流体チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る：５００～５０，０００平方μｍ、５００～４０，０００平方μｍ、５００～３０，０００平方μｍ、５００～２５，０００平方μｍ、５００～２０，０００平方μｍ、５００～１５，０００平方μｍ、５００～１０，０００平方μｍ、５００～７，５００平方μｍ、５００～５，０００平方μｍ、１，０００～２５，０００平方μｍ、１，０００～２０，０００平方μｍ、１，０００～１５，０００平方μｍ、１，０００～１０，０００平方μｍ、１，０００～７，５００平方μｍ、１，０００～５，０００平方μｍ、２，０００～２０，０００平方μｍ、２，０００～１５，０００平方μｍ、２，０００～１０，０００平方μｍ、２，０００～７，５００平方μｍ、２，０００～６，０００平方μｍ、３，０００～２０，０００平方μｍ、３，０００～１５，０００平方μｍ、３，０００～１０，０００平方μｍ、３，０００～７，５００平方μｍ、又は３，０００～６，０００平方μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。
隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：約１～６００μｍ、５～５５０μｍ、１０～５００μｍ、１５～４００μｍ、２０～３００μｍ、２０～５００μｍ、４０～４００μｍ、６０～３００μｍ、８０～２００μｍ、又は約１００～１５０μｍ。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記例と異なる範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）での接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：２０～５００μｍ、２０～４００μｍ、２０～３００μｍ、２０～２００μｍ、２０～１５０μｍ、２０～１００μｍ、２０～８０μｍ、２０～６０μｍ、３０～４００μｍ、３０～３００μｍ、３０～２００μｍ、３０～１５０μｍ、３０～１００μｍ、３０～８０μｍ、３０～６０μｍ、４０～３００μｍ、４０～２００μｍ、４０～１５０μｍ、４０～１００μｍ、４０～８０μｍ、４０～６０μｍ、５０～２５０μｍ、５０～２００μｍ、５０～１５０μｍ、５０～１００μｍ、５０～８０μｍ、６０～２００μｍ、６０～１５０μｍ、６０～１００μｍ、６０～８０μｍ、７０～１５０μｍ、７０～１００μｍ、及び８０～１００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）の接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）。
隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、卵子、又は胚であり得る生体細胞）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、卵母細胞、卵子、又は胚が配置される隔離ペンの基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲であり得る：約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約２２５μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、又は約１００～４００μｍ、約１２０～３５０μｍ、約１４０～２００～２００ ３００μｍ、又は約１４０～２００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なってもよい（例えば、上記列挙される任意の端点により定義される範囲）。
隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域の基端開口部の幅Ｗｐｒは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、細胞等の生物学的微小物体）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、幅Ｗｐｒは、約５０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、又は約５０～３００μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１００μｍ、約７５～１５０μｍ、約７５～１００μｍ、又は約２００～３００μｍの範囲であり得る。
隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はこれを超える比率。上記は単なる例であり、接続領域２３６の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記例と異なってもよい。
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００において、Ｖｍａｘは、約０．２マイクロリッター／秒、約０．３マイクロリッター／秒、約０．４マイクロリッター／秒、約０．５マイクロリッター／秒、約０．６マイクロリッター／秒、約０．７マイクロリッター／秒、約０．８マイクロリッター／秒、約０．９マイクロリッター／秒、約１．０マイクロリッター／秒、約１．１マイクロリッター／秒、約１．２マイクロリッター／秒、約１．３マイクロリッター／秒、約１．４マイクロリッター／秒、又は約１．５マイクロリッター／秒に設定することができる。
隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも５×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０８立方μｍ、少なくとも５×１０８立方μｍ、少なくとも８×１０８立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの容積は、約５×１０５立方μｍ、約６×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約３×１０７立方μｍ、約５×１０７立方μｍ、又は約８×１０７立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約１ナノリットル～約５０ナノリットル、２ナノリットル～約２５ナノリットル、２ナノリットル～約２０ナノリットル、約２ナノリットル～約１５ナノリットル、又は約２ナノリットル～約１０ナノリットルであり得る。
様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態でのように構成された隔離ペンを有し、その場合、マイクロ流体デバイスは、約５～約１０個の隔離ペン、約１０～約５０個の隔離ペン、約１００～約５００個の隔離ペン、約２００～約１０００個の隔離ペン、約５００～約１５００個の隔離ペン、約１０００～約２０００個の隔離ペン、又は約１０００～約３５００個の隔離ペンを有する。隔離ペンは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴を含み得る。
図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。マイクロ流体デバイス２８０は図２Ｇに示され、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離ペン１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離ペンを更に含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
図３Ａ～図３Ｂは、本開示によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。
通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ－ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ～－６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
図３Ａに示されるように、支持構造体３００（例えば、ネスト）は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造体３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／－０．１％、温度係数＋／－０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／－０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
上述したように、システム１５０は撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は光変調サブシステム３３０（図３Ｂ参照）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。適する光変調サブシステム４２２の一例は、Andor Technologies（商標）のMosaic（商標）システムである。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は顕微鏡３５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ又は複数の検出器３４８を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は構造化光の生成（例えば、光変調サブシステム３３０を介した）に使用することができ、第２の光源３３４は非構造化光の提供に使用することができる。第１の光源３３２は、光学的に作動される動電学的及び／又は蛍光励起のために構造化光を生成することができ、第２の光源３３４は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール１６４を使用して第１の光源３３２を制御することができ、撮像モジュール１６４を使用して第２の光源３３４を制御することができる。顕微鏡３５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００により保持されているとき、構造化光を光変調サブシステム３３０から受け取り、構造化光を光学作動式動電学的デバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域で結像し、（２）マイクロ流体デバイスから反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、そのような反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を検出器３４８上に結像するように構成され得る。光学縦列は、デバイスがネスト３００により保持されているとき、非構造化光を第２の光源から受け取り、非構造化光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域で結像するように更に構成され得る。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は重複領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。
図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
被覆溶液及び被覆剤
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の被覆剤を含む流体媒体中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、後述するような調整面を提供する）被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、フロー領域（例えば、チャネル）の表面、チャンバの表面、隔離ペンの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、被覆材料で被覆される。
被覆剤／溶液
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。
ポリマーベースの被覆材料
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ～約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ－ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２～１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷを有し得る。
他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。更に他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。
他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するのに適し得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。
他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７－デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
更に他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）並びに／或いはアルブミン及び／又は１つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組合わせ）であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約２０％（ｖ／ｖ）～約５０％ｖ／ｖの範囲で存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを挙げることができる。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。
幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
共有結合される被覆材料
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
共有結合分子は結合基を含み、結合基は、後述するように、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキル部分を含むが、これに限定されない）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。代替的には、共有結合部分は、上述した任意の部分であり得るポリマー部分を含み得る。
幾つかの実施形態では、共有結合部分は、線状鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖）を形成する炭素原子を含むことができ、且つ直鎖アルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得、ここで、アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。
他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上の種類のアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアルキレンオキシド部分を含み得、上述した任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な１クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、又は約２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離ペン及び／又はフロー領域（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。
調整面を提供する被覆材料は、一種のみの共有結合部分を含んでもよく、又は２つ以上の異なる種類の共有結合部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキル調整面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同じ、例えば、表面への同じ結合基及び共有結合、同じ全体長、及びフルオロアルキル部分を含む同数のフルオロメチレン単位を有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的には、被覆材料は、表面に付着する２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、被覆材料は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、被覆面においてより嵩張った部分を提示する能力をお提供し得る、より多数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に共有結合した荷電部分を有する更なる組の分子を更に含み得る。この場合、異なる、立体的に要求が余り厳しくない末端及びより少数の骨格原子を有する第１の組の分子は、基板表面全体を官能化し、それにより基板自体を構成するケイ素／酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない付着又は接触を回避するのに役立つことができる。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交流電荷を提示する両性イオン表面を提供し得る。
調整面特性
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がＤＥＰ力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式（例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング）等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１ｎｍ～約７ｎｍ、約１ｎｍ～約５ｎｍ、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約１０ｎｍ～約５０ｎｍの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、１０ｎｍ未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成基板表面）に共有結合した場合、単層を形成し得、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５ｎｍ～３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。これらの値は、約３０ｎｍの範囲の厚さを有するＣＹＴＯＰ（登録商標）（Asahi Glass Co., Ltd.、日本）フルオロポリマースピンコーティングの厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整面を提供する被覆材料は、所望の電気特性を提供し得る。理論による限定を意図せずに、特定の被覆材料が被覆された表面の堅牢性に影響する一因子は、本質的に電荷捕獲である。異なる被覆材料は電子を捕獲し得、これは被覆材料の破壊に繋がる恐れがある。被覆材料の欠陥は、電荷捕獲を増大させ、被覆材料の更なる破壊に繋がる恐れがある。同様に、異なる被覆材料は異なる絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊が生じる最小印加電場）を有し、これは電荷捕獲に影響を有し得る。特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造（例えば、高密度単層構造）を有することができる。
調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
単一又は複数パートの調整面
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、２部シーケンスで形成し得る。
共有結合された被覆材料を準備する方法
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離ペン及び／又はフロー領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合した被覆材料は、式１又は式２の構造を有する。被覆材料は、表面に１ステップで導入される場合、式１の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式２の構造を有する。
Figure 2022112033000003
被覆材料は、ＤＥＰ構成又はＥＷ構成基板の表面の酸化物に供給結合し得る。ＤＥＰ又はＥＷ構成基板は、ケイ素、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の元の化学構造の一部として存在してもよく、又は後述するように導入し得る。
被覆材料は、結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に結合し得、ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ又はホスホネートエステル基であり得る。マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧがその部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーＬは存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１～２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基からなる群から選択される１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０～２０個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は約５原子～約２００原子、約１０原子～約８０原子、約１０原子～約５０原子、又は約１０原子～約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得、上で示された式２の構造を有する。この部分は、上述した任意の部分であり得る。
幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒｘとペアとなる反応部分Ｒｐｘ（すなわち、反応部分Ｒｘと反応するように構成される部分）との反応の結果生成される基を表す。例えば、典型的な１つの結合基ＣＧはカルボキサミジル（carboxamidyl）基を含み得、これは、アミノ基と、活性化エステル、酸クロリド等のカルボン酸の誘導体との反応の結果である。他のＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）基、カルボキサミジル（carboxamidyl）、チオアミジル、オキシム、メルカプチル（mercaptyl）、二硫化物、エーテル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の端部（すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部）に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。結合基ＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、更に置換し得る（例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン（triazolylene）基）。
幾つかの実施形態では、被覆材料（又は表面修飾リガンド）は、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。蒸着プロセスは任意選択的に、例えば、溶媒浴への露出、超音波処理、又はそれらの組合せにより、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電層）を予めクリーニングすることにより改善することができる。代替又は追加として、そのような事前クリーニングは、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板を酸素プラズマクリーナにおいて処理することを含むことができ、酸素プラズマクリーナは、様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面（例えば、表面における酸化物、本明細書に記載されるように共有結合的に修飾し得る）を導入することができる。代替的には、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約３：１～約７：１であり得るピラニア溶液）等の液相処理を酸素プラズマクリーナの代わりに使用することもできる。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００が組み立てられて、マイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後、蒸着を使用して、マイクロ流体デバイス２００の内面を被覆し得る。理論による限定を意図せずに、そのような被覆材料を完全に組み立てられたマイクロ流体回路１２０に堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６の誘電層及び／又はカバー１１０との結合の弱化により生じる剥離を回避するに当たり有利であり得る。２ステッププロセスが利用される実施形態では、表面修飾リガンドは、上述したように蒸着を介して導入し得、続けて、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が導入される。続く反応は、表面修飾マイクロ流体デバイスを溶液中の適する結合試薬に露出させることにより実行し得る。
図２Ｈは、調整面を提供する例示的な共有結合被覆材料を有するマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。示されるように、被覆材料２９８（概略的に示される）は、ＤＥＰ基板であり得る基板２８６の内面２９４と、マイクロ流体デバイス２９０のカバー２８８の内面２９２と、の両方に共有結合した高密度分子の単層を含むことができる。被覆材料２９８は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造の画定に使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含む、マイクロ流体デバイス２９０のエンクロージャ２８４に近くエンクロージャ２８４に向かって内側に面する略全ての内面２９４、２９２に配置することができる。代替の実施形態では、被覆材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つのみ又は幾つかに配置することができる。
図２Ｈに示される実施形態では、被覆材料２９８は、オルガノシロキサン分子の単層を含むことができ、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合する。上記の被覆材料２９８のいずれかを使用することができ（例えば、アルキル末端、フルオロアルキル末端部分、ＰＥＧ末端部分、デキストラン末端部分、又はオルガノシロキサン部分に正電荷又は負電荷を含む末端部分）、末端部分は、エンクロージャに面する末端に配置される（すなわち、内面２９２、２９４に結合されず、エンクロージャ２８４に近い被覆材料２９８の単層の部分）。
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４の被覆に使用される被覆材料２９８はアニオン部分、カチオン部分、両性イオン部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び／又は両性イオン部分をマイクロ流体回路１２０のエンクロージャ２８４の内面に提示することにより、被覆材料２９８は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料２９８が被覆剤と併用される実施形態では、被覆材料２９８のアニオン、カチオン、又は両性イオンは、エンクロージャ２８４内の媒体１８０（例えば、被覆溶液）中に存在する非共有結合被覆剤（例えば、溶液中のタンパク質）の荷電部分とイオン結合を形成することができる。
更に他の実施形態では、被覆材料は、エンクロージャに面した末端において親水性被覆剤を含み得るか、又は提示するように化学的に修飾し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、デキストラン等のポリサッカリドを含み得る。上述した荷電部分（例えば、アニオン部分、カチオン部分、及び両性イオン部分）のように、親水性被覆剤は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。
適切な被覆処理及び修飾の更なる詳細については、２０１６年４月２２日に出願された米国特許出願公開第１５／１３５，７０７号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。
マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
マイクロ流体デバイス、方法、及びキットの幾つかの実施形態の記載
１．基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャであって、フロー領域を画定するエンクロージャと、エンクロージャ内及び任意選択的にフロー領域内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造であって、固化ポリマー網目構造を含む、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造とを含むマイクロ流体デバイス。
２．固化ポリマー網目構造は、１つ又は複数の官能化部位を含み得る、実施形態１に記載のマイクロ流体デバイス。
３．固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る、実施形態１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
４．マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、少なくとも１つの隔離ペンを含み得、任意選択的に、フロー領域への隔離ペンの基端開口部は、フロー領域中の流体媒体のフローの平均方向に実質的に平行する向きを有し得る、実施形態１～３のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
５．少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する、実施形態４に記載のマイクロ流体デバイス。
６．１つ又は複数のインサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペン内及び任意選択的に隔離ペンの分離領域内に配置し得る、実施形態４又は５に記載のマイクロ流体デバイス。
７．アッセイ試薬は、固化ポリマー網目構造に共有結合的に付着され得る、実施形態３～６のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
８．アッセイ試薬は、固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着され得る、実施形態３～６のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
９．アッセイ試薬は、ビオチン／ストレプトアビジン複合体を介して固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着され得る、実施形態８に記載のマイクロ流体デバイス。
１０．アッセイ試薬は、タンパク質、核酸、有機分子、及び／又はサッカリドであり得る、実施形態３～９のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１１．アッセイ試薬は、抗体を含み得る、実施形態１０に記載のマイクロ流体デバイス。
１２．アッセイ試薬は、抗原を含み得る、実施形態１０に記載のマイクロ流体デバイス。
１３．アッセイ試薬は、捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る、実施形態１０に記載のマイクロ流体デバイス。
１４．アッセイ検体は、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造の固化ポリマー網目構造に非共有結合的に結合され得る、実施形態３～６のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
１５．アッセイ検体は、タンパク質を含み得る、実施形態３～６のいずれか１つ又は１４に記載のマイクロ流体デバイス。
１６．アッセイ検体は、オリゴヌクレオチドを含み得る、実施形態３～６のいずれか１つ又は１４に記載のマイクロ流体デバイス。
１７．アッセイ検体は、抗体又はサイトカインを含み得る、実施形態３～６のいずれか１つ又は１４に記載のマイクロ流体デバイス。
１８．アッセイ検体は、有機分子を含み得る、実施形態３～６のいずれか１つ又は１４に記載のマイクロ流体デバイス。
１９．２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域及び／又は少なくとも１つの隔離ペンに配置され得る、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２０．２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造の第１の捕捉構造は、第１のアッセイ試薬又は第１のアッセイ検体に結合し得、及び２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造の第２の捕捉構造は、第２のアッセイ試薬又は第２のアッセイ検体に結合し得、第１のアッセイ試薬又は第１のアッセイ検体は、第２のアッセイ試薬又は第２のアッセイ検体と異なる、実施形態１９に記載のマイクロ流体デバイス。
２１．２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造のそれぞれは、少なくとも１つの隔離ペン内の異なる位置に配置され得る、実施形態１９又は２０に記載のマイクロ流体デバイス。
２２．マイクロ流体デバイスのカバーは、１つ又は複数の捕捉構造からの蛍光信号、比色信号、又は発光信号を実質的に透過し得る、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２３．固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含み得る、実施形態１～２２のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２４．固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、生体ポリマー、又はそれらの任意の組合せを含み得る、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２５．修飾合成ポリマーは、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含み得る、実施形態２４に記載のマイクロ流体デバイス。
２６．固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又はそれらの任意のコポリマーの組合せの少なくとも１つを含み得る、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２７．固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールポリマーを含む、実施形態１～２６のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２８．複数の隔離ペンを含み得る、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
２９．少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造は、微小物体が隔離ペンから出られるようにするように構成され得る、実施形態４～２８のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
３０．基板は、エンクロージャ内で誘導泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成され得る、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
３１．ＤＥＰ力は、光学的に作動され得る、実施形態３０に記載のマイクロ流体デバイス。
３２．マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面は、調整表面を更に含み得る、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のマイクロ流体デバイス。
３３．少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスにおいて微小物体をアッセイする方法であって、マイクロ流体デバイス内において、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置することであって、インサイチュー生成捕捉構造は、固化ポリマー網目構造を含み、固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含む、配置することと、アッセイ試薬又はアッセイ検体を微小物体又は微小物体の生物学的産物に接触させることと、アッセイ試薬又はアッセイ検体と微小物体又は生物学的産物との相互作用を検出することとを含む方法。
３４．マイクロ流体デバイスは、基板、フロー領域、及び任意選択的に少なくとも１つの隔離ペンを含むエンクロージャを含み得、第１のインサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域又は少なくとも１つの隔離ペン内に配置される、実施形態３３に記載の方法。
３５．少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み得、接続領域は、フロー領域への基端開口部及び分離領域への先端開口部を有する、実施形態３３又は３４に記載の方法。
３６．少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペンの分離領域内に配置され得る、実施形態３５に記載の方法。
３７．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着され得る、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、有機分子、又はサッカリドを含み得る、実施形態３３～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．アッセイ試薬は、抗体を含み得る、実施形態３３～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．生物学的産物は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、有機分子、又はサッカリドを含み得る、実施形態３３～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．タンパク質生物学的産物は、抗体及び抗原を含み得る、実施形態４０に記載の方法。
４２．微小物体は、生物学的微小物体を含み得る、実施形態３３～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．微小物体は、ハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、又はＴ細胞を含み得る、実施形態３３～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．第１のインサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペンの第１の壁に隣接する第１の位置に配置され得る、実施形態３３～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．アッセイ試薬又はアッセイ検体を生物学的産物又は微小物体に接触させるステップは、非共有結合複合体を形成することを更に含み得る、実施形態３３～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．相互作用を検出するステップは、検出可能な標識を有する検出試薬を、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に導入することを更に含み得る、実施形態３３～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．検出可能な標識は、アッセイ試薬又はアッセイ検体が生物学的産物又は微小物体と相互作用するとき、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造へ集中されるように構成され得る、実施形態４６に記載の方法。
４８．検出試薬の検出可能な標識は、蛍光性、比色性、又は発光性である、実施形態４６又は４７に記載の方法。
４９．検出試薬は、少なくとも第１の抗体を含み得る、実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．抗体検出試薬は、二次抗体を更に含み得る、実施形態４９に記載の方法。
５１．検出試薬は、インターカレーター染料を含み得る、実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の方法。
５２．検出試薬は、オリゴヌクレオチドを含み得る、実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の方法。
５３．アッセイ試薬又はアッセイ検体と微小物体又は生物学的産物との相互作用を検出するステップは、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造に結合される検出可能な標識の量を定量化することを更に含み得る、実施形態４６～５３に記載の方法。
５４．検出するステップは、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造からの蛍光信号を検出することを含み得る、実施形態３３～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの隔離ペンのフロー領域内に配置される第２のインサイチュー生成捕捉構造を更に含み得、インサイチュー生成される第２の捕捉構造は、第２の固化ポリマー網目構造を含み得、更に、インサイチュー生成される第２の固化ポリマー網目構造は、第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る、実施形態３４～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．第１及び第２のインサイチュー生成捕捉構造のそれぞれは、異なるアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る、実施形態５５に記載の方法。
５７．第１及び第２のインサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域又は隔離ペン内の区別可能な位置に配置され得る、実施形態５５又は５６に記載の方法。
５８．検出するステップは、微小物体の第１の生物学的産物及び微小物体の第２の生物学的産物を検出することを含み得、第１の生物学的産物は、第２の生物学的産物と異なる、実施形態５５～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．相互作用を検出するステップは、第１のインサイチュー生成捕捉構造及び第２のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に第１の検出試薬及び第２の検出試薬を導入することを更に含み得、第１の検出試薬及び第２の検出試薬は、それぞれ検出可能な標識を含み得る、実施形態５５～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．検出するステップは、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のそれぞれを、それぞれの第１のアッセイ試薬又はアッセイ検体及び第２のアッセイ試薬又はアッセイ検体に非共有結合的に付着されるようにすることを含み得る、実施形態５９に記載の方法。
６１．相互作用を検出するステップは、第１の検出可能な標識から第１の蛍光信号を、且つ第２の検出可能な標識から第２の蛍光信号を検出することを更に含み得る、実施形態５９又は６０に記載の方法。
６２．第１の蛍光信号及び第２の蛍光信号は、スペクトルが別個である、実施形態６１に記載の方法。
６３．第１の蛍光信号及び第２の蛍光信号は、位置によって区別可能であり得る、実施形態６１又は６２に記載の方法。
６４．第１の蛍光信号及び／又は第２の蛍光信号を定量化するステップを更に含む、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．少なくとも１つの隔離ペンのフロー領域内に配置される第３以上のインサイチュー生成捕捉構造を更に含み、第３以上のインサイチュー生成捕捉構造のそれぞれは、固化ポリマー網目構造を含み得、更に、第３以上の固化ポリマー網目構造のそれぞれの固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る、実施形態５５～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．検出するステップは、フロー領域又は少なくとも１つの隔離ペン内で位置が別個であるか、互いに検出可能にスペクトルが別個であるか、又はそれらの組合せである第１、第２、第３以上の検出可能な信号を検出することを更に含み得る、実施形態６５に記載の方法。
６７．マイクロ流体デバイス内において、少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置するステップは、誘電泳動力を使用して微小物体を移動させることを含み得る、実施形態３３～６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．誘電泳動力は、光学的に作動され得る、実施形態６７に記載の方法。
６９．マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面は、調整表面を更に含み得る、実施形態３３～６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．基板、マイクロ流体回路材料、及び任意選択的にカバーを含むエンクロージャを有するマイクロ流体デバイスであって、エンクロージャはフロー領域を画定する、マイクロ流体デバイスと、制御可能に活性化されて、固化ポリマー網目構造を形成することができる官能化プレポリマーとを含むキット。
７１．基板、マイクロ流体回路材料、及び任意選択的にカバーを含むエンクロージャであって、フロー領域を画定する、エンクロージャと、エンクロージャ内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造であって、固化ポリマー網目構造を含む、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造とを有するマイクロ流体デバイス含むキット。
７２．マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、フロー領域に流体的に接続される少なくとも１つの隔離ペンを更に含む、実施形態７０又は７１のキット。
７３．固化ポリマー網目構造は、１つ又は複数の官能化部位を含み得る、実施形態７０～７２のいずれか１つのキット。
７４．アッセイ試薬又はアッセイ検体を更に含む、実施形態７０～７３のいずれか１つのキット。
７５．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を更に含み得る、実施形態７４のキット。
７６．官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、固化ポリマー網目構造の１つ又は複数の官能化部位に会合又は結合するように構成される部分を含み得る、実施形態７５のキット。
７７．固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含み得る、実施形態７４～７６のいずれか１つのキット。
７８．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、固化ポリマー網目構造に共有結合的に付着され得る、実施形態７７のキット。
７９．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着され得る、実施形態７７のキット。
８０．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、ビオチン／ストレプトアビジン複合体を介して固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着され得る、実施形態７９のキット。
８１．固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含み得る、実施形態７０～８０のいずれか１つのキット。
８２．合成ポリマー修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、及び／又は細胞認識モチーフを含み得る、実施形態８１のキット。
８３．固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含み得る、実施形態７０～８２のいずれか１つのキット。
８４．固化ポリマー網目構造は、修飾ポリエチレングリコールを含む、実施形態７０～８３のいずれか１つのキット。
８５．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、タンパク質、核酸、有機分子、又はサッカリドを含み得る、実施形態７４～８４のいずれか１つのキット。
８６．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、抗体を含み得る、実施形態７４～８５のいずれか１つのキット。
８７．アッセイ試薬又はアッセイ検体は、抗原を含み得る、実施形態７４～８５のいずれか１つのキット。
８８．アッセイ試薬は、捕捉オリゴヌクレオチドを含み得る、実施形態７４～８５のいずれか１つのキット。
８９．検出試薬を更に含む、実施形態７０～８８のいずれか１つのキット。
９０．検出試薬は、検出可能な標識を含み得る、実施形態８９のキット。
９１．検出試薬の検出可能な標識は、蛍光標識、比色標識、又は発光標識を含み得る、実施形態９０のキット。
９２．検出試薬は、少なくとも第１の抗体を含み得る、実施形態８９～９１のいずれか１つのキット。
９３．検出試薬は、インターカレーター染料を含み得る、実施形態８９～９１のいずれか１つのキット。
９４．検出試薬は、ＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドを含み得る、実施形態８９～９１のいずれか１つのキット。
９５．エンクロージャは、その中に配置される少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造及び第２のインサイチュー生成捕捉構造を含み得、第１のインサイチュー生成捕捉構造は、第１の固化ポリマー網目構造を含み、第２のインサイチュー生成捕捉構造は、第２の固化ポリマー網目構造を含む、実施形態７１～９４のいずれか１つのキット。
９６．第１のインサイチュー生成捕捉構造及び第２のインサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域内に配置される、実施形態９５のキット。
９７．第１のインサイチュー生成捕捉構造及び第２のインサイチュー生成捕捉構造は、少なくとも１つの隔離ペン内に配置される、実施形態９５のキット。
９８．第１のインサイチュー生成捕捉構造及び第２のインサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域又は隔離ペン内の異なる位置に配置され得る、実施形態９５～９７のいずれか１つのキット。
９９．制御可能に活性化されて、第２の固化ポリマー網目構造を形成することができる第２の官能化プレポリマーを更に含む、実施形態７０のキット。
１００．第１のアッセイ試薬及び第２のアッセイ試薬を更に含み、更に、第１のアッセイ試薬は、第２のアッセイ試薬と異なり得る、実施形態９５～９９のいずれか１つのキット。
１０１．第１の固化ポリマー網目構造は、第１のアッセイ試薬を含み、及び第２の固化ポリマー網目構造は、第２のアッセイ試薬を含む、実施形態１００のキット。
１０２．第１の検出試薬及び第２の検出試薬を更に含み、第１の検出試薬は、第２の検出試薬と異なり得る、実施形態９５～１０１のいずれか１つのキット。
１０３．第１の検出試薬は、第１の検出可能な標識を含み、及び第２の検出試薬は、第２の検出可能な標識を含み、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識は、スペクトルが別個であり得る、実施形態１０２のキット。
１０４．マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、複数の隔離ペンを更に含み得る、実施形態７０～１０３のいずれか１つのキット。
１０５．複数の隔離ペンのそれぞれは、固化ポリマー網目構造を含む少なくとも１つの捕捉構造を含み得る、実施形態１０４のキット。
１０６．マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面は、調整表面を更に含み得る、実施形態７０～１０５のいずれか１つのキット。
１０７．少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを準備する方法であって、マイクロ流体デバイスを提供することであって、マイクロ流体デバイスは、基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャを含み、エンクロージャは、フロー領域を画定する、提供することと、第１の流動性官能化プレポリマーをフロー領域に導入することと、エンクロージャの少なくとも１つの選択されたエリアにおいて第１の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、その中で少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を形成することとを含む方法。
１０８．エンクロージャは、少なくとも１つの隔離ペンを更に画定する、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．第１のインサイチュー生成捕捉構造は、フロー領域に形成される、実施形態１０７又は１０８に記載の方法。
１１０．第１のインサイチュー生成捕捉構造は、隔離ペンに形成される、実施形態１０８に記載の方法。
１１１．少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造は、１つ又は複数の官能化部位を含む固化ポリマー網目構造を含み得る、実施形態１０７～１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１２．１つ又は複数の官能化部位は、ビオチン部分、アビジン部分、又はストレプトアビジン部分を含み得る、実施形態１１０に記載の方法。
１１３．１つ又は複数の官能化部位は、第１の流動性官能化プレポリマーの少なくとも１つの成分に共有結合され得る、実施形態１１１又は１１２に記載の方法。
１１４．マイクロ流体デバイスのフロー領域を通して第１の容量の第１の流体媒体を流し、それにより、固化しなかった第１の流動性官能化プレポリマーをフロー領域及び任意選択的に少なくとも１つの隔離ペン外に拡散させるステップを更に含む、実施形態１０７～１１３のいずれか１つに記載の方法。
１１５．第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を少なくとも第１の捕捉構造に導入することと、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位に会合させることとを更に含む、実施形態１０７～１１４のいずれか１つに記載の方法。
１１６．マイクロ流体デバイスを通して第２の容量の第１の流体媒体を流し、それにより、会合しなかった第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体をフロー領域及び任意選択的に少なくとも１つの隔離ペン外に拡散させることを更に含む、実施形態１１５に記載の方法。
１１７．第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、抗体、抗原、有機分子、又はオリゴヌクレオチドを含み得る、実施形態１１５又は１１６に記載の方法。
１１８．第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体の有機分子は、酵素、抗原、細胞表面マーカ、又はサイトカインへの基質を含み得る、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位に会合させるように構成される部分を更に含み得る、実施形態１１５～１１８のいずれか１つに記載の方法。
１２０．第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を会合させるように構成される部分は、少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の官能化部位へのビオチン結合パートナー、アビジン結合パートナー、又はストレプトアビジン結合パートナーを含み得る、実施形態１１９に記載の方法。
１２１．第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１のアッセイ試薬であり得る、実施形態１１５～１２０のいずれか１つに記載の方法。
１２２．第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を導入するステップを更に含む、実施形態１０７～１２１のいずれか１つに記載の方法。
１２３．第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、少なくとも第１の捕捉構造の固化ポリマー網目構造の第２の官能化部位に会合し得る、実施形態１２２に記載の方法。
１２４．第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体から検出可能に区別可能であり得る、実施形態１２３に記載の方法。
１２５．第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、少なくとも１つの隔離ペン内の第２の捕捉構造上の第１の官能化部位に会合し得る、実施形態１２３に記載の方法。
１２６．第２の捕捉構造をフロー領域又は少なくとも１つの隔離ペン内に導入することを更に含み、第２の捕捉構造を導入することは、第２の流動性官能化プレポリマーをフロー領域に導入するステップと、エンクロージャの少なくとも第２の選択されたエリアにおいて第２の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、その中に第２のインサイチュー生成捕捉構造を形成するステップと、更なる容量の第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのフロー領域に流すステップとを含み得る、実施形態１２５に記載の方法。
１２７．第３の捕捉構造をフロー領域又は少なくとも１つの隔離ペンを導入することを更に含み、第３の捕捉構造を導入することは、第３の流動性官能化プレポリマーをフロー領域内に導入することと、エンクロージャの少なくとも第３の選択されたエリアにおいて第３の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、その中に第３のインサイチュー生成捕捉構造を形成することと、更なる容量の第１の流体媒体をマイクロ流体デバイスのフロー領域に流すこととを含み得る、実施形態１２６に記載の方法。
１２８．第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体と異なり得る、実施形態１２２～１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．第１の流動性官能化プレポリマーは、第２の流動性官能化プレポリマーと異なる、実施形態１２６～１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．第１、第２、及び第３の流動性官能化プレポリマーのそれぞれは、互いに異なり得る、実施形態１２７～１２９のいずれか１つに記載の方法。
１３１．第３の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を導入するステップを更に含む、実施形態１２７～１３０のいずれか１つに記載の方法。
１３２．第３の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、少なくとも１つの隔離ペン内の第３の捕捉構造上の第１の官能化部位に会合し得る、実施形態１３１に記載の方法。
１３３．第３の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体及び第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体と異なり得る、実施形態１３１又は１３２に記載の方法。
１３４．マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面は、調整表面を更に含み得る、実施形態１０７～１３３のいずれか１つに記載の方法。
任意の上述した変更形態に加えて、本説明の趣旨及び範囲から逸脱せずに多くの他の変形形態及び代替構成を当業者は考案し得、添付の特許請求の範囲は、そのような変更形態及び構成を包含することが意図される。したがって、情報は、最も実際的且つ好ましい態様であると現在考えられるものに関連して具体的且つ詳細に上述したが、本明細書に記載される原理及び概念から逸脱せずに、形態、機能、動作様式、及び使用を含むがこれに限定されない多くの変更形態がなされ得ることが当業者に明らかである。また、本明細書で使用される場合、例及び実施形態は、全ての点に関して単なる例示が意味され、決して限定として解釈されるべきではない。更に、本明細書において要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が言及される場合、そのような言及は、リスト自体に列挙された要素のいずれか１つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ、及び／又は列挙された全ての要素の組合せを包含することが意図される。本明細書で使用される場合、１つの（a）、１つの（an）、及び１つ（one）という用語は、それぞれ少なくとも１つ及び１つ又は複数という用語と同義であり得る。ステップという用語が本明細書において使用されるが、この用語は、単に、説明される方法の異なる部分に注意を引くために使用され得、方法の任意の部分の開始点若しくは停止点を区切るか又は他の方法での限定として意図されないことにも留意されたい。

Claims (89)

  1. 基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャであって、それぞれ前記エンクロージャ内に位置するフロー領域及び少なくとも１つの隔離ペンを画定する、エンクロージャと、
    前記少なくとも１つの隔離ペン内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造であって、固化ポリマー網目構造を含む、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造と
    を含む、マイクロ流体デバイス。
  2. 前記固化ポリマー網目構造は、１つ又は複数の官能化部位を含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  3. 前記固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含む、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  4. 前記少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み、前記接続領域は、前記フロー領域への基端開口部及び前記分離領域への先端開口部を有する、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  5. 前記少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造は、前記隔離ペンの前記分離領域内に配置される、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
  6. 前記アッセイ試薬は、前記固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着される、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
  7. 前記アッセイ試薬は、ビオチン／ストレプトアビジン複合体を介して前記固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着される、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
  8. 前記アッセイ試薬は、タンパク質、核酸、有機分子、及び／又はサッカリドを含む、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
  9. 前記アッセイ試薬は、抗体を含む、請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。
  10. 前記アッセイ試薬は、抗原を含む、請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。
  11. 前記アッセイ検体は、前記少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造の前記固化ポリマー網目構造に非共有結合的に結合される、請求項３に記載のマイクロ流体デバイス。
  12. 前記アッセイ検体は、抗体又はサイトカインを含む、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
  13. ２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造は、前記少なくとも１つの隔離ペンに配置される、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  14. 前記２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造の第１のインサイチュー生成捕捉構造は、第１のアッセイ試薬又は第１のアッセイ検体に結合し、及び前記２つ以上の捕捉構造の第２のインサイチュー生成捕捉構造は、第２のアッセイ試薬又は第２のアッセイ検体に結合し、前記第１のアッセイ試薬又は前記第１のアッセイ検体は、前記第２のアッセイ試薬又は前記第２のアッセイ検体と異なる、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
  15. 前記２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造のそれぞれは、前記少なくとも１つの隔離ペン内の異なる位置に配置される、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
  16. 前記マイクロ流体デバイスのカバーは、前記１つ又は複数の捕捉構造からの蛍光信号、比色信号、又は発光信号を実質的に透過する、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  17. 前記固化ポリマー網目構造は、光開始ポリマーを含む、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  18. 前記固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、生体ポリマー、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  19. 前記固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又はそれらの任意のコポリマーの組合せの少なくとも１つを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  20. 複数の隔離ペンを含む、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  21. 前記基板は、前記エンクロージャ内で誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成される、請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  22. 前記ＤＥＰ力は、光学的に作動される、請求項２１に記載のマイクロ流体デバイス。
  23. 少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスにおいて微小物体をアッセイする方法であって、
    前記マイクロ流体デバイス内において、固化ポリマー網目構造を含む前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある領域に微小物体を配置することであって、前記固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ検体を含む、配置することと、
    前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体を前記微小物体又は前記微小物体の生物学的産物に接触させることと、
    前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体と前記微小物体又は前記生物学的産物との相互作用を検出することと
    を含む方法。
  24. 前記マイクロ流体デバイスは、基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャを含み、前記エンクロージャは、フロー領域及び少なくとも１つの隔離ペンを画定し、
    前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造は、前記少なくとも１つの隔離ペン内に配置される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記少なくとも１つの隔離ペンは、分離領域及び接続領域を含み、前記接続領域は、前記フロー領域への基端開口部及び前記分離領域への先端開口部を有する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記少なくとも第１の捕捉構造は、前記隔離ペンの前記分離領域内に配置される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体は、前記固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着される、請求項２３又は２４に記載の方法。
  28. 前記固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬を含み、前記アッセイ試薬は、タンパク質を含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
  29. 前記アッセイ試薬は、抗原又は抗体を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記生物学的産物は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、有機分子、又はサッカリドを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
  31. 前記微小物体の前記生物学的産物は、抗体又は抗原である、請求項２３又は２４に記載の方法。
  32. 前記微小物体は、生体細胞である、請求項２３又は２４に記載の方法。
  33. 前記生体細胞は、ハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、又はＴ細胞である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記少なくとも第１の捕捉構造は、前記隔離ペンの第１の壁に隣接する第１の位置に配置される、請求項２４に記載の方法。
  35. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体を前記生物学的産物又は前記微小物体に接触させる前記ステップは、非共有結合複合体を形成することを更に含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
  36. 前記相互作用を検出する前記ステップは、検出可能な標識を有する検出試薬を、前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある前記領域に導入することを更に含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
  37. 前記検出可能な標識は、前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体が前記生物学的産物又は前記微小物体と相互作用するとき、前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造へ集中されるように構成される、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記検出試薬の前記検出可能な標識は、蛍光性、比色性、又は発光性である、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記検出試薬は、少なくとも第１の抗体を含む、請求項３６に記載の方法。
  40. 前記検出するステップは、前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造からの蛍光信号を検出することを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
  41. 前記蛍光信号を検出する前記ステップは、前記蛍光信号を定量化することを更に含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記マイクロ流体デバイスは、前記少なくとも１つの隔離ペン内に配置される第２のインサイチュー生成捕捉構造を更に含み、前記第２のインサイチュー生成捕捉構造は、第２の固化ポリマー網目構造を含む、請求項２４に記載の方法。
  43. 前記第２の固化ポリマー網目構造は、第２のアッセイ試薬又は第２のアッセイ検体を含み、前記第１のインサイチュー生成捕捉構造及び前記第２のインサイチュー生成捕捉構造のそれぞれは、異なるアッセイ試薬又はアッセイ検体を含み、前記検出するステップは、前記微小物体の第１の生物学的産物及び前記微小物体の第２の生物学的産物を検出することを含み、前記第１の生物学的産物は、前記第２の生物学的産物と異なる、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記相互作用を検出する前記ステップは、前記第１のインサイチュー生成捕捉構造及び前記第２のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある前記領域に第１の検出試薬及び第２の検出試薬を導入することを更に含み、前記第１の検出試薬及び前記第２の検出試薬は、検出可能な標識を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記相互作用を検出する前記ステップは、第１の検出可能な標識から第１の蛍光信号を、且つ第２の検出可能な標識から第２の蛍光信号を検出することを更に含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記第１の蛍光信号及び前記第２の蛍光信号は、スペクトルが別個である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記第１の蛍光信号及び前記第２の蛍光信号は、位置によって区別可能である、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記マイクロ流体デバイスは、前記少なくとも１つの隔離ペンに配置される第３以上のインサイチュー生成捕捉構造を更に含み、前記第３以上のインサイチュー生成捕捉構造のそれぞれは、固化ポリマー網目構造を含み、更に、前記第３以上の固化ポリマー網目構造のそれぞれの前記固化ポリマー網目構造は、アッセイ試薬又はアッセイ剤を含む、請求項４２に記載の方法。
  49. 前記検出するステップは、前記少なくとも隔離ペン内で位置が別個であるか、検出可能にスペクトルが別個であるか、又はそれらの組合せである第１、第２、及び第３以上の検出可能な信号を検出することを更に含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記マイクロ流体デバイス内において、前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造への基端にある前記領域に前記微小物体を配置する前記ステップは、誘電泳動力を使用して前記微小物体を移動させることを含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
  51. 前記誘電泳動力は、光学的に作動される、請求項５０に記載の方法。
  52. 基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャであって、フロー領域及び少なくとも１つの隔離ペンを画定する、エンクロージャと、
    制御可能に活性化されて、固化ポリマー網目構造を形成することができる官能化プレポリマーと
    を含むマイクロ流体デバイスを含むキット。
  53. 基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャであって、フロー領域及び少なくとも１つの隔離ペンを画定する、エンクロージャと、
    前記少なくとも１つの隔離ペン内に配置される少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造であって、固化ポリマー網目構造を含む、少なくとも１つのインサイチュー生成捕捉構造と
    を含むマイクロ流体デバイスを含むキット。
  54. 前記固化ポリマー網目構造は、１つ又は複数の官能化部位を含む、請求項５２又は５３に記載のキット。
  55. アッセイ試薬又はアッセイ検体を更に含む、請求項５２又は５３に記載のキット。
  56. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体は、前記固化ポリマー網目構造の前記１つ又は複数の官能化部位に会合又は結合するように構成される部分を含む、請求項５５に記載のキット。
  57. 前記固化ポリマー網目構造は、前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体を含む、請求項５５に記載のキット。
  58. 検出試薬を更に含む、請求項５２又は５３に記載のキット。
  59. 前記固化ポリマー網目構造は、合成ポリマー、修飾合成ポリマー、又は生体ポリマーを含む、請求項５２又は５３に記載のキット。
  60. 前記固化ポリマー網目構造は、修飾合成ポリマーを含み、前記修飾は、サイズ変更モチーフ、切断モチーフ、反応末端モチーフ、又は細胞認識モチーフを含む、請求項５９に記載のキット。
  61. 前記固化ポリマー網目構造は、ポリエチレングリコール、修飾ポリエチレングリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、修飾ポリ乳酸、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、修飾ポリグリコール酸、ポリアクリルアミド（ＰＡＭ）、修飾ポリアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡｍ）、修飾ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、修飾ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、修飾ポリアクリル酸、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、修飾ポリカプロラクトン、フィブロネクチン、修飾フィブロネクチン、コラーゲン、修飾コラーゲン、ラミニン、修飾ラミニン、ポリサッカリド、修飾ポリサッカリド、又は任意の組合せのコポリマーの少なくとも１つを含む、請求項５２又は５３に記載のキット。
  62. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体は、前記固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着される、請求項５５に記載のキット。
  63. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体は、ビオチン／ストレプトアビジン複合体を介して前記固化ポリマー網目構造に非共有結合的に付着される、請求項６２に記載のキット。
  64. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体は、タンパク質、核酸、有機分子、又はサッカリドである、請求項５５に記載のキット。
  65. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体は、抗体を含む、請求項５５に記載のキット。
  66. 前記アッセイ試薬又は前記アッセイ検体は、抗原を含む、請求項５５に記載のキット。
  67. 前記検出試薬は、検出可能な標識を含む、請求項５８に記載のキット。
  68. 前記検出試薬は、少なくとも第１の抗体を含む、請求項５８に記載のキット。
  69. 前記少なくとも１つの隔離ペンは、その中に配置される２つ以上のインサイチュー生成捕捉構造を含み、第１のインサイチュー生成捕捉構造の第１の固化ポリマー網目構造は、第１のアッセイ試薬を含み、及び第２のインサイチュー生成捕捉構造の第２の固化ポリマー網目構造は、第２のアッセイ試薬を含み、更に、前記第１のアッセイ試薬は、前記第２のアッセイ試薬と異なる、請求項５３に記載のキット。
  70. 前記第１の捕捉構造及び前記第２の捕捉構造は、前記隔離ペン内の異なる位置に配置される、請求項６９に記載のキット。
  71. 第１の検出試薬及び第２の検出試薬を更に含み、前記第１の検出試薬は、前記第２の検出試薬と異なる、請求項６９又は７０に記載のキット。
  72. 前記第１の検出試薬の検出可能な標識及び前記第２の検出試薬の検出可能な標識は、スペクトルが別個である、請求項７１に記載のキット。
  73. 前記マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを更に含み、前記複数の隔離ペンのそれぞれは、前記フロー領域に流体的に接続される、請求項５２又は５３に記載のキット。
  74. 前記複数の隔離ペンのそれぞれは、固化ポリマー網目構造を含む少なくとも１つの捕捉構造を含む、請求項７３に記載のキット。
  75. 少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を含むマイクロ流体デバイスを準備する方法であって、
    前記マイクロ流体デバイスを提供することであって、前記マイクロ流体デバイスは、基板及びマイクロ流体回路材料を含むエンクロージャを含み、前記エンクロージャは、フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される少なくとも１つの隔離ペンを画定する、提供することと、
    第１の流動性官能化プレポリマーを前記フロー領域に導入することと、
    前記少なくとも１つの隔離ペンの少なくとも１つの選択されたエリアにおいて前記第１の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、その中で前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造を形成することと
    を含む方法。
  76. 前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造は、１つ又は複数の官能化部位を含む固化ポリマー網目構造を含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記１つ又は複数の官能化部位は、ビオチン部分、アビジン部分、又はストレプトアビジン部分を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記１つ又は複数の官能化部位は、前記第１の流動性官能化プレポリマーの少なくとも１つの成分に共有結合的に結合される、請求項７６又は７７に記載の方法。
  79. 前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域を通して第１の容量の第１の流体媒体を流し、それにより、固化しなかった第１の流動性官能化プレポリマーを前記少なくとも１つの隔離ペン外に拡散させることを更に含む、請求項７５又は７６に記載の方法。
  80. 第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を前記少なくとも１つの隔離ペン内の前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造に導入することと、
    前記第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造の前記固化ポリマー網目構造の前記官能化部位に会合させることと
    を更に含む、請求項７６に記載の方法。
  81. 前記マイクロ流体デバイスを通して第２の容量の前記第１の流動性媒体を流し、それにより、会合しなかった第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を前記少なくとも１つの隔離ペン外に拡散させることを更に含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、抗体、抗原、有機分子、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、前記第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を前記少なくとも第１のインサイチュー生成捕捉構造の前記固化ポリマー網目構造の前記官能化部位に会合させるように構成される部分を更に含む、請求項８０に記載の方法。
  84. 前記第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を会合させるように構成される前記部分は、ビオチン結合パートナー、アビジン結合パートナー、又はストレプトアビジン結合パートナーを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体を導入することを更に含む、請求項８０に記載の方法。
  86. 前記第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、前記第１の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体から検出可能に区別可能である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記第２以上の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、前記少なくとも１つの隔離ペン内の第２以上のインサイチュー生成捕捉構造上の第２以上の官能化部位に会合する、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記第２の捕捉構造を前記少なくとも１つの隔離ペン内に導入することを更に含み、前記第２以上の捕捉構造を導入することは、
    第２の流動性官能化プレポリマーを前記フロー領域に導入するステップと、
    前記少なくとも１つの隔離ペンの少なくとも第２の選択されたエリアにおいて前記第２の流動性官能化プレポリマーの固化を活性化し、それにより、その中に前記第２のインサイチュー生成捕捉構造を形成するステップと
    を含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 前記第２の官能化アッセイ試薬又はアッセイ検体は、前記第１の官能化アッセイ試薬と異なる、請求項８５に記載の方法。
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