JP2021533827A - ミトコンドリア疾患又は障害及びヘテロプラスミーを治療するための方法及び組成物 - Google Patents

ミトコンドリア疾患又は障害及びヘテロプラスミーを治療するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、ミトコンドリア交換細胞(MirC)の作製のための方法及び組成物、並びに年齢関連疾患もしくは症候群、ミトコンドリア疾患もしくは障害を有する対象、又はそれ以外にミトコンドリア交換を必要としている対象を治療するためのそのような組成物を使用する治療方法を提供する。ミトコンドリア疾患又は障害を有するレシピエント細胞を産生するための方法及び組成物、並びに誘導性多能性幹細胞(iPSC)の集団を産生するか又は該集団の産生を増強するための方法及び組成物も提供される。さらに、ミトコンドリア移入を増強するための方法及び組成物も含まれる。【選択図】図１Ａ

Description

本出願は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2018年8月14日に出願された米国仮出願第62/718,891号、2018年9月14日に出願された米国仮出願第62/731,731号、及び2019年3月13日に出願された米国仮出願第62/817,987号の恩典を主張する。
(配列表)
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、引用により完全に本明細書中に組み込まれる配列表を含む。2019年8月13日に作成された該ASCIIコピーは、14595-001-228_SL.txtと命名され、サイズが12,905バイトである。
(1.発明の分野)
本発明は、ミトコンドリアDNAの低下及び/又はミトコンドリアDNAの交換を有する細胞の組成物、その産生方法、並びに遺伝性又は年齢関連ミトコンドリア機能不全と関連する様々な疾患を治療する方法を提供する。
(2.発明の背景)
ミトコンドリアは、細胞ホメオスタシスにおいて主要かつ重要な役割を果たしており、様々な疾患プロセスに関与している。それは、細胞内シグナル伝達、アポトーシスに関与しており、かつピルビン酸酸化、クレブス回路、並びにアミノ酸、脂肪酸、ヌクレオチド、及びステロイドの代謝などの、数多くの生化学的仕事を果たしている。1つの極めて重要な仕事は、細胞エネルギー代謝におけるその役割である。これには、電子伝達鎖及び酸化的リン酸化系による脂肪酸のβ-酸化及びATPの産生が含まれる。ミトコンドリア呼吸鎖は、複合体I(NADH-ユビキノンオキシドレダクターゼ)、複合体II(コハク酸-ユビキノンオキシドレダクターゼ)、複合体III(ユビキノール-フェリシトクロムcオキシドレダクターゼ)、複合体IV(シトクロムcオキシドレダクターゼ)、及び複合体V(FIFO ATPアーゼ):を含む、内膜に埋め込まれた5つの多サブユニットタンパク質複合体からなる。
哺乳動物ミトコンドリアゲノムは、13個のタンパク質コード遺伝子、22個の転移RNA(tRNA)遺伝子、及び2個のリボソームRNA(rRNA)遺伝子を含む、37個の遺伝子を含有する、小さな環状二本鎖分子である。これらのうち、24個(22個のtRNA及び2個のrRNA)は、ミトコンドリアDNA翻訳に必要とされ、13個は、呼吸鎖複合体のサブユニットをコードする。さらに、核DNA(nDNA)は、ミトコンドリア内の約900個の遺伝子産物の大半をコードする。
ミトコンドリア疾患又は障害は、機能不全ミトコンドリアを特徴とする臨床的に不均一な障害群である。疾患発症は、どの年齢でも起こる可能性があり、多種多様な臨床症状を伴って現れる可能性がある。ミトコンドリア疾患又は障害は、任意の器官又は組織を冒し、特徴的には、好気的代謝に極めて依存的である器官に一般に影響を及ぼす多数の系統を冒す可能性があり、多くの場合、高い罹病率及び死亡率を伴って容赦なく進行する。ミトコンドリア疾患又は障害は、最も一般的な遺伝性代謝障害群であり、かつ遺伝性神経障害の最も一般的な形態の1つである。
ミトコンドリア疾患又は障害は、構造的ミトコンドリアタンパク質又はミトコンドリア機能に関与するタンパク質をコードする核DNA(nDNA)及び/又はミトコンドリアDNA(mtDNA)の遺伝子の突然変異によって生じ得る。一部のミトコンドリア障害は、単一の器官(例えば、レーバー遺伝性視神経萎縮症[LHON]における目)にしか影響を及ぼさないが、多くは、多数の器官系統を冒し、多くの場合、顕著な神経性及び筋障害性特徴を示す。脳、筋肉、及び目などのエネルギー需要の高い組織がより高い頻度で冒されるにもかかわらず、患者の表現型は、極めて多様でかつ不均一であることがある。この変動は、1つには、二重の遺伝子制御(nDNA及びmtDNA)、ヘテロプラスミーのレベル(単一の細胞及び組織における突然変異DNAのパーセンテージ)、組織エネルギー需要、母性遺伝、並びに有糸分裂分離などの、いくつかの因子によるものである。
ミトコンドリア疾患又は障害を有する多くの患者は、突然変異mtDNAと野生型mtDNAの混合物(ヘテロプラスミーとして知られる)を有し;突然変異mtDNAと野生型mtDNAの割合は、細胞が生化学的欠陥を発現するかどうかを決める重要な因子である。病原性mtDNA突然変異の大部分は、ヘテロプラスミックであり、個々の細胞の内部に突然変異mtDNAと野生型mtDNAを混合物を有する。高レベルのヘテロプラスミーが、高レベルの突然変異体mtDNAと低レベルの野生型mtDNAを有する細胞を指すのに対し、低レベルのヘテロプラスミーは、低レベルの突然変異体mtDNAと高レベルの野生型mtDNAを有する細胞を指す。ミトコンドリア疾患又は障害を有する患者由来の単一の細胞の研究により、突然変異mtDNAと野生型mtDNAのレベルが細胞表現型の決定に非常に重要であることが示されている。例えば、細胞は、それが高レベルの突然変異mtDNAと低レベルの野生型mtDNA(すなわち、高レベルのヘテロプラスミー)を含有する場合、呼吸欠損になる。この欠損が起こる閾値は、正確な突然変異及び細胞型によって決まる。通常、高パーセンテージレベルの突然変異mtDNA(＞50％)が細胞欠損を生じるために必要とされるが、あるmtDNA突然変異(通常、mt tRNA突然変異)は、非常に高いレベルで存在する場合にのみ欠損を生じ、他のmtDNA突然変異(例えば、単一の大規模なmtDNA欠失)は、〜60％のmtDNA欠失が存在する場合に欠損を生じる。例えば、m.8993T>G病原性変異体を保有する個体において、より高いパーセンテージレベルの突然変異mtDNAは、運動失調症及び網膜色素変性症を伴う神経衰弱(NARP)を示す個体よりもリー症候群を示す個体で見られる。さらに、MELAS及びMERRFにおける臨床的表現型は、ヘテロプラスミーと相関する(例えば、Chinnery, P. F.らの文献、Brain 120(Pt 10), 1713-1721(1997)を参照)。
次世代シークエンシング技術の進歩により、ミトコンドリア疾患又は障害を引き起こす多くの突然変異が明らかになった。さらに、線虫(C.elegans)などの他の生物の研究により、ヘテロプラスミーに関与するタンパク質のいくつかが明らかになった。例えば、線虫を用いた最近の研究により、ミトコンドリアアンフォールドタンパク質応答(UPRmt)は、ヘテロプラスミーを維持し、かつもとのmtDNAの妨害後に突然変異mtDNAを増殖させるように機能することが示された(例えば、Lin, Y. F.らの文献、Nature 533, 416-419, doi:10.1038/nature17989(2016)を参照)。しかしながら、哺乳動物におけるヘテロプラスミーの維持及び増殖に関するメカニズムは、依然として不明である。
ミトコンドリア疾患又は障害を有する患者の管理及び治療は、依然として困難である。圧倒的多数の患者について、この状態は容赦なく進行して、相当な罹病率をもたらし、最も重度の影響を受けた患者では、死をもたらす。内在性mtDNAを除去するための古典的な方法は、既知の発癌物質及び催奇性物質である低濃度の臭化エチジウム(EtBr)による細胞の長期的な処理を伴い、その治療目的での用途が制限される。望ましくない副作用の可能性に加えて、EtBrプロトコルは、数カ月かかることがあり、これにより、その臨床使用がさらに制限される。さらに、ミトコンドリア移入プロトコルは、通常、外因性ミトコンドリアの移入前に、rho(ρ)0細胞と呼ばれる、内在性mtDNAの完全な枯渇を伴う。このmtDNAの完全な枯渇は、外因性ミトコンドリアを摂取する細胞の能力を厳しく妨げる。
他のミトコンドリア移入プロトコルは、内在性mtDNAの枯渇を伴わずに、ミトコンドリアを追加することを試みたが、このアプローチは、細胞にとって非効率的かつ有害であることが分かった。例えば、単純な共インキュベーションを用いるミトコンドリア移入は、効果がなく、かつ様々な細胞型間で同等に効率的であるわけではないことが報告されている。移入するためのさらなる技法は、レシピエント細胞に害を及ぼす侵襲的器具、又はナノブレイドなどの他の侵襲的器具を用いる注射を必要としているが、全て、共インキュベーションよりも効率が低かった(Caicedoらの文献、Stem Cells International,(2017), vol. 2017, Article ID 7610414, 23ページ)。
したがって、最近のミトコンドリア移入方法は、臨床現場のために実用的でないだけでなく、非効率的であり、レシピエント細胞にとって有害であり、かつ/又は非常に時間がかかるものでもある。したがって、ミトコンドリア疾患もしくは障害及び正常に機能しないもしくは機能不全のミトコンドリアと関連する疾患もしくは障害を有するか又は該疾患もしくは障害を有することが疑われる対象の治療において任意に使用することができる改善されたミトコンドリア移入方法、並びにミトコンドリア疾患又は障害を研究するための改善されたモデルを開発する満たされていない大きな必要性が存在する。
(3.発明の概要)
一態様において、本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること:を含む、方法である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療する方法であって、(a)(i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程、(ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び(iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに(b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア交換を必要としている対象に投与することを含む、方法である。
また別の態様において、本明細書に提供されるのは、年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法であって、(a)(i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;(ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び(iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程:を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに(b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象に投与すること:を含む、方法である。
さらなる態様において、本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象を治療する方法であって、(a)(i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;(ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び(iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程:を含む、ミトコンドリア交換レシピエント細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに(b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象に投与すること:を含む、方法である。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、外因性ミトコンドリアは、機能的ミトコンドリアである。ある実施態様において、外因性ミトコンドリアは、野生型mtDNAを含む。具体的な実施態様において、外因性ミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアである。さらなる実施態様において、単離されたミトコンドリアは、無傷のミトコンドリアである。いくつかの実施態様において、外因性ミトコンドリアは、同種異系のものである。
また本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することを含む、方法である。
本開示は、ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療する方法であって、(a)(i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程、(ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び(iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程:を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに(b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア交換を必要としている対象に投与することを含む、方法も提供する。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法であって、(a)(i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;(ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び(iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程:を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに(b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象に投与すること:を含む、方法である。
また別の態様において、本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象を治療する方法であって、(a)(i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;(ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び(iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程:を含むミトコンドリア交換レシピエント細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに(b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象に投与すること:を含む、方法である。
本明細書に提供される方法のある実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、ミトコンドリア標的化配列(MTS)及びエンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、並びに小分子からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、小分子は、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)である。他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、メッセンジャーリボ核酸(mRNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)から構成される。さらなる実施態様において、レシピエント細胞は、融合タンパク質を一過性に発現する。またさらなる実施態様において、エンドヌクレアーゼは、XbaI、EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、MTSは、ミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とする。具体的な実施態様において、ミトコンドリアマトリックスタンパク質は、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIV、シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII、及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットXからなる群から選択される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、内在性mtDNAコピー数の約5％〜約99％を低下させる。ある実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、内在性mtDNAコピー数の約30％〜約70％を低下させる。さらなる実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、内在性mtDNAコピー数の約50％〜約95％を低下させる。またさらなる実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、内在性mtDNAコピー数の約60％〜約90％を低下させる。いくつかの実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、ミトコンドリア集塊を低下させる。
また本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、(a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞における該内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること:を含む、方法である。
本開示は、ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、(a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞における該内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること:を含む、方法も提供する。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、内在性ミトコンドリア機能を一過性に低下させる。他の実施態様において、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、内在性ミトコンドリア機能を恒久的に低下させる。
本明細書に提供される方法のある実施態様において、該ミトコンドリア交換を必要としている対象は、機能不全ミトコンドリア;年齢関連疾患、ミトコンドリア疾患もしくは障害、神経変性疾患、網膜疾患、糖尿病、聴覚障害、遺伝性疾患からなる群から選択される疾患;又はこれらの組合せを有する。いくつかの実施態様において、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、フリードライヒ運動失調症、シャルコー・マリー・トゥース病、及び白質ジストロフィーからなる群から選択される。具体的な実施態様において、網膜疾患は、加齢黄斑変性症、黄斑浮腫、及び緑内障からなる群から選択される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、年齢関連疾患は、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、癌、神経変性疾患、及び免疫老化からなる群から選択される。本明細書に提供される方法のある実施態様において、代謝性疾患は、糖尿病である。さらなる実施態様において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、又はパーキンソン病である。またさらなる実施態様において、遺伝性疾患は、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、及びハンチントン病からなる群から選択される。
本明細書に提供される方法のある実施態様において、ミトコンドリア疾患又は障害は、ミトコンドリアDNA異常、核DNA異常、又は両方によって引き起こされる。具体的な実施態様において、ミトコンドリアDNA異常によって引き起こされるミトコンドリア疾患又は障害は、慢性進行性外眼筋麻痺(CPEO)、ピアソン症候群、カーンズ・セイヤー症候群(KSS)、糖尿病、及び難聴(DAD)、ミトコンドリア糖尿病、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、LHON-プラス、ニューロパチー、運動失調症、及び網膜色素変性症症候群(NARP)、母性遺伝性リー症候群(MILS)、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、及び卒中様発作(MELAS)、ミオクローヌスてんかん及び赤色ぼろ線維疾患(MERRF)、家族性両側線条体壊死/線条体黒質変性症(FBSN)、ルフト病、アミノグリコシド誘発性難聴(AID)、並びにミトコンドリアDNA多重欠失症候群からなる群から選択される。また他の具体的な実施態様において、核DNA異常によって引き起こされるミトコンドリア疾患又は障害は、ミトコンドリアDNA枯渇症候群-4A、ミトコンドリア劣性運動失調症候群(MIRAS)、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症(MNGIE)、ミトコンドリアDNA枯渇症候群(MTDPS)、DNAポリメラーゼγ(POLG)関連障害、感覚性運動失調型ニューロパチー構音障害眼筋麻痺(SANDO)、脳幹及び脊髄の障害並びに乳酸上昇を伴う白質脳症(LBSL)、補酵素Q10欠損症、リー症候群、ミトコンドリア複合体異常、フマラーゼ欠損症、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体(KGDHC)欠損症、スクシニル-CoAリガーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症(PDHC)、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症(PCD)、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT I)欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII(CPT II)欠損症、カルニチン-アシル-カルニチン(CACT)欠損症、常染色体優性/常染色体劣性進行性外眼筋麻痺(ad-/ar-PEO)、乳児発症性脊髄小脳萎縮症(IOSCA)、ミトコンドリアミオパチー(MM)脊髄性筋萎縮症(SMA)、成長遅延、アミノ酸尿症、胆汁鬱滞、鉄過負荷、早期死亡(GRACILE)、及びシャルコー・マリー・トゥース病2A型(CMT2A)からなる群から選択される。
本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、内在性mtDNAは、機能不全ミトコンドリアをコードする。具体的な実施態様において、内在性mtDNAは、突然変異体mtDNAを含む。他の実施態様において、レシピエント細胞における内在性mtDNAは、野生型mtDNAを含む。またさらなる実施態様において、内在性mtDNAは、ミトコンドリア疾患又は障害と関連するmtDNAを含む。いくつかの実施態様において、内在性mtDNAは、ヘテロプラスミックである。具体的な実施態様において、レシピエント細胞は、機能不全である内在性ミトコンドリアを有する。
本明細書に提供される方法のある実施態様において、ミトコンドリア交換細胞は、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前のレシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を有する。
いくつかの実施態様において、レシピエント細胞は、動物細胞又は植物細胞である。ある実施態様において、動物細胞は、哺乳動物である。具体的な実施態様において、レシピエント細胞は、体細胞である。他の実施態様において、レシピエント細胞は、骨髄細胞である。いくつかの実施態様において、骨髄細胞は、造血幹細胞(HSC)又は間葉系幹細胞(MSC)である。他の実施態様において、レシピエント細胞は、癌細胞である。さらなる実施態様において、レシピエント細胞は、初代細胞である。またさらなる実施態様において、レシピエント細胞は、免疫細胞である。具体的な実施態様において、免疫細胞は、T細胞、食細胞、ミクログリア細胞、及びマクロファージからなる群から選択される。さらなる実施態様において、T細胞は、CD4+ T細胞である。他の実施態様において、T細胞は、CD8+ T細胞である。ある実施態様において、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞である。
本明細書に提供される方法の別の実施態様において、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAは、安定である。いくつかの実施態様において、外因性mtDNAは、レシピエント細胞におけるヘテロプラスミーを変化させる。
本明細書に提供される方法のいくつかの態様において、本方法は、小分子、ペプチド、又はタンパク質を送達することをさらに含む。
本開示は、レシピエント細胞を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAと共インキュベートする前に、レシピエント細胞を第二の活性作用因子と接触させることをさらに含む、本明細書に提供される方法も提供する。ある実施態様において、第二の活性作用因子は、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ第二の活性作用因子は、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される。いくつかの実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、細胞代謝のモジュレーターである。具体的な実施態様において、細胞代謝のモジュレーターは、栄養飢餓、化学インヒビター、又は小分子を含む。またさらなる実施態様において、化学インヒビター又は小分子は、mTORインヒビターである。一層さらなる実施態様において、mTORインヒビターは、ラパマイシン又はその誘導体を含む。
本開示は、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させ;(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する:方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物であって、該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、組成物も提供する。
本開示は、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させ、(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞の組成物であって、該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、組成物をさらに提供する。本明細書に提供される組成物のいくつかの実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞は、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前のレシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、1以上のミトコンドリア交換細胞を作製する方法で使用するための組成物であって、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子及び第二の活性作用因子を含む、組成物である。いくつかの実施態様において、1以上のレシピエント細胞又はその組合せをさらに含む組成物。ある実施態様において、外因性mtDNA、外因性mtDNA、及び/又は外因性ミトコンドリアをさらに含む組成物。
本明細書に提供される組成物のある実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、小分子又は融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、小分子は、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)である。他の実施態様において、融合タンパク質は、mtDNAを切断するエンドヌクレアーゼ及びミトコンドリア標的配列(MTS)を含む。いくつかの実施態様において、エンドヌクレアーゼは、野生型mtDNAを切断する。具体的な実施態様において、エンドヌクレアーゼは、XbaI、EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、MTSは、ミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とする。さらなる実施態様において、ミトコンドリアマトリックスタンパク質は、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIV、シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII、及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットXである。具体的な実施態様において、融合タンパク質は、一過性に発現される。
本明細書に提供される組成物のいくつかの実施態様において、内在性mtDNAコピー数の低下は、部分的な低下である。ある実施態様において、部分的な低下は、内在性mtDNAの約5％〜約99％の低下である。具体的な実施態様において、部分的な低下は、内在性mtDNAコピー数の約50％〜約95％の低下である。さらなる実施態様において、部分的な低下は、内在性mtDNAコピー数の約60％〜約90％の低下である。
本開示は、(a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させ;(b)該薬剤が該レシピエント細胞における内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ(c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する:方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物であって、該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、組成物も提供する。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、(a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させ;(b)該薬剤が該レシピエント細胞における内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ(c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する:方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞の組成物であって、該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、組成物である。いくつかの実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞は、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前のレシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を含む。
本開示は、1以上のミトコンドリア交換細胞を作製する方法で使用するための組成物であって、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子及び第二の活性作用因子を含む、組成物も提供する。いくつかの実施態様において、該組成物は、外因性ミトコンドリア、1以上のレシピエント細胞、又はその組合せをさらに含む。またさらなる実施態様において、該組成物は、外因性mtDNAをさらに含む。
本明細書に提供される組成物のいくつかの実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞は、野生型外因性mtDNAを含む。
また本明細書に提供されるのは、第二の活性作用因子をさらに含む組成物である。いくつかの実施態様において、第二の活性作用因子は、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ第二の活性作用因子は、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される。具体的な実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路のアクチベーターである。いくつかの実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路のアクチベーターである。さらなる実施態様において、クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路は、CLIC/GEECエンドサイトーシス経路、Arf6依存的エンドサイトーシス、フロチリン依存的エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、円形ドーサルラッフル(circular doral ruffles)、ファゴサイトーシス、及びトランス-エンドサイトーシスからなる群から選択される。またさらなる実施態様において、クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路は、マクロピノサイトーシスである。具体的な実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、栄養ストレス及び/又はmTORインヒビターを含む。いくつかの実施態様において、mTORインヒビターは、ラパマイシン又はその誘導体を含む。
ある実施態様において、本開示は、1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数が5％超の外因性mtDNAを含む組成物をさらに提供する。いくつかの実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数は、30％超の外因性mtDNAを含む。具体的な実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数は、50％超の外因性mtDNAを含む。さらなる実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数は、75％超の外因性mtDNAを含む。
本明細書に提供される組成物のいくつかの実施態様において、外因性ミトコンドリアは、単離されたミトコンドリアである。具体的な実施態様において、単離されたミトコンドリアは、無傷である。いくつかの実施態様において、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAは、同種異系のものである。具体的な実施態様において、外因性ミトコンドリアは、外因性mtDNAをさらに含む。
本明細書に提供される組成物のある実施態様において、1以上の細胞は、動物細胞又は植物細胞である。いくつかの実施態様において、動物細胞は、哺乳動物である。具体的な実施態様において、細胞は、体細胞である。さらなる実施態様において、体細胞は、上皮細胞である。またさらなる実施態様において、上皮細胞は、胸腺上皮細胞(TEC)である。他の実施態様において、体細胞は、免疫細胞である。ある実施態様において、免疫細胞は、T細胞である。具体的な実施態様において、T細胞は、CD4+ T細胞である。他の実施態様において、T細胞は、CD8+ T細胞である。いくつかの実施態様において、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞である。他の実施態様において、免疫細胞は、食細胞である。ある実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞は、骨髄細胞である。具体的な実施態様において、骨髄細胞は、造血幹細胞(HSC)又は間葉系幹細胞(MSC)である。
本明細書に提供される組成物のいくつかの実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞は、ホモプラスミックな内在性mtDNAを有する同系細胞よりも生存能力がある。他の実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞は、癌細胞の死滅化、年齢関連疾患の治療、ミトコンドリア疾患又は障害の治療、神経変性疾患の治療、糖尿病又は遺伝性疾患の治療に有効である。
本明細書に提供される組成物のある実施態様において、該組成物は、小分子、ペプチド、又はタンパク質をさらに含む。
また本明細書に提供されるのは、細胞における老化の遅延及び/又は寿命の延長において使用するための組成物であって、(a)内在性ミトコンドリアを有する老化した又老化しそうな細胞;(b)老化していない細胞由来の単離された外因性ミトコンドリア;及び(c)内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子:を含む、組成物である。いくつかの実施態様において、作用因子は、融合タンパク質である。ある実施態様において、融合タンパク質は、mtDNAを切断するエンドヌクレアーゼ及びミトコンドリア標的配列(MTS)を含む。具体的な実施態様において、エンドヌクレアーゼは、野生型mtDNAを切断する。いくつかの実施態様において、エンドヌクレアーゼは、XbaI、EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群から選択される。さらなる実施態様において、MTSは、ミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とする。またさらなる実施態様において、ミトコンドリアマトリックスタンパク質は、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIV、シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII、及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットXからなる群から選択される。ある実施態様において、融合タンパク質は、該老化した又老化しそうな細胞で一過性に発現される。
本開示は、細胞における老化の遅延及び/又は寿命の延長において使用するための組成物であって、(a)内在性ミトコンドリアを有する老化した又老化しそうな細胞;(b)老化していない細胞由来の単離された外因性ミトコンドリア;及び(c)ミトコンドリア機能を低下させる作用因子:を含む、組成物をさらに提供する。いくつかの実施態様において、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、内在性ミトコンドリア機能を一過性に低下させる。他の実施態様において、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、内在性ミトコンドリア機能を恒久的に低下させる。いくつかの実施態様において、老化していない細胞由来の外因性ミトコンドリアは、内在性ミトコンドリアと比べて、増強された機能を有する。
いくつかの実施態様において、細胞における老化の遅延及び/又は寿命の延長において使用するための組成物は、第二の活性作用因子をさらに含む。具体的な実施態様において、第二の活性作用因子は、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ第二の活性作用因子は、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される。いくつかの実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路のアクチベーターである。具体的な実施態様において、クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路は、CLIC/GEECエンドサイトーシス経路、Arf6依存的エンドサイトーシス、フロチリン依存的エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、円形ドーサルラッフル(circular doral ruffles)、ファゴサイトーシス、及びトランス-エンドサイトーシスからなる群から選択される。さらなる実施態様において、クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路は、マクロピノサイトーシスである。いくつかの実施態様において、該エンドサイトーシスのアクチベーターは、栄養ストレス及び/又はmTORインヒビターを含む。ある実施態様において、該mTORインヒビターは、ラパマイシン又はその誘導体を含む。
別の態様において、本開示は、健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物であって、該細胞がミトコンドリア交換細胞を得るための本明細書に提供される方法のいずれかによって得られる、組成物も提供する。また別の態様において、本開示は、健康なドナー由来の外因性mtDNAを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物であって、該細胞がミトコンドリア交換細胞を得るための本明細書に提供される方法のいずれかによって得られる、医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、健康なドナー由来の外因性mtDNAを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物は、外因性ミトコンドリアをさらに含む。
例えば、いくつかの実施態様において、健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを含む医薬組成物は、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することを含む、ミトコンドリア交換細胞を作製する方法によって得られる。ある実施態様において、該細胞は、(a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞における該内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することを含む方法によって得られる。
他の実施態様において、該細胞は、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することを含む方法によって得られる。他の実施態様において、該細胞は、(a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること;(b)該薬剤が該レシピエント細胞における該内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び(c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること:を含む方法によって得られる。
本明細書に提供される医薬組成物のある実施態様において、該細胞は、レシピエント細胞を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAと共インキュベートする前に、レシピエント細胞を第二の活性作用因子と接触させることをさらに含むことをさらに含む方法によって得られる。いくつかの実施態様において、第二の活性作用因子は、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ第二の活性作用因子は、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される。具体的な実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、細胞代謝のモジュレーターである。他の実施態様において、細胞代謝のモジュレーターは、栄養飢餓、化学インヒビター、又は小分子を含む。さらなる実施態様において、化学インヒビター又は小分子は、mTORインヒビターである。またさらなる実施態様において、該mTORインヒビターは、ラパマイシン又はその誘導体を含む。
本明細書に提供される医薬組成物のある実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体をさらに含む。
本明細書に提供される医薬組成物のいくつかの実施態様において、該細胞は、T細胞である。他の実施態様において、該細胞は、造血幹細胞である。
(4.図面の簡単な説明)
図1Aは、ミトコンドリア交換細胞(MirC)の作製のためのスキームを示している。
図1Bは、ミトコンドリア標的化配列(MTS)−XbaI制限酵素(XbaIR)プラスミドのプラスミドコンストラクトを示している。
図1Cは、単離されたミトコンドリアDNAがXbaI制限酵素によって複数の部位で消化されるのに対し、ミトコンドリアDNAのNotI消化は、ミトコンドリアDNAのケンブリッジ参照配列(CRS)によって予測された通りに、単一の断片を生じさせたことを示している。
図1Dは、ケンブリッジ参照配列(CRS)によって予測されたヒトミトコンドリアDNA上の5つのXbaIRエンドヌクレアーゼ部位(1193、2953、7440、8286、10256)を示している。
図1Eは、エレクトロポレーター(Nucleofector)を用いる融合体MTS-緑色蛍光タンパク質(GFP)プラスミドの取込み後の位相差下のヒト皮膚線維芽細胞(左)、緑色蛍光タンパク質の免疫蛍光(中央)、及び合成視野(右)の顕微鏡検査を示している。上、低倍率。下、高倍率。
図1Fは、pCAGGS-MTS-EGFP-PuroR及びpCAGGS-MTS-XbaIR-PuroRプラスミドのコンストラクトを示している。
図1Gは、テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)を用いるミトコンドリア特異的染色によるミトコンドリア内の外因性導入遺伝子産物MTS-EGFPの局在を示している。
図2Aは、非接触細胞と比べた、MTS-XbaIRエンドヌクレアーゼ法(上)と臭化エチジウム(EtBr)を用いる従来法(真ん中)とを比較するための日程のスキームを示している。
図2Bは、非接触細胞と比べた、MTS-XbaIRエンドヌクレアーゼ法又は臭化エチジウム処理のいずれかに触れた後のヒトβ-アクチン(Actb)(左列)及びミトコンドリアDNA(mtDNA)(右列)の定量を示している。XbaIRは、EtBr処理と比較して、mtDNAのより大きな低下をもたらした。Actbをハウスキーピング遺伝子として使用した。
図2Cは、ミトコンドリアで発現させておいたDsRed蛍光に基づく、EtBr処理と比べた、MTS-XbaIRの遺伝子移入にさらされた後のミトコンドリアのより大きな低下を示している。
図2Dは、TMRMの使用によるFACS解析を用いる、MTS-XbaIR又はEtBrの遺伝子移入に触れた細胞におけるミトコンドリア膜電位(ミトコンドリア含量の代用マーカー)の半定量を示し、MTS-XbaIRがミトコンドリアのより大きな低下をもたらしたことを示している。
図2Eは、14日間にわたる遺伝子移入系での導入遺伝子発現のタイムコース定量を示している。
図2F及び図2Gは、ピューロマイシン選択前(「pre」)及びピューロマイシン選択後(「post」)のGFPを担持するプラスミドの移入後の蛍光画像(図2F)を示しており、GFP/ミトコンドリア比の定量(図2G)により、ピューロマイシン選択後のGFPプラスミドの濃縮が示されている。
図3Aは、ミトコンドリア交換の日程のスキームを示している。TF: XbaIR又は模擬物の遺伝子トランスフェクション; Puro:遺伝子移入細胞の濃縮のためのピューロマイシン; U+:ミトコンドリアATP産生を欠くρ(-)細胞をレスキューするためのウリジンの添加; Mt Tx:ミトコンドリア移入; NHDF:正常ヒト皮膚線維芽細胞、EPC100:胎盤静脈内皮由来細胞株。
図3Bは、TMRM染色によって測定したときの、陰性対照ベクター発現GFPの移入後(下)ではなく、XbaIRの遺伝子移入後(上)、6日目のミトコンドリアの低下を示している。
図3Cは、XbaIRの遺伝子トランスフェクション又はGFPトランスフェクション後のNHDF細胞における核β-アクチンレベルと比べたヒト12S rRNAのqPCRによって推定されたミトコンドリアDNAコピー数の定量を示している。表示されている場合(「Mt Tx」)、ミトコンドリアがレシピエント細胞に移入された。XbaIRは、ミトコンドリアDNAの有意な低下をもたらした。これは、外因性ミトコンドリアの移入後の対照処理細胞と同等のレベルにレスキューすることができる。N＝3、*p＜0.01。
図3Dは、タイムラプス動画からの写真を示している:左上:ρ(-)細胞と単離され、DsRedでマーキングされたミトコンドリアとの共培養;右上:対照としてのρ(-)細胞;左下: NHDFとミトコンドリアとの共培養;右下: NHDFの模擬トランスフェクタントとミトコンドリアとの共培養;
図3Eは、時系列順に、水平に並べられた、図3Dに示されたタイムラプス動画からの一連の10枚の静止画像を示している;
図3Fは、FACS解析によるDsRed標識ミトコンドリアの測定を示しており、これにより、本発明(「DsRed-Mt EPC100」)が、以前に記載されている方法と比較して、外因性ミトコンドリアの取込みの増大をもたらすことが明らかにされた。
図3G及び図3Hは、アンチマイシンで処理した又は処理していないρ(0)細胞におけるミトコンドリア移入後のDsRed標識ミトコンドリア(図3G)及び位相差(図3H)の顕微鏡画像を示しており、これにより、外因性ミトコンドリアの飲込みがミトコンドリアの完全な破壊を伴う細胞で起こらなかったことが示されている;
図3Iは、図3Gに示されたタイムラプス動画からの時系列順に、水平に並べられた、一連の5枚の静止画像を示している。
図3Jは、Ds-Redミトコンドリアと共インキュベートされた、ρ(-)細胞もしくはρ(-)模擬トランスフェクト細胞、又は未処理細胞(付加Mt)における24時間毎に測定されたDsRed標識された単離された外因性ミトコンドリアの蛍光強度の定量を示している。
図4Aは、DsRedでマーキングされたミトコンドリアをドナーとして及びEGFPでマーキングされた細胞をレシピエントとして用いる、レシピエント細胞による飲込み後のドナーミトコンドリアの運命を測定するためのスキームを示している。
図4Bは、GFPでマーキングされたミトコンドリアを有するレシピエント細胞における飲み込まれた外因性ミトコンドリア(赤色で表示されている)を観察するための動画からの代表的な画像を示している。動画は、超精密顕微鏡検査を使用することにより記録され、融合画像はほとんど認識されず、ドナーミトコンドリアの大部分は、既存のミトコンドリアと別々に存在している。
図4Cは、融合体の3次元再構築写真を示している。
図4Dは、ミトコンドリア移入シグナルと融合されたDsRedをコードする遺伝子が移入されたNHDFの写真を示している。
図4Eは、TFAMと融合されたEGFPをコードする遺伝子が移入されたEPC100の写真を示している。
図4Fは、DsRedでマーキングされた細胞をレシピエントとして及びTFAM標的化EGFPをドナーミトコンドリアとして用いる、ミトコンドリア移入のタイムコースを示している。
図4Gは、外因性ミトコンドリアがレシピエント細胞と一過性に接触した後、外因性TFAMが既存のミトコンドリアに安定に飲み込まれたことを示し、TFAMを含むミトコンドリア核様体が、口移し摂取と類似した一過性接触を介して、既存のミトコンドリアに移入されたことを示唆している。
図5Aは、超可変(「HV」)領域1/2を示すヒトミトコンドリアDNAのケンブリッジ参照配列(CRS)を有する環状ミトコンドリアDNA全体、及びNHDFとEPC100の違いを同定するための5つのプライマーを示している;
図5Bは、NHDF ctrlレシピエント細胞(配列番号1)、EPC100 ctrlドナー細胞(配列番号2)、ミトコンドリア交換なしのNHDF由来ρ(-)細胞(配列番号3)、及びミトコンドリア交換ありのNHDF由来ρ(-)細胞(配列番号4)においてhmt16362を取り囲むヌクレオチドのDNAシークエンシングデータを示しており、これにより、ミトコンドリア交換ありのNHDF由来ρ(-)細胞(配列番号4)がhmt16362においてもとのレシピエント細胞のAからドナーmtDNAのGに変化することが示された。
図5Cは、hmt16362を取り囲むヒトミトコンドリアDNA D-ループ(配列番号8)のHV1領域の増幅用に使用されたプライマーのhmt16318-F(配列番号6)及びhmt16414-R(配列番号9)のセット、並びにTaqMan SNPジェノタイピングアッセイ用に設計されたNHDF特異的プローブ(配列番号5)及びEPC100特異的プローブ(配列番号7)を示している。
図5Dは、親NHDF及びEPC100細胞株、又はXbaIRで処理された、EPC100細胞由来のミトコンドリアを有するNHDF細胞(XbaIR Mt+)又はXbaIRで処理された、EPC100細胞由来のミトコンドリアを有さないNHDF細胞(XbaIR Mt-)におけるNHDF特異的hmtDNA(左)及びEPC100特異的hmtDNA(右)の定量を示しており、これにより、単一ヌクレオチド多型アッセイ(SNP)を用いて評価したとき、EPC100ミトコンドリアがXbaIR Mt+細胞にうまく移入されることが明らかになった。
図6Aは、Oroboros Oxygraph-2kを用いて実施されたミトコンドリア機能アッセイからの代表的なオキシグラフィーを示しており、これにより、交換されたミトコンドリアを有するNHDF細胞(ρ(-)Mt)(下)が、対照NHDF細胞(上)及びミトコンドリア交換なしのρ(-)NHDF細胞(中央)と比べて、ミトコンドリア機能を取り戻すことが示された。この装置は、呼吸流量を赤線で(pmol/秒/1×106細胞、右軸)及び酸素濃度を青線(μM、左軸)で示している。
図6Bは、各々の段階での呼吸流量(ルーチン、電子伝達系(ETS)、ROX)、自由ルーチン活性(ミトコンドリアATP産生)、プロトン漏出、及び共役効率によって、NHDF細胞(ρ(-)Mt)におけるミトコンドリア交換が、NHDF対照細胞及びmtDNA交換なしのNHDF(ρ(-))と比べて、ミトコンドリア機能を取り戻すことが示されたことを示している。
図6Cは、細胞の表面積に基づく連続的な細胞数の推定を可能にするタイムラプス顕微鏡写真を示しており、これにより、ρ(-)細胞が、3〜12日の間、休止状態となるのに対し、ミトコンドリア交換細胞は、6日以降、増殖能を取り戻すことが示された。
図6Dは、マクロピノサイトーシスの分子メカニズムを調べるために使用されたプロトコルのスキームを示している。このプロトコルには、NHDF細胞をMTS-XbaIR-P2A-PuroRプラスミドでトランスフェクトし、ピューロマイシンで選択し、その後、細胞を60分間血清飢餓状態にするか、又は細胞をパルミチン酸(PA)もしくはラパマイシンで24時間処理することが含まれた。
図6E〜図6Hは、S6キナーゼのリン酸化(図6E)及びAMPKのリン酸化(図6G)についてのWES(商標)解析の定量、並びにそれぞれ、対応するWES(商標)ブロット(図6F)及び(図6H)を示しており、これにより、ρ(-)細胞において、AMPKが活性化され、mTORが完全に抑制されてことが示された。Rapa:ラパマイシン、PA:パルミチン酸、EAA-:必須アミノ酸欠損。
図6Iは、MirC作製プロトコルの設定でmTOR媒介姓マクロピノサイトーシスの効果を調べるために使用されたプロトコルを示している。
図6J〜図6Lは、ラパマイシン処理ありもしくはなし、又はパルミチン酸(PA)処理ありもしくはなしの、対照(上)、模擬トランスフェクト細胞(中央)、及びρ(-)細胞におけるDsRed標識ミトコンドリア取込みの定量(図6J及び図6K)並びにFACS解析(図6L)を示している。ρ(-)細胞は、対照又は模擬TF細胞と比べて、ミトコンドリアのより大きい取込みを示し、ミトコンドリアの取込みが、ラパマイシン処理後、顕著に増大したのに対し、パルミチン酸は、ρ(-)細胞におけるミトコンドリア取込みを減少させた。
図7Aは、ミトコンドリアDNAのND3遺伝子の呼吸鎖複合体I(CI)サブユニットにおける10158T>Cというリー症候群関連突然変異を示す全mtDNA配列を示している。
図7Bは、EPC100細胞のND3においてhmt10158を取り囲むヌクレオチド(上;配列番号10)及びリー症候群(7SP)線維芽細胞のND3においてhmt10158を取り囲むヌクレオチド(下;配列番号11)のDNAシークエンシングデータを示しており、これにより、ヘテロプラスミーを示す、主要波のCと非主要波のTのモザイクである突然変異10158T>Cが明らかになった。
図7Cは、NHDF実験で見られるような、外因性ミトコンドリアを有するρ(-)7SP線維芽細胞と外因性ミトコンドリアを有さないρ(-)7SP線維芽細胞の両方における同様の挙動を示したタイムラプス動画からの写真を示している。
図7Dは、XbaIRの遺伝子トランスフェクション又は模擬トランスフェクション後のNHDF細胞における核β-アクチンレベルと比べたヒト12S rRNAのqPCRによって推定されたミトコンドリアDNAコピー数の定量を示している。表示されている場合、ミトコンドリアは、レシピエント細胞に移入された。XbaIRは、ミトコンドリアDNAの有意な低下をもたらし、これは、外因性ミトコンドリアの移入によってレスキューされることができた(n＝3)。
図7Eは、7SP ctrlレシピエント細胞(配列番号14)、EPC100 ctrlドナー細胞(配列番号12)、ミトコンドリア交換なしの7SP由来ρ(-)細胞(配列番号13)、及びミトコンドリア交換ありの7SP由来ρ(-)細胞(配列番号15)においてhmt10158を取り囲むヌクレオチドのDNAシークエンシングデータを示しており、これにより、7SP ctrl細胞がヘテロプラスミックであるのに対し(多数派の10158C;配列番号14)、EPC100はミトコンドリアDNAの同じ位置にTしか有さないことが明らかになった(配列番号12)。7SP細胞由来のρ(-)細胞ステムがもとのものと同じ波を表したのに対し(配列番号13)、ミトコンドリア交換7SP細胞は、主要波としてTを示した(配列番号15)。
図7Fは、hmt10158のリー症候群関連SNPを取り囲むヒトミトコンドリアDNA(配列番号16)のND3の増幅用に使用されたプライマーのhmt10085-F(配列番号17)及びhmt10184-R(配列番号20)のセット、並びにTaqMan SNPジェノタイピングアッセイ用に設計されたEPC100特異的プローブ(配列番号18)及び7SP特異的プローブ(配列番号19)を示している。ND3ペプチド配列も示されている(配列番号46)。
図7Gは、SNPアッセイによって評価された各々の細胞群におけるhmt10158ヘテロプラスミーのパーセンテージの定量を示しており、これにより、突然変異体配列のもとのヘテロプラスミーが90％超であるにもかかわらず、外因性正常配列(「健康」)がミトコンドリア交換7SP細胞において最大80％を占めることが明らかになった。模擬トランスフェクタントの場合、ヘテロプラスミーは、顕著には変化せず、ほぼ同じ比率を維持した。
図7H及び図7Iは、模擬対照で処理され、ミトコンドリア移入に供された7SP細胞での3つの独立した実験におけるヘテロプラスミーレベルパーセンテージ(図7H)及び絶対的mtDNAコピー数(図7I)の定量を示している。
図7Jは、時系列順に、水平に並べられた、図7Cに示されたタイムラプス動画からの一連の10枚の静止画像を示している。
図8Aは、もとの7SP線維芽細胞及びρ(-)7SP線維芽細胞と比較した、ρ(-)ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞における顕微鏡写真を経時的に示しており、これにより、ミトコンドリア交換細胞の増殖が対照レベル近くまで回復することが明らかになった。
図8Bは、ミトコンドリア交換を有する7SP線維芽細胞、ρ(-)7SP線維芽細胞、及びρ(-)7SP線維芽細胞におけるタイムラプス推定細胞増殖を示しており、これにより、ρ(-)7SP線維芽細胞が休止状態であるのに対し、ミトコンドリア交換7SP細胞は、12日頃に、もとの7SP線維芽細胞と同等のレベルにまで細胞増殖を回復することが明らかになった。
図8Cは、約集団倍加レベル(PDL)25の7SP線維芽細胞における老化を示しており、これは、健康なミトコンドリアの交換がPDL 8で実施されたρ(-)7SP線維芽細胞で約PDL 63に延長され、健全なミトコンドリア交換を有するρ(-)7SP線維芽細胞の寿命延長を示した。
図8Dは、PDLの増加が細胞サイズの増加をもたらし(左)、これが、ミトコンドリア交換後に逆戻りし、PDL 50を過ぎても維持される(右)ことを示している。
図8Eは、異なる起源を有する細胞を識別し、異なる種類の細胞の混入を特定する短タンデムリピート(STR)アッセイを示している。様々な時点でのミトコンドリア交換細胞におけるSTRのパターンは、もとの7SP線維芽細胞におけるSTRのパターンと完全に同一であった。
図8Fは、HeLa及びEPC100と比べた、様々なPDLについての7SP線維芽細胞及びミトコンドリア交換細胞におけるテロメラーゼのRT-PCR定量を示しており、これにより、細胞が癌細胞に形質転換しないことが示された。
図9Aは、カップリング制御プロトコル(CCP)に従ってOroboros O2kを用いるミトコンドリア交換後の様々なPDLでの7SP線維芽細胞におけるオキシグラフィーを示しており、この動態により、対照としてのもとの7SP線維芽細胞と比べて、ミトコンドリア機能が早期のPDLで降下し、その後、徐々に回復して、最終的には、ものと能力を上回ることが示された。
図9B及び図9Cは、呼吸流量(ルーチン、電子伝達系(ETS)、ROX)、自由ルーチン活性(ミトコンドリアATP産生)、プロトン漏出、及び共役効率(図9B)、並びにフラックス制御比(FCR)、ROX/E、L/E、R/E、及び(R-L)/E(図9C)によって、約PDL30の後、ミトコンドリア交換細胞(ρ(-)Mt)でほぼ対照レベルが取り戻されたことを示している。
図10Aは、基本条件下又はH2O2を用いた再灌流後のNHDF、7SP、7SP MirC細胞の顕微鏡検査画像を示しており、これは、7SP細胞がNHDF細胞と比べてH2O2に対する感受性が高いのに対し、7SP MirCはそうではないことを示している。
図10B〜図10Dは、未処理又はH2O2による処理後のアネキシンV陽性細胞及びヨウ化プロピジウム(PI)陽性細胞のFACS解析(図10B)並びにアネキシンV陽性細胞の定量(図10C)及びヨウ化プロピジウム陽性細胞の定量(PI;図10D)を示しており、これは、7SP細胞がNHDF細胞と比べてH2O2に対する感受性が高いのに対し、7SP MirCはそうではないことを示している。
図10Eは、基本条件下又は飢餓条件(EAA-)後のNHDF、7SP、7SP MirC細胞の顕微鏡検査画像を示しており、これは、7SP細胞がNHDF細胞と比べて飢餓条件に対する感受性が高いのに対し、7SP MirCはそうではないことを示している。
図10F〜図10Hは、未処理又は飢餓後のアネキシンV陽性細胞及びPI陽性細胞のFACS解析(図10F)並びにアネキシンV陽性細胞の定量(図10G)及びPI陽性細胞の定量(図10H)を示しており、これは、7SP細胞がNHDF細胞と比べて飢餓条件に対する感受性が高いのに対し、7SP MirCはそうではないことを示している。
図11は、そのPDLが約15〜20とほぼ同じである、NHDF、7SP線維芽細胞、及び7SP線維芽細胞由来MirC細胞についての、代表的なSASPサイトカインIL-6及びIL-8、ケモカインCXCL-1、並びに成長因子ICAM1の発現レベルの定量を示しており、これにより、MirCにおけるSASPの回復を示す、IL-6の有意な低下が示された。GAPDHを標準化に使用した。
図12Aは、ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞からの誘導性多能性幹細胞(iPSC)の作製のためのスキームを示している。
図12B〜12Dは、7SP線維芽細胞、7SP線維芽細胞由来MirC、又は7SP線維芽細胞に由来する模擬トランスフェクタントのいずれかから作製されたiPSCの指標としてのアルカリホスファターゼ(AP)染色及び定量を示している。AP染色細胞の微視的顕微鏡検査(図12B、左のパネル; 7SP線維芽細胞、真ん中のパネル; 7SP線維芽細胞由来MirC、右のパネル: 7SP線維芽細胞の模擬トランスフェクタント)及び巨視的顕微鏡検査(図12C、左のパネル; 7SP線維芽細胞、真ん中のパネル; 7SP線維芽細胞由来MirC、右のパネル: 7SP線維芽細胞の模擬トランスフェクタント)、並びにAP染色細胞の定量(図12D)により、XbaIR処理後のNHDF又は7SP線維芽細胞のいずれかにおけるミトコンドリア交換がAP染色の増加をもたらすことが明らかになった。
図12Eは、ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞に由来するiPSCのコロニー形成を示している。再プログラミング因子の遺伝子移入から75日及び170日後の3つの代表的なコロニーの写真。
図12Fは、ミトコンドリア交換後の7SP線維芽細胞から作製されたiPSCにおけるOCT3/4、NANOG、TRA1-80、及びTRA-160(これらは、多能性幹細胞の代表的なマーカーである)の免疫組織化学的染色を示している;
図12Gは、参照としてのもとの7SP線維芽細胞及び標準的ヒトiPSC(201B7)と比較した、7SP線維芽細胞由来MirCに由来するiPSCにおけるミトコンドリアDNAコピー数を示しており、これにより、iPSCが、標準的ヒトiPSC(201B7)のミトコンドリアDNAと同様の限られた数のミトコンドリアDNAを有することが明らかになった。
図12H及び図12Iは、再プログラミング処置から170日後の7SP線維芽細胞由来MirCに由来するiPSCにおけるヘテロプラスミーのパーセンテージ(図12H)及び絶対的mtDNAコピー数(図12I)を示しており、これにより、iPSCを形成する7SP線維芽細胞由来MirCが、少なくとも3つのコロニーで、無視してもよいレベルの突然変異ゲノム配列、全mtDNAの低下、及び100％に近いドナーmtDNAを示すことが明らかになり、MirCにおけるヘテロプラスミーの変化がもとの状態に戻り、IVFにおけるミトコンドリア交換療法と異なり得ることが示唆された。
図13Aは、ドナー細胞からレシピエント細胞へのミトコンドリア移入のためのプロトコルのスキームを示しており、ここで、ドナー細胞及びレシピエント細胞は、様々な寿命段階に由来するものである。
図13Bは、遺伝子型hmt16145 Aを有するNHDF ctrlレシピエント細胞(配列番号21)及び遺伝子型hmt16145 Gを有するTIG1 ctrlドナー細胞(配列番号22)においてhmt16145を取り囲むヌクレオチドのDNAシークエンシングデータを示している。
図13Cは、ミトコンドリア交換細胞(MirC)(「若い」TIG1ドナー細胞由来のミトコンドリアのミトコンドリア移入を有する「老いた」NHDFレシピエント細胞)由来の細胞のSNPアッセイによるhmt16145ヘテロプラスミーレベル(％)の定量を示しており、これにより、TIG1由来ミトコンドリアドナー細胞からのミトコンドリア交換を有するNHDF由来MirC細胞におけるmtDNAの90％超がhmt16145 G(すなわち、TIG1 mtDNA由来のもの)であるのに対し、NHDF ctrl細胞のmtDNAの100％がhmt16145 Aであることが示された。
図13Dは、MTS-GFP(「模擬」)もしくはMTS-XbaIR(「MirC」)でトランスフェクトされ、TIG1ドナー細胞由来の外因性ミトコンドリアと共インキュベートされたか、又はトランスフェクトされていない(「Ctrl」)、レシピエントNHDF細胞における集団倍加レベル(PDL)対時間(日)(左)及び倍加時間(時間)対集団倍加レベル(右)の定量を示している。上方向へのPDLの移動(左)及び右方向へのPDLの移動(右)によって示されるように、「老いた」正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)レシピエント細胞(PDL 41)への「若い」ドナーTIG1胚性肺細胞(PDL 10)を有するMirCは、寿命の延長を示した。
図13Eは、MTS-GFPでトランスフェクトされ、かつミトコンドリア移入されたか(「模擬」)、MTS-XbaIRでトランスフェクトされ、かつミトコンドリア移入されたか(「MirC」)、又はトランスフェクトされていない(「Ctrl」)、正常ヒト皮膚線維芽細胞における集団倍加レベル(PDL)対時間(日)(左)及び倍加時間(時間)対集団倍加レベル(右)の定量を示している。下方向へのPDLの移動(左)及び左方向へのPDLの移動(右)によって示されるように、「老いた」ドナー細胞(PDL 49)から「若い」レシピエント細胞(PDL＜21)へのミトコンドリア移入は、寿命の低下を示した。
図14Aは、MTS-EGFP及びMTS-XbaIRのmRNAの電気泳動によって測定される、インビトロ転写によって生成されるmRNAの品質評価を示している。
図14Bは、エレクトロポレーションから24時間後のT細胞のミトコンドリアにおけるMTS-GFP導入遺伝子の強い発現を示している。
図14Cは、エレクトロポレーションによるMTS-GFP mRNAのトランスフェクション後のT細胞におけるGFP発現のFACS解析を示しており、これにより、GFP発現がほぼ全てのT細胞に存在することが明らかになった。
図14Dは、DsRed標識ミトコンドリアのFACS解析を示しており、これは、MTS-XbaIRコンストラクトが内在性ミトコンドリアを強固に分解したのに対し、MTS-GFPはそうしなかったことを示している。
図14Eは、ミトコンドリア共インキュベーションの最適期間を決定するためのプロトコル設計のスキームを示している。
図14Fは、エレクトロポレーション(EP)から4時間、2日、4日、6日、及び8日後のエレクトロポレートされた対照細胞(上のパネル)及びエレクトロポレートされたMTS-GFP細胞(下のパネル)の蛍光画像を示しており、これにより、MTS-GFPコンストラクトがエレクトロポレーションから4時間以内に高発現を示し、6日目までにほぼ存在しないことが示された。
図14G及び図14Hは、GAPDHと比べた、MTS-GFP mRNAを受容した細胞におけるGFPの電気泳動(図14H)及び定量(図14G)を示している。ピーク発現は、4日目に生じ、発現は、6日目までに消失した。
図14Iは、4時間、2日(d2)、4日(d4)、6日(d6)、及び8日(d8)でのXbaIR転写物レベルの定量を示しており、エンドヌクレアーゼの転写物発現が遺伝子移入から4時間後に最も高かったことを示している。
図14Jは、MTS-XbaIに供された細胞におけるミトコンドリア含量(12S rRNA)の定量を示しており、これにより、ミトコンドリアが2日目までに約30％まで減少し、実験期間の全体を通して20％未満で維持されることが示された。
図15Aは、0日目のエレクトロポレーション、2日目の解析、7日目のミトコンドリア(mt)移入、9及び14日目のSNPアッセイ、並びに14日目のddPCRヘテロプラスミーアッセイを含む、ヒト初代T細胞のMirCプロトコルのスキームを示している。
図15Bは、ヒト初代NH T細胞対照レシピエント細胞(上;配列番号23)及びEPC100対照ドナー細胞(下;配列番号24)におけるヒトミトコンドリアDNA D-ループのHV1領域のhmtDNA 218及びhmtDNA 224を取り囲むヌクレオチドのDNAシークエンシングデータを示している。hmtDNA 218及びhmtDNA 224は、T細胞及びEPC100細胞について、それぞれ、C/C(配列番号23)及びT/T(配列番号24)である。
図15Cは、hmtDNA 218及びhmtDNA 224のSNPを取り囲むヒトミトコンドリアDNA D-ループ(配列番号25)のHV1領域の増幅用に使用されたプライマーのhmtHV1-F(配列番号26)及びhmtHV1-R(配列番号27)のセット、並びにTaqMan SNPジェノタイピングアッセイ用に設計されたSNPアッセイプライマー1-F(配列番号40)、SNPアッセイ-プライマー1-R(配列番号41)、N-末端VIC標識EPC100特異的プローブ(配列番号38)、及びN-末端FAM標識T細胞特異的プローブ(配列番号39)を示している。
図15Dは、ドナーEPC100細胞由来の外因性ミトコンドリアとの共インキュベーション後の模擬(MTS-GFP)又はMTS-XbaIR(XbaIR)処理細胞についての7日目及び12日目にレシピエント細胞に存在する外因性mtDNAの量の定量を示している。レシピエント及びドナー細胞の定量は、陽性対照として実施した。
図15Eは、Oroboros O2kを用いて実施された呼吸計測実験の定量を示しており、これにより、ヒトT細胞由来MirCにおけるATP産生及び共役効率の回復が示されたのに対し、エレクトロポレーションによるXbaIR mRNA移入によって作製されたρ(-)ヒトT細胞は、実験期間の全体を通して、ATP産生の消失を維持した。
図15F及び図15Gは、カップリング制御プロトコル(CCP)を用いた代表的な生データを示しており、これは、MirC T細胞がミトコンドリア呼吸を回復することができることを示している。
図16Aは、2日目(左のパネルの左側)、4日目(左パネルの真ん中)、及び6日目(左のパネルの右側)のRPMI1640(上)又はTexMACS(下)中で培養されたマウス初代T細胞の比較生存率(左のパネル)、又はCD3発現(右のパネル)を示しており、これにより、RPMI1640が、TexMACS培養培地と比較して、より大きい生存率及びより大きい細胞数、並びにCD3発現のわずかな増加をもたらすことが示された。
図16Bは、EPから6時間後(左上のパネル)、EPから2日後(右上のパネル)、EPから4日後(左下のパネル)、及びEPから6日後(右下のパネル)のpmax GFPのエレクトロポレーション(EP)後のT細胞(真ん中)もしくはMTS-GFPのエレクトロポレーション(EP)後のT細胞(右)、又はエレクトロポレーションなしのT細胞(左)におけるGFP発現の定量解析を示している。生存率は、2日又は4日でのMTS-GFPによるEP後に有意には影響を受けなかった。
図16Cは、エレクトロポレーションから4時間、2日、4日、及び6日後のMTS-XbaIRベクターがエレクトロポレートされたT細胞におけるXbaIRレベルのqPCR定量を示しており、これにより、XbaIR発現がゆっくりと減少することが示された。
図16Dは、MTS-XbaIRがエレクトロポレートされたT細胞における12S rRNAレベルの定量を示しており、これにより、マウスmtDNAが4日目までに約60％減少することが示された。
図16Eは、5日目にミトコンドリア共インキュベーションを用いるT細胞におけるMirC作製のため使用されたプロトコルのスキームを示している。
図16Fは、単離されたDsRed標識ミトコンドリアとの共インキュベーション後のレシピエントT細胞における飲み込まれたDsRed標識ミトコンドリアの48時間のFACS解析を示しており、これにより、エレクトロポレーションなしの対照細胞(すなわち、「付加」)の0.43％と比較して、MTS-XbaIRで外因性ミトコンドリアを発現するT細胞(右)の有意な陽性率(9.73％)が明らかになった。
図17Aは、遺伝子型mmt2766-A及びmmt2767-Tを有するマウスmtDNA C57BL6レシピエント細胞におけるND1を取り囲むヌクレオチド(「BL6」;上;配列番号34)並びに遺伝子型mmt2766-G及びmmt2767-Cを有するNZBドナー細胞におけるND1を取り囲むヌクレオチド(下;配列番号35)のDNAシークエンシングデータを示している。
図17Bは、TaqMan SNPジェノタイピングアッセイ用に設計された、多型ヌクレオチドmmt2766及びmmt2767を取り囲むマウスミトコンドリアDNA(配列番号32)のND1の増幅用に使用されたプライマーの2716-F(配列番号28)及び2883-R(配列番号33)のセット、並びにBL6特異的プローブ(配列番号29)及びNZB特異的プローブ(配列番号31)、並びに絶対的定量を可能にする標準曲線の作成用のプラスミドに該ヌクレオチド配列をクローニングするために使用されたBamH1-mND1-Fプライマー(配列番号30)を示している。ND1ペプチド配列も示されている(配列番号47)。
図17Cは、対照エレクトロポレーション(それぞれ、列1及び2)又はMTS-XbaIエレクトロポレーション及びNZB細胞由来の単離されたミトコンドリアとの共インキュベーション(それぞれ、列3及び4)から7日及び12日後のBL6レシピエント細胞におけるマウスmtND1ヘテロプラスミーレベルの定量を示している。BL6(列5)及びNZB(列6)細胞の基本レベルを対照として測定した。
図17Dは、MirCを作製するためのMTS-XbaIR mRNAによる老いたマウス細胞の処理及び若いドナー細胞由来の外因性ミトコンドリアとの共インキュベーション後のテロメア長の測定(若から老: YからO)を示しており、これにより、「老いた」親細胞と比較した、MirCのテロメア長の増加が明らかになった。
図17Eは、老いた親T細胞又はMirC由来T細胞におけるSASP関連サイトカインCXCL1、ICAM1、IL-6、及びIL-8の測定を示しており、これにより、CXCL1及びIL6がMirC由来T細胞でより少ないことが明らかになった。
図17Fは、ヒストン2 A(H2A)リン酸化抗体を用いるMirC及びもとのT細胞におけるDNA損傷応答の測定を示しており、これにより、DDRの陽性率が、もとのT細胞(4.75％)と比較して、MirCで低い(1.53％)ことが示された。
図18Aは、若いマウス由来のT細胞のACTを有する老いたマウス(第1群)、ACTを有する老いたマウス(第2群)、又は若いマウス由来の外因性ミトコンドリアが移入された老いたマウスのT細胞に由来するMirCのACTを有する老いたマウス(第3群)を用いるインビボACT実験のスキームを示している。
図18Bは、実験プロトコル中に実施された腫瘍成長イメージングの代表的な画像を示している。
図18Cは、模擬群、若いT細胞群、又はMirC群の体重を示しており、これにより、25日の実験期間中に、3つの群の間で有意差が観察されなかったことが明らかになっている。
図18D及び図18Eは、個別(図18D)及び平均(図18E)の癌集塊サイズの定量を示しており、これにより、MirC群が若いT細胞群と同等のレベルにまで癌集塊サイズを低下させるのに対し(下の線)、模擬群は、実験期間の全体を通して、癌集塊を増大させる(上の線)ことが明らかになった。
図18Fは、動物における注入されたT細胞の存在を解析するために使用されたプロトコルのスキームを示している。
図18Gは、末梢血(左パネル)又は脾臓(右パネル)のFACS解析を示している。C57BL/6マウスを用いる陰性対照(左上のパネル)、及びGFPトランスジェニックマウスを用いる陽性対照(左下のパネル)を末梢血と脾臓の両方について作成した。GFP蛍光を発現するT細胞の陽性率は、末梢血と脾臓の両方において、それぞれ、0.057％及び0.9％と認識された。
図18Hは、移植後6日目にマウスで検出された移入T細胞の免疫蛍光画像を示している。
図18Iは、1×107個又は2×107個の細胞を注射した後の末梢血(PB)又は脾臓における外因性T細胞の注入後のキメリズムのパーセンテージを示している。
図19A及び図19Bは、顕微鏡検査(図19A)又はFACS(図19B)によるX-001、Y-001、及びT-030プログラム(それぞれ、MTS-GFP1、2、及び3)又は陽性対照としてのpmax GFPもしくは陰性対照としてのCtl EPを用いる造血細胞(HSC)へのMTS-GFPトランスフェクションの評価を示しており、これにより、MTS-GFP1がHSCをエレクトロポレートするための最適なプロトコルであったことが示される。
図19Cは、EPC100細胞由来DsRed標識ミトコンドリアとの共インキュベーションから48時間後の骨髄由来Sca-1細胞の3-D共焦点蛍光イメージングを示しており、これにより、外因性ミトコンドリアが飲む込まれることが示された。
図19Dは、DsRed蛍光のFACS解析によるミトコンドリア移入効率の定量を示しており、これにより、Sca-1の約10％の亜集団が右方向への蛍光の移動を示すことが明らかになった。
図19Eは、4日目に外因性ミトコンドリアと共インキュベートし、6日目にSNPアッセイによってMirCを解析することにより、HSC由来MirCを作製するために使用されたスキームを示している。
図19Fは、c-kit+、Sca-1+、系譜-、CD34-(KSLCと呼ばれる)画分の細胞のFACSソーティングを示している。
図19Gは、KSLC画分の倍加時間が19時間であったことを示している。
図19Hは、HSC由来MirCを評価するために使用されたスキームを示している。
図19Iは、マウスKSLC由来MirC又は親レシピエントBL6細胞又はNZBドナー細胞におけるマウスmtND1ヘテロプラスミーレベルのパーセンテージの定量を示しており、これにより、MirC由来HSCが、エレクトロポレーションによるMTS-XbaI mRNAの移入後6日目に、ドナー細胞の多型遺伝子型の99.9％を発現することが示された。
図20Aは、突然変異mtDNA及び非突然変異mtDNAの配列をtRNA Leu 3243 A>Gについて正常ヒト皮膚線維芽細胞で解析したドロップレットデジタルPCRの結果の2-Dプロットを示しており、これは、非突然変異体配列の検出のみを示し(右下の四分円)、突然変異体配列の検出を示さない(左上の四分円)。
図20Bは、突然変異mtDNA及び非突然変異mtDNAの配列をND3 10158 T>Cについて正常ヒト皮膚線維芽細胞で解析したドロップレットデジタルPCRの結果の2-Dプロットを示しており、これは、非突然変異体配列の検出のみを示し(右下の四分円)、突然変異体配列の検出を示さない(左上の四分円)。
図20Cは、突然変異mtDNA及び非突然変異mtDNAの配列をATP6 9185 T>Cについて正常ヒト皮膚線維芽細胞で解析したドロップレットデジタルPCRの結果の2-Dプロットを示しており、これは、非突然変異体配列の検出のみを示し(右下の四分円)、突然変異体配列の検出を示さない(左上の四分円)。
図20Dは、突然変異mtDNA及び非突然変異mtDNAの配列をmtDNA A3243G突然変異を有するMELAS患者由来の初代皮膚線維芽細胞で解析したドロップレットデジタルPCRの結果の2-Dプロットを示しており、これは、大部分の細胞が突然変異mtDNAのホモプラスミーを有することを示している(左上の四分円)。
図20Eは、突然変異mtDNA及び非突然変異mtDNAの配列を複合体I、ND3遺伝子のmtDNA T10158C突然変異を有するリー症候群患者由来の初代皮膚線維芽細胞で解析したドロップレットデジタルPCRの結果の2-Dプロットを示しており、これにより、二重陽性細胞の少数の集団が単一細胞レベルでヘテロプラスミーを有し(右下の四分円)、多数の集団が突然変異mtDNAのホモプラスミーを有し(右下)、非突然変異mtDNAのホモプラスミーを有する集団がないこと(左下)が示された。
(5.発明の詳細な説明)
本明細書に提供されるのは、内在性mtDNAの完全な除去を必要とせず、臨床使用に適合する試薬を用いて任意に実施することができる、ミトコンドリア交換細胞(MirC)を作製するための新規かつ改善された方法である。さらに、ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される方法を用いて作製されたMirCの治療有効量を投与することを含む治療方法である。
また提供されるのは、本明細書に提供される方法によって得られる1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物である。ある実施態様において、該組成物は、外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、もしくはその組合せの取込みを増強する第二の活性作用因子、及び/又は内在性mtDNAコピー数を低下させるか、もしくは内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子を含むこともできる。さらなる実施態様において、該組成物は、外因性ミトコンドリア及び/もしくは外因性mtDNA、1以上のレシピエント細胞、又はその組合せを含むこともできる。1つの具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、機能不全ミトコンドリアと関連する疾患又は障害の治療において使用するための方法及び組成物である。しかしながら、本明細書に提供される方法及び組成物は、老化を遅延させるか、寿命を延長するか、又は機能的ミトコンドリアを有する細胞の機能を増強ために使用することもでき、かつ機能不全ミトコンドリアの交換に限定されないことが理解される。さらに、例えば、疾患モデルを作製するために、本明細書に提供される方法及び組成物を用いて、機能的ミトコンドリアを機能不全であるか又は疲弊している外因性ミトコンドリアと交換することもできる。
(5.1 定義)
別途、特に定義されない限り、本出願において使用される技術的及び科学的用語を含む用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書及び下記の実験方法で使用される命名法は、広く知られており、かつ関連分野で一般に使用されている。
本明細書で使用されるように、「ミトコンドリア交換細胞」又はMirCという用語は、内在性ミトコンドリア及び/又はmtDNAと外因性ミトコンドリア及び/又はmtDNAとの置換を有する細胞を意味することが意図される。例えば、例示的なミトコンドリア交換細胞(MirC)は、機能不全ミトコンドリアをコードする内在性mtDNA、例えば、ミトコンドリア疾患又は障害を有する対象に由来するmtDNAと、機能的ミトコンドリアをコードする外因性mtDNA、例えば、健康な対象に由来するmtDNAとの置換を伴う。例示的なMirCは、内在性ミトコンドリアが外因性ミトコンドリアで置換されている細胞を含むこともできる。しかしながら、内在性ミトコンドリア及び/又はmtDNAの置換が、例えば、異なる細胞由来の、例えば、若い対象に由来するより健康な細胞由来の機能的外因性mtDNAにより、ある細胞由来の、例えば、老いた細胞由来の機能的内在性mtDNAが置換されることを含むこともできることが理解される。例えば、ミトコンドリア疾患又は障害を模倣するために、健康な内在性ミトコンドリア及び/又はmtDNAを機能不全の外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAと置換することもできることがさらに理解される。交換が、細胞内の全ての内在性ミトコンドリアの完全な置換をもたらす必要はなく、その例示的なミトコンドリア及び/又はmtDNA交換は、約5％以上、約10％以上、約20％以上、約30％以上、約40％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、もしくは約95％、又はそれを上回る内在性ミトコンドリア及び/又はmtDNAの置換を伴う。
本明細書で使用されるように、「レシピエント細胞」、「アクセプター細胞」、及び「宿主細胞」という用語は、互換的であり、外因性ミトコンドリア及び/又はmtDNAを受容している細胞を指す。いくつかの実施態様において、外因性ミトコンドリア及び/又はmtDNAは、ドナー細胞由来の単離されたミトコンドリアに由来するものである。いくつかの実施態様において、ドナー細胞及びレシピエント細胞は、異なるものであっても、同一のものであってもよい。いくつかの実施態様において、ドナー細胞及びレシピエント細胞は、異なる種又は同じ種に由来する。いくつかの実施態様において、ドナー細胞及びレシピエント細胞は、異なる組織又は同じ組織に由来する。
本明細書で使用されるように、「健康なドナー」という用語は、ミトコンドリア疾患もしくは障害、年齢関連疾患、又はそれ以外に機能不全ミトコンドリアを有さないドナーを意味することが意図される。好ましい実施態様において、健康なドナーは、ミトコンドリアゲノムのケンブリッジ参照配列と比べて、野生型mtDNA配列を有する。
本明細書で使用されるように、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、症状の重症度、進行、拡大、及び/又は頻度の低下、症状及び/又は根本原因の消失、症状及び/又はその根本原因の発生の予防、並びに損傷の改善又は修復を指す。「治療」は、疾病、疾患、又は障害の治療的処置、及び予防的又は抑制的対策を含むことが意図される。
本明細書で使用されるように、「作用因子」という用語は、mtDNAの枯渇低下に関して使用されるとき、mtDNAを低下させることができる酵素又は化合物を指す。好ましい作用因子には、レシピエント細胞で毒性を生じることなく、1以上の部位でmtDNAを切断する、XbaIなどの制限酵素が含まれる。しかしながら、作用因子には、mtDNA合成を阻害するか又はミトコンドリアの分解を選択的に促進する酵素又は化合物も含まれ得る。
本明細書で使用されるように、「低下させる」又は「減少させる」という用語は、その用語が本明細書で定義されている場合、通常、参照レベルと比較して、少なくとも5％の減少、例えば、少なくとも約10％、又は少なくとも約20％、又は少なくとも約30％、又は少なくとも約40％、又は少なくとも約50％、又は少なくとも約60％、又は少なくとも約70％、又は少なくとも約80％、又は少なくとも約90％の減少、又は5％〜99％の間の任意の減少を意味する。本明細書で使用される部分的な低下又は内在性mtDNAを部分的に低下させる作用因子又は減少は、全ての内在性mtDNAの完全な枯渇(すなわち、ρ0細胞)をもたらすわけではないことが理解される。本明細書で使用される「増加する」という用語は、通常、少なくとも5％の増加、例えば、少なくとも約10％、又は少なくとも約20％、又は少なくとも約30％、又は少なくとも約40％、又は少なくとも約50％、又は少なくとも約60％、又は少なくとも約70％、又は少なくとも約80％、又は少なくとも約90％、又は90％超の増加を意味する。
本明細書で使用されるように、「内在性」という用語は、内部から生じること又は内部に由来することを指す。例えば、内在性ミトコンドリアは、細胞にとってネイティブであるミトコンドリアである。
本明細書で使用されるように、「外因性」という用語は、宿主にとってネイティブでない細胞材料(例えば、ミトコンドリア又はmtDNA)、例えば、外部に由来する細胞材料を指す。「外部に」は、通常、異なる源由来を意味する。例えば、ミトコンドリアゲノムが宿主細胞又は宿主ミトコンドリアと異なる細胞型又は異なる種に由来するとき、ミトコンドリアゲノムは、宿主細胞又は宿主ミトコンドリアにとって外因性である。さらに、「外因性」は、ミトコンドリアから取り出され、操作され、同じミトコンドリアに戻されるミトコンドリアゲノムを指すこともできる。
本明細書で使用されるように、「十分な期間」という用語は、所望の結果をもたらす量の時間を指す。十分な期間は、限定されないが、温度、使用される試薬の量、及び細胞型を含む、実験条件によって異なることが理解される。例示的なプロトコルは、「十分な期間」の指針として全体を通じて提供されており、当業者であれば、過度の実験を伴わずに十分である期間を特定することができるであろう。
本明細書で使用されるように、「大部分」という用語は、比較されている他の量と比べた、最大の量を意味することが意図される。2つの群を比較しているときの例示的な大部分は、その間の任意の整数を含む、全集団の約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、もしくは約90％以上、又は約95％以上を上回る任意の整数である量である。大部分は、比較されている全集団によって決まり、3以上の群が比較されているとき、50％未満の量であり得ることが理解される。
本明細書で使用されるように、「非侵襲的に」という用語は、外因性材料の移入との関連で使用されるとき、侵襲的器具(例えば、ナノブレイドもしくはエレクトロポレーション)、物理的力(例えば、遠心分離)、又は有害な培養条件(例えば、熱ショック)を使用しないことを意味することが意図される。好ましい実施態様において、非侵襲的移入手順は、レシピエント細胞とドナーミトコンドリアの共インキュベーションを伴う。
本明細書で使用されるように、「ミトコンドリア交換を必要としている対象」という用語は、機能不全ミトコンドリアを有するか又は機能不全ミトコンドリアを有する素因がある対象を意味することが意図される。ミトコンドリア交換を必要としている対象は、無症状で、かつ予防的ケアを必要としていてもよい。ミトコンドリア交換を必要としている対象はまた、無症状で、かつ治療を必要としていてもよい。ある実施態様において、ミトコンドリア交換を必要としている対象は、年齢関連疾患又はミトコンドリア疾患もしくは障害の結果ではない機能不全ミトコンドリアを有する。
本明細書で使用されるように、「対象」という用語は、哺乳動物を意味することが意図される。対象、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、又はこれらのトランスジェニック種であることができる。「対象」は、「患者」、例えば、ヒト患者を指すこともできることが理解される。
本明細書で使用されるように、「有効量」という用語は、ヘテロプラスミー及び/又は機能不全ミトコンドリアと関連する任意の疾患又は障害を調節、治療、又は改善するのに有効な本発明の組成物の量を指す。したがって、有効量は、例えば、治療における有効量を指す治療有効量、又は生物学的効果についての有効量を指す生物学的有効量を含むことができる。「治療有効量」及び「有効量」という用語は、治療全体を改善するか、症状又は疾患もしくは障害の原因を低下させもしくは回避するか、或いは別の治療剤の治療効力を増強する量を包含することができる。そのような量に対応する所与の組成物の量は、例えば、所与の組成物、医薬製剤、投与経路、疾病、疾患、又は障害のタイプ、治療を受けている対象又は宿主の同一性などの様々な因子によって異なるが、それでも、当業者によってルーチンに決定されることができる。本明細書で定義されているように、作用因子の治療有効量は、当技術分野で公知のルーチンの方法によって、当業者により容易に決定されることができる。
本明細書で使用されるように、「年齢関連疾患」という用語は、加齢に起因する任意の数の疾病を指す。これらの疾病としては、限定されないが、骨粗鬆症、骨量減少、関節炎、関節硬直、白内障、黄斑変性症、真性糖尿病を含む代謝性疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病を含む神経変性疾患、免疫老化、並びにアテローム性動脈硬化症及び脂質異常症を含む心臓疾患が挙げられる。「年齢関連疾患」という語句は、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病及び関連障害、ALS、ハンチントン病、パーキンソン病、並びに癌をさらに包含する。
本明細書で使用されるように、「自己免疫疾患」という用語は、個体自身の組織、器官に対する免疫反応に起因する疾患もしくは障害、又はその発現、又はその結果として生じる状態を意味することが意図される。自己免疫疾患は、自己免疫抗原もしくはそのエピトープと反応する自己抗体の産生に起因するか、又はそれによって悪化する状態を指すこともできる。自己免疫疾患は、組織もしくは器官特異的であることができ、又はそれは、全身性自己免疫疾患であることができる。全身性自己免疫疾患としては、結合組織疾患(CTD)、例えば、全身エリテマトーデス(狼瘡;SLE)、混合性結合組織疾患、全身性硬化症、多発性筋炎(PM)、皮膚筋炎(DM)、及びシェーグレン症候群(SS)が挙げられる。さらなる例示的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ及び抗好中球細胞質抗体(ANCA)多発性血管炎がさらに挙げられる。
本明細書で使用されるように、「遺伝性疾患」という用語は、核ゲノム中の異常、例えば、突然変異によって引き起こされる疾患を指す。例示的な遺伝性疾患としては、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、及びハンチントン病が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるように、「癌」という用語は、固形癌及び血行性癌を含むが、これらに限定されない。「癌」及び「癌性」という用語は、制御されない細胞増殖を典型的に特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、又はそれを説明するものである。
本明細書で使用されるように、「ミトコンドリア疾患又は障害」及び「ミトコンドリア障害」という用語は、互換的であり、身体の領域内のエネルギー不足を引き起こすミトコンドリアの遺伝的又は後天的損傷によって引き起こされる疾病群を指す。ミトコンドリア疾患又は障害による影響を受ける例示的な器官としては、大量のエネルギーを消費する器官、例えば、肝臓、筋肉、脳、目、耳、及び心臓が挙げられる。この結果は、肝不全、筋衰弱、疲労、並びに心臓、耳、及び様々な他の系に関する問題となることが多い。
本明細書で使用されるように、「ミトコンドリアDNA異常」という用語は、その産物がミトコンドリアに局在し、かつ健康な対象の細胞では観察されない、ミトコンドリア遺伝子の突然変異を指す。ミトコンドリアDNA異常と関連する例示的な疾患としては、例えば、慢性進行性外眼筋麻痺(CPEO)、ピアソン症候群、カーンズ・セイヤー症候群(KSS)、糖尿病及び難聴(DAD)、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、LHON-プラス、ニューロパチー、運動失調症、及び網膜色素変性症症候群(NARP)、突然変異体mtDNAによって引き起こされるリー症候群としても知られる母性遺伝性リー症候群(MILS)、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、及び卒中様発作(MELAS)、ミオクローヌスてんかん及び赤色ぼろ線維疾患(MERRF)、家族性両側線条体壊死/線条体黒質変性症(FBSN)、ルフト病、アミノグリコシド誘発性難聴(AID)、並びにミトコンドリアDNA多重欠失症候群が挙げられる。
本明細書で使用されるように、ミトコンドリア疾患又は障害との関連における「核DNA異常」という用語は、その産物がミトコンドリアに局在する核遺伝子の突然変異又はコード配列の変化を指す。核突然変異と関連する例示的なミトコンドリア疾患又は障害としては、ミトコンドリアDNA枯渇症候群-4A、ミトコンドリア劣性運動失調症候群(MIRAS)、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症(MNGIE)、ミトコンドリアDNA枯渇症候群(MTDPS)、DNAポリメラーゼγ(POLG)関連障害、感覚性運動失調型ニューロパチー構音障害眼筋麻痺(SANDO)、脳幹及び脊髄の障害並びに乳酸上昇を伴う白質脳症(LBSL)、補酵素Q10欠損症、リー症候群(核突然変異によって引き起こされる)、ミトコンドリア複合体異常、フマラーゼ欠損症、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体(KGDHC)欠損症、スクシニル-CoAリガーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症(PDHC)、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症(PCD)、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT I)欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII(CPT II)欠損症、カルニチン-アシル-カルニチン(CACT)欠損症、常染色体優性/常染色体劣性進行性外眼筋麻痺(ad-/ar-PEO)、乳児発症性脊髄小脳萎縮症(IOSCA)、ミトコンドリアミオパチー(MM)脊髄性筋萎縮症(SMA)、成長遅延、アミノ酸尿症、胆汁鬱滞、鉄過負荷、早期死亡(GRACILE)、並びにシャルコー・マリー・トゥース病2A型(CMT2A)が挙げられる。
本明細書で使用されるように、「機能不全ミトコンドリア」という用語は、機能的ミトコンドリアと反対であるミトコンドリアを指す。例示的な機能不全ミトコンドリアには、酸化的リン酸化によってATPを合成することができないか又は不十分な量のATP合成するミトコンドリアが含まれる。本明細書で使用されるように、「機能的ミトコンドリア」という用語は、酸素を消費し、ATPを産生するミトコンドリアを指す。
本明細書で使用されるように、「突然変異」という用語は、変異体(「突然変異体」とも呼ばれる)形態を結果として生じる遺伝子構造の何らかの変化を指す。遺伝子の突然変異は、DNAの単一塩基の変化、又は遺伝子もしくは染色体のより大きい部分の欠失、挿入、もしくは再配列によって引き起こされ得る。いくつかの実施態様において、突然変異は、機能又は結果として生じるタンパク質に影響を及ぼすことができる。例えば、タンパク質のコード領域中のDNAの単一ヌクレオチドの突然変異(すなわち、点突然変異)は、異なるアミノ酸をコードするコドン(すなわち、ミスセンス突然変異)を生じることができる。この異なるアミノ酸は、タンパク質の構造を変化させることができるということ、及び本明細書に記載されるようなある状況において、ミトコンドリアなどのオルガネラの機能を変化させることができるということが理解される。
本明細書で使用されるように、「ヘテロプラスミー」及び「ヘテロプラスミック」という用語は、個体又は試料における複数のタイプのミトコンドリアDNAゲノムの発生を指す。様々な程度のヘテロプラスミーは、本明細書に記載される様々な程度の生理的状態と関連する。ヘテロプラスミーは、当技術分野に公知の手段によって同定することができ、特定のヌクレオチドアレルと関連する生理的状態の重症度は、個体内のそのような関連アレルのパーセンテージによって異なると考えられる。
本明細書で使用されるように、ミトコンドリアDNAとの関連で使用される場合の「野生型」という用語は、それが天然で生じるような種の典型的な形態の遺伝子型を指す。野生型ヒトmtDNAゲノムの例示的な参照ゲノムとしては、ケンブリッジ参照配列(CRS)が挙げられる。
本明細書で使用されるように、「老いた」又は「より老いた」という用語は、mtDNAの源が、レシピエント細胞よりも年齢が高い対象に由来するものであるか、又はレシピエント細胞と比べて、そのインビトロ培養以来、より多くの回数(すなわち、集団倍加レベル、PDL)、その集団を倍加させた細胞の集団内の細胞に由来するものであることを意味することが意図される。
本明細書で使用されるように、「若い」又は「より若い」という用語は、mtDNAの源が、レシピエント細胞よりも年齢が低い対象に由来するものであるか、又はレシピエント細胞と比べて、そのインビトロ培養以来、より少ない回数(すなわち、集団倍加レベル、PDL)、その集団を倍加させた細胞の集団内の細胞に由来するものであることを意味することが意図される。
本明細書で使用されるように、ミトコンドリアとの関連で使用される場合の「単離された」という用語は、その天然の生物学的環境の他の細胞成分から物理的に分離又は除去されているミトコンドリアを指す。
本明細書で使用されるように、「無傷」及び「無傷のミトコンドリア」という用語は、外膜及び内膜、膜間空間、(内膜によって形成される)クリステ、並びにマトリックスを含むミトコンドリアを指す。例示的な無傷のミトコンドリアは、mtDNAを含有する。好ましい実施態様において、無傷のミトコンドリアは、機能的ミトコンドリアである。しかしながら、無傷の機能不全ミトコンドリアを本発明で使用することもできることが理解される。
本明細書で使用されるように、「自己」という用語は、同じ対象から得られた生物学的組成物を意味することが意図される。
本明細書で使用されるように、「同種異系」という用語は、同じ種から得られた生物学的組成物であるが、該生物学的組成物を受容する対象の遺伝子型とは異なる遺伝子型を意味することが意図される。
本明細書で使用されるように、「動物細胞」という用語は、真核生物由来の任意の細胞を意味することが意図される。動物細胞は、哺乳動物及び非哺乳動物種、例えば、両生類、魚類、昆虫(例えば、ドロソフィラ)、及び蠕虫(例えば、線虫(Caenorhabditis elegans))を含むことができることが理解される。
本明細書で使用されるように、「融合タンパク質」という用語は、必ずしもそうではないが、主に、ペプチド結合によって互いに接続されたアミノ酸の配列を指し、ここで、該配列のある部分は、1つの起源(天然又は合成)に由来し(すなわち、配列との配列類似性を有し)、配列の別の部分は、1以上の他の起源に由来する。例示的な融合タンパク質は、本質的に全ての結合がペプチド結合となるように、融合タンパク質の全体をコードする(両方の部分、例えば、ミトコンドリア標的化配列とエンドヌクレアーゼをコードする)発現ベクターの構築によって調製することができる。融合体は、例えば、ペプチドをコンジュゲートするために使用される公知の方法のいずれかを使用することによる化学的コンジュゲーションによって作製することができることも理解される。
本明細書で使用されるように、「ミトコンドリア標的化配列(mitochondrial-targeted sequence)(MTS)」及び「ミトコンドリア標的化配列(mitochondrial targeting sequence)(MTS)」という用語は、互換的であり、それに付着した酵素、ペプチド、配列、又は化合物のミトコンドリアへの輸送を生じさせる任意のアミノ酸配列を指す。ある実施態様において、MTSは、ヒトMTSである。別の実施態様において、MTSは、別の種に由来するものである。そのような配列の非限定的な例は、シトクロムcオキシダーゼサブユニットX(COX10)MTS
Figure 2021533827
 及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII(COX8)MTS
Figure 2021533827
 である。MTS配列の別の非限定的な例は、核DNAによってコードされ、細胞質で翻訳され(産生され)、ミトコンドリアに輸送される各々の個々のミトコンドリアタンパク質、並びにシトレートシンターゼ(cs)、リポアミドデイドロゲナーゼ(LAD)、及びC6ORF66(ORF)の天然のMTSである。様々なMTSは、その中の各々のミトコンドリア酵素について交換可能であり得る。各々の可能性は、本発明の使用のための融合タンパク質の別々の実施態様を表す。
本明細書で使用されるように、「小分子」という用語は、生物学的プロセスに影響を及ぼし、かつ約900ダルトン以下の分子量を有する化合物を指す。例示的な小分子は、約300〜約700ダルトンの分子量を有する。
本明細書で使用されるように、数字と併用される場合の「約(about)」又は「約(approximately)」という用語は、言及された数字の1、5、10、15、又は20％以内の任意数字を指す。
本明細書で使用されるように、「体細胞」という用語は、幹細胞、前駆細胞、並びに生殖系列細胞(すなわち、卵原細胞及び精原細胞)並びにこれらに由来する細胞(例えば、卵母細胞、精子)とは別に、生物の体を形成する任意の分化細胞を指す。例えば、内部器官、皮膚、骨、血液、及び結合組織は全て、体細胞で構成されている。体細胞は、動物、好ましくは、ヒト対象から得られ、当業者に利用可能な標準的な細胞培養プロトコルに従って培養される。
本明細書で使用されるように、「エンドサイトーシス経路」という用語は、細胞がその周囲から分子を取り入れる細胞プロセスを指す。エンドサイトーシス経路は、形質膜を曲げて、分子を吸収する小胞にするのを助けるためにクラスリンの動員を必要とする「クラスリン依存的」なもの、又はクラスリンの動員を必要としない「クラスリン非依存的」なものであることができる。例示的なタイプのクラスリン非依存的エンドサイトーシスとしては、例えば、マクロピノサイトーシスが挙げられる。本明細書で使用される「エンドサイトーシスのアクチベーター」という用語は、例えば、エンドサイトーシス経路が増加するように、エンドサイトーシス経路又はプロセスを誘導又は活性化する作用因子を指す。例示的な「エンドサイトーシスのアクチベーター」は、細胞外環境からのミトコンドリア取込みを増大させる。
本明細書で使用されるように、「マクロピノサイトーシス」という用語は、溶質分子、栄養素、及び抗原の非選択的取込みを媒介するクラスリン非依存的な形態のエンドサイトーシスを指す。
本明細書で使用されるように、「化合物」という用語は、所望の生物学的機能もたらすことができる化合物を指す。この用語は、DNA、RNA、タンパク質、ポリペプチド、及び成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は小分子を含む他の化合物を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるように、「ペプチド」という用語、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、拘束されている(すなわち、例えば、βターンもしくはβプリーツシートを引き起こすアミノ酸の存在のような、又は例えば、ジスルフィド結合したCys残基の存在によって環化した、構造のいくつかのエレメントを有する)或いは拘束されていない(例えば、線状もしくは構造化されていない)アミノ酸配列を指すために、互換的にかつその最も広い意味で使用されている。ポリペプチドを構成するアミノ酸は、天然由来のものであってもよいし、又は合成されたものであってもよい。ポリペプチドは、生物学的試料から精製することができる。ポリペプチド、タンパク質、又はペプチドは、修飾されたポリペプチド、タンパク質、及びペプチド、例えば、糖ポリペプチド、糖タンパク質、もしくは糖ペプチド;又はリポポリペプチド、リポタンパク質、もしくはリポペプチドも包含する。
本明細書で使用されるように、「調節する」、「調節」、「モジュレーター」、及び「調節すること」という用語は、基本的なホメオスタシス状態の性質又は組成の変化を意味することが意図される。例示的な調節には、細胞代謝が顕著に低下するような、ホメオスタシスの破壊による細胞代謝の変化が含まれる。「モジュレーター」という用語は、インヒビター及びアクチベーターを含む。インヒビターは、例えば、所望のタンパク質、経路、もしくはプロセスの発現もしくは修飾を阻害し、又は結合し、刺激を部分的にもしくは完全に遮断し、活性化を減少させ、妨害し、遅延させ、記載されている標的タンパク質、経路、もしくはプロセスの活性を不活化し、鈍感にし、もしくは下方調節する作用因子である。ある実施態様において、インヒビターは、標的タンパク質、経路、又はプロセスのアンタゴニストである。アクチベーターは、例えば、記載されている標的タンパク質、経路、もしくはプロセスの発現もしくは修飾を誘導もしくは活性化し、又は結合し、インヒビター活性の活性化を刺激し、増大させ、開始し、活性化し、促進し、増強し、記載されている標的タンパク質(もしくはコードポリヌクレオチド)、経路、もしくはプロセスの活性を敏感にし、もしくは上方調節する作用因子である。ある実施態様において、アクチベーターは、標的タンパク質、経路、又はプロセスのアゴニストである。モジュレーターには、天然及び合成のリガンド、アンタゴニスト、及びアゴニスト(例えば、アゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとして機能する小化学分子、抗体など)が含まれる。モジュレーターは、生物学的(例えば、抗体)又は化学的であり得ることがさらに理解される。
本明細書で使用されるように、「の前」という用語は、意図される事象が開始される前に所望の結果又は効果が完全に消散することなく、所望の結果(例えば、抗生物質選択)又は効果(例えば、生物学的効果)を達成し、持続するのに十分な時間となるような、事象の開始に先行する期間を意味することが意図される。例えば、例示的な状況において、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの移入の前に細胞代謝を調節することは、例えば、生物学的効果を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの移入が生じる前のホメオスタシス状態に復帰させることなく、所望の生物学的効果を示す(例えば、S6キナーゼのリン酸化を増大させる)のに十分な期間を含むことが理解される。
本明細書で使用されるように、「栄養ストレス」という用語は、オートファジー、AMPKシグナル伝達、及び/又はmTORシグナル伝達経路の誘導などの細胞ホメオスタシスの混乱を生じさせるのに十分な栄養の欠乏又は栄養飢餓状態を指す。例示的な栄養ストレス状態としては、血清飢餓、必須アミノ酸の除去、及び/又は代謝経路の崩壊が挙げられる。
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、2つの天然の核酸のものと類似した配列特異的な様式で天然の核酸とハイブリダイズすることができる、例えば、ワトソン・クリック型塩基対形成相互作用に関与することができる、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドから構成される任意の長さのポリマー、又は合成によって産生される化合物を説明するために本明細書で互換的に使用されている。ポリヌクレオチド配列との関連において本明細書で使用されるように、「塩基(bases)(又は「塩基(base)」)」という用語は、「ヌクレオチド(nucleotides)」(又は「ヌクレオチド(nucleotide)」)、すなわち、ポリヌクレオチドのモノマーサブユニットと同義である。ヌクレオチドとの関連で使用される場合の「A」という略語は、アデニン(A)を意味することが意図される。ヌクレオチドとの関連で使用される場合の「G」という略語は、グアニン(G)を意味することが意図される。ヌクレオチドとの関連で使用される場合の「C」という略語は、シトシン(C)を意味することが意図される。ヌクレオチドとの関連で使用される場合の「T」という略語は、チミン(T)を意味することが意図される。
担体との関連で使用される場合の「医薬として許容し得る」という用語は、担体、希釈剤、又は賦形剤が製剤の他の成分と適合性があり、かつそのレシピエントにとって害のないものでなければならないことを意味することが意図される。
本明細書に提供される実施態様の実施は、別途示されない限り、当業者の技能の範囲内である、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来の技法を利用する。そのような技法は、文献中で十分に説明されている。特に好適な参考用テキストの例としては、以下のもの: Sambrookらの文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001); Ausubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999); Glover編、DNAクローニング(DNA Cloning)、第I巻及び第II巻(1985); Gait編、オリゴヌクレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)(1984); Hames及びHiggins編、核酸ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)(1984); Hames及びHiggins編、転写及び翻訳(Transcription and Translation)(1984); Freshney編、動物細胞培養:固定化細胞及び酵素(Animal Cell Culture: Immobilized Cells and Enzymes)(IRL Press, 1986); Kallenらの文献、植物分子生物学−実験室マニュアル(Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual)(Melody S. Clark編; Springer-Verlag, 1997);細胞における免疫化学的方法及び分子生物学(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology)(Academic Press, London); Scopesの文献、タンパク質精製:原理及び実践(Protein Purification: Principles and Practice)(Springer Verlag, N.Y.、第2版、1987);並びにWeir及びBlackwell編、実験免疫学のハンドブック(Handbook of Experimental Immunology)、第I巻〜第IV巻(1986)が挙げられる。
(5.2 ミトコンドリア交換細胞(MirC)を作製する方法)
本発明は、内在性ミトコンドリアDNA(mtDNA)を低下させる作用因子を含む、内在性ミトコンドリアの機能を低下させる任意の作用因子が外因性ミトコンドリアの非侵襲的移入を増強し得るという発見に一部基づいている。しかしながら、ρ(0)細胞の場合のような内在性mtDNAの完全な枯渇は、この増強を妨害する。これは、外因性ミトコンドリアの非侵襲的移入がエネルギー依存的であり、内在性mtDNAの完全な枯渇が非侵襲的移入プロセスを促進するために利用可能なエネルギーを大きく制限するからである。同様に、外因性ミトコンドリアの非侵襲的移入は、ミトコンドリア機能及び/又はmtDNAが混乱しない場合、例えば、ミトコンドリアが単に共インキュベートされる(すなわち、「付加」)か又は遠心分離によって添加される場合も非効率的である。
したがって、本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア交換細胞(MirC)を作製する方法であって、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子又はミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること;(b)該レシピエント細胞を、該作用因子が、該レシピエント細胞において、それぞれ、該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるか又は該内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、インキュベートすること;及び(c)(1)それぞれ、該内在性mtDNA又は該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来のレシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することを含むことができる、方法である。また本明細書に提供されるのは、ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、上記の工程(a)及び(b)を実施すること、並びにその後、(c)(1)それぞれ、該内在性mtDNA又は該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来のレシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することを含む、方法である。ある実施態様において、外因性mtDNAは、外因性ミトコンドリアによって移入される。
MirCの作製は、種々の用途に有用な戦略であることができる。例として、レシピエント細胞への外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、又はその組合せの移入は、例えば、機能不全であり、かつ/又は突然変異体mtDNAから構成される内在性ミトコンドリアを、機能的ミトコンドリア、例えば、野生型mtDNAから構成されるミトコンドリアと交換する際に有用であることができる。ある実施態様において、本明細書に提供される方法は、機能不全ミトコンドリアをコードする内在性mtDNAを有するレシピエント細胞で実施される。具体的な実施態様において、内在性mtDNAは、突然変異体mtDNAである。ある実施態様において、内在性mtDNAは、ヘテロプラスミックであり、かつ野生型mtDNAと突然変異体mtDNAの両方から構成される。
上記のように、ある用途において、外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、又はその組合せの移入は、例えば、機能不全であるか、又は突然変異体mtDNAから構成される内在性ミトコンドリアを交換するための機能的ミトコンドリア又は野生型mtDNAの移入を伴うことができる。したがって、ある実施態様において、外因性mtDNAは、野生型mtDNAである。他の実施態様において、レシピエント細胞の内在性ミトコンドリアは、野生型mtDNA及び機能不全の内在性ミトコンドリアを有する。例えば、野生型mtDNAを有するレシピエント細胞の例示的な機能不全ミトコンドリアは、ミトコンドリアタンパク質をコードする突然変異体核DNA、又は加齢もしくは疾患などの副次的効果によって生じる機能不全ミトコンドリアを含むことができる。
それゆえ、機能不全であるか、突然変異体mtDNAから構成されるか、又はその組合せである内在性ミトコンドリアは、本明細書に記載される方法を用いて交換することができる。ミトコンドリア機能不全は、多くの要因の結果として起こることができる。非限定的な例としては、疾患(例えば、年齢関連疾患、ミトコンドリア疾患又は障害、神経変性疾患、網膜疾患、遺伝性疾患)、糖尿病、聴覚障害、又はこれらの任意の組合せによるミトコンドリア機能不全が挙げられる。ミトコンドリア機能不全は、5％超、10％超、20％超、30％超、40％超、50％超、60％超、70％超、80％超、又は90％超低下している内在性ミトコンドリアの機能を含むことができる。それゆえ、いくつかの実施態様において、内在性ミトコンドリアは、機能が、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、又は約100％低下しているミトコンドリアを含む。
本明細書に提供される方法は、ホモプラスミックmtDNAとヘテロプラスミックmtDNAの両方に適用可能である。具体的な実施態様において、内在性mtDNAは、単一のタイプのmtDNAである(すなわち、内在性mtDNAは、ホモプラスミックである)。他の具体的な実施態様において、内在性mtDNAは、複数のタイプのmtDNAを含む(すなわち、内在性mtDNAは、ヘテロプラスミックである)。いくつかの実施態様において、ヘテロプラスミックmtDNAは、野生型mtDNAと突然変異体mtDNAの両方を含む。通常、突然変異体mtDNAの比率は、表現型の重症度を決定し、ミトコンドリア機能が低下する程度に影響を及ぼすことができる。例えば、いくつかの実施態様において、ヘテロプラスミックmtDNAは、5％の突然変異体mtDNAと95％の野生型mtDNAであり、ミトコンドリア機能は、5％低下する。他の実施態様において、ヘテロプラスミックmtDNAは、55％の突然変異体mtDNAと45％の野生型mtDNAであり、ミトコンドリア機能は、55％低下する。しかしながら、突然変異体mtDNAのパーセンテージは、ミトコンドリア機能と比例する必要はないことが理解される。
機能不全ミトコンドリアは、ルーチン、電子伝達鎖における効率の消失及びアデノシン-5'-三リン酸(ATP)などの高エネルギー分子の合成の低下、有害な活性酸素種(ROS)の漏出、並びに/又は細胞呼吸の破壊を特徴とする。当業者であれば、ミトコンドリア機能をどのように評価するかということを理解しているであろう。例えば、単一の実験における基礎酸素消費、解糖速度、ATP産生、及び呼吸容量の決定のために実施される、Seahorse Bioscience XF Extracellular Flux Analyzerなどの細胞ベースのアッセイを用いて、ミトコンドリア機能不全を評価することができる。同様に、Oroboros 02K呼吸活性測定器を用いて、定量的な機能的ミトコンドリア診断を確定することもできる。上記のアッセイ例は、例示的なものであり、ミトコンドリア機能を評価するための方法の全てを含むものではないことが理解される。
いくつかの実施態様において、機能的ミトコンドリアは、無傷の外膜を有する。いくつかの実施態様において、機能的ミトコンドリアは、無傷のミトコンドリアである。別の実施態様において、機能的ミトコンドリアは、時間とともに増加する割合で酸素を消費する。別の実施態様において、ミトコンドリアの機能性は、酸素消費によって測定される。別の実施態様において、ミトコンドリアの酸素消費は、限定されないが、MitoXpress蛍光プローブ(Luxcel)などの、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。いくつかの実施態様において、機能的ミトコンドリアは、ADP及び限定されないが、グルタメート、マレート、又はスクシネートなどの基質の存在下で酸素消費の速度の増大を示すミトコンドリアである。各々の可能性は、本発明の別々の実施態様を表す。別の実施態様において、機能的ミトコンドリアは、ATPを産生するミトコンドリアである。
本明細書に提供される方法は、機能不全ミトコンドリア(mitochondrial)、突然変異体mtDNA、又はその組合せを有するレシピエント細胞からMirCを作製する際に有用であり得るが、MirC作製が機能不全ミトコンドリアを有するレシピエント細胞で実施される必要がないことも理解される。いくつかの実施態様において、MirCは、機能的な内在性ミトコンドリア、野生型mtDNA、又はその組合せレシピエント細胞を用いて作製され、外因性ミトコンドリアも機能的であるか、野生型mtDNAを含有するか、又はその組合せである。例えば、内在性野生型mtDNAを、本明細書に提供される方法を用いて低下させることができ、健康なドナー細胞(例えば、比較的低いPDLを有する若い細胞)由来の外因性mtDNAを用いる「老いた」レシピエント細胞(例えば、加齢した対象由来の細胞又は比較的高い集団倍加レベル(PDL)を有する細胞)におけるミトコンドリア交換など、外因性野生型mtDNAをレシピエント細胞に移入することができる。したがって、ある実施態様において、外因性mtDNAは、健康なドナー細胞であるドナー細胞、例えば、レシピエント細胞よりも若いドナー細胞由来のものである。ある実施態様において、ドナー及びレシピエント細胞は、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約5倍、又は5倍超のPDLの差を有する。他の実施態様において、ドナー及びレシピエント細胞は、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約5倍、又は5倍を超えて年が離れている対象由来のものである。しかしながら、ドナー細胞とレシピエント細胞の年の差は必要条件ではないことが理解される。いくつかの実施態様において、ドナー及びレシピエント細胞は、同じ年齢であり、ドナー細胞は、健康な細胞である。
また他の実施態様において、MirCの作製は、機能的な内在性ミトコンドリア、例えば、野生型内在性mtDNAを有するレシピエント細胞で実施され、外因性mtDNAが突然変異体であるか、機能不全ミトコンドリアをコードするか、外因性ミトコンドリアが機能不全であるか、又はその組合せである。他の実施態様において、外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、又はその組合せは、レシピエント細胞よりも老いているドナー細胞由来のものである。例えば、いくつかの実施態様において、ミトコンドリア疾患又は障害のモデルは、レシピエント細胞の機能的ミトコンドリアと、突然変異体であり、かつ/又は機能不全ミトコンドリアをコードするドナー細胞由来の外因性mtDNAとの交換によって作出することができる。本明細書に記載される例は、例示的なものであり、mtDNA交換を伴う全ての組合せを含むものではないことが理解される。
本明細書に提供されるように、MirCを作製する方法は、内在性mtDNAを低下させる作用因子、又は内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子のいずれかを用いて実施することができる。ある状況において、2つの作用因子の組合せを使用することができる。ミトコンドリア機能を低下させることができる作用因子は、当技術分野で周知であり、当業者の技能の範囲内である。例示的な作用因子としては、ADPもしくは脱共役剤、例えば、複合体IIIのインヒビター(例えば、ミキソチアゾール)、複合体IVのインヒビター(例えば、アジ化ナトリウム、シアン化カリウム(KCN))、もしくは複合体Vのインヒビター(例えば、オリゴマイシン)のいずれか; ADPを添加した後の酸素消費の爆発を無効化するが、脱共役剤によって刺激される呼吸に対する影響がないリン酸化のインヒビター;無傷のミトコンドリアで観察される呼吸鎖とリン酸化系の間の強制的連関を無効化する脱共役剤(例えば、ジニトロフェノール、CCCP、FCCP); ATPの流出もしくはミトコンドリア内膜を横断する原料の流入のいずれかを妨害するATP/ADP輸送体インヒビター、例えば、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼインヒビター(例えば、アトラクチロシド);内膜が通常は横断することができない化合物を透過するようにするイオノフォア(例えば、バリノマイシン、ニゲリシン);又は1以上のTCA回路酵素、もしくは付随的反応を遮断するクレブス回路インヒビター(例えば、アーセナイト、アミノオキシアセテート)の存在下で呼吸を遮断するミトコンドリア呼吸鎖のインヒビターが挙げられる。上記のミトコンドリア機能を低下させることができる作用因子は非限定的であること、及び当業者は、当技術分野で公知の技法を用いて、ミトコンドリア機能を低下させることができる好適な作用因子を容易に同定することができることが理解される。
具体的な実施態様において、内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、内在性ミトコンドリア機能を一過性に低下させる。他の実施態様において、内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、内在性ミトコンドリア機能を恒久的に低下させる。好ましい実施態様において、内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させる。
様々な作用因子を用いて、mtDNAを低下させることができる。ある実施態様において、mtDNAを低下させる作用因子は、ミトコンドリア標的化配列(MTS)とエンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質、エンドヌクレアーゼ、又は小分子をコードする核酸から選択される。ある実施態様において、小分子は、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)である。核酸は、メッセンジャーリボ核酸(mRNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)であることができる。ある実施態様において、mtDNAを低下させる作用因子は、エンドヌクレアーゼをコードするプラスミドDNA発現ベクターカセットである。好ましい実施態様において、該作用因子は、MTSとともにエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドDNA発現ベクターカセットである。様々な発現ベクターカセットを使用することができ、当業者であれば、宿主細胞に応じてエンドヌクレアーゼの発現の成功を可能にするために要求される必要な考慮を理解しているであろう。例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、又はCAGプロモーターを有するベクターなどの哺乳動物発現ベクターは、非哺乳動物細胞ではなく、哺乳動物でのエンドヌクレアーゼの発現に好適であろう。同様に、ウイルス発現ベクターを使用することもできることが理解され、当業者であれば、そのようなウイルス発現ベクターが移入プラスミドとタンデムに使用されるヘルパープラスミド(すなわち、エンベロープ及びパッケージングプラスミド)を必要とし得ることを理解しているであろう。他の実施態様において、該作用因子は、エンドヌクレアーゼをコードするmRNAである。他の好ましい実施態様において、該作用因子は、MTSとともにエンドヌクレアーゼをコードするmRNAである。またさらなる実施態様において、該作用因子は、組換えタンパク質であるエンドヌクレアーゼである。他の実施態様において、該作用因子は、例えば、mtDNAの合成を混乱させる小分子などの小分子である。発現方法のいずれかを作成するための技法は、当業者に公知であり、過度な実験を伴うことなく、容易に実施されることができる。好ましい実施態様において、該作用因子は、臨床使用に好適である。
具体的な実施態様において、エンドヌクレアーゼは、例えば、以下のDNA配列:
Figure 2021533827
 を切断するXbaIなどの、特異的部位でDNA二重らせんを切断して断片にする制限酵素であることができる。エンドヌクレアーゼとしては、例えば、XbaI以外の制限酵素、例えば、EcoRI、BamHI、HindIII、又はPstIを挙げることもでき、これらは全て、複数の部位でmtDNAを消化する。エンドヌクレアーゼは、規定の認識部位を有し、これにより、mtDNAに対するその感度の予測が可能にある。例えば、XbaI、EcoRI、及びSmaIなどの制限酵素の規定の認識部位は、所与の核酸配列に特異的である。したがって、いくつかの実施態様において、内在性mtDNAの低下は、DNAヌクレアーゼへと組み合わされているジンクフィンガー及び転写アクチベーター様エフェクター(TALE)を用いて行われることができる。これら2つのタイプのDNA結合タンパク質は、対象となる新しいDNA配列に対する特異性を有するように改変することができる。同様に、クラスター化した規則的な配置の短い回文配列の繰り返し(CRISPR)/Cas9タンパク質を、対応するコード遺伝子の付加によって、細胞に導入することもできる。それゆえ、いくつかの実施態様において、エンドヌクレアーゼは、プログラム可能なヌクレアーゼ、例えば、RNAガイド化DNAエンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、又は転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)であることができる。上記のヌクレアーゼは、非限定的であるということ、及び当業者は、当技術分野で公知の技法を用いて、好適なエンドヌクレアーゼを容易に同定することができることが理解される。例えば、ケンブリッジ参照配列又は同様のコンセンサス配列を用いて、mtDNA配列を認識する好適なエンドヌクレアーゼを、例えば、インシリコ解析によって同定することができる。具体的な実施態様において、該エンドヌクレアーゼは、mtDNAの野生型配列を切断する。他の実施態様において、該エンドヌクレアーゼは、mtDNAの突然変異体配列を切断する。内在性mtDNAを低下させる作用因子は、臭化エチジウムなどの、mtDNAの生合成を阻害する作用因子を含め、エンドヌクレアーゼである必要がないこと、及びを低下させることができる任意のmtDNAを利用することができることも理解される。また本明細書で想定されるのは、例えば、内在性ミトコンドリアの選択的分解を促進するためにオートファジーを誘導する、ウロリチンA又は小分子p62媒介姓マイトファジーインデューサー(PMI)などの作用因子(すなわち、マイトファジーアゴニスト)である。本発明は、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)を、mtDNAを低下させる作用因子として用いて実施することもできる。
さらに、いくつかの実施態様において、発現ベクターカセットは、発現ベクターカセットを発現する細胞の集団の選択を可能にするために、1以上の抗生物質耐性遺伝子を含むことができる。例えば、いくつかの実施態様において、発現ベクターは、ストレプトマイセス属(Streptomyces)由来のピューロマイシン N-アセチル-トランスフェラーゼ遺伝子(pac)を含むことができ、細胞は、ピューロマイシンを用いて選択することができる。抗生物質、例えば、ピューロマイシンを用いて選択が行われる状況において、選択は、薬物への長時間曝露を制限するために、短時間(例えば、24〜48時間)であることができる。しかしながら、上で提供されている例が単に例示的なものであること、及び発現ベクターカセットが、例えば、bsr、bls、又はブラストサイジンによる選択用のBSD遺伝子、又はハイグロマイシンBによる選択用のhph遺伝子などの他の抗生物質耐性遺伝子を含み得ることが理解される。選択に使用される抗生物質の濃度は、抗生物質のタイプ及び細胞のタイプによって決まり、過度の実験を伴うことなく、当業者に容易に入手可能であることが一般に理解される。選択は、当技術分野で公知の任意の手段によってもたらされることができ、抗生物質耐性を伴う必要がないことがさらに理解される。例えば、いくつかの実施態様において、細胞の選択は、例えば、細胞表面マーカーの蛍光活性化細胞選別(FACS)又は発現によってコードされる蛍光タンパク質の発現によって行われることができる。またさらなる実施態様において、選択は、細胞の表現型に従って行われることができる。例えば、いくつかの実施態様において、ヘテロプラスミーを有する細胞における突然変異体内在性mtDNAは、例えば、細胞生存などの、選択可能である表現型応答をもたらすことができる。
したがって、いくつかの実施態様において、細胞は、mtDNAを分解するエンドヌクレアーゼを含有する発現ベクターカセットを導入した後に選択される。いくつかの実施態様において、細胞は、mtDNAを分解するエンドヌクレアーゼを発現する均一な細胞集団を得るために選択される。具体的な実施態様において、細胞は、mtDNAを分解するエンドヌクレアーゼを含有する発現ベクターカセットを導入した後に選択され、均一な安定細胞株が作製される。他の実施態様において、細胞は、mtDNAを分解するエンドヌクレアーゼを発現する細胞の集団を濃縮するために選択される。上記のように、この選択による濃縮は、抗生物質への短い曝露を伴うことができる。濃縮される細胞は、選択圧の程度及び/又は様式によって、エンドヌクレアーゼを安定に発現するか又はエンドヌクレアーゼを一過性に発現することができる。濃縮された集団は均一である必要はないこと、及びmtDNAを分解するエンドヌクレアーゼを発現する濃縮された細胞集団は、選択されていない細胞集団と比べて、より高いパーセンテージのエンドヌクレアーゼを有する細胞を含有するが、エンドヌクレアーゼを発現しない一部の細胞も含有し得ることが理解される。
他の実施態様において、細胞は、mtDNAを分解するエンドヌクレアーゼを含有する発現ベクターを導入した後に選択されない。具体的な実施態様において、細胞は、mtDNAを分解するエンドヌクレアーゼを含有する発現ベクターを導入した後に選択されず、エンドヌクレアーゼは、一過性に発現される。
プラスミドDNA発現ベクターカセット、mRNA、及び/又は組換えタンパク質を導入するための様々な方法は、当技術分野で公知である。いくつかの実施態様において、プラスミドDNA発現ベクターカセットは、エレクトロポレーションによって導入される。具体的な実施態様において、エレクトロポレーション法は、フローエレクトロポレーション、例えば、MaxCyte Flow Electroporationである。他の具体的な実施態様において、エレクトロポレーション法は、ヌクレオフェクション技術、例えば、LonzaのNucleofector(商標)技術を含む。他の実施態様において、プラスミドDNA発現ベクターカセットは、カチオン性脂質トランスフェクションによって導入される。またさらなる実施態様において、プラスミドDNA発現ベクターカセットは、ウイルス形質導入によって導入される。発現ベクターカセットを導入するための上記の方法は非限定的であり、例示的な方法であることが単に意図されること、及び当技術分野で公知の任意の方法をDNA発現ベクターカセットを導入するために使用することができることが理解される。
内在性ミトコンドリアを低下させる作用因子がエンドヌクレアーゼを含む場合、該エンドヌクレアーゼの発現は、該エンドヌクレアーゼをコードするmRNAの導入又は組換えタンパク質としての該エンドヌクレアーゼの導入を伴うこともできる。ある実施態様において、MaxCyteエレクトロポレーターは、特に、適正製造基準及び適正臨床基準の標準をクリアした、臨床現場でのmRNAトランスフェクションに使用することができる。トランスフェクションは、製造元のプロトコルに従って、MaxCyteエレクトロポレーターを用いて実施することができる。上記の方法は単に例示的であること、及びmRNA及び/又は組換えタンパク質を導入する任意の手段を使用することができることがさらに理解される。
エンドヌクレアーゼのミトコンドリアへの特異的標的化は、ミトコンドリアを標的化する融合タンパク質を生じさせる、エンドヌクレアーゼコード配列に隣接するミトコンドリア標的化配列(MTS)を組み入れることにより実施することができる。強力なMTSが同定されており、そのN-末端に融合されたときに、タンパク質を特定の区画に標的化することができることが示されており、ミトコンドリア標的化配列と呼ばれる。本発明の方法に好適なMTSは、当業者に周知である(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる米国特許第8,039,587B2号を参照)。例えば、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIV(COX 4)、サブユニットVIII(COX 8)、又はサブユニットX(COX 10)由来の標的化ペプチドであるMTSなどの、ミトコンドリアマトリックスに対するMTSを使用することができる。原理上、任意の核コードミトコンドリアマトリックスもしくは内膜酵素に由来する任意の標的配列又は融合タンパク質をミトコンドリアインポートタンパク質(5.5超の疎水性モーメント、少なくとも2つの塩基性残基、両親媒性α-ヘリックス立体構造;例えば、Bedwellらの文献、Mol Cell Biol. 9(3)(1989), 1014-1025を参照)にすることができる人工配列は、本発明の目的のために有用である。
ある実施態様において、MTSは、ヒトMTSである。別の実施態様において、MTSは、別の種に由来するものである。そのような配列の非限定的な例は、シトクロムcオキシダーゼサブユニットX(COX 10) MTS
Figure 2021533827
 及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII(COX 8) MTS
Figure 2021533827
 である。MTS配列のさらなる非限定的な例は、核DNAによってコードされ、細胞質で翻訳され(産生され)、ミトコンドリアに輸送される各々の個々のミトコンドリアタンパク質、並びにシトレートシンターゼ(cs)、リポアミドデイドロゲナーゼ(LAD)、及びC6ORF66(ORF)の天然のMTSである。様々なMTSは、その中の各々のミトコンドリア酵素について交換可能であり得る。したがって、いくつかの実施態様において、MTSは、ミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とする。具体的な実施態様において、ミトコンドリアマトリックスタンパク質は、ヒトシトクロムcオキシダーゼのサブユニットVIIIである。各々の可能性は、本発明の使用のための融合タンパク質の別々の実施態様を表す。
レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子又は内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させると、レシピエント細胞は、該作用因子が、それぞれ、レシピエント細胞における内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるか又はレシピエント細胞内の内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、インキュベートされる。該作用因子が内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるか又は内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのを可能にする「十分な期間」を特定することは、当業者の技能の範囲内である。十分な又は適切な期間は、限定されないが、細胞の特定のタイプ、出発材料の量(例えば、レシピエント細胞の数及び/もしくは低下させられるmtDNAの量)、作用因子の量及びタイプ、プラスミドプロモーター調節因子、並びに/又は培養条件を含む、様々な因子によって異なる。様々な実施態様において、レシピエント細胞における内在性mtDNAコピー数の部分的な低下を可能にする十分な期間は、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約1〜2週間、約2〜3週間、又は約3〜4週間である。好ましい実施態様において、十分な期間は、得られるレシピエント細胞が、該レシピエント細胞を外因性mtDNA及び/又は外因性ミトコンドリアとインキュベートする前に、大部分の内在性mtDNAコピー数の低下又は大部分の内在性ミトコンドリアの機能の低下を有し、かつ内在性mtDNAを低下させる作用因子又は内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子も実質的に含まないのに十分なほど長い。
本発明の重要かつ新規の態様は、ミトコンドリア移入効率が内在性ミトコンドリアの完全な枯渇を有する細胞(すなわち、(ρ)0細胞)で激しく低下しているが、内在性mtDNAコピー数が低下しているが、完全に枯渇していない場合(すなわち、(ρ)-細胞)、大いに改善され得るという発見である。さらに、本発明は、単なる付加又は遠心分離プロトコルが、内在性mtDNAコピー数の部分的な低下がなければ、非効率的であることも示している。したがって、好ましい実施態様において、レシピエント細胞における内在性mtDNAコピー数の低下は、内在性mtDNAの100％枯渇よりも小さい。いくつかの実施態様において、レシピエント細胞における内在性mtDNAコピー数は、約5％〜約99％低下している。具体的な実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、内在性mtDNAコピー数の約30％〜約70％を低下させる。他の実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、内在性mtDNAコピー数の約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、もしくは約90％以上、又は約95％以上を低下させる。またさらなる実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、内在性mtDNAコピー数の約60％〜約90％を低下させる。いくつかの実施態様において、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子は、ミトコンドリア集塊を低下させることも理解される。
ある実施態様において、外因性mtDNAは、ドナー細胞由来の単離された外因性ミトコンドリアに含まれる。ミトコンドリア単離は、限定されないが、本明細書に及び引用参考文献に記載される技法を含む、いくつかの周知の技法のいずれかによって達成することができる。ある実施態様において、ミトコンドリア移入で使用するための外因性ミトコンドリアは、例えば、Qproteumミトコンドリア単離キット(Qiagen, USA)、MITOISO2ミトコンドリア単離キット(Sigma, USA)、又は培養細胞用のミトコンドリア単離キット(Thermo Scientific)などの市販のキットを用いて単離される。他の実施態様において、ミトコンドリア移入で使用するための外因性ミトコンドリアは、手作業で単離される。例えば、例示的な手作業でのミトコンドリアの単離は、ドナー細胞をペレット化し、培養下で増殖した約109個の細胞から得られた1〜2mLの細胞ペレットを洗浄し、低張バッファー中で細胞を膨張させ、しっかりとフィットする乳棒を用いるDounce又はPotter-Elvehjemホモジナイザーで細胞を破裂させ、かつ示差遠心分離によってミトコンドリアを単離することにより、ドナー細胞からミトコンドリアを単離することを含む。手作業での単離は、例えば、スクロース密度勾配超遠心分離、又はフリーフロー電気泳動を含むこともできる。任意の特定の理論によって束縛されるものではないが、本明細書に記載されるキット及び手作業での方法は例示的であること、及び任意のミトコンドリア単離法が使用されることができ、かつ当業者の技能の範囲内であることが理解される。
いくつかの実施態様において、単離されたドナーミトコンドリアは、他のオルガネラから実質的に純粋である。他の実施態様において、単離されたミトコンドリアは、不純物を含有することができ、ミトコンドリアについて濃縮される。例えば、いくつかの実施態様において、単離されたミトコンドリアは、約90％純粋、約80％純粋、約70％純粋、約60％,純粋、約50％純粋、又はこれらの間の任意の整数である。一般に、単離されたドナーミトコンドリアに含まれる任意の不純物は、ミトコンドリア移入時に、レシピエント細胞の生存又は機能に影響を及ぼさないことが理解される。具体的な実施態様において、外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、又はその組合せの移入は、非ミトコンドリアオルガネラの移入を伴わない。
単離されたミトコンドリアの量及び質は、限定されないが、本明細書に及び引用参考文献に記載される技法を含む、いくつかの周知の技法によって容易に決定することができる。例えば、いくつかの実施態様において、単離されたミトコンドリアの量は、全タンパク質含有量の評価によって決定される。Biuret及びLowry法などの、様々な方法が全タンパク質含有量の測定に利用可能である(例えば、Hartwigらの文献、プロテオミクス, 2009 Jun; 9(11):3209-14を参照)。他の実施態様において、単離されたミトコンドリアの量は、mtDNAコピー数によって決定される。
いくつかの実施態様において、単離されたミトコンドリアは、機能的ミトコンドリアである。さらなる実施態様において、単離されたミトコンドリアは、機能不全ミトコンドリアである。いくつかの実施態様において、ミトコンドリア機能は、単離前のドナー細胞で評価することができる。他の実施態様において、ミトコンドリア機能は、単離されたミトコンドリアからアッセイすることができる。
ミトコンドリア膜の完全性の保持は、ミトコンドリア単離時の別の重要な因子である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法で使用されるmtDNAは、無傷のミトコンドリア由来のものである。具体的な実施態様において、単離されたミトコンドリアの約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、又は90％超は、無傷である。ミトコンドリア膜の完全性は、限定されないが、本明細書に及び引用参考文献に記載される技法を含む、いくつかの周知の技法のいずれかによって達成することができる。例えば、TMRM、Rhod123、JC-1、及びDiOC6は、ミトコンドリア膜電位の測定のための典型的なプローブである(例えば、Perryらの文献、Biotechniques, 2011 Feb;50(2):98-115を参照)。JC-1は、単離されたミトコンドリアの内膜電位の測定のための広く使用されている色素であり、ミトコンドリア内膜の電気化学的プロトン勾配に基づく。
本明細書に提供される方法のある実施態様において、内在性mtDNAの部分的な低下を有するレシピエントを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアと共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する。他の実施態様において、内在性mtDNAの部分的な低下を有するレシピエントを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、健康なドナー由来の外因性mtDNAと共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する。外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAをレシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに「十分な期間」を特定することは、当業者の技能の範囲内である。十分な又は適切な期間は、限定されないが、細胞の特定のタイプ、出発材料の量(例えば、レシピエント細胞の数及び/もしくは交換される内在性mtDNAの量)、ドナー材料の量(例えば、外因性mtDNAの量、質、及び/もしくは純度)、並びに/又は培養条件を含む、様々な因子によって異なる。様々な実施態様において、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAをレシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間は、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、約7日、約8日、約9日、約10日、約1〜2週間、約2〜3週間、又は約3〜4週間である。ある実施態様において、共インキュベーションの終了時に、レシピエント細胞は、大部分の外因性mtDNAを有し、かつ任意の外因性ミトコンドリアオルガネラを実質的に含まない。
本発明の別の特徴は、MirCにおける総mtDNAコピー数が、もとのレシピエント細胞と比べて、実質的には増加しないという発見である。対照的に、他のあまり効率的ではない方法は、共インキュベーション工程の前にレシピエント細胞を調節しないで、ミトコンドリアを付加するか、又は遠心分離の前にレシピエント細胞を調節しないで、遠心分離を用いて外因性ミトコンドリアを移入しようと試みてきた。結果的に、非効率的な方法を用いて得られる細胞集団は、総mtDNAコピー数が大きく増加する傾向がある。したがって、ある実施態様において、ミトコンドリア交換細胞は、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前のレシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を有する。
非侵襲的移入の使用は、本発明の別の独特の態様である。以前の方法は、侵襲的器具を利用して、外因性ミトコンドリアを注入し、遠心分離、又はレシピエント細胞にとって有害である同様の過酷な条件によって、ミトコンドリアを細胞に物理的に押し込んできた。臨床現場において、特に、造血幹細胞又はT細胞の場合など、レシピエント細胞数が限られている場合、過酷な細胞操作は望ましくない。それゆえ、非侵襲的移入の使用は、臨床現場での使用に向いている本発明の有益な特徴である。
本明細書に提供されるように、外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、又はその組合せは、レシピエント細胞にとって自己又は同種異系のものであることができる。いくつかの実施態様において、外因性mtDNAは、レシピエント細胞に対して、同種異系のものである。例えば、外因性mtDNAは、レシピエント細胞と同じ種から得ることができ、レシピエント細胞の遺伝子型と異なる遺伝子型を有する。他の実施態様において、外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、又はその組合せは、自己のものである。例として、例示的な自己外因性mtDNAとしては、健康なドナー細胞、例えば、「若い」ドナー細胞、例えば、臍帯血由来のものに由来するmtDNAを挙げることができ、レシピエント細胞は、同じ対象由来のもので、かつ「老いた」レシピエント細胞であることができ、ここで、「若い」及び「老いた」という用語は、集団内の細胞が倍加する総回数又は細胞が採取される対象の年齢を指す。別の例示的な自己外因性mtDNAとしては、例えば、レシピエント細胞と同じ対象から単離され、かつそれをレシピエント細胞と交換する前に修飾されたドナーmtDNAを挙げることができる。ある実施態様において、mtDNA及び/又はミトコンドリアだけが同種異系のものであり、レシピエント細胞は、外因性mtDNA及び/又は外因性ミトコンドリアを必要としている対象にとって自家のものである。
ある実施態様において、レシピエント細胞におけるmtDNAの交換は、mtDNAの超可変領域(HVR)、例えば、D-ループのHV1及び/又はHV2のDNA配列をシークエンシングし、それをドナーミトコンドリアとレシピエント細胞の両方の配列と比較することにより評価することができる。具体的な実施態様において、レシピエント細胞とドナーミトコンドリア配列の違いは、単一ヌクレオチド多型アッセイによって同定することができる。例えば、レシピエント細胞及びドナーミトコンドリア由来のmtDNAの増幅配列を定量の標準として使用するためのプラスミドにクローニングすることができる。
いくつかの実施態様において、細胞(すなわち、ドナー細胞及びレシピエント細胞)は、動物細胞又は植物細胞である。具体的な実施態様において、細胞は、哺乳動物である。いくつかの実施態様において、細胞は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、及びヒツジ:からなる群から選択される哺乳動物対象から単離される。いくつかの実施態様において、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は、培養下の細胞である。細胞は、その場で調製されるか又は市販の細胞源から購入される、哺乳動物(好ましくは、ヒト)から直接、又は市販の供給源から、又は組織から、又は例えば、培養細胞の形態で、及び同様に得ることができる。ある実施態様において、細胞は、初代細胞(すなわち、生きた組織から直接得られた細胞、例えば、生検材料)である。細胞は、限定されないが、血液もしくはリンパ系を含む、任意の器官に、筋肉、任意の器官、腺、皮膚、又は脳に由来してもよい。ある実施態様において、細胞は、体細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は、上皮細胞、神経細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞(例えば、骨髄細胞)、メラニン細胞、軟骨細胞、肝細胞、B細胞、T細胞、赤血球、マクロファージ、単球、線維芽細胞、筋肉細胞、血管平滑筋細胞、肝細胞、脾臓細胞、及び膵臓β細胞からなる群から選択される。
本明細書に提供されるように、具体的な実施態様において、ドナー細胞は、現在の適正製造基準(cGMP)の下で培養された市販の細胞である。例えば、ドナー細胞は、Waisman Biomanufacturingなどの細胞レポジトリ、又は同様の商業的資源、例えば、cGMP準拠細胞を生み出す市販の供給源から得ることができる。いくつかの実施態様において、ドナー細胞は、cGMP製造の骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)である。他の実施態様において、細胞は、cGMP等級のヒト肝細胞である。したがって、ドナー細胞は、ミトコンドリアを単離する前に解凍される凍結細胞であることができることも理解される。しかしながら、ミトコンドリアは、細胞を凍結させた後に単離される必要はなく、新鮮な細胞から単離され、すぐに使用されることができるか、又はある実施態様において、ミトコンドリアは、単離され、その後、レシピエント細胞に移入される前に凍結されることができる。
いくつかの実施態様において、細胞は、癌細胞である。典型的には、癌細胞は、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳腫瘍、原発性脳腫瘍、頭頸部癌、神経膠腫、膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛腫、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、神経芽腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、原発性マクログロブリン血症、及び網膜芽腫からなる群から選択される癌から単離される。
いくつかの実施態様において、細胞は、幹細胞である。本明細書で使用されるように、「幹細胞」という用語は、増殖するように誘導することができる未分化細胞を指す。幹細胞は、自己維持又は自己再生することができ、これは、各々の細胞分裂とともに、1つの娘細胞が幹細胞にもなることを意味する。幹細胞は、胚性、出生後、幼若、又は成体組織から得ることができる。幹細胞は、多能性(pluripotent)又は多能性(multipotent)であることができる。本明細書で使用される「前駆細胞」という用語は、幹細胞に由来し、それ自体、幹細胞ではない、未分化細胞を指す。一部の前駆細胞は、複数の細胞型に分化することができる子孫を生むことができる。幹細胞には、体の組織系譜:中胚葉、内胚葉、及び外胚葉のいずれかの細胞を形成することができる多能性(pluripotent)幹細胞が含まれる。それゆえ、例えば、幹細胞は、ヒト胚性幹(ES)細胞;ヒト内部細胞塊(ICM)/エピブラスト細胞;ヒト原始外胚葉細胞、ヒト原始内胚葉細胞;ヒト原始中胚葉細胞;及びヒト始原生殖(EG)細胞から選択することができる。幹細胞には、組織全体又は複数の組織を構成する多数の細胞系譜を形成することができる多能性(multipotent)幹細胞、例えば、限定されないが、造血幹細胞又は神経前駆体細胞も含まれる。幹細胞には、生物全体を形成することができる全能性幹細胞も含まれる。いくつかの実施態様において、幹細胞は、間葉系幹細胞である。「間葉系幹細胞」又は「MSC」という用語は、最終分化していないか、いずれかの幹細胞である細胞を生じるように分裂することができるか、又はサイトカインなどの生体活性因子からの様々な影響に応じて、間葉系細胞系譜の細胞、例えば、脂肪性、骨性、軟骨性、弾性、及び線維結合組織、筋芽細胞)、並びに胚性中胚葉に由来する組織以外の組織(例えば、神経細胞)を生じるように不可逆的に分化する成体細胞について、互換的に使用される。いくつかの実施態様において、幹細胞は、部分的に分化した又は分化している細胞である。いくつかの実施態様において、幹細胞は、再プログラム化されているか又は脱分化させられている誘導性多能性(pluripotent)幹細胞(iPSC)である。具体的な実施態様において、レシピエント細胞は、iPSCである。他の実施態様において、レシピエント細胞は、造血幹細胞(HSC)又はMSCである。幹細胞は、胚性、胎児性、又は成体組織から得ることができる。
他の実施態様において、細胞は、免疫細胞である。具体的な実施態様において、レシピエント細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施態様において、免疫細胞は、T細胞、食細胞、ミクログリア細胞、及びマクロファージからなる群から選択される。具体的な実施態様において、T細胞は、CD4+ T細胞である。他の実施態様において、T細胞は、CD8+ T細胞である。またさらなる実施態様において、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞である。具体的な実施態様において、レシピエント細胞は、T細胞機能不全の状態又はそれに近い状態の疲弊した又はほとんど疲弊したT細胞である。
(5.3 ミトコンドリア移入の増強方法)
また本明細書に提供されるのは、第5.2節に記載されている方法のいずれかと組み合わせた第二の活性作用因子の使用を伴う、mtDNA及び/又はミトコンドリアの移入のための方法である。ミトコンドリアの移入は、ATP依存的プロセスであるエンドサイトーシス経路が関係することが報告されている。例えば、ある細胞培養条件下で、ミトコンドリアは、マクロピノサイトーシスによって飲み込まれることが観察されている(例えば、Kitaniらの文献、J Cell Mol Med., 2014, 18(8):1694-1703)。したがって、本発明は、レシピエント細胞を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAと共インキュベートする前の第二の活性作用因子の使用が外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの取込みを促進することができるという新規の発見にも関する。
様々なタイプの作用因子を用いて、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの取込みを促進することができる。いくつかの実施態様において、第二の活性作用因子は、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、第二の活性作用因子は、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される。具体的な実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、細胞代謝のモジュレーターである。細胞代謝は、当業者に公知の様々な方法を用いて調製することができる。ある実施態様において、細胞代謝の調節は、栄養飢餓、化学インヒビター、又は小分子を含む。
上記のように、無傷のミトコンドリアの移入は、エンドサイトーシス経路によって生じることが報告されている。例えば、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAは、エンドサイトーシス経路を介する無傷のミトコンドリアの取込みによって移入される。エンドサイトーシス経路は、4つのカテゴリー: 1)クラスリン媒介エンドサイトーシス、2)カベオラ、3)マクロピノサイトーシス、及び4)ファゴサイトーシスに細分化することができる。クラスリン媒介エンドサイトーシスは、細胞質ゾルタンパク質クラスリンと主に関連しているタンパク質の複合体から構成される形態的に特徴のある被膜を有する小型(直径約100nm)の小胞によって媒介される。したがって、ある実施態様において、ミトコンドリア移入のためのエンドサイトーシス経路は、クラスリン依存的エンドサイトーシス経路である。他の実施態様において、ミトコンドリア移入のためのエンドサイトーシス経路は、クラスリン非依存的経路である。具体的な実施態様において、エンドサイトーシス経路は、マクロピノサイトーシスである。
マクロピノサイトーシスは、栄養不足の環境における重要なプロセスであることが示唆されている。結果として、細胞栄養の不足又は十分な栄養摂取で活性化される経路もしくは標的分子、例えば、mTORの阻害は、細胞質ゾルへの無傷のミトコンドリアの細胞飲込みを強化する戦略であるという仮説が立てられた。具体的には、本明細書に提供されているように、mTORの抑制が外因性ミトコンドリアの取込みを増強することができることが発見された。mTORは、アミノ酸、エネルギー、酸素、及び成長因子の不可欠なセンサーであり、かつ細胞外栄養の取込みに関与するタンパク質、脂質、及びヌクレオチド合成の重要な調節因子である。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法は、レシピエント細胞を、マクロピノサイトーシスを増大させることができる小さい化合物、ペプチド、又はタンパク質と接触させることをさらに含む。具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法は、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの移入の前に、レシピエント細胞の細胞代謝を調節することをさらに含む。ある実施態様において、細胞代謝を調節することは、マクロピノサイトーシスを増大させることができる同じ小さい化合物、ペプチド、又はタンパク質を用いて実施される。
細胞代謝を調節することは、限定されないが、本明細書に及び引用参考文献に記載されている技法を含む、いくつかの周知の技法のいずれかによって達成することができる。例えば、いくつかの実施態様において、細胞代謝を調節することは、栄養飢餓又は栄養欠乏によって実施される。他の実施態様において、細胞代謝を調節することは、化学インヒビター又は小分子によって実施される。具体的な実施態様において、化学インヒビター又は小分子は、mTORインヒビターである。
ラパマイシン、別名、シロリムス(CAS番号53123-88-9; C51H79NO13)及びラパマイシン誘導体(例えば、ラパマイシン類似体、別名、「ラパログ」)を含む、様々な化合物は、mTORを阻害することが知られている。ラパマイシン誘導体としては、例えば、テムシロリムス(CAS番号162635-04-3; C56H87NO16)、エベロリムス(CAS番号159351-69-6; C53H83NO14)、及びリダホロリムス(CAS番号572924-54-0; C53H84NO14P)が挙げられる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるミトコンドリア移入の方法は、ラパマイシン又はその誘導体を用いる外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの移入の前に、レシピエント細胞の細胞代謝を調節することをさらに含む。細胞代謝を調節するための上記の実施態様は非限定的であること、及び細胞代謝を調節することは化学化合物又は小分子を伴う必要がないことが理解される。
したがって、いくつかの実施態様において、臨床的に承認されている薬物を含むラパマイシン又はその誘導体を利用して、独立した方法として、又は本明細書に提供される方法、例えば、レシピエント細胞の内在性ミトコンドリアの部分的な低下を伴う方法のいずれかと組み合わせて、外因性ミトコンドリアの移入効率を増大させることができる。
当業者であれば、さらなる送達方法を用いて、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAを導入することができること、並びにマクロピノサイトーシスが例示的な経路であることを理解しているであろう。いくつかの実施態様において、mtDNAは、クラスリン依存的エンドサイトーシス又はクラスリン非依存的エンドサイトーシスによって送達することができる。具体的な実施態様において、クラスリン非依存的経路は、例えば、CLIC/GEECエンドサイトーシス経路、Arf6依存的エンドサイトーシス、フロチリン依存的エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、円形ドーサルラッフル(circular doral ruffles)、ファゴサイトーシス、又はトランス-エンドサイトーシスであることができる。外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの送達は、ミトコンドリア送達を刺激する任意の化合物、例えば、エンドサイトーシスのアクチベーターの使用によって増強することができる。エンドサイトーシスを活性化するのに好適な非限定的で例示的な化合物には、例えば、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)(C36H56O8)、12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセテート(TPA)(C36H56O8)、タンシノンIIAスルホン酸ナトリウム(TSN-SS)(C19H17O6S.Na)、及びホルボール-12,13-ジブチレート、又はこれらの誘導体が含まれることがさらに理解される。さらに、エンドサイトーシス及び/又は細胞融合を迂回する方法を含む、mtDNA及び/又はミトコンドリアの非エンドサイトーシス媒介移入を使用することができることも理解される。
(5.4 治療方法)
本明細書に提供されるのは、突然変異体mtDNA及び/又は機能不全ミトコンドリアと関連する疾病の治療のための様々な方法、突然変異体mtDNA及び/又は機能不全ミトコンドリアと関連する疾病の治療のための組成物の使用、並びに突然変異体mtDNA及び/又は機能不全ミトコンドリアと関連する疾病の治療のための医薬の製造における組成物の使用である。また提供されるのは、内在性ミトコンドリアの機能を回復又は増強するための外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの使用、内在性ミトコンドリアの機能を回復又は増強するための組成物の使用、並びにミトコンドリア交換を必要としている対象の治療のための医薬の製造における組成物の使用を伴う治療方法である。ある実施態様において、治療は、ミトコンドリア機能不全の予防を伴う。
(5.4.1 年齢関連疾患を治療する方法)
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法であって、第5.2節及び/又は第5.3節に記載されている方法のいずれかを含む、方法である。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法であって、レシピエント細胞を、内在性mtDNAを低下させるか又は内在性ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること、該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるか又は内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること、(1)内在性mtDNA又は内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下しているレシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製することすることにより、ミトコンドリア交換細胞を作製し、その後、ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、年齢関連を有するか又は年齢関連を有することが疑われる対象に投与することを含む、方法である。
ある実施態様において、年齢関連疾患としては、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、癌、神経変性疾患、及び免疫老化が挙げられる。代謝性疾患としては、糖尿病を挙げることができる。本明細書に提供される方法によって治療することができる神経変性疾患の非限定的な例としては、アルツハイマー病又はパーキンソン病が挙げられる。さらに、治療することができる遺伝性疾患としては、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、及びハンチントン病が挙げられる。機能不全ミトコンドリアを含むさらなる年齢関連疾患も想定される。
ある実施態様において、年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法は、MirCを作製することを含み、ここで、該MirCを作製するために使用されるレシピエント細胞は、T細胞又は造血幹細胞(HSC)である。例えば、老化したT細胞又は造血幹細胞(HSC)における内在性mtDNA、内在性ミトコンドリア、又はその組合せを若返りのために交換することができる。インビトロ又はエクスビボでのミトコンドリア交換は、罹患した患者に関して、ヒトT細胞及び/又は造血幹細胞を用いる治療のための実現可能な選択肢であることができる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法を用いて、健康な老化していない細胞由来の単離された外因性ミトコンドリアを老化した又老化しそうな細胞に非侵襲的に移入することにより、老化を遅延させ、かつ/又は細胞の寿命を延長して、該レシピエント細胞を若返らせ、その後、得られる若返ったMirCを、年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる患者に投与することができる。
本明細書に示されているように、老化したT細胞の若返りは、本発明を用いて、年齢関連疾患、例えば、癌を有する対象を治療することができる、1つのあり得る実施態様である。例として、炎症性サイトカイン、成長因子、及びプロテアーゼからなる老化関連分泌表現型(SASP)、細胞集団倍加の速度の低下及び/又は遅延、テロメアの短縮、DNA損傷応答(DDR)の増大、又はその組合せを示す老いたT細胞は、本明細書に提供される方法を用いて、例えば、年齢関連疾患、例えば、癌を有する対象にとって自己である若く、健康なT細胞由来の単離されたミトコンドリアを非侵襲的に移入することにより若返らせることができる。その後、若く、老化していない細胞の特徴を有するT細胞由来MirCは、年齢関連疾患の治療のための対象に投与することができる。
したがって、具体的な実施態様において、年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法は、MirCの作製を含み、ここで、レシピエント細胞は、T細胞である。T細胞運命は、代謝経路によって調節され、解糖又は酸化的リン酸化(OXPHOS)のいずれかがエネルギーの大部分をT細胞に提供することに関与している。解糖優位なT細胞がエフェクターT細胞に分化することを選択するのに対し、OXPHOS優位なT細胞は、メモリーT細胞向けのものである。したがって、外因性ミトコンドリア及び/又はmtDNAを用いて、T細胞運命を調節することができる。例えば、アレルギーの場合、外因性ミトコンドリア及び/又はmtDNAを用いて、過剰に活性化されたT細胞を沈静化することができる。癌免疫療法などの他の状況において、外因性ミトコンドリア及び/又はmtDNAは、抗腫瘍T細胞に力を与えて、該T細胞が長時間存続するか、又はT細胞溶解能を促進し、かつ/もしくは腫瘍負荷を低下させることを可能にすることができる。さらに、キメラ抗原受容体T細胞(CAR T)を用いる新たな治療では、自己T細胞が使用される。このCAR T細胞は、癌の重度の病理病期に頻繁に見られる加齢又は悪液質などの栄養不良のために、疲労状態にある可能性がある。ミトコンドリア交換技術は、より多くのATPを提供するように、CAR Tを活性化し、若返らせて、より良好な転帰をもたらすことができる。
したがって、ある実施態様において、対象を治療する方法は、T細胞であるレシピエント細胞を含む。T細胞は、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、又はCAR T細胞であることができる。具体的な実施態様において、レシピエントT細胞におけるミトコンドリア交換は、寿命が延長されたT細胞を生じさせる。例えば、寿命は、約1.5倍、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、又は5倍を超えて増加させることができる。具体的な実施態様において、レシピエントT細胞におけるミトコンドリア交換は、ミトコンドリア交換していないT細胞と比較して、レシピエントT細胞の老化を阻害し又は遅延させる。第5.2節に記載されているように、レシピエント細胞よりも若いドナー細胞由来の外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAを用いてmtDNA交換を実施することにより、寿命を延長することができる。ある実施態様において、ドナー及びレシピエント細胞は、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約4倍、約5倍、又は5倍超のPDLの違いを有する。他の実施態様において、ドナー及びレシピエント細胞は、年齢が約5歳、約10歳、約15歳、約20歳、又は20歳を超えて離れている対象由来のものである。他の具体的な実施態様において、レシピエントT細胞におけるミトコンドリア交換は、ミトコンドリア交換を有さないT細胞と比べて、溶解能が増大したT細胞を生じさせる。またさらなる実施態様において、T細胞におけるミトコンドリア交換は、腫瘍負荷の低下をもたらす。
ある実施態様において、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAを有するT細胞を作製するために、プラスミドベースの遺伝子トランスフェクションを使用することができるが、他の実施態様において、mRNAトランスフェクションを使用することができる。mRNAトランスフェクションの使用は、RNA配列が宿主ゲノムに組み込まれる機会を減少させることができ、かつ内在性mtDNA低下を引き起こす最小限の長期遺伝子発現を有することもできる。
ある実施態様において、MaxCyteエレクトロポレーターは、特に、適正製造基準及び適正臨床基準の標準をクリアしている、臨床現場での、mRNAトランスフェクションに使用することができる。トランスフェクションは、製造元のプロトコルに従って、MaxCyteエレクトロポレーターを用いて実施することができる。
年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法は、本明細書に提供される方法を用いるMirCの作製を含むこともでき、ここで、レシピエント細胞は、造血幹細胞(HSC)である。造血幹細胞(HSC)は、血液細胞だけでなく、例えば、分化転換により、遠隔器官の損傷を受けた常在細胞を元通りにする内皮も供給する。さらに、HSCの機能不全は、全身の老化に関与すると報告されている。それゆえ、HSC由来MirCを任意の年齢関連疾患の治療方法として使用することができることが想定される。
さらに、同種異系HSC移植は、移植片の拒絶又は移植片対宿主病すら生じさせることがある。自己HSC移植は、多くの場合、疾患介入のための安全かつより実際的な手段である。例えば、自己HSC移植は、通常、放射線及び化学物質などの免疫抑制作用因子による前処理を必要としない。したがって、後に患者の体内に戻される自己HSCにおける健康で若いミトコンドリア由来の外因性mtDNAを用いるMirCのインビトロ又はエクスビボ作製が本明細書に提供される方法を用いて想定される。
ある実施態様において、HSCは、ミトコンドリア及び/又はmtDNA交換を必要としている対象にとって自己のものであり、外因性mtDNAは、同種異系のものである。本明細書に提供されるように、HSCにおけるmtDNA交換は、機能的ミトコンドリアを有する分化細胞及び/又は改善された機能を有する分化細胞を生じさせることができる。したがって、本明細書に提供される方法は、HSC移植の状況で使用することができる。
加齢は、生物学的プロセスを変化させ、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、2型真性糖尿病、並びに慢性腎疾患及び慢性閉塞性肺疾患の原因となる組織線維症などの、変性障害の発症をもたらす。ミトコンドリアは、加齢プロセスに影響を及ぼし得る、ミトコンドリアによって生成される活性酸素種を介して、老化において役割を果たすことができる。加齢におけるミトコンドリア機能不全は、ニコチン酸アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)の下方調節及びポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP1)の過剰活性化によって引き起こされるニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)の不足がNAD+依存的デアセチラーゼサーチュイン1(SIRT1)の阻害をもたらす、栄養感知の脱調節に関する悪循環に陥る。その後、これは、PGC1αのアセチル化依存的不活化に引き継がれ、結果的に、NAD+の利用可能性を拡大するミトコンドリア生合成の低下をもたらす。PGC1αの低い活性は、核内でコードされたミトコンドリアタンパク質だけでなく、ミトコンドリアDNAの周辺にあるミトコンドリア転写因子TFAMの発現の下方調節ももたらす。
p53及びp16/Rbを含む2つの中核となる老化調節経路に加えて、IL-1、IL-6/VEGF、IL-8、及びCXCL9/MMPなどの多くの炎症性サイトカイン、ケモカイン、及びプロテアーゼが放出される老化関連分泌表現型(SASP)は、老化における最も特徴付けられている現象の1つである。転写因子GATA4が通常の条件下での選択的オートファジーによるオートファジーアダプターp62の会合とともに分解するのに対し、DNA損傷応答(DDR)キナーゼATM(運動失調症毛細血管拡張症突然変異)及びATR(運動失調症毛細血管拡張症及びRad3関連)受容型老化シグナルは、GATA4とp62の解離を促進し、GATA4を安定化し、その後、TRAF3IP2(腫瘍壊死因子受容体関連因子相互作用タンパク質2)及びIL1Aを通じて、NF-kBを活性化し、SASPを支持する。SASPは、rho0細胞(強制的なマイトファジーによって樹立されたmtDNAのない細胞)で完全に妨げられる。実験的IVFにおける老いたものに由来する卵母細胞のミトコンドリア交換は、受精卵形成、胚の発生及び着床、並びに子孫出産の成功率を確実に増進させた。
タンパク質恒常性(タンパク質ホメオスタシス)の障害は、加齢の別の特徴である。タンパク質恒常性の完全性は、翻訳調節、タンパク質フォールディングシャペロン、ユビキチン-プロテアソーム系(UPS)、及びオートファジー-リソソーム系によって厳格に維持される。シャペロンはATPに依存するので、加齢に伴う生物エネルギーの減少は、正確なタンパク質フォールディングに対する機能を危険に曝す。UPSとマイトファジーを含むオートファジー-リソソーム系は両方とも、時間とともに減少する。これら3つの系の変化は、細胞質ゾルで再利用されない凝集体を生成させ、変性障害をもたらす。ミトコンドリアマトリックスにおいて、異常タンパク質の蓄積は、この系を作動させて、それを分解させるだけでなく、ミトコンドリアアンフォールドタンパク質応答(UPRmt)と呼ばれる、核とコミュニケーションを取るミトコンドリア機能を回復する機会を提供する。上述の経路は全て、ミトコンドリアを含む。体細胞におけるミトコンドリア交換であれば、悪化する有害な加齢サイクルを破壊し、老化プロセスを遅らせ、細胞を若返らせることすらできる。
したがって、本明細書に提供される方法は、内在性機能不全ミトコンドリア、例えば、突然変異体mtDNAを有する内在性ミトコンドリアを、自己起源又は同種異系起源のいずれかを有することができる若い及び/又は健康なミトコンドリアと交換することにより、ヘテロプラスミーを治療するための及び/又は老化と関連する疾患などの様々な疾患を治療するための臨床的に実行可能な方法を提供する。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるミトコンドリア交換の方法は、ミトコンドリア疾患又は障害、並びに老化、癌、及び免疫系不全の治療に使用することができる。
(5.4.2 ミトコンドリア疾患又は障害を治療する方法)
また本明細書に提供されるには、第5.2節及び/又は第5.3節に記載される方法のいずれかに従って、ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象を治療する方法である。いくつかの実施態様において、ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象を治療する方法は、第5.2節及び/又は第5.3節に記載される方法のいずれかに従ってMirCを作製し、その後、ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象に投与することを含む。
様々なミトコンドリア疾患又は障害が公知であり、全て、本明細書に提供される方法を用いて治療することができる。例えば、本明細書に提供される方法を用いて治療されるミトコンドリア疾患又は障害は、複合体I欠損症(OMIM:252010)であることができる。複合体I欠損症は、そのサブユニットのいずれかにおける突然変異によって引き起こされることができる。別の実施態様において、複合体I欠損症は、NDUFV1(OMIM:161015)、NDUFV2(OMIM:600532)、NDUFS1(OMIM:157655)、NDUFS2(OMIM:602985)、NDUFS3(OMIM:603846)、NDUFS4(OMIM:602694)、NDUFS6(OMIM:603848)、NDUFS7(OMIM:601825)、NDUFS8(OMIM:602141)、及びNDUFA2(OMIM:602137)からなる群から選択される遺伝子の突然変異によって引き起こされる。
さらに、本明細書に提供される方法を用いて治療することができるミトコンドリア疾患又は障害は、複合体IV欠損症(シトクロムcオキシダーゼ; OMIM:220110)であることができる。複合体IV欠損症は、そのサブユニットのいずれかにおける突然変異によって引き起こされることができる。ある状況において、複合体IV欠損症は、MTCO1(OMIM:516030)、MTCO2(OMIM:516040)、MTCO3(OMIM:516050)、COX10(OMIM:602125)、COX6B1(OMIM:124089)、SCO1(OMIM:603644)、FASTKD2(OMIM:612322)、及びSCO2(OMIM:604272)からなる群から選択される遺伝子の突然変異によって引き起こされる。
ミトコンドリア疾患又は障害は、突然変異によって引き起こされるか、又は突然変異と関連することができる。突然変異は、点突然変異、ミスセンス突然変異、欠失、及び挿入であることができる。mtDNA又はnDNAにおける突然変異の同定は、当業者の技能の範囲内であることが理解され、例えば、単一ヌクレオチド多型(SNP)アッセイ又はドロップレットデジタルPCRなどの例示的な方法が本明細書に提供されている。
本明細書に提供される方法を用いて治療することができる特定のタイプのミトコンドリア疾患又は障害のの非限定的な例としては、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症(高アンモニア血症)(OTCD)、カルニチン O-パルミトイルトランスフェラーゼII欠損症(CPT2)、フマラーゼ欠損症、リー症候群と関連するシトクロムcオキシダーゼ欠損症、メープルシロップ尿症(MSUD)、中鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症(MCAD)、極長鎖アシル-CoAデヒドロゲナーゼ欠損症(LCAD)、三機能タンパク質欠損症、ミトコンドリアDNA欠失を伴う進行性外眼筋麻痺(POLG)、DGUOK、TK2、ピルビン酸デカルボキシラーゼ欠損症、及びリー症候群(LS)が挙げられる。別の実施態様において、ミトコンドリア疾患又は障害は、アルパース病;バース症候群;β-酸化欠陥;カルニチン-アシル-カミチン欠損症;カルニチン欠損症;補酵素Q10欠損症;複合体II欠損症(OMIM:252011)、複合体III欠損症(OMIM:124000)、複合体V欠損症(OMIM:604273)、LHON-レーバー遺伝性視神経萎縮症; MM-ミトコンドリアミオパチー; LIMM-致死型乳児ミトコンドリアミオパチー; MMC-母性遺伝性ミオパチー及び心筋症; NARP-神経原性筋衰弱、運動失調症、及び網膜色素変性;リー病; FICP-致死型乳児心筋症プラス、MELAS関連心筋症; MELAS-乳酸アシドーシス及び脳卒中様発作を伴うミトコンドリア脳筋症; LDYT-レーベル遺伝性視神経症及びジストニア; MERRF-ミオクローヌスてんかん及び赤色ぼろ筋線維; MHCM-母性遺伝性肥大型心筋症; CPEO-慢性進行性外眼筋麻痺; KSS-カーンズ・セイヤー症候群; DM-真性糖尿病; DMDF 真性糖尿病＋難聴; CIPO-ミオパチー及び眼筋麻痺を伴う慢性偽性腸閉塞症; DEAF-母性遺伝性難聴; PEM-進行性脳障害; SNHL-感音性聴力低下;脳筋症;ミトコンドリア細胞症; DEMCHO-認知症及び舞踏病; AMDF-運動失調症、ミオクローヌス; ESOC てんかん;視神経萎縮; FBSN 家族性両側線条体壊死; FSGS 巣状分節性糸球体硬化症; LIMM 致死型乳児ミトコンドリアミオパチー; MDM ミオパチー及び真性糖尿病; MEPR ミオクローヌスてんかん及び精神運動発達退行; MERME MERRF/MELAS重複疾患; MHCM 母性遺伝性肥大型心筋症; MICM 母性遺伝性心筋症; MILS 母性遺伝性リー症候群;ミトコンドリア脳心筋症;多系統ミトコンドリア障害(ミオパチー、脳障害、盲目、聴力低下、末梢神経障害); NAION 非動脈炎性前部虚血性視神経; PEM 進行性脳障害; PME 進行性ミオクローヌスてんかん; RTT レット症候群; SIDS 乳幼児突然死症候群;並びにMIDD 母性遺伝性糖尿病及び難聴からなる群から選択される。
本明細書に提供されるミトコンドリア疾患又は障害を治療するための方法は、具体的な実施態様において、ミトコンドリアDNA異常によって引き起こされるミトコンドリア疾患又は障害を含むこともでき、ここで、該ミトコンドリアDNA異常は、慢性進行性外眼筋麻痺(CPEO)、ピアソン症候群、カーンズ・セイヤー症候群(KSS)、糖尿病、及び難聴(DAD)、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、LHON-プラス、ニューロパチー、運動失調症、及び網膜色素変性症症候群(NARP)、母性遺伝性リー症候群(MILS)、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、及び脳卒中様発作(MELAS)、ミオクローヌスてんかん及び赤色ぼろ線維疾患(MERRF)、家族性両側線条体壊死/線条体黒質変性症(FBSN)、ルフト病、アミノグリコシド誘発性難聴(AID)、並びにミトコンドリアDNA多重欠失症候群からなる群から選択される。
mtDNAの突然変異は、数多くの臨床障害と関連すると考えられる。成人において、これらのものとしては、神経学的疾患(例えば、片頭痛、脳卒中、てんかん、認知症、ミオパチー、末梢神経障害、複視、運動失調症、言語障害、及び感音性聴力低下)、消化器疾患(例えば、便秘、過敏性腸、及び嚥下障害)、心臓疾患(例えば、心不全、心臓ブロック、及び心筋症)、呼吸器疾患(例えば、呼吸不全、夜行性低換気、反復性誤嚥、及び肺炎)、内分泌疾患(例えば、糖尿病、甲状腺疾患、副甲状腺疾患、及び卵巣不全)、眼科疾患(例えば、視神経萎縮、白内障、眼筋麻痺、及び眼瞼下垂症)が挙げられる。小児において、mtDNA突然変異と関連すると考えられる障害としては、神経学的疾患(例えば、てんかん、ミオパチー、精神運動遅滞、運動失調症、痙直、筋失調症、及び感音性聴力低下)、消化器疾患(例えば、嘔吐、発育不良、及び嚥下障害)、心臓疾患(例えば、両室肥大性心筋症及びリズム異常)、呼吸器疾患(例えば、中枢性低換気及び無呼吸)、血液学的疾患(例えば、貧血及び汎血球減少症)、腎疾患(例えば、尿細管異常)、肝疾患(例えば、肝不全)、内分泌疾患(例えば、糖尿病及び副腎不全)、並びに眼科疾患(例えば、視神経萎縮)が挙げられる。したがって、本明細書に提供される方法及び組成物は、mtDNAの突然変異と関連する疾患及び障害の治療又は予防における用途が想定される。
他の具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法は、ミトコンドリア疾患又は障害を治療することを可能にし、ここで、該ミトコンドリア疾患又は障害は、核DNA異常によって引き起こされ、該核DNA異常は、ミトコンドリアDNA枯渇症候群-4A、ミトコンドリア劣性運動失調症候群(MIRAS)、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症(MNGIE)、ミトコンドリアDNA枯渇症候群(MTDPS)、DNAポリメラーゼγ(POLG)関連障害、感覚性運動失調型ニューロパチー構音障害眼筋麻痺(SANDO)、脳幹及び脊髄の障害並びに乳酸上昇を伴う白質脳症(LBSL)、補酵素Q10欠損症、リー症候群、ミトコンドリア複合体異常、フマラーゼ欠損症、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体(KGDHC)欠損症、スクシニル-CoAリガーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症(PDHC)、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症(PCD)、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT I)欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII(CPT II)欠損症、カルニチン-アシル-カルニチン(CACT)欠損症、常染色体優性/常染色体劣性進行性外眼筋麻痺(ad-/ar-PEO)、乳児発症性脊髄小脳萎縮症(IOSCA)、ミトコンドリアミオパチー(MM)脊髄性筋萎縮症(SMA)、成長遅延、アミノ酸尿症、胆汁鬱滞、鉄過負荷、早期死亡(GRACILE)、及びシャルコー・マリー・トゥース病2A型(CMT2A)からなる群から選択される。
mtDNAの突然変異を有する多くの個体は、カーンズ・セイヤー症候群(KSS)、慢性進行性外眼筋麻痺(CPEO)、乳酸アシドーシス及び卒中様発作を伴うミトコンドリア脳筋症(MELAS)、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん(MERRF)、運動失調症及び網膜色素変性症を伴う神経衰弱(NARP)、又はリー症候群(LS)などの、個別の臨床的症候群に分類される臨床的特徴群を示す。しかしながら、かなりの臨床的変動性が存在し、多くの個体は、重複する様々な疾患表現型(ミトコンドリア疾患又は障害の主な原因として浮上した、核遺伝子POLGの突然変異に起因するミトコンドリア劣性運動失調症候群(MIRAS)を含む)によってうまく説明される1つの特定のカテゴリーにきれいに当てはまらない。
ミトコンドリア障害が重要な役割を果たすことが知られている例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び筋萎縮性側索硬化症を含む、多くの神経変性疾患の発病が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ミトコンドリア疾患又は障害は、突然変異のタイプではなく、症状に従って、いくつかの症候群に亜分類される。例えば、ミトコンドリア症候群には、ミトコンドリアミオパチー、脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様症状(MELAS)、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん(MERRF)、並びにリー症候群が含まれる。
(5.4.3 ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療する方法)
また本明細書に提供されるのは、第5.2節及び/又は第5.3節に記載されている方法のいずれかに従って、ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療する方法である。いくつかの実施態様において、ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療する方法は、第5.2節及び/又は第5.3節に記載されている方法のいずれかに従って、MirCを作製し、その後、ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を該ミトコンドリア交換を必要としている対象に投与することを含む。
ミトコンドリア交換を必要としている対象は、機能不全ミトコンドリアを有する任意の対象を含む。ある実施態様において、該ミトコンドリア交換を必要としている対象は、年齢関連疾患、ミトコンドリア疾患もしくは障害、神経変性疾患、網膜疾患、糖尿病、聴覚障害、遺伝性疾患、又はその組合せを有する。ミトコンドリア交換から利益を得ることができる神経変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、フリードライヒ運動失調症、シャルコー・マリー・トゥース病、及び白質ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。網膜疾患は、湿潤もしくは乾燥加齢黄斑変性症、黄斑浮腫、又は緑内障であることができる。年齢関連疾患及び/又はミトコンドリア疾患もしくは障害などの、他の例示的な疾患は、第5.4.1節及び第5.4.2節でより詳細に記載されている。
ミトコンドリア交換を必要としている対象には、ミトコンドリア機能不全の素因があり、かつ無症状である対象が含まれ得る。例えば、該対象は、突然変異体mtDNAを有し得るが、例えば、ミトコンドリア疾患の兆候はない。これは、該疾患が成人発症疾患であるからである。それゆえ、本明細書に提供される方法を用いて、ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療することにより、本明細書に記載される疾患のいずれかを予防することもできる。
(5.5 iPSCを産生する方法)
本発明は、非多能性細胞から誘導性多能性幹細胞(iPSC)を産生する又はその産生を増強するための第5.2節及び第5.3節に記載されている方法も提供する。iPSCは、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycなどの幹細胞性因子の外因性発現を用いて、非多能性細胞から産生されることが示されている。さらに、少量のミトコンドリアDNA(mtDNA)コピーが未分化ESCで検出されているが、この数は、分化すると、ミトコンドリア成熟のレベルと一緒に増加する(Facucho-Oliveira JMらの文献、J Cell Sci 2007;120(Pt 22):4025-4034)。したがって、本発明は、本明細書に提供される方法を用いて、非多能性レシピエント細胞を、内在性mtDNAを低下させる作用因子と接触させて、該作用因子が非多能性細胞の内在性mtDNAを部分的に低下させるのに十分な期間、非多能性レシピエント細胞をインキュベートすることにより、非多能性のものにおける内在性mtDNAを低下させ、その後、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycの発現のための1以上の発現カセットを導入することにより、iPSCの作製を増強することができることも確認している。ある実施態様において、外因性mtDNA及び/又は外因性ミトコンドリアは、レシピエント細胞に非侵襲的に移入される。
Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycの発現用の1以上の発現カセットの導入は、内在性mtDNAを低下させる作用因子の導入前、導入中、又は導入後に起こり得ることが理解される。したがって、いくつかの実施態様において、iPSCを産生する方法は、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycの発現用の1以上の発現カセットを導入すること、非多能性レシピエント細胞を、内在性mtDNAを低下させる作用因子と接触させること、及び該作用因子が該レシピエント細胞の内在性mtDNAを部分的に低下させるのに十分な期間、該非多能性レシピエントをインキュベートすることを含む。
ある実施態様において、本方法は、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAをレシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、レシピエント細胞を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAとともにインキュベートすることをさらに含む。具体的な実施態様において、本方法は、内在性mtDNAの大部分を交換するのに十分な期間、レシピエント細胞を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAとともにインキュベートすることをさらに含む。外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNA及び/又は外因性ミトコンドリアを移入することを含む非多能性細胞からiPSCを産生する方法は、第5.3節に記載されている実施態様のいずれかを含むこともできる。
少量のミトコンドリアDNA(mtDNA)コピーが未分化胚性幹細胞(ESC)で検出されているので、本明細書に提供される方法を用いて、非多能性幹細胞の多能性を促進し、iPSCを作製するのに必要とされる外因性遺伝子の数を低下させることもできる。例えば、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法を用いて、非多能性レシピエント細胞を、内在性mtDNAを低下させる作用因子と接触させて、該作用因子が非多能性細胞の内在性mtDNAを部分的に低下させるのに十分な期間、非多能性レシピエント細胞をインキュベートすることにより、非多能性のものにおける内在性mtDNAを低下させ、その後、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycのうちの1つ又は複数を非多能性細胞に導入し、それにより、多能性幹細胞を作製することにより、iPSCを作製することもできる。いくつかの実施態様において、iPSCは、小分子作用因子のみを用いて、外因性因子なしで作製することすらできる。
ある実施態様において、iPSCは、突然変異体mtDNAを含有することができる。例えば、突然変異体mtDNAは、例えば、tRNAの点突然変異(例えば、MELAS)などの点突然変異を含有することができる。突然変異体mtDNAは、mtDNAの長い欠失を有するmtDNAを含むこともできる。他の実施態様において、iPSCを産生する際に使用するための非多能性細胞は、ヘテロプラスミックである。突然変異体mtDNAの組込みは、例えば、疾患モデルの作成を容易にすることができる。
いくつかの実施態様において、非多能性レシピエント細胞は、体細胞である。具体的な実施態様において、非多能性細胞は、線維芽細胞である。
iPSCの培養条件、同定、及び樹立は、当業者の技能の範囲内である。例えば、方法は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第8,058,065号及び第8,278,104号に提供されている方法を含む。
(5.6 ヘテロプラスミーを測定するためのアッセイ)
先に開示されているように、突然変異体mtDNA及び/又はヘテロプラスミーは、機能不全ミトコンドリアを生じさせることができる。それゆえ、mtDNA交換のための本明細書に提供される方法との関係においてミトコンドリア機能及び/又はmtDNA突然変異を評価するために有用なアッセイは、ミトコンドリア及び/又はmtDNA突然変異の機能性を決定又は予測するために使用することができる当業者に公知の任意のアッセイを含む。
例として、ミトコンドリア機能を決定するためのアッセイは、例えば、以下のもの:老化と関連する分泌因子(例えば、炎症促進性サイトカイン、プロテアーゼ、並びに増殖及び血管新生因子、例えば、IL-1、IL-6/VEGF、IL-8、及びCXCL9/MMP); Oroborosを使用することによるミトコンドリア機能; Keima-Redを使用することによるマイトファジー;ミトコンドリア透過性;ミトコンドリア膜電位;シトクロムcレベル;活性酸素種;細胞呼吸;活性化された自然免疫、過剰に活性化された解糖の無効化、ERストレスの緩和、mTOR-S6経路の抑制、及び細胞周期の測定のためのトランスクリプトミクス及びプロテオミクス;超精密顕微鏡検査によって観察され、専門ソフトウェアによって定量されるミトコンドリアダイナミクス、例えば、分裂及び融合のうちのいずれか1つの測定;又はミトコンドリア機能を測定する当技術分野で公知の任意のアッセイを含む。
様々なシークエンシング法を本明細書に提供される方法のいずれかと組み合わせて用いて、(1)突然変異体mtDNAを検出し、(2)ヘテロプラスミーを定量し、かつ/又は(3)外因性ミトコンドリア及び/もしくは外因性mtDNAの移入を評価もしくは確認することができる。約1,100ヌクレオチドのストレッチは、遺伝子を含まず、D-ループ、ディスプレイスメントループ、及び制御領域と呼ばれている。D-ループは、突然変異がミトコンドリアゲノム中の他の場所よりも高頻度に蓄積する2つの領域を含有する。この領域は、それぞれ、超可変領域HV1及びHV2と呼ばれる。したがって、いくつかの実施態様において、mtDNA突然変異は、mtDNAのD-ループの超可変領域(HV)(すなわち、HV1及び/又はHV2)をシークエンシングすることにより、本明細書に提供される方法との関連で同定することができる。mtDNAシークエンシングは、当技術分野で公知の任意のシークエンシング法を用いて実施することができる。具体的な実施態様において、シークエンシング法は、単一ヌクレオチド多型(SNP)アッセイを含む。他の実施態様において、シークエンシング法は、デジタルPCRを含む。具体的な実施態様において、デジタルPCRは、ドロップレットデジタルPCRである。
(5.7 組成物)
また本明細書に提供されるのは、第5.2節〜第5.5節に記載されている方法のいずれかによって得られた細胞の組成物である。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させ;(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)外因性ミトコンドリアを、該外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する:方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物であって、該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、組成物である。他の態様において、本明細書に提供されるのは、(a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させ;(b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ(c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する:方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物であって、該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、組成物である。
該組成物は、細胞をミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させ、その後、該薬剤が該レシピエント細胞における内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすることを含む、方法によって得ることもできる。いくつかの実施態様において、その後、内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下しているレシピエント細胞を、健康なドナー由来のいずれかの外因性ミトコンドリアと、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することができる。他の実施態様において、その後、内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下しているレシピエント細胞を、健康なドナー由来のいずれかの外因性mtDNAと、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することができる。いくつかの実施態様において、上記の方法によって作製されるミトコンドリア交換細胞は、5％超の外因性mtDNAを含む。
上記のように、外因性ミトコンドリアは、外因性mtDNAから構成されることができる。それゆえ、いくつかの実施態様において、外因性ミトコンドリアと外因性mtDNAの両方がレシピエント細胞に移入され、MirCは、外因性ミトコンドリアと外因性mtDNAの両方を有する。他の実施態様において、外因性mtDNAは、外因性ミトコンドリアを介して、レシピエント細胞に移入され、その後、外因性mtDNAは、内在性ミトコンドリアに送達される。ある状況において、外因性ミトコンドリアは、外因性mtDNAが内在性ミトコンドリアに送達された後に、細胞から除去される。したがって、いくつかの実施態様において、MirCは、外因性mtDNAを有し、外因性ミトコンドリアを有さない。
レシピエント細胞の内在性mtDNAが一部分解されるので、外因性ミトコンドリア、外因性mtDNA、又はその組合せを含むMirCは、外因性mtDNAと内在性mtDNAの両方を含有することができる。同様に、外因性ミトコンドリアがレシピエント細胞に移入されるシナリオにおいて、MirCは、外因性ミトコンドリアと内在性ミトコンドリアの両方を含有することができる。したがって、具体的な実施態様において、本明細書に提供される方法によって得られる1以上のミトコンドリア交換細胞の組成物は、内在性ミトコンドリアと外因性ミトコンドリアの組合せを有する。他の実施態様において、本明細書に提供される方法によって得られる1以上のミトコンドリア交換細胞の組成物は、内在性mtDNAと外因性mtDNAの組合せ(すなわち、ヘテロプラスミックmtDNA)を有する。またさらなる実施態様において、1以上のミトコンドリア交換細胞は、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前のレシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を有する。
本発明は、内在性mtDNAを低下させる作用因子又はミトコンドリア機能を低下させる作用因子及び第二の活性作用因子を含む、ミトコンドリア交換を作製する方法で使用するための組成物も含む。ある実施態様において、該組成物は、外因性ミトコンドリア、1以上のレシピエント細胞、又はその組合せをさらに含むことができる。またさらなる実施態様において、該組成物は、外因性mtDNAをさらに含むことができる。
第5.3節に記載されているように、様々な第二の活性作用因子は、1以上のミトコンドリア交換細胞を作製する方法で使用することができる。例えば、いくつかの実施態様において、第二の活性作用因子は、巨大分子、小分子、又は細胞療法を含み、かつ第二の活性作用因子は、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターから任意に選択される。
エンドサイトーシスのアクチベーターの使用は、MTS-XbaIRプラスミドで処理された細胞における外因性ミトコンドリアの取込みを増強することが分かったが、「付加」又は模擬トランスフェクト細胞における取込みを促進する効果がなく、これにより、外因性ミトコンドリアを移入するこのメカニズムが本明細書に提供される方法に特有であることが示された。エンドサイトーシスを活性化するのに好適な非限定的で例示的な化合物としては、例えば、ホルボール-12-ミリステート-13-アセテート(PMA)(C36H56O8)、12-O-テトラデカノイルホルボール 13-アセテート(TPA)(C36H56O8)、タンシノンIIAスルホン酸ナトリウム(TSN-SS)(C19H17O6S.Na)、及びホルボール-12,13-ジブチレート、又はこれらの誘導体が挙げられる。いくつかの実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、細胞代謝のモジュレーターを含む。
細胞代謝を調節することは、限定されないが、本明細書に及び引用参考文献に記載される技法を含む、いくつかの周知の技法のいずれかによって達成することができる。例えば、いくつかの実施態様において、細胞代謝を調節することは、栄養飢餓又は栄養欠乏によって実施される。他の実施態様において、細胞代謝を調節することは、化学インヒビター又は小分子によって実施される。具体的な実施態様において、化学インヒビター又は小分子は、mTORインヒビターである。
ラパマイシン、別名、シロリムス(CAS番号53123-88-9; C51H79NO13)及びラパマイシン誘導体(例えば、ラパマイシン類似体、別名、「ラパログ」)を含む、様々な化合物が、mTORを阻害することが知られている。ラパマイシン誘導体としては、例えば、テムシロリムス(CAS番号162635-04-3; C56H87NO16)、エベロリムス(CAS番号159351-69-6; C53H83NO14)、及びリダホロリムス(CAS番号572924-54-0;C53H84NO14P)が挙げられる。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される組成物は、ラパマイシン又はその誘導体を含む。細胞代謝を調節するための上記の実施態様は非限定的であり、細胞代謝を調節することは、化学化合物又は小分子を必要とせず、かつmTORを越える他の経路の調節を含むことができることが理解される。該組成物は、エンドサイトーシスのアクチベーターを任意に含むことができること、及びそれは、必要とされる構成要素ではないことも理解される。さらに、いくつかの実施態様において、本明細書に提供される発明は、例えば、非臨床現場でのmtDNA及び/又はミトコンドリアの非エンドサイトーシス媒介移入を含むことができる。
第5.5節に記載されているように、本発明は、ある実施態様において、内在性mtDNAを低下させる作用因子、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycの発現のための1以上の発現カセット、並びにレシピエント細胞を含む、非多能性細胞から誘導性多能性幹細胞(iPSC)を産生する方法で使用するための組成物も提供し、ここで、該レシピエント細胞は、非多能性細胞であり、ここで、内在性mtDNAを低下させる作用因子は、内在性mtDNAを低下させる作用因子で処理されていない非多能性細胞と比較して、非多能性細胞から誘導性多能性幹細胞(iPSC)を産生する効率を増大させるのに有効な量で存在する。いくつかの実施態様において、内在性mtDNAを低下させる作用因子は、内在性mtDNAを低下させる作用因子で処理されていない非多能性細胞と比較して、非多能性細胞から誘導性多能性幹細胞(iPSC)を産生する効率を増大させるのに有効な量で存在する。これは、1つには、多能性細胞がmtDNAコピー数の低下を有するという観察に基づく。具体的な実施態様において、iPSCを産生する方法で使用するための組成物は、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAをさらに含む。
本発明は、第5.4節に記載される、年齢関連疾患、ミトコンドリア疾患もしくは障害、神経変性疾患、糖尿病、遺伝性疾患、又はミトコンドリア交換を必要としている任意の対象の治療において使用するための医薬組成物も含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物であり、該細胞は、本明細書中、例えば、第5.2節〜第5.3節に記載される方法によって得られる。他の実施態様において、該医薬組成物は、健康なドナー由来の外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含み、かつ該細胞は、本明細書中、例えば、第5.2節〜第5.3節に記載される方法によって得られる。例えば、いくつかの実施態様において、外因性mtDNAを有するミトコンドリア交換細胞は、外因性ミトコンドリアを任意にさらに含むことができる。他の実施態様において、外因性mtDNAは、内在性ミトコンドリアに送達される外因性ミトコンドリアを介して細胞に移入され、その後、外因性ミトコンドリアは、レシピエント細胞から除去される。
本開示は、健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物も提供し、ここで、該細胞は、ミトコンドリア交換細胞を得るための本明細書に提供される方法のいずれかによって得られる。また別の態様において、本開示は、健康なドナー由来の外因性mtDNAを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物を提供し、ここで、該細胞は、ミトコンドリア交換細胞を得るための本明細書に提供される方法のいずれかによって得られる。いくつかの実施態様において、健康なドナー由来の外因性mtDNAを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物は、外因性ミトコンドリアをさらに含む。
例えば、いくつかの実施態様において、健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを含む医薬組成物は、細胞をmtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させ、その後、レシピエント細胞を、該作用因子が該レシピエント細胞の内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、インキュベートすることを含む方法によって得られる。いくつかの実施態様において、その後、部分的に低下している内在性mtDNAコピー数を有するレシピエント細胞を、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、健康なドナー由来のいずれかの外因性ミトコンドリアと共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することができる。他の実施態様において、その後、部分的に低下している内在性mtDNAコピー数を有するレシピエント細胞を、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、健康なドナー由来のいずれかの外因性mtDNAと共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することができる。いくつかの実施態様において、上記の方法によって作製されるミトコンドリア交換細胞は、5％超の外因性mtDNAを含む。
他の実施態様において、細胞は、細胞をミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させ、その後、該薬剤が該レシピエント細胞における内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすることを含む方法によって得られる。いくつかの実施態様において、その後、部分的に低下している内在性ミトコンドリア機能を有するレシピエント細胞を、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、健康なドナー由来のいずれかの外因性ミトコンドリアと共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することができる。他の実施態様において、その後、部分的に低下している内在性ミトコンドリア機能を有するレシピエント細胞を、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、健康なドナー由来のいずれかの外因性mtDNAと共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製することができる。いくつかの実施態様において、上記の方法によって作製されるミトコンドリア交換細胞は、5％超の外因性mtDNAを含む。ミトコンドリア機能を低下させる作用因子は、ミトコンドリア機能を一過性に又は恒久的に低下させることができる。該作用因子がミトコンドリア機能を一過性に低下させるか(例えば、可逆的インヒビター)又は恒久的に低下させるか(例えば、不可逆的インヒビター)を決定することができることは、当業者の技能の範囲内である。
本明細書に提供される医薬組成物のある実施態様において、細胞は、レシピエント細胞を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAと共インキュベートする前に、レシピエント細胞を第二の活性作用因子と接触させることを含むことをさらに含む方法によって得られる。いくつかの実施態様において、第二の活性作用因子は、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ第二の活性作用因子は、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される。具体的な実施態様において、エンドサイトーシスのアクチベーターは、細胞代謝のモジュレーターである。他の実施態様において、細胞代謝のモジュレーターは、栄養飢餓、化学インヒビター、又は小分子を含む。さらなる実施態様において、化学インヒビター又は小分子は、mTORインヒビターである。またさらなる実施態様において、該mTORインヒビターは、ラパマイシン又はその誘導体を含む。
上の第5.2節に記載されているように、様々なタイプの細胞をレシピエント細胞及びドナー細胞として使用することができる。例えば、本開示は、レシピエント細胞が哺乳動物である数多くの例を記載している。しかしながら、ミトコンドリアを有する任意の細胞がレシピエント細胞であることができることも理解される。それゆえ、レシピエント細胞は、植物細胞であることもできる。
いくつかの実施態様において、動物細胞は、哺乳動物である。具体的な実施態様において、細胞は、体細胞である。さらなる実施態様において、体細胞は、上皮細胞である。またさらなる実施態様において、上皮細胞は、胸腺上皮細胞(TEC)である。
本開示は、体細胞が免疫細胞である組成物も提供する。例えば、該組成物は、免疫細胞を含むことができ、ここで、該免疫細胞は、T細胞、例えば、疲弊したT細胞である。いくつかの実施態様において、該組成物は、外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAを含有する若返ったT細胞を含む。例えば、老化したT細胞又は老化しそうなT細胞(例えば、免疫老化したもの)は、レシピエント細胞としての役割を果たすことができ、T細胞由来MirCは、健康な外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAを有するT細胞を産生するための本明細書に提供される方法を用いて作製することができる。具体的な実施態様において、該T細胞は、CD4+ T細胞である。他の実施態様において、該T細胞は、CD8+ T細胞である。いくつかの実施態様において、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞である。例えば、いくつかの実施態様において、本開示は、癌細胞を死滅させるのに効果がある、CAR-T細胞であるMirCを提供する。MirC由来CARTは、免疫監視の増加及び癌細胞死滅化の増強を可能にする長期生存を有することができる。他の実施態様において、免疫細胞は、食細胞である。
上記のように、本明細書に提供される組成物は、細胞における老化の遅延及び/又は寿命の延長において使用するための組成物を含むこともできる。該組成物は、内在性ミトコンドリアを有する老化した又老化しそうな細胞、老化していない細胞由来の単離された外因性ミトコンドリア、及び内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子を含むことができる。該組成物は、内在性ミトコンドリアを有する老化した又老化しそうな細胞、老化していない細胞由来の単離された外因性ミトコンドリア、及びミトコンドリア機能を低下させる作用因子を含むこともできる。
また本明細書に提供されるのは、骨髄細胞であるレシピエント細胞に由来する1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物である。具体的な実施態様において、骨髄細胞は、造血幹細胞(HSC)又は間葉系幹細胞(MSC)である。例えば、HSC又はMSCは、ミトコンドリア疾患、年齢関連疾患を有するもしくはミトコンドリア疾患、年齢関連疾患を有することが疑われるか、又はそれ以外にミトコンドリア交換を必要としており、かつ外因性ミトコンドリアと交換された内在性ミトコンドリアを有する対象から単離することができる。その後、HSC又はMSC由来MirCを該ミトコンドリア交換を必要としている対象に移植して戻すことができる。またさらなる実施態様において、レシピエント細胞は、iPS細胞である。該組成物は、臨床現場で使用することができ、かつ年齢関連疾患の治療、ミトコンドリア疾患又は障害の治療、神経変性疾患の治療、糖尿病又は遺伝性疾患の治療に効果があり得る。例えば、いくつかの実施態様において、iPSCは、対象に投与して戻す前に、当技術分野で公知の方法を用いて、特定の細胞型に分化させることができる。
他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、低下した量の内在性mtDNAを有する単離された多能性細胞の集団を含む医薬組成物であり、ここで、該細胞は、第5.5節に記載されている実施態様のいずれかによって得られる。具体的な実施態様において、単離された多能性細胞の集団は、iPS細胞である。
本明細書に記載される細胞又は化合物の投与は、薬剤を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。本発明の医薬組成物は、医薬として許容し得る担体を含むことができる。具体的な実施態様において、「医薬として許容し得る」という用語は、動物、より特には、ヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか、又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた外国の薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。医薬として許容し得る担体は、投与される特定の組成物によって、及び組成物を投与するために使用される方法によって、ある程度決定される。したがって、本発明の医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する(例えば、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第17版、1985を参照)。
投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び製剤を等張性にする溶質を含有することができる、水性及び非水性溶液、等張滅菌溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実施において、組成物は、例えば、経口、鼻腔内、局所、静脈内、腹腔内、髄腔内、又は眼内(例えば、点眼もしくは注射により)投与することができる。化合物の製剤は、アンプル及びバイアルなどの、単位用量又は複数用量密閉容器中で提供することができる。溶液及び懸濁液は、先に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
本発明との関連において患者に投与される用量は、対象において経時的に有益な応答を誘発する、すなわち、対象の疾病を予防し、改善し、又は好転させるのに十分なものであるべきである。任意の患者についての最適な用量レベルは、利用される特定のモジュレーターの効力、患者の年齢、体重、身体活動性、及び食事、並びに他の薬物との考えられる組合せを含む、種々の因子によって決まる。用量のサイズも、特定の対象における特定の化合物又はベクターの投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定される。投与は、単一又は分割用量によって達成されることができる。
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載されているものに加えた本発明の様々な変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明白であろう。そのような変更は、付随する特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
本明細書に引用される特許、出願、公開出願、及び他の刊行物は全て、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。記載されている用語の任意の説明が引用により本明細書中に組み込まれた任意の文書と矛盾する場合、本明細書に記載されている用語の任意の説明が優先されるものとする。
本出願の全体を通して、様々な刊行物が言及されている。これらの刊行物の完全な開示は、本発明が属する分野の最先端をより十分に説明するために、本出願で引用により本明細書中に組み込まれる。本発明は、上で提供された例を参照して記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるべきである。
(6.実施例)
この節の実施例は、限定目的ではなく、例証目的で提供されている。以下の実施例は、本発明の例示的な実施態様として提示されている。これらは、本発明の広範な範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
(実施例I: MirCプロトコルの最適化は、XbaIがmtDNAをインビトロで分解し、MTS発現ベクターがミトコンドリアを標的とすることを明らかにした)
ミトコンドリア交換細胞(MirC)を作製するために使用された方法のスキームは、図1Aに提供されている。まず、当技術分野で公知の標準的な技法を用いてMTS-XbaI配列をpCAGGSベクターにクローニングすることにより、ミトコンドリア標的化配列(MTS)に融合したXbaI制限酵素を発現させるために使用される哺乳動物発現ベクターを人為的に作製した(図1B)。報告されているミトコンドリア移入シグナル(MTS)の中で、本発明者らは、ND4シグナル配列を本試験で利用した。得られた発現ベクターも、選択を可能にするためのピューロマイシン耐性遺伝子を含有していた(図1B)。
XbaIRは、最も強力なエンドヌクレアーゼのうちの1つであり、ヒトミトコンドリアゲノムのケンブリッジ参照配列(CRS)に従って命名されたmtDNAの標準配列は、特定のエンドヌクレアーゼによって標的化される5つもの認識部位を有する(図1D)。単離されたmtDNAがXbaIRによって複数の部位で消化されるインビトロエンドヌクレアーゼの共インキュベーションによって確認された(図1C)。対照的に、mtDNAのNotI消化は、ミトコンドリアDNAのケンブリッジ参照配列(CRS)によって予測されるような、単一の断片を示した(図1C)。
細胞へのプラスミドDNAの遺伝子移入プロトコルを、Nucleofectorエレクトロポレーションベースのトランスフェクション法を使用することにより、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現する正常ヒト皮膚線維芽(NHDF)細胞を用いて最適化した。2μg/mlのピューロマイシン曝露の1日後、90％を上回る有効性及び90％を上回る生存が達成された(図1E)。
MTS標的化配列の有効性を具体的に評価するために、EGFPと融合したMTSを担持するプラスミドを、EGFP遺伝子をXbaIR遺伝子の代わりにサブクローニングすることにより作製して、pCAGGS-MTS-EGFP-PuroRプラスミドを作製した(図1F)。正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)をMTS-EGFP発現ベクターでトンラスフェクトし、細胞を、無傷の膜電位を有する活性型ミトコンドリアに蓄積する細胞透過性色素であるTMRM(テトラメチルローダミン、メチルエステル)で対比染色した(図1G)。
まとめると、これらの結果は、XbaIを用いて、ミトコンドリアDNAを消化することができ、細胞生存に影響を及ぼすことなく、細胞を効率的にトランスフェクトすることができ、MTSを含有する発現ベクターがミトコンドリアを有効に標的化することができることを示した。
(実施例II:エンドヌクレアーゼMTS-XbaIR処理は従来のEtBr法と比べてmtDNAの分解の改善を示す)
臭化エチジウム(EtBr)を利用する従来法と比べたMTS-XbaIR発現ベクターの効率及び有効性を、図2Aに示されるスキームに従って評価した。DsRed標識ミトコンドリアを有する胎盤静脈内皮由来細胞株EPC100を、10％胎仔ウシ血清(FBS)及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含むピルビン酸非含有DMEM(Wako cat# 044-29765)中で培養し、0日目に、細胞を処理しないか(「正常」)、MTS-XbaIR発現ベクター(「MTS-XbaIR」)でトランスフェクトするか、又は50ng/mLのEtBrで処理するかのいずれかにした。1日目に、細胞を100μg/mLのピルビン酸塩及び50μg/mLのウリジンが補充された10％FBS及び1％P/Sを含むDMEM中で培養した。ハウスキーピング遺伝子のβ-アクチン(Actb)と比べてmtDNAを測定するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を当技術分野で公知の方法に従って3及び5日目に実施した。これらの結果は、XbaIRがmtDNAコピー数を2715.8141にまで低下させるのに対し、EtBr処理が、未処理細胞における6189.6867のDNAコピー数と同様である5169.1258までしかmtDNAコピー数を低下させないことを示した(図2B)。エンドヌクレアーゼ処理群におけるmtDNAの低下は、従来法で処理された群のmtDNAの低下よりも優れていたが、これは、完全な欠失ではなく、内在性mtDNAの約30％が残存した(図2B)。この部分的なmtDNAの低下を有する細胞をρ(-)細胞と称した。
EtBr群と比べた、MTS-XbaIR処理群における内在性mtDNAの分解の増強をDsRed標識ミトコンドリアの顕微鏡検査によってさらに確認した(図2C)。低下のレベルは、TMRM染色によって推定される残りの健康なミトコンドリア容量に反映され、これは、従来法で処理された群よりもXbaIR処理群で低かった(図2C)。さらに、NHDF細胞のFACS解析により、XbaIRで処理した後のTMRMの低下が示された(図2D)。
プラスミド遺伝子移入後のXbaIRの発現の動態をqPCRによって調べた。3日目に、発現は、ピークに達し、その後、7日目に0にまで減少した(図2E)。対象となる他の遺伝子(例えば、GFP)により、XbaIRと同じ動態が確認された(図2E)。蛍光画像により、トランスフェクション前と比較して、ピューロマイシン選択後のMTS-EGFP-PuroRプラスミドでトランスフェクトした細胞で生じるGFPの濃縮が確認された(図2F及び図2G)。GFP陽性細胞の画分は、ピューロマイシンを1日間曝露させることにより、ほぼ100％にまで顕著に増加した(図2F)。
これらの結果は、XbaIエンドヌクレアーゼ処理群におけるmtDNAコピー数の低下が、従来のEtBr法で処理された群よりも優れており、内在性mtDNAの全てを完全に欠失させるわけではないことを示した。さらに、ピューロマイシンを用いた短時間の選択により、MTSコンストラクトを発現する細胞の顕著な濃縮が可能になった。
(実施例III:レシピエント細胞でMTS-XbaIRコンストラクトを使用する内在性ミトコンドリアの部分的分解は外因性ドナー細胞からのミトコンドリア交換を可能にした)
健康なドナー細胞由来の外因性ミトコンドリアをXbaIにより媒介されるmtDNAの欠失によってレシピエント細胞に移入することができるかどうかを評価するために、NHDF細胞をMTS-GFP又はMTS-XbaIRプラスミドでトランスフェクトし、48時間後にピューロマイシンを用いて選択した。トランスフェクションから6日後、DsRedで標識された子宮の内皮に由来するヒト細胞株(EPC100として命名)由来の単離されたミトコンドリアをドナー細胞に移入した。プロトコルのスキームは、図3Aに示されている。
MTS-GFP又はMTS-XbaIのトランスフェクション及びピューロマイシンによる選択の後、ミトコンドリア含量をTMRM染色により評価した。図3Bに示されているように、MTS-GFPトランスフェクト細胞は、TMRMの強い染色を示し、NHDF細胞における高レベルのミトコンドリアを示した。対照的に、MTS-XbaIトランスフェクト細胞(ρ-)は、TMRM染色により可視化したとき、ミトコンドリア容量の低下を示した(図3B)。
核内のβ-アクチン(Actb)で調整した後の12S-rRNAのqPCRによってミトコンドリアDNAコピーの数を定量することにより、ミトコンドリアDNAの低下をさらに確認した(図3C)。6日目に、MTS-GFPでトランスフェクトされたNHDF対照細胞と比べて、MTS-XbaIトランスフェクト細胞(ρ-)の由来のミトコンドリアDNAの有意な低下が見られた(図3C)。ρ-細胞におけるミトコンドリアDNAの有意な低下は、アッセイ期間中持続し、これは、12日目に停止した。具体的には、コピー数は、6日目にもとのコピー数の約1/3にまで降下し、さらに、12日目にρ-細胞で約1/4にまで減少した(図3C)。
ミトコンドリアを、示差遠心分離により、DsRed-Mt EMCから単離した。簡潔に述べると、細胞を、プロテアーゼインヒビター混合物(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)を含有するホモジナイゼーションバッファー[HB; 20mM HEPES-KOH(pH 7.4)、220mMマンニトール、及び70mMスクロース]を含む培養皿から回収した。細胞ペレットをHBに再懸濁し、氷上で5分間インキュベートした。該細胞を氷上で27-ゲージ針の10回のストロークにより破壊した。ホモジネートを2回遠心分離して(400g、4℃、5分)、破壊されていない細胞を除去した。ミトコンドリアを遠心分離(6000g、4℃、5分)により回収し、HBに再懸濁した。Bio-Radタンパク質アッセイキット(Bio-Rad, Richmond, CA, USA)を用いて、単離されたミトコンドリアの量をタンパク質濃度として表した。単離されたミトコンドリアを、2mlの標準培地中、37℃、5％CO2下で24時間、細胞と共インキュベートすることにより、ミトコンドリア移入を行った。重要なことに、12日目の単離されたミトコンドリアとρ(-)細胞との共インキュベーションにより、対照NHDF細胞のレベルと同様の、mtDNAコピー数の有意な増加がもたらされた(図3C)。
図2C及び図2Dに示されている結果と一致して、ρ(-)細胞は、TMRMの可視化によって測定される、MTS-XbaIトランスフェクション後のミトコンドリア含量の低下を示した。重要なことに、ミトコンドリアの減少は、DsRed標識された単離されたミトコンドリアの取込みによって示されるように、ρ(-)細胞を単離された外因性ミトコンドリアと接触させることによりレスキューすることができた(図3D及び図3E)。対照的に、DsRedマーキングされ、かつ単離されたミトコンドリアとNHDF対照細胞又は模擬トランスフェクタントMTS-EGFP発現ベクターでトランスフェクトされたNHDF細胞のいずれかとの共培養により、外因性ミトコンドリアが細胞の周辺に集まり、凝集体を形成するが、内在化されないことが明らかになった(図3D、下のパネル)。ミトコンドリアのほんの一部は飲み込まれるものの、その大部分は、無傷の内在性ミトコンドリアを有する細胞の外側にあり、この期間中、DsRedの強度は維持された。DsRedの凝集体は、より小さく、かつより少なくなり、DsRedの強度は低下し、外因性ミトコンドリアを細胞膜上に集めた後、これらが飲み込まれ、そのミトコンドリアの膜部分が速やかに消化されることを示唆した。
既存の方法の比較から、本発明のエンドヌクレアーゼ法が外因性ミトコンドリアを有するミトコンドリア交換細胞を作製する際により効果的であることが示された(図3F)。例えば、本発明のエンドヌクレアーゼ法を、(1)本発明者らの以前の研究に記載さている付加ミトコンドリア移入法(例えば、Kitani, T.らの文献、J Cell Mol Med(2014)18, 1694を参照)又は(2)単離されたミトコンドリアと代謝的に健康な細胞とのスピノキュレーションを利用する最近報告された方法(例えば、Kim, M. J.らの文献、Sci Rep 8, 3330,(2018)を参照)と比較した(図3F)。以前に報告された方法(すなわち、ミトコンドリア添加;「Mt付加」又は800×gもしくは1500×gでのスピノキュレーション)はいずれも、DsRed標識外因性ミトコンドリアのFACS解析により測定したとき、外因性ミトコンドリアの顕著な移入を示さなかった(図3F)。他方、MTS-XbaIによって媒介される内在性ミトコンドリアの部分分解と、それに続く、非侵襲的移入又は外因性ミトコンドリア(Mt EPC100)を利用する本明細書に提供される新規の方法により、外因性ミトコンドリアの移入後の顕著なDsRed陽性率及び増大した平均蛍光強度が示された(図3F、右上のグラフ、右端の線)。
ミトコンドリア生物学で使用される以前に確立された方法では、ミトコンドリアの完全な欠失を有する細胞であるρ(0)細胞が利用された(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2010年9月23日に出願され、US 2011-0008778 A1として刊行された米国特許出願第12/747,771号を参照)。しかしながら、ρ(0)細胞は、外因性ミトコンドリアを飲み込むことができなかった(図3G〜図3I)。本明細書提示されるこれらの結果に基づいて、ρ(0)細胞は、マクロピノサイトーシスを受けるのに必要なエネルギーが不足しているため、外因性ミトコンドリアを飲み込むことができないという仮説が立てられた。この仮説を確認するために、本発明者らは、マイトファジーを誘導するアンチマイシンへの曝露によってρ(0)細胞を生成する遺伝子修飾細胞を設計し、ミトコンドリア移入レベルを調べた。結果は、外因性ミトコンドリアの飲込みがミトコンドリアの完全な欠失を有する細胞で起こらないことを示した(図3G〜図3I)。それゆえ、これらの結果は、完全な欠失ではなく、既存のmtDNAの部分欠失が外因性及び細胞外ミトコンドリアのマクロピノサイトーシスにおける重要な因子であることを示唆した。
さらに、DsRed標識外因性ミトコンドリアの取込みを、外因性ミトコンドリアで処理されたもしくは処理されていないρ(-)細胞、トランスフェクトされていない細胞(付加Mt)、又は模擬MTS-GFPプラスミドで処理された細胞でモニタリングした。DsRedの蛍光強度を、NIH画像ソフトウェアを用いて、24時間毎に定量した。初期強度に対する相対値を棒グラフで示した(図3J)。この定量により、単純な付加ミトコンドリア共インキュベーションと模擬トランスフェクタントとのミトコンドリア共インキュベーションが、単離されたミトコンドリアの凝集のために、同じ割合で強度を増大させることが示され、Ds-red標識ミトコンドリアの飲込みではなく、蓄積が示された。対照的に、単離された外因性ミトコンドリアと共インキュベートされたρ(-)細胞の強度は、時間とともに徐々に減少し、飲み込まれたミトコンドリアが分解されることが示唆された。
これらの結果は、MTS-XbaI発現ベクターが内在性ミトコンドリアの部分欠失を有するρ(-)細胞を生成させることができること、及びミトコンドリア含量がドナー細胞由来の単離された外因性ミトコンドリアを移入することによりレスキューされることができることを示した。本明細書に記載されているように、本発明の方法は、以前に記載された方法、例えば、遠心分離と組み合わせて実施される方法、又は内在性mtDNAの部分的な低下を伴わない、ミトコンドリアの単純な「添加」と比べて、ミトコンドリア移入の効率の改善をもたらす。しかしながら、ミトコンドリア移入は、内在性ミトコンドリアの完全な分解を有する細胞(ρ(0)細胞)で行われることができず、これにより、外因性ミトコンドリアの取込みがエネルギーを必要とする可能性が高いことが示された。
(実施例IV:単離された外因性ミトコンドリアは、内在性ミトコンドリアと融合して、ドナーmtDNAを移入する)
無傷のミトコンドリアのミトコンドリア移入がどのようにして起こるかをさらに解明するために、細胞に移入されたミトコンドリアの運命を外膜及び内膜並びに核様体で別々に調べた。ある状況において、一過性のミトコンドリア間融合事象が観察されており、この場合、2つのミトコンドリアが近接して並ぶ状態になり、可溶性膜間スペースタンパク質とマトリックスタンパク質を交換し、再び離れて、もとの形態を保持する(例えば、Liu Xらの文献、EMBO J. 2009;28(20):3074-3089; Huang Xらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(8):2846-2851を参照)。それゆえ、一過性のミトコンドリア間融合事象を本明細書に記載される条件下で解析した。
EPC100ドナー細胞由来の単離されたミトコンドリアをDsRedで標識し、EGFPでマーキングされたミトコンドリアを有するレシピエント細胞を使用した。利用されたプロトコルの図式は、図4Aに示されている。ドナーと内在ミトコンドリアの一時的な接触の顕微鏡画像から、広範なミトコンドリア融合が観察されないことが明らかになった(図4B及び図4C)。ドナーミトコンドリアの大部分は、内在性ミトコンドリアとは別々に存在していた。さらに、わずかな一過性融合画像が観察され、その後、ドナーミトコンドリアは、それが最終的に消える前に、逃げ去るように見えた(図4C)。
図4Fに示されているプロトコルに従って、ミトコンドリア移入を実施した。簡潔に述べると、レシピエントNHDF細胞のミトコンドリアをDsRedマーキングされたものでマーキングし(図4D)、ドナーEPC100細胞由来のミトコンドリアを、mtDNAに結合し、ミトコンドリアの追跡を可能にするTFAMでマーキングした(図4E)。レシピエントNHDF細胞をpCAGGS-MTS-XbaIR-P2A-PuroR発現ベクターでトランスフェクトし、2日目に、ピューロマイシンで24時間選択した。6日目に、EPC100ドナー細胞由来のTFAM-GFP標識ミトコンドリアからのミトコンドリア移入を実施した。その後、8日目に、細胞をイメージングした。ミトコンドリア移入の顕微鏡検査により、ドナー核様体が既存のミトコンドリアマトリックスに沈着することが明らかになった(図4G)。外因性ミトコンドリアは、レシピエントのミトコンドリアと一過性に接触し、TFAMを含むミトコンドリア核様体が一過性の接触によって既存のミトコンドリアに移入されることを示唆した。
これらの結果は、ドナーミトコンドリアがレシピエント細胞のミトコンドリアマトリックスに移入され、既存のミトコンドリアの低下を受けて優位になることを示している。さらに、これらの実験によれば、ほぼ全ての単離されたミトコンドリアが飲み込まれた。他方、付加型のミトコンドリア移入トランスフェクタント及び模擬トランスフェクタントは、厳格な飲込みを示すのではなく、これらの外因性ミトコンドリアの大部分を細胞表面に凝集させた。
まとめると、実施例III及びIVの結果は、ρ(-)細胞が飲み込まれたミトコンドリアを分解すること(図3J)、及び外因性ミトコンドリアが既存のミトコンドリアと一時的に接触し(図4B〜図4C)、その一方、TFAMを有する外因性mtDNAが既存のミトコンドリア中に存在すること(図4G)を示している。
したがって、外因性ミトコンドリアは、内在性ミトコンドリアと短時間相互作用し、この短時間の接触の間、mtDNAを輸送することができるという仮説が立てられる。その場合は、外因性ミトコンドリア膜複合体を細胞質ゾル中で分解して、ミトコンドリアの再構築のための構成要素を提供することができる。外因性ミトコンドリアを受容するレシピエント細胞のミトコンドリアは、ミトコンドリア膜複合体を徐々に再構築することができ、機能的回復を示す。
(実施例V: SNPアッセイにより、単離された外因性ミトコンドリアの移入後に外因性ミトコンドリアの増加が検出された)
mtDNA交換後のmtDNAの起源を評価するために、超可変領域1及び2をシークエンシングすることによりNHDFとEPC100の間で同定された異なるヌクレオチドを使用した(図5A及び図5B)。NHDFがCRSの16362の位置にAを保持している一方、EPC100は、AからGへの変化をもたらす同じ位置に突然変異を保有する(図5B)。重要なことに、ミトコンドリア交換ρ(-)細胞(NHDFρ(-)Mt)の評価から、非主要波中のもとのヌクレオチドと主要波中の外因性ヌクレオチドGの両方の存在が示され、これにより、該細胞がヘテロプラスミックであることが示された(図5B、下のパネル)。
ミトコンドリア交換NHDFにおけるヘテロプラスミーを、レシピエントNHDFとドナーEPC100の違いを検出するための単一ヌクレオチド多型アッセイによってさらに評価した(図5C)。hmt16318-Fプライマー
Figure 2021533827
 及びhmt16414-Rプライマー
Figure 2021533827
 を用いて、HV1領域を増幅し、NHDF特異的プローブ
Figure 2021533827
 及びEPC100特異的プローブ
Figure 2021533827
 を用いて、SNPを検出した(図5C)。SNPアッセイ結果は、EPC100対NHDFの比が、mtDNA交換後12日目に、66.6％に達することを示した(図5D)。この結果は、以前の方法からの予期せぬ改善であり、これは、細胞外ミトコンドリアの比較的小さい部分がヒト子宮内膜腺由来間葉系細胞によって飲み込まれる結果を生じ、ヘテロプラスミーレベルに対してほとんど効果がなかった(例えば、Kitani, T.らの文献、Journal of Cellular and Molecular Medicine, 18, 1694-1703(2014)を参照)。
これらの結果は、mtDNAと外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAとの交換のための本明細書に提供される方法が完全に新規のものであり、かつ既存の技術を超える改善であることを示している。上記のように、提供されている方法は、MTS-XbaIによって媒介される内在性ミトコンドリアの分解後のミトコンドリアの移入によって、結果的に外因性mtDNAが優勢なmtDNAとなることができることを示している。
(実施例VI:交換されたミトコンドリアはエネルギーを生成し、MirCは正常な対象細胞と同様の表現型の回復を示す)
交換されたミトコンドリアがエネルギーを生成するように機能するかどうかを、製造元の指示に従ってOroboros O2kを使用することにより調べた。陰性対照細胞、ρ(-)細胞、及びミトコンドリア交換細胞に関する代表的な酸素消費速度曲線を作成し、その後、呼吸流量及び制御比を計算した(図6A及び図6B)。基礎呼吸、電子伝達系の最大能力、及びATP産生(自由ルーチン活性)は全て、同様の動態を示し、これらの指標がρ(-)細胞で有意に減少することを示した(図6B、上の列)。重要なことに、これらの指標は、ミトコンドリア交換細胞では、もとの値にまで回復した(図6A及び図6B)。非ミトコンドリアATP産生(ROX)は上方調節され、共役比はρ(-)細胞で下方調節された(図6B、下の列)。ρ(-)細胞におけるエネルギー供給機構は、ミトコンドリアATP生成から解糖に傾き、これらの変化は、mtDNA交換後にもとに戻った(図6B、右上)。
さらに、ミトコンドリア交換細胞(MirC)の表現型回復がその増殖能によって示された(図6C)。具体的には、ρ(-)細胞が低い増殖能を示したのに対し、MirCは、6〜12日までに、対照細胞の増殖能に近いレベルにまで回復した(図6C、右)。
これらの結果は、この方法が臨床的に適用可能な材料とのmtDNA交換を提供し、ミトコンドリア交換細胞(MirC)の表現型回復を可能にする機能的ミトコンドリアを有する細胞を生じさせることを示した。
(実施例VII:ラパマイシンによるmTORの阻害はρ(-)細胞における外因性ミトコンドリアのマクロピノサイトーシスを増強する)
MirCを受ける細胞の能力を増大させる方法を決定するために、外因性ミトコンドリアのマクロピノサイトーシスを調節するメカニズムを調べた。ρ(-)細胞は、ミトコンドリアの低下の結果としてATPを消耗するので、ρ(-)細胞の細胞内エネルギー状態は飢餓状態と同様であるという仮説が立てられた。この趣旨で、2つの分子経路:ラパマイシン複合体1(mTORC1)及びAMP活性化タンパク質キナーゼ(AMPK)の哺乳動物標的を調べた。mTORC1は、アミノ酸、エネルギー、酸素、及び成長因子の不可欠なセンサーであり、かつタンパク質、脂質、及びヌクレオチド合成の重要な調節因子である。AMPKは、AMPレベルのセンサーであり、その活性化は、オートファジー、ミトコンドリア生合成、解糖、及び脂肪分解をもたらす。両方の経路は、細胞外栄養の取込みに関与している。
図6Dに示されているように、ρ(-)細胞におけるマクロピノサイトーシスのメカニズムを調べるために、飢餓を用いて、AMPK/mTORC1を刺激し、その一方で、「薬物」のパルミチン酸及びラパマイシンを用いて、それぞれ、特異的にmTORC1活性化を刺激し、mTORC1を抑制した。ラパマイシンを、50ng/mlの濃度で24時間、培養培地中に添加し、血清を含まないグルコース及び必須アミノ酸非含有培地に、細胞を1時間曝露させて、飢餓を刺激した。パルミチン酸(PA)は、インビボで200μMの濃度でmTORC1を活性化することが報告されたが、培養線維芽細胞についてのPAの力価測定により、50μMの濃度及び24時間の持続時間が細胞生存率に基づいて最適であることが示された。リン酸化AMPKとAMPKとの比及びリン酸化p70 S6キナーゼとp70 S6キナーゼ(これは、mTORC1の下流標的である)との比を、キャピラリー電気泳動Wes(商標)(Protein Simple)を使用することにより調べた。
PA又はラパマイシンによる処理により、AMPK経路は、ρ(-)細胞で顕著には活性化されないが(図6G及び図6H)、mTORC1経路は、pS6/S6によって測定したとき、飢餓及びラパマイシンと同様のレベルで、ρ(-)細胞で劇的に抑制される(図6E〜図6F)ことを示した。これらの結果は、mTORC1がρ(-)細胞におけるミトコンドリアのマクロピノサイトーシスの重要な標的に相当することを示した。
次に、本発明者らは、細胞をミトコンドリア共培養時にラパマイシン又はパルミチン酸で同時に処理することにより、ミトコンドリア飲込み時のラパマイシン及びパルミチン酸の効果を調べた。プロトコルのスキームは、図6Iに示されている。簡潔に述べると、NHDFレシピエント細胞をMTS-XbaI発現ベクターでトランスフェクトし、ラパマイシンありもしくはなしで、又はパルミチン酸(PA)ありもしくはなしで培養した。MTS-XbaIを発現するρ(-)細胞のピューロマイシン選択を48時間後に実施した。6日目に、EPC100細胞由来のDsRedでマーキングされた単離されたミトコンドリアの移入を実施した。8日目に、FACS解析を実施して、NHDFレシピエント細胞におけるDsRed発現を測定することにより、ドナーミトコンドリアを検出した。
図6I〜図6Lに示されているように、ラパマイシン処理がDsRed標識された単離された外因性ミトコンドリアの飲込みを有意に増強したのに対し、パルミチン酸は、それを明らかに抑制した。これらの実験を4回繰り返し、陽性率をまとめ、これにより、ρ(-)細胞に対するラパマイシンとパルミチン酸の統計的に有意な差が示された(図6I及び図6K)。特に、模擬トランスフェクションと付加型のミトコンドリア移入の両方において、有意差はなかった。さらに、これらの結果は、mTORC1活性を調節する効果がρ(-)細胞のミトコンドリア移入にしか影響を及ぼさず、「付加」又は模擬トランスフェクト細胞に効果がないことを示し、これにより、外因性ミトコンドリアを移入するこのメカニズムが本明細書に提供される発明に特有のものであることが示された。
これらの結果は、ミトコンドリア移入時のラパマイシンによるmTORC1の活性化がミトコンドリアのマクロピノサイトーシスを増強することができることを示している。さらに、これらの方法は、臨床的に利用可能な薬物であるラパマイシンを用いて、MirC作製のためのマクロピノサイトーシスの効率を増大させることができることを示している。
(実施例VIII:リー症候群を有する患者に由来する線維芽細胞におけるヘテロプラスミー逆転を伴うmtDNA交換)
ミトコンドリア疾患細胞がインビトロのmtDNA交換技法を使用することにより矯正され得るかどうかを調べるために、mtDNA T10158C突然変異を有するリー症候群と診断された患者に由来する初代線維芽細胞(7SP)をレシピエント細胞として使用した(図7A)。先にNHDF細胞で記載された同じプロトコルを7SP線維芽細胞に適用した。10158番目のヌクレオチドにおけるEPC100ドナーミトコンドリアのmtDNAのDNAシークエンシングがTであると確認されたのに対し(図7B、上)、7SP線維芽細胞は、ヘテロプラスミーを示す、主要波のTと非主要波のCのモザイクを有していた(図7B、下)。
7S線維芽細胞におけるmtDNAの含量の動態は、ミトコンドリア交換後のNHDFとほぼ同じであった(図7C及び図7J)。低速度撮影観察により、ρ(-)7SP線維芽細胞はρ(-)NHDF細胞の挙動と同じ挙動を示すことが明らかになった。特に、ρ(-)細胞の表面の外因性ミトコンドリアの蓄積した凝集体は、時間とともにより小さく、かつより少なくなり、細胞質ゾル中のDsRedの強度は、速やかに低下し、細胞質ゾルへの効率的な飲込み及び細胞質ゾル中の消化を示唆し、これは、ρ(-)NHDF細胞を用いてもたらされる結果と一致した。
重要なことに、ミトコンドリア交換後のmtDNAコピーの数は、12日目に、もとの7S線維芽細胞のmtDNAコピーの数と同じ値にまで回復した(図7D)。他方、7SP線維芽細胞の模擬トランスフェクタント(付加型ミトコンドリア移入)は、同じ条件下の単離されたミトコンドリアと同じ共培養にもかかわらず、mtDNAコピーの数を増大させることすらできず、外因性ミトコンドリアの低い移入を示した(図7D、明灰色の棒)。
10158ヌクレオチドを含むミトコンドリアゲノム断片をシークエンシングすることにより、7S線維芽細胞のミトコンドリアが外因性かつ健康なmtDNAを含有するかどうかを調べた。図7Eに示されているように、7SP細胞のmtDNA配列は、ミトコンドリア交換後のレシピエント7SPρ(-)細胞において、10158ヌクレオチド位置に大部分の突然変異体ヘテロプラスミーを有するもの(Cの大きい波及びTの小さい波)から大部分の野生型mtDNAを有するもの(Tの大きい波及びCの小さい波)に変化した(図7E、下)。
定量的情報をもたらすために、単一ヌクレオチド多型(SNP)アッセイを実施して、この技術を用いてもたらされるヘテロプラスミーを推定した。hmt10085-Fプライマー
Figure 2021533827
 及びhmt10184-Rプライマー
Figure 2021533827
 並びにEPC100特異的プローブ
Figure 2021533827
 又は7SP特異的プローブ
Figure 2021533827
 を用いて、ミトコンドリアDNAのND3領域を増幅した(図7F)。これらの結果は、7SP線維芽細胞におけるもとのhmt10158ヘテロプラスミーレベルが約90％突然変異体mtDNAであることを示した(図7G)。ミトコンドリア移入を受容した7SP細胞(7SP ρ(-)Mt)におけるヘテロプラスミーが、交換後12日目に、わずか10％のヘテロプラスミーレベルを示したのに対し(図7G)、模擬トランスフェクタント(付加型ミトコンドリア移入)は、ヘテロプラスミーを有意には変化させず、ほぼ同じ比率又は90％超を維持した(図7H及び図7I)。これらの結果は、本明細書に提供されるミトコンドリア交換技術が以前に報告されている付加ミトコンドリア移入よりも優れていることを示した。エンドヌクレアーゼ処理を経たρ(-)細胞は、mtDNAコピーの数の約80％低下を伴って、ヘテロプラスミーを約75％にまで向上させた。
まとめると、これらの結果は、MTS-XbaIを用いて内在性ミトコンドリアを部分的に低下させる本明細書に記載されるミトコンドリア交換細胞を作製する方法を、ミトコンドリア疾患又は障害を有する対象由来の細胞で効果的に用いて、ヘテロプラスミーレベルを改善し、突然変異体mtDNAの量を低下させることができることを示している。
(実施例IX:リー症候群を有する患者に由来する線維芽細胞におけるmtDNA交換は細胞寿命及び細胞代謝の改善をもたらす)
ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞の機能的活性を評価した。図8A及び図8Bに示されているように、ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞(ρ(-)Mt)細胞の増殖は、12日目頃に、もとの7SP線維芽細胞のレベルと同等のレベルにまで回復することができた。
さらに、ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞(ρ(-)Mt)細胞が約63回の集団倍加レベル(PDL)まで、寿命の劇的な延長を示した一方で、倍加時間は、成長停止の閾値である120時間を超えた(図8C)。約8回のPDLでmtDNA交換を受容した細胞及び健康なmtDNAを有する再構築された細胞は、55回のPDLを超えて分裂し続けることができ、これは、細胞分裂が停止する前に、正常なヒト細胞集団が分裂する回数(すなわち、ハイフリックの限界)であると考えられる。対照的に、未処理の7S線維芽細胞は、25回のPDLで老化状態になった(図8C)。したがって、この実験から、mtDNA交換がミトコンドリア疾患細胞の増殖及び寿命に顕著な影響を及ぼすことが示された。老化が年齢とともに増大し、癌細胞がミトコンドリア機能不全を伴うことが多いことを考慮すると、この方法は、若返りの決定的な手がかりを提供する可能性があり、かつこれは、癌療法及び他の年齢関連疾患の療法に対する新規の戦略の基礎を提供する可能性がある。
細胞のサイズを測定することにより、7S線維芽細胞におけるミトコンドリア移入の機能的効果をさらに評価した(図8D)。呼吸鎖中の複合体IのND4遺伝子のコード配列中の7S線維芽細胞における突然変異によって、マトリックスから膜間空間へとプロトンを汲み上げるその機能と相まって電子を伝達する複合体Iの障害がもたらされた。結果として、解糖は、7S線維芽細胞におけるミトコンドリアATP産生に対して優位となり、かつその損傷及び低い機能にもかかわらず、より多くのミトコンドリアを含有するように、細胞サイズがより大きくなる代償的適応をもたらす(図8D)。PDL 15(黒の実線)と比べて、PDL 25によって、7S線維芽細胞の直径は、NHDFの直径よりも約1.5倍大きく、細胞サイズの増加は、PDL 35によって倍加し、最終的に、そのサイズは、約3〜8倍大きくなるまで増加した(図8D、左)。
mtDNA交換後の7SP細胞の機能的回復と一致して、7SP線維芽細胞において早期のPDLで観察される細胞サイズの著しい増加は、ミトコンドリア交換後に阻害された(図8D、右)。さらに、PDL 8で外因性ミトコンドリアを受容するミトコンドリア交換7SP細胞のサイズは、50回目のPDLまでずっと維持された(図8D、右)。さらに、クエン酸シンテターゼ(CS)の濃度は、10回目のPDLまでに、NHDF細胞におけるCS濃度よりも7SP線維芽細胞で2倍高く、これは、7SP線維芽細胞のサイズ上昇の増加と一致している(データは示さない)。
ミトコンドリア交換後の観察された細胞機能の向上が他の細胞型の混入によるものではないことを確認するために、様々な起源を有する細胞を明確に識別することができる短いタンデムリピート(STR)アッセイを実施した(図8E)。重要なことに、異なる時点でのミトコンドリア交換細胞におけるSTRのパターンは、もとの7SP線維芽細胞のSTRのパターンと完全に同一であり(図8E)、これにより、混入がないことが示された。さらに、RT-PCRにより、テロメラーゼ及びE6を発現する細胞に由来する外因性ミトコンドリアの移入が初代線維芽細胞を癌細胞に形質転換しないことが明らかになった(図8F)。
まとめると、これらの結果は、リー症候群を有する患者に由来する7SP細胞への野生型mtDNAを有する外因性単離されたミトコンドリアのミトコンドリア移入が7SP細胞の寿命を増大させ、かつ細胞機能を改善することを示した。重要なことに、この移入は、ミトコンドリア交換7SP細胞を癌細胞に形質転換しなかった。
(実施例X:リー症候群を有する患者に由来する線維芽細胞への外因性ミトコンドリアの移入は機能的ミトコンドリアを生み出す)
Oroboros O2kを使用することによって、細胞の呼吸機能を解析することにより、7SP線維芽細胞におけるミトコンドリア交換の機能的効果をさらに評価した(図9A)。結果の定量により、基礎呼吸及びATP産生(自由ルーチン活性)が、ミトコンドリア交換細胞の作製後、10回目のPDLから20回目のPDLまで減少し続け、電子伝達系の最大能力が7SP線維芽細胞のもとのレベルを維持することが示された(図9B)。外因性ミトコンドリアの移入後、30回目のPDLまでに、呼吸機能の3つ全ての指標(通常、ETS、及び自由ルーチン活性)は上昇し、もとの細胞のレベルを上回りさえした(図9B)。これらの結果は、mtDNA交換後、電子伝達系を健康でかつ突然変異していない複合体Iで再構築するのにわずかな遅れがあることを示した。プロトン漏出は、非ミトコンドリアATP産生の動態と同じ動態を示し、これは、初期段階から着実に改善された(図9B)。
これらの結果は、ミトコンドリア疾患又は障害を有する患者に由来する線維芽細胞への外因性ミトコンドリアの移入が機能的ミトコンドリアを生み出すことができることを示した。
(実施例XI:外因性ミトコンドリアの移入は慢性的かつ持続的な活性酸素種(ROS)発生を消失させることができる)
7SP線維芽細胞由来MirCの特性を特徴付けるために、培養条件下の再灌流と飢餓モデルの両方を、7SP線維芽細胞由来MirC、もとの7SP線維芽細胞、及び対照としてのNHDFに使用した。これらのストレス条件は、培養細胞においてアポトーシスを誘導し、その程度は、初期マーカーとしてのアネキシンV及び後期マーカーとしてのヨウ化プロピジウム(PI)によって定量することができる。環境障害の中で、再灌流傷害がミトコンドリア機能不全に主として寄与する。mtDNA突然変異が原因でミトコンドリア機能不全の素因がある細胞は、健康な細胞よりも再灌流傷害に対して脆弱である。
細胞をウェル当たり1×105細胞で6ウェルプレートに播種した。翌日、600μM H2O2(FUJIFILM Wako Pure Chemical)を再灌流モデル用の細胞に添加するか、又は血清を含まない必須アミノ酸非含有(「-EAA」)DMEM(FUJIFILM Wako Pure Chemical)を飢餓モデル用の培養培地として使用した。3時間のH2O2又は48時間の飢餓処理の後、細胞をPBSで洗浄し、遠心分離チューブに回収した。アネキシンV-FITC及びPI溶液を細胞に添加し、遮光して、室温で30分間反応させておいた。その後、細胞を、488及び561nmのレーザーラインを用いるFCM解析に速やかに供した。SH800(Sony)を用いて、蛍光データを収集した。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を使用することにより、フローサイトメトリーファイルを解析した。
これらの結果は、リー症候群を有する対象に由来する7SP細胞が両方の形態のストレス(すなわち、H2O2及び飢餓)に極めて影響されやすいことを示した。図10A〜10Dに示されているように、H2O2で処理された7SP細胞は、初期アポトーシスと後期アポトーシスの両方の有意な増加を示した。再灌流モデル(H2O2)において、NHDFは、アネキシンV及びPI染色に基づく、アポトーシスのプロセスにおける顕著な損傷を示さなかった(図10B〜図10D)。しかしながら、この軽度の再灌流ストレスは、7SP線維芽細胞におけるアポトーシスを誘導した。対照的に、7SP線維芽細胞由来MirCにおけるアネキシンVとPIの両方の陽性率は、親7SP線維芽細胞よりも有意に低く、NHDF細胞のレベルに近かった(図10B〜図10D)。重要なことに、7SP線維芽細胞由来MirCとNHDFの間に有意差はなく、MirCがこの軽度の再灌流傷害に耐える能力を取り戻すことを示唆した。
再灌流と同じ傾向は、飢餓モデルを用いて認められた(図10E〜図10H)。初期と後期の両方におけるより多くのアポトーシスが7SP線維芽細胞で示されたのに対し、7SP線維芽細胞由来MirCは、NHDFとほぼ同じレベルの基底値のアポトーシスを示し、これは、もとの7SP線維芽細胞のものよりも有意に低かった(図10F〜図10H)。これらの結果は、本発明のミトコンドリア交換方法がレシピエント細胞の機能的回復を向上させることをさらに裏付けている。
これらの結果は、健康な細胞から突然変異体mtDNAを有する細胞への外因性ミトコンドリアの移入がレシピエント細胞の機能を向上させることができることを示した。
(実施例XII:レシピエント細胞への外因性ミトコンドリアの移入は初期段階の老化関連分泌表現型(SASP)を逆転させた)
本実施例は、レシピエント細胞への外因性ミトコンドリアの移入が初期段階の老化関連分泌表現型(SASP)を逆転させたことを示している。炎症性サイトカイン、成長因子、及びプロテアーゼからなるSASPは、老化した細胞の特徴的な特色である。
老化した細胞への外因性ミトコンドリアの移入がSASPを逆転させることができるかどうかを決定するために、代表的なSASPサイトカインIL-6及びIL-8、ケモカインCXCL-1、及び成長因子ICAM1の発現レベルを、そのPDLがほぼ同じの約15〜20であるNHDF、7SP線維芽細胞、及び7SP線維芽細胞由来MirC細胞について、転写レベルで定量的に測定した(図11)。IL-6がNHDF及び7SP線維芽細胞由来MirCよりも7SP線維芽細胞で有意に高かったのに対し、他の3つの因子は、これらの細胞間で有意差を示さなかった。このPDLで、7SP線維芽細胞は、典型的なSASPを示さなかったが、より高いIL-6発現だけは示し、老化の初期段階を示唆した。重要なことに、7SP線維芽細胞由来MirCのこのPDLにおける初期段階の老化のプロセスを逆転させることができた。
まとめると、これらのデータは、ミトコンドリア交換がmtDNAの突然変異を伴うミトコンドリア疾患を治療するだけでなく、神経変性、心臓血管、代謝、及び自己免疫疾患、並びに癌さえも含む様々な疾患に関与する細胞などの、老化した細胞を若返らせることもできることを示している。
(実施例XIII: mtDNA交換線維芽細胞から作製されたiPS細胞)
mtDNAの長い欠失を有する患者に由来する細胞を用いて、誘導性多能性幹細胞(iPSC)を作製することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、NHDFによく効果を発揮するOct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Myc(OKSM)を担持するセンダイウイルスを用いる標準的な方法を用いて、7SP線維芽細胞からiPSCを構築することを試みた。プロトコル設計の図式は、図12Aに示されている。
初期段階のiPSCコロニーを検出するアルカリホスファターゼ染色(AP染色)により、もとの7SP線維芽細胞由来コロニーが崩れそうな外観を有するように見えるのに対し、ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞由来コロニーは21日目に頑丈であることが示された(図12B)。対照的に、mtDNA交換を受容していないρ(-)7SP線維芽細胞は、コロニーを生成しなかった(図12B)。AP染色によって測定したとき、iPS細胞のいくつかの株は、ミトコンドリア交換7S線維芽細胞から作製することができた(図12C及び図12D)。iPSCクローンは、培養下で安定であり、独立したコロニー間で同様の形態を示した(図12E)。免疫組織化学染色により、OKSMを過剰発現するミトコンドリア交換7SP線維芽細胞由来コロニー上でのヒト多能性幹細胞マーカーであるSOX2、OCT3/4、NANOG、SSEA4、TRA1-81、及びTRA1-60の発現が確認された(図12F)。
本明細書に記載される方法によって作製されるiPSCを市販のKYOU-DXR0109B ヒト誘導性多能性幹(IPS)細胞[201B7]とさらに比較した。重要なことに、ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞は、iPS作製に関して健康な線維芽細胞の効率と同じレベルの効率を示した。さらに、以前の研究と一致して、核β-アクチンに対して標準化された12S-rRNAのqPCRにより、ミトコンドリア交換7SP線維芽細胞によって作製されたiPS細胞は、対照と比べて、半分のmtDNA含量を示し、mtDNAレベルは、201B7 iPSC標準のレベルと同様であることが示された(図12G)。
さらに、hmt10158ヘテロプラスミーレベルは、作製されたiPSCで10％未満であった(図12H)。絶対的なmtDNAコピー数の定量により、mtDNAのレベルの低下及び突然変異体mtDNAの低下が確認された(図12I)。
これらの結果は、iPSCが本明細書に提供されるミトコンドリア交換技術を用いて作製されることができ、かつこの手順全体では、診療に適応可能な材料しか使用されないので、臨床分野で適用可能であり得ることを示している。
(実施例XIV:ドナー細胞由来ミトコンドリアのミトコンドリア交換はレシピエント細胞の寿命細胞を変化させる)
本実施例は、mtDNA交換がレシピエント細胞の寿命を変化させることができることを示している。ミトコンドリア交換が老化した細胞を若返らせることができるという仮説を検証するために、倍加時間及び成長停止時のPDLなどの、細胞周期能力に関して、2つのモデルを推定した。
初期PDL(約5〜10、「若い」と呼ばれる)及び後期PDL(約40〜45、「老いた」と呼ばれる)を有するNHDF及びTIG1胚性肺細胞を利用して、モデルを設計した。1つのモデルは、「O2Y」と命名された、老いた細胞に由来するミトコンドリアと交換された若い細胞を伴い、別のモデルは、「Y2O」と命名された、若い細胞に由来するミトコンドリアと交換された老いた細胞を伴った(図13A)。
mtDNAの交換の程度は、それぞれ、A及びGである、NHDFとTIG1の間での16145の位置におけるmtDNAの単一ヌクレオチドの違いに基づく、TaqMan SNPジェノタイピングアッセイによって評価された(図13B)。NHDF由来MirCは、内在性mtDNA(hmt16145-A)の90％超がTIG1由来mtDNA(hmt16145-G)と交換されていることを明確に示した(図13C)。親TIG1細胞で検出されたわずかなパーセンテージのhmt16145-Aは、バックグラウンド誤差であるとみなされた(図13C)。
さらに、Y2Oモデルは、約65 PDLへの老いた細胞の寿命の回復を明確に示した(図13D)。老いた対照細胞及び模擬トランスフェクタントは、55 PDLでの成長停止を示した。これは、ハイフリックの限界と一致している。他方、O2Yは、約45 PDLでの若い細胞の寿命の低下を示した(図13E)。両方のモデルにおける約10 PDLの差は、外因性mtDNAに原因があり得る。これらの結果は、若い細胞から老いた細胞への外因性ミトコンドリアの移入が細胞を若返らせることができることを示している。
(実施例XV: mRNAトランスフェクションを用いるヒト初代T細胞由来のミトコンドリア交換細胞(MirC)の最適化)
本実施例は、mRNAトランスフェクションを使用することによるヒト初代T細胞由来のミトコンドリア交換細胞(MirC)の作製を記載している。
実験前に、ヒト初代T細胞の使用は、本発明者らの施設内倫理委員会によって承認された。末梢血を健康なボランティアから採取し、1.077の比重で、400gで35分間、20℃でパーコールを用いて遠心分離して、リンパ球を分離した。1ml当たり1×106細胞の単離されたリンパ球を、抗CD3及び抗CD28抗体でコーティングした96-ウェルフラットプレートに播種した。プレートを、5μg/mlの抗CD3及び1μg/mlの抗CD28と一晩インキュベートすることにより調製し、播種の前に、37℃で2時間、予め温めた。播種の翌日、IL-7及びIL-15を、それぞれ、20μg/ml及び10μg/mlの濃度で培地に添加した。培地を、最初の添加と同じ濃度のIL-7及びIL-15を用いて、3日毎に交換した。
製造元のプロトコルに従って、GMP/GCPの基準を満たすMaxCyteエレクトロポレーターを用いて、トランスフェクションを実施した。わずかに修正した、mMESSAGE mMACHINE T7 Ultraキット(Thermo Fisher)の製造元のプロトコルに従って、mRNAを作製した。簡潔に述べると、RNアーゼをごちゃ混ぜにする可能性をできる限り低く抑えるために、mRNAのDNA鋳型を、エンドヌクレアーゼ消化後に断片を精製することなく、DNA配列を保有するプラスミドから調製した(図14A)。
結果は、EGFPのmRNA作製用の精製していないDNA鋳型が、遺伝子トランスフェクションから24時間後に高い発現及び高い生存率を伴って、ほぼ100％の遺伝子移入効率をもたらすことを示した(図14B及び図14C)。トランスフェクション効率が高いため、この方法を使用すると、抗生物質選択は必要とされなかった。さらに、MTS-XbaIRのトランスフェクションは、ミトコンドリア膜電位の低下をもたらし、これは、内在性mtDNAの低下に原因がある可能性があった(図14D)。
単離されたミトコンドリアの共インキュベーションのタイミングに関する最適なプロトコルを決定するために、MaxCyte ATXを用いるエレクトロポレーションによってGFPのmRNAを受容したヒト初代T細胞の蛍光画像を、示されているように、8日間にわたって撮影した(図14E)。細胞がGFPプラスミドでトランスフェクトされているエレクトロポレートされた対照細胞の蛍光画像(図14F、上のパネル)は、線維芽細胞の蛍光画像で見られるものと同様の動態を示した。発現は、2日目にピークに達し、8日目までに消えた。対照的に、MTS-GFP mRNAを受容した細胞(図14F、下のパネル)は、プラスミドが移入された細胞で見られるものよりも高いエレクトロポレーション後4時間以内の発現及びより早い6日目の消失を示した。
MTS-GFP mRNAを受容している細胞におけるGFPのタンパク質発現を、キャピラリー電気泳動を用いるウェスタンブロット解析により評価した。ウェスタンブロットで示され(図14H)、かつ図14Gで定量されているように、ピーク発現は、4日目に生じ、発現は、6日目までに失われた。XbaIR転写物レベルの動態の定量をqPCRにより実施し、これにより、エンドヌクレアーゼの転写物発現が遺伝子移入から4時間後に完全に最大になることが明らかになった(図14I)。XbaIR転写物レベルは、2日目までに急速に減少し、6日目までにごくわずかであった(図14I)。12S rRNAを定量することにより、ミトコンドリア含量を推定し(図14J)、ミトコンドリアが2日目までに約30％にまで減少し、実験期間の全体を通して、20％未満で維持されることが示された。
まとめると、これらの結果は、MTSと融合したXbaIなどのエンドヌクレアーゼのmRNAトランスフェクションが宿主mtDNAを効率的に分解することができ、ヒト初代T細胞由来のミトコンドリア交換細胞(MirC)を作製するために使用することができることを示している。
(実施例XVI: mRNAトランスフェクションを用いるヒト初代T細胞由来のミトコンドリア交換細胞(MirC)の作製)
実施例XVのヒト初代T細胞でミトコンドリア移入を実施するための最適な時点を決定した後、残存するエンドヌクレアーゼによる外因性mtDNAの消化を防ぐために、ミトコンドリア共インキュベーションを7日目に実施した。ヒト初代T細胞についてのMirCプロトコルのスキームは、図15Aに示されている。
ミトコンドリア交換後のレシピエントヒト初代T細胞におけるmtDNAのヘテロプラスミーを決定するために、ドナーミトコンドリアとレシピエント細胞のmtDNAの違いをTaqMan SNPジェノタイピングアッセイにより決定した。正常ヒト初代T細胞及びEPC100(ミトコンドリアドナー細胞)におけるmtDNAのD-ループのシークエンシングにより、2つのヌクレオチド位置(ヌクレオチド218及び224のmtDNA)の違いが示され、これらは、T細胞及びEPC100細胞について、それぞれ、C/C及びT/Tであった(図15B)。TaqMan SNPジェノタイピングアッセイについての標準曲線を描くために、mtDNAの218及び224個のヌクレオチドを包含する可変領域の断片をpBluescript SK(-)にサブクローニングした。多型ヌクレオチドをヒトケンブリッジ参照配列上にマッピングし、D-ループの所望の領域を増幅及び標的化するように、プライマー及びプローブを設計した(この場合、プローブは、FAM及びVIC蛍光団を有していた)(図15C)。5'エキソヌクレアーゼ活性を有するTaqManポリメラーゼを用いて、qPCRを実施し、閾値サイクル(Ct値)を決定し、これを、上記のプラスミドのいくつかの異なるコピー数を各々の配列に対して用いて作成された標準曲線に当てはめた。体細胞ミトコンドリア交換の後、EPC100 mtDNAの起源が7日目と12日目の両方でヒトT細胞において優位を占めたのに対し、遺伝物質なしでエレクトロポレーションを受容し、MirCと同じプロトコルで単離されたミトコンドリアと共インキュベートされた模擬トランスフェクタントは、7日目に10％未満、12日目にバックグラウンドレベルで外因性のmtDNA起源を示した(図15D)。これは、MTS-XbaIR mRNAがヒト初代T細胞で効率的なミトコンドリア移入を促進することを示した。
次に、ミトコンドリア移入がMirCヒトT細胞の機能に対して及ぼした効果を評価するために、Oroboros O2kを用いて、呼吸計測実験を行った。結果は、7日目のヒトT細胞由来MirCにおけるATP産生及び共役効率の回復を示したが、エレクトロポレーションによるXbaIR mRNA移入によって作製されたρ(-)ヒトT細胞は、実験の全体を通して、ATP産生の消失を維持した(図15E)。カップリング制御プロトコル(CCP)を用いた代表的な生データは、図15F及び図15Gに示されており、これは、MirC T細胞がミトコンドリア呼吸を回復することができることを示している。
これらの結果は、ヒト初代T細胞が、MaxCyte社によって生産されるエレクトロポレーターなどのGMP等級のエレクトロポレーターを用いてMirCを産生するように、ミトコンドリア交換することができることを示した。
(実施例XVII: mRNAトランスフェクションを用いるマウス初代T細胞由来のミトコンドリア交換細胞(MirC)の作製)
T細胞由来MirCのさらなる特徴解析をマウスT細胞について実施した。磁石を用いる陰性選択によって高度に純化されたT細胞集団を提供するEasySepマウス単離キット(STEM CELL Technologies社)を用いて、脾臓から得られる懸濁溶液からのマウスT細胞の単離を行った。単離されたマウスT細胞(1×106細胞/ml)を、1:1のビーズ対細胞の比及び30U/mlの組換えIL-2で、DynabeadsマウスT-アクチベーターCD3/CD28(Invitrogen社)とともに、96-ウェルプレートに播種した。マウスT細胞を培養するための培地を細胞増殖及びCD3発現に関して決定し、RPMI1640がTexMACSよりも優れていることが分かった(図16A)。例えば、生存率及び総細胞数は、TexMACSと比較して、RPMI1640で培養された細胞でより大きかった。培地は、3又は4日毎に交換した。
次に、Nucleofector装置及びmRNAを用いて、マウスT細胞のエレクトロポレーションを実施した。mRNA移入後のGFP発現の動態は、ヒトT細胞と同様であった(図16B)。例えば、MTS-GFP mRNAのエレクトロポレーションから6時間後、ほぼ全ての細胞がGFPを強く発現することが分かった(図16B)。これは、MTS-GFPが高い効率でトランスフェクトされることを示した。GFPの強度は、時間とともに急速に減少し、最終的には、エレクトロポレーション後6日目に消失した(図16B)。
MTS-XbaI mRNAのトランスフェクションにより、マウスT細胞が、ヒトT細胞と比べて、より穏やかなXbaIR転写物発現の減少を示し、6日目に低いレベルでも持続することが示された(図16C)。mtDNAの代用マーカーとしての12S rRNAレベルの定量により、マウスmtDNAが6日目でも対照の約40％で持続することが示された(図16D)。次に、5日目のDs-Red標識外因性ミトコンドリアとρ(-)マウスT細胞の共インキュベーションを実施した(図16E)。ヒトT細胞と比べて、XbaIRの持続がより長く、かつ内在性mtDNA低下のレベルがより低いにもかかわらず、単離されたミトコンドリアとの共インキュベーションから48時間後の飲み込まれた蛍光標識ミトコンドリアのFACS解析により、外因性ミトコンドリアを発現するT細胞のかなりの陽性率(9.73％)が明らかになった(図16F)。外因性ミトコンドリアを発現する陽性細胞のパーセンテージは、線維芽細胞実験でのパーセンテージよりもさらに高く、このマウスT細胞用のプロトコルがT細胞由来MirCを作製するのに最適であり得ることを示した。
(実施例XVIII: T細胞への外因性ミトコンドリアの移入は老化を逆転させた)
本実施例は、ミトコンドリア交換がマウスT細胞で成功し、老化したT細胞を若返らせることを示している。
外因性ミトコンドリアをうまく移入して、マウスT細胞由来MirCを作製することできるかどうかを評価するために、mtDNAヘテロプラスミーレベルをBL6(レシピエント)細胞及びNZB(ドナー)細胞のものとした。ND1の2766及び2767 mtDNAにおける2つの連続する多型が確認された(図17A)。具体的には、BL6ミトコンドリアがmtDNAの位置2766及び2767にATを含有していたのに対し、NZBミトコンドリアは、同じ位置にGCを含有していた。GC及びAT多型の各々に異なる蛍光団を用いて多型を識別するために、プライマーセット及び2つのプローブを設計した(図17B)。さらに、それぞれ、GC及びAT多型を発現させるために、2つの別々のプラスミドを作製し、MirCにおけるヘテロプラスミーの定量的推定を容易にするために、標準曲線を作成した。
MTS-XbaIでトランスフェクトされ、かつNZBマウスから単離されたミトコンドリアと共インキュベートされたBL6細胞におけるミトコンドリア交換(XbaIR Mt)の定量により、外因性mtDNAの圧倒的な優位が示されたのに対し、エンドヌクレアーゼのmRNAの非存在下でのエレクトロポレーション後に単離されたミトコンドリアと共インキュベートされた模擬トランスフェクションでは、外因性mtDNAが飲み込まれなかった(図17C)。この結果は、T細胞がミトコンドリア交換を許容することを示した。
本明細書に記載される結果により、線維芽細胞由来MirCがインビトロで若返りを経ることができることが示されたので(図13)、T細胞由来MirCも若返りの可能性について調べた。老いたマウスT細胞由来のレシピエント細胞を、80週齢を超えるマウス(C57BL/6)の脾臓から調製し、ドナーマウスのミトコンドリアを約10週齢のマウス(C57BL/6)の肝臓から単離した。テロメア長は、年齢とともに短くなると報告されている。それゆえ、絶対的マウステロメア長定量qPCRアッセイキット(ScienCell社)を使用することにより、テロメア長を測定した。老いたマウス細胞をMTS-XbaIR mRNAで処理し、若いドナー細胞由来の外因性ミトコンドリアと共インキュベートして、MirC(若から老: YからO)を作製した後、テロメア長は、もとの老いたT細胞と比べて、長さが1.7倍増加していることが観察された(図17D)。これにより、ミトコンドリア交換細胞が若返りの特徴を示すことが示される。
さらに、先に記載された同じ代表的なマーカーセットを用いて、SASPを評価した(図11)。CXCL1、ICAM1、IL-6、及びIL-8の測定により、マウスT細胞由来MirCがIL-6及びCXCL-1を減少させ、ICAM-1及びIL-8の変化を示さないことが明らかになった(図17E)。これらの結果は、MirC T細胞についてのSASPの減少を示した。
さらに、老化したT細胞は、若いT細胞と比較して、より大きいDNA損傷応答(DDR)を示すことが分かっている。それゆえ、ヒストン2 A(H2A)リン酸化抗体を用いて、MirC及びもとのT細胞について、DDRを測定した。結果は、DDRの陽性率が、もとのT細胞(4.75％)と比較して、MirCでより低い(1.53％)ことを示した(図17F)。したがって、MirC T細胞は、より低いDDRレベルを有しており、老化した性質の逆転を示した。
これらのインビトロの結果は、体細胞ミトコンドリア交換がMirC mtDNAで確認され、この交換がMirC T細胞における老化の逆転を示す多くの変化をもたらしたことを裏付けている。
(実施例XIX:腫瘍増殖は若いマウス由来の外因性ミトコンドリアを含有する老いたT細胞に由来するMirCを用いる養子細胞移植(ACT)によって軽減される)
老化した細胞を若返らせたミトコンドリア交換の機能的能力を調べるために、養子細胞移植(ACT)実験を行った。アスベスト繊維を注射されたC57BL/6Jマウスの腹腔に由来するAE17中皮腫細胞株を用いて、マウスで腫瘍形成を発生させた。このモデルを用いた以前の実験により、腫瘍成長が若い同系T細胞のACTによって軽減されるが、老いた同系T細胞のACTによって軽減されないことが示されている(Jackamanらの文献、OncoImmunology 2019; 8(4): 1-16)。
単離された外因性ミトコンドリアを若いマウスから老いたマウス由来のT細胞に移入することにより作製された若返った老T細胞が機能的活性を示すかどうかを決定するために、AE17細胞を、老いたマウス(第1群:若いマウス由来のT細胞のACTを有する老いたマウス;第2群:老いたマウス;又は第3群:若いマウス由来の外因性ミトコンドリアが移入された老いたマウスのT細胞に由来するMirCのACTを有する老いたマウスという3つの群に皮下注射した(図18A)。老いたT細胞に由来するMirCを腫瘍成長を抑制するその能力について評価した。22〜24カ月齢のC57BL/6マウスをACT実験で利用した。実験で使用された若いマウスは、2〜3カ月齢のマウスであった。体重測定に加えて、3日毎に撮影された写真のNIH画像を用いて、腫瘍成長を測定した(図18B)。100μLのMatrigelに懸濁した2×106個の細胞を用いて、-14日目にAE17接種を実施し、T細胞移入の日を0日目とみなした。0日目に、若いT細胞又は老いたT細胞のいずれか由来のMirCの2×106個の細胞を腫瘍担持マウスに静脈内注射した。同じ日に、組換えIL-2(2μg)を腹腔内に1回注射し、その後、もう2回、2日目と3日目に注射した。
各々の群における体重は、有意差を示さなかった(図18C)。しかしながら、第1群のマウス(若いT細胞を有する老いたマウス)と第3群のマウス(老いたT細胞に由来するMirCを有する老いたマウス)の両方では、腫瘍が減衰していたのに対し、第2群(模擬)のマウスでは、腫瘍が着実に増殖した(図18D)。相対的な平均集塊は、個別のマウスと同様の傾向を示し、MirCが若いT細胞のように挙動することを示した(図18E)。
動物における注入されたT細胞の存在を確認するために、GFPトランスジェニックマウスに由来するT細胞を同系C57BL/6マウスに移植し、末梢血及び脾臓を調べて、ドナー細胞を追跡した(図18F)。GFP蛍光を検出するためのFSC対FL-1を用いる2次元プロットを作成して、稀少な集団を明確にした。C57BL/6マウスを用いる陰性対照(左上のパネル)及びGFPトランスジェニックマウスを用いる陽性対照(左下のパネル)を末梢血と脾臓の両方について作製した(図18G)。GFP蛍光を発現するT細胞の確定的集団は、両方の試料で認識されたが、その分率は、末梢血及び脾臓で、それぞれ、0.057％及び0.9％であった(図18G)。このプロトコルでの移入されたT細胞は、移植後6日目に検出され(図18H)、これにより、このプロトコルが移入された細胞の能力を評価するために使用され得ることが確認された。さらに、外因性T細胞の注入後のキメリズムのパーセンテージは、より多くの量の細胞が注入されたときに増大することが分かった(図18I)。
これらの結果は、老いたマウス由来のT細胞への若いマウス由来のミトコンドリアを用いるエクスビボでのMirC作製がインビボで効果的に機能し、若いマウス由来のT細胞と同様のレベルで腫瘍負荷を低下させることができることを明確に示している。
(実施例XX:造血幹細胞はMirCを生成させることができる)
現在まで、造血幹細胞のための遺伝子移入法は、主に、ウイルスベクターの使用を伴っているが、それは、その標的が、主に、欠損遺伝子の持続可能な遺伝子発現を必要とする遺伝子障害であったからである。結果として、恒久的な遺伝子発現を生み出す必要があるため、エレクトロポレーションは、造血幹細胞の遺伝子移入の最新プロトコルでは使用されない。対照的に、本明細書に提供されるミトコンドリア交換技術の目的は、エキソヌクレアーゼの一時的な高発現を達成することである。
線維芽細胞及びT細胞についての実験に基づいて、Nucleofector/mRNAのエレクトロポレーションの条件を調整し、いくつかの条件を、濃縮された造血幹細胞(HSC)集団であると考えられる、マウス胎仔肝臓由来Sca-1陽性細胞について調べた(図19A)。いくつかの条件の中で、3つの条件(装置提供者におけるコード番号であるプログラムX-001、Y-001、及びT-030)を免疫蛍光及び細胞生存率によって評価した(図19A)。実験条件を、使用されたプログラムに従って、MTS-GFP1、2、及び3と称した(それぞれ、プログラムX-001、Y-001、及びT-030)。
さらなる検討を、GFPのmRNAのエレクトロポレーション後1日目の平均蛍光強度(MFI)についてのFACS解析によって行った(図19B)。結果は、最適条件がX-001プログラム(MTS-GFP1)であることを示した。なぜなら、条件中のMFIの右への移動は、ほとんどなかったが、それが他のものと比較して顕著であったからである(図19B)。マウス骨髄由来Sca-1細胞を、DsRed蛍光を発現する安定な遺伝子修飾細胞株である同系マウス細胞から単離されたミトコンドリアと共インキュベートした。共インキュベーションから48時間後の骨髄由来Sca-1細胞の3-D蛍光イメージングにより、外因性ミトコンドリアが飲み込まれることが示された(図19C)。ミトコンドリア移入効率をDsRed蛍光軸についてのFACS解析により推定し、これにより、Sca-1の約10％の亜集団が蛍光の右方向への移動を示すことが明らかになり、BM由来Sca-1陽性細胞が体細胞ミトコンドリア交換を経ることができることが示唆された(図19D)。しかしながら、内在性ミトコンドリアの欠失を伴わないMTS-GFP発現細胞における外因性ミトコンドリアの移入は、臨床応用向けには、非常に少ない。
次に、本発明者らは、MTS-XbaIR mRNA移入を用いるρ(-)細胞の作製を介するこのミトコンドリア交換手順が造血幹細胞に適用可能であり得るかどうかを調べた(図19E)。実際の造血幹細胞集団は、骨髄細胞全体の約0.005％であるc-kit+、Sca-1+、系譜-、CD34-(KSLCと呼ばれる)と考えられる(Wilkinson, A. C.らの文献、Nature, 571(7763):117-121(2019))。マウス骨髄由来細胞由来のKSL細胞についてFACS選別した後(図19F)、KSL細胞を、幹細胞因子及びTPOの存在下、ポリビニルアルコール(PVA)とともに5日間培養した。肉眼的に、KSL細胞は形態を維持し、19時間という短い倍加時間を示した(図19G)。
上記のように、TaqMan SNPジェノタイピングアッセイを用いて、ヘテロプラスミー変化を評価した。アッセイのスキームは、図19Hに示されている。マウスKSLC由来MirCは、エレクトロポレーションによるエンドヌクレアーゼmRNA移入後6日目に、NZB中の多型を有する外因性mtDNAが99.9％であることを示し(図19I)、これにより、外因性mtDNAがCL57BL/6の内在性mtDNAにほぼ完全に置き換わったことが示された。これらの結果は、造血幹細胞がMirCを作製するためのこの技術を許容することを示した。
(実施例XXII: mtDNA及びヘテロプラスミーの測定のためのドロップレットデジタルPCR(ddPCR))
本実施例は、ミトコンドリアDNA(mtDNA)を、デジタルPCR(dPCR)を用いて、特定のmtDNA配列、例えば、mtDNA中の突然変異の存在についてアッセイすることができることを示している。ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、水-油型エマルジョンドロップレット技術に基づくデジタルPCRを実施するための方法である。
ミトコンドリア疾患を有する患者に由来する初代皮膚線維芽細胞を解析した。患者情報は、下の表1に提供されている。
表1:患者情報
Figure 2021533827
標的集団由来の細胞を、プライマー及びプローブを含むPCR混合物を含む液滴当たり1細胞の濃度で、液滴中に封入した。細胞密度を単一の液滴中に単一の細胞が生じるように最適化し、線維芽細胞をddPCR用に1×106細胞/mLに最終的に希釈した。単一細胞を封入した後、細胞溶解及び標的配列の増幅を液滴中で行った。蛍光シグナルを有する液滴の数は、標的又は参照遺伝子を保有する細胞の数を示した。
簡潔に述べると、20×プライマー/プローブミックスを下の表2に記載されている通りに調製した。標準的なddPCRマスターミックスは、前記のプライマー/プローブミックス、鋳型DNA、及び2×ddPCRスーパーミックスを含む25μLミックスであった。
表2: dPCRプライマー及びプローブミックス
Figure 2021533827
 表3: dPCR反応マスターミックス
Figure 2021533827
試料を、20μLの調製済みqPCR試料、次いで、70μLの液滴発生オイルを用いて、8-チャンバーカートリッジの隣接するウェルに充填した。ラバーガスケットをチャンバーの上部にわたって伸ばして、真空密封を確保した。各々の8-チャンバーカートリッジをQX100液滴発生器に充填して、試料当たり20,000個の液滴を生じさせた。50μLマルチチャネルピペットを用いて、40μLの発生した液滴を96-ウェルプレートに移し、突き刺し可能なホイルで加熱密閉した。50％(3℃/秒)の傾斜率を伴う標準的な2段階のqPCR温度サイクリング条件を用いて、プレートをサーマルサイクラー内に入れた。温度サイクリング条件を実行する前に、アニール/伸長温度を最適化するために、プライマー/プローブセットを温度勾配を用いて最適化した。
表4: dPCRサイクリング条件
Figure 2021533827
温度サイクリングの後、プレートをQX100液滴リーダーにローディングし、終点反応を解析した。陽性液滴及び陰性液滴の数のポワソン統計解析により、標的配列の絶対的定量が得られた。
疾患細胞を調べる前に、非突然変異配列(ケンブリッジ参照配列と同じもの)を有する正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF細胞)を使用することにより、突然変異配列用に設計されたプローブに対する特異性及び非突然変異配列用に設計されたプローブに対する感度を評価した(図20A〜図20C)。左下の領域中のドットは、液滴中に細胞がないことを示した。3つの異なるプローブセットの評価から、非突然変異配列が明確に検出され(BK01の右下(図20A)、BK02の左上(図20B)、及びBK04の左上(図20C))、突然変異体配列が検出されなかった(BK01の左上(図20A)、BK02の右下(図20B)及びBK04の右下(図20C))。
BK01から得られた線維芽細胞のddPCRは、数パーセントの二重陽性集団を示し、大部分は、突然変異mtDNAのホモプラスミーを有する細胞であった(図20D)。単一の細胞に非突然変異mtDNAのホモプラスミーを有する顕著な集団は存在しなかった。さらに、BK02は、わずかな部分の二重陽性細胞を示し、これにより、マイクロヘテロプラスミーと定義される、単一細胞レベルでのヘテロプラスミーが示された(図20E)。BK02の結果から、突然変異体mtDNAの主要なホモプラスミー集団が明らかになり、非突然変異mtDNAのホモプラスミーを有する集団は認識されなかった。
まとめると、これらの結果は、ホモプラスミー及びヘテロプラスミーを正確にかつ定量的に単一細胞レベルで評価することができることを示した。さらに、これらの結果は、ミトコンドリア疾患を有する対象のmtDNAを正確に測定することができることを示しており、これは、対象への移植前に治療用組成物を評価するか、又は治療の前及び/もしくは後にmtDNA含有量をモニタリングするのに有用であり得る。
(実施例XVII:ドナーcGMP製造骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)由来のレシピエント造血幹又は前駆細胞(HSPC)におけるmtDNA交換)
本実施例は、本明細書に提供されるmtDNA交換方法を治療に用いて、造血幹又は前駆細胞(HSPC)をエクスビボで調節することができることを示している。
HSPCの調節は、幹細胞移植と関連させてエクスビボで実施することができる。簡潔に述べると、末梢血幹細胞を移動させ、血液試料を患者から得る。末梢造血幹又は前駆細胞(HSPC)、例えば、CD34+細胞を単離し、製造施設に送る。製造施設で、ミトコンドリアを、本明細書に提供される方法に従って、一部枯渇させる。
細胞レポジトリ(例えば、Waisman Biomanufacturing)から得られた最新の適正製造基準(cGMP)製造の骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)を用いて、ドナーミトコンドリアを単離する。十分なインフォームドコンセントを伴って、かつ連邦政府の規制(例えば、21 CFR 1271)を順守して、最初の骨髄吸引物を収集した。この吸引物をcGMPの下で処理し、後の拡大のために、早い継代でバンクに預けた。
BM-MSC由来のドナーミトコンドリアを培養HSPCに移入し、ヘテロプラスミーを変化させる。修飾されたHSPCを自己移植(すなわち、HSPCが単離された同じ対象へのもの)用に医療センターに送り返す。移植前に、患者は、非骨髄破壊的レジメン、例えば、部分的放射線照射又は致死量未満の用量の抗癌薬、例えば、ブスルファンを含み得る最小限の治療を受ける。同種異系ドナーミトコンドリアのみを含有する修飾されたHSPCを患者に輸血して戻す。
本実施例は、本明細書に提供されるmtDNA交換方法を同種異系HSPCの移植を伴わない療法に用いて、HSPCをエクスビボで調節することができることを示している。
上記の実施態様は、単に例示的であることが意図されており、当業者は、特定の化合物、材料、及び手順の多くの等価物を認識するか、又はルーチンの実験だけを用いて、それらを確認することができる。そのような等価物は全て、本発明の範囲内にあると考えられ、付随する特許請求の範囲に包含される。

Claims (149)

  1. ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、
    (a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させること;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び
    (c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること
    :を含む、前記方法。
  2. ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療する方法であって、
    (a)
    (i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;
    (ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び
    (iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程
    :を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに
    (b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア交換を必要としている対象に投与すること
    :を含む、前記方法。
  3. 年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法であって、
    (a)
    (i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;
    (ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び
    (iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程
    :を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに
    (b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象に投与すること
    :を含む、前記方法。
  4. ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象を治療する方法であって、
    (a)
    (i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;
    (ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び
    (iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程
    :を含む、ミトコンドリア交換レシピエント細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに
    (b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象に投与すること
    :を含む、前記方法。
  5. 前記外因性ミトコンドリアが機能的ミトコンドリアである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記外因性ミトコンドリアが野生型mtDNAを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記外因性ミトコンドリアが単離されたミトコンドリアである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
  8. 前記単離されたミトコンドリアが無傷のミトコンドリアである、請求項7記載の方法。
  9. 前記外因性ミトコンドリアが同種異系のものである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、
    (a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させること;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び
    (c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること
    :を含む、前記方法。
  11. ミトコンドリア交換を必要としている対象を治療する方法であって、
    (a)
    (i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;
    (ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び
    (iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程
    :を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに
    (b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア交換を必要としている対象に投与すること
    :を含む、前記方法。
  12. 年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象を治療する方法であって、
    (a)
    (i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;
    (ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び
    (iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程
    :を含む、ミトコンドリア交換細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに
    (b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該年齢関連疾患を有するか又は年齢関連疾患を有することが疑われる対象に投与すること
    :を含む、前記方法。
  13. ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象を治療する方法であって、
    (a)
    (i)レシピエント細胞を、mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる工程;
    (ii)該薬剤が該レシピエント細胞におけるmtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートする工程;及び
    (iii)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(ii)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する工程
    :を含む、ミトコンドリア交換レシピエント細胞をエクスビボ又はインビトロで作製すること;並びに
    (b)工程(a)由来の該ミトコンドリア交換レシピエント細胞の治療有効量を、該ミトコンドリア疾患もしくは障害を有するか又はミトコンドリア疾患もしくは障害を有することが疑われる対象に投与すること
    :を含む、前記方法。
  14. 前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子が、ミトコンドリア標的化配列(MTS)及びエンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、及び小分子からなる群から選択される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
  15. 前記小分子がヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)である、請求項14記載の方法。
  16. 前記ポリヌクレオチドがメッセンジャーリボ核酸(mRNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)から構成される、請求項14記載の方法。
  17. 前記レシピエント細胞が前記融合タンパク質を一過性に発現する、請求項14記載の方法。
  18. 前記エンドヌクレアーゼが、XbaI、EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群から選択される、請求項14記載の方法。
  19. 前記MTSがミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とする、請求項14、17、又は18のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記ミトコンドリアマトリックスタンパク質が、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIV、シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII、及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットXからなる群から選択される、請求項19記載の方法。
  21. 前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子が該内在性mtDNAコピー数の約5％〜約99％を低下させる、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子が該内在性mtDNAコピー数の約30％〜約70％を低下させる、請求項21記載の方法。
  23. 前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子が該内在性mtDNAコピー数の約50％〜約95％を低下させる、請求項21記載の方法。
  24. 前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子が該内在性mtDNAコピー数の約60％〜約90％を低下させる、請求項21記載の方法。
  25. 前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子がミトコンドリア集塊を低下させる、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、
    (a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞における該内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び
    (c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること
    :を含む、前記方法。
  27. ミトコンドリア交換細胞を作製する方法であって、
    (a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させること;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞における該内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートすること;及び
    (c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製すること
    :を含む、前記方法。
  28. 前記ミトコンドリア機能を低下させる作用因子が内在性ミトコンドリア機能を一過性に低下させる、請求項26又は27記載の方法。
  29. 前記ミトコンドリア機能を低下させる作用因子が内在性ミトコンドリア機能を恒久的に低下させる、請求項26又は27記載の方法。
  30. 前記ミトコンドリア交換を必要としている対象が、機能不全ミトコンドリア;年齢関連疾患、ミトコンドリア疾患もしくは障害、神経変性疾患、網膜疾患、糖尿病、聴覚障害、遺伝性疾患からなる群から選択される疾患;又はこれらの組合せを有する、請求項2又は11記載の方法。
  31. 前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、フリードライヒ運動失調症、シャルコー・マリー・トゥース病、及び白質ジストロフィーからなる群から選択される、請求項30記載の方法。
  32. 前記網膜疾患が、加齢黄斑変性症、黄斑浮腫、及び緑内障からなる群から選択される、請求項30記載の方法。
  33. 前記年齢関連疾患が、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患、癌、神経変性疾患、及び免疫老化からなる群から選択される、請求項3、12、又は30のいずれか一項記載の方法。
  34. 前記代謝性疾患が糖尿病である、請求項33記載の方法。
  35. 前記神経変性疾患がアルツハイマー病又はパーキンソン病である、請求項33記載の方法。
  36. 前記遺伝性疾患が、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群、ウェルナー症候群、及びハンチントン病からなる群から選択される、請求項30又は33記載の方法。
  37. 前記ミトコンドリア疾患又は障害が、ミトコンドリアDNA異常、核DNA異常、又は両方によって引き起こされる、請求項4、13、又は30のいずれか一項記載の方法。
  38. 前記ミトコンドリアDNA異常によって引き起こされるミトコンドリア疾患又は障害が、慢性進行性外眼筋麻痺(CPEO)、ピアソン症候群、カーンズ・セイヤー症候群(KSS)、糖尿病、及び難聴(DAD)、ミトコンドリア糖尿病、レーバー遺伝性視神経萎縮症(LHON)、LHON-プラス、ニューロパチー、運動失調症、及び網膜色素変性症症候群(NARP)、母性遺伝性リー症候群(MILS)、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、及び卒中様発作(MELAS)、ミオクローヌスてんかん及び赤色ぼろ線維疾患(MERRF)、家族性両側線条体壊死/線条体黒質変性症(FBSN)、ルフト病、アミノグリコシド誘発性難聴(AID)、並びにミトコンドリアDNA多重欠失症候群からなる群から選択される、請求項37記載の方法。
  39. 前記核DNA異常によって引き起こされるミトコンドリア疾患又は障害が、ミトコンドリアDNA枯渇症候群-4A、ミトコンドリア劣性運動失調症候群(MIRAS)、ミトコンドリア神経性胃腸管系脳筋症(MNGIE)、ミトコンドリアDNA枯渇症候群(MTDPS)、DNAポリメラーゼγ(POLG)関連障害、感覚性運動失調型ニューロパチー構音障害眼筋麻痺(SANDO)、脳幹及び脊髄の障害並びに乳酸上昇を伴う白質脳症(LBSL)、補酵素Q10欠損症、リー症候群、ミトコンドリア複合体異常、フマラーゼ欠損症、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体(KGDHC)欠損症、スクシニル-CoAリガーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症(PDHC)、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症(PCD)、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼI(CPT I)欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼII(CPT II)欠損症、カルニチン-アシル-カルニチン(CACT)欠損症、常染色体優性/常染色体劣性進行性外眼筋麻痺(ad-/ar-PEO)、乳児発症性脊髄小脳萎縮症(IOSCA)、ミトコンドリアミオパチー(MM)脊髄性筋萎縮症(SMA)、成長遅延、アミノ酸尿症、胆汁鬱滞、鉄過負荷、早期死亡(GRACILE)、並びにシャルコー・マリー・トゥース病2A型(CMT2A)からなる群から選択される、請求項37記載の方法。
  40. 前記内在性mtDNAが機能不全ミトコンドリアをコードする、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
  41. 前記内在性mtDNAが突然変異体mtDNAを含む、請求項1〜40のいずれか一項記載の方法。
  42. 前記内在性mtDNAがミトコンドリア疾患又は障害と関連するmtDNAを含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の方法。
  43. 前記内在性mtDNAがヘテロプラスミックである、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
  44. 前記レシピエント細胞が機能不全である内在性ミトコンドリアを有する、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
  45. 前記レシピエント細胞における内在性mtDNAが野生型mtDNAを含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
  46. 前記ミトコンドリア交換細胞が、前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前の前記レシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を有する、請求項1〜45のいずれか一項記載の方法。
  47. 前記レシピエント細胞が動物細胞又は植物細胞である、請求項1〜46のいずれか一項記載の方法。
  48. 前記動物細胞が哺乳動物である、請求項47記載の方法。
  49. 前記レシピエント細胞が体細胞である、請求項48記載の方法。
  50. 前記レシピエント細胞が骨髄細胞である、請求項48記載の方法。
  51. 前記骨髄細胞が造血幹細胞(HSC)又は間葉系幹細胞(MSC)である、請求項50記載の方法。
  52. 前記レシピエント細胞が癌細胞である、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。
  53. 前記レシピエント細胞が初代細胞である、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。
  54. 前記レシピエント細胞が免疫細胞である、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。
  55. 前記免疫細胞が、T細胞、食細胞、ミクログリア細胞、及びマクロファージからなる群から選択される、請求項54記載の方法。
  56. 前記T細胞がCD4+ T細胞である、請求項55記載の方法。
  57. 前記T細胞がCD8+ T細胞である、請求項55記載の方法。
  58. 前記T細胞がキメラ抗原受容体(CAR)T細胞である、請求項55記載の方法。
  59. 前記外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAの移入が安定である、請求項1〜58のいずれか一項記載の方法。
  60. 前記外因性mtDNAが前記レシピエント細胞におけるヘテロプラスミーを変化させる、請求項59記載の方法。
  61. 小分子、ペプチド、又はタンパク質を送達することをさらに含む、請求項1〜60のいずれか一項記載の方法。
  62. 前記レシピエント細胞を外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAと共インキュベートする前に、該レシピエント細胞を第二の活性作用因子と接触させることをさらに含む、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
  63. 前記第二の活性作用因子が、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ該第二の活性作用因子が、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される、請求項62記載の方法。
  64. 前記エンドサイトーシスのアクチベーターが細胞代謝のモジュレーターである、請求項63記載の方法。
  65. 前記細胞代謝のモジュレーターが、栄養飢餓、化学インヒビター、又は小分子を含む、請求項64記載の方法。
  66. 前記化学インヒビター又は前記小分子がmTORインヒビターである、請求項65記載の方法。
  67. 前記mTORインヒビターがラパマイシン又はその誘導体を含む、請求項66記載の方法。
  68. (a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させ;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ
    (c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する
    :方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物であって、
    該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、前記組成物。
  69. (a)レシピエント細胞を、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させ;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞内の該内在性mtDNAコピー数を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ
    (c)(1)該内在性mtDNAが部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する
    :方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞の組成物であって、
    該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、前記組成物。
  70. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞が、前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前の前記レシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を含む、請求項68又は69記載の組成物。
  71. 1以上のミトコンドリア交換細胞を作製する方法で使用するための組成物であって、内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子及び第二の活性作用因子を含む、前記組成物。
  72. 1以上のレシピエント細胞又はその組合せをさらに含む、請求項71記載の組成物。
  73. 外因性mtDNA、外因性mtDNA、及び/又は外因性ミトコンドリアをさらに含む、請求項71又は72記載の組成物。
  74. 前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子が小分子又は融合タンパク質である、請求項68〜73のいずれか一項記載の組成物。
  75. 前記小分子がヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NRTI)である、請求項74記載の組成物。
  76. 前記融合タンパク質が、mtDNAを切断するエンドヌクレアーゼ及びミトコンドリア標的配列(MTS)を含む、請求項74記載の組成物。
  77. 前記エンドヌクレアーゼが野生型mtDNAを切断する、請求項76記載の組成物。
  78. 前記エンドヌクレアーゼが、XbaI、EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群から選択される、請求項77記載の組成物。
  79. 前記MTSがミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とする、請求項76〜78のいずれか一項記載の組成物。
  80. 前記ミトコンドリアマトリックスタンパク質が、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIV、シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII、及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットXである、請求項79記載の組成物。
  81. 前記融合タンパク質が一過性に発現される、請求項74〜80のいずれか一項記載の組成物。
  82. 前記内在性mtDNAコピー数の低下が部分的な低下である、請求項68〜81のいずれか一項記載の組成物。
  83. 前記部分的な低下が内在性mtDNAの約5％〜約99％の低下である、請求項82記載の組成物。
  84. 前記部分的な低下が前記内在性mtDNAコピー数の約50％〜約95％の低下である、請求項82記載の組成物。
  85. 前記部分的な低下が前記内在性mtDNAコピー数の約60％〜約90％の低下である、請求項82記載の組成物。
  86. (a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させ;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞における内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ
    (c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを、外因性ミトコンドリアを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する
    :方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞を含む組成物であって、
    該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、前記組成物。
  87. (a)レシピエント細胞を、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子と接触させ;
    (b)該薬剤が該レシピエント細胞における内在性ミトコンドリア機能を部分的に低下させるのに十分な期間、該レシピエント細胞をインキュベートし;かつ
    (c)(1)該内在性ミトコンドリア機能が部分的に低下している工程(b)由来の該レシピエント細胞と(2)健康なドナー由来の外因性mtDNAを、外因性mtDNAを該レシピエント細胞に非侵襲的に移入するのに十分な期間、共インキュベートし、それにより、ミトコンドリア交換細胞を作製する
    :方法によって得られた1以上のミトコンドリア交換細胞の組成物であって、
    該ミトコンドリア交換細胞が5％超の外因性mtDNAを含む、前記組成物。
  88. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞が、前記内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子と接触させる前の前記レシピエント細胞の総mtDNAコピー数と比べて、約1.1倍、約1.2倍、約1.3倍、約1.4倍、約1.5倍、又はそれ以上を超えない総mtDNAコピー数を含む、請求項86又は87記載の組成物。
  89. 1以上のミトコンドリア交換細胞を作製する方法で使用するための組成物であって、ミトコンドリア機能を低下させる作用因子及び第二の活性作用因子を含む、前記組成物。
  90. 外因性ミトコンドリア、1以上のレシピエント細胞、又はその組合せをさらに含む、請求項89記載の組成物。
  91. 外因性mtDNAをさらに含む、請求項89又は90記載の組成物。
  92. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞が野生型外因性mtDNAを含む、請求項68又は69記載の組成物。
  93. 第二の活性作用因子をさらに含む、請求項68又は69記載の組成物。
  94. 前記第二の活性作用因子が、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ該第二の活性作用因子が、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される、請求項71又は93記載の組成物。
  95. 前記エンドサイトーシスのアクチベーターがクラスリン非依存的エンドサイトーシス経路のアクチベーターである、請求項94記載の組成物。
  96. 前記エンドサイトーシスのアクチベーターがクラスリン非依存的エンドサイトーシス経路のアクチベーターである、請求項95記載の組成物。
  97. 前記クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路が、CLIC/GEECエンドサイトーシス経路、Arf6依存的エンドサイトーシス、フロチリン依存的エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、円形ドーサルラッフル(circular doral ruffles)、ファゴサイトーシス、及びトランス-エンドサイトーシスからなる群から選択される、請求項96記載の組成物。
  98. 前記クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路がマクロピノサイトーシスである、請求項96記載の組成物。
  99. 前記エンドサイトーシスのアクチベーターが栄養ストレス及び/又はmTORインヒビターを含む、請求項95記載の組成物。
  100. 前記mTORインヒビターがラパマイシン又はその誘導体を含む、請求項99記載の組成物。
  101. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数が5％超の外因性mtDNAを含む、請求項68〜100のいずれか一項記載の組成物。
  102. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数が30％超の外因性mtDNAを含む、請求項68〜101のいずれか一項記載の組成物。
  103. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数が50％超の外因性mtDNAを含む、請求項68〜102のいずれか一項記載の組成物。
  104. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞の総mtDNAコピー数が75％超の外因性mtDNAを含む、請求項68〜103のいずれか一項記載の組成物。
  105. 前記外因性ミトコンドリアが単離されたミトコンドリアである、請求項68記載の組成物。
  106. 前記単離されたミトコンドリアが無傷である、請求項105記載の組成物。
  107. 前記外因性ミトコンドリア及び/又は外因性mtDNAが同種異系のものである、請求項68〜106のいずれか一項記載の組成物。
  108. 前記外因性ミトコンドリアが外因性mtDNAをさらに含む、請求項68記載の組成物。
  109. 前記1以上の細胞が動物細胞又は植物細胞である、請求項68〜108のいずれか一項記載の組成物。
  110. 前記動物細胞が哺乳動物である、請求項109記載の組成物。
  111. 前記細胞が体細胞である、請求項110記載の組成物。
  112. 前記体細胞が上皮細胞である、請求項111記載の組成物。
  113. 前記上皮細胞が胸腺上皮細胞(TEC)である、請求項112記載の組成物。
  114. 前記体細胞が免疫細胞である、請求項111記載の組成物。
  115. 前記免疫細胞がT細胞である、請求項114記載の組成物。
  116. 前記T細胞がCD4+ T細胞である、請求項115記載の組成物。
  117. 前記T細胞がCD8+ T細胞である、請求項115記載の組成物。
  118. 前記T細胞がキメラ抗原受容体(CAR)T細胞である、請求項115記載の組成物。
  119. 前記免疫細胞が食細胞である、請求項114記載の組成物。
  120. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞が骨髄細胞である、請求項68〜108のいずれか一項記載の組成物。
  121. 前記骨髄細胞が造血幹細胞(HSC)又は間葉系幹細胞(MSC)である、請求項120記載の組成物。
  122. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞がホモプラスミックな内在性mtDNAを有する同系細胞よりも生存能力がある、請求項68〜121のいずれか一項記載の組成物。
  123. 前記1以上のミトコンドリア交換細胞が、癌細胞の死滅化、年齢関連疾患の治療、ミトコンドリア疾患又は障害の治療、神経変性疾患の治療、糖尿病又は遺伝性疾患の治療に有効である、請求項68〜122のいずれか一項記載の組成物。
  124. 小分子、ペプチド、又はタンパク質をさらに含む、請求項68〜123のいずれか一項記載の組成物。
  125. 細胞における老化の遅延及び/又は寿命の延長において使用するための組成物であって:
    (a)内在性ミトコンドリアを有する老化した又は老化しそうな細胞;
    (b)老化していない細胞由来の単離された外因性ミトコンドリア;及び
    (c)内在性mtDNAコピー数を低下させる作用因子
    を含む、前記組成物。
  126. 前記薬剤が融合タンパク質である、請求項125記載の組成物。
  127. 前記融合タンパク質が、mtDNAを切断するエンドヌクレアーゼ及びミトコンドリア標的配列(MTS)を含む、請求項126記載の組成物。
  128. 前記エンドヌクレアーゼが野生型mtDNAを切断する、請求項127記載の組成物。
  129. 前記エンドヌクレアーゼが、XbaI、EcoRI、BamHI、HindIII、PstI、Cas9、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)からなる群から選択される、請求項127又は128記載の組成物。
  130. 前記MTSがミトコンドリアマトリックスタンパク質を標的とする、請求項127〜129のいずれか一項記載の組成物。
  131. 前記ミトコンドリアマトリックスタンパク質が、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIV、シトクロムcオキシダーゼサブユニットVIII、及びシトクロムcオキシダーゼサブユニットXからなる群から選択される、請求項130記載の組成物。
  132. 前記融合タンパク質が前記老化した又老化しそうな細胞で一過性に発現される、請求項126〜131のいずれか一項記載の組成物。
  133. 細胞における老化の遅延及び/又は寿命の延長において使用するための組成物であって:
    (a)内在性ミトコンドリアを有する老化した又老化しそうな細胞;
    (b)老化していない細胞由来の単離された外因性ミトコンドリア;及び
    (c)ミトコンドリア機能を低下させる作用因子
    を含む、前記組成物。
  134. 前記ミトコンドリア機能を低下させる作用因子が内在性ミトコンドリア機能を一過性に低下させる、請求項133記載の組成物。
  135. 前記ミトコンドリア機能を低下させる作用因子が内在性ミトコンドリア機能を恒久的に低下させる、請求項133記載の組成物。
  136. 前記老化していない細胞由来の前記外因性ミトコンドリアが前記内在性ミトコンドリアと比べて増強された機能を有する、請求項125〜135のいずれか一項記載の組成物。
  137. 第二の活性作用因子をさらに含む、請求項125〜132のいずれか一項記載の組成物。
  138. 前記第二の活性作用因子が、巨大分子、小分子、又は細胞療法からなる群から選択され、かつ該第二の活性作用因子が、ラパマイシン、NR(ニコチンアミドリボシド)、ベザフィブラート、イデベノン、システアミン酒石酸水素塩(RP103)、エラミプレチド(MTP131)、オマベロキソロン(RTA408)、KH176、バチキノン(Epi743)、チオクト酸、A0001(α-トコフェロールキノン)、ミトコンドリアCoQ10(MitoQ)、SkQ1(ビソミチン)、レスベラトロール、クルクミン、ケトン食治療、低酸素、及びエンドサイトーシスのアクチベーターからなる群から任意に選択される、請求項137記載の組成物。
  139. 前記エンドサイトーシスのアクチベーターがクラスリン非依存的エンドサイトーシス経路のアクチベーターである、請求項138記載の組成物。
  140. 前記クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路が、CLIC/GEECエンドサイトーシス経路、Arf6依存的エンドサイトーシス、フロチリン依存的エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、円形ドーサルラッフル(circular doral ruffles)、ファゴサイトーシス、及びトランス-エンドサイトーシスからなる群から選択される、請求項139記載の組成物。
  141. 前記クラスリン非依存的エンドサイトーシス経路がマクロピノサイトーシスである、請求項139記載の組成物。
  142. 前記エンドサイトーシスのアクチベーターが栄養ストレス及び/又はmTORインヒビターを含む、請求項138記載の組成物。
  143. 前記mTORインヒビターがラパマイシン又はその誘導体を含む、請求項142記載の組成物。
  144. 健康なドナー由来の外因性ミトコンドリアを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物であって、該細胞が、請求項1、26、又は62記載の方法によって得られる、前記医薬組成物。
  145. 健康なドナー由来の外因性mtDNAを有する単離されたミトコンドリア交換細胞の集団を含む医薬組成物であって、該細胞が、請求項1、10、26、27、又は62記載の方法によって得られる、前記医薬組成物。
  146. 外因性ミトコンドリアをさらに含む、請求項144記載の医薬組成物。
  147. 医薬として許容し得る担体をさらに含む、請求項144〜146のいずれか一項記載の医薬組成物。
  148. 前記細胞がT細胞である、請求項144〜147のいずれか一項記載の医薬組成物。
  149. 前記細胞が造血幹細胞である、請求項144〜147のいずれか一項記載の医薬組成物。
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