JP2022524509A - Ｃｄ４０ｌの組成と調整可能な制御のための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、がん免疫療法のための制御可能な生体回路システム、エフェクターモジュール、及び組成物を提供する。対象において抗がん免疫応答を誘導するための方法も提供される。本開示は、小分子依存性の安定性を示す新規のタンパク質ドメインを提供する。このようなタンパク質ドメインは、薬物応答ドメイン（ＤＲＤ）と呼ばれる。その結合リガンドの非存在下では、ＤＲＤは不安定化し、ＤＲＤに融合したペイロードまたは目的のタンパク質（ＰＯＩ）（本明細書で交換可能に使用される）の分解を引き起こし、その結合リガンドの存在下では、作動可能に連結されたＤＲＤ及びペイロードを安定化することができ、その安定性は用量に依存する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月８日に出願された米国仮出願第６２／８１５，４０４号、２０１９年４月１８日に出願された米国仮出願第６２／８３５，５５４号、及び２０１９年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／８６０，３５６号に対する優先権及び権益を主張するものであり、それらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表への参照
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願される。配列表は、２０２０年３月４日に作成された１０．８ＭＢのサイズの２０９５＿１２１６ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

遺伝子治療と細胞治療は医学に革命をもたらし、以前は難治性であった状態の治療に新たな可能性をもたらしている。しかしながら、現在のほとんどの技術では、標的タンパク質の誘導のタイミングまたはレベルを用量設定することはできない。これにより、多くの潜在的な遺伝子及び細胞治療アプリケーションを安全かつ効果的に展開することが困難または不可能になっている。

不十分な外因性及び／または内因性の遺伝子制御は、多くの遺伝子及び細胞治療の状況において重大な問題である。この調整可能性の欠如はまた、狭いまたは不確実な治療ウィンドウを有するタンパク質、またはより用量設定されたまたは一過性の発現を必要とするタンパク質を安全に発現させることを困難にする。

タンパク質の発現または機能を制御するための１つのアプローチは、不安定化ドメイン（ＤＤ）としても知られる薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）の使用である。薬物応答性ドメインは、目的の標的タンパク質に付加できる小さなタンパク質ドメインである。ＤＲＤは、ＤＲＤ結合リガンドの非存在下では、結合した目的のタンパク質を不安定にし、目的のタンパク質は、細胞のユビキチン－プロテアソームシステムによって急速に分解される。しかしながら、特定の小分子ＤＲＤ結合リガンドがＤＲＤに結合すると、結合した目的のタンパク質が安定化され、タンパク質の機能が達成される。

腫瘍制御における免疫系の役割、特にＴ細胞を介した細胞傷害性はよく認識されている。Ｔ細胞ががん患者の腫瘍の増殖と生存を、病気の初期段階と後期段階の両方で制御できるという証拠が増えている。しかしながら、腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、がん患者で開始及び維持することは困難である。

現在までに大きな注目を集めているＴ細胞経路としては、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２）及びプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１またはＣＤ２７４としても知られる）を介したシグナル伝達が挙げられる。しかしながら、最近、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を含む、Ｔ細胞経路を介してシグナル伝達する他の分子が、腫瘍制御のメディエーターとして関心を集めている。

ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４、ＣＤ４０リガンド、ｇｐ３９、またはＴＢＡＭとしても知られる）は、３３ｋＤａのＩＩ型膜糖タンパク質（Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔＡｃｃ－Ｎｏ Ｐ２９９６５）である。さらに、より短い１８ｋＤａのＣＤ４０Ｌ可溶性形態が存在する（ｓＣＤ４０Ｌまたは可溶性ＣＤ４０Ｌとしても知られる）。ＣＤ４０Ｌのこれらの可溶性形態は、膜結合タンパク質のタンパク質分解プロセシングによって生成されるが、可溶性種の細胞活性は、高次のオリゴマー化（例えば、三量体化）がない場合は弱い。ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合して活性化する。

ＣＤ４０Ｌは、主に活性化Ｔ細胞（Ｔｈ０、Ｔｈ１、及びＴｈ２サブタイプを含む）で発現する分子のＴＮＦファミリーのメンバーであり、このファミリーの他のメンバーと同様のホモ三量体を形成する。さらに、ＣＤ４０Ｌはマスト細胞、活性化された好塩基球及び好酸球にも発現していることがわかっている。ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の受容体ＣＤ４０に結合し、これにより、標的細胞型に応じて多くの効果がもたらされる。一般に、ＣＤ４０Ｌは共刺激分子の役割を果たし、ＡＰＣ上のＭＨＣ分子によるＴ細胞受容体刺激に関連してＡＰＣの活性化を誘導する。ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、血小板、好中球、樹状細胞、内皮細胞、及びαＳＭＣ（平滑筋細胞）にも結合できる。樹状細胞で発現するＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合は、樹状細胞（ＤＣ）ライセンシングを促進できる。ＤＣは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するために、抗原特異的Ｔヘルパー細胞によって機能状態に変換され得、これはＤＣライセンスと呼ばれるプロセスである。ＤＣ上でのＣＤ４０の結合は、共刺激分子及びＭＨＣ分子の表面発現によって証明されるようにＤＣ刺激、炎症性サイトカインの産生（例えば、ＩＬ１２及びＴＮＦ）、ならびにエピトープ拡大（ｅｐｉｔｏｐｅ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、腫瘍の根絶及び抗腫瘍効果を助けると考えられているすべての免疫応答をもたらす。

がん及び他の疾患と闘うための戦略の開発において過去１０年間に大きな進歩があったにもかかわらず、進行性、難治性、及び転移性の疾患の患者は臨床の選択肢が限られている。化学療法、照射法、及び大量化学療法は用量制限毒性となっている。特に既存の治療法に耐性のある進行した疾患またはがんを有する患者にとって、より優れた治療効果、より長い臨床的利益、及び改善された安全性プロファイルを有する新しいより毒性の低い方法及び治療法に対する実質的に満たされていない必要性が残されている。

本開示は、小分子依存性の安定性を示す新規のタンパク質ドメインを提供する。このようなタンパク質ドメインは、薬物応答ドメイン（ＤＲＤ）と呼ばれる。その結合リガンドの非存在下では、ＤＲＤは不安定化し、ＤＲＤに融合したペイロードまたは目的のタンパク質（ＰＯＩ）（本明細書で交換可能に使用される）の分解を引き起こし、その結合リガンドの存在下では、作動可能に連結されたＤＲＤ及びペイロードを安定化することができ、その安定性は用量に依存する。

本明細書で提供されるのは、エフェクターモジュールを含む組成物である。エフェクターモジュールは、１つ以上のペイロードに作動可能に連結されている刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含んでもよい。様々な実施形態では、ＳＲＥは、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）を含むか、または本質的に薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）からなるか、または薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）からなる。本明細書で使用される場合、ＳＲＥはまた、ＤＲＤまたはＤＤと呼ばれることもある。

本明細書で例示される組成物は、エフェクターモジュールを含む組成物を含むが、これに限定されず、当該エフェクターモジュールは、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含み、当該第１のペイロードは、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）または配列番号３８２０に対してＹ１７０Ｇ、Ｙ１７２Ｇ、Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｆ、Ｇ２２６Ｈ、Ｇ２２６Ｗ、またはＧ２２７Ｆから選択される１つ以上の変異を含む変異体ＣＤ４０Ｌを含み、当該ペイロードは、当該ＳＲＥに結合、付加、または結合する。上に示した組成物は、ＤＲＤを含み得、ＤＲＤは、全体的または部分的に、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈＤＨＦＲタンパク質を含み、ＤＲＤは、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈＤＨＦＲタンパク質の当該アミノ酸配列における１つ以上の変異をさらに含む。

本明細書に記載の例示的なＣＤ４０Ｌペイロードは、Ｙ１７０Ｇ、Ｙ１７２Ｇ、Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｆ、Ｇ２２６Ｈ、Ｇ２２６Ｗ、またはＧ２２７Ｆなどであるがこれらに限定されない、配列番号３８２０に対する１つ以上の変異を含み得る。第１のペイロードは、全体的または部分的に、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）を含み得る。いくつかの実施形態では、第１のペイロードは、ＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）全体であってよい。ＣＤ４０Ｌ全体を含むペイロードの非限定的な例は、ＣＤ４０Ｌ（Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｆ）（配列番号６５９８）；ＣＤ４０Ｌ（Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｈ）（配列番号６６００）；ＣＤ４０Ｌ（Ｙ１７２Ｇ、Ｇ２２６Ｆ）（配列番号６６０２）；ＣＤ４０Ｌ（Ｙ１７０Ｇ、Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｗ）（配列番号６６０４）；またはＣＤ４０Ｌ（Ｈ１２５Ｇ、Ｇ２２７Ｆ）（配列番号６６０６）であってよい。

本明細書に記載のＳＲＥは、少なくとも１つの刺激に応答するか、またはそれと相互作用し得る。一実施形態では、刺激は小分子であり得る。

本開示は、ｅｃＤＨＦＲなどの親タンパク質の全体または一部に由来するＳＲＥと、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）を全体的または部分的に含む第１のペイロードとを有するエフェクターモジュールを含む組成物を提供する。一実施形態では、ＳＲＥは、ｅｃＤＨＦＲのアミノ酸２～１５９を含む。いくつかの実施形態では、ＳＲＥは、親タンパク質と比較して１つ以上の変異を含み得る。ＳＲＥには、配列番号６５５４、６５５６、６５５８、６５６０、６５６２、６５６４、６５６６、６５６８、６５７０、６５７２、６５７４、６５７６、６５７８、６５８０、６５８２、６５８４、６５８６、６５８８、または６５９０であってよいが、これらに限定されない。

本明細書に記載のＳＲＥは、少なくとも１つの刺激に応答するか、またはそれと相互作用し得る。一態様では、刺激は、ＴＭＰなどであるがこれに限定されない小分子であり得る。

本明細書に提供されるのはまた、本明細書に記載の組成物をコードするポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドをコードするベクター、及び本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞である。本開示はまた、本明細書に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、本明細書に記載の組成物を発現する改変細胞または操作された細胞と、を含む医薬組成物を提供する。

また、本明細書に例示されるのは、疾患、例えば、そのような治療を必要とするがんを有する対象の治療のための方法である。本開示の実施形態に従うがんを治療する例示的な方法は、対象における腫瘍量を減少させる方法であって、（ａ）対象に本明細書に開示される免疫細胞の治療有効量を投与することであって、免疫細胞は、少なくとも１つの刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含むエフェクターモジュールを含み、ＳＲＥは第１のペイロードに作動可能に連結され、当該第１のペイロードは、全体的または部分的にヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）、またはその変異体ＣＤ４０Ｌを含む、投与することと；（ｂ）治療有効量の 刺激を対象に投与して、第１のペイロードの発現を調節し、それによって腫瘍量を低減することと、を含む、方法を含む。関連する実施形態では、エフェクターモジュールは、第１のペイロードと同じかまたは異なるＤＲＤへの連結を含むかまたは含まずに、免疫細胞において発現する第２のペイロードを含んでもよい。いくつかの関連する態様では、第２のペイロードは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、本明細書に記載されるようなＣＤ１９ ＣＡＲである。

例示的な例において、本開示は、対象において樹状細胞を活性化する方法であって、（ａ）対象に１つ以上の免疫細胞を投与するステップであって、当該１つ以上の免疫細胞は、エフェクターモジュールを含み、エフェクターモジュールは、第１のペイロードに作動可能に連結された少なくとも１つの刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含み、当該第１のペイロードは、全体的または部分的にヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）、またはその変異体を含み、免疫細胞はＴ細胞である、ステップと；（ｂ）第１のペイロードの発現を調節するために治療有効量の刺激を対象に投与するステップであって、刺激がリガンドであるステップと；（ｃ）樹状細胞活性化を測定するために対象におけるリガンドに応答した樹状細胞活性化マーカーであるＩＬ１２を測定するステップと、を含む、方法を提供する。

本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載されている。本明細書において記載されているものと類似または同等の任意の物質及び方法は、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい物質及び発明は本明細書に記載される。本開示の他の特長、目的、及び利点は、説明から明らかになるであろう。本明細書において、文脈が別途明確に指示しない限り、単数形は複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合、本記載が優先するであろう。
Ａ． 組成物
本開示は、改変された細胞、核酸分子、ベクター、ならびに経口小分子薬物の投与を通じて天然の治療用タンパク質のタイミングまたはレベルを制御することができる細胞及び遺伝子治療を提供する。さらに、本開示は、目的のタンパク質（ＰＯＩ、本明細書では「ペイロード」とも呼ばれ、交換可能に使用され得る）の調整可能な発現のための組成物、システム、及び方法を提供する。組成物は、細胞における目的のタンパク質の調整可能な発現のためのシステム、及び少なくとも１つの目的のタンパク質に作動可能に連結された少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードするポリヌクレオチドの翻訳を誘導する薬剤に関する。本開示によって提供される組成物は、ＤＲＤを安定化するリガンドの存在下での、疾患の治療に使用するための目的のタンパク質の調整可能な発現のためのシステムに関連する核酸分子、ポリペプチド、及び改変細胞を含む。本開示によって提供されるタンパク質発現のための調整可能なシステムに関連する方法には、改変細胞を産生する方法、及び疾患を治療または予防する方法が含まれる。

様々な実施形態では、本開示は、それを必要とする対象における疾患を治療するための方法を提供し、この方法は、ａ．細胞の集団を提供することと、ｂ．細胞集団中の少なくとも１つの細胞に少なくとも１つの核酸を導入することであって、核酸分子は、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）に作動可能に連結された目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む導入することと、ｃ．細胞を被験者に送達することと、ｄ．少なくとも１つの細胞で目的のタンパク質の発現を可能にするのに十分にＤＲＤを安定化するリガンドを対象に投与することと、を含み、目的のタンパク質の発現は、対象におけるリガンドの存在によって調節され、リガンド投与の量及び／または期間は、細胞集団内の少なくとも１つの細胞において治療有効量の目的のタンパク質を産生するのに十分である。

１．調整可能なタンパク質発現システム
一般に、ＤＲＤを含む刺激応答エレメント（ＳＲＥ）は、任意のペイロード（例えば、免疫療法薬）であり得るペイロード構築物に作動可能に連結され、エフェクターモジュールを形成することができる。ＳＲＥは、特定の刺激、安定化リガンドまたは単にリガンド（本明細書で交換可能に使用される）、例えば小分子によって活性化されると、操作された細胞においてシグナルまたは結果をもたらして、連結されたペイロードの転写、翻訳、及び／またはタンパク質レベルを制御することができる。ペイロードの調整可能な発現は、ＤＲＤを安定化して作動可能に連結されたペイロードの調整可能な発現をもたらす安定化リガンドを提供または除外することにより、上方または下方に調節することができる。様々な実施形態では、本開示は、免疫療法に使用される任意の薬剤の発現レベル及び活性を調整するＳＲＥをコードするポリヌクレオチドを提供する。

本明細書で使用される場合、「生体回路」または「生体回路システム」は、刺激と刺激に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールとを含み、刺激への応答が、生物学的システム内、その間、その指標として、またはその上での、少なくとも１つのシグナルまたは結果をもたらす。生物学的システムは、一般に、動物、植物、真菌、細菌、またはウイルスであるかどうかにかかわらず、任意の細胞、組織、臓器、臓器系、または生物であると理解されている。生体回路は、本開示によって教示される刺激またはエフェクターモジュールを使用し、診断、レポーターシステム、デバイス、アッセイまたはキットなどの無細胞環境においてシグナルまたは結果をもたらす人工回路であり得ることも理解される。人工回路は、１つ以上の電子的、磁気的、または放射性の構成要素または部品に関連付けられ得る。

２．エフェクターモジュール及び刺激応答エレメント（ＳＲＥ）
本開示のシステム、組成物及び方法は、エフェクターモジュールシステムの構成要素として少なくとも１つの刺激応答エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「エフェクターモジュール」は、少なくとも（ａ）１つ以上の刺激応答エレメントと、（ｂ）１つ以上のペイロード（例えば、目的のペイロードまたは目的のタンパク質（ＰＯＩ））と、を含む単一または多成分の構築物または複合体である。一実施形態では、ＳＲＥのＤＲＤは、全体的または部分的に、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈｄｈｄｒ ｈＤＨＦＲタンパク質を含み、ＤＲＤは、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈＤＨＦＲタンパク質の当該アミノ酸配列における１つ以上の変異をさらに含む。一実施形態では、ペイロードは、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）、または配列番号３８２０に対してＹ１７０Ｇ、Ｙ１７２Ｇ、Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｆ、Ｇ２２６Ｈ、Ｇ２２６Ｗ、またはＧ２２７Ｆから選択される１つ以上の変異を含む変異体ＣＤ４０Ｌを含む。

本明細書で使用される場合、「刺激応答エレメント（ＳＲＥ）」は、エフェクターモジュールの１つ以上のペイロードに結合、結合、作動可能に連結、または結合されたエフェクターモジュールの構成要素であり、場合によっては、１つ以上の刺激に対するエフェクターモジュールの応答性の性質を担う。本明細書で使用される場合、刺激に対するＳＲＥの「応答性」の性質は、共有結合または非共有結合の相互作用、直接または間接の結合、または刺激に対する構造的または化学的反応によって特徴付けられ得る。さらに、刺激に対するいずれかのＳＲＥの応答は、程度または種類の問題であってよい。応答は部分的な応答であってよい。応答は可逆応答であってよい。応答は、最終的には制御されたシグナルまたは結果をもたらしてもよい。そのような結果シグナルは、刺激に対して相対的な性質のものであってよく、例えば、１％から１００％の間の調節効果、または２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれ以上などの倍数の増加または減少をもたらしてもよい。

いくつかの実施形態では、本開示は、タンパク質の発現、機能、またはレベルを調節するための方法を提供する。いくつかの態様では、タンパク質の発現、機能、またはレベルの調節は、少なくとも２０％、例えば、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または少なくとも２０～３０％、２０～４０％、２０～５０％、２０～６０％、２０～７０％、２０～８０％、２０～９０％、２０～９５％、２０～１００％、３０～４０％、３０～５０％、３０～６０％、３０～７０％、３０～８０％、３０～９０％、３０～９５％、３０～１００％、４０～５０％、４０～６０％、４０～７０％、４０～８０％、４０～９０％、４０～９５％、４０～１００％、５０～６０％、５０～７０％、５０～８０％、５０～９０％、５０～９５％、５０～１００％、６０～７０％、６０～８０％、６０～９０％、６０～９５％、６０～１００％、７０～８０％、７０～９０％、７０～９５％、７０～１００％、８０～９０％、８０～９５％、８０～１００％、９０～９５％、９０～１００％、または９５～１００％の発現、機能またはレベルの調節を指す。

３．調整可能なタンパク質発現システムのリガンド依存性活性の特性評価
調整可能なタンパク質発現システムのリガンド依存性活性は、様々な方法によって特性評価され得る。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムのリガンド依存性活性は、ＤＲＤのリガンド依存性制御によって特性評価される。いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムのリガンド依存性活性は、ＤＲＤのリガンド用量依存性制御によって特性評価される。ＤＲＤ転写因子ポリペプチドのリガンド依存性調節は、様々な方法によって特性評価され得る。いくつかの態様では、ＤＲＤのリガンド依存性制御は、ＤＲＤ、目的のタンパク質、またはその両方のレベルを測定することを目的としたイムノアッセイなどによって、ＤＲＤ、作動可能に連結された目的のタンパク質、またはその両方のレベルを測定することによって評価され得る。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムのリガンド依存性活性は、ＤＲＤに作動可能に連結されたペイロードのリガンド依存性発現によって特性評価される。ペイロードの発現は、さまざまな方法で評価できる。いくつかの態様では、ペイロードの発現は、タンパク質／ポリペプチドレベルを測定することによって評価される。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、ＤＲＤを欠く対照の調整可能なタンパク質発現システムと比較され得る。いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムのリガンド依存性活性は、ＤＲＤを欠くペイロード含有構築物を含む調整可能なタンパク質発現システムの活性と比較して分析または特性評価され得る。

様々な実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、目的のタンパク質またはペイロード（本明細書において交換可能に使用される）の調整可能な発現を提供する。様々な実施形態では、本開示の核酸配列は、目的のタンパク質をコードし、ＤＲＤをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列を含む。ＤＲＤをコードするヌクレオチド配列は、ペイロードをコードする核酸配列の上流または下流に配置され得る。

ＤＲＤを含む細胞または生物が外因性安定化リガンドに曝露されると、ＤＲＤは安定化される。安定化されたＤＲＤ及びＤＲＤの上流または下流に配置された任意のポリペプチド配列も安定化され、ユビキチンプロテアソーム分解経路に輸送されない。外因性安定化リガンドが存在しない場合、ＤＲＤならびにＤＲＤの上流及び／または下流のＤＲＤに作動可能に連結された任意の作動可能に連結されたポリペプチド配列は、細胞内で分解及び排除される。したがって、タンパク質発現の量とタイミングの両方は、細胞または生物に外因性安定化リガンドを投与することによって制御することができる。

様々な実施形態では、ＤＲＤ及び目的のタンパク質は、典型的には作動可能に連結され、または１つ以上の介在するヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列、例えば、リンカー、シグナル配列、リーダー配列、膜貫通ドメイン、切断部位のテール内ドメインによって分離され得る。様々な実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第１の核酸配列と、目的のタンパク質をコードする第２の核酸配列と、を含み得る。そのような実施形態では、本明細書で細胞内に記載されている目的のタンパク質は、ＤＲＤに作動可能に連結されている。さらに、細胞はまた、ＤＲＤ、目的のタンパク質、またはその両方に作動可能に連結され得る他の任意選択のヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ペイロードをコードする第１の核酸配列と、ペイロードに作動可能に連結されている薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２の核酸配列と、を含み得る、少なくとも第１のポリヌクレオチドを含む。任意選択で、いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び／またはベクターは、例えば、１つ以上のペイロード及び１つ以上のＤＲＤのモノシストロン性及び／またはバイシストロン性発現のための調整可能なタンパク質発現システムの追加の構成要素、例えば、ＩＲＥＳ配列及び切断部位を、ペイロードの上流もしくは下流に、またはＤＲＤの上流もしくは下流に配置された任意選択の介在ペプチドまたはポリペプチド配列を伴って含み得る。

いくつかの実施形態では、ベクターはまた、例えば細菌において、ベクターの増幅を可能にする複製起点（ｏｒｉ）を有する。付加的に、または代替的に、ベクターは、抗生物質耐性遺伝子、着色マーカーの遺伝子、及び自殺遺伝子などの選択可能なマーカー、ならびに細菌、ウイルス、及び真核細胞におけるクローニング及び／または発現を可能にする他の調節配列を含む。

４．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）
薬物応答性ドメイン（ＤＲＤまたはＤＤ）は、不安定でリガンドの非存在下で分解されるタンパク質ドメインであるが、対応するＤＲＤ結合リガンド（本明細書では刺激または刺激リガンドまたは単にリガンドとも呼ばれる）に結合することによってその安定性が救済される。薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）という用語は、不安定化ドメイン（ＤＤ）という用語と互換的である。薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）は、目的のポリペプチドまたはタンパク質に付加することができ、ＤＲＤ結合リガンドの非存在下で結合したポリペプチドまたはタンパク質を不安定にできる。ＤＲＤは、タンパク質分解を介して、結合したポリペプチドまたはタンパク質に不安定化特性をもたらす。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＤＲＤ結合リガンドの非存在下で、付加されたまたは作動可能に連結されたポリペプチドまたはタンパク質は、細胞のユビキチン－プロテアソーム系によって急速に分解されると考えられている。ＤＲＤに結合するかまたはそれと相互作用するリガンドは、そのような結合または相互作用の際に、ＤＲＤ及び任意の付加されたかまたは作動可能に連結されたポリペプチドまたはタンパク質の安定性を調節することができる。リガンドが目的のＤＲＤに結合すると、不安定性が逆転し、付加されたポリペプチドまたはタンパク質の機能が回復する。ＤＲＤの安定性の条件付きの性質により、安定したタンパク質から分解のための不安定な基質への迅速で揺らぎない切り替えが可能になる。さらに、そのリガンドの濃度への依存性は、分解速度の調整可能な制御をさらに提供する。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、タンパク質の翻訳後調節が可能である既知のポリペプチドに由来し得る。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、既知のタンパク質から開発または誘導され得る。野生型タンパク質の領域または部分またはドメインは、全体的または部分的にＤＲＤとして利用され得る。それらを組み合わせたり、再配置したりして、新しいペプチド、タンパク質、領域、またはドメインを作成することができ、それらのいずれをもＤＲＤまたはさらなるＤＲＤの設計の開始点として使用することができる。

いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、親タンパク質、または親タンパク質と比較して１個、２個、３個、またはそれ以上のアミノ酸変異を有する変異体タンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、親タンパク質は、ＦＫＢＰ；ヒトタンパク質ＦＫＢＰ；ヒトＤＨＦＲ（ｈＤＨＦＲ）；Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨＦＲ（ｅｃＤＨＦＲ）；ＰＤＥ５（ホスホジエステラーゼ５）；及びＥＲ（エストロゲン受容体）から選択され得るが、これに限定されない。ＤＲＤとそのリガンドの開発に使用できるタンパク質の例を表１に列挙する。

表１：ＤＲＤとその結合リガンド

いくつかの実施形態では、ＤＲＤを開発するために使用されタンパク質の配列は、表１のタンパク質配列の全部、一部、またはその領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤを開発するために使用され得るタンパク質は、表１に列挙されるタンパク質のアイソフォームを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５に由来する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォーム２に由来する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォーム３に由来する。いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォームＸ１に由来する。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ１（ｈＤＨＦＲ１）、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ２（ｈＤＨＦＲ２）、またはそれらの断片もしくはバリアントなどであるがこれらに限定されないヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）タンパク質に由来する。

いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

本開示に包含されるＤＲＤのアミノ酸配列は、それが由来する親タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約７５％または８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。

本開示のＤＲＤの例としては、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５に由来するものが挙げられる。薬物応答性ドメインまたはリガンド結合ドメインと呼ばれ得る適切なＤＲＤもまた、当該技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０１８／１６１０００；ＷＯ２０１８／２３１７５９；ＷＯ２０１９／２４１３１５；ＵＳ８，１７３，７９２；ＵＳ８，５３０，６３６；ＷＯ２０１８／２３７３２３；ＷＯ２０１７／１８１１１９；ＵＳ２０１７／０１１４３４６；ＵＳ２０１９／０３００８６４；ＷＯ２０１７／１５６２３８；Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １３４：３９４２ （２０１２）；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｃｅｌｌ １２６：９９５－１００４；Ｓｔａｎｋｕｎａｓ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ １２：１６１５－１６２４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １４：１１２３－１１２７；Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １７：９８１－９８８；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１００７－１００９；Ｍａｄｅｉｒａ ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０６：７５８３－７５８８；Ｐｒｕｅｔｔ－Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ５：ｅ１０００３７６；及びＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｅｌｉｆｅ ４：ｅ１０６０６を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ１（ｈＤＨＦＲ１）、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ２（ｈＤＨＦＲ２）、またはそれらの断片もしくはバリアントなどであるがこれらに限定されないヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）タンパク質に由来する。

いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、２つ、３つ、４つ、または５つの変異を含み得る。

本開示に包含されるＤＲＤのアミノ酸配列は、それが由来する親タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約７５％または８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。

本開示のＤＲＤの例としては、ヒトＤＨＦＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）、ＦＫＢＰ、ヒトタンパク質ＦＫＢＰ、及びヒトＰＤＥ５に由来するものが挙げられる。薬物応答性ドメインまたはリガンド結合ドメインと呼ばれ得る適切なＤＲＤもまた、当該技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０１８／１６１０００；ＷＯ２０１８／２３１７５９；ＷＯ２０１９／２４１３１５；ＵＳ８，１７３，７９２；ＵＳ８，５３０，６３６；ＷＯ２０１８／２３７３２３；ＷＯ２０１７／１８１１１９；ＵＳ２０１７／０１１４３４６；ＵＳ２０１９／０３００８６４；ＷＯ２０１７／１５６２３８；Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １３４：３９４２ （２０１２）；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｃｅｌｌ １２６：９９５－１００４；Ｓｔａｎｋｕｎａｓ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ １２：１６１５－１６２４；Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． １４：１１２３－１１２７；Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１７：９８１－９８８；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１００７－１００９；Ｍａｄｅｉｒａ ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６：７５８３－７５８８；Ｐｒｕｅｔｔ－Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００９） ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ５：ｅ１０００３７６；及びＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｅｌｉｆｅ ４：ｅ１０６０６を参照されたい。

一実施形態では、ＳＲＥは、親タンパク質の領域または変異タンパク質に由来する。親タンパク質の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、または４５０を超えるアミノ酸長であってよい。親タンパク質の領域は、５～５０、２５～７５、５０～１００、７５～１２５、１００～１５０、１２５～１７５、１５０～２００、１７５～２２５、２００～２５０、２２５～２７５、２５０～３００、２７５～３２５、３００～３５０、３２５～３７５、３５０～４００、３７５～４２５、または４００～４５０のアミノ酸長であってよい。

一実施形態では、ＳＲＥは、親タンパク質または変異体タンパク質に由来し、親タンパク質の領域を含む。ＳＲＥは、親タンパク質または変異体タンパク質の、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％、または５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～１００％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、１０～３０％、２０～４０％、３０～５０％、４０～６０％、５０～７０％、６０～８０％、７０～９０％、８０～１００％、１０～４０％、２０～５０％、３０～６０％、４０～７０％、５０～８０％、６０～９０％、７０～１００％、１０～５０％、２０～６０％、３０～７０％、４０～８０％、５０～９０％、６０～１００％、１０～６０％、２０～７０％、３０～８０％、４０～９０％、５０～１００％、１０～７０％、２０～８０％、３０～９０％、４０～１００％、１０～８０％、２０～９０％、３０～１００％、１０～９０％、２０～１００％、２５～５０％、５０～７５％、もしくは７５～１００％である親タンパク質の領域を含み得る。

一実施形態では、ＳＲＥは親タンパク質または変異体タンパク質に由来し、親タンパク質または変異体タンパク質に対して、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、もしくは１００％、または５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～１００％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、１０～３０％、２０～４０％、３０～５０％、４０～６０％、５０～７０％、６０～８０％、７０～９０％、８０～１００％、１０～４０％、２０～５０％、３０～６０％、４０～７０％、５０～８０％、６０～９０％、７０～１００％、１０～５０％、２０～６０％、３０～７０％、４０～８０％、５０～９０％、６０～１００％、１０～６０％、２０～７０％、３０～８０％、４０～９０％、５０～１００％、１０～７０％、２０～８０％、３０～９０％、４０～１００％、１０～８０％、２０～９０％、３０～１００％、１０～９０％、２０～１００％、２５～５０％、５０～７５％、もしくは７５～１００％の同一性を有し得る。

一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）を含み得る。エフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるＤＲＤを含んでもよい。１つを超えるＤＲＤが存在する場合、それぞれのＤＲＤは、同じ親タンパク質（例えば、ＰＤＥ５）、異なる親タンパク質（例えば、ＰＤＥ５とｈＤＨＦＲ）に由来してもよく、２つの異なる親タンパク質の融合体であってもよく、人工物であってもよい。

一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、２つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、３つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、４つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、５つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、６つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、７つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、８つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、９つのＤＲＤを含んでもよい。一実施形態では、本開示のエフェクターモジュール及び／またはＳＲＥは、１０つのＤＲＤを含んでもよい。ＤＲＤは、当該技術分野で知られている、及び／または本明細書に記載されている任意の親タンパク質に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、同じ親タンパク質（例えば、ＰＤＥ５）に由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、同じ親タンパク質の異なる領域（例えば、ＰＤＥ５のアミノ酸５３５～８６０及びアミノ酸５９０～８３６）に由来する。いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、異なる親タンパク質（例えば、ＰＤＥ５とｈＤＨＦＲ）に由来する。

５．ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）
一実施形態では、ＳＲＥは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ１（ｈＤＨＦＲ１）、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ２（ｈＤＨＦＲ２）、またはその断片もしくはバリアントなどであるがこれらに限定されないヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）タンパク質に由来する少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＤ）を含み得る。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＤＨＦＲ１に由来する少なくとも１つのＤＲＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＤＨＦＲ２に由来する少なくとも１つのＤＲＤを含む。

いくつかの実施形態では、本開示のＤＲＤは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）に由来し得る。ｈＤＨＦＲは、ジヒドロ葉酸の還元を触媒する小さな（１８ｋＤａ）酵素であり、さまざまな同化経路で重要な役割を果たす。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は、ニコチンアミドアデニンリン酸二水素（ＮＡＤＰＨ）の存在下で、７，８－ジヒドロ葉酸（ＤＨＦ）を５，６，７，８，テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）に変換する必須酵素である。葉酸の構造類似体であるメトトレキサート（ＭＴＸ）など、天然の基質であるＤＨＦよりも強くＤＨＦＲに結合する葉酸拮抗薬は、主にジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害によって葉酸代謝を妨害し、プリンとピリミジンの前駆体合成を抑制する。葉酸、ＴＱＤ、トリメトプリム（ＴＭＰ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ＥＣＧ（エピカテキンガレート）などの他のｈＤＨＦＲ阻害剤も、ｈＤＨＦＲに結合し、その安定性を制御する。

一実施形態では、ＳＲＥは、ｈＤＨＦＲタンパク質の領域を含む。ｈＤＨＦＲタンパク質の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、または４５０を超えるアミノ酸長であってよい。親タンパク質の領域は、５～５０、２５～７５、５０～１００、７５～１２５、１００～１５０、１２５～１７５、１５０～２００、１７５～２２５、２００～２５０、２２５～２７５、２５０～３００、２７５～３２５、３００～３５０、３２５～３７５、３５０～４００、３７５～４２５、または４００～４５０のアミノ酸長であってよい。

一実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｖ２Ａ、Ｃ７Ｒ、Ｉ８Ｖ、Ｖ９Ａ、Ａ１０Ｔ、Ａ１０Ｖ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ１４Ｓ、Ｇ１６Ｓ、Ｉ１７Ｎ、Ｉ１７Ｖ、Ｋ１９Ｅ、Ｎ２０Ｄ、Ｇ２１Ｅ、Ｇ２１Ｔ、Ｄ２２Ｓ、Ｌ２３Ｓ、Ｐ２４Ｓ、Ｌ２８Ｐ、Ｎ３０Ｄ、Ｎ３０Ｈ、Ｎ３０Ｓ、Ｅ３１Ｄ、Ｅ３１Ｇ、Ｆ３２Ｍ、Ｒ３３Ｇ、Ｒ３３Ｓ、Ｆ３５Ｌ、Ｑ３６Ｆ、Ｑ３６Ｋ、Ｑ３６Ｒ、Ｑ３６Ｓ、Ｒ３７Ｇ、Ｍ３８Ｔ、Ｍ３８Ｖ、Ｔ４０Ａ、Ｖ４４Ａ、Ｋ４７Ｒ、Ｎ４９Ｄ、Ｎ４９Ｓ、Ｍ５３Ｔ、Ｇ５４Ｒ、Ｋ５６Ｅ、Ｋ５６Ｒ、Ｔ５７Ａ、Ｆ５９Ｓ、Ｉ６１Ｔ、Ｅ６３Ｇ、Ｋ６４Ｒ、Ｎ６５Ａ、Ｎ６５Ｄ、Ｎ６５Ｆ、Ｎ６５Ｓ、Ｌ６８Ｓ、Ｋ６９Ｅ、Ｋ６９Ｒ、Ｒ７１Ｇ、Ｉ７２Ａ、Ｉ７２Ｔ、Ｉ７２Ｖ、Ｎ７３Ｇ、Ｌ７４Ｎ、Ｖ７５Ｆ、Ｒ７８Ｇ、Ｌ８０Ｐ、Ｋ８１Ｒ、Ｅ８２Ｇ、Ｈ８８Ｙ、Ｆ８９Ｌ、Ｒ９２Ｇ、Ｓ９３Ｇ、Ｓ９３Ｒ、Ｌ９４Ａ、Ｄ９６Ｇ、Ａ９７Ｔ、Ｌ９８Ｓ、Ｋ９９Ｇ、Ｋ９９Ｒ、Ｌ１００Ｐ、Ｅ１０２Ｇ、Ｑ１０３Ｒ、Ｐ１０４Ｓ、Ｅ１０５Ｇ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｖ、Ｖ１１３Ａ、Ｗ１１４Ｒ、Ｉ１１５Ｌ、Ｉ１１５Ｖ、Ｖ１１６Ｉ、Ｇ１１７Ｄ、Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｃ、Ｙ１２２Ｄ、Ｙ１２２Ｉ、Ｙ１２２Ｎ、Ａ１０７Ｔ、Ａ１０７Ｖ、Ｎ１０８Ｄ、Ｋ１０９Ｅ、Ｋ１０９Ｒ、Ｖ１１０Ａ、Ｄ１１１Ｎ、Ｋ１２３Ｅ、Ｋ１２３Ｒ、Ａ１２５Ｆ、Ｍ１２６Ｉ、Ｎ１２７Ｒ、Ｎ１２７Ｓ、Ｎ１２７Ｙ、Ｈ１２８Ｒ、Ｈ１２８Ｙ、Ｈ１３１Ｒ、Ｌ１３２Ｐ、Ｋ１３３Ｅ、Ｌ１３４Ｐ、Ｆ１３５Ｌ、Ｆ１３５Ｐ、Ｆ１３５Ｓ、Ｆ１３５Ｖ、Ｖ１３６Ｍ、Ｔ１３７Ｒ、Ｒ１３８Ｇ、Ｒ１３８Ｉ、Ｉ１３９Ｔ、Ｉ１３９Ｖ、Ｍ１４０Ｉ、Ｍ１４０Ｖ、Ｑ１４１Ｒ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１４３Ｌ、Ｆ１４３Ｓ、Ｅ１４４Ｇ、Ｄ１４６Ｇ、Ｔ１４７Ａ、Ｆ１４８Ｌ、Ｆ１４８Ｓ、Ｆ１４９Ｌ、Ｐ１５０Ｌ、Ｅ１５１Ｇ、Ｉ１５２Ｖ、Ｄ１５３Ａ、Ｄ１５３Ｇ、Ｅ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｒ、Ｙ１５７Ｃ、Ｙ１５７Ｒ、Ｋ１５８Ｅ、Ｋ１５８Ｒ、Ｌ１５９Ｐ、Ｌ１６０Ｐ、Ｅ１６２Ｇ、Ｙ１６３Ｃ、Ｖ１６６Ａ、Ｎ１６８Ｄ、Ｓ１６８Ｃ、Ｄ１６９Ｇ、Ｖ１７０Ａ、Ｑ１７１Ｒ、Ｅ１７２Ｇ、Ｅ１７３Ａ、Ｅ１７３Ｇ、Ｋ１７４Ｒ、Ｉ１７６Ａ、Ｉ１７６Ｆ、Ｉ１７６Ｔ、Ｋ１７７Ｅ、Ｋ１７７Ｒ、Ｙ１７８Ｃ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８０Ｌ、Ｅ１８１Ｇ、Ｖ１８２Ａ、Ｙ１８３Ｃ、Ｙ１８３Ｈ、Ｅ１８４Ｇ、Ｅ１８４Ｒ、Ｋ１８５ｄｅｌ、Ｋ１８５Ｅ、Ｋ１８５Ｒ、Ｎ１８６Ｄ、Ｎ１８６Ｓ、Ｄ１８７Ｇ、及びＤ１８７Ｎが挙げられる。

一実施形態では、ＤＲＤは、ｈＤＨＦＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。本明細書に列挙される変異のいずれも、ＤＲＤに含まれ得る。二重変異の非限定的な例としては、Ｃ７Ｒ、Ｙ１６３Ｃ；Ａ１０Ｖ、Ｈ８８Ｙ；Ｉ１７Ｖ、Ｙ１２２Ｉ；Ｇ２１Ｔ、Ｙ１２２Ｉ；Ｑ３６Ｋ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ５３Ｔ、Ｒ１３８Ｉ；Ｔ５７Ａ、Ｉ７２Ａ；Ｅ６３Ｇ、Ｉ１７６Ｆ；Ｌ７４Ｎ、Ｙ１２２Ｉ；Ｖ７５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ；Ｌ９４Ａ、Ｔ１４７Ａ；Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｉ；Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ；Ｙ１２２Ｉ、Ｎ１２７Ｙ；Ｙ１２２Ｉ、Ｍ１４０Ｉ；Ｈ１３１Ｒ、Ｅ１４４Ｇ；Ｔ１３７Ｒ、Ｆ１４３Ｌ；Ｅ１６２Ｇ、Ｉ１７６Ｆ；Ｙ１７８Ｈ、Ｅ１８１Ｇ；Ｙ１８３Ｈ、Ｋ１８５Ｅ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｉ１７Ｖ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｋ１８５Ｅ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｎ１２７Ｙ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｎ１６８Ｄ；及びＭ１ｄｅｌ、Ｍ１４０Ｉが挙げられる。三重変異の非限定的な例としては、Ｉ８Ｖ、Ｋ１３３Ｅ、Ｙ１６３Ｃ；Ｖ９Ａ、Ｓ９３Ｒ、Ｐ１５０Ｌ；Ｋ１９Ｅ、Ｆ８９Ｌ、Ｅ１８１Ｇ；Ｇ２１Ｅ、Ｉ７２Ｖ、Ｉ１７６Ｔ；Ｌ２３Ｓ、Ｖ１２１Ａ、Ｙ１５７Ｃ；Ｅ３１Ｄ、Ｆ３２Ｍ、Ｖ１１６Ｉ；Ｑ３６Ｆ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ；Ｑ３６Ｋ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ；Ｑ３６Ｆ、Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ；Ｎ４９Ｄ、Ｆ５９Ｓ、Ｄ１５３Ｇ；Ｖ１１０Ａ、Ｖ１３６Ｍ、Ｋ１７７Ｒ；Ｙ１２２Ｉ、Ｈ１３１Ｒ、Ｅ１４４Ｇ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｉ１７Ｖ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｇ２１Ｔ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｇ２１Ｔ、Ｙ１２２Ｎ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｑ３６Ｋ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｍ５３Ｔ、Ｒ１３８Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｌ７４Ｎ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｖ７５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｌ９４Ａ、Ｔ１４７Ａ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｖ１２１Ａ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｙ１２２Ｉ、Ｍ１４０Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｙ１２２Ｉ、Ｎ１２７Ｙ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｈ１３１Ｒ、Ｅ１４４Ｇ；及びＭ１ｄｅｌ、Ｅ１６２Ｇ、Ｉ１７６Ｆが挙げられる。４つの変異の非限定的な例としては、Ｇ５４Ｒ、Ｉ１１５Ｌ、Ｍ１４０Ｖ、Ｓ１６８Ｃ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｅ３１Ｄ、Ｆ３２Ｍ、Ｖ１１６Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｑ３６Ｆ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｑ３６Ｆ、Ｙ１２２Ｉ、Ａ１２５Ｆ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｑ３６Ｋ、Ｎ６５Ｆ、Ｙ１２２Ｉ；及びＭ１ｄｅｌ、Ｙ１２２Ｉ、Ｈ１３１Ｒ、Ｅ１４４Ｇが挙げられる。５つの変異の非限定的な例としては、Ｖ２Ａ、Ｒ３３Ｇ、Ｑ３６Ｒ、Ｌ１００Ｐ、Ｋ１８５Ｒ；Ｄ２２Ｓ、Ｆ３２Ｍ、Ｒ３３Ｓ、Ｑ３６Ｓ、Ｎ６５Ｓ；及びＭ１ｄｅｌ、Ｄ２２Ｓ、Ｆ３２Ｍ、Ｒ３３Ｓ、Ｑ３６Ｓ、Ｎ６５Ｓが挙げられる。５つを超える変異の非限定的な例としては、Ｉ１７Ｎ、Ｌ９８Ｓ、Ｋ９９Ｒ、Ｍ１１２Ｔ、Ｅ１５１Ｇ、Ｅ１６２Ｇ、Ｅ１７２Ｇ；Ｇ１６Ｓ、Ｉ１７Ｖ、Ｆ８９Ｌ、Ｄ９６Ｇ、Ｋ１２３Ｅ、Ｍ１４０Ｖ、Ｄ１４６Ｇ、Ｋ１５６Ｒ；Ｋ８１Ｒ、Ｋ９９Ｒ、Ｌ１００Ｐ、Ｅ１０２Ｇ、Ｎ１０８Ｄ、Ｋ１２３Ｒ、Ｈ１２８Ｒ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１８０Ｌ、Ｋ１８５Ｅ；Ｒ１３８Ｇ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１４３Ｓ、Ｋ１５６Ｒ、Ｋ１５８Ｅ、Ｅ１６２Ｇ、Ｖ１６６Ａ、Ｋ１７７Ｅ、Ｙ１７８Ｃ、Ｋ１８５Ｅ、Ｎ１８６Ｓ；Ｎ１４Ｓ、Ｐ２４Ｓ、Ｆ３５Ｌ、Ｍ５３Ｔ、Ｋ５６Ｅ、Ｒ９２Ｇ、Ｓ９３Ｇ、Ｎ１２７Ｓ、Ｈ１２８Ｙ、Ｆ１３５Ｌ、Ｆ１４３Ｓ、Ｌ１５９Ｐ、Ｌ１６０Ｐ、Ｅ１７３Ａ、Ｆ１８０Ｌ；Ｆ３５Ｌ、Ｒ３７Ｇ、Ｎ６５Ａ、Ｌ６８Ｓ、Ｋ６９Ｅ、Ｒ７１Ｇ、Ｌ８０Ｐ、Ｋ９９Ｇ、Ｇ１１７Ｄ、Ｌ１３２Ｐ、Ｉ１３９Ｖ、Ｍ１４０Ｉ、Ｄ１４２Ｇ、Ｄ１４６Ｇ、Ｅ１７３Ｇ、Ｄ１８７Ｇ；Ｌ２８Ｐ、Ｎ３０Ｈ、Ｍ３８Ｖ、Ｖ４４Ａ、Ｌ６８Ｓ、Ｎ７３Ｇ、Ｒ７８Ｇ、Ａ９７Ｔ、Ｋ９９Ｒ、Ａ１０７Ｔ、Ｋ１０９Ｒ、Ｄ１１１Ｎ、Ｌ１３４Ｐ、Ｆ１３５Ｖ、Ｔ１４７Ａ、Ｉ１５２Ｖ、Ｋ１５８Ｒ、Ｅ１７２Ｇ、Ｖ１８２Ａ、Ｅ１８４Ｒ；Ｖ２Ａ、Ｉ１７Ｖ、Ｎ３０Ｄ、Ｅ３１Ｇ、Ｑ３６Ｒ、Ｆ５９Ｓ、Ｋ６９Ｅ、Ｉ７２Ｔ、Ｈ８８Ｙ、Ｆ８９Ｌ、Ｎ１０８Ｄ、Ｋ１０９Ｅ、Ｖ１１０Ａ、Ｉ１１５Ｖ、Ｙ１２２Ｄ、Ｌ１３２Ｐ、Ｆ１３５Ｓ、Ｍ１４０Ｖ、Ｅ１４４Ｇ、Ｔ１４７Ａ、Ｙ１５７Ｃ、Ｖ１７０Ａ、Ｋ１７４Ｒ、Ｎ１８６Ｓ；Ｌ１００Ｐ、Ｅ１０２Ｇ、Ｑ１０３Ｒ、Ｐ１０４Ｓ、Ｅ１０５Ｇ、Ｎ１０８Ｄ、Ｖ１１３Ａ、Ｗ１１４Ｒ、Ｙ１２２Ｃ、Ｍ１２６Ｉ、Ｎ１２７Ｒ、Ｈ１２８Ｙ、Ｌ１３２Ｐ、Ｆ１３５Ｐ、Ｉ１３９Ｔ、Ｆ１４８Ｓ、Ｆ１４９Ｌ、Ｉ１５２Ｖ、Ｄ１５３Ａ、Ｄ１６９Ｇ、Ｖ１７０Ａ、Ｉ１７６Ａ、Ｋ１７７Ｒ、Ｖ１８２Ａ、Ｋ１８５Ｒ、Ｎ１８６Ｓ；及びＡ１０Ｔ、Ｑ１３Ｒ、Ｎ１４Ｓ、Ｎ２０Ｄ、Ｐ２４Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｍ３８Ｔ、Ｔ４０Ａ、Ｋ４７Ｒ、Ｎ４９Ｓ、Ｋ５６Ｒ、Ｉ６１Ｔ、Ｋ６４Ｒ、Ｋ６９Ｒ、Ｉ７２Ａ、Ｒ７８Ｇ、Ｅ８２Ｇ、Ｆ８９Ｌ、Ｄ９６Ｇ、Ｎ１０８Ｄ、Ｍ１１２Ｖ、Ｗ１１４Ｒ、Ｙ１２２Ｄ、Ｋ１２３Ｅ、Ｉ１３９Ｖ、Ｑ１４１Ｒ、Ｄ１４２Ｇ、Ｆ１４８Ｌ、Ｅ１５１Ｇ、Ｅ１５５Ｇ、Ｙ１５７Ｒ、Ｑ１７１Ｒ、Ｙ１８３Ｃ、Ｅ１８４Ｇ、Ｋ１８５ｄｅｌ、Ｄ１８７Ｎが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ｈＤＨＦＲに由来するＤＲＤは、親ｈＤＨＦＲ配列のアミノ酸２～１８７を含み得る。これは、本明細書ではＭ１ｄｅｌ変異と呼ばれる。

一実施形態では、刺激は、ＳＲＥに結合して翻訳後タンパク質レベルを制御する小分子である。一態様では、ＤＨＦＲリガンド：トリメトプリム（ＴＭＰ）及びメトトレキサート（ＭＴＸ）は、ｈＤＨＦＲ変異体を安定化するために使用される。

ｈＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメイン（アミノ酸及び核酸の配列）の非限定的なリストを表２に列挙する。ｈＤＨＦＲに由来するＤＲＤについて、表２に列挙されている変異アミノ酸の位置は、配列番号３０のヒトＤＨＦＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ００３７４）（表２では「ＷＴ」と呼ばれる）を基準にしている。表２において、「ｄｅｌ」は、変異が野生型配列と比較してその位置でのアミノ酸の欠失であることを意味する。表２において、親ｈＤＨＦＲ配列のアミノ酸１～１８７を含むＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメインは、例えば、ｈＤＨＦＲ（Ｙ１２２Ｉ）のように括弧内の変異の識別を伴うｈＤＨＦＲとして示されている。

表２：ｈＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）

一実施形態では、ＳＲＥは、ｈＤＨＦＲＤＤ－１、ｈＤＨＦＲＤＤ－２、ｈＤＨＦＲＤＤ－３、ｈＤＨＦＲＤＤ－４、ｈＤＨＦＲＤＤ－５、ｈＤＨＦＲＤＤ－６、ｈＤＨＦＲＤＤ－７、ｈＤＨＦＲＤＤ－８、ｈＤＨＦＲＤＤ－９、ｈＤＨＦＲＤＤ－１０、ｈＤＨＦＲＤＤ－１１、ｈＤＨＦＲＤＤ－１２、ｈＤＨＦＲＤＤ－１３、ｈＤＨＦＲＤＤ－１４、ｈＤＨＦＲＤＤ－１５、ｈＤＨＦＲＤＤ－１６、ｈＤＨＦＲＤＤ－１７、ｈＤＨＦＲＤＤ－１８、ｈＤＨＦＲＤＤ－１９、ｈＤＨＦＲＤＤ－２０、ｈＤＨＦＲＤＤ－２１、ｈＤＨＦＲＤＤ－２２、ｈＤＨＦＲＤＤ－２３、ｈＤＨＦＲＤＤ－２４、ｈＤＨＦＲＤＤ－２５、ｈＤＨＦＲＤＤ－２６、ｈＤＨＦＲＤＤ－２７、ｈＤＨＦＲＤＤ－２８、ｈＤＨＦＲＤＤ－２９、ｈＤＨＦＲＤＤ－３０、ｈＤＨＦＲＤＤ－３１、ｈＤＨＦＲＤＤ－３２、ｈＤＨＦＲＤＤ－３３、ｈＤＨＦＲＤＤ－３４、ｈＤＨＦＲＤＤ－３５、ｈＤＨＦＲＤＤ－３６、ｈＤＨＦＲＤＤ－３７、ｈＤＨＦＲＤＤ－３８、ｈＤＨＦＲＤＤ－３９、ｈＤＨＦＲＤＤ－４０、ｈＤＨＦＲＤＤ－４１、ｈＤＨＦＲＤＤ－４２、ｈＤＨＦＲＤＤ－４３、ｈＤＨＦＲＤＤ－４４、ｈＤＨＦＲＤＤ－４５、ｈＤＨＦＲＤＤ－４６、ｈＤＨＦＲＤＤ－４７、ｈＤＨＦＲＤＤ－４８、ｈＤＨＦＲＤＤ－４９、ｈＤＨＦＲＤＤ－５０、ｈＤＨＦＲＤＤ－５１、ｈＤＨＦＲＤＤ－５２、ｈＤＨＦＲＤＤ－５３、ｈＤＨＦＲＤＤ－５４、ｈＤＨＦＲＤＤ－５５、ｈＤＨＦＲＤＤ－５６、ｈＤＨＦＲＤＤ－５７、ｈＤＨＦＲＤＤ－５８、ｈＤＨＦＲＤＤ－５９、ｈＤＨＦＲＤＤ－６０、ｈＤＨＦＲＤＤ－６１、ｈＤＨＦＲＤＤ－６２、ｈＤＨＦＲＤＤ－６３、ｈＤＨＦＲＤＤ－６４、ｈＤＨＦＲＤＤ－６５、ｈＤＨＦＲＤＤ－６６、ｈＤＨＦＲＤＤ－６７、ｈＤＨＦＲＤＤ－６８、ｈＤＨＦＲＤＤ－６９、ｈＤＨＦＲＤＤ－７０、ｈＤＨＦＲＤＤ－７１、ｈＤＨＦＲＤＤ－７２、ｈＤＨＦＲＤＤ－７３、ｈＤＨＦＲＤＤ－７４、ｈＤＨＦＲＤＤ－７５、ｈＤＨＦＲＤＤ－７６、ｈＤＨＦＲＤＤ－７７、ｈＤＨＦＲＤＤ－７８、ｈＤＨＦＲＤＤ－７９、ｈＤＨＦＲＤＤ－８０、ｈＤＨＦＲＤＤ－８１、ｈＤＨＦＲＤＤ－８２、ｈＤＨＦＲＤＤ－８３、ｈＤＨＦＲＤＤ－８４、ｈＤＨＦＲＤＤ－８５、及びｈＤＨＦＲＤＤ－８６などであるが、これらに限定されない、少なくとも１つのｈＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）を含んでもよい。

６．Ｅ． Ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）
一実施形態では、ＳＲＥは、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）を含み得る。

一実施形態では、ＳＲＥは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質の領域を含む。ｅｃＤＨＦＲタンパク質の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、または４５０を超えるアミノ酸長であってよい。親タンパク質の領域は、５～５０、２５～７５、５０～１００、７５～１２５、１００～１５０、１２５～１７５、１５０～２００、１７５～２２５、２００～２５０、２２５～２７５、２５０～３００、２７５～３２５、３００～３５０、３２５～３７５、３５０～４００、３７５～４２５、または４００～４５０のアミノ酸長であってよい。

一実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｒ１２Ｙ、Ｒ１２Ｈ、Ｇ２７Ｓ、Ｙ１００Ｉ、及びＥ１２９Ｋが挙げられる。

一実施形態では、ＤＲＤは、ｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。本明細書に列挙される変異のいずれも、ＤＲＤに含まれ得る。二重変異の非限定的な例としては、Ｒ１２Ｙ及びＹ１００Ｉが挙げられる。三重変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｒ１２Ｙ、Ｙ１００Ｉ；Ｍ１ｄｅｌ、Ｒ１２Ｙ、Ｅ１２９Ｋ；及びＭ１ｄｅｌ、Ｒ１２Ｈ、Ｅ１２９Ｋが挙げられる。４つの変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｒ１２Ｙ、Ｇ２７Ｓ、Ｙ１００Ｉが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ｅｃＤＨＦＲに由来するＤＲＤは、ｅｃｈＤＨＦＲ配列のアミノ酸２～１５９を含み得る。これは、本明細書ではＭ１ｄｅｌ変異と呼ばれる。

一実施形態では、刺激は、ＳＲＥに結合して翻訳後タンパク質レベルを制御する小分子である。一態様では、ｅｃＤＨＦＲリガンド：トリメトプリム（ＴＭＰ）及びメトトレキサート（ＭＴＸ）は、ｅｃＤＨＦＲ変異体を安定化するために使用される。

ｅｃＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメイン（アミノ酸及び核酸の配列）の非限定的なリストを表３に列挙する。表３に列挙されている変異アミノ酸の位置は、配列番号３５のＥ． Ｃｏｌｉ ＤＨＦＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ： Ｐ０ＡＢＱ４）（表３では「ＷＴ」と呼ばれる）を基準にしている。表３において、「ｄｅｌ」は、変異が野生型配列と比較してその位置でのアミノ酸の欠失であることを意味する。表３において、親ｅｃＤＨＦＲ配列のアミノ酸１～１５９を含むｅｃＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメインは、例えば、ｅｃＤＨＦＲ（Ｒ１２Ｙ、Ｙ１００Ｉ）のように括弧内の変異の識別を伴うｅｃＤＨＦＲとして示されている。

表３：ｅｃＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）

一実施形態では、ＳＲＥは、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－２、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－３、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－４、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－５、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－６、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－７、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－８、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－９、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１０、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１１、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１２、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１３、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１４、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１５、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１６、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１７、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１８、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－１９、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－２０、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－２１、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－２２、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－２３、ｅｃＤＨＦＲＤＤ－２４、及びｅｃＤＨＦＲＤＤ－２５などであるが、これらに限定されない、少なくとも１つのｅｃＤＨＦＲ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）を含み得る。

ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）

一実施形態では、ＳＲＥは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）を含み得る。

一実施形態では、ＳＲＥは、ＦＫＢＰタンパク質の領域を含む。ＦＫＢＰタンパク質の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、または４５０を超えるアミノ酸長であってよい。親タンパク質の領域は、５～５０、２５～７５、５０～１００、７５～１２５、１００～１５０、１２５～１７５、１５０～２００、１７５～２２５、２００～２５０、２２５～２７５、２５０～３００、２７５～３２５、３００～３５０、３２５～３７５、３５０～４００、３７５～４２５、または４００～４５０のアミノ酸長であってよい。

一実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｅ３２Ｇ、Ｆ３７Ｖ、Ｒ７２Ｇ、Ｋ１０６Ｅ、及びＬ１０９Ｐが挙げられる。

一実施形態では、ＤＲＤは、ＦＫＢＰタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。本明細書に記載されている変異のいずれも、ＤＤに含まれ得る。二重変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｆ３７Ｖ；Ｆ３７Ｖ、Ｌ１０７Ｐが挙げられる。三重変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｆ３７Ｖ、Ｌ１０７Ｐが挙げられる。４つの変異の非限定的な例としては、Ｅ３２Ｇ、Ｆ３７Ｖ、Ｒ７２Ｇ、Ｋ１０６Ｅが挙げられる。５つの変異の非限定的な例としては、Ｍ１ｄｅｌ、Ｅ３２Ｇ、Ｆ３７Ｖ、Ｒ７２Ｇ、Ｋ１０６Ｅが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＦＫＢＰに由来するＤＲＤは、親ＦＫＢＰ配列のアミノ酸２～１０８を含み得る。これは、本明細書ではＭ１ｄｅｌ変異と呼ばれる。

一実施形態では、刺激は、ＳＲＥに結合して翻訳後タンパク質レベルを制御する小分子である。一態様では、ＦＫＢＰリガンドシールド－１は、ＦＫＢＰ変異体を安定化するために使用される。

ＦＫＢＰタンパク質由来の薬物応答性ドメイン（アミノ酸及び核酸の配列）の非限定的なリストは、表４に列挙される。表４に列挙される変異アミノ酸の位置は、配列番号３７のＦＫＢＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ： Ｐ６２９４２）（表４では「ＷＴ」と呼ばれる）を基準にしている。表４において、「ｄｅｌ」は、変異が野生型配列と比較してその位置でのアミノ酸の欠失であることを意味する。表４において、親ＦＫＢＰ配列のアミノ酸１～１０８を含むＦＫＢＰ由来の薬物応答性ドメインは、例えば、ＦＫＢＰ（Ｆ３７Ｖ）のように括弧内の変異の識別を伴うＦＫＢＰとして示されている。

表４：ＦＫＢＰ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）

一実施形態では、ＳＲＥは、ＦＫＢＰＤＤ－１、ＦＫＢＰＤＤ－２、ＦＫＢＰＤＤ－３、ＦＫＢＰＤＤ－４、ＦＫＢＰＤＤ－５、ＦＫＢＰＤＤ－６、及びＦＫＢＰＤＤ－７などであるがこれらに限定されない、少なくとも１つのＦＫＢＰ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）を含み得る。

７．ヒトホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ）由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）
一実施形態では、ＳＲＥは、ヒトホスホジエステラーゼ１Ａ（ｈＰＤＥ１Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ１Ｂ（ｈＰＤＥ１Ｂ）、ヒトホスホジエステラーゼ１Ｃ（ｈＰＤＥ１Ｃ）、ヒトホスホジエステラーゼ１Ｄ（ｈＰＤＥ１Ｄ）、ヒトホスホジエステラーゼ２Ａ（ｈＰＤＥ２Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ３Ａ（ｈＰＤＥ３Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ３Ｂ（ｈＰＤＥ３Ｂ）、ヒトホスホジエステラーゼ４Ａ（ｈＰＤＥ４Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ４Ｂ（ｈＰＤＥ４Ｂ）、ヒトホスホジエステラーゼ４Ｃ（ｈＰＤＥ４Ｃ）、ヒトホスホジエステラーゼ４Ｄ（ｈＰＤＥ４Ｄ）、ヒトホスホジエステラーゼ６Ａ（ｈＰＤＥ６Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ６Ｂ（ｈＰＤＥ６Ｂ）、ヒトホスホジエステラーゼ６Ｃ（ｈＰＤＥ６Ｃ）、ヒトホスホジエステラーゼ７Ａ（ｈＰＤＥ７Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ７Ｂ（ｈＰＤＥ７Ｂ）、ヒトホスホジエステラーゼ８Ａ（ｈＰＤＥ８Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ８Ｂ（ｈＰＤＥ８Ｂ）、ヒトホスホジエステラーゼ９Ａ（ｈＰＤＥ９Ａ）、ヒトホスホジエステラーゼ１０Ａ（ｈＰＤＥ１０Ａ）、及びヒトホスホジエステラーゼ１１Ａ（ｈＰＤＥ１１Ａ）、またはそれらの断片もしくはバリアントなどであるがこれらに限定されないヒトホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ）タンパク質に由来する少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）を含み得る。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ１Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ１Ｂに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ１Ｃに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ１Ｄに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ２Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ３Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ３Ｂに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ４Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ４Ｂに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ４Ｃに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ４Ｄに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ６Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ６Ｂに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ６Ｃに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ７Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ７Ｂに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ８Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ８Ｂに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ９Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ１０Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。非限定的な例として、ＳＲＥは、ｈＰＤＥ１１Ａに由来する少なくとも１つのＤＤを含む。

一実施形態では、ＳＲＥは、ｈＰＤＥタンパク質の領域を含む。ｈＰＤＥタンパク質の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、または４５０を超えるアミノ酸長であってよい。親タンパク質の領域は、５～５０、２５～７５、５０～１００、７５～１２５、１００～１５０、１２５～１７５、１５０～２００、１７５～２２５、２００～２５０、２２５～２７５、２５０～３００、２７５～３２５、３００～３５０、３２５～３７５、３５０～４００、３７５～４２５、または４００～４５０のアミノ酸長であってよい。

一実施形態では、ＤＲＤは、ＰＤＥタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。

一実施形態では、ＤＲＤは、ＰＤＥ５タンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。変異の非限定的な例としては、Ｅ５３５Ｄ、Ｅ５３６Ｇ、Ｑ５４１Ｒ、Ｓ５４２Ｌ、Ｖ５４８Ｍ、Ｐ５４９Ｓ、Ｓ５５０Ｆ、Ｌ５５４Ｒ、Ｋ５５５Ｒ、Ｉ５５６Ｓ、Ｆ５５９Ｌ、Ｓ５６０Ｇ、Ｆ５６１Ｌ、Ｓ５６２Ｇ、Ｆ５６４Ｌ、Ｆ５６４Ｓ、Ｆ５６４Ｉ、Ｌ５６９Ｍ、Ｔ５７１Ｓ、Ｔ５７１Ｉ、Ｌ５７３Ｍ、Ｃ５７４Ｙ、Ｖ５８５Ａ、Ｖ５８５Ｍ、Ｎ５８７Ｓ、Ｑ５８６Ｌ、Ｑ５８６Ｐ、Ｑ５８９Ｅ、Ｋ５９１Ｅ、Ｈ５９２Ｒ、Ｖ５９４Ｉ、Ｉ５９９Ｖ、Ｋ６０４Ｒ、Ｋ６０４Ｅ、Ｎ６０５Ｄ、Ｎ６０５Ｙ、Ｒ６０７Ｗ、Ｒ６０７Ｑ、Ｋ６０８Ｅ、Ｎ６０９Ｈ、Ｎ６０９Ｙ、Ａ６１１Ｔ、Ｙ６１２Ｆ、Ｙ６１２Ｗ、Ｙ６１２Ａ、Ｈ６１３Ｌ、Ｈ６１３Ｒ、Ｗ６１５Ｒ、Ｈ６１７Ｌ、Ｎ６２０Ｓ、Ｍ６２５Ｉ、Ｋ６３０Ｒ、Ｋ６３３Ｅ、Ｎ６３６Ｓ、Ｉ６４８Ｖ、Ｈ６５３Ａ、Ｄ６５６Ｌ、Ｒ６５８Ｈ、Ｇ６５９Ａ、Ｎ６６１Ｓ、Ｎ６６２Ｙ、Ｓ６６３Ｙ、Ｓ６６３Ｐ、Ｑ６６６Ｈ、Ｌ６７５Ｐ、Ｙ６７６Ｄ、Ｙ６７６Ｎ、Ｃ６７７Ｒ、Ｈ６７８Ｒ、Ｉ６８０Ｓ、Ｅ６８２Ａ、Ｄ６８７Ａ、Ｈ６８５Ｌ、Ｍ６９１Ｉ、Ｌ６９３Ｐ、Ｉ７００Ｆ、Ｉ７０６Ｎ、Ｅ７０８Ｖ、Ｙ７０９Ｈ、Ｋ７１０Ｎ、Ｔ７１１Ａ、Ｔ７１２Ｓ、Ｔ７１２Ｍ、Ｉ７１５Ｋ、Ａ７２２Ｖ、Ｔ７２３Ｓ、Ｔ７２３Ｒ、Ｄ７２４Ｙ、Ｄ７２４Ａ、Ｄ７２４Ｎ、Ｄ７２４Ｇ、Ｌ７２７Ｐ、Ｙ７２８Ｌ、Ｋ７３０Ｅ、Ｒ７３２Ｌ、Ｒ７３２Ｇ、Ｒ７３２Ａ、Ｒ７３２Ｖ、Ｒ７３２Ｉ、Ｒ７３２Ｐ、Ｒ７３２Ｆ、Ｒ７３２Ｗ、Ｒ７３２Ｙ、Ｒ７３２Ｈ、Ｒ７３２Ｓ、Ｒ７３２Ｔ、Ｒ７３２Ｄ、Ｒ７３２Ｅ、Ｒ７３２Ｑ、Ｒ７３２Ｎ、Ｒ７３２Ｍ、Ｒ７３２Ｃ、Ｒ７３２Ｋ、Ｆ７３５Ｌ、Ｆ７３６Ａ、Ｆ７３６Ｇ、Ｆ７３６Ｌ、Ｆ７３６Ｍ、Ｆ７３６Ｒ、Ｆ７３６Ｗ、Ｆ７３６Ｋ、Ｆ７３６Ｑ、Ｆ７３６Ｅ、Ｆ７３６Ｓ、Ｆ７３６Ｐ、Ｆ７３６Ｖ、Ｆ７３６Ｃ、Ｆ７３６Ｙ、Ｆ７３６Ｈ、Ｆ７３６Ｉ、Ｆ７３６Ｎ、Ｆ７３６Ｄ、Ｆ７３６Ｔ、Ｌ７３８Ｈ、Ｎ７４２Ｓ、Ｑ７４３Ｌ、Ｆ７４４Ｌ、Ｌ７４６Ｓ、Ｆ７５５Ｌ、Ｆ７５５Ｙ、Ｍ７５８Ｉ、Ｍ７６０Ｉ、Ａ７６２Ｔ、Ａ７６２Ｓ、Ｄ７６４Ｎ、Ｄ７６４Ｇ、Ｄ７６４Ｖ、Ｄ７６４Ａ、Ｓ７６６Ｆ、Ａ７６７Ｅ、Ｉ７６８Ｎ、Ｋ７７０Ｑ、Ｗ７７２Ｃ、Ａ７７９Ｔ、Ｌ７８１Ｐ、Ｔ７８４Ｉ、Ｆ７８７Ｖ、Ｆ７８７Ａ、Ｋ７９５Ｅ、Ｅ７９５Ｒ、Ｋ７９５Ｎ、Ｅ７９６Ｇ、Ｅ７９６Ｄ、Ｌ７９７Ｆ、Ｉ７９９Ｌ、Ｉ７９９Ｔ、Ｔ８０２Ｐ、Ｄ８０３Ｎ、Ｌ８０４Ｐ、Ｅ８０８Ｇ、Ｓ８１５Ｃ、Ｍ８１６Ａ、Ｍ８１６Ｔ、Ｆ８２０Ｉ、Ｉ８２１Ａ、Ａ８２３Ｔ、Ｉ８２４Ｔ、Ｙ８２９Ａ、Ｔ８３３Ｓ、Ｃ８３９Ｓ、Ｆ８４０Ｓ、Ｒ８４７Ｇ、Ｒ８４７Ｔ、Ｋ８４８Ｎ、Ｋ８５２Ｅ、Ｗ８５３Ｆ、Ｅ８５８Ｖ、及びＱ８５９Ｒが挙げられる。

一実施形態では、ＤＲＤは、ＰＤＥ５タンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。本明細書に列挙される変異のいずれも、ＤＤに含まれ得る。二重変異の非限定的な例としては、Ｙ６１２Ａ、Ｒ７３２Ｌ；Ｙ６１２Ｆ、Ｒ７３２Ｌ；Ｙ６１２Ｗ、Ｒ７３２Ｌ；Ｙ７０９Ｈ、Ｆ７８７Ｖ；Ｙ７２８Ｌ、Ｄ７６４Ｎ；Ｌ５６９Ｍ、Ｔ８３３Ｓ；Ｄ７２４Ａ、Ｒ７３２Ｌ；Ｄ７２４Ｇ、Ｄ７６４Ｇ；Ｄ７２４Ｇ、Ｋ８４８Ｎ；Ｅ６８２Ａ、Ｒ７３２Ｌ；Ｆ７３６Ａ、Ｄ７６４Ｎ；Ｇ６５９Ａ、Ｔ７８４Ｉ；Ｈ６１７Ｌ、Ａ７２２Ｖ；Ｈ６５３Ａ、Ｒ７３２Ｌ；Ｉ５５６Ｓ、Ｅ７９６Ｄ；Ｉ７００Ｆ、Ｅ７９６Ｇ；Ｋ７７０Ｑ、Ｋ８４８Ｎ；Ｌ５７３Ｍ、Ｆ７３５Ｌ；Ｎ６０５Ｙ、Ｉ７１５Ｋ；Ｎ６０９Ｙ、Ｉ７９９Ｌ；Ｒ７３２Ｌ、Ｄ７６４Ａ；Ｒ７３２Ｌ、Ｄ７６４Ｎ；Ｒ７３２Ｌ、Ｆ７３６Ａ；Ｓ５５０Ｆ、Ｌ５５４Ｒ；Ｖ５４８Ｍ、Ｄ８０３Ｎ；Ｖ５４８Ｍ、Ｆ８２０Ｉが挙げられる。三重変異の非限定的な例としては、Ａ７２２Ｖ、Ｆ７５５Ｌ、Ｍ７６０Ｉ；Ｆ５６１Ｌ、Ｇ６５９Ａ、Ｔ７８４Ｉ；Ｈ６１３Ｌ、Ｄ７２４Ｙ、Ｆ７５５Ｙ；Ｌ５５４Ｒ、Ｑ５８９Ｅ、Ａ８２３Ｔ；Ｌ５５４Ｒ、Ｑ５８９Ｅ、Ｍ６９１Ｉ；Ｓ５４２Ｌ、Ｅ７０８Ｖ、Ｗ７７２Ｃ；Ｓ５６２Ｇ、Ｌ７２７Ｐ、Ｒ８４７Ｔ；Ｔ５７１Ｓ、Ｖ５８５Ｍ、Ｔ７２３Ｓ；Ｔ７１２Ｍ、Ｍ７５８Ｉ、Ｑ８５９Ｒが挙げられる。４つの変異の非限定的な例としては、Ｌ５５４Ｒ、Ｑ５８６Ｐ、Ｋ７１０Ｎ、Ｋ７３０Ｅ；Ｑ５８６Ｌ、Ｓ６６３Ｙ、Ａ７６２Ｔ、Ｅ８０８Ｇ；Ｔ５７１Ｉ、Ｋ６０４Ｒ、Ｉ７０６Ｎ、Ｅ７９５Ｒ；Ｗ６１５Ｒ、Ｔ７２３Ｒ、Ａ７６２Ｔ、Ｅ８０８Ｇが挙げられる。５つの変異の非限定的な例としては、Ｆ５６４Ｉ、Ｎ６６２Ｙ、Ｈ６８５Ｌ、Ｌ６９３Ｐ、Ｆ７３６Ｉ；Ｐ５４９Ｓ、Ｆ５６４Ｉ、Ｒ６５８Ｈ、Ａ７７９Ｔ、Ｒ８４７Ｇが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＰＤＥ５に由来するＤＲＤは、親ＰＤＥ５配列のアミノ酸２～８７５を含み得る。これは、本明細書ではＭ１ｄｅｌ変異と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、ＤＲＤは、ＰＤＥ５タンパク質の領域に由来する。非限定的な例として、この領域は、ｈＰＤＥ５のアミノ酸５３５～８６０（配列番号４３）である。非限定的な例として、この領域は、ｈＰＤＥ５のアミノ酸５３５～８３０（配列番号４４）である。非限定的な例として、この領域は、ｈＰＤＥ５のアミノ酸５３５～８３６（配列番号４５）である。非限定的な例として、この領域は、ｈＰＤＥ５のアミノ酸５６７～８６０（配列番号４６）である。非限定的な例として、この領域は、ｈＰＤＥ５のアミノ酸５９０～８３６（配列番号４７）である。非限定的な例として、この領域は、ｈＰＤＥ５のアミノ酸５９０～８６０（配列番号４８）である。

一実施形態では、刺激は、ＳＲＥに結合して翻訳後タンパク質レベルを制御する小分子である。一態様では、ＰＤＥ５リガンドであるシルデナフィル、バルデナフィル、またはタダラフィルは、ＰＤＥ５変異体を安定化するために使用される。

ＰＤＥ５由来の薬物応答性ドメイン（アミノ酸及び核酸の配列）の非限定的なリストを表５に列挙する。表５に列挙される変異アミノ酸の位置は、配列番号１のＰＤＥ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｏ７６０７４）を基準にしている。表５において、「ｄｅｌ」は、変異が野生型配列と比較してその位置でのアミノ酸の欠失であることを意味する。

表５：ＰＤＥ５由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）

一実施形態では、ＳＲＥは、ＰＤＥ５ＤＤ－１、ＰＤＥ５ＤＤ－２、ＰＤＥ５ＤＤ－３、ＰＤＥ５ＤＤ－４、ＰＤＥ５ＤＤ－５、ＰＤＥ５ＤＤ－６、ＰＤＥ５ＤＤ－７、ＰＤＥ５ＤＤ－８、ＰＤＥ５ＤＤ－９、ＰＤＥ５ＤＤ－１０、ＰＤＥ５ＤＤ－１１、ＰＤＥ５ＤＤ－１２、ＰＤＥ５ＤＤ－１３、ＰＤＥ５ＤＤ－１４、ＰＤＥ５ＤＤ－１５、ＰＤＥ５ＤＤ－１６、ＰＤＥ５ＤＤ－１７、ＰＤＥ５ＤＤ－１８、ＰＤＥ５ＤＤ－１９、ＰＤＥ５ＤＤ－２０、ＰＤＥ５ＤＤ－２１、ＰＤＥ５ＤＤ－２２、ＰＤＥ５ＤＤ－２３、ＰＤＥ５ＤＤ－２４、ＰＤＥ５ＤＤ－２５、ＰＤＥ５ＤＤ－２６、ＰＤＥ５ＤＤ－２７、ＰＤＥ５ＤＤ－２８、ＰＤＥ５ＤＤ－２９、ＰＤＥ５ＤＤ－３０、ＰＤＥ５ＤＤ－３１、ＰＤＥ５ＤＤ－３２、ＰＤＥ５ＤＤ－３３、ＰＤＥ５ＤＤ－３４、ＰＤＥ５ＤＤ－３５、ＰＤＥ５ＤＤ－３６、ＰＤＥ５ＤＤ－３７、ＰＤＥ５ＤＤ－３８、ＰＤＥ５ＤＤ－３９、ＰＤＥ５ＤＤ－４０、ＰＤＥ５ＤＤ－４１、ＰＤＥ５ＤＤ－４２、ＰＤＥ５ＤＤ－４３、ＰＤＥ５ＤＤ－４４、ＰＤＥ５ＤＤ－４５、ＰＤＥ５ＤＤ－４６、ＰＤＥ５ＤＤ－４７、ＰＤＥ５ＤＤ－４８、ＰＤＥ５ＤＤ－４９、ＰＤＥ５ＤＤ－５０、ＰＤＥ５ＤＤ－５１、ＰＤＥ５ＤＤ－５２、ＰＤＥ５ＤＤ－５３、ＰＤＥ５ＤＤ－５４、ＰＤＥ５ＤＤ－５５、ＰＤＥ５ＤＤ－５６、ＰＤＥ５ＤＤ－５７、ＰＤＥ５ＤＤ－５８、ＰＤＥ５ＤＤ－５９、ＰＤＥ５ＤＤ－６０、ＰＤＥ５ＤＤ－６１、ＰＤＥ５ＤＤ－６２、ＰＤＥ５ＤＤ－６３、ＰＤＥ５ＤＤ－６４、ＰＤＥ５ＤＤ－６５、ＰＤＥ５ＤＤ－６６、ＰＤＥ５ＤＤ－６７、ＰＤＥ５ＤＤ－６８、ＰＤＥ５ＤＤ－６９、ＰＤＥ５ＤＤ－７０、ＰＤＥ５ＤＤ－７１、ＰＤＥ５ＤＤ－７２、ＰＤＥ５ＤＤ－７３、ＰＤＥ５ＤＤ－７４、ＰＤＥ５ＤＤ－７５、ＰＤＥ５ＤＤ－７６、ＰＤＥ５ＤＤ－７７、ＰＤＥ５ＤＤ－７８、ＰＤＥ５ＤＤ－７９、ＰＤＥ５ＤＤ－８０、ＰＤＥ５ＤＤ－８１、ＰＤＥ５ＤＤ－８２、ＰＤＥ５ＤＤ－８３、ＰＤＥ５ＤＤ－８４、ＰＤＥ５ＤＤ－８５、ＰＤＥ５ＤＤ－８６、ＰＤＥ５ＤＤ－８７、ＰＤＥ５ＤＤ－８８、ＰＤＥ５ＤＤ－８９、ＰＤＥ５ＤＤ－９０、ＰＤＥ５ＤＤ－９１、ＰＤＥ５ＤＤ－９２、ＰＤＥ５ＤＤ－９３、ＰＤＥ５ＤＤ－９４、ＰＤＥ５ＤＤ－９５、ＰＤＥ５ＤＤ－９６、ＰＤＥ５ＤＤ－９７、ＰＤＥ５ＤＤ－９８、ＰＤＥ５ＤＤ－９９、ＰＤＥ５ＤＤ－１００、ＰＤＥ５ＤＤ－１０１、ＰＤＥ５ＤＤ－１０２、ＰＤＥ５ＤＤ－１０３、ＰＤＥ５ＤＤ－１０４、ＰＤＥ５ＤＤ－１０５、ＰＤＥ５ＤＤ－１０６、ＰＤＥ５ＤＤ－１０７、ＰＤＥ５ＤＤ－１０８、ＰＤＥ５ＤＤ－１０９、ＰＤＥ５ＤＤ－１１０、ＰＤＥ５ＤＤ－１１１、ＰＤＥ５ＤＤ－１１２、ＰＤＥ５ＤＤ－１１３、ＰＤＥ５ＤＤ－１１４、ＰＤＥ５ＤＤ－１１５、ＰＤＥ５ＤＤ－１１６、ＰＤＥ５ＤＤ－１１７、ＰＤＥ５ＤＤ－１１８、ＰＤＥ５ＤＤ－１１９、ＰＤＥ５ＤＤ－１２０、ＰＤＥ５ＤＤ－１２１、ＰＤＥ５ＤＤ－１２２、ＰＤＥ５ＤＤ－１２３、ＰＤＥ５ＤＤ－１２４、ＰＤＥ５ＤＤ－１２５、ＰＤＥ５ＤＤ－１２６、ＰＤＥ５ＤＤ－１２７、ＰＤＥ５ＤＤ－１２８、ＰＤＥ５ＤＤ－１２９、ＰＤＥ５ＤＤ－１３０、ＰＤＥ５ＤＤ－１３１、ＰＤＥ５ＤＤ－１３２、ＰＤＥ５ＤＤ－１３３、ＰＤＥ５ＤＤ－１３４、ＰＤＥ５ＤＤ－１３５、ＰＤＥ５ＤＤ－１３６、ＰＤＥ５ＤＤ－１３７、ＰＤＥ５ＤＤ－１３８、ＰＤＥ５ＤＤ－１３９、ＰＤＥ５ＤＤ－１４０、ＰＤＥ５ＤＤ－１４１、ＰＤＥ５ＤＤ－１４２、ＰＤＥ５ＤＤ－１４３、ＰＤＥ５ＤＤ－１４４、ＰＤＥ５ＤＤ－１４５、ＰＤＥ５ＤＤ－１４６、ＰＤＥ５ＤＤ－１４７、ＰＤＥ５ＤＤ－１４８、ＰＤＥ５ＤＤ－１４９、ＰＤＥ５ＤＤ－１５０、ＰＤＥ５ＤＤ－１５１、ＰＤＥ５ＤＤ－１５２、ＰＤＥ５ＤＤ－１５３、ＰＤＥ５ＤＤ－１５４、ＰＤＥ５ＤＤ－１５５、ＰＤＥ５ＤＤ－１５６、ＰＤＥ５ＤＤ－１５７、ＰＤＥ５ＤＤ－１５８、ＰＤＥ５ＤＤ－１５９、ＰＤＥ５ＤＤ－１６０、ＰＤＥ５ＤＤ－１６１、ＰＤＥ５ＤＤ－１６２、ＰＤＥ５ＤＤ－１６３、ＰＤＥ５ＤＤ－１６４、ＰＤＥ５ＤＤ－１６５、ＰＤＥ５ＤＤ－１６６、ＰＤＥ５ＤＤ－１６７、ＰＤＥ５ＤＤ－１６８、ＰＤＥ５ＤＤ－１６９、ＰＤＥ５ＤＤ－１７０、ＰＤＥ５ＤＤ－１７１、ＰＤＥ５ＤＤ－１７２、ＰＤＥ５ＤＤ－１７３、ＰＤＥ５ＤＤ－１７４、ＰＤＥ５ＤＤ－１７５、ＰＤＥ５ＤＤ－１７６、ＰＤＥ５ＤＤ－１７７、ＰＤＥ５ＤＤ－１７８、ＰＤＥ５ＤＤ－１７９、ＰＤＥ５ＤＤ－１８０、ＰＤＥ５ＤＤ－１８１、ＰＤＥ５ＤＤ－１８２、ＰＤＥ５ＤＤ－１８３、ＰＤＥ５ＤＤ－１８４、ＰＤＥ５ＤＤ－１８５、ＰＤＥ５ＤＤ－１８６、ＰＤＥ５ＤＤ－１８７、ＰＤＥ５ＤＤ－１８８、ＰＤＥ５ＤＤ－１８９、ＰＤＥ５ＤＤ－１９０、ＰＤＥ５ＤＤ－１９１、ＰＤＥ５ＤＤ－１９２、ＰＤＥ５ＤＤ－１９３、ＰＤＥ５ＤＤ－１９４、ＰＤＥ５ＤＤ－１９５、ＰＤＥ５ＤＤ－１９６、ＰＤＥ５ＤＤ－１９７、ＰＤＥ５ＤＤ－１９８、ＰＤＥ５ＤＤ－１９９、ＰＤＥ５ＤＤ－２００、ＰＤＥ５ＤＤ－２０１、ＰＤＥ５ＤＤ－２０２、ＰＤＥ５ＤＤ－２０３、ＰＤＥ５ＤＤ－２０４、ＰＤＥ５ＤＤ－２０５、ＰＤＥ５ＤＤ－２０６、ＰＤＥ５ＤＤ－２０７、ＰＤＥ５ＤＤ－２０８、ＰＤＥ５ＤＤ－２０９、ＰＤＥ５ＤＤ－２１０、ＰＤＥ５ＤＤ－２１１、ＰＤＥ５ＤＤ－２１２、ＰＤＥ５ＤＤ－２１３、ＰＤＥ５ＤＤ－２１４、ＰＤＥ５ＤＤ－２１５、ＰＤＥ５ＤＤ－２１６、ＰＤＥ５ＤＤ－２１７、ＰＤＥ５ＤＤ－２１８、ＰＤＥ５ＤＤ－２１９、ＰＤＥ５ＤＤ－２２０、ＰＤＥ５ＤＤ－２２１、ＰＤＥ５ＤＤ－２２２、ＰＤＥ５ＤＤ－２２３、ＰＤＥ５ＤＤ－２２４、ＰＤＥ５ＤＤ－２２５、ＰＤＥ５ＤＤ－２２６、ＰＤＥ５ＤＤ－２２７、ＰＤＥ５ＤＤ－２２８、ＰＤＥ５ＤＤ－２２９、ＰＤＥ５ＤＤ－２３０、ＰＤＥ５ＤＤ－２３１、ＰＤＥ５ＤＤ－２３２、ＰＤＥ５ＤＤ－２３３、ＰＤＥ５ＤＤ－２３４、ＰＤＥ５ＤＤ－２３５、ＰＤＥ５ＤＤ－２３６、ＰＤＥ５ＤＤ－２３７、ＰＤＥ５ＤＤ－２３８、ＰＤＥ５ＤＤ－２３９、ＰＤＥ５ＤＤ－２４０、ＰＤＥ５ＤＤ－２４１、ＰＤＥ５ＤＤ－２４２、ＰＤＥ５ＤＤ－２４３、ＰＤＥ５ＤＤ－２４４、ＰＤＥ５ＤＤ－２４５、ＰＤＥ５ＤＤ－２４６、ＰＤＥ５ＤＤ－２４７、ＰＤＥ５ＤＤ－２４８、及びＰＤＥ５ＤＤ－２４９などであるが、これらに限定されない、少なくとも１つのＰＤＥ５由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）を含み得る。

８．ＰＰＡＲガンマ（ＰＰＡＲｇ）由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）
一実施形態では、ＳＲＥは、ＰＰＡＲガンマ（ＰＰＡＲｇ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＤ）を含み得る。

一実施形態では、ＳＲＥは、ＰＰＡＲｇタンパク質の領域を含む。ＰＰＡＲｇタンパク質の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、または４５０を超えるアミノ酸長であってよい。親タンパク質の領域は、５～５０、２５～７５、５０～１００、７５～１２５、１００～１５０、１２５～１７５、１５０～２００、１７５～２２５、２００～２５０、２２５～２７５、２５０～３００、２７５～３２５、３００～３５０、３２５～３７５、３５０～４００、３７５～４２５、または４００～４５０のアミノ酸長であってよい。

９．エストロゲン受容体（ＥＲ）由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）
一実施形態では、ＳＲＥは、エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質またはその断片もしくはバリアントに由来する少なくとも１つの薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）を含み得る。

一実施形態では、ＳＲＥは、ＥＲタンパク質の領域を含む。ＥＲタンパク質の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、または４５０を超えるアミノ酸長であってよい。親タンパク質の領域は、５～５０、２５～７５、５０～１００、７５～１２５、１００～１５０、１２５～１７５、１５０～２００、１７５～２２５、２００～２５０、２２５～２７５、２５０～３００、２７５～３２５、３００～３５０、３２５～３７５、３５０～４００、３７５～４２５、または４００～４５０のアミノ酸長であってよい。

一実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、少なくとも１つの変異を含み得る。変異の非限定的な例としては、Ｋ３０３Ｒ、Ｎ３０４Ｓ、Ｔ３７１Ａ、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｎ５１９Ｓ、Ｇ５２１Ｇ、Ｙ５３７Ｓが挙げられる。

一実施形態では、ＤＲＤは、ＥＲタンパク質に由来し得、１つを超える変異を含み得る。本明細書に列挙される変異のいずれも、ＤＲＤに含まれ得る。４つの変異の非限定的な例としては、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓが挙げられる。６つの変異の非限定的な例としては、Ｔ３７１Ａ、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｎ５１９Ｓ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓが挙げられる。８つの変異の非限定的な例としては、Ｋ３０３Ｒ、Ｎ３０４Ｓ、Ｔ３７１Ａ、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｎ５１９Ｓ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＥＲに由来するＤＲＤは、親ＥＲ配列のアミノ酸２～５９５を含み得る。これは、本明細書ではＭ１ｄｅｌ変異と呼ばれる。

一実施形態では、刺激は、ＳＲＥに結合して翻訳後タンパク質レベルを制御する小分子である。

いくつかの実施形態では、ＥＲに由来するＤＲＤは、親ＥＲ配列のアミノ酸２～８７５を含み得る。これは、本明細書ではＭ１ｄｅｌ変異と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、ＤＤは、ＥＲタンパク質の領域に由来する。非限定的な例として、この領域は、ＥＲのアミノ酸３０５～５４９（配列番号７６）である。

ＥＲ薬物応答性ドメイン（アミノ酸及び核酸の配列）の非限定的なリストを表６に列挙する。表６に列挙されている変異アミノ酸の位置は、配列番号４２のＥＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０３３７２．２）を基準にしている。表６において、「ｄｅｌ」は、変異が野生型配列と比較してその位置でのアミノ酸の欠失であることを意味する。

表６： ＥＲ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＤ）

一実施形態では、ＳＲＥは、ＥＲＤＤ－１、ＥＲＤＤ－２、ＥＲＤＤ－３、ＥＲＤＤ－６、ＥＲＤＤ－７、ＥＲＤＤ－８、ＥＲＤＤ－９、ＥＲＤＤ－１０、ＥＲＤＤ－１１、ＥＲＤＤ－１２、ＥＲＤＤ－１３、ＥＲＤＤ－１４、ＥＲＤＤ－１５、ＥＲＤＤ－１６、ＥＲＤＤ－１７、ＥＲＤＤ－１８、ＥＲＤＤ－１９、ＥＲＤＤ－２０、ＥＲＤＤ－２１、ＥＲＤＤ－２２、ＥＲＤＤ－２３、ＥＲＤＤ－２４、ＥＲＤＤ－２５、ＥＲＤＤ－２６、ＥＲＤＤ－２７、ＥＲＤＤ－２８、ＥＲＤＤ－２９、ＥＲＤＤ－３０、ＥＲＤＤ－３１、ＥＲＤＤ－３２、ＥＲＤＤ－３３、ＥＲＤＤ－３４、ＥＲＤＤ－３５、ＥＲＤＤ－３６、ＥＲＤＤ－３７、ＥＲＤＤ－３８、ＥＲＤＤ－３９、ＥＲＤＤ－４０、ＥＲＤＤ－４１、ＥＲＤＤ－４２、ＥＲＤＤ－４３、ＥＲＤＤ－４４、ＥＲＤＤ－４５、ＥＲＤＤ－４６、ＥＲＤＤ－４７、及びＥＲＤＤ－４８などであるがこれらに限定されない、少なくとも１つのＥＲ由来の薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）を含み得る。

いくつかの実施形態では、ＥＲＤＤは、Ｎ４１３Ｔ、Ｎ４１３Ｈ、Ｎ４１３Ａ、Ｎ４１３Ｑ、Ｎ４１３Ｖ、Ｎ４１３Ｃ、Ｎ４１３Ｋ、Ｎ４１３Ｍ、Ｎ４１３Ｒ、Ｎ４１３Ｓ、Ｎ４１３Ｗ、Ｎ４１３Ｉ、Ｎ４１３Ｅ、Ｎ４１３Ｌ、Ｎ４１３Ｐ、Ｎ４１３Ｆ、Ｎ４１３Ｙ、Ｎ４１３Ｇ Ｑ５０２Ｄ、Ｑ５０２Ｈ、Ｑ５０２Ｅ、Ｑ５０２Ｖ、Ｑ５０２Ａ、Ｑ５０２Ｔ、Ｑ５０２Ｎ、Ｑ５０２Ｋ、Ｑ５０２Ｓ、Ｑ５０２Ｌ、Ｑ５０２Ｙ、Ｑ５０２Ｗ、Ｑ５０２Ｆ、Ｑ５０２Ｉ、Ｑ５０２Ｇ、Ｑ５０２Ｐ、Ｑ５０２Ｍ、Ｑ５０２Ｃ、Ｌ３８４Ｍ、Ｍ４２１Ｇ、Ｇ５２１Ｒ、Ｙ５３７Ｓ、Ｋ３０３Ｒ、Ｎ３０４Ｓ、Ｓ３０５Ｎ、Ｒ３３５Ｇ、Ｔ３７１Ａ、Ｔ４３１Ｉ、Ｎ５１９Ｓ、Ｅ５２３Ｇ、Ａ５４６Ｔ、及びＧ４４２Ｖから選択されるがこれらに限定されない１つ以上の変異を含み得る。

本開示は、ＰＤＥ５などの親タンパク質の全体または一部に由来するＳＲＥと、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）またはその変異体を全体的または部分的に含む第１のペイロードとを有するエフェクターモジュールを含む組成物を提供する。一実施形態では、ＳＲＥは、ＰＤＥ５のアミノ酸５３５～８６０を含む。いくつかの実施形態では、ＳＲＥは、親タンパク質と比較して１つ以上の変異を含み得る。ＳＲＥは、配列番号２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０６、３０８、３１３、３１５、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７５、３７８、３８１、３８４、３８７、３８９、３９１、３９４、３９７、４００、４０３、４０６、４０９、４１２、４１５、４１７、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６４０６、６４０８、６４１０、６４１２、６４１４、６４１６、６４１８、６４２０、６４２２、６４２４、６４２６、６４２８、６４３０、６４３２、６４３４、６４３６、６４３８、６４４０、６４４２、６４４４、６４４６、６４４８、６４５０、６４５２、６４５４、６４５６、６４５８、６４６０、６４６２、６４６４、６４６６、６４６８、６４７０、６４７２、６４７４、６４７６、６４７８、６４８０、６４８２、６４８４、６４８６、６４８８、６４９０、６４９２、６４９４、６４９６、６４９８、６５００、６５０２、６５０４、６５０６、６５０８、６５１０、６５１２、６５１４、６５１６、６５１８、６５２０、６５２２、６５２４、６５２６、６５２８、または６５３０を含み得るが、これらに限定されない。

一実施形態では、ＳＲＥは変異Ｒ７３２Ｌを含み、ＳＲＥは配列番号３０８のアミノ酸配列を含み得る。

本明細書に記載のＳＲＥは、少なくとも１つの刺激に応答するか、またはそれと相互作用し得る。一態様では、刺激は、バルデナフィル、タダラフィル、またはシルデナフィルなどであるがこれらに限定されない小分子であり得る。一態様では、小分子はバルデナフィルである。

いくつかの態様では、エフェクターモジュールはリンカーを含んでもよい。そのようなリンカーは、ＳＲＥを第１のペイロードに作動可能に連結することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン及びセリン含有リンカー、または当該技術分野で、例えば、以下の刊行物のいずれか１つ以上のものであり得る：ＷＯ２０１８／１６１０００；ＷＯ２０１８／２３１７５９；ＷＯ２０１９／２４１３１５；ＷＯ２０１８／１６０９９３；ＷＯ２０１８／２３７３２３；及びＷＯ２０１８／１６１０３８。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号６５３２のアミノ酸配列を含む。

一実施形態では、エフェクターモジュールは、配列番号６５３４であり得る。

本明細書に提供されるのはまた、本明細書に記載の組成物をコードするポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドをコードするベクターである。本開示はまた、本明細書に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、本明細書に記載の組成物を発現する免疫細胞と、を含む医薬組成物を提供する。

また、本明細書では、対象における腫瘍量を低減する方法が提供される。この方法は、治療有効量の免疫細胞を対象に投与するステップを含み得る。免疫細胞は、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含む組成物を含み得るか、または発現し得る。第１のペイロードは、全体的または部分的に、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）またはその変異体を含み得る。免疫細胞はまた、本明細書に記載の組成物を含む医薬組成物を発現し得る。この方法はまた、治療有効量の刺激を対象に投与することを含む。一実施形態では、刺激はリガンドである。リガンドは、腫瘍量を低減するために第１のペイロードの発現を調節することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、バルデナフィル、タダラフィル、シルデナフィル、シールド－１、またはトリメトプリムである。

本開示はまた、対象において樹状細胞を活性化するための方法を提供する。この方法は、治療有効量の免疫細胞を対象に投与するステップを含み得る。免疫細胞は、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含む組成物を含み得るか、または発現し得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。第１のペイロードは、全体的または部分的に、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）またはその変異体を含み得る。免疫細胞はまた、本明細書に記載の組成物を含む医薬組成物を発現し得る。この方法はまた、治療有効量の刺激を対象に投与することを含む。一実施形態では、刺激はリガンドである。この方法はさらに、樹状細胞の活性化を決定するために、リガンドに応答して対象の樹状細胞活性化マーカーＩＬ１２を測定することを含み得る。一実施形態では、樹状細胞は、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１４＋樹状細胞、ランゲルハンス細胞、またはミクログリアであり得る。一態様では、樹状細胞は骨髄性樹状細胞である。

本明細書に記載の組成物は、ＣＡＲをさらに含み得る。ＣＡＲは、（ａ）細胞外標的部分と、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、（ｄ）任意選択で、１つ以上の共刺激ドメインと、を含み得る。ＣＡＲの細胞外標的部分はｓｃＦｖであってよい。一実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ１９ ｓｃＦｖであってよい。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインが存在してもよい。

１０．調整可能なタンパク質発現システムの刺激
本開示の調整可能なタンパク質発現システムは、刺激に応答することができる。

いくつかの実施形態では、刺激はリガンドである。リガンドは、核酸ベース、タンパク質ベース、脂質ベース、有機、無機、または前述の任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、合成分子であってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、小分子治療化合物であってよい。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＦＤＡなどの規制当局によって以前に承認された小分子薬であってよい。

本開示に記載されるように、調整可能なタンパク質発現システムは、リガンド依存性活性を示すことができる。リガンドはＤＲＤに結合し、付加された、または作動可能に連結された目的のタンパク質を安定化することができる。候補ＤＲＤに結合することが知られているリガンドは、調整可能なタンパク質発現システムの活性に対するそれらの効果について試験することができる。

いくつかの実施形態では、リガンドは細胞透過性である。いくつかの実施形態では、リガンドは、細胞透過性を改善するために親油性であるように設計され得る。

いくつかの実施形態では、リガンドは、小分子である。小分子リガンドは、安全であり、適切な医薬動態及び分布を有することが臨床的に承認されていてもよい。

いくつかの実施形態では、リガンドは、別のリガンド、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、脂質誘導体、ステロール、ステロイド、代謝産物、代謝産物誘導体、または小分子などであるが、これらに限定されない、１つ以上の他の分子と複合体を形成し得るか、またはそれらに結合し得る。いくつかの実施形態では、リガンド刺激は、１つ以上の異なる種類及び／または多くの他の分子と複合体を形成するか、または結合する。いくつかの実施形態では、リガンド刺激は、同じ種類のリガンドの多量体である。いくつかの実施形態では、リガンド刺激多量体は、２、３、４、５、６、またはそれ以上の単量体を含む。

１１．ＤＨＦＲリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ジヒドロ葉酸レダクターゼに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ機能に結合して阻害し、本明細書では、ジヒドロ葉酸阻害剤と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、リガンドは、ヒトＤＨＦＲの選択的阻害剤であり得る。本開示のリガンドはまた、細菌及び寄生生物、例えば、ニューモシスティス属、トキソプラズマ属、トリパノソーマ属、マイコバクテリウム属、及びストレプトコッカス属のジヒドロ葉酸レダクターゼの選択的阻害剤であり得る。他のＤＨＦＲに特異的なリガンドは、ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼへの結合を改善するために改変することができる。

ジヒドロ葉酸阻害剤の例としては、トリメトプリム（ＴＭＰ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、プララトレキサート、ピリトレキサート、ピリメタミン、タロトレキシン、クロログアニド、ペンタミジン、トリメトレキサート、アミノプテリン、Ｃ１ ８９８三塩酸塩、ペメトレキセド二ナトリウム、ラルチトレキセド、スルファグアニジン、フォロチン、イクラプリム及びジアベリジンが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ヒトＤＨＦＲに結合し得るジヒドロ葉酸またはその誘導体のいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、２，４，ジアミノ複素環化合物であり得る。いくつかの実施形態では、ジヒドロ葉酸中の４－オキソ基は、ＤＨＦＲ阻害剤をもたらすように改変され得る。一例では、４－オキソ基を４－アミノ基で置き換えることができる。プテリジン、キナゾリン、ピリドピリミジン、ピリミジン、及びトリアジンを含む様々なジアミノ複素環もまた、ＤＨＦＲ阻害剤を開発するための足場として使用することができ、本開示に従って使用することができる。

いくつかの実施形態では、リガンドは、ＤＨＦＲへの結合を媒介することが知られているリガンドの部分を含むＴＭＰ由来のリガンドを含む。リガンドはまた、他の葉酸代謝酵素へのオフターゲット結合を減少させ、ＤＨＦＲへの特異的結合を増加させるように改変され得る。

１２．ＥＲリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ＥＲに結合する。リガンドは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＥＲ機能に結合して阻害し、本明細書では、ＥＲ阻害剤と呼ばれる。いくつかの実施形態では、リガンドは、ヒトＥＲの選択的阻害剤であり得る。本開示のリガンドはまた、他の種のＥＲの選択的阻害剤であり得る。他のＥＲに特異的なリガンドは、ヒトＥＲへの結合を改善するために改変することができる。

リガンドは、内因性エストロゲン１７ｂ－エストラジオール（Ｅ２）及び合成非ステロイド性エストロゲンジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などのＥＲアゴニストであってよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リガンドは、ＩＣＩ－１６４，３８４、ＲＵ４８６、タモキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）、フルベストラント、オレミフェン、ラソフォキシフェン、クロミフェン、フェマレル、及びオルメロキシフェン、及びラロキシフェン（ＲＡＬ）などのＥＲアンタゴニストであり得る。

いくつかの実施形態では、本開示の刺激は、バゼドキシフェン及び／またはラロキシフェンなどであるがこれらに限定されないＥＲアンタゴニストであり得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、ＥＲへの結合を媒介することが知られているリガンドの部分を含むバゼドキシフェン由来のリガンドを含む。リガンドはまた、他の葉酸代謝酵素へのオフターゲット結合を減少させ、ＥＲ由来のＤＲＤへの特異的結合を増加させるように改変され得る。

１３．ホスホジエステラーゼリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ホスホジエステラーゼに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、ホスホジエステラーゼ機能に結合して阻害し、本明細書では、ホスホジエステラーゼ阻害剤と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、リガンドは、ホスホジエステラーゼ５に結合する小分子である。一実施形態では、小分子は、ｈＰＤＥ５阻害剤である。ｈＰＤＥ５阻害剤の例としては、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンズアミドナフィル、ダサンタフィル、ベミナフィル、ＳＬｘ－２１０１、ＬＡＳ ３４１７９、ＵＫ－３４３，６６４、ＵＫ－３５７９０３、ＵＫ－３７１８００、及びＢＭＳ－３４１４００が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、リガンドは、ｈＰＤＥ５への結合を媒介することが知られているリガンドの部分を含むシルデナフィル由来のリガンドを含む。リガンドはまた、ホスホジエステラーゼへのオフターゲット結合を減少させ、ｈＰＤＥ５への特異的結合を増加させるように改変され得る。

いくつかの実施形態では、刺激は、１つを超えるホスホジエステラーゼに結合するリガンドであり得る。一実施形態では、刺激は、アミノフィリン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、ジピリダモール、テオフィリン、ザプリナスト、イカリイン、ＣＤＰ－８４０、エタゾレート、及びグラウシンなどの２つ以上のｈＰＤＥに結合し得る汎ホスホジエステラーゼ阻害剤である。

１４．ＦＫＢＰリガンド
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、ヒトＦＫＢＰを含むＦＫＢＰに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドはＳＬＦまたはシールド－１である。

１５．安定化と不安定化の比率
いくつかの実施形態では、本開示は、安定化比及び不安定化比を測定することによって、タンパク質、発現、機能、またはレベルを調節するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、安定化比は、ＳＲＥに対して特異的な刺激が存在しない場合の目的のタンパク質の発現、機能、またはレベルに対する、刺激に応答した目的のタンパク質の発現、機能、またはレベルの比率として定義され得る。いくつかの態様では、安定化比は、少なくとも１、例えば、少なくとも１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、２０～３０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～９５、２０～１００、３０～４０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～９５、３０～１００、４０～５０、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～９５、４０～１００、５０～６０、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～９５、５０～１００、６０～７０、６０～８０、６０～９０、６０～９５、６０～１００、７０～８０、７０～９０、７０～９５、７０～１００、８０～９０、８０～９５、８０～１００、９０～９５、９０～１００または９５～１００である。本明細書で使用される場合、不安定化比は、構成的に、ＳＲＥに特異的な刺激が存在しない場合に発現する、目的のタンパク質の発現、機能、またはレベルに対する、エフェクターモジュールに特異的な刺激が存在しない場合の、目的のタンパク質の発現、機能、またはレベルの比として定義され得る。本明細書で使用される場合、「構成的に」は、ＳＲＥに連結されておらず、したがって刺激の存在下と非存在下の両方で発現される目的のタンパク質の発現、機能、またはレベルを指す。いくつかの態様では、不安定化比は、少なくとも０、例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または少なくとも０～０．１、０～０．２、０～０．３、０～０．４、０～０．５、０～０．６、０～０．７、０～０．８、０～０．９、０．１～０．２、０．１～０．３、０．１～０．４、０．１～０．５、０．１～０．６、０．１～０．７、０．１～０．８、０．１～０．９、０．２～０．３、０．２～０．４、０．２～０．５、０．２～０．６、０．２～０．７、０．２～０．８、０．２～０．９、０．３～０．４、０．３～０．５、０．３～０．６、０．３～０．７、０．３～０．８、０．３～０．９、０．４～０．５、０．４～０．６、０．４～０．７、０．４～０．８、０．４～０．９、０．５～０．６、０．５～０．７、０．５～０．８、０．５～０．９、０．６～０．７、０．６～０．８、０．６～０．９、０．７～０．８、０．７～０．９、または０．８～０．９である。

いくつかの実施形態では、エフェクターモジュールのＳＲＥは、１つ以上の安定化比によって目的のペイロードを安定化することができ、安定化比は、刺激が存在しない場合の目的のペイロードの表現、機能、またはレベルに対する、刺激の存在下での目的のペイロードの発現、機能、またはレベルの比を含み得る。

いくつかの実施形態では、ＳＲＥは、０～０．０９の間の不安定化比によって免疫療法薬を不安定化することができ、不安定化比は、構成的に、ＳＲＥに特異的な刺激が存在しない場合に発現する目的のペイロードの発現、機能、またはレベルに対する、ＳＲＥに特異的な刺激が存在しない場合に発現する目的のペイロードの発現、機能、またはレベルの比を含み得る。

１６．追加のエフェクターモジュール機能
本開示のエフェクターモジュールは、ＤＲＤまたはペイロード、あるいはその両方のいずれかに作動可能に連結され得る追加の構成要素をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、追加の構成要素としては、目的のペイロードの分布を制御するシグナル配列、エフェクターモジュール構築物からのペイロードの切断を促進する切断及び／または加工機能、エフェクターモジュールの細胞局在を制御できるターゲティング及び／または貫通配列、タグ、及び／またはエフェクターモジュールの異なる成分、調節エレメント、ポリアデニル化配列、膜貫通ドメイン、テール内ドメイン、ヒンジ、タグ、切断部位、リーダーを連結する１つ以上のリンカー配列が挙げられる。そのような追加のエフェクターモジュール構成要素の例は、ＷＯ２０１８／１６１０００；ＷＯ２０１８／２３１７５９；ＷＯ２０１９／２４１３１５；ＷＯ２０１８／１６０９９３；ＷＯ２０１８／２３７３２３；及びＷＯ２０１８／１６１０３８に記載されている。一実施形態では、第１のペイロードの膜貫通ドメイン領域は、第２の親タンパク質由来の膜貫通ドメイン、そのバリアントまたは断片で置き換えることができる。

１７．ペイロード
本明細書で使用される場合、「ペイロード」または「目的のタンパク質」（本明細書で交換可能に使用される）は、本開示のＤＲＤに連結、付加、または作動可能に連結される任意のポリペプチド、タンパク質、またはその一部である。

ペイロードは、任意のポリペプチドまたは任意のタンパク質またはその断片を含み得る。ペイロードは、野生型配列、野生型配列の断片、及び／または１つ以上の変異を含み得る。ペイロードは、生物ゲノム由来の天然タンパク質、またはそれらのバリアント、変異体、及び誘導体であり得る。天然タンパク質は、例えば、哺乳動物、細菌、及びウイルスに由来し得る。ペイロードは、組換え核酸分子によってコードされるタンパク質またはポリペプチド、融合またはキメラポリペプチド、またはタンパク質複合体の一部として機能するポリペプチドであり得る。

一例では、ペイロードは、ヒトゲノム由来の核酸配列によってコードされるポリペプチドであり得る。

いくつかの実施形態では、ペイロードは、親ポリペプチドのバリアント配列であり得る。いくつかの態様では、バリアント配列は、参照配列と同じかまたは類似の活性を有し得る。代替的に、バリアントは、参照配列と比較して変化した活性（例えば、増加または減少）を有し得る。一般に、本開示の特定のポリペプチドのバリアントは、当業者に知られている配列アラインメントプログラムによって決定されるとき、その特定の参照ポリペプチドに対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有するであろう。

１８．ペイロードとしての治療薬
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、治療薬であり得る。例えば、ペイロードは、がん治療薬、自己免疫疾患の治療薬、免疫療法薬、抗炎症薬、抗病原体薬、または遺伝子治療薬であり得る。いくつかの態様では、免疫治療薬は、抗体及びその断片及びバリアント、ＴＣＲ受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、共阻害分子のアンタゴニスト、共刺激分子のアゴニスト、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、代謝因子、凝固因子、酵素、ホーミング受容体、ならびに安全スイッチであり得る。

いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、生物において免疫応答を誘導する免疫療法薬であり得る。免疫療法薬は、抗体及びその断片及びバリアント、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン－サイトカイン受容体融合ポリペプチド、または免疫応答を誘導する任意の薬剤であり得、免疫細胞の活性、機能、または応答を変化させる任意の薬剤を含み得るが、これらに限定されない。一実施形態では、免疫療法薬は、細胞または対象において抗がん免疫応答を誘導する。

１９．ペイロードとしてのサイトカイン、ケモカイン、及びその他の可溶性因子
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ならびに、体内の細胞と組織との間の化学伝達物質として作用する免疫細胞、がん細胞、及び他の細胞型によって産生される可溶性タンパク質であり得る。これらのタンパク質は、細胞の増殖、分化、遊走、生存への影響から、多くのエフェクター活性まで、幅広い生理学的機能を媒介する。例えば、活性化されたＴ細胞は、腫瘍細胞を排除する細胞傷害性機能のためのさまざまなサイトカインを産生する。

いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＴＧＦベータ、及びケモカインを含むがこれらに限定されない、サイトカイン、ならびにそれらの断片、バリアント、類似体、及び誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のペイロードは、免疫応答を刺激するサイトカインであり得る。他の実施形態では、本発明のペイロードは、抗がん免疫応答に負の影響を及ぼすサイトカインのアンタゴニストであり得る。

例えば、第１のペイロードの膜貫通は、膜貫通ドメイン、そのバリアントまたは断片のいずれかで置き換えることができる。

いくつかの実施形態では、ペイロードは、記載された免疫療法薬のいずれかとユビキチンを含む融合タンパク質であり得る。融合タンパク質内で、ユビキチンはＮ末端に配置され得、免疫療法薬はＣ末端に配置され得る。一態様では、免疫療法薬はそれ自体が融合タンパク質であり得、ユビキチンは融合されたタンパク質の間に位置し得る。ペイロードは、単一のユビキチンタンパク質またはユビキチンタンパク質の鎖を含み得る。ユビキチンタンパク質は、単一のアミノ酸を介して免疫療法薬に連結してもよい。

２０．免疫療法薬
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、生物において免疫応答を誘導する免疫療法薬であり得る。免疫療法薬は、抗体及びその断片及びバリアント、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン－サイトカイン受容体融合ポリペプチド、または免疫応答を誘導する任意の薬剤であり得るが、これらに限定されない。一実施形態では、免疫療法薬は、細胞または対象において抗がん免疫応答を誘導する。

２１．ＣＤ４０Ｌ
様々な実施形態では、本開示のペイロードは、免疫療法薬を含む。様々な実施形態では、免疫療法薬は、ＣＤ１５４またはＴＮＦＲＦ５としても知られるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、またはヒトＣＤ４０Ｌの野生型配列への１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含む変異体である。ＣＤ４０ＬはＴＮＦスーパーファミリーに属し、主にＴ細胞に発現している。ＣＤ４０Ｌは、多数の免疫細胞で発現するＣＤ４０に結合し、細胞の種類に応じて細胞応答のカスケードを開始する。ＣＤ４０Ｌはα５β１インテグリン及びαＩＩｂβ３インテグリンにも結合し得る。ＣＤ４０Ｌは、Ｎ末端における細胞質ドメイン、膜貫通領域、次いでＣ末端における細胞外ドメインを有する、ＩＩ型膜ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本開示のＣＤ４０Ｌは、その結合パートナーのうちの１つ、例えば、ＣＤ４０のみに結合するように操作され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載されるＣＤ４０Ｌは、その同族の結合パートナーのすべてに結合することが可能であり得る。

特に明記しない限り、全長ＣＤ４０Ｌは本明細書では「ＣＤ４０Ｌ」と呼ばれる。マウス及びヒト由来のＣＤ４０Ｌのヌクレオチド及びアミノ酸の配列は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，９６２，４０６号（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．）に見出すことができる。ＣＤ４０リガンドの意味には、ムチンに対する免疫応答を誘発するリガンドの能力を変化させない保存的アミノ酸変化などを含む配列のバリエーションも含まれる。

ＣＤ４０Ｌは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、血小板、好中球、樹状細胞、内皮細胞、及びαＳＭＣ（平滑筋細胞）で発現するＣＤ４０に結合し得る。樹状細胞で発現するＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合は、樹状細胞（ＤＣ）ライセンシングを促進できる。ＤＣは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するために、抗原特異的Ｔヘルパー細胞によって機能状態に変換され得、これはＤＣライセンスと呼ばれるプロセスである。ＤＣ上でのＣＤ４０の結合は、共刺激分子及びＭＨＣ分子の表面発現によって証明されるようにＤＣ刺激、炎症性サイトカインの産生（例えば、ＩＬ１２及びＴＮＦ）、ならびにエピトープ拡大をもたらす。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の調整可能なタンパク質発現システムによって制御されるＣＤ４０Ｌは、固形の免疫原性腫瘍の治療に利用され得る。ＣＤ４０Ｌは、適応性のある自然免疫応答をインサイチュで活性化することにより、免疫原性腫瘍における固形腫瘍を標的としたＴ細胞の有効性を改善し得る。Ｔ細胞における内因性ＣＤ４０Ｌの発現は一過性であるため、本明細書に記載の調節可能なＣＤ４０Ｌベースの生体回路システムが望ましくあり得る。さらに、腫瘍の微小環境は、Ｔ細胞によって発現される内因性ＣＤ４０Ｌを切断し得るシェダーゼが豊富である。外因的に発現した構成的ＣＤ４０Ｌ発現は、肝毒性及び過剰なＢ細胞増殖を引き起こし、リンパ腫を引き起こすおそれがある（それぞれの内容が、参照によりその全体が組み込まれる、Ｓｃｈｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ （２００６） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４４（２）：４３０－９， Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １；２５（７）：８７６－８３， Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．；７（１０）：１２９９－３０６））。構成的（調節されていない）発現は、ＣＲＳ、血栓塞栓症候群、自己免疫反応、過免疫刺激及び腫瘍血管新生によるＡＩＣＤをもたらすおそれがあり、そのため、本開示の生体回路の必要性が生じる。

いくつかの実施形態では、免疫療法薬は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、または八量体などであるがこれらに限定されないＣＤ４０Ｌ分子の多量体であり得る。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは三量体を形成し得る。ＣＤ４０Ｌの多量体化は、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０軸を介したシグナル伝達を強化し得る。三量体ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合は、ＣＤ４０のクラスター化とＴＲＡＦの活性化を開始し、最終的にＮＦ－κＢの活性化をもたらし得る。

本明細書に記載のＣＤ４０Ｌは、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７などの腫瘍微小環境に見られるものなどのプロテイナーゼ及びシェダーゼに耐性を有し得る。腫瘍微小環境におけるＡＤＡＭ１７の活性の上昇は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ軸を介したシグナル伝達の低下と関連している（その内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｏｗｅ ａｎｄ Ｃｏｒｖａｉａ （２０１６）， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ， ３：０５８を参照されたい）。

いくつかの態様では、ＣＤ４０Ｌはキメラ抗原受容体と共発現され得る。ＣＡＲ Ｔ細胞で発現したＣＤ４０Ｌは、腫瘍微小環境の樹状細胞、マクロファージ、骨髄細胞、Ｂ細胞、血小板、内皮細胞、上皮細胞、及び線維芽細胞、ならびに腫瘍細胞自体などであるがこれらに限定されない、ＣＤ４０＋免疫細胞の活性化を介して、ＣＡＲＴ細胞及びバイスタンダーエフェクター細胞の機能を高め得る。一実施形態では、ペイロードは、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ共刺激ドメインを有するＣＤ４０Ｌ及びＣＤ１９ＣＡＲを含むバイシストロン性構築物であり得る（その内容が参照により全体として組み込まれる、Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２３： ４；７６９－７７８を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞はまた、ＣＤ４０Ｌと併せて本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を発現するように操作され得る。ＣＤ４０Ｌは、構成的に発現され得るか、または本開示のエフェクターモジュールにおけるペイロードとして使用され得る。ＣＤ４０Ｌは樹状細胞の抗原提示、ＩＬ１２の産生、及びＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の生成に関与している。ＣＤ４０Ｌを使用してＣＡＲの抗腫瘍効果を増強するための、Ｃｕｒｒｅｎらによって記述された方法のいずれも、本開示において有用であり得る（その内容が参照によりその全体が組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１５ Ａｐｒ；２３（４）： ７６９－７７８）。一実施形態では、アゴニストＣＤ４０抗体は、本開示において有用であり得る。ＣＤ４０モノクローナル抗体は、毒性を無効にすることなく臨床活性を示している。

Ｔ制御性細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、及び腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の広範な間質ネットワークの組み合わせは、現在の免疫療法によるＴ細胞の浸潤及び／または活性化を防ぐことにより、抗腫瘍免疫応答を弱めることができる（その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａ ｅｔ ａｌ． Ａ ＣＤ４０ ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｄ ＰＤ－１ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｔｏ ａｌｌｏｗ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ Ｊａｎ． １４， ２０１９；ｄｏｉ： １０．１１５８／２３２６－６０６．ＣＩＲ－１８－００６１を参照されたい）。現在のＣＡＲＴ療法は、免疫抑制、腫瘍抗原エスケープ、不十分なＣＡＲ Ｔ拡大、及び健康組織の毒性があるため、効果的ではない。

本開示は、本明細書に記載のＤＲＤを含むＳＲＥに直接的または間接的に融合された、免疫療法薬としてのＣＤ４０Ｌを備えたエフェクターモジュールの利用に関するこれらの問題に対処する。ＣＤ４０Ｌは、エフェクターモジュール内の唯一の免疫療法薬でなくてもよい。エフェクターモジュールはまた、ＣＡＲ構築物を含み得る。免疫療法薬としてのＣＤ４０Ｌ及びＣＡＲとＳＲＥの組み合わせは、以下のいずれかを単独または組み合わせて引き起こし得る：（１）腫瘍微小環境におけるＣＤ４０＋マクロファージの炎症誘発性状態への再分極、（２）腫瘍抗原エスケープを減少させることができるエピトープ拡大を促進するＣＤ４０＋樹状細胞の活性化（例えば、ＣＡＲ標的抗原の喪失を減少させる）、（３）抗原依存性Ｔ細胞拡大を増強する逆シグナル伝達及びサイトカイン産生、（４）健康な組織に対する治療薬の毒性を低下させるＳＲＥからの制御可能なタンパク質産生。非限定的な例として、ＣＤ４０Ｌに融合したＳＲＥ及びＣＡＲ免疫療法薬を含むエフェクターモジュールを使用して、樹状細胞に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を動員させて抗腫瘍特異的Ｔ細胞の群を拡大することにより、ＣＡＲ標的抗原の喪失（例えば、抗原エスケープ）を克服することができる。非限定的な例として、ＣＤ４０Ｌに融合したＳＲＥ及びＣＡＲ免疫療法薬を含むエフェクターモジュールを使用して、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を抑制性から炎症性の表現型を再分極することにより、固形腫瘍の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の制約を軽減することができる。非限定的な例として、ＣＤ４０Ｌに融合したＳＲＥ及びＣＡＲ免疫療法薬を含むエフェクターモジュールを使用して、抗原依存性Ｔ細胞拡大を引き起こすことによってＣＡＲＴ細胞拡大を増強することができる。

いくつかの実施形態では、エフェクターモジュールは、少なくとも１つの免疫療法薬を含む。一実施形態では、免疫療法薬はＣＤ４０Ｌである。一実施形態では、エフェクターモジュールは、２つの抗体などの同じタイプ、またはＣＤ４０ＬとＣＡＲ構築物などの異なるタイプであり得る２つ以上の免疫療法薬を含む。

本明細書で提供されるのは、細胞または対象において免疫応答を誘導するための組成物である。組成物は、エフェクターモジュールを含み得る。エフェクターモジュールは、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含み得る。第１のペイロードは、全体的または部分的に、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）またはその変異体を含み得る。一実施形態では、第１のペイロードは、ＣＤ４０Ｌ全体（配列番号３８２０）である。

一態様では、第１のペイロードは、ＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）の領域であってよい。一態様では、ＣＤ４０Ｌの領域は、配列番号３８２０のアミノ酸１１３～２６９（配列番号３８２２）を含み得る。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの領域は、配列番号３８２０のアミノ酸１２～２６１（配列番号３８２４）を含み得る。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌの領域は、配列番号３８２０のアミノ酸１１０～１１６に欠失を有する配列番号３８２０のアミノ酸１４～２６１（配列番号３８２６）を含み得る。

エフェクターモジュールのＳＲＥは、少なくとも１つの親タンパク質の全部または一部に由来し得、当該親タンパク質は、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、及びｈＤＨＦＲからなる群から選択される。

一実施形態では、ＳＲＥは、親タンパク質と比較して１つ以上の変異を含み得る。

一実施形態では、ＳＲＥはＥＲに由来し得、ＳＲＥは、表６に列挙されたアミノ酸配列を含み得るが、これに限定されない。

一実施形態では、ＳＲＥはｅｃＤＨＦＲに由来し得、ＳＲＥは、表３に列挙されたアミノ酸配列を含み得るが、これに限定されない。

一実施形態では、ＳＲＥはＦＫＢＰに由来し得、ＳＲＥは、表４に列挙されたアミノ酸配列を含み得るが、これに限定されない。

一実施形態では、ＳＲＥはＰＤＥ５に由来し得、ＳＲＥは、表５に列挙されたアミノ酸配列を含み得るが、これに限定されない。

いくつかの態様では、ＳＲＥは、少なくとも１つの刺激に応答するか、またはそれと相互作用し得る。一態様では、エフェクタモジュールは、第２のペイロードを含み得る。一実施形態では、第２のペイロードは、免疫療法薬であってよい。いくつかの実施形態では、免疫療法薬はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってよい。本明細書に記載のＣＡＲは、（ａ）細胞外標的部分と、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、（ｄ）任意選択で、１つ以上の共刺激ドメインと、を含み得る。

ＣＡＲの細胞外標的部分はｓｃＦｖであってよい。いくつかの態様では、細胞外標的部分は、ｓｃＦｖであり得る。一実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＤ１９ ｓｃＦｖであってよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインを含む。

同様に本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の組成物をコードするポリヌクレオチド、本明細書に記載のポリヌクレオチドを発現するベクター、及び本明細書に記載の組成物と薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物である。

本開示はまた、本明細書に開示される様々な治療方法、例えば、がんの治療及び医薬組成物を発現する養子細胞移植のための免疫細胞を提供する。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、樹状細胞、ヒト胚性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、またはそれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は樹状細胞である。いくつかの実施形態では、循環免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一態様では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。

本明細書でさらに提供されるのは、対象における免疫応答を誘導する方法である。そのような方法は、対象に、本明細書に記載の有効量の免疫細胞を投与することを含み得る。免疫細胞は、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含むエフェクターモジュールを発現する免疫細動である。第１のペイロードは、全体的または部分的に、ヒトＣＤ４０Ｌを含み得る。免疫細胞によって発現されるＳＲＥは、少なくとも１つの刺激に応答し得るか、相互作用し得る。この方法はさらに、対象を刺激に曝露し、ＣＤ４０Ｌ発現を調節することを含み得る。ＣＤ４０Ｌ発現の調節は免疫応答を誘導する。いくつかの態様では、この方法は、有効量のＣＤ４０陽性細胞を対象に投与することをさらに含み得る。いくつかの態様では、ＣＤ４０陽性細胞は、樹状細胞、マクロファージ、骨髄細胞、Ｂ細胞、血小板、内皮細胞、上皮細胞、及び線維芽細胞であり得る。

本明細書に記載の組成物は、免疫応答を誘導するために使用することができる。そのような組成物は、（ａ）ＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）を含むエフェクターモジュールを発現することができる第１の免疫細胞、またはその第１のペイロードとして変異体ＣＤ４０Ｌ、ならびにＣＤ４０Ｌを発現する第２の免疫細胞を含み得る。第１の免疫細胞及び第２の免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、樹状細胞、ヒト胚性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、樹状細胞、マクロファージ、骨髄性細胞、Ｂ細胞、血小板、内皮細胞、上皮細胞、及び線維芽細胞から独立して選択され得る。

本開示はまた、対象において樹状細胞を活性化するための方法を提供する。この方法は、治療有効量の免疫細胞を対象に投与するステップを含み得る。免疫細胞は、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含む組成物を含み得るか、または発現し得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。第１のペイロードは、全体的または部分的に、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）、または本明細書に記載のＣＤ４０Ｌ変異体を含み得る。免疫細胞はまた、本明細書に記載の組成物を含む医薬組成物を発現し得る。この方法はまた、治療有効量の刺激を対象に投与することを含む。一実施形態では、刺激はリガンドである。この方法はさらに、樹状細胞の活性化を決定するために、リガンドに応答して対象の樹状細胞活性化マーカーＩＬ１２を測定することを含み得る。一実施形態では、樹状細胞は、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１４＋樹状細胞、ランゲルハンス細胞、またはミクログリアであり得る。一態様では、樹状細胞は骨髄性樹状細胞である。

一実施形態では、ＣＤ４０Ｌまたはその変異体である免疫療法薬は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２９９６５（本明細書では「ＷＴ」とも呼ばれる）に由来し得る。本開示のペイロードは、そのような変異体をコードするアミノ酸またはヌクレオチドの配列における変異を含むかまたは含まない、ＣＤ４０Ｌの領域または部分であり得る。ＣＤ４０Ｌの領域の非限定的な例としては、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインの一部がＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２９９６から削除され、細胞外ドメインの一部と無傷受容体結合ドメインが残っている、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２９９６のアミノ酸１１３～２６９が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ペイロードは、ＣＤ４０Ｌの細胞質テールを除外し、それにより、潜在的に内在化を低減し得る、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２９９６のアミノ酸１４～２６１であり得る。一態様では、ペイロードは、ＣＤ４０Ｌをタンパク質分解酵素による切断に対して耐性にする、アミノ酸Ｓ１１０～Ｇ１１６が欠失したＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２９９６のアミノ酸１４～２６１であり得る。

いくつかの実施形態では、変異は、本明細書に記載の細胞によって内因的に発現されるＣＤ４０Ｌに結合しないか、または減少した親和性で結合するように、ＣＤ４０Ｌペイロード内で操作され得る。ＣＤ４０Ｌは、細胞表面に三量体を形成するＩＩ型膜貫通タンパク質である。いくつかの実施形態では、三量体化は、配列番号３８２０のアミノ酸残基４７～２６１の相互作用を介して起こる。いくつかの実施形態では、配列番号３８２０の４７～２６１内の残基は、三量体化を防ぐために、ＣＤ４０Ｌペイロードにおいて変異され得る（以下、「三量体化変異体」と呼ばれる）。いくつかの実施形態では、配列番号３８２０の１１６～２６１内の残基は、変異され得る。いくつかの態様では、変異は、ＣＤ４０Ｌ三量体化変異体が別のＣＤ４０Ｌ三量体化変異体タンパク質に結合できるが、変異を欠くＣＤ４０Ｌタンパク質には結合できないような選択的三量体化を可能にし得る。三量体化変異部位は、ＣＤ４０Ｌ三量体の結晶構造によって決定されるとき、三量体化に関与するＣＤ４０Ｌタンパク質内の部位であり得る。変異し得るＣＤ４０Ｌ内の位置には、配列番号３８２０の位置１２５、１７０、１７２、２２４、２２６及び／または２２７のアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、内因性ＣＤ４０Ｌとのその三量体化を防ぐためのＣＤ４０Ｌペイロードへの変異は、Ｙ１７０Ｇ、Ｙ１７２Ｇ、Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｆ、Ｇ２２６Ｈ、Ｇ２２６Ｗ、及び／またはＧ２２７Ｆを含み得るが、これらに限定されない。

腫瘍微小環境に存在するシェダーゼ、例えばＡＤＡＭ１０／１７はＣＤ４０Ｌを切断し、それによってＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の活性化の達成を妨げることができる。ＣＤ４０Ｌの配列を分析すると、ＡＤＡＭ１０／１７タンパク質分解切断部位が明らかになる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌのアミノ酸１～１３の欠失は、内在化を低減するように操作され得る。ＣＤ４０Ｌのアミノ酸１１０～１１６の欠失は、ＡＤＡＭ１０／１７部位を除去するように操作することもできる。ＣＤ４０Ｌのアミノ酸位置１１３のメチオニン残基の欠失または変異もまた、ＡＤＡＭ１０／１７酵素による切断を減らすために利用され得る。一実施形態では、ヒトＣＤ４０Ｌタンパク質の領域または一部をマウスＣＤ４０Ｌタンパク質配列で置き換えて、ＡＤＡＭ１０／１７による切断に耐性を有するＣＤ４０Ｌタンパク質を生成することができる。米国特許公開第ＵＳ２０１８００８５４５１Ａ１号及び／または米国特許第７，４９５，０９０Ｂ２号に記載されているようにそのシェディングを低減することを目的とするＣＤ４０Ｌ配列のいずれも、本明細書に記載のエフェクターモジュール及び生体回路で使用することができる（それぞれの内容は参照によりその全体が組み込まれる）。ＣＤ４０Ｌは、膜貫通ドメインのいずれかを使用して膜に係留されていてもよい。一実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン及び／またはＣＤ８細胞質テールなどであるがこれらに限定されないＣＤ８由来ドメインを使用して膜に係留され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるエフェクターモジュールは、ＤＤとＣＤ４０Ｌとの間の１つ以上の切断部位を含み得る。切断部位を含めると、ＤＤのタンパク質分解ターンオーバーがペイロードから切り離され、それによってＤＤとは無関係にペイロードの発現レベルを変化させ得る。いくつかの実施形態では、切断部位の追加は、ペイロードの発現を増加させ得る。他の態様では、切断部位の追加は、ペイロードの発現を減少させ得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ４０Ｌペイロード及びＳＲＥは連結され得る。

ＣＤ４０Ｌ構築物構成要素とＣＤ４０Ｌ構築物をそれぞれ表７と表８に示す。表７及び表８で、ＣＤ４０Ｌ「ＷＴ」はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２９９６５を指し、ｈＰＤＥ５「ＷＴ」はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｏ７６０７４を指し、ＥＲ「ＷＴ」はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０３３７２．２を指す。

表７：ＣＤ４０Ｌ構築物構成要素

表８：ＣＤ４０Ｌ構築物

Ｂ．医薬組成物及び製剤
本教示は、本開示の１つ以上の調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、改変細胞、またはペイロードと、任意選択で少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または不活性成分と、を含む医薬組成物をさらに含む。

本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、本明細書に記載の調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロードもしくは成分、またはそれらの薬学的に許容される塩のうちの１つ以上と、任意選択で、生理学的に適切な担体及び賦形剤などの他の化学成分を伴う製剤を指す。

「賦形剤」または「不活性成分」という用語は、化合物の投与をさらに促進するために医薬組成物に添加される不活性または不活性の物質を指す。

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒトの患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「有効成分」という語句は、一般に、本明細書に記載されるように送達される任意の１つ以上の調整可能なタンパク質発現システム成分を指す。

本明細書に提供する医薬組成物の記載は、ヒトへの投与に適した医薬組成物を主に対象とするが、このような組成物は一般に任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に適していることを当業者は理解するであろう。医薬組成物の投与が企図される対象としては、ウシ、ウマ、ニワトリ、及びブタなどの農業動物、ネコ、イヌなどの飼育動物、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、及び非ヒト霊長類などの実験動物が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示による医薬組成物は、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、大量に調製、包装、及び／または販売することができる。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投与量及び／または例えばそのような投与量の半分または３分の１などのそのような投与量の便利な画分に等しい。

本開示の医薬組成物における活性成分、医薬的に許容される賦形剤、もしくは不活性成分、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／または状態に応じて、ならびにさらに、組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。

治療の有効性または疾患の改善は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重症度、疼痛の軽減、生活の質、治療効果を維持するために必要な医薬の用量、疾患マーカーのレベル、または治療中または予防の対象となる特定の疾患に適した他の測定可能なパラメータを測定することによって評価することができる。当業者は、そのようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することによって、治療または予防の有効性をモニターすることができる。本開示の組成物の投与に関連して、例えばがんに対して「有効」であることは、臨床的に適切な方法での投与が、症状の改善、治癒、疾患負荷の減少、腫瘍の質量または細胞数の減少、寿命の延長、生活の質の改善、または特定の種類のがんの治療に精通している医師によって一般的に陽性と認められる他の効果などの少なくとも統計的に有意な割合の患者に有益な効果をもたらすことを示す。

治療または予防効果は、疾患状態の１つ以上のパラメータに統計的に有意な改善がある場合、または他の方法で予想される症状の悪化または発症のないことによって明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータにおける少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の好ましい変化は、効果的な治療を示し得る。本開示の所与の組成物または製剤の有効性はまた、当該技術分野で知られている所与の疾患の実験動物モデルを使用して判断することができる。実験動物モデルを使用する場合、統計的に有意な変化が観察されると、治療の有効性が実証される。

１．製剤
本開示の組成物、例えば、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、及びベクター組成物は、送達に適した任意の方法で製剤化することができる。製剤は、ナノ粒子、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、及びそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。

一実施形態では、ポリヌクレオチド及びベクター製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、及びＰＥＧ化脂質から選択できるが、これらに限定されない。別の態様において、脂質は、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、及びＤＯＤＭＡなどのカチオン性脂質であり得るが、これらに限定されない。

本開示のポリヌクレオチドの場合、製剤は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０９６１０で教示されているもののいずれかから選択することができる。

２．不活性成分
いくつかの実施形態では、医薬または他の製剤は、不活性成分である少なくとも１つの賦形剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる１つ以上の不活性剤を指す。いくつかの実施形態では、本開示の製剤において使用され得る不活性成分のすべて、なし、またはいくつかは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され得る。本開示の製剤に適した不活性成分は、出願人のＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１８／１６１０００；ＷＯ２０１８／２３１７５９；ＷＯ２０１９／２４１３１５；及びＷＯ２０１８／２３７３２３に見出すことができる。

３．投与、送達、及び管理
本開示の組成物は、１つ以上の経路及びモダリティを介して細胞または対象に送達され得る。１つ以上の調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、及び本明細書に記載の他の成分を含むウイルスベクターを使用して、それらを細胞及び／または対象に送達することができる。ｍＲＮＡ、プラスミドなどの他のモダリティも、組換えタンパク質として使用できる。

４．ネイキッド送達
本開示の医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードは、ネイキッドの形態で細胞、組織、臓器、及び／または生物に送達され得る。本明細書で使用される場合、「ネイキッド」という用語は、トランスフェクションまたは透過性を促進する薬剤または修飾を含まずに送達される医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードを指す。ネイキッドの医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードは、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている投与経路を使用して、細胞、組織、臓器、及び／または生物に送達され得る。いくつかの実施形態では、ネイキッド送達は、生理食塩水またはＰＢＳなどの単純な緩衝液中の製剤を含み得る。

５．製剤化された配達
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードは、本明細書に記載の方法を使用して製剤化され得る。製剤は、改変及び／または非改変であり得る医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードを含み得る。製剤には、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生体侵食性または生体適合性ポリマー、溶媒、及び／または徐放性送達デポーがさらに含まれ得るが、これらに限定されない。本開示の製剤は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている投与経路を使用して細胞に送達することができる。

医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、またはペイロードはまた、カテーテルを介する、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／またはドロップによって、組成物などでコーティングまたは含浸された布または生分解性材料などの基質を使用することによってなどの、直接浸漬または薬浴を含むがこれらに限定されない、当該技術分野におけるいくつかの方法のいずれかで臓器または組織への直接送達のために製剤化され得る。

６．細胞への送達
本開示の別の態様では、調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、または目的のペイロード、ならびに本開示の組成物及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターをコードするポリヌクレオチドを、免疫エフェクター細胞などの細胞に導入することができる。

本開示の一態様では、調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、または目的のペイロード及び本開示の組成物をコードするポリヌクレオチドは、プラスミド、ウイルスベクターにパッケージ化されるか、またはウイルスゲノムに組み込まれ得、ポリヌクレオチドの一過性または安定な発現を可能にする。好ましいウイルスベクターは、レンチウイルスベクター及びガンマレトロウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクターを構築するために、調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、または目的のペイロードをコードするポリヌクレオチド分子を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損ウイルスを生成する。次いで、組換えウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及びパッケージング構成要素を含まないパッケージング細胞株に導入される。組換えレトロウイルス粒子は培地に分泌され、次いで収集され、任意選択で濃縮され、遺伝子導入に使用される。レンチウイルスベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができるため、特に好ましい。

ベクターは、ニードル、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ハイドロポレーションなどの物理的方法、無機粒子（例えば、リン酸カルシウム、シリカ、金）などの化学的担体、及び／または化学的方法による非ウイルス法によって細胞に導入することもできる。いくつかの実施形態では、合成または天然の生分解性薬剤は、カチオン性脂質、脂質ナノエマルジョン、ナノ粒子、ペプチドベースのベクター、またはポリマーベースのベクターなどの送達のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、一時的な膜破壊によって、例えば、高速の細胞変形によって、細胞に導入され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、細胞に直接送達され得る。一実施形態では、本開示のポリペプチドは、細胞透過性ドメイン（ＣＬＤ）に融合されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含む合成ペプチドを使用して送達され得る。本開示のポリペプチドは、ＥＬＤ－ＣＬＤ－合成ペプチドとともに細胞に同時導入される。ＥＬＤは、エンドソームにトラップされたタンパク質のサイトゾルへの脱出を促進する。そのようなドメインは、微生物及びウイルス起源の由来タンパク質であり、当該技術分野で記載されている。ＣＰＤは、原形質膜を横切るタンパク質の輸送を可能にし、また当該技術分野で記載されている。ＥＬＤ－ＣＬＤ融合タンパク質は、いずれかのドメインのみとの共形質導入と比較した場合、相乗的に形質導入効率を高める。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、エンドソームからサイトゾルへのカーゴの脱出を可能にする追加の方法として、任意選択でシャトル構築物に追加され得る。シャトルはまた、融合ペプチドの多量体を生成するために、ＮまたはＣ末端にシステイン残基を含み得る。ペプチドの末端へのシステイン残基の付加によって生成されたＥＬＤ－ＣＬＤ融合ペプチドの多量体は、単一の融合ペプチド構築物と比較した場合、さらに高い形質導入効率を示す。本開示のポリペプチドはまた、カーゴを適切な細胞内位置、例えば核に向けるために、適切な局在化シグナルに付加され得る。いくつかの実施形態では、国際特許公開、ＷＯ２０１６１６１５１６及びＷＯ２０１７１７５０７２に教示されているＥＬＤ、ＣＬＤまたは融合ＥＬＤ－ＣＬＤ合成ペプチドのいずれかが、本開示において有用であり得る（それらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

７．送達モダリティ及び／またはベクター
本開示の目的の調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロードは、１つ以上のモダリティを使用して送達することができる。本開示はまた、調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロード構築物、及びそれらの組み合わせをコードする本開示のポリヌクレオチドをパッケージ化するベクターを提供する。本開示のベクターはまた、パッケージされたポリヌクレオチドを細胞、局所組織部位、または対象に送達するために使用され得る。これらのベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、ウイルスベクター、及び粒子を含む任意の種類のものであり得る。ウイルスベクター技術はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アルファウイルス、フラビウイルス、ヘルペスウイルス、はしかウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ポックスウイルス、及びピコルナウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクターから選択される。

一般に、ベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製起点、プロモーター配列、及び便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、ならびに１つ以上の選択可能なマーカー、例えば薬剤耐性遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、組換え発現ベクターは、ベクターが導入される宿主細胞のタイプに特異的な、転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの調節配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、本明細書で教示される１つ以上のペイロードを含み得、２つ以上のペイロードは、１つのリガンド応答に含まれ得る。この場合、２つ以上のペイロードは、同じリガンドまたは応答剤によって同時に調整される。

８．レンチウイルスビヒクル／粒子
いくつかの実施形態では、レンチウイルスビヒクル／粒子は、送達モダリティとして使用され得る。レンチウイルスは、ウイルスのレトロウイルス科ファミリーのサブグループであり、ウイルスＲＮＡゲノムのＤＮＡへの逆転写が宿主ゲノムに組み込まれる前に必要であるために名付けられた。このように、レンチウイルスビヒクル／粒子の最も重要な特徴は、それらの遺伝物質を標的／宿主細胞のゲノムに組み込むことである。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス、ビスナ－マエディ、及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。

典型的には、遺伝子送達ビヒクルを構成するレンチウイルス粒子は、それ自体で複製欠陥である（「自己不活性化」とも呼ばれる）。レンチウイルスは、インタクトな宿主エンベロープを介した侵入メカニズムにより、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができる。組換えレンチウイルスビヒクル／粒子は、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されている。例えば、遺伝子Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ、及びＴａｔが削除され、ベクターが生物学的に安全になっている。それに対応して、例えば、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２に由来するレンチウイルスビヒクルは、非分裂細胞への導入遺伝子の効率的な送達、組み込み、及び長期発現を媒介することができる。本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、レンチウイルス配列と非レンチウイルスレトロウイルス配列の両方を含むベクターまたは他の核酸を指す。

レンチウイルス粒子は、ウイルスパッケージング要素とベクターゲノム自体をヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞などのプロデューサー細胞で共発現させることによって生成することができる。これらの要素は通常、３つまたは４つの別々のプラスミドで提供される。プロデューサー細胞は、ウイルスのコア（すなわち構造タンパク質）及び酵素構成要素、及びエンベロープタンパク質（パッケージングシステムと呼ばれる）を含むレンチウイルス構成要素をコードするプラスミド、ならびに標的細胞に導入される外来導入遺伝子を含むゲノムをコードするプラスミド、すなわちビヒクルそれ自身（トランスファーベクターとも呼ばれる）で共トランスフェクトされる。一般に、プラスミドまたはベクターはプロデューサー細胞株に含まれている。プラスミド／ベクターは、トランスフェクション、形質導入、または感染を介してプロデューサー細胞株に導入される。トランスフェクション、形質導入、または感染の方法は、当業者によく知られている。非限定的な例として、パッケージング及びトランスファー構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションによって、一般に、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンテターゼまたはＡＤＡなどの主要な選択マーカーと一緒にプロデューサー細胞株に導入でき、その後、適切な薬物の存在とクローンの分離が続く。

プロデューサー細胞は、外来遺伝子、例えば、本開示の調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、及びペイロードを含む組換えウイルス粒子を産生する。組換えウイルス粒子は、培養培地から回収され、当業者によって使用される標準的な方法によって力価決定される。組換えレンチウイルスビヒクルを使用して、標的細胞を感染させることができる。

高力価レンチウイルス粒子を産生するために使用できる細胞としては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２９３Ｇ細胞、ＳＴＡＲ細胞（Ｒｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ２００５， １１： ４５２－４５９）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）、及びその他のＨＥＫ２９３Ｔベースのプロデューサー細胞株（例えば、それぞれの内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１１， ２２（３）：３５７－３６９；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， ２０１２， １０９９６）： １５５１－１５６０；Ｔｈｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ． ２００９， １１３（２１）： ５１０４－５１１０）。

いくつかの態様では、エンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ Ｇ）のＧタンパク質またはバキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質などの他のウイルスからの異種エンベロープタンパク質であり得る。ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、特に水疱性口内炎ウイルス属に分類される種：カラハスウイルス（ＣＪＳＶ）、チャンディプラウイルス（ＣＨＰＶ）、コカルウイルス（ＣＯＣＶ）、イスファハンウイルス（ＩＳＦＶ）、マラバウイルス（ＭＡＲＡＶ）、パイリーウイルス（ＰＩＲＹＶ）、水疱性口内炎アラゴアスウイルス（ＶＳＡＶ）、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）、及び／またはベシキュロウイルス属に暫定的に分類される種、グラスカープラブドウイルス、ＢｅＡｎ １５７５７５ウイルス（ＢｅＡｎ １５７５７５）、ボテケウイルス（ＢＴＫＶ）、カルチャキウイルス（ＣＱＩＶ）、イールウイルスアメリカン（ＥＶＡ）、グレイロッジウイルス（ＧＬＯＶ）、ジュロナウイルス（ＪＵＲＹ）、クラマスウイルス（ＫＬＡＶ）、クワッタウイルス（ＫＷＡＶ）、ラジョヤウイルス（ＬＪＶ）、マルパイススプリングウイルス（ＭＳＰＶ）、マウントエルゴンバットウイルス（ＭＥＢＶ）、ペリネットウイルス（ＰＥＲＶ）、パイクフライラブドウイルス（ＰＦＲＶ）、ポートンウイルス（ＰＯＲＶ）、ラディウイルス（ＲＡＤＩＶ）、鯉春ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣＶ）、ツパイ属ウイルス（ＴＵＰＶ）、潰瘍性疾患ラブドウイルス（ＵＤＲＶ）、及びユグボグダノバックウイルス（ＹＢＶ）の中から選択できる。ｇｐ６４または他のバキュロウイルスのｅｎｖタンパク質は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）、Ａｎａｇｒａｐｈａ ｆａｌｃｉｆｅｒａ核多角体病ウイルス、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ核多角体病ウイルス、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ単一キャプシド核多角体病ウイルス、Ｅｐｉｐｈｙａｓ ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ核多角体病ウイルス、Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ ｃｕｎｅａ核多角体病ウイルス、Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ核多角体病ウイルス、Ｄｈｏｒｉウイルス、Ｔｈｏｇｏｔｏウイルス、Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｐｅｍｙｉ核多角体ウイルス、またはＢａｔｋｅｎウイルスに由来し得る。

レンチウイルス粒子で提供される他の要素は、５’または３’末端のいずれかでのレトロウイルスＬＴＲ（長い末端反復）、レトロウイルス輸出要素、任意選択でレンチウイルス逆応答要素（ＲＲＥ）、そのプロモーターまたは活性部分、及び遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）またはその活性部分を含み得る。

組換えレンチウイルス粒子を生成するための方法は、例えば、米国特許第８，８４６，３８５号；同第７，７４５，１７９号；同第７，６２９，１５３号；同第７，５７５，９２４号；同第７，１７９，９０３号；及び同第６， ８０８， ９０５号など、当該技術分野で論じられている。

使用されるレンチウイルスベクターは、ｐＬＶＸ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＬＪＭ１、ＦＵＧＷ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ、ｐＬＪＭ１－ＥＧＦＰ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２０、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ、ｐＣＷ５７．１、ｐＴＲＰＥ、ｐＥＬＰＳ、ｐＲＲＬ、及びｐＬｉｏｎＩＩから選択され得るが、これらに限定されない。
９． アデノ随伴ウイルス粒子

本開示の調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロード構築物のいずれかのポリヌクレオチドの送達は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用して達成され得る。そのようなベクターまたはウイルス粒子は、既知の血清型キャプシドのいずれかまたは血清型キャプシドの組み合わせを利用するように設計することができる。

ＡＡＶベクターには、一本鎖ベクターだけでなく、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）も含まれる。ｓｃＡＡＶベクターには、二本鎖ベクターゲノムを形成するために一緒にアニーリングするＤＮＡが含まれている。第２の鎖の合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは細胞内での迅速な発現を可能にする。

ｒＡＡＶベクターは、ｓｆ９昆虫細胞、またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞の浮遊細胞培養における三重トランスフェクションなど、当該技術分野における標準的な方法によって製造することができる。

調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロード構築物は、本明細書で教示されるＡＡＶキャプシドにパッケージ化される１つ以上のウイルスゲノムにコードされ得る。

そのようなベクターまたはウイルスゲノムはまた、少なくとも１つまたは２つのＩＴＲ（逆方向末端反復）に加えて、ベクターまたはウイルスゲノムからの発現に必要な特定の調節エレメントを含み得る。そのような調節エレメントは当該技術分野で周知であり、例えば、プロモーター、イントロン、スペーサー、スタッファー配列などが含まれる。

本開示の調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロード構築物は、１つ以上のまたは別個のＡＡＶ粒子で投与することができる。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、１つ以上のＡＡＶ粒子で投与され得る。いくつかの実施形態では、１つを超える調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロードがウイルスゲノムにコードされ得る。

１０．レトロウイルスビヒクル／粒子（γ－レトロウイルスベクター）
いくつかの実施形態では、レトロウイルスビヒクル／粒子は、本開示の調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロード構築物を送達するために使用され得る。レトロウイルスベクター（ＲＶ）は、標的細胞への導入遺伝子の恒久的な組み込みを可能にする。複雑なＨＩＶ－１／２に基づくレンチウイルスベクターに加えて、単純なガンマレトロウイルスに基づくレトロウイルスベクターは、治療遺伝子を送達するために広く使用されており、広範囲の細胞型を形質導入できる最も効率的で強力な遺伝子送達システムの１つとして臨床的に実証されている。ガンマレトロウイルスの例示的な種には、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）が含まれる。

いくつかの実施形態では、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの哺乳動物ガンマレトロウイルスに由来するガンマレトロウイルスベクターは、組換え体である。ガンマレトロウイルスのＭＬＶファミリーには、エコトロピック、アンホトロピック、キセノトロピック、及びポリトロープサブファミリーが含まれる。エコトロピックウイルスは、ｍＣＡＴ－１受容体を使用してマウス細胞にのみ感染することができる。エコトロピックウイルスの例は、モロニーＭＬＶ及びＡＫＶである。両種性ウイルスは、Ｐｉｔ－２受容体を介してマウス、ヒト、その他の種に感染する。両種性ウイルスの一例は４０７０Ａウイルスである。異種指向性ウイルスとポリトロープウイルスは同じ（Ｘｐｒ１）受容体を利用するが、種の親和性が異なる。ＮＺＢ－９－１などの異種指向性ウイルスはヒト及び他の種に感染するが、マウス種には感染しないが、焦点形成ウイルス（ＭＣＦ）などのポリトロピックウイルスはマウス、ヒト及び他の種に感染する。

ガンマレトロウイルスベクターは、レトロウイルスの構造的及び酵素的（ｇａｇ－ｐｏｌ）ポリタンパク質をコードするプラスミド、エンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質をコードするプラスミド、ならびに新たに形成されたウイルス粒子にパッケージされる本開示の組成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクターｍＲＮＡをコードするプラスミドを含むいくつかのプラスミドで細胞を共トランスフェクトすることにより、パッケージング細胞で産生され得る。

いくつかの態様では、組換えガンマレトロウイルスベクターは、他のウイルスからのエンベロープタンパク質で偽型とされる。エンベロープ糖タンパク質は、ウイルス粒子の外側の脂質層に組み込まれており、細胞の指向性を増加／変化させ得る。

いくつかの実施形態では、組換えガンマレトロウイルスベクターは、自己不活化（ＳＩＮ）ガンマレトロウイルスベクターである。ベクターは複製能力がない。ＳＩＮベクターは、最初にエンハンサー／プロモーター活性を含む３’のＵ３領域内に欠失を担持し得る。さらに、５’のＵ３領域は、サイトメガロウイルスまたはＲＳＶに由来する強力なプロモーター（パッケージング細胞株に必要）、または選択した内部プロモーター、及び／またはエンハンサーエレメントで置き換えることができる。内部プロモーターの選択は、本開示の特定の目的に必要な遺伝子発現の特定の要件に従って行うことができる。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロード構築物をコードするポリヌクレオチドは、組換えウイルスゲノム内に挿入される。組換えガンマレトロウイルスベクターのウイルスｍＲＮＡの他の構成要素は、天然に存在する配列の挿入または除去（例えば、ＩＲＥＳの挿入、目的のポリペプチドまたは阻害性核酸をコードする異種ポリヌクレオチドの挿入、野生型プロモーターなどの代わりに、異なるレトロウイルスまたはウイルスからのより効果的なプロモーターのシャッフリング）によって改変し得る。いくつかの例において、組換えガンマレトロウイルスベクターは、改変されたパッケージングシグナル、及び／またはプライマー結合部位（ＰＢＳ）、及び／または５’の長い末端反復（ＬＴＲ）のＵ３領域における５’エンハンサー／プロモーター要素、及び／または３’－ＬＴＲのＵ３領域の改変された３’－ＳＩＮ要素を含み得る。これらの改変により、力価と感染能力が向上し得る。

１１．腫瘍溶解性ウイルスベクター
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、腫瘍溶解性ウイルスにパッケージングされ得る。本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、がん細胞に優先的に感染するか、がん細胞を殺傷するウイルス、例えばワクチンウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、自然に発生するものでもよく、または、腫瘍溶解性アデノウイルス及び腫瘍溶解性ヘルペスウイルスなどの遺伝子改変ウイルスであってもよい。

いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクチンウイルスは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）－コロニー刺激因子（ＣＳＦ）発現、複製能力のあるワクシニアウイルスベクターのウイルス粒子を含み得、腫瘍における細胞の溶解を誘導するのに十分である。例えば、米国特許第９，２２６，９７７号を参照されたい。

１２．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、本開示の調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロードは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として設計され得る。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のポリペプチドをコードし、翻訳されて、インビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボでコードされた目的のポリペプチドを生成することができる任意のポリヌクレオチドを指す。そのようなｍＲＮＡ分子は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２で教示されているもののいずれかの構造的構成要素または特徴を有し得る。

いくつかの実施形態では、エフェクターモジュールは、自己増幅ＲＮＡとして設計され得る。本明細書で使用される場合、「自己増幅ＲＮＡ」は、宿主内で複製することができ、その結果、ＲＮＡ及びＲＮＡによってコードされるタンパク質の量が増加することができるＲＮＡ分子を指す。そのような自己増幅ＲＮＡは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１００５７９９号に教示されているもののいずれかの構造的特徴または構成要素を有し得る。

１３．投与
本開示は、調整可能なタンパク質発現システムの任意の１つ以上の成分または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。これらは、疾患、障害、及び／または状態（例えば、がんまたは自己免疫疾患に関連する疾患、障害、及び／または状態）を予防または治療または画像化するのに有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、活性様式などに応じて変動し得る。

本開示による組成物は、典型的には、投与の容易性及び投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者についての治療上有効、予防上有効、または適切なイメージング用量レベルは、治療される障害、障害の重症度、使用される化合物の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別、及び食事、使用される特定の化合物の投与の時間、投与経路、及び排出率、治療期間、使用される特定の化合物と併用してまたは同時に使用される薬物を含めた様々な因子、ならびに医学分野で周知の同様の因子に依存する。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、Ｔ細胞疲弊を回避し、サイトカイン放出症候群を防止し、そして免疫療法に関連する毒性を最小化するために、様々な用量でがん免疫療法に使用され得る。例えば、本開示の組成物の低用量は、最初に腫瘍量の高い患者を治療するために使用され得、一方、腫瘍量の低い患者は、最小の腫瘍抗原負荷の認識を確実にするために、本開示の組成物の高用量及び反復用量で治療され得る。別の例では、本開示の組成物は、持続性Ｔ細胞シグナル伝達を低減し、インビボでの持続性を増強するために、拍動性の様式で送達され得る。いくつかの態様では、毒性は、高用量を投与する前に、最初に低用量の本開示の組成物を使用することによって最小化され得る。フェリチン、血清Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ６、ＩＦＮ－γ、及びＴＮＦ－αなどの血清マーカーが上昇している場合は、投与量を変更できる。

いくつかの実施形態では、神経毒性は、ＣＡＲまたはＴＩＬ療法に関連する可能性がある。このような神経毒性は、ＣＤ１９－ＣＡＲに関連している可能性がある。毒性は、脳への過剰なＴ細胞浸潤が原因である可能性がある。いくつかの実施形態では、神経毒性は、血液脳関門を通るＴ細胞の通過を防ぐことによって軽減され得る。これは、チサブリ／ナタリズマブなどの内因性アルファ－４インテグリン阻害剤の標的遺伝子欠失によって達成することができ、本開示においても有用であり得る。

同様に、本明細書では、それを必要とする対象への本開示に従う、リガンドまたはＤＲＤリガンドを投与する方法が提供される。リガンドは、本開示の調整可能なタンパク質発現システム、ＤＲＤ、またはペイロードを調整するのに有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して、対象または細胞に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、活性様式などに応じて変動し得る。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であり得る。本開示による組成物は、典型的には、投与の容易性及び投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。特定の実施形態では、本開示によるリガンドは、所望の効果を得るために、１日あたり１回または複数回、１日あたり、対象体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで投与され得る。いくつかの実施形態では、投与量レベルは、所望の効果を得るために、１日あたり１回または複数回、１日あたり、対象体重の１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ，１４０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｋｇであり得る。

本開示は、本明細書に記載のリガンドのいずれかを細胞または組織に送達するための方法であって、細胞または組織を当該リガンドと接触させることを含み、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで達成することができる方法を提供する。特定の実施形態では、本開示によるリガンドは、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約５０ｎＭ、約１０ｎＭ～約１００ｎＭ、約５０ｎＭ～約５００ｎＭ、約１００ｎＭ～約１０００ｎＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約５μＭ～約５０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約２５μＭ～約２５０μＭ約５０μＭ～約５００μＭを送達するのに十分な投与量レベルで細胞に投与され得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、０．０００６４μＭ、０．００３２μＭ、０．０１６μＭ、０．０８μＭ、０．４μＭ、１μＭ、２μＭ、１０μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、１７５μＭ、２００μＭ、２５０μＭから選択されるがこれらに限定されない用量で細胞に投与され得る。

本開示のリガンドの所望の投与量は、１回のみ、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達することができる。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。複数回投与が採用される場合、本明細書に記載されるような分割投与レジメンが使用され得る。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、「単一単位用量」または総日用量を２つ以上の用量、例えば「単一単位用量」の２回以上の投与に分割することである。本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」とは、１用量／一度／単一経路／単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。本開示のリガンドの所望の投与量は、「パルス投与量」または「連続流」として投与することができる。本明細書で使用される場合、「パルス用量」は、ある期間にわたって設定された頻度で投与される任意の治療薬の一連の単一単位用量である。本明細書で使用される場合、「連続フロー」は、単一の経路／単一の接触点、すなわち連続投与事象において一定期間連続的に投与される治療薬の用量である。２４時間で投与されるか処方される量である総１日用量は、これらの方法のいずれかによって、またはこれらの方法の組み合わせとして、または医薬投与に適した他の任意の方法によって投与され得る。

１４．投与
いくつかの実施形態では、がん免疫療法または自己免疫疾患の治療のための組成物は、エクスビボで細胞に投与され得、その後、対象に投与され得る。免疫細胞は、当該技術分野で知られている様々な方法を使用して、エクスビボで単離及び拡大させることができる。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を単離する方法は、米国特許第６，８０５，８６１号及び同第６，５３１，４５１号に記載されている。ＮＫ細胞の単離は、米国特許第７，４３５，５９６号に記載されている。

いくつかの実施形態では、細胞の性質に応じて、細胞は、注射、輸血、注入、局所点滴注入、または移植を含む多種多様な方法で、宿主生物、例えば哺乳動物に導入され得る。いくつかの態様では、本開示の細胞は、腫瘍の部位に導入され得る。使用される細胞の数は、いくつかの状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコール、例えば、投与の数、細胞が増殖する能力などに依存するであろう。細胞は、生理学的に許容される媒体中に存在し得る。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、疾患または状態を有する対象に複数の用量で投与され得る。投与は、一般に、がんまたは臨床状態の１つ以上の症状の改善をもたらし、及び／またはがんまたは臨床状態またはその症状を治療または予防する。

１５．送達経路
本開示の医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、ベクター、及び細胞は、治療上有効な結果を達成するために任意の経路で投与することができる。これらとしては、経腸（腸内）、胃腸、硬膜外（硬膜内）、経口（口経由）、経皮、硬膜外、脳内（大脳内）、脳室内（脳室へ）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚自体へ）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻から）、静脈内（静脈内）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈内）、筋肉内（筋肉内）、心臓内（心臓内）、骨内注入（骨髄内）、髄腔内（脊髄管内）、腹腔内（腹腔内への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内、（眼を通して）、海綿体内注射（病的空洞へ）、腔内（陰茎の基部へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためのインタクトな皮膚からの拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、経膣、吹送（鼻息）、舌下、陰唇下、浮腫、点眼（結膜上）、点耳、耳介（耳内または耳経由）、頬（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯科（１つまたは複数の歯に）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨内）、尾側（馬尾内）、嚢内（大槽小脳延髄内）、角膜内（角膜内）、歯角膜内、冠状動脈内（冠状動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の拡張可能な空間内）、椎間板内（椎間板内）、管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内または硬膜下）、表皮内（表皮まで）、食道内（食道まで）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（小腸の遠位部分内）、病変内（限局性病変内または局所病変に直接導入される）、管腔内（管の内腔内）、リンパ内（リンパ内）、髄内（骨の骨髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、心筋内（心筋内）、眼内（眼内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺またはその気管支内）、鼻腔内（鼻または眼窩周囲洞）、脊髄内（脊柱内）、滑膜内（関節の滑膜腔内）、腱内（腱内）、精巣内（睾丸内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルでの脳脊髄液内）、胸腔内（胸部内）、細管内（臓器の細管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（耳中膜内）、血管内（１つまたは複数の血管内）、脳室内（脳室内）、イオントフォレーシス（可溶性塩のイオンが体の組織に移動する電流による）、洗浄（開いた傷や体の空洞を浸すか洗い流すため）、喉頭（喉頭に直接）、鼻胃（鼻を通って胃）、閉塞性ドレッシング技術（局所経路投与、その後、その領域を閉塞する包帯で覆われる）、眼科（外眼）、中咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身効果のために経口または鼻から吸入することにより気道内）、眼球後部（脳橋の後ろまたは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通ってまたは横切って）、経気管（気管の壁を通って）、経鼓膜（喉頭腔を横切ってまたは通り抜ける）、尿管（尿管まで）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨麻酔、診断、神経ブロック、胆道灌流、心臓灌流、体外循環光療法、または脊髄が挙げられるが、これらに限定されない。

１６．非経口及び注射可能な投与
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、ベクター、及び細胞は、非経口的に投与され得る。経口及び非経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及び／またはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物などの可溶化剤及び乳化剤など、当該技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤以外に、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味剤、香味剤、及び香料等のアジュバントを含むことができる。非経口投与の特定の実施形態では、組成物は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／またはそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。他の実施形態では、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤が含まれる。

注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、及び／または懸濁剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用製剤は、例えば１，３－ブタンジオール溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤及び／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、及び／またはエマルジョンであり得る。使用され得る許容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ、及び生理食塩液である。滅菌の不揮発性油が、従来、溶媒または懸濁媒体として使用されている。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油が使用され得る。オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用することができる。

注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通しての濾過により、及び／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散できる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。

１７．検出可能な薬剤及び標識
本開示の調整可能なタンパク質発現システム、核酸、ポリヌクレオチド、ペイロード、ベクター、及び細胞は、１つ以上の放射性薬剤または検出可能な薬剤に関連するか、またはそれらに結合し得る。

これらの薬剤には、様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素または酵素基質、蛍光物質、発光物質（例えば、ルミノール）、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリン）、化学発光物質、放射性物質（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ、または９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４－）として）、ならびに造影剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）、超小型超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ））、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ－ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ素化造影剤（イオヘキソール）、マイクロバブル、またはパーフルオロカーボン）が含まれる。

いくつかの実施形態では、検出可能な薬剤は、活性化時に検出可能となる検出不可能な前駆体（例えば、蛍光発生テトラジン－フルオロフォア構築物（例えば、テトラジン－ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、テトラジン－オレゴングリーン４８８、またはテトラジン－ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ－Ｘ）または酵素活性化可能な蛍光発生剤（例えば、ＰＲＯＳＥＮＳＥ（登録商標）（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）））であり得る。酵素標識組成物を使用できるインビトロアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及びウエスタンブロット解析が含まれるが、これらに限定されない。

１８． 適用及び使用
本開示の調整可能なタンパク質発現システム、構築物、リガンド、または組成物は、治療、診断及び予後、バイオエンジニアリング、バイオプロセシング、バイオ製造、研究試薬、メタボロミクス、遺伝子発現、酵素補充などを含むがこれらに限定されない多種多様な用途で利用され得る。

本開示は、組成物、例えば、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

例えば、科学的研究のための細胞株及び試薬を生成するために、医学的治療を伴わないいくつかの使用があり得るが、１つの使用は、インビボ遺伝子治療または養子細胞療法、例えば、がん、自己免疫疾患及び他の疾患の治療のための改変細胞を生成するための本開示の組成物の投与を含む。それを必要とする対象における疾患、状態、または障害の医学的治療または予防の例示的な方法において、（ａ）細胞の集団（ヒト、動物、初代または細胞培養のいずれか、自家、同種、または同系を含む）を提供するステップと；（ｂ）細胞集団中の少なくとも１つの細胞に少なくとも１つの核酸分子を導入するステップであって、少なくとも１つの核酸分子が（ｉ）疾患を治療するための目的のタンパク質をコードする第１の核酸配列、及び薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２の核酸配列を含み、ペイロード核酸配列は、疾患を治療する目的のタンパク質をコードするＤＲＤ核酸配列に作動可能に連結されている第１のポリヌクレオチドを含む、ステップと；（ｃ）細胞を対象に送達するステップと；（ｄ）細胞内で目的のタンパク質の発現を可能にするのに十分にＤＲＤを安定化するリガンドを対象に投与するステップであって、目的のタンパク質の発現が、対象におけるリガンドの存在によって制御され、リガンド投与の量及び／または期間は、疾患を治療するために、治療有効量の目的のタンパク質を生成するのに十分であるステップと、を含み得る。

上述の方法では、目的のタンパク質を使用して、疾患、状態、または障害の１つ以上の症状を改善、治癒、予防、または軽減することができる。

本開示の組成物は、これらは、疾患、障害、及び／または状態（例えば、作業記憶障害に関連する疾患、障害、及び／または状態）を予防または治療または画像化するのに有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、活性様式などに応じて変動し得る。

本開示による組成物は、典型的には、投与の容易性及び投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の対象についての具体的な治療上有効、または適切なイメージング用量レベルは、治療される障害、障害の重症度、使用される化合物の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別、及び食事、使用される特定の化合物の投与の時間、投与経路、及び排出率、治療期間、使用される特定の化合物と併用してまたは同時に使用される薬物を含めた様々な因子、ならびに医学分野で周知の同様の因子に依存する。

１つ以上の安定化リガンド（本明細書で使用される場合、ＤＲＤを安定化するリガンドは、安定化リガンドまたは単にリガンドと呼ばれ得り、リガンドは本開示による調整可能なタンパク質発現システムにおいて使用されるＤＲＤを安定化するのに効果的であるという理解で）をそれを必要とする対象に投与する方法も本明細書で提供される。リガンドは、調整可能なタンパク質発現システムで形質転換された細胞において本開示の目的のタンパク質の量を調整するのに有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して、対象または細胞に投与することができる。必要とされる安定化リガンドの正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、活性様式などに応じて変動し得る。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であり得る。

Ｃ．治療的使用
１．がん免疫療法
がん免疫療法は、がんに対する免疫系の反応性の誘導または回復を目的としている。免疫療法研究の重要な進歩により、能動免疫療法と受動免疫療法に大まかに分類できるさまざまな戦略が開発された。一般に、これらの戦略は、がん細胞を直接殺すため、または免疫抑制性腫瘍微小環境に対抗するために利用することができる。能動免疫療法は、内因性で長期的な腫瘍抗原特異的免疫応答の誘導を目的としている。応答は、サイトカインなどの免疫応答修飾因子の非特異的刺激によってさらに増強することができる。対照的に、受動免疫療法には、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞または抗体などのエフェクター免疫分子を宿主に投与するアプローチが含まれる。このアプローチは短命であり、複数のアプリケーションが必要である。

重要な進歩にもかかわらず、現在の免疫療法戦略の有効性は、関連する毒性によって制限されている。これらは、免疫療法に関連する狭い治療ウィンドウに関連していることが多く、臨床的に意味のある治療効果を得るために、治療用量を潜在的に致命的な毒性の端まで押し上げる必要性から部分的に現れる。さらに、養子移入された免疫細胞が患者内で増殖し続けるため、用量はインビボで拡大し、しばしば予測できない。

免疫療法に伴う主なリスクは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の正常な組織発現に応答した、Ｔ細胞の活性化に起因するオンターゲットであるが腫瘍外である副作用である。特異的なＴＡＡに対してＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を利用した臨床試験では、免疫療法に反応した皮膚の発疹、大腸炎、難聴が報告された。

免疫療法はまた、免疫療法に応答して腫瘍細胞が殺傷されたときに現れるオンターゲットの腫瘍上毒性を生み出す可能性がある。有害作用には、腫瘍崩壊症候群、サイトカイン放出症候群、及び関連するマクロファージ活性化症候群が含まれる。重要なことに、これらの有害作用は腫瘍の破壊中に発生する可能性があり、したがって腫瘍上免疫療法が成功したとしても毒性をもたらす可能性がある。したがって、免疫療法薬の調節を介して免疫療法を制御するアプローチは、毒性を低減し、有効性を最大化するため、非常に望ましい。

本開示は、がん免疫療法のためのシステム、組成物、免疫療法薬、及び方法を提供する。これらの組成物は、免疫療法における遺伝子発現及び機能の調整可能な調節を提供する。一態様では、本開示のシステム、組成物、免疫療法薬、及び他の成分は、別個に添加された安定化リガンドによって制御することができ、これは、がん免疫療法を制御するための顕著な柔軟性を提供する。さらに、本開示のシステム、組成物、及び方法はまた、化学療法剤、小分子、遺伝子治療、及び抗体などの治療薬と組み合わせることができる。

本開示のシステム及び組成物の調整可能な性質は、免疫療法の効力及び有効期間を改善する可能性を有する。本開示の組成物を使用して養子移植された細胞の生物活性を可逆的にサイレンシングすることにより、取り返しのつかないほど殺傷したり治療を終了したりすることなく、細胞治療の可能性を最大化することができる。

本開示は、患者への投与後の免疫療法の微調整のための方法を提供する。これにより、免疫療法の安全性と有効性が向上し、免疫療法の恩恵を受ける可能性のある対象集団が増加する。

いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞または腫瘍浸潤腫瘍細胞であり得、免疫細胞は、第２のペイロード、例えば、本明細書で教示される抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（ＣＡＲ Ｔ細胞として知られる）に加えてＣＤ４０Ｌを発現するように改変される。したがって、ＣＤ４０ＬとＣＡＲシステム（またはＴＣＲ）の両方をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、またはＤＲＤに作動可能に連結されたＣＤ４０Ｌペイロードをコードする第１のポリヌクレオチド及び異なるペイロード、例えば本明細書に記載の抗原特異的Ｔ細胞または抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２のポリヌクレオチドは、ＣＤ４０Ｌに連結されたＤＲＤと同じまたは異なるＤＲＤに連結され得る。いくつかの実施形態では、本開示の調整可能なタンパク質発現システムは、第１のＤＲＤに連結されたＣＤ４０Ｌをコードする第１のポリヌクレオチドと、第１のＤＲＤまたは任意選択で第２の異なるＤＲＤに作動可能に連結された第２のペイロード、例えば、抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含み得る。第２のペイロードはＤＲＤに連結されていなくてもよく、形質転換またはトランスフェクトされた細胞で発現され得る。様々な実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチドは、単一のベクターに存在し得るか、または２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、２つの異なるベクターに別々に存在し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌ及び第２のペイロードが同じポリヌクレオチドによってコードされる場合、第２のペイロードは、ＤＲＤに作動可能に連結され得るか、またはそれは、ＣＤ４０Ｌとは独立して発現され得、いかなるＤＲＤにも連結され得ず、ＩＲＥＳまたは他の何らかの転写終止シグナルによって、ＣＤ４０Ｌ及び／またはＤＲＤから分離され得、これにより、第２のペイロードの翻訳及び発現は、ＤＲＤに作動可能に連結されたＣＤ４０Ｌペイロードの翻訳及び発現とは独立している。次いで、１つ以上のベクターを、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、または腫瘍浸潤腫瘍細胞に導入することができる。

関連する実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲの細胞外標的化部分を介して特定の抗原に結合し、それにより、細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を介したシグナルがＴ細胞に伝達され、その結果、Ｔ細胞が活性化される。活性化されたＣＡＲ Ｔ細胞は、細胞傷害性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、及びリンホトキシンなど）の放出、細胞増殖速度の改善、細胞表面分子の変化などを含むその挙動を変化させる。このような変化は、ＣＡＲまたはＴＣＲによって認識される抗原を発現する標的細胞の破壊を引き起こす。さらに、サイトカインの放出または細胞表面分子の変化は、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを刺激する。

関連する例示的な実施形態では、Ｔ細胞に導入されるＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ζからの細胞内シグナル伝達ドメインのみを含む第１世代のＣＡＲ、またはＴＣＲ ＣＤ３ζからの細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第２世代のＣＡＲ、またはＴＣＲ ＣＤ３ζからの細胞内シグナル伝達ドメインと２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む第３世代のＣＡＲ、またはスプリットＣＡＲシステム、またはオン／オフスイッチＣＡＲシステムであり得る。一例では、ＣＤ４０Ｌ、ＣＡＲ、またはＴＣＲの発現は、作動可能に連結されたＤＲＤの安定化によって制御され、安定化リガンドがない場合、ペイロード、すなわちＣＡＲまたはＴＣＲの蓄積はほとんどないかまたはまったくない。これらの例では、２つ以上のペイロードが同じＤＲＤまたは異なるＤＲＤに連結され得るか、または２つのペイロードのうちの１つがＤＲＤによって制御されないものであり得る。

目的のペイロードはＤＲＤに作動可能に連結されているため、安定化リガンドがないと、対象のタンパク質はほとんどまたはまったく生成されない。調整可能なタンパク質発現システムで形質転換された細胞に安定化リガンドを投与すると、ＤＲＤに連結されたペイロードが安定化され、目的のタンパク質が細胞内に蓄積されるようになる。いくつかの例示的な実施形態では、ＤＲＤ安定化リガンドの存在または非存在は、形質導入されたＴ細胞またはＮＫ細胞におけるＣＡＲまたはＴＣＲ発現を調整するために使用される。様々な実施形態では、ペイロードは、シグナル配列、リーダー配列、切断部位、または目的のタンパク質がその蓄積後に細胞内のＤＲＤから分離されることを可能にするいくつかの他のペプチドまたはポリペプチド配列または配列に任意選択で連結され得る。

いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞は、別の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の免疫療法薬を発現するようにさらに改変され得る。免疫療法薬は、異なる標的分子に特異的な別のＣＡＲもしくはＴＣＲ；ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、及びＩＬ１８などのサイトカイン、またはＩＬ１５Ｒａなどのサイトカイン受容体；抑制性シグナルを刺激性シグナルに変換するキメラスイッチ受容体；腫瘍組織などの標的に養子移植された細胞を誘導するホーミング受容体；免疫細胞の代謝を最適化する薬剤；または養子細胞移植後に重篤な事象が観察された場合、もしくは移植された免疫細胞が不要になった場合に、活性化Ｔ細胞を殺傷する安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）であってよい。これらの分子は、同じエフェクターモジュールまたは別々のエフェクターモジュールに含まれていてもよい。

一実施形態では、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＣＲ Ｔ細胞を含む）は、ＣＡＲペイロードと、同じまたは同じかまたは異なるＤＲＤに作動可能に連結されたＣＤ４０Ｌをコードする同じかまたは異なるポリヌクレオチド配列のいずれかと、を含む、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上で形質転換された「アームド」ＣＡＲ Ｔ細胞であり得る。誘導性または構成的に分泌される活性サイトカインは、効果と持続性を改善するためにＣＡＲＴ細胞をさらに武装させる。この文脈において、そのようなＣＡＲ Ｔ細胞は、「アーマードＣＡＲ Ｔ細胞」とも呼ばれる。「アーマー」分子は、腫瘍の微小環境及び自然免疫系及び適応免疫系の他の要素に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、分子は、さまざまなメカニズムによる敵対的な腫瘍微小環境に直面して、ＣＡＲ Ｔ細胞の効力及び持続性をさらに増強することが示されているＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、Ｉ型ＩＦＮ、ＣＤ４０Ｌ、及び４－１ＢＢＬなどの刺激因子であり得る。

一実施形態では、任意の記載された目的のペイロードまたはタンパク質（交換可能に使用される）の発現レベル及び活性を調整する調整可能なタンパク質発現システム、及びその構成要素を免疫療法に使用することができる。非限定的な例として、免疫療法薬は、抗体及びその断片及びバリアント、がん特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びそのバリアント、抗腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、共抑制受容体またはリガンドの阻害剤、共刺激受容体及びリガンドのアゴニスト、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、可溶性増殖因子、代謝因子、自殺遺伝子、ホーミング受容体、または細胞及び対象において免疫応答を誘導する任意の薬剤であり得る。

いくつかの実施形態では、免疫応答を誘導または抑制するための組成物は、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素、または調整可能なタンパク質発現システムによってコードされる１つ以上のポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、ペイロードをコードする第１の核酸配列を含む第１のポリヌクレオチドと、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２の核酸配列と、を含み得る。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システム、及び本開示の組成物は、例えば、免疫療法薬の抗腫瘍免疫応答を含む、調整可能なタンパク質発現（目的のタンパク質またはペイロード）機能に関する。いくつかの実施形態では、免疫治療薬は、サイトカイン、ケモカイン、抗体、インテグリン、細胞膜内タンパク質、膜タンパク質、細胞外タンパク質、例えば、ＣＤ４０Ｌを含み得、これらは、１つ以上の免疫細胞型の機能を上方制御または改善するために、あるいは１つ以上の免疫細胞型の活性を下方制御するために、使用され得る。様々な実施形態では、疾患、状態、または障害の治療に有用な免疫療法薬は、単独で、または他のサイトカイン、ケモカイン、抗体、インテグリン、細胞膜内タンパク質、膜タンパク質、細胞外タンパク質と組み合わせて、ＣＤ４０Ｌを含み得る。様々な実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、疾患、状態、もしくは障害、またはこれらのいずれかに関連する症状を治療するのに有用な１つ以上の免疫細胞型の寿命及び活性を促進または上方制御するＣＤ４０Ｌを含む目的のタンパク質またはペイロードを提供する。

２．養子細胞移植（養子免疫療法）
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのペイロード、例えば、ＤＲＤに作動可能に連結されたＣＤ４０Ｌをコード化及び発現するように遺伝子改変された細胞の制御された発現は養子細胞療法（ＡＣＴ）に使用され得る。本明細書で使用される場合、養子細胞移植は、直接的な抗がん活性を有する免疫細胞（自家、同種異系または遺伝子改変された宿主からの）の投与を指す。ＡＣＴは、悪性及び感染症に対する臨床応用において有望であることが示されている。

本開示によれば、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素は、養子細胞療法などの細胞療法の開発及び実施において使用され得る。いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素は、ＣＡＲ療法を実施するための細胞療法、ＴＩＬの操作または制御、同種異系細胞療法、他の治療ライン（例えば、放射線、サイトカイン）とのＴ細胞療法の組み合わせ、操作されたＴＣＲ、または改変されたＴＣＲをコード化するため、またはＴＣＲ以外のＴ細胞を増強するため（例えば、サイトカイン遺伝子、チェックポイント阻害剤ＰＤ１、ＣＴＬＡ４の遺伝子を導入することによって）に、使用することができる。

本明細書で提供されるのは、養子細胞療法で使用するための方法である。この方法は、それを必要とする対象を前処理することと、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素、及び／または本開示の組成物で免疫細胞を調節することと、本開示の組成物を発現する操作された免疫細胞を対象に投与することと、対象内の操作された細胞の生着の成功と、を含む。

いくつかの実施形態では、本開示の制御可能なタンパク質発現システム及び組成物は、養子細胞療法に関連するプレコンディショニングレジメンを最小化するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「プレコンディショニング」は、養子細胞療法の結果を改善するために対象に投与される任意の治療レジメンを指す。プレコンディショニング戦略には、全身照射及び／またはリンパ枯渇化学療法が含まれるが、これらに限定されない。プレコンディショニングなしの養子療法の臨床試験は、臨床的利益を実証することができず、ＡＣＴにおけるその重要性を示している。それにもかかわらず、プレコンディショニングは重大な毒性と関連しており、ＡＣＴに適した対象コホートを制限する。場合によっては、プレコンディショニングの必要性を減らすために、ＡＣＴのための免疫細胞は、本開示の安定化リガンドを使用して調整することができる目的のタンパク質の選択的発現を可能にする本明細書に記載の調整可能なタンパク質発現構築物を使用して、ＣＤ４０Ｌを単独で、またはＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ１２、及びＩＬ１５などのサイトカインとともにペイロードとして発現する。

いくつかの実施形態では、ＡＣＴのための免疫細胞は、樹状細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ヘルパーＴ細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、及びそれらの任意の組み合わせであり得る。他の実施形態では、ＡＣＴのための免疫刺激細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成され得る。いくつかの実施形態では、自家または同種異系の免疫細胞がＡＣＴに使用される。

いくつかの実施形態では、ＡＣＴに使用される細胞は、抗原提示細胞、例えば、ＣＤ４０Ｌを単独で、または目的の腫瘍細胞上の抗原に特異的な抗原結合ドメインを含むＣＡＲと組み合わせて発現するように操作された樹状細胞及びＴ細胞であり得る。他の実施形態では、ＡＣＴに使用される細胞は、ＣＤ４０Ｌを単独で、または養子免疫療法に使用され得るサイトカインまたはＣＡＲと組み合わせて発現するように操作されたＮＫ細胞であり得る。一例では、樹状細胞、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の混合物をＡＣＴに使用することができる。本開示によると、抗原提示細胞、Ｔ細胞、及び／またはＮＫ細胞におけるＣＤ４０Ｌの発現レベルは、ペイロード、例えば、ＣＤ４０Ｌに作動可能に連結されたＤＲＤ（複数可）に結合する小分子によって調整及び制御される。これは、形質転換された抗原提示細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞において、単独で、または他のペイロード、例えば、ペイロードとしてのＣＡＲまたはサイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ１２及びＩＬ１５と組み合わせて、ＣＤ４０Ｌの選択的発現を可能にする。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を発現するように操作されたＮＫ細胞をＡＣＴに使用することができる。ＮＫ細胞の活性化は、標的細胞にパーフォリン／グランザイム依存性アポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞の活性化は、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－α、及びＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカイン分泌も誘導する。これらのサイトカインは、マクロファージの食作用機能とその抗菌活性を高め、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞による抗原提示の上方制御を介して適応免疫応答を増強する。

遺伝子改変の他の例には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の導入及びＮＫＧ２Ａなどの抑制性ＮＫ細胞受容体の下方制御を含み得る。

ＮＫ細胞はまた、腫瘍細胞との相互作用の際にＮＫ細胞阻害シグナルを回避するように遺伝的に再プログラムされ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、またはＴＡＬＥＮを使用してＮＫ細胞を遺伝子改変し、それらの阻害性受容体をサイレンシングすると、ＮＫ細胞の抗腫瘍能を増強できる。

免疫細胞は、当該技術分野で知られている様々な方法を使用して、エクスビボで単離及び拡大することができる。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞を単離及び拡大する方法は、米国特許第６，８０５，８６１号及び第６，５３１，４５１号；米国特許公開番号ＵＳ２０１６０３４８０７２Ａ１及び国際特許公開番号ＷＯ２０１６１６８５９５Ａ１に記載され、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＮＫ細胞の単離及び拡大は、米国特許公開第ＵＳ２０１５０１５２３８７Ａ１号、米国特許第７，４３５，５９６号、及びＯｙｅｒ， Ｊ．Ｌ． （２０１６）． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １８（５）：６５３－６３に記載され、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、ヒト初代ＮＫ細胞は、フィーダー細胞、例えば、膜結合ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１２、及び４－１ＢＢＬを発現するように遺伝子改変された骨髄性細胞株の存在下で拡大し得る。

場合によっては、免疫細胞のサブ集団がＡＣＴに富んでいてもよい。免疫細胞濃縮の方法は、国際特許公開番号ＷＯ２０１５０３９１００Ａ１に記載されている。別の例では、Ｂ及びＴリンパ球減衰マーカーＢＴＬＡに陽性のＴ細胞を使用して、米国特許第９，５１２，４０１号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗がん反応性であるＴ細胞を濃縮することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＣＴのための免疫細胞は、Ｔ細胞拡大を増強するために、選択されたサブ集団を枯渇できる。例えば、免疫細胞は、米国特許公開ＵＳ２０１６０２９８０８１Ａ１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている方法を使用して、抗腫瘍免疫応答を最小化するために、Ｆｏｘｐ３＋Ｔリンパ球を枯渇させることができる。。

いくつかの実施形態では、ＡＣＴのためのＴ細胞の活性化及び拡大は、細胞表面上で一過性に発現されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原刺激で達成する。そのような活性化方法は、国際特許ＷＯ２０１７０１５４２７に開示され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合する抗原によって活性化され得る。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、抗原特異的または非特異的である樹状細胞、マクロファージ、またはＢ細胞であり得る。ＡＰＣは、臓器内で自家または同種であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＰＣは、細胞ベースのａＡＰＣまたは無細胞ａＡＰＣなどの人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であり得る。細胞ベースのａＡＰＣは、ヒト赤白血病細胞などの遺伝子改変同種異系細胞、またはマウス線維芽細胞及びショウジョウバエ細胞などの異種細胞のいずれかから選択することができる。代替的に、ＡＰＣは無細胞であってよく、抗原または共刺激ドメインは、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ、脂質小胞、またはエクソソームなどの合成表面に提示される。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞、具体的には、Ｔ細胞は、人工細胞プラットフォームを使用して拡大され得る。一実施形態では、成熟Ｔ細胞は、Ｓｅｅｔ ＣＳ ｅｔ ａｌ． ２０１７． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４， ５２１－５３０（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）を使用して生成され得る。ＡＴＯは、標準的なノッチリガンド（ＤＬＬ１）のようなデルタを発現する間質細胞株に基づいている。この方法では、間質細胞を遠心分離によって造血幹細胞及び前駆細胞と凝集させ、気液界面の細胞培養インサートに配置してオルガノイド培養を生成する。ＡＴＯ由来のＴ細胞は、ナイーブな表現型、多様なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリー、及びＴＣＲ依存性機能を示す。

いくつかの実施形態では、養子細胞療法は、自家移植によって実施され、細胞は、治療を必要とする対象に由来し、単離及び処理後の細胞は、同じ対象に投与される。他の例では、ＡＣＴは、細胞が、最終的に細胞治療を受けるレシピエント対象以外のドナー対象から単離及び／または調製される同種異系移入を含み得る。ドナーとレシピエントの対象は、遺伝的に同一であるか類似しているか、または同じＨＬＡクラスまたはサブタイプを発現していてもよい。

いくつかの実施形態では、ＡＣＴのために免疫細胞（例えば、樹状細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞）に導入される複数の免疫療法薬は、同じまたは異なる調整可能なタンパク質発現システムによって制御され得る。一例では、２つのペイロード、例えば、ＣＤ４０Ｌペイロード及びＣＤ１９ ＣＡＲペイロードなどのＣＡＲ構築物のそれぞれは、同じまたは異なる調整可能なタンパク質発現システム上の１つ以上のＤＲＤによって制御される。いくつかの関連する実施形態では、ペイロードは、同じまたは異なるＤＲＤに連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、ＤＲＤに作動可能に連結され、ＣＤ１９ ＣＡＲなどのＣＡＲ構築物は、ＣＤ４０Ｌの上流または下流に配置され、いかなるＤＲＤにも連結されないか、あるいはＣＤ１９ ＣＡＲなどのＣＡＲ構築物は、細胞に導入され、第１のペイロードをコードするヌクレオチド配列とは別個のヌクレオチド配列によってコードされ、第２のペイロードは、ＣＤ４０Ｌに連結されたＤＲＤと同じまたは異なるＤＲＤにリンクされ得るか、あるいは任意のＤＲＤへの連結がなくてもよい。ペイロードは、ＤＲＤ（複数可）がＤＲＤ（複数可）に特異的な安定化リガンドで安定化されると、転写、翻訳、及び発現される。ＣＤ４０Ｌならびに任意選択で第２のペイロード、例えば、ＩＬ１２及び／またはＣＤ１９ ＣＡＲの発現は、１つ以上の安定化リガンドを使用して調整することができる。他の実施形態では、ＡＣＴのために免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）に導入される複数の免疫療法薬は、異なる調整可能なタンパク質発現システムによって制御され得る。一例では、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ１９ ＣＡＲなどのＣＡＲ構築物は、それぞれが異なるＤＲＤに作動可能に連結され得、それにより、異なる刺激を使用して別々に調整され得る。

調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素及び本開示の組成物を使用する遺伝子調節に続いて、細胞は、それを必要とする対象に投与される。養子細胞療法のための細胞の投与方法は知られており、提供された方法及び組成物に関連して使用することができる。

いくつかの実施形態では、ＡＣＴのための免疫細胞は、免疫細胞の活性化、浸潤、拡大、生存、及び抗腫瘍機能を促進する１つ以上の免疫療法薬（目的のタンパク質）を発現するように改変され得る。免疫療法薬は、異なる標的分子に特異的な第２のＣＡＲもしくはＴＣＲ；サイトカインもしくはサイトカイン受容体；抑制性シグナルを刺激性シグナルに変換するキメラスイッチ受容体；腫瘍組織などの標的に養子移植された細胞を誘導するホーミング受容体；免疫細胞の代謝を最適化する薬剤；または養子細胞移植後に重篤な事象が観察された場合、もしくは移植された免疫細胞が不要になった場合に、活性化Ｔ細胞を殺傷する安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）であってよい。

いくつかの実施形態では、養子細胞移植に使用される免疫細胞は、全体として、がん患者において腫瘍を殺傷するそれらの能力をさらに改善することを目的として、それらの持続性、細胞傷害性、腫瘍標的化能力、及びインビボで疾患部位に帰巣する能力を改善するために遺伝的操作することができる。一例は、ガンマサイトカイン（例えば、ＩＬ２及びＩＬ１５）などのサイトカインをコードする本開示の調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を免疫細胞に導入して、免疫細胞の増殖及び生存を促進することである。調整可能なタンパク質発現システムによってコードされるサイトカイン遺伝子（例えば、ガンマサイトカインＩＬ２及びＩＬ１５）の免疫細胞への形質導入は、免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞が外因性サイトカインを添加することなく増殖することを可能にし、その結果、サイトカイン発現ＮＫ細胞は増強された腫瘍細胞傷害性を有する。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を利用して、Ｔ細胞の疲弊を防ぐことができる。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞疲弊」は、慢性Ｔ細胞活性化によって引き起こされるＴ細胞機能の段階的かつ進行性の喪失を指す。Ｔ細胞疲弊は、抗ウイルス及び抗腫瘍免疫療法の有効性を制限する主要な要因である。疲弊したＴ細胞は、アポトーシス率が高く、複数の抑制性受容体の表面発現が高いと同時に、増殖能とサイトカイン産生能が低くなっている。疲弊をもたらすＴ細胞の活性化は、抗原の存在下または非存在下のいずれかで発生し得る。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システム及びそれらの構成要素は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）との関連で、Ｔ細胞疲弊を防ぐために利用され得る。これに関連して、場合によっては、疲弊は、ＣＡＲの細胞内ドメインの継続的な活性化をもたらす細胞表面上のＣＡＲのｓｃＦｖのオリゴマー化によって引き起こされ得る。非限定的な例として、本開示のＣＡＲは、オリゴマー化することができないｓｃＦｖを含み得る。別の非限定的な例として、抗原曝露後に急速に内在化及び再発現されるＣＡＲもまた、細胞表面での慢性的なｓｃＦｖのオリゴマー化を防ぐために選択され得る。一実施形態では、ｓｃＦｖのフレームワーク領域は、構成的ＣＡＲシグナル伝達を防止するように改変され得る（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１４． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ７４（１９） Ｓ１；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本開示の調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を使用して、Ｔ細胞表面上のＣＡＲの表面発現を制御して、慢性Ｔ細胞活性化を防止することもできる。本開示のＣＡＲはまた、疲弊を最小限に抑えるように設計され得る。非限定的な例として、４１－ＢＢシグナル伝達ドメインをＣＡＲ設計に組み込んで、Ｔ細胞の疲弊を改善することができる。いくつかの実施形態では、Ｌｏｎｇ ＨＡらによって開示された戦略のいずれかを使用して疲弊を防ぐことができる（ （Ｌｏｎｇ Ａ Ｈ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１， ５８１－５９０；その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

いくつかの実施形態では、本開示の調整可能なタンパク質発現システムの調整可能な性質を利用して、持続性ＣＡＲシグナル伝達で観察されるヒトＴ細胞の枯疲弊を逆転させることができる。本開示の組成物を使用して養子移植された細胞の生物活性を可逆的にサイレンシングすることは、持続性シグナル伝達を逆転させるために使用され得、これは次に、Ｔ細胞を再活性化し得る。疲弊の逆転は、疲弊に関連する複数の抑制性受容体の下方制御によって測定し得る。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞代謝経路は、疲弊に対するＴ細胞の感受性を減少させるように改変され得る。代謝経路には、解糖、尿素回路、クエン酸回路、ベータ酸化、脂肪酸生合成、ペントースリン酸経路、ヌクレオチド生合成、及びグリコーゲン代謝経路が含まれ得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、解糖の速度を低下させるペイロードを利用して、Ｔ細胞の疲弊を制限または防止することができる（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３， １（Ｓｕｐｐｌ １）： Ｐ２１；その内容は参照によりその全体が組み込まれる）。一実施形態では、本開示のＴ細胞は、２－デオキシグルコース、及びラパマイシンなどの解糖阻害剤と組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の目的のペイロードまたはタンパク質は、Ｔ細胞疲弊に関連するＴ細胞表面マーカーを標的とする抗体または断片と組み合わせて使用され得る。使用できるＴ細胞疲弊に関連するＴ細胞表面マーカーには、ＣＴＬＡ－１、ＰＤ－１、ＴＧＩＴ、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、及びＣＤ９６が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を利用して、Ｔ細胞の疲弊を防ぐことができる。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞疲弊」は、慢性Ｔ細胞活性化によって引き起こされるＴ細胞機能の段階的かつ進行性の喪失を指す。Ｔ細胞疲弊は、抗ウイルス及び抗腫瘍免疫療法の有効性を制限する主要な要因である。疲弊したＴ細胞は、アポトーシス率が高く、複数の抑制性受容体の表面発現が高いと同時に、増殖能とサイトカイン産生能が低くなっている。疲弊をもたらすＴ細胞の活性化は、抗原の存在下または非存在下のいずれかで発生し得る。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素及びそれらの構成要素は、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）との関連で、Ｔ細胞疲弊を防ぐために利用され得る。これに関連して、場合によっては、疲弊は、ＣＡＲの細胞内ドメインの継続的な活性化をもたらす細胞表面上のＣＡＲのｓｃＦｖのオリゴマー化によって引き起こされ得る。非限定的な例として、本開示のＣＡＲは、オリゴマー化することができないｓｃＦｖを含み得る。別の非限定的な例として、抗原曝露後に急速に内在化及び再発現されるＣＡＲもまた、細胞表面での慢性的なｓｃＦｖのオリゴマー化を防ぐために選択され得る。一実施形態では、ｓｃＦｖのフレームワーク領域は、構成的ＣＡＲシグナル伝達を防止するように改変され得る（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１４． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ７４（１９） Ｓ１；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本開示の調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を使用して、Ｔ細胞表面上のＣＡＲの表面発現を制御して、慢性Ｔ細胞活性化を防止することもできる。本開示のＣＡＲはまた、疲弊を最小限に抑えるように設計され得る。非限定的な例として、４１－ＢＢシグナル伝達ドメインをＣＡＲ設計に組み込んで、Ｔ細胞の疲弊を改善することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、対象におけるＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）集団を改変するために利用され得る。一実施形態では、本明細書に記載のペイロードのいずれかを利用して、ＣＤ４陽性細胞対ＣＤ８陽性集団の比率を変更することができる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、エクスビボで選別され、そして本明細書に記載されるサイトカインのいずれかを発現するように操作され得る。本開示のペイロードを使用して、ＴＩＬのＣＤ４及び／またはＣＤ８集団を拡大し、ＴＩＬ媒介免疫応答を増強することができる。

ＣＡＲ－Ｔ療法の結果を改善するためのパラメータは、Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ． ＪＣＩ． ２０１９；１２９（５）：２１２３－２１３２（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。アフェレーシス時の末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるバイオマーカーＬＡＧ３（高）／ＴＮＦ－α（低）のレベルは、数週間を超えて耐久性がある完全な応答を達成しない高抗原負荷での対象におけるその後の機能不全応答も予測することができる。開始Ｔ細胞レパートリーの結果及び製造プロセスの効果であるＴ細胞固有の特徴は、養子移植後のＣＤ１９抗原誘発性活性化と収束し、ＣＡＲ－Ｔ療法の結果にも役割を果たし得る。開始Ｔ細胞レパートリーは、アフェレーシスのタイミングによって部分的に影響を受け得る。一実施形態では、化学療法の前にアフェレーシスを実施することができる。リンパ枯渇化学療法の前に骨髄で評価された、ＣＤ１９を発現する白血病及び正常なＢ細胞の累積的負担は、ＣＡＲ－Ｔ療法の結果を決定するために重要であり得る。Ｆｉｎｎｅｙらによると、抗原負荷の増加はＣＡＲ－Ｔ療法の結果を改善する。インビボでのＣＤ１９抗原負荷を増加させるために、対象はまた、ＣＤ１９を発現するように遺伝子改変された拡大された対象由来Ｔ細胞（Ｔ－ＡＰＣとも呼ばれる）を注入され得る。

３． がんワクチン
いくつかの実施形態では、本開示の調整可能なタンパク質発現システム構築物、目的のペイロード（例えば、免疫療法薬）、ベクター、細胞、及び組成物は、がんワクチンと組み合わせて使用され得る。

いくつかの実施形態では、がんワクチンは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するペプチド及び／またはタンパク質を含み得る。そのような戦略は、対象において免疫応答を誘発するために利用され得、これは、場合によっては、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答であり得る。がんワクチンに使用されるペプチドはまた、対象の変異プロファイルに一致するように改変され得る。例えば、治療を必要としている対象で見出される変異と一致する変異を有するＥＧＦＲ由来ペプチドは、肺癌の患者で首尾よく使用されてきた。

一実施形態では、本開示のがんワクチンは、ＴＡＡに由来するスーパーアゴニスト改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）を含み得る。これらは、１つ以上のアミノ酸によって天然ペプチド配列から逸脱している変異ペプチドリガンドであり、天然エピトープよりも効果的に特定のＣＴＬクローンを活性化する。これらの改変により、ペプチドは拘束クラスＩ ＭＨＣ分子によりよく結合するか、または特定の腫瘍特異的ＣＴＬサブセットのＴＣＲとより有利に相互作用することができる。ＡＰＬは、当該技術分野で知られている方法を使用して選択することができる。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムの構成要素をコードするように遺伝子改変されたエフェクター免疫細胞、及び本開示のペイロードは、本明細書に記載の生物学的アジュバントと組み合わせることができる。ＣＡＲとサイトカイン及びリガンドとの二重制御は、標的を介した活性化の速度論的制御を内因性細胞Ｔ細胞の拡大から分離する。このような二重制御はまた、患者のプレコンディショニングレジメンの必要性を最小限に抑える。非限定的な例として、ＣＡＲ、例えばＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせたＤＲＤ制御されたペイロード、例えば、ＣＤ４０Ｌは、ＣＡＲの抗腫瘍効果を増強するためにサイトカイン、例えばＩＬ１２と組み合わせることができる。別の非限定的な例として、高リスクの小児肉腫患者の転帰を改善するために組換えヒトＩＬ７と組み合わせた樹状細胞ベースのワクチン接種を、本明細書に記載の方法で使用することができる。

いくつかの実施形態では、１つ以上の抗原特異的ＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように改変されたエフェクター免疫細胞は、免疫抑制剤腫瘍微小環境を変換する免疫療法薬、例えば、ＣＤ４０Ｌを含む本開示の組成物と組み合わせることができる。

一態様では、同じ細胞上の異なる標的分子に特異的なＣＡＲを発現するように改変されたエフェクター免疫細胞を組み合わせることができる。別の局面において、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの同じＣＡＲ構築物を発現するように改変された異なる免疫細胞は、腫瘍治療のために組み合わせて使用され得る。例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせてＣＤ４０Ｌを発現するように改変されたＴ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するために同じＣＤ１９ＣＡＲを発現するように改変されたＮＫ細胞と組み合わせ得る。

他の実施形態では、ＣＡＲを発現するように改変された免疫細胞は、チェックポイント遮断薬と組み合わせることができる。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素、例えば、本開示のペイロードを発現するように遺伝子改変されたエフェクター免疫細胞は、本開示のがんワクチン及び他の免疫療法及びアジュバント治療と組み合わせることができる。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本開示の組成物と、がん、感染症、及び他の免疫不全障害の治療に有効な他の薬剤、例えば抗がん剤との組み合わせを含み得る。本明細書で使用される場合、「抗がん」剤という用語は、例えば、がん細胞におけるアポトーシスを含むがん細胞の殺傷、がん細胞の増殖率の低減、転移の発生もしくは数の低減、腫瘍サイズの低減、腫瘍増殖の阻害、腫瘍もしくはがん細胞に対する血液供給の低減、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答の促進、がんの増殖の防止もしくは阻害、またはがんを有する対象の寿命の増加によって、対象におけるがんに負の影響を及ぼす任意の薬剤を指す。

いくつかの実施形態では、抗がん剤または療法は、化学療法剤、または放射線療法、免疫療法薬、外科手術、または本開示と組み合わせて治療の治療効果を改善する任意の他の治療薬であり得る。

一実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を、バーキット型チロシン受容体キナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤などのアミノピリミジン誘導体と組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、腫瘍細胞の表面上のいくつかの標的分子に特異的な抗体など、本明細書に記載の本発明の治療以外の免疫療法と組み合わせて使用され得る。

例示的な化学療法としては、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾールヒドロクロリド；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペリン、スリンダク、クルクミン、以下を含むアルキル化剤：メクロルエタミンなどのナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、及びクロラムブシル；カルムスチン（ＢＣ Ｕ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣ Ｕ）などのニトロソウレア；スリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）などのチレニミン／メチルメラミン；ブスルファンなどのアルキルスルホネート；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン；メトトレキサート及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体、５－フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５－アザチオプリン、２，２’－ジフルオロデオキシシチジンなどのピロリジン類似体、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、アザチオプリン、２’－デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２－クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２－ＣｄＡ）などのプリン類似体を含む代謝拮抗剤；パクリタキセルなどの有糸分裂阻害薬、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビンなどのビンカアルカロイド、タキソテール、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンなどの天然物；エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；アクチモマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシンなどの抗生物質；Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素、インターフェロン（ＩＦＮ）－ガンマ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－アルファ、ＴＮＦ－ベータ及びＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカイン、アンギジオスタチン及びエンドスタチンなどの抗血管新生因子、可溶性ＶＧＦ／ＶＥＧＦ受容体を含む血管新生因子の受容体の可溶型などのＦＧＦまたはＶＥＧＦの阻害剤、シスプラチンや及びカルボプラチンなどのプラチナ配位複合体、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素などの置換尿素、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＦｆ）及びプロカルバジンなどのメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ο、ρ’－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤；プレドニゾン及び同等物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドなどのアドレナリンコルチコステロイドアンタゴニストを含むホルモン及びアンタゴニスト；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール同等物などのエストロゲン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、リュープロリドなどの抗アンドロゲン；フルタミドなどの非ステロイド性抗アンドロゲン；キナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、メチル化阻害剤、プロテアソーム阻害剤、モノクローナル抗体、酸化剤、抗酸化剤、テロメラーゼ阻害剤、ＢＨ３模倣物、ユビキチンリガーゼ阻害剤、ｓｔａｔ阻害剤、及びメシル酸イマチニブ（グリベックまたはグリバックとして販売）などの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、及び現在タルベカとして販売されているエルロチニブ（ＥＧＦ受容体阻害剤）；リン酸オセルタミビル、アムホテリシンＢ、及びパリビズマブなどの抗ウイルス薬；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；老化由来阻害因子１；スパルフォシン酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；スティピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸ペプチドアゴニスト；ベラレソル；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラルスコブ；及びジノスタチン刺激剤；ＰＩ３Ｋβ小分子阻害剤、ＧＳＫ２６３６７７１；汎ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＢＫＭ１２０）；ＢＲＡＦ阻害剤、ベムラフェニブ（ゼルボラフ）及びダブラフェニブ（タフィンラー）；または前述の類似体または派生物及び変形物が挙げられるが、これらに限定されない。

放射線治療薬及び因子には、ＤＮＡ損傷を誘発する放射線及び波、例えば、γ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位元素などが含まれる。治療は、限局性腫瘍部位に上述の形態の放射線を照射することによって達成することができる。これらの因子のすべては、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに、染色体の会合と維持に対し広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）、５０～２００レントゲンの１日用量から２０００～６０００レントゲンの単回用量までの範囲までである。放射性同位体の線量範囲は、広範囲に変動し、同位体の半減期、放出された放射線の強さと型、新生物細胞による取り込みに依存する。

いくつかの実施形態では、化学療法薬は、レナリドマイド（ＬＥＮ）などの免疫賦活剤であり得る。最近の研究は、レナリドマイドがＣＡＲ改変Ｔ細胞の抗腫瘍機能を増強できることを示している。抗腫瘍抗体のいくつかの例には、トシリズマブ、シルツキシマブが含まれる。

本開示の組成物と組み合わせて使用され得る他の薬剤はまた、細胞表面受容体及びそれらのリガンド、例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬの上方制御に影響を与える薬剤、ならびにＧＡＰ接合部、細胞静止剤及び分化剤、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンなどの細胞接着の阻害剤、または抗体Ｃ２２５などのアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める薬剤を含み得るが、これらに限定されない。

組み合わせは、本開示の組成物及び他の薬剤を同時にまたは別々に投与することを含み得る。代替的に、本免疫療法は、数分、数日、数週間から数ヶ月の範囲の間隔で、他の薬剤／療法の前または後にあり得る。
４． 疾患

本開示において提供されるのは、必要としている対象における腫瘍体積または腫瘍量を低減する方法であり、この方法は、対象に本開示の組成物を導入することを含む。

本開示はまた、対象における癌を治療するための方法であって、本開示の調整可能なタンパク質発現システムを含むように遺伝子改変された有効量のエフェクター免疫細胞を対象に投与することを含む、方法を提供する。

５．がん
様々ながんは、本開示の医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システム構成要素、及びそれらのＤＲＤ及びペイロードを含む構築物で治療され得る。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、周囲の組織に侵入し、新しい身体部位に転移する傾向がある退形成細胞の増殖を特徴とする様々な悪性新生物のいずれかを指し、また、そのような悪性腫瘍性増殖を特徴とする病態を指す。がんは腫瘍または血液悪性腫瘍であってもよく、すべてのタイプのリンパ腫／白血病、癌腫及び肉腫、例えば肛門、膀胱、胆管、骨、脳、乳房、子宮頸部、結腸／直腸、子宮内膜、食道、目、胆嚢、頭頸部、肝臓、腎臓、喉頭、肺、縦隔（胸部）、口、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、小腸、胃、脊髄、尾骨、睾丸、甲状腺、及び子宮に見られるがんまたは腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。

本開示の組成物で治療することができる癌腫の種類には、乳頭腫／癌腫、脈絡癌腫、皮内洞腫瘍、奇形腫、腺腫／腺癌、黒色腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、横紋筋肉腫、中皮腫、血管腫、骨腫、軟骨腫、神経膠腫、リンパ腫／白血病、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、基底細胞癌、及び鼻副鼻腔未分化癌が含まれるが、これらに限定されない。

本開示の組成物で治療することができる肉腫の種類には、肺胞軟部肉腫などの軟組織肉腫、血管肉腫、皮膚線維肉腫、デスモイド腫瘍、線維形成性小円形細胞腫瘍、骨格外軟骨肉腫、骨格外骨肉腫、線維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポシ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、及びアスキン腫瘍、ユーイング肉腫（原始神経外胚葉性腫瘍）、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、及び軟骨肉腫が含まれるが、これらに限定されない。

６．感染症
いくつかの実施形態では、本開示の調整可能なタンパク質発現システムは、感染症の治療のために使用され得る。本開示の調整可能なタンパク質発現システムは、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及び／またはＴ細胞などの養子細胞移植に適した細胞に導入することができる。本開示の調整可能なタンパク質発現システムによって治療される感染症には、ウイルス、細菌、真菌、及び／または寄生虫によって引き起こされる疾患が含まれ得る。本開示のＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒａペイロードは、感染症の治療に有用な免疫細胞の増殖及び／または免疫細胞の持続性を増加させるために使用され得る。

本明細書における「感染症」は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に感染し、疾患状態を引き起こす任意の病原体または病原体によって引き起こされる疾患を指す。その例には、細菌、酵母、真菌、原生動物、マイコプラズマ、ウイルス、プリオン、及び寄生虫が含まれる。例としては、（ａ）例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－ＩＩ、ＣＭＶ、またはＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、バリオラまたはワクシニア、または軟体動物コンタギオサムなどのオルソポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルスまたはエンテロウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、生殖器疣贅、一般的な疣贅、または足底疣贅を引き起こすものなどのパピローマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルスまたはデングウイルス）、またはレトロウイルス（例えば、ＨＩＶなどのレンチウイルス）などのウイルス性疾患；（ｂ）例えば、エシェリキア属、エンテロバクター属、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、赤痢菌属、リステリア属、エアロバクター属、ヘリコバクター属、クレブシエラ属、プロテウス属、シュードモナス属、ストレプトコッカス属、クラミディア属、マイコプラズマ属、ニューモコッカス属、ナイセリア属、クロストリジウム属、バシラス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、カンピロバクター属、ビブリオ属、セラチア属、プロビデンシア属、クロモバクテリウム属、ブルセラ属、エルシニア属、ヘモフィルス属、またはボルデテラ属の細菌による感染に起因する疾患などの細菌性疾患；（ｃ）クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、組織形質症、クリプトコッカス性髄膜炎を含むがこれらに限定されない真菌性疾患、マラリア、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｎｉｉ肺炎、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及びトリパノソーム感染症、及びクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、バリアントクロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、及びクールーなどのヒト疾患を引き起こすプリオンを含むがこれらに限定されない他の感染症に含まれるものが挙げられる。

７．免疫腫瘍学及び細胞治療
がん免疫学の分野における最近の進歩により、免疫系ががんを寄せ付けないようにするためのいくつかのアプローチの開発が可能になった。このような免疫療法のアプローチには、モノクローナル抗体またはエクスビボで操作されたＴ細胞（例えば、キメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体を含む）の養子移植によるがん抗原の標的化が含まれる。

いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システムは、１つ以上のがんを標的とするための免疫系の調節または改変または利用において使用され得る。このアプローチは、他のそのような生物学的アプローチ、例えば、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、他のモノクローナル抗体、ワクチン、遺伝子治療の投与などの免疫応答修飾療法と一緒に検討することもでき、非特異的免疫調節剤も本開示のそれらのペイロードを含む、医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システムと組み合わせる抗がん治療として想定される。

がん免疫療法とは、患者自身の免疫系にがんと闘うように誘導するように設計された多様な治療戦略のセットを指す。いくつかの実施形態では、本開示のそれらのペイロードを含む、医薬組成物、医薬組成物、調整可能なタンパク質発現システムは、免疫腫瘍学治療薬として設計されている。

８．細胞治療
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を担持する遺伝子操作されたＴ細胞、組換えＴＣＲ技術を含む、いくつかの種類の細胞性免疫療法が存在する。

本開示によれば、調整可能なタンパク質発現システムは、養子細胞療法などの細胞療法の開発及び実施において使用され得る。調整可能なタンパク質発現システムとそれらのペイロードは、ＴＣＲ除去－ＴＣＲ遺伝子破壊を行うための細胞療法において、ＴＣＲエンジニアリングにおいて、エピトープタグ付き受容体を制御するために、Ｔ細胞を刺激するためのＡＰＣプラットフォームにおいて、エクスビボＡＰＣ刺激を増強するツールとして、Ｔ細胞拡大の方法を改善するために、抗原によるエクスビボ刺激において、ＴＣＲ／ＣＡＲの組み合わせにおいて、ＴＩＬの操作または制御において、同種異系細胞療法において、他の治療ライン（例えば、放射線、サイトカイン）とのＴ細胞療法の組み合わせにおいて、操作されたＴＣＲまたは改変されたＴＣＲをコードするため、またはＴＣＲ以外のＴ細胞を増強する（例えば、サイトカイン遺伝子、チェックポイント阻害剤ＰＤ１、ＣＴＬＡ４の遺伝子を導入することによって）ために、使用することができる。

いくつかの実施形態では、改善された奏効率は、細胞療法を支持して得られる。

細胞集団の拡大及び持続は、ペイロード、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または他の免疫関連細胞における受容体または経路の構成要素の制御または微調整を通じて達成され得る。いくつかの実施形態では、本開示の調整可能なタンパク質発現システムは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の応答を増強するタンパク質の発現を空間的及び／または時間的に制御するように設計されている。いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の応答を阻害するタンパク質の発現を空間的及び／または時間的に制御するように設計されている。

免疫系は、がん以外の疾患の治療にも利用できる。調整可能なタンパク質発現システム、それらの構成要素は、自己免疫疾患、アレルギー、移植片対宿主病、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などの免疫不全をもたらす可能性のある疾患及び障害を含むがこれらに限定されない疾患の治療のための免疫療法に利用され得る。

本開示は、免疫療法のための組成物を提供する。このような組成物には、ペイロードとしてＣＤ４０Ｌを含むエフェクターモジュールが含まれ得る。組成物は、追加のペイロードとしてキメラ抗原受容体をさらに含み得る。組成物は、養子細胞療法に適した免疫細胞で発現し得る。エフェクターモジュールを発現する細胞は、対象に直接送達され得る。いくつかの態様では、エフェクターモジュールを発現する細胞は、ＣＤ４０を発現する免疫細胞と共投与され得る。これらの細胞におけるＣＤ４０の発現は、異所性または内因性であり得る。ＣＤ４０の発現は、本開示のエフェクターモジュールを発現する他の免疫細胞との共培養によっても誘導され得る。ＣＤ４０陽性細胞のいくつかの非限定的な例としては、樹状細胞、マクロファージ、骨髄細胞、Ｂ細胞、血小板、内皮細胞、上皮細胞、及び線維芽細胞などの細胞が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペイロードは、樹状細胞の活性化に使用することができる。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、骨髄樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１４＋樹状細胞、ランゲルハンス細胞、またはミクログリアであり得る。いくつかの実施形態では、骨髄性ＤＣ（ｍＤＣ）は、マウスＣＤ１１ｃ＋「古典的」または「通常型」ＤＣに対応する典型的な骨髄性抗原ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ３３、及びＣＤ１１ｂを発現する。ヒトでは、単球とｍＤＣの両方がＣＤ１１ｃを発現するが、ＤＣはＣＤ１４またはＣＤ１６を欠いており、ＣＤ１ｃ＋とＣＤ１４１＋の画分に分割され得る。これらの２つの画分は、ＣＤ１１ｂ（ＣＤ１ｃ＋ＤＣ）またはＣＤ８／ＣＤ１０３（ＣＤ１４１＋ＤＣ）のいずれかを発現するマウスの古典的ＤＣと相同性を共有する。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）であり得る。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は、典型的には骨髄抗原を欠き、ＣＤ１２３、ＣＤ３０３、及びＣＤ３０４の発現によって区別され得る。一実施形態では、樹状細胞は、ＣＤ１４＋であり得る。このような細胞は組織に見られ、リンパ節は元々「間質性ＤＣ」と呼ばれていたＣＤ１１ｃ＋骨髄細胞の第３のサブセットである。それらは、ＣＤ１ｃ＋及びＣＤ１４１＋ｍＤＣよりも単球様またはマクロファージ様であり、古典的な単球から生じ得る。同等の細胞は、最近、マウスで、ＥＳＡＭを発現するＣＤ１１ｂ古典的ＤＣの新しい単球由来サブセットとして発見された。一実施形態では、樹状細胞は、ランゲルハンス細胞またはミクログリアであり得る。ランゲルハンス細胞（ＬＣ）及びミクログリアは、それぞれ重層扁平上皮及び脳実質に見られる２つの特殊な自己複製ＤＣ集団である。ＬＣは移動性ＤＣに分化することができるものであり得、一方でミクログリアはマクロファージの一種とみなされている。

いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）に形質導入されると、免疫細胞を、ＣＡＲの細胞外標的部分によって認識される分子を発現する標的（例えば、腫瘍細胞）に対して向け直すことができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。

いくつかの実施形態では、それらのペイロードまたは目的のタンパク質を含む調整可能なタンパク質発現システムを含む医薬組成物は、自己免疫疾患を軽減するために、自己抗体及び自己反応性免疫細胞などの１つ以上の自己反応性免疫構成要素を標的とする免疫系の調節または改変または利用において使用され得る。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を弱めるかまたは軽減するために、免疫療法に基づく治療において利用され得る。宿主病（ＧＶＨＤ）。ＧＶＨＤは、幹細胞または骨髄の移植後、同種異系ドナーの免疫細胞が宿主組織に対して反応する状態を指す。いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、ＧＶＨＤの治療のためにＴｒｅｇを調節するように設計されたサイトカインまたは免疫学的薬剤をコードするように設計され得る。

いくつかの実施形態では、調整可能なタンパク質発現システムは、目的のヒト天然タンパク質の発現のために、当該技術分野の他の生体回路またはスイッチよりも免疫原性が著しく低くあり得る。

様々な自己免疫疾患及び自己免疫関連疾患は、本開示の調整可能なタンパク質発現システムを含む医薬組成物によって治療することができる。本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、身体が自身の組織を攻撃する抗体を産生する疾患を指す。

様々な血液疾患は、本開示の調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を含む医薬組成物で治療することができる。

９．中枢神経系（ＣＮＳ）
いくつかの実施形態では、本開示の調整可能なタンパク質発現システムの１つ以上の構成要素を含む医薬組成物は、脳脊髄（ＣＳＦ）タンパク質を含む中枢神経系におけるタンパク質の調節または改変または利用において使用され得る。

１０．幹細胞アプリケーション
本開示の調整可能なタンパク質発現システム及び／またはそれらの構成要素は、細胞の調節された再プログラミング、幹細胞生着、またはそのような再プログラミング因子の制御されたまたは調整可能な発現が有用である他の用途において利用され得る。

本開示の調整可能なタンパク質発現システム構築物は、幹細胞または誘導幹細胞を含む細胞の再プログラミングに使用することができる。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の誘導は、ウイルスベクターを使用して、総称してＫＭＯＳとしても知られるＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２を発現させることにより、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ， ２００６． １２６（４）：６６３－７６；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって最初に達成された。

切除可能なレンチウイルス及びトランスポゾンベクター、一過性プラスミドの反復適用、エピソーム及びアデノウイルスベクターも、ｉＰＳＣの誘導を試みるために使用されてきた。

ヒトｉＰＳＣを生成するためのＤＮＡを含まない方法も、細胞透過性ペプチド部分を組み込んだ組換えタンパク質による連続的なタンパク質の形質導入、及びセンダイウイルスを使用した感染性導入遺伝子送達を使用して導き出された。

本開示の調整可能なタンパク質発現システムは、ＯＣＴ４などのＯＣＴ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、及びＳＯＸ１８などのＳＯＸ、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＫＬＦ５などのＫＬＦ、ｃ－ＭＹＣ及びｎ－ＭＹＣなどのＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、及びＬＩＮ２８、ならびに細胞の再プログラミングを支持するそれらのバリアントを含むがこれらに限定されない遺伝子のいずれかを含むペイロードを含み得る。そのような再プログラミング因子の配列は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４５６０に教示されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示の調整可能なタンパク質発現システムは、幹細胞動員に寄与する因子のいずれかを含むペイロードを含み得る。自家幹細胞治療では、移植用の幹細胞の供給源としては、骨髄、末梢血単核細胞、及び臍帯血が挙げられ得る。幹細胞は、これらの供給源（例えば、骨髄）から刺激されて血流へと入る。したがって、将来の再注入のために収集するのに十分な幹細胞が利用可能である。Ｇ－ＣＳＦ（フィルグラスチム）、ＧＭ－ＣＳＦ、及びサイトカインに先行する化学療法（化学動員）を含むがこれらに限定されない、サイトカイン戦略の１つまたは組み合わせを使用して、幹細胞を動員することができる。

１１．治療薬を作るためのツールと薬剤
本開示において提供されるのは、必要とする対象の腫瘍体積または腫瘍量を低減するための免疫療法などであるがそれらに限定されない治療薬を生成する際に使用され得るツール及び薬剤である。ペイロードの構造、細胞の種類、遺伝子導入の方法、エクスビボでの拡大の方法と時間、プレコンディショニング、対象における腫瘍量の量と種類など、かなりの数の変数が治療薬の製造に関与している。このようなパラメータは、本明細書に記載のツール及びエージェントを使用して最適化することができる。

１２．細胞株
本開示は、本開示の組成物で遺伝子改変された哺乳動物細胞を提供する。適切な哺乳動物細胞としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。適切な哺乳動物細胞株としては、ヒト胚性腎臓細胞株２９３、線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３、不死化Ｔ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＳｕｐＴ１細胞）、リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞、ＮＡＬＭ－６細胞、Ｋ５６２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＣ１２細胞、ＨＬ－６０細胞、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、ＮＫ９６２、及びＹＴＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、細胞は不死化細胞株ではなく、代わりに個体から得られた細胞であり、本明細書では初代細胞と呼ばれる。例えば、細胞は個体から得られたＴリンパ球である。他の例としては、細胞傷害性細胞、幹細胞、末梢血単核細胞、または個体から得られた前駆細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

１３．細胞アッセイ
いくつかの実施形態では、免疫療法薬としての本開示の組成物の有効性は、細胞アッセイを使用して評価され得る。本開示の組成物の発現及び／または同一性のレベルは、タンパク質を同定するため及び／またはタンパク質レベルを定量化するための当該技術分野で知られている任意の方法に従って決定することができる。いくつかの実施形態では、そのような方法は、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、及びイムノアッセイを含み得る。

本明細書で提供されるのは、本開示の調整可能なタンパク質発現システム構築物及び本開示の組成物で形質転換または形質導入された細胞を機能的に特徴付けるための方法である。いくつかの実施形態では、機能的特徴付けは、初代免疫細胞または不死化免疫細胞株において実施され、細胞表面マーカーの発現によって決定され得る。Ｔ細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５及びＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＩＦＮガンマが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ細胞疲弊のマーカーには、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ３９、及びＬＡＧ３が含まれる。抗原提示細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＦＮγ受容体及びＩＬ２受容体、ＩＣＡＭ－１及び／またはＦｃγ受容体が挙げられるが、これらに限定されない。樹状細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７－２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ－４４、ＣＭＲＦ－５６、ＤＣＩＲ及び／またはデクチン－１などが挙げられるが、これらに限定されず、場合によっては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ １９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／またはＣＤ５７が非存在であることもある。ＮＫ細胞の細胞表面マーカーの例としては、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ６９、ＣＣＲ５、ホスホＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ホスホＥＲＫ、ホスホｐ３８／ＭＡＰＫ、ホスホＡＫＴ、ホスホＳＴＡＴ３、グラヌリシン、グランザイムＢ、グランザイムＫ、ＩＬ１０、ＩＬ２２、ＩＦＮｇ、ＬＡＰ、パーフォリン、及びＴＮＦａが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞代謝経路は、疲弊に対するＴ細胞の感受性を減少させるように改変され得る。代謝経路には、解糖、尿素回路、クエン酸回路、ベータ酸化、脂肪酸生合成、ペントースリン酸経路、ヌクレオチド生合成、及びグリコーゲン代謝経路が含まれ得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、解糖の速度を低下させるペイロードを利用して、Ｔ細胞疲弊を制限または防止することができる。一実施形態では、本開示のＴ細胞は、２－デオキシグルコース、及びラパマイシンなどの解糖阻害剤と組み合わせて使用することができる。

いくつかの実施形態では、免疫療法に有用な、本開示の調整可能なタンパク質発現システム構築物は、Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体アルファ遺伝子座定数（ＴＲＡＣ）遺伝子座の転写制御下に置かれ得る。Ｅｙｑｕｅｍらは、ＴＲＡＣ遺伝子座からのＣＡＲの発現は、過剰なＴ細胞の活性化によって引き起こされるＴ細胞の疲弊とＴ細胞の分化の加速を防ぐことを示している。

いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、Ｔ細胞疲弊に関連するＴ細胞表面マーカーを標的とする抗体または断片を含み得る。ペイロードとして使用できるＴ細胞疲弊に関連するＴ細胞表面マーカーには、ＣＴＬＡ－１、ＰＤ－１、ＴＧＩＴ、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、及びＣＤ９６が含まれ得るが、これらに限定されない。

一実施形態では、本開示のペイロードは、初期のＴ細胞疲弊に関連するマーカーの上方制御を示さない、ＣＤ２７６ ＣＡＲ（ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを有する）であり得る。

１４．細胞
本開示によれば、本開示のコードされたＤＲＤリガンドの制御下で、目的の少なくとも１つのタンパク質またはペイロードを発現するように遺伝子改変された細胞が提供される。本開示の細胞は、非現実的に、免疫細胞、幹細胞、及び腫瘍細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｆｏｘｐ３＋細胞）などのＴ細胞、Ｔメモリー幹細胞、中央Ｔメモリー細胞、及びエフェクターメモリーＴ細胞などのメモリーＴ細胞、最終分化エフェクターＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及び樹状細胞（ＤＣ、例えば、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１４＋樹状細胞、ランゲルハンス細胞、またはミクログリア）、エフェクター機能を誘発することができる他の免疫細胞、またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されないエフェクター免疫細胞である。Ｔ細胞は、Ｔαβ細胞及びＴγδ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び神経幹細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、枯渇した内因性Ｔ細胞受容体であり得る。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、特定の個々の対象に関して、自家、同種異系、同系、または異種であり得る。

いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞であり得る。本開示の細胞は、初代細胞または不死化細胞株であり得る。

操作された免疫細胞は、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２の核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのペイロードをコードする第１の核酸配列を含む核酸分子を細胞に導入することを含む方法によって達成することができる。

ベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、組換えＡＡＶ、アデノウイルスベクター、及び腫瘍溶解性ウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。他の態様において、非ウイルスベクター、例えば、ナノ粒子及びリポソームもまた使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、安定化リガンドを使用して調整可能な本開示の少なくとも１つの免疫療法薬を発現するように遺伝子改変されている。いくつかの例では、同じ調整可能なタンパク質発現システム構築物で構築された２つ、３つ、またはそれ以上の免疫療法薬が細胞に導入される。他の例では、２つ、３つ、またはそれ以上の調整可能なタンパク質発現システム構築物を細胞に導入することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、ＣＤ４０Ｌ、及び任意選択で、本明細書で教示される抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わせて発現するように改変されるＴ細胞及び／またはＮＫ細胞であり得る。

１５．ポリヌクレオチド
エフェクターモジュール、それらのＳＲＥ及びペイロードを含む調整可能なタンパク質発現システムの構成要素は、核酸ベースであり得る。「核酸」という用語は、その最も広い意味で、ヌクレオチドのポリマー、例えば、連結されたヌクレオシドを含む任意の化合物及び／または物質を含む。これらのポリマーは、しばしばポリヌクレオチドと呼ばれる。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡを含むＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のポリペプチドをコードし、翻訳されて、インビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボでコードされた目的のポリペプチドを生成することができる任意のポリヌクレオチドを指す。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは任意の核酸分子であり得、化学的に修飾されていてもされていなくてもよい。

伝統的に、ｍＲＮＡ分子の基本的な構成要素は、少なくともコード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡテールを含む。この野生型モジュラー構造に基づいて、本開示は、モジュラー構成を維持するが、ポリヌクレオチドに有用な特性、例えば機能の調整可能性を付与する１つ以上の構造的及び／または化学的修飾または改変を含むペイロード構築物を提供することにより、従来のｍＲＮＡ分子の機能の範囲を拡大する。本明細書で使用される場合、「構造的」特徴または修飾は、ヌクレオシド自体に大幅な化学的修飾を加えることなく、２つ以上の連結ヌクレオシドがポリヌクレオチドに挿入、欠失、複製、反転またはランダム化されるものである。化学結合は必然的に破壊され、構造修飾を行うために再形成されるため、構造修飾は化学的性質のものであり、したがって化学修飾である。しかしながら、構造修飾により、ヌクレオチドの配列が異なる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ－５ｍｅＣ－Ｇ」へと化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾され得る。ここでは、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドの構造修飾をもたらす。

いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、翻訳開始において役割を果たす５’ＵＴＲ配列を含み得る。５’ＵＴＲ配列には、リボソームが遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列などの機能が含まれ得る。コザック配列は、コンセンサスＸＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧを有し、式中、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のＲはプリン（アデニンまたはグアニン）であり、Ｘは任意のヌクレオチドである。一実施形態では、コザック配列はＡＣＣＧＣＣである。標的細胞または組織の豊富に発現される遺伝子に典型的に見られる特徴を操作することにより、本開示のポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を増強することができる。

さらに提供されるのは、ポリヌクレオチドに５’キャップ構造がない場合にタンパク質合成を開始するのに重要な役割を果たす配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得るポリヌクレオチドである。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能する場合もあれば、複数の結合部位の１つとして機能する場合もある。１つを超える機能性リボソーム結合部位を含む本開示のポリヌクレオチドは、バイシストロン性及び／またはマルチシストロン性の核酸分子を生じさせるリボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。

一実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列と特定の同一性を有するバリアントポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用される場合、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、野生型配列、または別の配列の設計において参照がなされる任意の配列であり得る。

当該技術分野で知られている「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上の配列間の関係を指す。当該技術分野において、同一性はまた、２つ以上の残基（アミノ酸または核酸）の鎖間の一致の数によって決定される、配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される、（存在する場合）ギャップアラインメントを持つ２つ以上のシーケンス間の同一性一致のパーセントを測定する。関連する配列の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． ４８， １０７３ （１９８８）に記載されている方法が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、バリアント配列は、参照配列と同じかまたは類似の活性を有し得る。代替的に、バリアントは、参照配列と比較して変化した活性（例えば、増加または減少）を有し得る。一般に、本開示の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に知られている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される場合、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有するであろう。アライメントのためのそのようなツールとしては、ＢＬＡＳＴスイートのツールが挙げられる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｔｈｏｍａｓ Ｌ． Ｍａｄｄｅｎ， Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ． Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ， Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ， ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ （１９９７）， “Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２）。

１６．コドン選択
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドの１つ以上のコドンは、コドン選択と呼ばれるプロセスを通じて、ＳＲＥの発現を調整するために、天然アミノ酸配列をコードする他のコドンで置き換えられ得る。ｍＲＮＡコドン、及びｔＲＮＡアンチコドンプールは、生物、細胞型、細胞内位置、及び時間の経過とともに変化する傾向があるため、本明細書に記載のコドン選択は、時空間（ＳＴ）コドン選択である。

本開示のいくつかの実施形態では、特定のポリヌクレオチドの特徴は、コドン最適化され得る。コドン最適化とは、天然配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０以上のコドンを天然のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を改変するプロセスを指す。コドン使用頻度は、参照遺伝子セットからのコーディングポリヌクレオチド配列の偏差を測定するコドン適応指数（ＣＡＩ）を使用して測定することができる。コドン使用頻度表は、コドン使用頻度データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）で入手でき、ＣＡＩはＥＭＢＯＳＳ ＣＡＩプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）によって計算できる。コドン最適化方法は当該技術分野で知られており、いくつかの目標のうちの１つ以上を達成するための努力において有用であり得る。

本開示のポリヌクレオチドの終止コドンは、本開示のＳＲＥ、ペイロード、及びエフェクターモジュールの発現レベルを変更するための配列及びモチーフを含むように改変され得る。そのような配列は、終止コドンのリードスルーを誘導するために組み込まれ得、終止コドンは、アミノ酸、例えば、セレノシステインまたはピロリシンを特定し得る。他の例では、終止コドンを完全にスキップして、代替のオープンリーディングフレームを介して翻訳を再開することができる。終止コドンのリードスルーは、エフェクターモジュールの構成要素の発現を特定の比率で調整するために利用することができる（例えば、終止コドンの文脈によって決定されるとき）。好ましい終止コドンモチーフの例としては、ＵＧＡＮ、ＵＡＡＮ、及びＵＡＧＮが挙げられ、ここで、ＮはＣまたはＵのいずれかである。

終止の抑制は、拡張されたカルボキシ末端を持つ第２のタンパク質を生成する手段として、多くのウイルスｍＲＮＡの翻訳中に発生する。レトロウイルスでは、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は単一のｍＲＮＡによってコードされ、アンバー終止コドンＵＡＧによって分離される。アンバーコドンの翻訳抑制は、ｇａｇ ｐｏｌ前駆体の合成を可能にする。翻訳抑制は、終止コドンを認識して特定のアミノ酸を挿入できるサプレッサーｔＲＮＡによって媒介される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエフェクターモジュールは、アンバー終止コドンを組み込んでもよい。このようなコドンは、バイシストロン性構築物中のＩＲＥＳ及びｐ２Ａ配列の代わりに、またはそれらに加えて使用することができる。終止コドンのリードスルーは、Ｐ２Ａと組み合わせて、下流の遺伝子（例えば、ＩＬ１２）の低レベルの発現を得ることができる。いくつかの実施形態では、アンバー終止コドンは、さらなる制御のために、ｔＲＮＡ発現またはアミノ－アシルｔＲＮＡシンテターゼと組み合わせることができる。一態様では、ペイロードは、制御されたｔＲＮＡシンテターゼであり得る。

１７．対象部位
いくつかの実施形態では、刺激は対象部位である。対象部位は、血液、血漿、肝臓、腎臓、脳、心臓、肺、骨、及び骨髄から選択される臓器などであるがこれらに限定されない、対象内の場所であり得る。

１８．プロモーター
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、プロモーターを含む。

本明細書で使用される場合、プロモーターは、本開示のポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要とされる、細胞の転写機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。ベクターは、本開示のポリヌクレオチドに作動可能に連結された天然または非天然のプロモーターを含むことができる。選択されるプロモーターは、強い、弱い、構成的、誘導性、組織特異的、発生段階特異的、及び／または生物特異的であり得る。適切なプロモーターの一例は、配列番号６３８４～６３８６などであるがこれに限定されない最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。プロモーターの別の例は、配列番号６３８７～６３９１などであるがこれに限定されない伸長増殖因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）である。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニワトリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター（非限定的な例としては配列番号６３９２～６３９９が挙げられる）、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトＵ６小核タンパク質プロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含むがこれらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない他の構成的プロモーターも使用され得る。場合によっては、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターなどであるがこれらに限定されない誘導性プロモーターを使用することができる。

いくつかの実施形態では、最適なプロモーターは、リガンドの非存在下での本開示のＳＲＥ及びペイロードの最小の発現と、リガンドの存在下での検出可能な発現とを達成するその能力に基づいて選択され得る。

エンハンサーなどの追加のプロモーターエレメントを使用して、転写開始の頻度を制御することができる。このような領域は、開始部位の上流または下流の１０～１００塩基対に位置し得る。場合によっては、２つ以上のプロモーター要素を使用して、協調的または独立して転写を活性化することができる。

１９．その他の制御性機能
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、任意のプロテアソームアダプターを含み得る。本明細書で使用される場合、「プロテアソームアダプター」という用語は、分解のために付加されたペイロードを標的とする任意のヌクレオチド／アミノ酸配列を指す。いくつかの態様では、アダプターは、分解のためにペイロードを直接標的とし、それにより、ユビキチン化反応の必要性を回避する。プロテアソームアダプターは、ペイロードの基本的な発現を減らすために、薬物応答性ドメインと組み合わせて使用することができる。例示的なプロテアソームアダプターとしては、Ｒａｄ２３またはｈＨＲ２３ｂのＵｂＬドメイン、標的タンパク質ＲｂとプロテアソームのＳ４サブユニットの両方に高い親和性で結合してユビキチン化機構をバイパスして直接プロテアソームターゲティングを可能にするＨＰＶ Ｅ７、ＲｂとプロテアソームサブユニットＳ６に結合するタンパク質ガンキリンが挙げられる。

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。場合によっては、一般に理解されている意味を持つ用語は、明確にするため、及び／またはすぐに参照及び理解するために本明細書で定義され、そのような定義を本明細書に含めることは、当該技術分野で一般に理解されているものとの実質的な違いを意味すると必ずしも解釈されるべきではない。分子生物学の用語及び／または方法及び／またはプロトコールの一般的に理解されている定義は、Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ， ５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１；Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９４；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｄ ｅｄ． ２００１）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４）， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ （２００６） Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＩＳＢＮ－１０： ０８７９６９７７１７；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＩＳＢＮ－１０： ０４７１２５０９２９に見出すことができる。

必要に応じて、市販のキット及び／または試薬の使用を含む手順は、特に断りのない限り、一般に、製造業者のガイダンス及び／またはプロトコール及び／またはパラメータに従って実施される。

「親和性」は、結合の強さを指し、増加する結合親和性は、低下するＫｄと相関する。

養子細胞療法（ＡＣＴ）：本明細書で使用される場合、「養子細胞療法」または「養子細胞移植」という用語は、細胞が患者に由来する可能性があるか、または別の個人からのものであり、患者に戻される前に操作（改変）されている、患者への細胞の移植を含む細胞療法を指す。治療用細胞は、エフェクター免疫細胞：ＣＤ４＋Ｔ細胞；ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）；切除された腫瘍に由来するＢ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの免疫系に由来し得る。最も一般的に移植される細胞は、エクスビボでの増殖または操作後の自家抗腫瘍Ｔ細胞である。例えば、自家末梢血リンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現することにより、特異的な腫瘍抗原を認識するように遺伝子操作することができる。

薬剤：本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、生物学的、医薬的、または化学的化合物を指す。非限定的な例としては、単純または複雑な、有機または無機の分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、受容体、及び可溶性因子が含まれる。

アゴニスト：本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、受容体と組み合わせて、細胞応答もたらすことができる化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドであり得る。代替的に、アゴニストは、例えば、（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成することによって、または（ｂ）そうでなければ、他の化合物が直接受容体に結合するように別の化合物の改変をもたらすことによって、間接的に受容体と結合することができる。アゴニストは、特定の受容体または受容体ファミリーのアゴニスト、例えば、共刺激受容体のアゴニストと呼ばれ得る。

アンタゴニスト：本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語は、それが結合する標的（複数可）の生物活性を阻害または低減する任意の薬剤を指す。

およそ：本明細書で使用する場合、１つ以上の目的の値に適用されるとき、「およそ」または「約」という用語は、言及された参照値に類似する値を指す。いくつかの実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記されていない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００を超える場合を除いて）、言及された参照値の２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１またはそれ以下のいずれかの方向（よりより大きいまたはより小さい）の範囲内の値の範囲を指す。

結合する：本明細書で使用される場合、「結合する」、「コンジュゲートする」、「連結される」、「結合する」、及び「係留される」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、その部分が互いに、または、直接もしくは連結剤として機能する１つ以上の追加の部分を介してのいずれかにより、物理的に結合または接続して、構造が使用される条件下、例えば生理学的条件下で部分が物理的に結合したままであるように十分に安定な構造を形成することを意味する。「結合」は、厳密には直接共有化学結合によるものである必要はない。また、「結合する」実体が物理的に結合したままになるように、イオン結合または水素結合、またはハイブリダイゼーションベースの接続が十分に安定していることを示唆している場合もある。

本明細書で使用される場合、「自家」という用語は、それが後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指すことが意図されている。

「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸塩残基との接触）。そのような相互作用は、概して、１０－６Ｍ－１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。

「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成するために）、かつ／またはそれは、異なるタンパク質または複数のタンパク質の１つ以上の分子に結合し得る。結合タンパク質は、１つを超える結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、及びタンパク質結合活性を有する。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断も二本鎖切断もいずれも可能であり、二本鎖切断は、２つのはっきりと異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態では、融合ポリペプチドは、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。

ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでトランスＲＮＡスプライシング（コード配列にイントロンが含まれている場合）され、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は細胞内の転写及び翻訳制御配列の「制御下」にある。

「構築物」は、一般に、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製する核酸分子、ファージ、あるいは、１つ以上の核酸分子が作動可能に連結されている核酸分子を含む、ゲノム組み込みまたは自律複製が可能な任意の供給源に由来する、直線状または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ核酸分子などの任意の組換え核酸分子として理解される。構築物は、例えば、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）からの追加の調節核酸分子を含み得るが、これらに限定されない。構築物には、翻訳開始に重要な役割を果たすことができ、発現構築物の遺伝的構成要素にもなり得る、ｍＲＮＡ核酸分子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含めることができるが、これに限定されない。これらの追加の上流及び下流の調節核酸分子は、プロモーター構築物上に存在する他の要素に関して天然または異種である供給源に由来し得る。

サイトカイン：本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、免疫系の機能に影響を及ぼし、制御することができる多くの細胞型によって産生される多面発現機能を有する小さな可溶性因子のファミリーを指す。

送達：本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、化合物、物質、実体、部分、カーゴ、またはペイロードを送達する作用または方法を指す。「送達剤」は、１つ以上の物質（本開示の化合物及び／または組成物を含むが、これらに限定されない）を細胞、対象、または他の生物学的システムの細胞にインビボで送達することを、少なくとも部分的に促進する任意の薬剤を指す。

本明細書で使用される場合、ＤＲＤまたはペイロードに関連する「由来する」という語句は、ＤＲＤまたはペイロードが、記載された親分子または配列に少なくとも部分的に由来することを意味する。例えば、ＤＲＤは、天然に存在するタンパク質のエピトープまたは領域に由来し得、ＤＲＤ機能を最適化するために本明細書で教示される方法のいずれかで改変される。

不安定化：本明細書で使用される場合、「不安定化」、「不安定化」、「不安定化領域」または「不安定化ドメイン」という用語は、同じ領域または分子の開始、参照、野生型、または天然型よりも安定性が低い領域または分子を意味する。

ＤＮＡの「コード配列」または「コード領域」は、ポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡ配列を指し、細胞内で、エクスビボ、インビトロ、またはインビボで、適切な調節配列の制御下に置かれると、転写及び翻訳されてポリペプチドとなり得る。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）にあるヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡ処理、もしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、及びステムループ構造が含まれ得る。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。コード配列が真核細胞での発現を目的としている場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置する。

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、下流のヌクレオチド配列は、一般に、転写の開始点に続く配列に関連している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置している。

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’に位置するヌクレオチド配列を指す。特に、上流のヌクレオチド配列は、一般に、コード配列の５’側または転写の開始点に位置する配列に関連している。例えば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置している。

操作される：本明細書で使用される場合、本開示の実施形態は、出発点、野生型、または天然分子から変化する、構造的または化学的であるかどうかにかかわらず、特徴または特性を有するように設計される場合に「操作されている」。

「外因性」分子は、通常細胞中に存在しないが、１つ以上の遺伝子学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「通常は細胞に存在する」ことは、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成人筋肉細胞に対して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能バージョンまたは正常に機能する内因性分子の機能不全バージョンを含み得る。

外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって生成される分子等の小分子であり得るか、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上述の分子の任意の修飾された誘導体、もしくは上述の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体等の巨大分子であり得る。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、直線状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、及びヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。

外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞に導入される感染ウイルスゲノム、プラスミド、もしくはエピソーム、または細胞中に通常存在しない染色体を含み得る。細胞に外因性分子を導入するための方法が当業者に知られており、脂質媒介導入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入、及びウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。外因性分子は、内因性分子と同一の種類の分子でもあり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、本来はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入され得る。

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子及び酵素を含み得る。

「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例として、プラスミド及びあるウイルスゲノムが挙げられる。

「真核」細胞には、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物の処理（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端処理による）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、（４）ポリペプチドまたはタンパク質の折り畳み、及び（５）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾の事象のうちの１つ以上を指す。

発現ベクター、発現構築物、プラスミド、または組換えＤＮＡ構築物は、一般に、例えば、宿主細胞における、特定の核酸．ｃｎｄｏｔの転写または翻訳を可能にする一連の特定の核酸エレメントによって、組換え手段または直接化学合成を含む、ヒトの介入によって生成された核酸を指すと理解されている。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されて転写される核酸を含むことができる。

ポリヌクレオチド配列に適用される「断片」という用語は、参照核酸に比べて長さが短く、共通部分に参照核酸と同一のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を指す。本発明によるそのような核酸断片は、適切な場合、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチドに含まれ得る。そのような断片は、本発明による核酸の連続したヌクレオチドのうちの少なくとも６、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３９、４０、４２、４５、４８、５０、５１、５４、５７、６０、６３、６６、７０、７５、７８、８０、９０、１００、１０５、１２０、１３５、１５０、２００、３００、５００、７２０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、またはそれ以上の範囲の長さのオリゴヌクレオチドを含むか、または代替的にそれからなる。

タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能性断片」は、その配列が、全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一の機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能性断片は、対応する天然分子よりも多い残基、少ない残基、もしくは対応する天然分子と同一の数の残基を有し得、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コーディング機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能を、例えば、フィルタ結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断をゲル電気泳動によって評価することができる。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力を、例えば、免疫共沈降、２ハイブリッドアッセイ、または相補性（遺伝的及び生化学的の両方）によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６、米国特許第５，５８５，２４５号及びＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「機能性」生体分子は、それが特徴付けられる特性及び／または活性を呈する構造及び形態の生物学的実体である。

「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に結合した分子である。サブユニット分子は、同一の化学型の分子であり得るか、または異なる化学型の分子であり得る。第１のタイプの融合分子の例には、融合タンパク質、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ及び／またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）とヌクレアーゼ（切断）ドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼなど）及び融合核酸（例えば、前出の融合タンパク質をコードする核酸）との間の融合が含まれるが、これらに限定されない。第２のタイプの融合分子の例として、三本鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、及び副溝結合剤と核酸との間の融合が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達に起因し得、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断、及びポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドを送達するための方法が本開示のいずこかに提示されている。

「遺伝子」は、転写のみ（例えば、生物活性ＲＮＡ種）または転写及び翻訳（例えば、ポリペプチド）によって産生される機能性分子を含む機能性分子をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸を包含する。「遺伝子」はまた、コード配列の前（５’非コード配列）及び後（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のＲＮＡ、タンパク質、またはポリペプチドを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自身の調節配列を有する自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界で一緒に見出されない調節及び／またはコード配列を含む、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、あるいは同じ供給源に由来するが自然界に見られるものとは異なる方法で配置された調節配列及びコード配列を含み得る。キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来するコード配列及び／または異なる供給源に由来する調節配列を含み得る。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム内の自然な位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子または「異種」遺伝子は、宿主生物には通常は見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、天然に存在しない生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。例えば、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）遺伝子はＩＬ－１２タンパク質をコードする。ＩＬ－１２は、３５ｋＤサブユニット（ｐ３５）と４０ｋＤサブユニット（ｐ４０）のヘテロ二量体であり、ジスルフィド結合を介して結合し、完全に機能するＩＬ－１２ｐ７０を形成する。ＩＬ－１２遺伝子は、ｐ３５サブユニットとｐ４０サブユニットの両方をコードしている。

転写されたポリヌクレオチドは、機能性タンパク質などのポリペプチドをコードする配列を有することができ、これは、適切な調節領域の制御下に置かれると、コードされるポリペプチドに翻訳され得る。遺伝子は、プロモーター、５’リーダー配列、コード配列、及びポリアデニル化部位などの３’非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結された断片を含み得、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を、そのような調節配列がコード及び／または転写された配列に隣接しているかどうかにかかわりなく含み得る。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含む。

キメラ遺伝子または組換え遺伝子は、例えば、プロモーターが転写されたＤＮＡ領域の一部または全部と自然界で関連していない遺伝子など、通常は自然界には見られない遺伝子である。「遺伝子の発現」は、遺伝子がＲＮＡに転写される、及び／または機能性タンパク質に翻訳されるプロセスを指す。

「遺伝子送達」または「遺伝子導入」は、組換えまたは外来ＤＮＡを宿主細胞に導入するための方法を指す。導入されたＤＮＡは、宿主細胞のゲノムに組み込まれていないままであるか、または好ましくは宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。遺伝子送達は、例えば、ウイルスベクターを使用する形質導入によって、またはエレクトロポレーション、細胞衝撃などの既知の方法を使用する細胞の形質転換によって行うことができる。

「ゲノム」という用語には、染色体、ならびにミトコンドリア、葉緑体、及びウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。

「ヘッドトゥーヘッド（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ）」という用語は、本明細書では、互いに対する２つのポリヌクレオチド配列の配向を説明するために使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドの５’末端から離れて進行する場合、ヘッドトゥーヘッドの方向に配置されている。「ヘッドトゥーヘッド」という用語は、（５’）トゥー（５’）と省略される場合がある。

「テールトゥーテール（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）」という用語は、本明細書では、互いに対する２つのポリヌクレオチド配列の配向を説明するために使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドに向かって進行する場合、テールトゥーテールの方向に配置されている。「テールトゥーテール」という用語は、（３’）トゥー（３’）と省略される場合がある。

「ヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ－ｔｏ－ｔａｉｌ）」という用語は、本明細書では、互いに対する２つのポリヌクレオチド配列の配向を説明するために使用される。２つのポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチドのコード鎖の５’末端が他方のポリヌクレオチドのコード鎖の３’末端に隣接し、それにより、各ポリヌクレオチドの転写の方向が他のポリヌクレオチドの転写の方向と同じ方向に進行する場合、ヘッドトゥーテールの方向に配置されている。「ヘッドトゥーテール」という用語は、（５’）トゥー（３’）と省略される場合がある。

本明細書で使用される「異種ＤＮＡ配列」、「外因性ＤＮＡセグメント」、または「異種核酸」という用語はそれぞれ、特定の宿主細胞に外来の供給源に由来するか、または同じ供給源に由来する場合は元の形態から改変される配列を指す。したがって、宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に内因性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用によって改変された遺伝子を含む。この用語には、天然に存在するＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピーも含まれる。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来または異種であるか、または細胞に対して相同であるが、要素が通常は見出されない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを生成するように発現される。「相同な」ＤＮＡ配列は、それが導入される宿主細胞に自然に関連するＤＮＡ配列である。

「異種ＤＮＡ」は、細胞内、または細胞の染色体部位に天然に位置していないＤＮＡを指す。異種ＤＮＡは、細胞にとって外来の遺伝子を含み得る。

「相同組換え」は、別のＤＮＡ分子への外来ＤＮＡ配列の挿入、例えば、染色体へのベクターの挿入を指す。好ましくは、ベクターは、相同組換えのために特異的な染色体部位を標的とする。特異的な相同組換えの場合、ベクターは染色体の配列に対して十分に長い相同領域を含み、染色体へのベクターの相補的結合及び組み込みを可能にする。より長い相同領域、及びより高度な配列類似性は、相同組換えの効率を高め得る。

免疫細胞：本明細書で使用される場合の「免疫細胞」という用語は、骨髄中の造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を指し、これは、２つの主要な系統、骨髄前駆細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球、顆粒球などの骨髄細胞を発生する）とリンパ系前駆細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ系細胞を発生する）を発生する。例示的な免疫系細胞には、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブＴ細胞、Ｔγδ細胞、Ｔαβ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び樹状細胞が含まれる。マクロファージ及び樹状細胞は、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と呼ぶことができ、これらは、ペプチドと複合体を形成したＡＰＣの表面にある主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面のＴＣＲと相互作用するときにＴ細胞を活性化できる特別な細胞である。

免疫療法：本明細書で使用される場合の「免疫療法」という用語は、疾患に対する免疫系の反応性の誘導または回復による疾患の治療の種類を指す。

免疫療法薬：本明細書で使用される場合の「免疫療法薬」という用語は、生物学的、医薬、または化合物による疾患に対する免疫系の反応性の誘導または回復による疾患の治療を指す。

本発明の目的のための「単離された」という用語は、元の環境（それが自然に存在する環境）から取り出された生物由来物質（細胞、核酸またはタンパク質）を指す。例えば、植物または動物に自然状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、それが天然に存在する隣接する核酸から分離された同じポリヌクレオチドは「単離された」とみなされる。

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現を調節することができる。遺伝子の不活性化とは、本明細書に記載のＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含まない細胞と比較した場合の遺伝子発現の低下を指す。したがって、遺伝子の不活性化は部分的または完全であり得る。

改変：本明細書で使用される場合、「改変された」という用語は、親または参照分子または実体と比較した、分子または実体の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む多くの方法で改変することができる。いくつかの実施形態では、本開示の化合物及び／または組成物は、非天然アミノ酸の導入によって改変される。

変異：本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、変化及び／または改変を指す。いくつかの実施形態では、変異は、タンパク質（ペプチド及びポリペプチドを含む）及び／または核酸（ポリ核酸を含む）に対する変化及び／または改変であり得る。いくつかの実施形態では、変異は、タンパク質及び／または核酸配列への変化及び／または改変を含む。そのような変化及び／または改変は、１つ以上のアミノ酸（タンパク質及び／またはペプチドの場合）及び／またはヌクレオチド（核酸及び／またはポリ核酸、例えばポリヌクレオチドの場合）の付加、置換及び／または欠失を含み得る。変異がアミノ酸及び／またはヌクレオチドの付加及び／または置換を含むいくつかの実施形態では、そのような付加及び／または置換は、１つ以上のアミノ酸及び／またはヌクレオチド残基を含み得、そして改変されたアミノ酸及び／またはヌクレオチドを含み得る。変異、変化、または改変の得られた構築物、分子、または配列は、本明細書では変異体と呼ばれ得る。

「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）、またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル高分子形態、または一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかのホスホロチオエート及びチオエステルなどのそれらの任意のホスホエステル類似体を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次及び二次構造のみを指し、特定の三次形態に限定されない。したがって、この用語には、とりわけ、直線状または環状のＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、スーパーコイル状のＤＮＡ、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際に、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向の配列のみを与えるという通常の慣習に従って本明細書で記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び半合成ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「単離された核酸断片」は、一本鎖または二本鎖であり、任意選択で合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。

外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意の種類のコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つ以上の制御エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。加えて、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を生成し得る。

作動可能に連結された：本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という語句は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的結合を指す。

核酸配列及びポリヌクレオチドを指す場合の「作動可能に連結された」または「機能的に連結された」は、一方の機能が他方によって影響を受け、一方で核酸配列は、必ずしも互いに隣接または隣接している必要はないが、それらの間に配列が介在していてもよい、単一の核酸断片での核酸配列の結合を指す。例えば、調節ＤＮＡ配列は、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を与えるように２つの配列が位置する（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）場合、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結」または「結合する」と言われる。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で調節配列に作動可能に連結することができる。転写制御配列は、概して、シスでコード配列と作動可能に結合されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが隣接していなくても、コード配列に作動可能に連結されている転写調節配列であるか、またはプロモーターが細胞内で目的の遺伝子の転写を調節または媒介する場合、プロモーターは目的の遺伝子に作動可能に連結されている。

典型的には、それは、転写調節配列と転写された配列との機能的関係を指す。例えば、ＥＦ－１プロモーターまたはエンハンサー配列は、適切な宿主細胞または他の発現システムにおけるコード配列の転写を刺激または調節する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写された配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写された配列に物理的に隣接している、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、転写が増強されるコード配列に物理的に隣接している必要はなく、近接して配置されている必要もない。ポリリンカーは、遺伝子がＡＰ－１プロモーターに作動可能に連結されるように、コード配列を挿入するための便利な場所を提供する。ポリリンカーは、一連の３つ以上の近接した制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含むポリヌクレオチド配列である。

融合ポリペプチドを作製するための２つ以上のポリペプチドまたはそのドメイン間の結合において、「作動可能に連結された」という用語は、融合タンパク質中の１つのポリペプチドの状態または機能が、融合タンパク質中の他のポリペプチドによって影響を受けることを意味する。例えば、ＤＲＤ及びペイロードを含む融合タンパク質に関して、リガンドによるＤＲＤの安定化がペイロードの安定化をもたらし、一方でリガンドの非存在下でのＤＲＤの不安定化がペイロードを不安定にする場合、ＤＲＤ及びペイロードは、作動可能に連結されている。作動可能に連結されたという用語は、確かに、ＤＲＤがペイロードに隣接するかまたは直接融合される実施形態を含み得るが、ＤＲＤが他のヌクレオチド配列またはペプチドまたはポリペプチド配列によってペイロードから分離される場合などの他の実施形態もまた、リガンドによるＤＲＤの安定化がペイロードの安定化をもたらし、一方でリガンドの非存在下でのＤＲＤの不安定化がペイロードの不安定化をもたらす場合、「作動可能に」連結されている。

「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略され、ＡＴＧまたはＡＵＧなどの翻訳開始シグナルまたは開始コドン、及び終止コドンを含み、潜在的にポリペプチド配列に翻訳される可能性がある、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡのいずれかの一定の長さの核酸配列を指す。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体または改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「プラスミド」という用語は、細胞の中心代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形で遺伝子を運ぶことが多い染色体外要素を指す。そのような要素は、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直線状、環状、またはスーパーコイルであり得、多くのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のプロモーター断片とＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列とともに細胞に導入できる独自の構築物に結合されているかまたは組換えられている。本明細書に開示される出発プラスミドは、市販されているか、無制限に公に入手可能であるか、または周知の公開された手順の日常的な適用によって入手可能なプラスミドから構築することができる。本発明に従って使用することができる多くのプラスミド及び他のクローニング及び発現ベクターはよく知られており、当業者に容易に利用可能である。さらに、当業者は、本発明での使用に適した任意の数の他のプラスミドを容易に構築することができる。本発明におけるそのようなプラスミド、ならびに他のベクターの特性、構築及び使用は、本開示から当業者に容易に明らかになるであろう。

「ポリペプチド」という用語は、本明細書では「ポリペプチド」及び「タンパク質（複数可）」という用語と互換的に使用され、例えば、自然界のタンパク質に典型的に見られるようなアミノ酸残基のポリマーを指す。「成熟タンパク質」は、全長であり、任意選択で、所与の細胞膜におけるタンパク質に典型的なグリコシル化または他の修飾を含むタンパク質である。

「プロモーター」及び「プロモーター配列」は互換的に使用され、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置している。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来するか、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されるか、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえあり得る。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境または生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を誘導し得ることが当業者によって理解されている。本明細書で使用されるとき、「プロモーター」は、ポリメラーゼＩＩタイププロモーターの場合においては、ＴＡＴＡエレメントなどの、転写の開始部位の近くで必要な核酸配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを、必要に応じて含み得る。

ほとんどの場合、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を特定の細胞型で発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階で発現させるプロモーターは、一般に「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターを誘導する薬剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などで細胞を曝露または処理した後に誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導性プロモーター」または「調節可能プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があることがさらに認識されている。プロモーター配列は、典型的には、その３’末端において転写開始部位によって境界とされ、上流（５’の方向）に伸長し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることによって便利に定義される）、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。

遺伝子のプロモーター領域には、典型的には、構造遺伝子の５’側にある転写調節エレメントが含まれる。遺伝子が活性化される場合、転写因子として知られるタンパク質が遺伝子のプロモーター領域に結合する。このアセンブリは、酵素が２番目の遺伝子セグメントをＤＮＡからＲＮＡに転写できるようにすることで、「オンスイッチ」に類似する。ほとんどの場合、得られたＲＮＡ分子は、特定のタンパク質を合成するためのテンプレートとして機能し、しばしばＲＮＡ自体が最終産物となることもある。プロモーター領域は、正常な細胞プロモーターまたは腫瘍プロモーターであり得る。

生物由来物質に適用される「精製された」という用語は、他の化合物の存在を排除して、絶対的な純度を示す形態で材料が存在することを必要としない。それはむしろ相対的な定義である。

ペイロードまたは目的のペイロード（ＰＯＩ）：本明細書で使用される場合の「ペイロード」及び「目的のペイロード（ＰＯＩ）」という用語は、互換的に使用される。目的のペイロード（ＰＯＩ）とは、機能が改変されるタンパク質または化合物を指す。本開示の文脈において、ＰＯＩは、自然免疫系と適応免疫系の両方を含む免疫系の構成要素である。目的のペイロードは、タンパク質、融合タンパク質をコードする融合構築物、または非コード遺伝子、あるいはそれらの変異体及び断片であり得る。目的のペイロードまたはペイロードは、アミノ酸ベースの場合、目的のタンパク質と呼ばれることがある。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチドバリアント」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然または参照アミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に、置換、欠失、及び／または挿入を有する。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有し、好ましくは、それらは、天然または参照配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一（相同）である。

いくつかの実施形態では、「バリアント模倣物」が提供される。本明細書で使用される場合、「バリアント模倣物」という用語は、活性化された配列を模倣するであろう１つ以上のアミノ酸を含むバリアントを指す。例えば、グルタミン酸は、ホスホトレオニン及び／またはホスホセリンの模倣物として機能し得る。代替的に、バリアント模倣物は、不活性化をもたらすか、または模倣物を含む不活化産物をもたらし得る。例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活化置換として作用し得る。またはアラニンはセリンの不活性化置換として機能し得る。本開示のそれらのＳＲＥまたはペイロードを含む医薬組成物、生体回路、回路構成要素、エフェクターモジュールのアミノ酸配列は、天然に存在するアミノ酸を含み得、したがって、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、またはそれらの断片とみなされ得る。代替的に、それらのＳＲＥまたはペイロードを含む医薬組成物、生体回路、生体回路構成要素、エフェクターモジュールは、天然に存在するアミノ酸と天然に存在しないアミノ酸の両方を含み得る。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列バリアント」という用語は、天然または出発配列と比較して、それらのアミノ酸配列にいくつかの違いがある分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、アミノ酸配列内のある特定の位置に、置換、欠失、及び／または挿入を有する。本明細書で使用される場合、配列を指す場合の「天然」または「出発」という用語は、比較を行うことができる元の分子を指す相対的な用語である。天然または出発配列を野生型配列と混同するべきではない。天然配列または分子は、野生型（自然界に見られる配列）を表す場合があるが、野生型配列と同一である必要はない。

通常、バリアントは、天然配列に対して少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくは、それらは、天然配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するであろう。

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列に適用される「相同性」という用語は、配列をアラインメントさせ、必要に応じて、最大パーセントの相同性を達成するためのギャップを導入した後の第２の配列のアミノ酸配列の残基と同一である候補アミノ酸配列の残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当該技術分野でよく知られている。相同性は同一性パーセントの計算に依存するが、計算で導入されたギャップとペナルティのために値が異なる場合があることが理解される。

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列に適用される「相同体」という用語は、第２の種の第２の配列と実質的な同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。

本明細書で使用される場合、「類似体」という用語は、１つ以上のアミノ酸改変、例えば、親ポリペプチドの特性を依然として維持するアミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチドバリアントを含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義的に使用され、参照分子または出発分子に対して何らかの方法で改変または変更された分子を指す。

薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される場合の「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、医薬組成物中に存在し、対象において実質的に非毒性及び非炎症性であるという特性を有する活性剤（例えば、本明細書に記載される）以外の任意の成分を指す。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、活性剤を懸濁及び／または溶解することができるビヒクルである。賦形剤には、例えば、付着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、皮膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、香料、流動促進剤（流動促進剤）、潤滑剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味料、及び水和水が含まれ得る。例示的な賦形剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコール酸、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが含まれるが、これらに限定されない。

薬学的に許容される塩：本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩は、酸または塩基の部分がその塩形態である（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることによって生成される）開示された化合物の形態である。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されないアミンカチオンが含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性の無機酸または有機酸に由来する従来の非毒性の塩が含まれる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性の部分を含む親化合物から調製される。一般的に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中または有機希釈剤または２つの混合物中の化学量論的な量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ． １４１８， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ， Ｐ．Ｈ． Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ． Ｗｅｒｍｕｔｈ （ｅｄｓ．）， Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００８， ａｎｄ Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ６６， １－１９ （１９７７）に見出され、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。薬学的に許容される溶媒和物：本明細書で使用される場合の「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、適切な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれている化合物の結晶形態を指す。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製することができる。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、溶媒和物に組み込まれる溶媒は、溶媒和物が投与される生物に対して生理学的に許容される種類またはレベルである（例えば、医薬組成物の単位剤形において）。

「組換え」という用語は、当該技術分野での通常の意味を有し、インビトロで合成または他の方法で操作されるポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）を指し、細胞または他の生物学的システムにおいて遺伝子産物を産生するために組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）を指す。細胞に関して使用される場合、この用語は、細胞が異種核酸を複製するか、または異種核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態には見られない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた細胞の天然の形態に見られる遺伝子を含むことができ、遺伝子は改変され、人工的な手段によって細胞に再導入される。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなく改変された細胞に内因性の核酸を含む細胞を包含し、そのような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異、及び関連する技術によって得られるものが含まれる。

「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、組換えまたは合成的に生成された核酸構築物であり、そのような配列と互換性のある宿主の制御エレメントに作動可能に連結されている構造遺伝子の発現に影響を及ぼし得る制御エレメントを有する。発現カセットは、少なくともプロモーター及び任意選択で転写終結シグナルを含む。典型的には、組換え発現カセットは、少なくとも転写される核酸と、プロモーターと、を含む。発現をもたらすのに必要または有用な追加の因子もまた、本明細書に記載されるように使用することができる。例えば、遺伝子発現に影響を与える転写終結シグナル、エンハンサー、及び他の核酸配列もまた、発現カセットに含まれ得る。

「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換えによるドナー捕捉を含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復メカニズムを介した細胞における二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を用いて「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経た分子）を鋳型修復し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすことにより、「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として広く知られている。特定の理論に拘束されることを望まないが、そのような導入は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／またはドナーが標的の一部となる遺伝情報を再合成するために使用される「合成依存的鎖アニーリング」、及び／または関連するプロセスを含み得る。そのような特殊化されたＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、多くの場合、標的分子の配列の改変をもたらす。本明細書に記載の方法のいずれにおいても、遺伝子編集ヌクレアーゼの追加の対を使用して、細胞内の追加の標的部位の追加の二本鎖切断を行うことができる。

「目的の領域」は、例えば、遺伝子、または遺伝子内の非コード配列もしくは遺伝子に隣接した非コード配列などの細胞クロマチンの任意の領域であり、その中で外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的化されたＤＮＡ切断及び／または標的化された組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー配列、もしくはイントロン等）内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内に存在し得る。目的の領域は、単一のヌクレオチド対という小さいものから最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、またはヌクレオチド対の任意の整数値までとすることができる。

「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター遺伝子の効果に基づいて同定することができる同定因子をコードする核酸を指し、その効果は、目的の核酸の遺伝を追跡し、目的の核酸を遺伝している細胞または生物を同定するために、及び／または遺伝子発現の誘導または転写を測定するために使用される。当該技術分野で知られ使用されているレポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが含まれる。選択可能なマーカー遺伝子もレポーター遺伝子とみなすことができる。

「応答エレメント」という用語は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインとの相互作用を介して媒介されるプロモーターに応答性を与える１つ以上のシス作用性ＤＮＡエレメントを指す。このＤＮＡエレメントは、その配列がパリンドローム（完全または不完全）であるか、配列モチーフまたは可変数のヌクレオチドで分離されたハーフ部位のいずれかで構成され得る。ハーフ部位は類似または同一であり、直接または逆方向反復のいずれかとして、または単一のハーフ部位または隣接するハーフ部位のマルチマーとしてタンデムに配置することができる。応答エレメントは、応答エレメントが組み込まれている細胞または生物の性質に応じて、異なる生物から単離された最小のプロモーターを含み得る。転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、リガンドの存在下または非存在下で、応答エレメントのＤＮＡ配列に結合し、この応答エレメントの制御下で下流の遺伝子（複数可）の転写を開始または抑制する。

「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、直線状、環状、または分岐状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。

「選択可能なマーカー」という用語は、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどに基づいて選択することができる識別因子、通常は抗生物質または化学的耐性遺伝子を指し、効果は、目的の核酸の遺伝を追跡するために、及び／または目的の核酸を遺伝した細胞または生物を同定するために使用される。当該技術分野で知られ使用されている選択可能なマーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。

安定性：本明細書で使用される場合、「安定性」は、反応混合物からの有用な純度までの単離に耐えるのに十分に頑強であり、好ましくは有効な治療薬に製剤化することができる化合物または実体を指す。

本明細書で使用される場合、「安定化する」、「安定化された」、「安定化された領域」という用語は、安定化または安定化することを意味する。いくつかの実施形態では、安定性は絶対値に対して測定される。いくつかの実施形態では、安定性は、二次状態または状態、あるいは参照化合物または実体に対して測定される。

本明細書で使用される場合、「標準ＣＡＲ」という用語は、キメラ抗原受容体の標準設計を指す。細胞外ｓｃＦｖ断片、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内ドメインを含むＣＡＲ融合タンパク質の構成要素は、単一の融合タンパク質として直線的に構築される。

「対象」及び「患者」という用語は互換的に使用され、ヒト患者及び非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、及び他の動物などの実験動物を指す。したがって、本明細書で使用される場合の「対象」または「患者」という用語は、本発明の細胞または幹細胞を投与することができる任意の患者または対象（例えば、哺乳動物）を意味する。

Ｔ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を産生する免疫細胞である。Ｔ細胞はナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、及びＣＤ４５ＲＡの発現の増加、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現の減少）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原経験がある、長寿命）、及びエフェクター細胞（抗原経験がある、細胞傷害性）であり得る。ＴＭは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＤ９５の発現の増加、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の減少）と、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現の減少、ならびにＣＤ１２７の発現の増加）のサブセットにさらに分割できる。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）とは、ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現が減少し、グランザイム及びパーフォリンが陽性である抗原経験のあるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。他の例示的なＴ細胞には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）制御性性Ｔ細胞及びＴｒｅｇ１７細胞などの制御性Ｔ細胞、ならびにＴｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８－、及びＱａ－１拘束Ｔ細胞が含まれる。

Ｔ細胞受容体：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、可変抗原結合ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域、及び短い細胞質テールを有する免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを指し、これは、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる。ＴＣＲは細胞の表面または可溶型で見られ、一般にα鎖とβ鎖（それぞれＴＣＲαとＴＣＲβとしても知られる）、またはγ鎖とδ鎖（それぞれＴＣＲγとＴＣＲδとしても知られる）を有するヘテロダイマーで構成されている。ＴＣＲ鎖（例えば、α鎖、β鎖）の細胞外部分は、Ｎ末端に２つの免疫グロブリンドメイン、可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメインまたはＶα、β鎖可変ドメインまたはＶβ）、及び細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα及びβ鎖定常ドメインまたはＣβ）を含む。免疫グロブリンと同様に、可変ドメインには、フレームワーク領域（ＦＲ）で区切られた相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれている。ＴＣＲは通常、ＣＤ３複合体と結合してＴＣＲ複合体を形成する。本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」という用語は、ＣＤ３とＴＣＲとの結合によって形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲα鎖、及びＴＣＲβ鎖から構成され得る。代替的に、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、及びＴＣＲδ鎖から構成され得る。本明細書で使用される「ＴＣＲ複合体の構成要素」は、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、もしくはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、もしくはＣＤ３ζ）、または２つ以上のＴＣＲ鎖またはＣＤ３鎖によって形成される複合体（例えば、ＴＣＲαとＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγとＴＣＲδの複合体、ＣＤ３εとＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γとＣＤ３εの複合体）、またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及び２つのＣＤ３ε鎖のサブＴＣＲ複合体を指す。

治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／または状態の治療、症状の改善、診断、予防、及び／または発症の遅延のために、感染、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているか、またはそれらに感染しやすい対象に投与されるときに十分な送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回投与で提供される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、複数の用量を含む投与レジメンで投与される。当業者は、いくつかの実施形態では、単位剤形が、そのような投与レジメンの一部として投与されたときに有効な量を含む場合、治療有効量の特定の薬剤または実体を含むと見なされ得ることを理解するであろう。

治療または治療すること：本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」という用語は、有益または所望の臨床結果を含む、好ましくはそれらである、有益または所望の結果を得るためのアプローチを示す。そのような有益または所望の臨床結果としては、がん性細胞または他の疾患細胞の増殖の低減（もしくはその破壊）、がんで見られるがん性細胞の転移の低減、腫瘍サイズの縮小、疾患に起因する症状の減少、疾患に罹患している者の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の薬物の用量の減少、疾患の進行の遅延、及び／または個体の生存期間の延長のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。

調整：本明細書で使用される場合、「調整」という用語は、刺激に応答して、または特定の結果に向けて、１つのものを調整、バランス化、または適応させることを意味する。１つの非限定的な例では、本開示のＤＲＤは、特定の刺激及び／または環境に応答して、それらが付加、結合、または結合する組成物の機能または構造を調整、バランス化、または適合させる。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列に少なくともいくらかの配列相同性を示す。

「標的部位」または「標的配列」は、結合するのに十分な条件が存在する場合、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。「意図された」標的部位は、ＤＮＡ結合分子が結合するように設計及び／または選択される部位である。

転写とは、ＲＮＡポリメラーゼと遺伝子との相互作用を伴うプロセスを指し、遺伝子のコード配列に存在する構造情報のＲＮＡとしての発現を誘導する。このプロセスには、（１）転写開始ステップ、（２）転写伸長ステップ、（３）転写スプライシングステップ、（４）転写キャッピングステップ、（５）転写終止ステップ、（６）転写ポリアデニルステップ化、（７）転写物の核外輸送ステップ、（８）転写物の編集ステップ、及び（９）転写物の安定化ステップが含まれるがこれらに限定されない。

転写調節エレメントまたは配列には、プロモーター配列（例えば、ＴＡＴＡボックス）、エンハンサーエレメント、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイが含まれるが、これらに限定されない。それは、それに作動可能に連結された遺伝子の転写を制御または制御する。

本明細書で使用される「転写可能な核酸分子」は、ＲＮＡ分子に転写されることができる任意の核酸分子を指す。転写可能な核酸分子が、翻訳され、したがってタンパク質産物として発現される機能的なｍＲＮＡ分子に転写されるような方法で、構築物を細胞に導入するための方法が知られている。構築物はまた、目的の特定のＲＮＡ分子の翻訳を阻害するために、アンチセンスＲＮＡ分子を発現することができるように構築され得る。

「転写開始部位」または「開始部位」は、転写された配列の一部である１番目のヌクレオチドを囲む位置であり、これは、位置＋１としても定義される。この部位に対して、遺伝子の他のすべての配列及びその制御領域に番号を付けることができる。下流の配列（すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）は正と呼ばれ、上流の配列（５’方向の主に制御領域）は負と呼ばれる。

「導入遺伝子」は、宿主細胞に導入された遺伝子を指す。導入遺伝子は、細胞にとって天然である配列、細胞内で天然に存在しない配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。導入遺伝子は、細胞内のコード配列の発現のための適切な調節配列に作動可能に連結され得る１つ以上のタンパク質をコードする配列を含み得る。

「形質導入」は、レンチウイルスベクターまたはｒＡＡＶなどの遺伝子送達ベクターなどによる、レシピエント宿主細胞への核酸分子の送達を指す。例えば、ｒＡＡＶビリオンによる標的細胞の形質導入は、そのビリオンに含まれるｒＡＡＶベクターの形質導入された細胞への移入をもたらす。「宿主細胞」または「標的細胞」は、核酸送達が行われる細胞を指す。

「形質転換」という用語は、遺伝的に安定した遺伝をもたらす、宿主細胞のゲノムへの核酸断片の導入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主細胞は「トランスジェニック」細胞と呼ばれ、トランスジェニック細胞を含む生物は「トランスジェニック生物」と呼ばれる。

「形質転換された」、「トランスジェニック」、及び「組換え」は、異種核酸分子が導入された細菌、シアノバクテリア、動物、または植物などの宿主細胞または生物を指す。核酸分子は、当該技術分野で一般に知られており、開示されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ １９８９；Ｉｎｎｉｓ １９９５；Ｇｅｌｆａｎｄ １９９５；Ｉｎｎｉｓ ＆ Ｇｅｌｆａｎｄ １９９９）ように、ゲノムに安定して組み込むことができる。ＰＣＲの既知の方法には、対のプライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチのプライマーなどを使用する方法が含まれるが、これらに限定されない。「形質転換されていない」という用語は、形質転換プロセスを経ていない正常細胞を指す。

「トランスフェクション」という用語は、細胞による外因性または異種のＲＮＡまたはＤＮＡの取り込みを指す。細胞は、外因性または異種のＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内部に導入されたときに、そのようなＲＮＡまたはＤＮＡによって「トランスフェクト」されている。トランスフェクトされたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす場合、細胞は外因性または異種のＲＮＡまたはＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換させたＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合）ていてもよい。

「形質転換」は、遺伝的に安定した遺伝をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸断片の導入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。

「転写及び翻訳制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのようなＤＮＡ調節配列を指す。真核細胞では、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。

ＡＰ－１のモジュレーターなどの分子の「バリアント」は、分子全体またはその断片のいずれかと構造及び生物活性が実質的に類似している分子を指すことを意味する。したがって、２つの分子が同様の活性を持っている場合、一方の分子の組成または二次、三次、または四次構造が他方に見られるものと同一でない場合でも、またはアミノ酸残基の配列が同一でない場合でも、その用語が本明細書で使用される場合、それらはバリアントとみなされる。

「ベクター」は、核酸のクローニング及び／または宿主細胞への導入のための任意のビヒクルを指す。ベクターは、結合したセグメントの複製をもたらすために、別のＤＮＡセグメントが結合し得るレプリコンであり得る。「レプリコン」とは、インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製することができる任意の遺伝的要素（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルスと非ウイルスのビヒクルの両方を含む。当該技術分野で知られている多数のベクターを使用して、核酸を操作し、応答エレメント及びプロモーターを遺伝子などに組み込むことができる。可能性のあるベクターとしては、例えば、例えばラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはｐＢＲ３２２もしくはｐＵＣプラスミド誘導体、もしくはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどのプラスミドを含むプラスミドまたは改変ウイルスが挙げられる。例えば、適切なベクターへの応答エレメント及びプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、相補的な付着端を有する選択されたベクターに適切なＤＮＡ断片を連結することによって達成することができる。代替的に、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変するか、またはヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結することによって任意の部位を生成することができる。そのようなベクターは、マーカーを細胞ゲノムに組み込んだ細胞の選択を提供する選択可能なマーカー遺伝子を含むように操作することができる。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされるタンパク質を組み込んで発現する宿主細胞の同定及び／または選択を可能にする。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び（主に酵母と細菌で）「人工染色体」が含まれる。「発現ベクター」は、ベクターにクローン化される核酸の転写を提供または促進する要素を含むベクターである。そのような要素は、例えば、目的の核酸に作動可能に結合されたプロモーター及び／またはエンハンサーを含むことができる。

「クローニングベクター」は、連続的に複製し、複製起点を含み、これに対して別の核酸セグメントが結合して結合したセグメントの複製をもたらす、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどの、核酸、好ましくはＤＮＡの単位長である「レプリコン」を指す。クローニングベクターは、ある細胞型で複製し、別の細胞型で発現することができるものであり得る（「シャトルベクター」）。クローニングベクターは、ベクターを含む細胞の選択に使用できる１つ以上の配列、及び／または目的の配列を挿入するための１つ以上のマルチクローニング部位を含み得る。

「発現ベクター」という用語は、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計されたベクター、プラスミド、またはビヒクルを指す。クローン化された遺伝子、すなわち挿入された核酸配列は、通常、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサーなどの制御要素の制御下に置かれる。所望の宿主細胞における核酸の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。これらの遺伝子の発現を駆動することができる事実上すべてのプロモーターを発現ベクターで使用することができ、これらとしては、ウイルスプロモーター、細菌プロモーター、動物プロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、病因または疾患関連プロモーター、発生特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光調節プロモーター；ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰ１、アルカリホスファターゼプロモーター（サッカロミセス属での発現に有用）；ＡＯＸ１プロモーター（ピキア属での発現に有用）；ベータラクタマーゼ、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、及びｔｒｃプロモーター（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの発現に有用）；光調節－、種子特異的－、花粉特異的－、卵巣特異的－、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ、ＣＭＶ ３５Ｓ最小、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質、リブロース１，５－二リン酸カルボキシラーゼ、芽特異的、根特異的、キチナーゼ、ストレス誘導性、イネツングロ稈菌状ウイルス、植物スーパープロモーター、ポテトロイシンアミノペプチダーゼ、硝酸レダクターゼ、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ、ユビキチン、ゼインタンパク質、及びアントシアニンプロモーター（植物細胞での発現に有用）；ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）に含まれるプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルス１Ｅ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｌプロモーター及び転写制御領域の調節配列、ユビキタスプロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α－アクチン、チューブリンなど）、中間フィラメントのプロモーター（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰなど）、治療遺伝子のプロモーター（ＭＤＲ、ＣＦＴＲまたは第ＶＩＩＩ因子タイプなど）、病因または疾患関連プロモーター、及び組織特異性を示すプロモーター、トランスジェニック動物で利用されてきたプロモーター、例えば、膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ球細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣、乳房、リンパ球、及び肥満細胞で活性なマウス乳がんウイルス制御領域；アルブミン遺伝子、肝臓で活性なＡｐｏＡＩ及びＡｐｏＡＩＩ制御領域、肝臓で活性なα－フェトタンパク質遺伝子制御領域、肝臓で活性なα１－アンチトリプシン遺伝子制御領域、骨髄細胞で活性なベータグロビン遺伝子制御領域、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋で活性なミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域、視床下部で活性な性腺刺激性放出ホルモン遺伝子制御領域、ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモーター、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞α－アクチンのプロモーターなどのプロモーターを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている動物及び哺乳動物プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、これらの発現配列は、エンハンサーまたは調節配列などの付加によって改変され得る。

ベクターは、当該技術分野で知られている方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＦデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーター（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９６３ （１９９２）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１４６２１ （１９８８）；及びＨａｒｔｍｕｔらのカナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照されたい）によって所望の宿主細胞へと導入できる。

ウイルスベクター、特にレンチウイルス及びレトロウイルスベクターは、生きている動物の対象だけでなく、細胞内のさまざまな遺伝子送達アプリケーションで使用されてきた。使用できるウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン・バー、アデノウイルス、ジェミニウイルス、及びカリモウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ－タンパク質複合体、及び生体高分子が挙げられる。核酸に加えて、ベクターはまた、１つ以上の調節領域、及び／または核酸導入結果（どの組織への導入、発現の持続時間など）の選択、測定、及びモニタリングに有用な選択可能なマーカーを含み得る。

当該技術分野で知られているいくつかの方法を使用して、本発明によるポリヌクレオチドを増殖させることができる。適切な宿主システム及び増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターを増殖させ、大量に調製することができる。本明細書に記載されるように、使用できる発現ベクターとしては、レンチウイルス、ワクシニアウイルスまたはＡＡＶまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、プラスミド及びコスミドＤＮＡベクターなどのベクターまたはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のベクターはまた、筋肉内投与を含むがこれに限定されない任意の投与経路によって対象に投与され得る。

本開示によるポリヌクレオチドはまた、リポフェクションによってインビボで導入され得る。インビトロでの核酸のカプセル化及びトランスフェクションのためのリポソームの使用が増加している。リポソームを介したトランスフェクションで遭遇する困難と危険を制限するように設計された合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームを調製することができる。カチオン性脂質の使用は、負に帯電した核酸のカプセル化を促進し得、また負に帯電した細胞膜との融合を促進し得る。核酸の導入に特に有用な脂質化合物及び組成物は、ＷＯ９５／１８８６３、ＷＯ９６／１７８２３、及び米国特許第５，４５９，１２７号に記載されている。インビボで特定の臓器に外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実際的な利点を有する。特定の細胞へのリポソームの分子標的化は、１つの利点の領域を表している。膵臓、肝臓、腎臓、脳などの細胞の不均一性を持つ組織では、特定の細胞型にトランスフェクションを誘導することが特に好ましいことは明らかである。脂質は、標的化の目的で他の分子に化学的に結合することができる。標的ペプチド、例えばホルモンまたは神経伝達物質、ならびに抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子は、リポソームに化学的に結合することができる。

カチオン性オリゴペプチド（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド（例えば、ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＷＯ９５／２１９３１）などの他の分子もまた、インビボでの核酸のトランスフェクションを促進するために有用である。

ネイキッドＤＮＡプラスミドとしてインビボでベクターを導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号及び第５，５８０，８５９号を参照されたい）。受容体を介したＤＮＡ送達アプローチも使用できる。

さらに、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、それらの増幅またはそれらの発現が求められる細胞宿主における複製のための１つ以上の起点、マーカー、または選択可能なマーカーを含み得る。

タンパク質を指す場合の「置換バリアント」は、天然または出発配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、同じ位置でその場所に異なるアミノ酸が挿入されているものである。置換は、分子内の１つのアミノ酸のみが置換されている単一の場合もあれば、同じ分子内で２つ以上のアミノ酸が置換されている複数の場合もある。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸を、同様のサイズ、電荷、または極性である、異なるアミノ酸で置換することを指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基の別の非極性残基への置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、及びグリシンとセリンの間など、ある極性（親水性）残基の別の残基への置換が含まれる。さらに、リシン、アルギニン、またはヒスチジンなどの塩基性残基を別の残基に置換すること、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などのある酸性残基を別の酸性残基に置換することは、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジンなどの極性（親水性）残基への置換、及び／または極性残基の非極性残基への置換が含まれる。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「挿入バリアント」という用語は、天然または出発配列の特定の位置でアミノ酸にすぐ隣接して挿入された１つ以上のアミノ酸を有するものである。本明細書で使用される場合、「すぐ隣接する」という用語は、出発アミノ酸または参照アミノ酸のアルファ－カルボキシまたはアルファ－アミノ官能基のいずれかに接続されている隣接アミノ酸を指す。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「欠失バリアント」という用語は、天然または出発アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは、分子の特定の領域で１つ以上のアミノ酸が欠失している。

本明細書で使用される場合、本明細書で言及される場合の「誘導体」という用語は、有機タンパク質性または非タンパク質性の誘導体化剤による１つ以上の修飾、及び翻訳後修飾を含む天然または出発タンパク質のバリアントを含む。共有結合修飾は、伝統的に、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞で機能する翻訳後修飾のメカニズムを利用することによって導入される。得られた共有結合誘導体は、生物活性、イムノアッセイ、または組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製に重要な残基を同定することを目的としたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は当業者の範囲内であり、過度の実験なしに実行される。

本開示のタンパク質の特徴には、表面発現、局所的立体配座形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「特徴」という用語は、分子の別個のアミノ酸配列に基づく構成要素として定義される。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「表面発現」という用語は、最も外側の表面に現れるタンパク質のポリペプチドに基づく構成要素を指す。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「局所的立体配座形状」という用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチドに基づく構造的発現を指す。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化の際に得られるアミノ酸配列の立体配座を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次または三次レベルで発生し得る。二次レベルの折り畳みの例には、ベータシートとアルファヘリックスが含まれる。三次折り畳みの例には、エネルギー力の凝集または分離によって形成されたドメイン及び領域が含まれる。このようにして形成された領域には、疎水性及び親水性のポケットなどが含まれる。

本明細書で使用される場合、タンパク質コンフォメーションに関連する「ターン」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変える屈曲を指し、１、２、３、またはそれ以上のアミノ酸残基を含み得る。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させ、４つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドまたはポリペプチドの構造的特徴を指す。Ｏｌｉｖａらは、少なくとも５つのクラスのタンパク質ループを同定した（Ｏｌｉｖａ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｏｐｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９７． ２６６（４）：８１４－３０．）。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「ハーフループ」という用語は、それが由来するループとして存在するアミノ酸の数の少なくとも半分を有する同定されたループの一部を指す。ループが常に偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことが理解される。したがって、ループに奇数のアミノ酸が含まれている、または含まれていると同定された場合、奇数のループのハーフループは、ループの整数部分または次の整数部分（ループのアミノ酸数／２＋／－０．５アミノ酸）からなる。例えば、７アミノ酸ループとして同定されたループは、３アミノ酸または４アミノ酸のハーフループを生成し得る（７／２＝３．５＋／－０．５は３または４である）。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「ドメイン」という用語は、１つ以上の識別可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、タンパク質間相互作用の部位として機能する結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「ハーフドメイン」という用語は、それが由来するドメインとして存在するアミノ酸の数の少なくとも半分を有する同定されたドメインの一部を指す。ドメインが常に偶数のアミノ酸残基を含むとは限らないことが理解される。したがって、ドメインに奇数のアミノ酸が含まれている、または含まれていると同定された場合、奇数のドメインのハーフドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分（ドメインのアミノ酸数／２＋／－０．５アミノ酸）からなる。例えば、７アミノ酸ドメインとして同定されたドメインは、３アミノ酸または４アミノ酸のハーフドメインを生成し得る（７／２＝３．５＋／－０．５は３または４である）。サブドメインは、ドメインまたはハーフドメイン内で識別され得、これらのサブドメインは、それらが由来するドメインまたはハーフドメインで同定されるすべての構造的または機能的特性よりも少ないことも理解される。本明細書のドメインタイプのいずれかを含むアミノ酸は、ポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はないことも理解される（すなわち、隣接しないアミノ酸は、構造的に折り畳まれて、ドメイン、ハーフドメイン、またはサブドメインを生成し得る）。

本明細書で使用される場合、アミノ酸ベースの実施形態に関係する「部位」という用語は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。部位は、本開示のポリペプチドベースの分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変動することができるペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。

本明細書で使用される場合、タンパク質を指す場合の「末端」または「末端」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。そのような末端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位に限定されるのではなく、末端領域における追加のアミノ酸を含み得る。本開示のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終結する）とＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸により終結する）の両方を有することを特徴とし得る。「野生型」とは、既知の変異がなく、天然に見られるウイルスまたは生物を指す。

ジンクフィンガー及びＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識へリックス領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を改変する）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計及び選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準によってもたらされる天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥ設計及び結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、及び同第８，５８６，５２６号を参照されたい。ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、及びＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。

「カセット」、「発現カセット」、及び「遺伝子発現カセット」という用語は、特定の制限部位で、または相同組換えによって、核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。ＤＮＡのセグメントは、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセット及び制限部位は、転写及び翻訳のための適切なリーディングフレームへのカセットの挿入を確実にするように設計されている。「形質転換カセット」は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドに加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。本発明のカセット、発現カセット、遺伝子発現カセット、及び形質転換カセットはまた、宿主細胞における目的のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの増強された発現を可能にするエレメントを含み得る。これらのエレメントには、プロモーター、最小プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが含まれ得るが、これらに限定されない。

疾患特異的プロモーターの例として、がんを治療するための有用なプロモーターにはがん遺伝子のプロモーターが含まれ、貧血を治療するためのプロモーターを含む。がん遺伝子のクラスの例には、増殖因子、増殖因子受容体、プロテインキナーゼ、プログラム細胞死調節因子、及び転写因子が含まれるが、これらに限定されない。

当該技術分野で知られており、本発明の治療スイッチプロモーターとして有用であるプロモーター配列及び他の調節エレメント（例えば、エンハンサー）の例は、２０１２年３月２日に出願された米国特許第９，４０２，９１９号、連続番号１４／００１，９４３に開示されている。

また、「含むこと」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップの包含を許可するものであるが、その包含は必ず塩必要ではないことに留意されたい。本明細書で「含むこと」という用語が使用されるとき、「～からなる」という用語もそれによって包含され、開示される。

範囲が指定されている場合、端点が含まれている。さらに、別段の指示がない限り、または文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、本開示の異なる実施形態で述べられた範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈の別段の定めがない限り、範囲の下限の単位の１０分の１までをとることができることを理解されたい。

さらに、先行技術に含まれる本開示の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。そのような実施形態は、当業者に知られているとみなされるため、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも、除外されてもよい。本開示の組成物のいずれの特定の実施形態（例えば、いずれかの抗生剤、治療、または活性の成分、任意の産生方法、任意の使用方法なども、先行技術の存在に関連するか否かに関わらず、あらゆる理由により、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。

使用されている言葉は限定ではなく説明の言葉であり、その広い態様における開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更を加えることができることを理解されたい。

本開示は、いくつかの記載された実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の詳細さをもって説明されてきたが、そのような詳細または実施形態または特定の実施形態に限定されるべきではなく、むしろ先行技術に照らしてそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、したがって、開示の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲への参照と解釈されるべきである。本発明はさらに、以下の非限定的な実施例によって説明される。

実施例１． 変異導入スクリーニングによる新規リガンド応答性ＳＲＥまたはＤＤの生成。

本開示の組成物及び方法においてＤＲＤを有用にするための方法は、以下の公開された出願、ＷＯ２０１８／１６１０００、ＷＯ２０１８／２３１７５９；ＷＯ２０１９／２４１３１５；ＷＯ２０１８／１６０９９３；ＷＯ２０１８／２３７３２３；及びＷＯ２０１８／１６１０３８に記載及び例示されており、例示されたＤＲＤを同定、スクリーニング、及び単離するための方法に関する前述の出願の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例２． 膜結合ＣＤ４０Ｌを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞及び初代Ｔ細胞のインビトロ制御

５０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞に、構築物に対応するレンチウイルスを形質導入した。ＯＴ－００１６６１、ＯＴ－００１６８５、ＯＴ－００１６６２、またはＯＴ－００１６６６は、４８時間培養した。フローサイトメトリーによる分析の前に、細胞を分割し、リガンドとともに２４時間インキュベートした。

Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１μＭのシールド－１、５０μＭのＴＭＰ、１μＭのバゼドキシフェン（ＢＺＤ）、またはビヒクル対照のいずれかで処理された。ＣＤ４０Ｌの表面発現はＦＡＣＳを使用して測定され、結果を表９に示す。すべての値はモードに正規化された。

表９：ＣＤ４０Ｌの表面発現

試験したすべての構築物で、非常に低いベースライン活性が観察された。それらの対応するリガンドの存在下で、ＦＫＢＰ及びｅｃＤＨＦＲのＤＲＤベースの構築物は強力なリガンド依存性制御を示した。ＥＲのＤＲＤベースの構築物では、適度なリガンド依存性制御が観察された。予想通り、構成的に発現した構築物ＯＴ－００１６６１で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞は、形質導入されていない細胞よりも高いレベルでＣＤ４０Ｌ発現を示した。

ＯＴ－００１６６１、ＯＴ－００１６８５、ＯＴ－００１６６２、ＯＴ－００１６６６、またはＯＴ－００１６６７で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）と共培養した。共培養物をリガンド（１μＭのシールド－１、５０μＭのＴＭＰ、１μＭのバゼドキシフェン（ＢＺＤ）、またはビヒクル対照）で２４時間処理し、分泌された胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターレベルを培地で測定した。リガンド処理サンプル中の可溶性ＣＤ４０Ｌのｐｇ／ｍＬレベルを表１０に示す。ビヒクルで処理されたすべてのサンプルには、バックグラウンドのＳＥＡＰ活性があった。組換え可溶性ＣＤ４０Ｌを実験の標準として使用した。

表１０：リガンドの存在下でのＣＤ４０Ｌレベル

リガンドの存在下及びビヒクル対照におけるその事実上の非存在での可溶性ＣＤ４０Ｌの検出は、すべての構築物がＪｕｒｋａｔ細胞において機能的であり、検出可能なレベルのＣＤ４０Ｌと関連していることを示唆している。

ｅｃＤＨＦＲ（Ｒ１２Ｙ、Ｙ１００Ｉ）のＤＲＤベースの構築物ＯＴ－００１６６２及びＥＲ（Ｎ４１３Ｄ）のＤＲＤベースの構築物ＯＴ－００１６６６の制御をＣＤ８陽性Ｔ細胞で試験した。ＯＴ－００１６６２発現細胞の場合、ウイルス形質導入の６日後に５０μＭのＴＭＰの用量でリガンドを添加した。ＯＴ－００１６６６発現細胞は、形質導入の５日後に、０．５μＭのバゼドキシフェンまたはビヒクル対照で処理された。ＦＡＣＳにより、サンプルあたり約１５～３０ｋの細胞を分析した。すべてのサンプルを、空のベクター対照及び構成的に発現する構築物ＯＴ－００１６６１と比較した。表１１に、各サンプルで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

表１１：ＣＤ４０Ｌ ＭＦＩ

試験した両方の構築物で、非常に低いベースライン活性が観察された。リガンドの存在下でのｅｃＤＨＦＲのＤＲＤベースの構築物ＯＴ－００１６６２におけるＣＤ４０Ｌの発現は、ＥＲＤのＲＤベースの構築物ＯＴ－００１６６６よりも高かった。

リガンド用量反応曲線実験は、ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞でＯＴ－００１６６２及びＯＴ－００１６６６構築物を使用して、リガンドの用量を増やしながら実施した。

実験は、形質導入用の３つの異なる量のウイルス、すなわち０．５、２、及び１０μＬを使用して実施された。結果を表１２及び表１３に示す。

表１２：ＯＴ－００１６６２による用量反応

表１３：ＯＴ－００１６６６による用量反応

表１２及び表１３の結果は、用量応答性リガンドを介した安定化が、両方の構築物の低いリガンド濃度でＣＤ４＋Ｔ細胞において明らかであることを示している。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞では、高用量で高レベルのＣＤ４０Ｌ陽性細胞％が得られた。これらの結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞における内因性ＣＤ４０Ｌの発現によって影響を受け得る。比較すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、より高いリガンド用量でより低い基礎発現及びより低いレベルのＣＤ４０陽性細胞％を示した。ＣＤ８＋細胞は内因性遺伝子座からＣＤ４０Ｌを発現しないため、基礎発現レベルが低くなる可能性がある。

ＯＴ－００１６６３及びＯＴ－００１６６４は、ウエスタンブロットで測定した場合、タンパク質レベルでリガンド依存性の安定化を示した。

実施例３． 可溶性ＣＤ４０Ｌを形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞及び初代Ｔ細胞のインビトロ制御

可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）構築物ＯＴ－００１６７２、ＯＴ－００１６８６、ＯＴ－００１６７３、ＯＴ－００１６７４、ＯＴ－００１６７７、及びＯＴ－００１６８４をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトした。細胞は、リガンドである１μＭのシールド－１、５０μＭのＴＭＰ、１μＭのバゼドキシフェン（ＢＺＤ）、またはビヒクル対照のいずれかで処理された。

可溶性ＣＤ４０Ｌのｐｇ／ｍＬレベルをＥＬＩＳＡで測定した（表１４）。組換え可溶性ＣＤ４０Ｌを実験の標準として使用した。

表１４：可溶性ＣＤ４０Ｌレベル

表１４に示すように、可溶性ＣＤ４０Ｌレベルのリガンド依存性制御は、ＯＴ－００１６８６、ＯＴ－００１６７３、及びＯＴ－００１６７４で観察された。同様の環境での独立した実験では、ＯＴ－００１６７７は７．２の安定化率を示し、リガンドの非存在下では非常に低い基礎発現を示した。ｓＣＤ４０Ｌ構築物を使用して実行されたＨＥＫ－ＢｌｕｅＣＤ４０アッセイは、すべての構築物が機能的であることを示している。構築物ＯＴ－００１６７２、ＯＴ－００１６８６、及びＯＴ－００１６７３は、試験した他の構築物よりも高い機能性を示した。対応するビヒクル対照で処理された細胞では、検出可能な活性は観察されなかった。

例４． シェディングを減らすためのＣＤ４０Ｌの改変

腫瘍微小環境に存在するシェダーゼ、例えばＡＤＡＭ１０／１７はＣＤ４０Ｌを切断し、それによってＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の活性化の達成を妨げることができる。ＣＤ４０Ｌの配列を分析すると、ＡＤＡＭ１０／１７タンパク質分解切断部位が明らかになる。ＣＤ４０Ｌのアミノ酸１～１３が欠失しているＯＴ－００１６６９は内在化を減らすように設計されており、ＣＤ４０Ｌのアミノ酸１１０～１１６が欠失しているＯＴ－００１６６８はＡＤＡＭ１０／１７部位を除去するように設計されている。全長構築物ＯＴ－００１６６１、ＯＴ－００１６６９、またはＯＴ－００１６６８を安定して発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、１．２５μｇ／ｍｌの組換えヒト（ｈ）またはマウス（ｍ）ＣＤ４０－Ｆｃ受容体とともに６時間培養するか、あるいは未処理のままにして、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験した（表１５）。

表１５：上清中のＣＤ４０Ｌレベル

表１５に見られるように、ＣＤ４０－Ｆｃによる処理がない場合でもシェディングが観察され、構成的なシェディングがあることを示している。ヒトＣＤ４０－ＦｃはＯＴ－００１６６９発現細胞のシェディングを促進するようであったが、ＡＤＡＭ１０／１７部位を欠くＯＴ－００１６６８ではシェディングは観察されなかった。マウスＣＤ４０－ＦｃもヒトＣＤ４０Ｌとの活性を示し、種間の交差反応性を示唆している。

実施例５． 制御されたＣＤ４０Ｌの機能分析

樹状細胞を免疫応答に関与させるためには、樹状細胞を抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって機能状態に変換する必要がある。樹状細胞の活性化の後に、樹状細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化が続き得、これは、樹状細胞ライセンシングと呼ばれるプロセスである。ＣＤ４＋細胞で発現したＣＤ４０Ｌと樹状細胞のＣＤ４０との結合は、（ｉ）樹状細胞刺激－共刺激及びＭＨＣ分子の発現によって測定される、（ｉｉ）炎症性サイトカイン放出（例えば、ＩＬ１２、ＴＮＦα、及びＩＮＦγ）、（ｉｉｉ）エピトープ拡大をもたらす。本開示の生体回路によって調整されるＣＤ４０Ｌ発現の効果を測定するために、本明細書に記載のＣＤ４０Ｌ構築物のいずれかを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞を樹状細胞と共培養した。

ＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞との共培養に応答した樹状細胞の機能を、リガンドまたは対応するビヒクル対照の存在下で評価した。単球由来樹状細胞（ｍＤＣ）（ＣＤ１４＋）を新鮮な血液から単離し、ＩＬ－４（７．５ｎｇ／ｍＬ）及びＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）とともに５日間培養した。ｍＤＣは５日間の培養後に凍結された。Ｔ細胞にＯＴ－００１６６２を形質導入し、９日間拡大した後、凍結した。ｍＤＣとＴ細胞を解凍し、１：１０のＤＣ：Ｔ細胞比（すなわち、５×１０^４ＤＣ：５×１０^５Ｔ細胞）で共培養した。ｍＤＣ細胞とＴ細胞を２日間共培養した後、フローサイトメトリー用に細胞を収集し、サイトカイン分析用に上清を収集した。制御された構築物の評価のために、リガンド（様々な用量のＴＭＰ）を共培養の開始時に添加し、２日間共培養に保持した。サイトカインは、１回の凍結融解サイクル後にＭＳＤによって分析された。実験の過程で、すべての細胞を１０％ＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩで培養した。ＣＤ４０Ｌを発現するｍＤＣ－Ｔ共培養における細胞のパーセンテージとそれらのＭＦＩを表１６に示す。ＳＲは安定化率を示す。

表１６：ｍＤＣ共培養によるＴ細胞のＣＤ４０Ｌレベル

ＣＤ４０Ｌのリガンド依存性制御は、安定化率によって証明されるように、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方で明らかであり、特にＯＴ－００１６６２を含む共培養における高用量のＴＭＰで明らかであった。ＣＤ８＋細胞と比較して、ＣＤ４＋細胞ではより高いＭＦＩが観察されたが、ＴＭＰの高用量でのみ観察された。制御されたＣＤ４０Ｌはまた、ＤＣ共培養アッセイでサイトカイン産生の変化を誘発した（表１７を参照されたい）。

表１７：サイトカイン産生（ｐｇ／ｍｌ）

ＯＴ－００１６６２で１０μＭのＴＭＰを使用して得られたＩＦＮγのレベルは、構成的な構築物ＯＴ－００１６６１で観察されたレベルと同等であったが、ＴＭＰの低用量ではＩＦＮγの用量応答性の増加を示した。ＩＬ１２及びＴＮＦαのＴＭＰ用量応答性の増加も観察された。

実施例６． ＰＤＥ５制御されるＣＤ４０Ｌ

ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧリンカーを備えた構築物ＯＴ－００１８９２をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で試験した。ＯＴ－００１８９２に対応する１μｇのＤＮＡを３００，０００個の細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をリガンド（１μＭのバルデナフィル）またはビヒクル対照でさらに２４時間処理した。ＣＤ４０Ｌの表面発現はＦＡＣＳによって分析された。１μＭのバルデナフィルで処理されたＯＴ－００１８９２トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞の３０％がＣＤ４０Ｌに陽性であったのに対し、ビヒクル対照で処理されたＯＴ－００１８９２トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔの９％のみがＣＤ４０Ｌ発現に陽性であった。したがって、ＣＤ４０Ｌ陽性細胞のパーセンテージのリガンド依存性の増加が観察された。

構築物ＯＴ－００１８９２の発現は、形質導入されたＪｕｒｋａｔ及びＴ細胞との関連でも測定された。Ｊｕｒｋａｔ細胞をディッシュあたり１００，００で播種し、ＯＴ－００１８９２に対応する１０μＬのレンチウイルスを形質導入した。トランスフェクションの２４時間後、細胞をリガンド（１μＭのバルデナフィル）またはビヒクル対照でさらに２４時間処理した。ＣＤ４０Ｌの表面発現はＦＡＣＳによって分析された。１μＭのバルデナフィルで処理されたＯＴ－００１８９２で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞の３７．６％がＣＤ４０Ｌに陽性であったのに対し、ビヒクル対照で処理されたＯＴ－００１８９２で形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞の２．７％のみがＣＤ４０Ｌ発現に陽性であった。ビヒクル対照処理群の－１８７のＭＦＩと比較して、２３３の中央値蛍光強度が１μＭのバルデナフィルで処理された細胞で観察された。

Ｔ細胞にＯＴ－００１８９２に対応する１０μＬのレンチウイルスを形質導入した。形質導入の４日後、細胞を増加する濃度のリガンド（バルデナフィル）またはビヒクル対照で２４時間処理した。Ｔ細胞ならびにＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおけるＣＤ４０Ｌの表面発現をＦＡＣＳによって分析した。結果を表１８に示す。安定化率（ＳＲ）は、バルデナフィルの非存在下でのＣＤ４０Ｌの発現に対するバルデナフィルに応答したＣＤ４０Ｌの発現の比率として定義することができる。

表１８： ＰＤＥ５制御されたＣＤ４０Ｌ構築物のＣＤ４０Ｌレベル

表１８に示すように、ＣＤ８＋細胞と比較してＣＤ４＋集団ではより高い安定化率が得られ、より高い発現レベルを示している。測定したすべての細胞集団でリガンドの用量依存性応答が観察され、０．０００１μＭという少ないバルデナフィルで安定化率が１を超えていた。空のベクターとＤＭＳＯで処理したＯＴ－００１８９２を形質導入したＣＤ４＋細胞で得られたＭＦＩを比較すると、ＣＤ４０Ｌの発現は、空のベクター発現細胞と比較して、ＤＭＳＯ処理細胞で低くなっている。ＤＭＳＯ処理細胞における内因性ＣＤ４０Ｌの不安定化は、ＤＭＳＯ処理細胞におけるＣＤ４０Ｌ発現の観察された減少をもたらす可能性がある。

実施例７． 腫瘍モデルにおけるＣＤ１９ ＣＡＲとのＣＤ４０Ｌ共発現の有効性

インビトロ研究

形質導入されたＴ細胞がＣＤ１９－ＣＡＲとＣＤ４０Ｌを共発現するかどうかを決定するために、活性化Ｔ細胞に空のベクター（ＥＶ）、構成的ＣＤ４０Ｌ（ＯＴ－００１６６１）、ＣＤ１９ ＣＡＲ（ＯＴ－００１４０７）、及びＣＤ４０ＬとＣＤ１９ ＣＡＲ（ＯＴ－００１６０５）をレンチウイルスで形質導入し、２日間増殖させた後、ＣＤ４０Ｌ及びＣＤ１９の表面レベルを測定し、Ｔ細胞におけるＣＤ１９ＣＡＲ及びＣＤ４０Ｌ及びＣＤ１９ＣＡＲ構築物の発現の増加が見られた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞と総細胞の結果を以下に示す。

表１９：ＣＤ４０ＬとＣＤ１９ ＣＡＲを共発現している細胞のパーセント

インビボ研究

ＣＤ１９陽性ＣＡＲＴ細胞でのＣＤ４０Ｌの発現増加は、インビボでのＣＡＲ＋Ｔ細胞の有効性を増加させ得る。これを試験するために、８週齢のマウスにＮａｌｍ６－ｌｕｃ（マウスあたり１００万）を注射した。６日目に、Ｎａｌｍ６の腫瘍量を測定し、マウスを群分けして、すべての群の腫瘍サイズが類似していることを確認した。７日目に、構築物で形質導入されたＴ細胞がマウスに注射され、表２０に示される群が確立された。体重と生物発光強度（ＢＬＩ）を週に２回測定した。平均ＢＬＩ値を表２１に示す。サイトカイン分析、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ１２のために血液及び血漿も収集された。

表２０：腫瘍研究コホート

表２１：平均ＢＬＩ値

表２１に示すように、ＣＤ１９ＣＡＲ－２Ａ－ＣＤ４０Ｌ Ｔ細胞をＮＡＬＭ６マウスに注射すると、ＢＬＩ値が減少し、腫瘍量の減少が示された。ＣＤ１９ＣＡＲのみの細胞はＢＬＩのいくらかの減少を示したが、ＣＤ１９ＣＡＲ－２Ａ－ＣＤ４０Ｌ群ほど顕著ではなかった。

ヒト細胞は、Ｔ細胞注入の１４日後、すなわち腫瘍移植後２１日後の血液からＦＡＣＳ（ｈＣＤ４５＋）によって分析された。結果を表２２に示す。ここで、Ｍは百万を示す。

表２２：ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ

表２２に示すように、ＯＴ－００１６０５（１Ｍ）は、３つの細胞数群のすべてでＴ細胞の最大の拡大を示した。これらの結果は、ＣＤ４０Ｌの発現がインビボでＣＡＲ依存性Ｔ細胞の拡大を増加させることを示している。

実施例８． Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌ速度論

ＯＴ－００１６６２を発現する安定して形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を使用して速度論を試験した。ＣＤ４０Ｌの発現をオンにする速度論を研究するために、細胞をＴＭＰ（５または５０μＭ）で処理し、０、３、６、９、２４、４８時間後にＦＡＣＳのために固定した。実験の終わりに、すべての固定物を染色し、ＦＡＣＳによって並行して分析した。発現をオフにする速度論を研究するために、発現は最初に５０μＭのＴＭＰでＪｕｒｋａｔ細胞に誘導された。次いで、細胞を洗浄してＴＭＰを除去し、０、３、６、９、２４時間後に固定し、染色し、ＦＡＣＳによって並行して分析した。表２３及び表２４は、それぞれ発現をオン及びオフにする速度論を示した。

表２３：オンの速度論

表２４：オフの速度論

表２３及び表２４に示すように、おそらくＣＤ４０Ｌを輸送のために三量体化する必要があるため、表面発現は２４時間にわたって徐々に増加する。しかしながら、オフの速度論は速く見え、表面ＣＤ４０Ｌの半減期が短いことを示している。代替的に、リガンドが除去されたときに細胞表面からの活発な不安定化／分解があるかもしれないことも示唆している。

実施例９． Ｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌ制御

Ｔ細胞にＯＴ－００１６６２を形質導入し、次いで４日目に１０μＭのＴＭＰで処理した。ＣＤ４０Ｌ発現は、ＣＤ４とＣＤ８陽性Ｔ細胞集団の両方でＦＡＣＳによって分析された。結果を表２５に示す。

表２５：インビトロでのＣＤ４０Ｌ ＭＦＩ

リガンド依存性制御は、構成的ＣＤ４０Ｌ構築物、すなわちＯＴ－００１６６１で観察されたものよりも低いＣＤ４０ＬレベルでＴＭＰ処理によって観察された。

インビトロデータに基づいて、インビボでのＣＤ４０Ｌ構築物の制御可能性を試験した。１０週齢のＮＳＧオスマウスに、以下の構築物のいずれかを形質導入したＴ細胞を注射した（０日目）：空のベクター、ＯＴ－００１６６１、及びＯＴ－００１６６２。１日目に、リガンドを投与する前にマウスを事前に出血させた。２日目に、５００ｍｇ／ｋｇマウス体重のＴＭＰまたはビヒクル対照を４時間ごとにマウスに投与した。すべての投与の２時間後、ＣＤ４０Ｌレベルを測定するためにマウスから血液を採取した。３日目、すなわち最初の投与の２４時間後、分析のためにマウスを最終的に出血させた。ＣＤ４０Ｌレベルを表２６に示す。太字の値は、各出血の平均値を表す。

表２６：インビボでのＣＤ４０Ｌ陽性細胞％

２０％のピークＣＤ４０Ｌ発現が初回投与の１０時間後に観察された。また、すべての場合において、制御されたＣＤ４０Ｌ発現は、リガンド曝露後に構成的に発現した構築物よりも低かったことが注目された。

実施例１０． 樹状細胞の活性化

ＣＤ４０Ｌがインビボで樹状細胞を機能的に活性化できるかどうかを試験するために、ＮＳＧマウスへの同種異系ｍｏＤＣ及びＣＤ４０Ｌ＋／－Ｔ細胞の逐次的な腹腔内（ＩＰ）または静脈内（ＩＶ）注射を実施した。この研究で利用されたさまざまな群を表２７に示す。構築物ＯＴ－００１６６１をこれらの実験に利用し、結果を表２８に示す。

表２７：研究群

表２８：血漿ＩＬ１２レベル（ｐｇ／ｍｌ）

表２８の結果は、ＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞がインビボでｍｏＤＣを刺激して、検出可能なレベルのＩＬ１２を分泌できることを示している。これは、ＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞が樹状細胞を活性化してＩＬ１２分泌を引き起こすことを示唆している。

実施例１１． 異なる薬物応答性ドメインによるＴ細胞におけるＣＤ４０Ｌの制御

制御を試験するために、活性化Ｔ細胞は異なる薬物応答性ドメインによって制御されるＣＤ４０Ｌでレンチウイルス形質導入され、活性化Ｔ細胞はｅｃＤＨＦＲ制御されたＣＤ４０Ｌ（ＯＴ－００１６６２）、ＥＲ制御されたＣＤ４０Ｌ（ＯＴ－００１９６６）、ＰＤＥ５制御されたＣＤ４０Ｌ（ＯＴ－００１８９２）、及びＣＤ４０Ｌの対照（ＯＴ－００１６６１）でレンチウイルス形質導入された。２日後、細胞を、表２９に記載されるようにビヒクルまたは１００ｍＭのリガンドで２４時間処理し、その後、それらをＣＤ４０Ｌ表面発現について分析した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞と総細胞の結果を以下に示す。表中、「ＴＭＰ」はトリメトプリム、「Ｂａｚ」はバゼドキシフェン、「Ｖａｒｄ」はバルデナフィル、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドである。

表２９：ＣＤ４０Ｌを発現している細胞のパーセント

すべての薬物応答性ドメインによって制御された発現は、内因性レベルを超えてＣＤ４０Ｌ発現を顕著に増強した。ｅｃＤＨＦＲ薬物応答性ドメインは、臨床的に適切なレベルに近いリガンド用量で構成的発現に近いレベルを示す。

実施例１２．ＣＤ４０Ｌ多量体化変異体

変異は、ＣＤ４０Ｌペイロード内で操作され、細胞によって内因的に発現されるＣＤ４０Ｌに対するＣＤ４０Ｌペイロードの結合親和性を低下させた。構築物ＯＴ－００２０７８、ＯＴ－００２０７９、ＯＴ－００２０８０、ＯＴ－００２０８１、ＯＴ－００２０８２は、ＣＤ４０Ｌ三量体化変異体で生成された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に構築物を一過性にトランスフェクトし、ＣＤ４０Ｌの発現をＦＡＣＳで測定した。ＣＤ４０Ｌの細胞表面発現に陽性であったＨＥＫ２９３Ｔ細胞のパーセンテージを表３０に示す。

表３０： ＣＤ４０Ｌを発現している細胞のパーセント

構築物ＯＴ－００２０７８及びＯＴ－００２０７９は、細胞表面で５０％を超える発現を示した。ＣＤ４０Ｌの表面発現は三量体化に依存しているため、これらのデータは、三量体化変異タンパク質が依然として互いに相互作用してそれらの表面発現をもたらすことができることを示唆している。

実施例１３．ＥＲ制御されたＣＤ４０Ｌ発現

Ｔ細胞にＯＴ－００１６６２またはＯＴ－００１６６６を形質導入した。４日目に、ＯＴ－００１６６２を発現するＴ細胞に対してＴＭＰの用量を増やして細胞を処理した。ＯＴ－００１６６６を発現する細胞は、バゼドキシフェンまたはラロキシフェンの濃度を上げながら処理した。データは、ＣＤ４０Ｌ陽性Ｔ細胞のパーセンテージとして表３０に示されている。表３１及び表３２に示すように、ＴＭＰとバゼドキシフェンの両方がＣＤ４０Ｌ陽性Ｔ細胞％の用量依存的な増加を誘導した。ＯＴ－００１６６６のラロキシフェン依存性発現は、１μＭの用量でのみ観察された。

表３１： ＣＤ４０Ｌを発現している細胞のパーセント

表３２：ＣＤ４０Ｌを発現している細胞のパーセント

ＣＤ４０ＬのＤＤを介した制御におけるリンカーの長さの影響を調べるために、さまざまなリンカーの長さを持つ構築物を生成した。ＯＴ－００１９６６、ＯＴ－００１９６５、ＯＴ－００１９６７、ＯＴ－００１６６６構築物が生成され、リンカーの長さの降順でここに示されている。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にこれらの構築物を一過性にトランスフェクトし、１μＭのバゼドキシフェンで２４時間処理した。ＣＤ４０Ｌの表面発現の指標である中央値蛍光強度をフローサイトメトリーで分析した。試験されたすべての構築物は、ＣＤ４０Ｌ発現のバゼドキシフェン依存性制御を示し、試験されたすべてのリンカーが制御を可能にすることを示している。最長のリンカーベースの構築物ＯＴ－００１９６６では、ＣＤ４０Ｌ表面発現が高い細胞のパーセンテージが最も高くなった。

Ｊｕｒｋａｔ細胞をレンチウイルスで形質導入し、形質導入の２４時間後にＤＭＳＯまたは１μＭのバゼドキシフェンでさらに２４時間処理し、フローサイトメトリーでＣＤ４０Ｌの表面発現を分析した。表３３は、ＣＤ４０Ｌ陽性細胞のパーセンテージを示す。表３３において、ＳＲは安定化率を示す。

表３３：ＣＤ４０Ｌを発現しているＪｕｒｋａｔ細胞のパーセント

表３３に示されるように、最長のリンカーベースの構築物ＯＴ－００１９６６では、ＣＤ４０Ｌ表面発現が高い細胞のパーセンテージが最も高くなった。この傾向は、安定化率の計算でも観察された。

Ｔ細胞にＯＴ－００１９６６、ＯＴ－００１９６７、ＯＴ－００１６６６を形質導入した。４日目に、細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＪｕｒｋａｔ細胞で実施された実験と同様に、リンカーが長くなると、ＥＲで制御されるＣＤ４０Ｌ構築物で表面発現が増強された。

Ｔ細胞におけるバゼドキシフェンの用量反応は、ＯＴ－００１９６６、ＯＴ－００１９６７、ＯＴ－００１６６６に対して実施された。ＣＤ４０Ｌの発現は、（ａ）形質導入後４日目、（ｂ）細胞を凍結融解した後、または（ｃ）細胞を凍結融解した後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで再刺激した後に測定した。ＣＤ４及びＣＤ８陽性亜集団内のＣＤ４０Ｌ ＭＦＩ（中央値蛍光強度）をそれぞれ表３４及び表３５に示す。

表３４：ＣＤ４＋細胞におけるＣＤ４０Ｌ発現

表３５：ＣＤ８＋細胞におけるＣＤ４０Ｌ発現

表３４及び表３５に示すように、バゼドキシフェンは最高用量で細胞の健康に影響を及ぼした。凍結融解後のより高い発現には、Ｔ細胞の再刺激が必要であった。ＣＤ８陽性細胞内では、長いリンカーのＯＴ－００１９６６と再刺激により、ＥＲによって制御されるＣＤ４０Ｌの発現が最も高くなった。

実施例１４．ヒト及びＥ． ｃｏｌｉのＤＨＦＲはＣＤ４０Ｌ発現を制御した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｈＤＨＦＲ制御された構築物、すなわちＯＴ－００１９６２、ＯＴ－００１９６１、ＯＴ－００１９６３で２４時間一過性に形質導入された。トランスフェクション後、細胞を５０μＭのＴＭＰで２４時間処理し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４０Ｌ細胞表面発現を測定した。表３６は、ＴＭＰ処理を行ったＣＤ４０Ｌ陽性細胞％を示す。リガンドの非存在下でのＣＤ４０Ｌ発現は事実上検出できなかった。

表３６：ＴＭＰ処理によるＣＤ４０Ｌ発現％

表３６のデータは、ＣＤ４０ＬがｈＤＨＦＲのＤＤ及びＴＭＰによって制御できることを示している。

Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＯＴ－００１６６２、ＯＴ－００１９６２、ＯＴ－００１９６１、ＯＴ－００１９６３に対応するレンチウイルスで形質導入された。形質導入の２４時間後、細胞を分割し、フローサイトメトリーベースの分析までさらに２４時間ＤＭＳＯまたは５０μＭのＴＭＰで処理した。結果を表３７に示す。ここで、ＳＲは安定化率を示す。

表３７： ＴＭＰ処理によるＣＤ４０Ｌ発現％

試験されたｈＤＨＦＲ構築物の中で、ＯＴ－００１９６２ は、強力なＴＭＰ依存性制御と最高の安定化率を示した。

Ｔ細胞におけるＴＭＰによる用量反応は、ＯＴ－００１９６２に対して実施された。ＣＤ４０Ｌの発現は、（ａ）形質導入後４日目、（ｂ）細胞を凍結融解した後、または（ｃ）細胞を凍結融解した後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで再刺激した後に測定した。ＣＤ４及びＣＤ８陽性亜集団内のＣＤ４０Ｌ ＭＦＩ（中央値蛍光強度）を表３８に示す。

表３８：ＯＴ－００１９６２によるＣＤ４０Ｌの発現

表３８に示すように、形質導入の４日後に得られた発現に匹敵するＣＤ４０Ｌ発現を達成するには、凍結融解後の再刺激が必要であった。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、表３９の構築物（１μｇのＤＮＡ）で一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、培地を除去し、５０μＭのＴＭＰまたはＤＭＳＯを含む新しい培地と交換した。さらに２４時間後、細胞をフローサイトメトリーでＣＤ４０Ｌ表面発現について分析した。表３９は、ＣＤ４０Ｌ陽性細胞％と中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の両方としてＣＤ４０Ｌの発現を示している。

表３９：ＣＤ４０Ｌ－ｅｃＤＨＦＲ構築物を使用したＣＤ４０Ｌの発現

ＯＴ－００２０３５を除いて、試験されたすべての構築物は、ＴＭＰを介したＣＤ４０Ｌの発現を示した。

実施例１５．切断耐性のＣＤ４０Ｌの制御

Ｔ細胞にＯＴ－００１６６８を形質導入し、４日目にＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞（ＣＤ４とＣＤ８の両方内）の亜集団の割合を計算した。結果を表４０に示す。

表４０：ＣＤ４０Ｌの発現

ＣＤ４０Ｌの高発現は、切断耐性構築物ＯＴ－００１６６８で観察された。空のベクターで形質導入されたＴ細胞でいくらかの発現が観察された。これはおそらくＣＤ４＋Ｔ細胞によって発現された内因性ＣＤ４０Ｌの発現である。Ｔ細胞は、切断に耐性のあるＣＤ４０Ｌタンパク質を含むｅｃＤＨＦＲ制御された構築物ＯＴ－００１６７１で形質導入された。４日目に細胞を１０μＭのＴＭＰで２４時間処理した。ＴＭＰを介したＣＤ４０Ｌ発現の制御は、ＣＤ４とＣＤ８のＴ細胞集団の両方で観察された。独立した実験では、ＯＴ－００１６７１に対応するさまざまな量のウイルスで形質導入されたＴ細胞を、増加する用量のＴＭＰで２４時間処理した。ＣＤ４０Ｌ陽性細胞のパーセンテージを表４１に示す。表４１で、０．５μＬ、２μＬ、及び１０μＬは、使用されたウイルスの量が異なることを示している。

表４１：ＴＭＰ用量反応

ｅｃＤＨＦＲによって制御される切断耐性ＣＤ４０Ｌは、ＴＭＰ用量の増加に応答してＣＤ４０Ｌ陽性細胞のパーセンテージの増加を示した。より高いレベルのウイルス（０．５、２、または１０μｌ）を追加すると、ＴＭＰの高用量でＣＤ４０Ｌレベルが増加した。中央値蛍光強度の測定でも、同様の実験傾向が観察された。

実施例１６．Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるインビボＣＤ４０Ｌ制御

ＯＴ－００１６６１、ＯＴ－００２０３４を安定に発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、８週齢のＮＳＧマウスに静脈注入された（１マウスあたり２千万）。１５日目から、表４２に示す研究計画に従ってマウスに経口投与し、１６日目にＪｕｒｋａｔ細胞を骨髄から採取し、ＦＡＣＳで分析した。表４１及び４２では、ＴＭＰはトリメトプリムを指し、すべての投与は１６日目の「０時間」の時点を基準にしている。結果を表４３及び表４４に示す。ここで、「ＥＶ」は空のベクター対照を指す。

表４２：研究計画

表４３：ＣＤ４０Ｌ ＭＦＩ値

表４４：ＣＤ４０Ｌ陽性細胞パーセント

表４３及び表４４に示すように、ＴＭＰで処理したマウスの骨髄から回収したＯＴ－００２０３４発現Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ビヒクル対照または空のベクターで処理したマウスと比較した場合、増加したＣＤ４０Ｌ値とＣＤ４０Ｌ陽性細胞％を示したが、ＯＴ－００１６６１を発現すＪｕｒｋａｔ細胞と同等であった。

本開示は、いくつかの記載された実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の詳細さをもって説明されてきたが、そのような詳細または実施形態または特定の実施形態に限定されるべきではなく、むしろ先行技術に照らしてそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、したがって、開示の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲への参照と解釈されるべきである。

本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するであろう。更に、セクションの見出し、物質、方法、及び例は、例示にすぎず、限定を意図しない。

Claims (44)

1. エフェクターモジュールを含む組成物であって、前記エフェクターモジュールは、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含み、前記第１のペイロードは、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）または配列番号３８２０に対してＹ１７０Ｇ、Ｙ１７２Ｇ、Ｈ２２４Ｇ、Ｇ２２６Ｆ、Ｇ２２６Ｈ、Ｇ２２６Ｗ、またはＧ２２７Ｆから選択される１つ以上の変異を含む変異体ＣＤ４０Ｌを含む、前記組成物。
2. 前記ＳＲＥが、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈＤＨＦＲタンパク質から選択されるＤＲＤを全体的または部分的に含み、前記ＤＲＤが、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈＤＨＦＲタンパク質の前記アミノ酸配列に１つ以上の変異をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＤＲＤがＥＲタンパク質に由来し、前記ＤＲＤが配列番号６３３、６３７、６４１、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、または７２６を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ＤＲＤがｅｃＤＨＦＲタンパク質に由来し、前記ＤＲＤが配列番号２５３、２５５、２６４、２６７、２６９、６５５４、６５５６、６５５８、６５６０、６５６２、６５６４、６５６６、６５６８、６５７０、６５７２、６５７４、６５７６、６５７８、６５８０、６５８２、６５８４、６５８６、６５８８、または６５９０を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の組成物。
5. 前記ＤＲＤがＦＫＢＰタンパク質に由来し、前記ＤＲＤが配列番号２７０、２７１、２７２、２７４、２７７、２８５、または２８６を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の組成物。
6. 前記ＤＲＤがＰＤＥ５タンパク質に由来し、前記ＤＲＤが配列番号２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０６、３０８、３１３、３１５、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７５、３７８、３８１、３８４、３８７、３８９、３９１、３９４、３９７、４００、４０３、４０６、４０９、４１２、４１５、４１７、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６４０６、６４０８、６４１０、６４１２、６４１４、６４１６、６４１８、６４２０、６４２２、６４２４、６４２６、６４２８、６４３０、６４３２、６４３４、６４３６、６４３８、６４４０、６４４２、６４４４、６４４６、６４４８、６４５０、６４５２、６４５４、６４５６、６４５８、６４６０、６４６２、６４６４、６４６６、６４６８、６４７０、６４７２、６４７４、６４７６、６４７８、６４８０、６４８２、６４８４、６４８６、６４８８、６４９０、６４９２、６４９４、６４９６、６４９８、６５００、６５０２、６５０４、６５０６、６５０８、６５１０、６５１２、６５１４、６５１６、６５１８、６５２０、６５２２、６５２４、６５２６、６５２８、または６５３０を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の組成物。
7. 前記ＤＲＤがｈＤＨＦＲタンパク質に由来し、前記ＤＲＤが配列番号７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７９、１８１、１８３、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１または６５５２を含むアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の組成物。
8. 前記ＤＲＤが少なくとも１つの刺激に応答するか、またはそれと相互作用する、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 前記刺激が小分子である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記ＳＲＥが第２のペイロードを含み、前記第２のペイロードがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１に記載の組成物。
11. 前記第２のペイロードがＣＤ１９ ＣＡＲを含む、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記ＳＲＥが配列番号６５３９のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. エフェクターモジュールであって、前記エフェクターモジュールは、第１のペイロードに作動可能に連結された薬物応答エレメント（ＤＲＤ）を含み、前記ＤＲＤは、全体的または部分的に、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈＤＨＦＲタンパク質を含み、前記ＤＲＤは、ＥＲ、ｅｃＤＨＦＲ、ＦＫＢＰ、ＰＤＥ５、またはｈＤＨＦＲタンパク質の前記アミノ酸配列における１つ以上の変異をさらに含み、前記第１のペイロードは、全体的または部分的に、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）またはそのヒトＣＤ４０Ｌ変異体を含む、前記エフェクターモジュール。
14. 前記エフェクターモジュールが、配列番号６５４６、または配列番号６５５０、または配列番号６６２０、または配列番号６６２２、または配列番号６６２４、または配列番号６６２６、または配列番号６６２８、または配列番号６６３０、または配列番号６６３２、または配列番号６６３４、または配列番号６６３６、または配列番号６６３８、または配列番号６６４０、または配列番号６６４２、または配列番号６６４４、または配列番号６６４６、または配列番号６６４８、または配列番号６６５０、または配列番号６６５２、または配列番号６６５４、または配列番号６６５６、または配列番号６６５８、または配列番号６６６０、または配列番号６６６２、または配列番号６６６４、または配列番号６６６６、または配列番号６６６８、または配列番号６６７０、または配列番号６６７２から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のエフェクターモジュール。
15. 前記第１のペイロードが変異体ＣＤ４０Ｌである、請求項１３に記載のエフェクターモジュール。
16. 前記ＤＲＤが配列番号２５３、２５５、２６４、２６７、２６９、６５５４、６５５６、６５５８、６５６０、６５６２、６５６４、６５６６、６５６８、６５７０、６５７２、６５７４、６５７６、６５７８、６５８０、６５８２、６５８４、６５８６、６５８８、または６５９０のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のエフェクターモジュール。
17. 前記ＤＲＤが配列番号６３３、６３７、６４１、６４２、６４４、６４６、６４８、６５０、６５２、６５４、６５６、６５８、６６０、６６２、６６４、６６６、６６８、６７０、６７２、６７４、６７６、６７８、６８０、６８２、６８４、６８６、６８８、６９０、６９２、６９４、６９６、６９８、７００、７０２、７０４、７０６、７０８、７１０、７１２、７１４、７１６、７１８、７２０、７２２、７２４、または７２６のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のエフェクターモジュール。
18. 前記ＤＲＤが、配列番号２７０、２７１、２７２、２７４、２７７、２８５または２８６のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のエフェクターモジュール。
19. 前記ＤＲＤが、配列番号２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０６、３０８、３１３、３１５、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７５、３７８、３８１、３８４、３８７、３８９、３９１、３９４、３９７、４００、４０３、４０６、４０９、４１２、４１５、４１７、４２０、４２２、４２４、４２６、４２８、４３０、４３２、４３４、４３６、４３８、４４０、４４２、４４４、４４６、４４８、４５０、４５２、４５４、４５６、４５８、４６０、４６２、４６４、４６６、４６８、４７０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０、４９２、４９４、４９６、４９８、５００、５０２、５０４、５０６、５０８、５１０、５１２、５１４、５１６、５１８、５２０、５２２、５２４、５２６、５２８、５３０、５３２、５３４、５３６、５３８、５４０、５４２、５４４、５４６、５４８、５５０、５５２、５５４、５５６、５５８、５６０、５６３、５６５、５６７、５６９、５７１、５７３、５７５、５７７、５７９、５８１、５８３、５８５、５８７、５８９、５９１、５９３、５９５、５９７、５９９、６０１、６０３、６０５、６０７、６０９、６１１、６１３、６１５、６１７、６１９、６２１、６２３、６２５、６２７、６２９、６３１、６４０６、６４０８、６４１０、６４１２、６４１４、６４１６、６４１８、６４２０、６４２２、６４２４、６４２６、６４２８、６４３０、６４３２、６４３４、６４３６、６４３８、６４４０、６４４２、６４４４、６４４６、６４４８、６４５０、６４５２、６４５４、６４５６、６４５８、６４６０、６４６２、６４６４、６４６６、６４６８、６４７０、６４７２、６４７４、６４７６、６４７８、６４８０、６４８２、６４８４、６４８６、６４８８、６４９０、６４９２、６４９４、６４９６、６４９８、６５００、６５０２、６５０４、６５０６、６５０８、６５１０、６５１２、６５１４、６５１６、６５１８、６５２０、６５２２、６５２４、６５２６、６５２８、または６５３０のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のエフェクターモジュール。
20. 前記ＤＲＤが、配列番号７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７９、１８１、１８３、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、または６５５２のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のエフェクターモジュール。
21. 前記ＤＲＤが少なくとも１つの刺激に応答するか、またはそれと相互作用する、請求項１３～２０のいずれか１項に記載のエフェクターモジュール。
22. 前記刺激が小分子であり、前記分子がＴＭＰまたはＭＴＸである、請求項２０または２１に記載のエフェクターモジュール。
23. 前記刺激が小分子であり、前記小分子がバルデナフィル、タダラフィル、またはシルデナフィルである、請求項１９に記載のエフェクターモジュール。
24. 前記刺激が小分子であり、前記小分子がバゼドキシフェン、ラロキシフェン、またはシールド－１である、請求項１７または１８に記載のエフェクターモジュール。
25. 請求項１３～２５のいずれか１項に記載のエフェクターモジュールを含む単離されたポリペプチド。
26. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１３～２４のいずれか１項に記載のエフェクターモジュール、または請求項２５に記載の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
27. 請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
28. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１３～２４のいずれか１項に記載のエフェクターモジュール、または請求項２５に記載の単離されたポリペプチド、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド、または請求項２７に記載のベクターを含む改変細胞。
29. 前記改変細胞が免疫細胞である、請求項２８に記載の改変細胞。
30. 請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１３～２４のいずれか１項に記載のエフェクターモジュール、または請求項２５に記載の単離されたポリペプチドバリアント、または請求項２６に記載のポリヌクレオチド、または請求項２７に記載のベクター、または請求項２８～２９のいずれか１項に記載の改変細胞と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物。
31. エフェクターモジュールを含む細胞を作製するための方法であって、前記エフェクターモジュールは、第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含み、前記第１のペイロードは、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）または変異体ＣＤ４０Ｌを含み、少なくとも１つの核酸を１つ以上の細胞に導入することを含み、前記核酸分子は、薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２の核酸に作動可能に連結されたヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）またはその変異体ＣＤ４０Ｌをコードする少なくとも第１の核酸配列を含む、前記方法。
32. 疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
    ａ．薬物応答性ドメイン（ＤＲＤ）をコードする第２の核酸に作動可能に連結された、ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）またはその変異体ＣＤ４０Ｌをコードする少なくとも第１の核酸配列を含む核酸分子を含む１つ以上の細胞を提供することと；
    ｂ． 前記１つ以上の細胞を前記対象に送達することと；
    ｃ． 前記１つ以上の細胞において前記ヒトＣＤ４０Ｌまたはその変異体ＣＤ４０Ｌの発現を可能にするのに十分に前記ＤＲＤを安定化するリガンドを前記対象に投与することと；を含み、
    前記ヒトＣＤ４０Ｌまたはその変異体ＣＤ４０Ｌの発現は、前記対象におけるリガンドの存在によって制御され、リガンド投与の量及び／または期間は、前記細胞の集団の少なくとも１つの細胞において治療有効量の前記ヒトＣＤ４０Ｌまたはその変異体ＣＤ４０Ｌを産生するのに十分である、前記方法。
33. 前記少なくとも１つの核酸が、配列番号６５４６、または配列番号６５５０、または配列番号６６２０、または配列番号６６２２、または配列番号６６２４、または配列番号６６２６、または配列番号６６２８、または配列番号６６３０、または配列番号６６３２、または配列番号６６３４、または配列番号６６３６、または配列番号６６３８、または配列番号６６４０、または配列番号６６４２、または配列番号６６４４、または配列番号６６４６、または配列番号６６４８、または配列番号６６５０、または配列番号６６５２、または配列番号６６５４、または配列番号６６５６、または配列番号６６５８、または配列番号６６６０、または配列番号６６６２、または配列番号６６６４、または配列番号６６６６、または配列番号６６６８、または配列番号６６７０、または配列番号６６７２から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質構築物をコードする、請求項３２に記載の方法。
34. 前記核酸分子が、ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする第３の核酸配列をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
35. 前記ＤＲＤが少なくとも１つの刺激に応答するか、またはそれと相互作用する、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記刺激が小分子である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記少なくとも１つの細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、樹状細胞からなる群から選択される免疫細胞である、請求項３２に記載の方法。
38. 前記疾患ががんである、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 対象の腫瘍量を低減するための方法であって、
    （ａ）第１のペイロードに作動可能に連結された刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含む組成物を含み、前記第１のペイロードが全体的または部分的に前記ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）を含む、請求項３８に記載の治療有効量の免疫細胞、または医薬組成物を前記対象に投与することと；
    （ｂ）前記第１のペイロードの発現を調節するために、治療上有効な量の刺激を前記対象に投与し、それによって前記腫瘍量を低減することと、を含む、前記方法。
40. 対象における樹状細胞を活性化する方法であって、
    （ａ）前記対象に１つ以上の免疫細胞を投与することであって、前記１つ以上の免疫細胞はエフェクターモジュールを含み、前記エフェクターモジュールは、第１のペイロードに作動可能に連結された少なくとも１つの刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を有し、前記第１のペイロードは、全体的または部分的に前記ヒトＣＤ４０Ｌ（配列番号３８２０）、またはその変異体を含み、前記免疫細胞はＴ細胞である、前記投与することと；
    （ｂ）治療有効量の刺激を前記対象に投与することであって、前記刺激が前記第１のペイロードの発現を調節するためのリガンドである、前記投与することと；
    （ｃ）前記リガンドに応答した前記対象において樹状細胞活性化マーカーであるＩＬ１２を測定して、樹状細胞活性化を測定することと、を含む、前記方法。
41. 前記樹状細胞が、骨髄性樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ＣＤ１４＋樹状細胞、ランゲルハンス細胞、またはミクログリアである、請求項４０に記載の方法。
42. 前記樹状細胞が骨髄性樹状細胞である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記エフェクターモジュールが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、サイトカイン－サイトカイン受容体融合ポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む第２のペイロードをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
44. 前記第２のペイロードがＣＤ１９ ＣＡＲである、請求項４３に記載の方法。