JP2021518543A - 生体試料中の細菌の測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により組み込まれる、2018年3月22日出願の米国仮特許出願第62/646,588号について優先権の利益を主張するものである。
本開示は、生体試料中の細菌を測定する方法に関する。
流体中の細菌、酵母、およびその他の生物体の定量化は、医療診断、薬物開発、産業衛生、食品安全性、およびその他の多くの分野で有用であるとすることができる。たとえば、尿中細菌の量は、感染症の臨床診断において重要なパラメーターである。一般に、尿中105/mL以上の細菌の存在は、尿路感染症陽性の基準として認められている。細菌103/mL以下を有する尿試料は、尿路感染症に対して陰性であるとされる(すなわち、正常な細菌叢を有するとして)。しかし、尿試料が細菌約104/mLを有する場合、診断は確定されず、試料は再検査されることが多い。
生体試料を、1種または複数の界面活性剤を含む水性浄化用溶液(aqueous clearance solution)と接触させること;および
試料中の細菌を定量すること
を含む。
生体試料の第1の一部を第1の一部中の細菌に関して分析すること;
非細菌性粒子状物質の存在または量が、細菌に関する分析を妨害すると判定すること;
生体試料の第2の一部を、1種または複数の界面活性剤を含む水性浄化用溶液と接触させること;および
生体試料の第2の一部中の細菌を定量すること
を含む。
構造
接触させた試料の画像をカメラによって生成すること;
画像中の細菌と相関するピクセル数を測定すること;および
ピクセル数を所定のピクセル数と相関させて、試料中の細菌の量を得ること
によって決定することができる。
生体試料の第1の一部を第1の一部中の細菌に関して分析すること;
非細菌性粒子状物質の存在または量が、細菌に関する分析を妨害すると判定すること;
生体試料の第2の一部を、本明細書に記載の水性浄化用溶液と接触させること;および
第2の一部中の細菌を定量して、生体試料中の細菌を測定すること
を含む、生体試料中の細菌を測定する方法を提供する。
新鮮な冷蔵尿を、分析直前まで2〜8℃で保存した。分析前に、試料を室温(およそ25℃)まで温めた。分析は、試料の受領後できる限り速やかに行う必要がある(たとえば、12時間以内に)。
イヌ全血および/またはLBブロスで増殖させた大腸菌を、0.2μmでろ過したイヌ尿(本明細書では尿ろ液と呼ぶ)の培地に添加した。希釈は、大腸菌4時間培養物の60倍とした。血液試料の場合、全体の希釈は約1200倍とした。水を希釈対照として使用し、1:9の比率で尿ろ液に添加した。浄化用溶液とキレーター溶液の両方が水性であるので、水を対照として選択した。浄化用溶液およびキレーター溶液は、実施例1に従って調製し、同じ手順に従った。
大きな結晶性デブリならびに多数の血球および細菌を含有するイヌ尿を、SMOTの10w/v%溶液と19:1で合わせ、混合した(すなわち、SMOTの最終濃度を0.5%とした)。生じた混合物を、500mM EDTAおよび500mM EGTAを含有する溶液と19:1で合わせ(すなわち、最終濃度を各キレーターについて25mMとした)、穏やかに混合して処理済み試料を生じさせた。未処理の尿および処理済み試料を観察し、カスタムの半自動顕微鏡システムで撮影した。結果の例示的な画像を図5に示す。本開示の方法(すなわち、SMOTおよびキレート化溶液による処理)によると、尿から結晶性デブリおよび血球が取り除かれていたが、細菌は依然として可視であった。
3つの試験生体試料を以下のように調製した。「血液」試料を、イヌ全血5μLをろ過滅菌イヌ尿3mLに添加することにより調製した;「大腸菌」試料を、大腸菌4時間培養物を含有する溶原培地(LB)50μLをろ過滅菌イヌ尿3mLに添加することにより調製した;そして「血液および大腸菌」の試料を、イヌ全血5μLおよび大腸菌4時間培養物を含有するLB 50μLをろ過滅菌イヌ尿3mLに添加することにより調製した。
SMOTを飽和させて、以下のように、ステアロイルメチルタウリンナトリウム(すなわち、2−[メチル(オクタデカノイル)アミノ]エタンスルホン酸ナトリウム塩またはSMST)を得た。N−メチル−N−オレイルタウリンナトリウム500mg(1.2mmol)、ギ酸アンモニウム(884mg、12mmol、10当量)、および10%Pd/C(380mg、0.3mmol)を、不活性雰囲気(アルゴン)下で、メタノール(30mL)に懸濁させた。反応混合物を不活性雰囲気下、室温で一晩撹拌した。混合物をセライトを通してろ過し、セライトを酢酸エチル20mLで3回洗浄した。合わせた有機物を回転蒸発下で除去して、淡黄色油として生成物(N−メチル−N−ステアロイルタウリンナトリウム)を得た。SMOT浄化用溶液を、350mMクエン酸中にSMOT 3.5w/v%を有するように調製した;SMST浄化用溶液を、350mMクエン酸中にSMST 2.2w/v%を有するように調製した;キレート化溶液を、500mM NaOH中に325mM EDTA、325mM EGTAを有するように調製した。イヌ尿試料(60μL)を、浄化用溶液(すなわち、SMOTまたはSMST)15μLでまず処理した。SMOT処理済み試料中のSMOTの濃度は0.7w/v%であり、一方、SMST処理済み試料中のSMSTの濃度は0.44w/v%であった。浄化用溶液で尿試料を処理することに続いて、キレート化溶液15μLを添加した。SediVue Dx(登録商標)Urine Sediment Analyzerでの分析のために、処理済み試料を、SediVue(登録商標)カートリッジに移した。
異なる6つのキレーター溶液を調製した:200mM EDTA溶液;200mM EGTA溶液;1M EDTA溶液;1M EGTA溶液;100mM/100mM EDTA/EGTA;および500mM/500mM EDTA/EGTA。
10w/v% SMOTの一定分量200μLを様々な量(0.2μLから6.4μL)の4Mクエン酸または4M酢酸と組み合わせて、異なる酸性度の浄化用溶液を作製した。各浄化用溶液16.5μLを、穏やかに混合しながら、結晶性デブリおよび細菌を有するイヌ尿165μLに添加した。生じた溶液のpHを測定し、この溶液165μLをSediVue(登録商標)カートリッジに移し、SediVue Analyzerを使用して全体の結晶カウント(CRY)を測定した。
結晶性デブリ(主にストルバイト)を有するイヌ尿165μLを、SMOT 10w/v%および154mMから1Mの範囲のクエン酸を含有する一連の浄化用溶液16.5μLで処理し、これに続いて、穏やかに混合した。次いで、この混合物165μLを水16.5μLと合わせ、穏やかに混合した。次いで、生じた混合物165μLをSediVue(登録商標)カートリッジに入れ、SediVue Analyzerを使用して全体の結晶カウントを測定した。表1に示すように、浄化用溶液中のクエン酸の濃度の上昇と共に、高倍率視野あたりの全体の結晶カウントは減少した。
尿性結晶、細菌、およびイヌ血液0.1v/v%を含有するイヌ尿165μLを、浄化用溶液(10w/v% SMOTの1Mクエン酸)16.5μLと合わせ、穏やかに混合した。処理済み尿試料中のSMOTの最終濃度は0.9w/v%であり、クエン酸は91mMであった。次いで、この混合物165μLに、キレーター溶液(500mM EGTA、500mM EDTA、2M NaOH)16.5μLを添加し、穏やかに混合した。添加後のEGTAおよびEDTAの最終濃度は、それぞれ45mMであり、NaOHは182mMであった。次いで、生じた混合物165μLをSediVue(登録商標)カートリッジに入れ、SediVue Analyzerを使用して、直ちにまたは4分のインキュベーション後に分析した。陰性対照を、尿性結晶、細菌、およびイヌ血液0.1v/v%を含有する未処理のイヌ尿とした。
本開示の方法による処理の前後で、SediVue Analyzerによる細菌認識の性能を、定量的培養と比較した。新鮮な317本のイヌ尿試料を使用した。定量的培養の場合、上記のように、尿試料を希釈し、血液寒天プレート上にプレーティングした。105細菌/mL以上の力価を有する尿を培養により陽性とみなし、105細菌/mL未満を培養により陰性とみなした。
ろ過した3本のイヌ尿試料に、血液0.1v/v%を添加して、血液含有尿試料を得た。これら血液含有尿試料(60μL)を、浄化用溶液(0w/v%、0.006w/v%、0.012w/v%または0.024w/v%でのSMOT、および350mMクエン酸)15μLでそれぞれ処理し、穏やかに混合した。処理済み尿試料中のSMOTの最終濃度は、0w/v%、0.0012w/v%、0.0024w/v%、または0.0049w/v%であった。処理済み試料75μLに、キレーター溶液(325mM EDTA、325mM EGTA、および500mM NaOH)15μLを添加し、これに続いて、穏やかに混合した。生じた最終混合物に関して手動の光学顕微鏡検査が明らかにしたことは、3つの尿すべてはすべての結晶、デブリ、およびRBCが取り除かれたことであった。生じた最終混合物に関して手動の光学顕微鏡検査が明らかにしたことは、最終SMOT濃度0.0024w/v%以上が尿試料からRBCを取り除くのに十分であったことであった。
結晶、RBCおよび白血球で混雑しているネコ尿165μLを浄化用溶液(5w/v% SMOTの500mMクエン酸)30μLと合わせ、穏やかに混合した。次いで、この処理済み試料165μLに、キレーター溶液(250mM EGTA、250mM EDTA、330mM NaOH)50μLを添加し、穏やかに混合した。生じた最終混合物を光学顕微鏡検査によって観察した。
Claims (38)
- 生体試料を、1種または複数の界面活性剤を含む水性浄化用溶液と接触させること;および
試料中の細菌の量を決定すること
を含む、生体試料中の細菌の量を測定する方法。 - 生体試料を、1種または複数の界面活性剤を含む水性浄化用溶液と接触させることを含む、生体試料から非細菌性粒子状物質を取り除く方法。
- 界面活性剤がアニオン性界面活性剤である、請求項1または2に記載の方法。
- 界面活性剤がN−メチルタウリンの脂肪酸アミド誘導体、またはその塩である、請求項1または2に記載の方法。
- 脂肪酸が一価不飽和C10〜C22脂肪酸である、請求項4に記載の方法。
- 界面活性剤がオレオイルメチルタウリンナトリウムである、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 界面活性剤が胆汁酸またはその塩である、請求項1または2に記載の方法。
- 界面活性剤が、コーラル酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、およびデオキシコール酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 浄化用溶液中の1種または複数の界面活性剤の量が、浄化用溶液の総容積に対して、約0.0001w/v%〜約50w/v%の範囲に、たとえば、0.001w/v%〜50w/v%、0.01w/v%〜50w/v%、0.001w/v%〜10w/v%、0.01w/v%〜7w/v%、または0.01w/v%〜5w/v%、0.01w/v%〜2w/v%、0.01w/v%〜1w/v%、または0.01w/v%〜0.1w/v%の範囲にある、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 浄化用溶液中の1種または複数の界面活性剤の量が、浄化用溶液の総容積に対して、約0.5w/v%〜約50w/v%の範囲に、たとえば、0.5w/v%〜10w/v%、0.5w/v%〜7w/v%、0.5w/v%〜5w/v%、0.5w/v%〜2w/v%、または0.5w/v%〜1w/v%の範囲にある、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 浄化用溶液中の1種または複数の界面活性剤の量が、浄化用溶液の総容積に対して、約1w/v%〜約50w/v%の範囲に、たとえば、1w/v%〜10w/v%、1w/v%〜7w/v%、1w/v%〜5w/v%、1w/v%〜2w/v%、2w/v%〜10w/v%、2w/v%〜7w/v%、2w/v%〜5w/v%、または2w/v%〜3w/v%の範囲にある、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 浄化用溶液が酸性である、たとえば、約3〜約6のpHを有する、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 浄化用溶液がカルボン酸またはその塩を含む、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 浄化用溶液がクエン酸またはその塩を含む、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 浄化用溶液中の酸の濃度が、約300mM〜1M、たとえば、300mM〜400mM、300mM〜500mM、または500mM〜1Mの範囲にある、請求項13または14に記載の方法。
- 試料を水性キレーター溶液と接触させることをさらに含む、請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- キレーター溶液と接触させることが、浄化用溶液と接触させた後である、請求項16に記載の方法。
- キレーター溶液と接触させることが、浄化用溶液と接触させる前である、請求項16に記載の方法。
- キレーター溶液が、エチレングリコール−ビス(ベータ−アミノエチルエーテル)−N,N,N’,N’−四酢酸四ナトリウム塩、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩脱水物、またはそれらの組合せを含む、請求項16から18のいずれかに記載の方法。
- キレーター溶液が塩基性である、たとえば、約10〜約14のpHを有する、請求項16から19のいずれかに記載の方法。
- キレーター溶液が水酸化ナトリウム溶液を含む、請求項16から20のいずれかに記載の方法。
- 試料中の細菌の量を決定する前に、試料を約30秒〜約30分間インキュベートすることをさらに含む、請求項1から21のいずれかに記載の方法。
- 細菌を染色剤または染料と接触させることをさらに含む、請求項1から22のいずれかに記載の方法。
- 試料中の細菌の量を決定する前に、試料を染色剤または染料と接触させない、請求項1から22のいずれかに記載の方法。
- 決定することが、細菌をカウントすることおよび/または細菌を分析すること(たとえば、光学顕微鏡下で)を含む、請求項1または3から24のいずれかに記載の方法。
- 決定することが、明視野顕微鏡検査、暗視野顕微鏡検査、または蛍光顕微鏡検査を使用することである、請求項25に記載の方法。
- 決定することが:
接触させた試料の画像をカメラによって生成すること;
画像中の細菌と相関するピクセル数を測定すること;および
前記ピクセル数を所定のピクセル数と相関させて、試料中の細菌の量を得ること
を含む、請求項1または3から24のいずれかに記載の方法。 - 試料の画像をユーザーインターフェース上に表示することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 所定のピクセル数が、既知量の細菌を有する標準試料を使用して実証実験を独立して行うことによって得ることができる、請求項27または28に記載の方法。
- 細菌形状(たとえば、桿菌、または双球菌や連鎖球菌などの球菌を含む球菌)を決定することをさらに含む、請求項1または3から29のいずれかに記載の方法。
- 試料を水性浄化用溶液、水性キレーター溶液、またはその両方と接触させた後、細菌の少なくとも10%が生存可能である、請求項1または3から30のいずれかに記載の方法。
- 細菌の少なくとも50%が生存可能である、請求項31に記載の方法。
- 試料が尿試料である、請求項1から32のいずれかに記載の方法。
- 尿試料が、沈殿物、デブリ、粘液糸、結晶、無定形の塩、細胞断片、赤血球、および患者の細胞からなる群から選択される1種または複数の夾雑物を含む、請求項33記載の方法。
- 生体試料を水性浄化用溶液と接触させる前に:
生体試料の一部を採取するステップ;
前記一部を細菌に関して分析するステップ;および
非細菌性粒子状物質の存在または量が、細菌に関する分析を妨害すると判定するステップ
をさらに含む、請求項1または3から30のいずれかに記載の方法。 - 非細菌性粒子状物質が、沈殿物、デブリ、粘液糸、結晶、無定形の塩、細胞断片、赤血球、および患者の細胞からなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- 少なくとも試料中の細菌の量に基づいて健康判定を行うことをさらに含む、請求項1から36のいずれかに記載の方法。
- 生体試料の第1の一部を第1の一部中の細菌に関して分析すること;
非細菌性粒子状物質の存在または量が、細菌に関する分析を妨害すると判定すること;
生体試料の第2の一部を、1種または複数の界面活性剤を含む水性浄化用溶液と接触させること;および
生体試料の第2の一部中の細菌を定量すること
を含む、生体試料中の細菌の量を測定する方法。
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