ES2930344T3 - Aislamiento de micro ARN a partir de fluido biológico - Google Patents

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Abstract

La presente descripción proporciona métodos y kits para aislar miARN de fluidos biológicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Aislamiento de micro ARN a partir de fluido biológico
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente divulgación se refiere a medios para aislar micro ARN de muestras biológicas.
ANTECEDENTES
Los micro ARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que influyen en las redes reguladoras de genes mediante la regulación postranscripcional de objetivos específicos de ARN mensajero (ARNm) a través de interacciones específicas de apareamiento de bases. Se ha demostrado que los miARN están presentes en biofluidos humanos en forma libre de células. Estos miARN libres de células pueden ser no vesiculares, unidos y protegidos por proteínas en complejos miARN-proteína, encerrados en vesículas unidas a la membrana, como exosomas o microvesículas, o ambos. Dada la importante función funcional de los miARN en las enfermedades, este conjunto de moléculas de ácido nucleico contiene candidatos para diagnosticar y pronosticar enfermedades y monitorear la respuesta a las terapias en una amplia variedad de pacientes y en sujetos antes de que manifiesten la enfermedad en una muestra biológica fácilmente disponible, como como suero y plasma sanguíneo, orina o saliva. Los procedimientos actuales de aislamiento de miARN están dirigidos a miARN relativamente abundantes en células y tejidos, utilizan columnas giratorias que no se automatizan o amplían fácilmente, son complicadas e involucran compuestos tóxicos, o pueden aislar específicamente miARN vesiculares o no vesiculares. Además, los miARN de interés diagnóstico o pronóstico suelen estar presentes en cantidades bajas en los biofluidos, lo que dificulta su detección mediante los procedimientos de aislamiento actuales. Por lo tanto, existe la necesidad de un procedimiento simple, eficiente, automatizable y escalable para aislar todos o la mayoría de los miARN en biofluidos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para aislar microARN (miARN) de una muestra biológica. El procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un agente activo de superficie y un reactivo de proteína de unión anti-miARN, en el que el agente activo de superficie disocia los componentes de la muestra y el reactivo de proteína de unión anti-miARN interactúa con una proteína de unión de miARN asociada con miARN para formar complejos de miARN inmunoprecipitados. El procedimiento comprende además liberar miARN de los complejos de miARN inmunoprecipitados sin purificación poniendo en contacto, a temperatura ambiente, los complejos de miARN inmunoprecipitados con una proteasa.
Otro aspecto de la divulgación abarca un equipo para aislar microARN de una muestra biológica. El equipo comprende (a) un primer agente tensioactivo seleccionado entre un tensioactivo aniónico, un tensioactivo no iónico y combinaciones de los mismos; (b) un segundo agente tensioactivo que comprende desoxicolato de sodio y laurilsulfato de sodio; (c) un anticuerpo anti-Argonaut; y (d) proteinasa K.
Otros aspectos e iteraciones de la divulgación se describen con más detalle a continuación. La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 presenta dos gráficos que comparan el aislamiento de miARN de 0,2 ml de plasma utilizando Tri Reagent® BD o inmunoprecipitación de ARN (RIP). Las cantidades de miRNA aislado por RIP se presentan como la diferencia en veces del miRNA aislado usando Tri Reagent® BD. (A ) representa los niveles de los miARN let-7a-5p, 23a-3p y 191-5p, y (B) muestra los niveles de los miARN 142-3p y 451a.
La figura 2 presenta tres gráficos que muestran los niveles de miARN aislados de plasma usando Ago-RIP o un equipo de purificación de columna Qiagen (Q1, Q2). Las cantidades de miARN aislado, como copias de miR/pl eluidas, se muestran para los miARN let-7a, 23a y 142 (A), 191 miARN (B) y miARN 451a (C).
La figura 3 presenta tres gráficos que muestran los niveles de miARN aislados de plasma utilizando RIP con anticuerpos biotinilados (b-Ago2 o b-Ago) o no biotinilados (Ago2) con estreptavidina o perlas de proteína A. Se muestran las cantidades de miARN aislado representadas como copias de miR/pl eluidas para let-7a (A), 23a (B), y 191 (C) miARN. El anticuerpo (clon entre paréntesis) utilizado se indica en los ejes x.
La figura 4 presenta dos gráficos que muestran los niveles de miARN aislados del plasma usando Ago-RIP con liberación de calor. Q representa la purificación en columna de Qiagen; RIP-Q representa inmunoprecipitación seguida de purificación en columna Qiagen; bRIP-Q representa la inmunoprecipitación con anticuerpo biotinilado seguida de purificación en columna Qiagen. (A ) muestra los niveles de adición de cel-miR-39-3p sintético utilizando la purificación en columna de Qiagen, RIP en combinación con la purificación en columna y RIP con liberación de proteasa K. Los niveles de adición se representan como porcentaje total de cel-miR-39-3p sintético añadido durante el aislamiento. (B) representa los niveles de miARN let7a aislado del plasma mediante la purificación en columna Qiagen, RIP en combinación con purificación en columna y RIP con liberación de proteasa K. Los niveles de let7a se representan como copias de let7a en 1 pl de muestra recuperada.
La figura 5 presenta dos gráficos que muestran los niveles de miARN aislados de plasma usando Ago-RIP con liberación de proteasa K a varias temperaturas. (A ) muestra los niveles de miARN let7a liberados por la proteasa K (barra izquierda a cada temperatura) y los niveles retenidos en las perlas (barra derecha a cada temperatura). Los niveles de miARN let7a se representan como porcentaje total de miARN let7a en 0,2 ml del mismo plasma aislado con el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen. (B) muestra los niveles de miARN miR451a liberados por la proteasa K (barra izquierda a cada temperatura) y los niveles retenidos en las perlas (barra derecha a cada temperatura). Los niveles de miARN miR451a se representan como porcentaje total de miARN miR451a en 0,2 ml del mismo plasma aislado con el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen.
La figura 6 presenta dos gráficos que muestran los niveles de let7a (A ) o miR451a (B) miARN aislado de plasma usando procedimientos comercialmente disponibles de aislamiento de miARN, o aislamiento usando RIP con liberación de proteasa K en tubos estándar. E1 y E2 representan el aislamiento de miARN mediante el uso de biofluidos del equipo de aislamiento de ARN miRCury de Exiqon. Q1 y Q2 representan el aislamiento de miARN utilizando el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen. RIP-std-Q representa inmunoprecipitación seguida de purificación en columna Qiagen. Los niveles de miARN se representan como copias totales recuperadas de 0,2 ml de plasma.
La figura 7 presenta dos gráficos que muestran los niveles de miARN let7a aislado del plasma utilizando procedimientos disponibles comercialmente de aislamiento de miARN, o aislamiento mediante Ago-RIP con liberación de proteasa K (RIP1-4). (A ) Muestra la prueba 1 y (B) muestra el ensayo 2. E1 y E2 representan el aislamiento de miARN con el equipo de aislamiento de ARN miRCury - Biofluids de Exiqon. Q1 y Q2 representan el aislamiento de miARN utilizando el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen. Los niveles de let7a se representan como copias totales de let7a recuperadas de 0,2 ml de plasma.
La figura 8 presenta dos gráficos que muestran los niveles de miARN aislados del plasma usando Ago-RIP seguidos de la liberación de proteasa K con o sin inhibidores de proteasa y ARNasa, y con o sin pretratamiento con detergente. pre, inh; se agregaron Igepal e inhibidores al plasma y se incubaron ~30 minutos antes de agregarlos a las perlas Ago2. pre,-inh; Igepal se añadió al plasma sin inhibidores y se incubó ~30 minutos antes de añadirlo a las perlas Ago2. -pre, inh; Igepal e inhibidores añadidos al plasma al mismo tiempo que las perlas Ago2. -pre,-inh; Igepal se añadió al plasma sin inhibidores al mismo tiempo que las perlas Ago2. (A ) Representa copias recuperadas del miARN let7a, y (B) representa copias de miARN miR451a recuperadas.
La figura 9 presenta un gráfico que muestra los niveles libres (barra izquierda para cada miARN) y vesiculares (barra derecha para cada miARN) para los miARN indicados como % total de miARN tratados con IGEPAL. La figura 10 presenta tres gráficos que muestran los niveles de miARN aislados de 0,2 o 0,4 ml de plasma usando Ago-RIP seguido de liberación de proteasa K (RIP), o de 0,2 ml de plasma usando equipo de aislamiento miRCury RNA -Biofluids de Exiqon (E). (A) Representa copias de let7a miRNA recuperadas, (B) representa copias de miARN miR191 recuperadas, y (C) representa copias de miARN miR451a recuperadas.
La figura 11 presenta un gráfico que muestra los niveles de let7a aislado del plasma utilizando Ago-RIP seguido de la liberación de proteasa K. Las incubaciones RIP se realizaron a temperatura ambiente durante 5, 15, 30 o 60 minutos (5', 15', 30', 60'). Los que se incubaron durante 5, 15 o 30 minutos se lavaron todos 5 veces antes de la liberación de proteinasa K. Los 60 minutos incubados se lavaron 5, 4, 3, 2 o 1 vez (5w, 4w, 3w, 2w, 1w). Se muestra el rendimiento total de let7a recuperado de 0,2 ml de plasma.
La figura 12A muestra los niveles de miARN let7a aislado del plasma usando Ago-RIP o equipos de aislamiento de miARN basados en columnas. Se presentan tres experimentos diferentes (Exp). S1 y S2 representan aislamiento usando Ago-RIP; E1 y E2 representan el aislamiento utilizando el equipo de aislamiento de ARN miRCury-Biofluids de Exiqon; y Q1 y Q2 representan el aislamiento usando el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen.
La figura 12B presenta los niveles de ARN nuclear pequeño de RNU6 y ARN nucleolar pequeño de SNORD48 aislados de plasma utilizando Ago-RIP o equipos de aislamiento de miARN basados en columnas. Se presentan tres experimentos diferentes. S1 y S2 representan aislamiento usando Ago-RIP; E1 y E2 representan el aislamiento utilizando el equipo de aislamiento de ARN miRCury-Biofluids de Exiqon; y Q1 y Q2 representan el aislamiento usando el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen.
La figura l2 c muestra los niveles de ARN mensajero de GAPDH, ARN ribosómico RN18S y ARN ribosómico RN28S aislados de plasma mediante Ago-RIP o equipos de aislamiento de miARN basados en columnas. Se presentan tres experimentos diferentes. S1 y S2 representan aislamiento usando Ago-RIP; E1 y E2 representan el aislamiento utilizando el equipo de aislamiento de ARN miRCury-Biofluids de Exiqon; y Q1 y Q2 representan el aislamiento usando el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen.
La figura 13 presenta un gráfico que muestra los niveles de los miARN indicados aislados del plasma a través de Ago-RIP usando anticuerpos anti-Ago1, anticuerpos anti-Ago2 o una combinación de anticuerpos anti-Ago1 y anti-Ago2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se ha descubierto un procedimiento eficiente y rápido para aislar miRNAs circulantes. Como se ilustra en los ejemplos, un procedimiento de la divulgación puede aislar simultáneamente miARN circulantes asociados a vesículas y no asociados a vesículas. Ventajosamente, los procedimientos y equipos de la presente divulgación permiten el aislamiento rápido y específico de preparaciones puras de miARN sin contaminación por otros tipos de ARN. Además, los procedimientos y equipos descritos en el presente documento permiten el aislamiento de miARN con alto rendimiento a partir de fluidos extracelulares diluidos. Además, los procedimientos de la presente invención son escalables, lo que permite el aislamiento de miARN a partir de volúmenes crecientes de fluidos biológicos extracelulares.
Los niveles de miARN se correlacionan con enfermedades, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y muchas otras enfermedades y procesos de desarrollo, como la esquizofrenia, la enfermedad de Alzheimer, el desarrollo de células inmunitarias y la modulación de la inmunidad innata y adaptativa, el mantenimiento y la pluripotencia de las células madre, el desarrollo del sistema nervioso, enfermedad endocrina, incluida la diabetes, desarrollo del páncreas, síndrome de X frágil, cicatrización de heridas cutáneas, progresión del ciclo celular, rechazo de tejido trasplantado, hipoxia, diferenciación del músculo esquelético. Además, los miARN también son expresados por virus y se han identificado los genes diana de esos miARN. Como tales, los procedimientos y equipos de la presente divulgación se pueden usar para preparar miARN para ensayos para diagnosticar enfermedades o estados patológicos usando una muestra biológica fácilmente disponible, como sangre, suero o plasma.
I. Procedimiento
La presente divulgación abarca un procedimiento para aislar microARN (miARN) de una muestra biológica. El procedimiento comprende poner en contacto la muestra biológica con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN. El agente tensioactivo disocia los componentes de la muestra y el reactivo anti-proteína de unión a miARN interactúa con las proteínas de unión a miARN asociadas con miARN para formar complejos de miARN inmunoprecipitados sin purificación al poner en contacto, a temperatura ambiente, los complejos de miARN inmunoprecipitados con una proteasa. El procedimiento comprende además liberar miARN de los complejos de miARN inmunoprecipitados.
El procedimiento divulgado en el presente documento aísla específicamente los miARN. Como se detalla en el Ejemplo 12 a continuación, otros tipos de ARN pequeños (como los ARN nucleares pequeños o los ARN nucleolares pequeños) no se aíslan mediante el procedimiento divulgado, y las moléculas de ARN más grandes (como los ARN mensajeros o los ARN ribosómicos) no se aíslan mediante el procedimiento divulgado.
(a) fluido biológico
Un procedimiento de la presente divulgación comprende el aislamiento de miARN circulante extracelular en una muestra de fluido biológico obtenida de un sujeto. El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un ser humano o un animal. El sujeto puede ser un embrión, un juvenil o un adulto. El sujeto puede ser hombre o mujer. Los animales adecuados incluyen vertebrados tales como mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Los ejemplos de mamíferos adecuados incluyen, sin limitación, roedores, animales de compañía, ganado y primates. Los ejemplos no limitativos de roedores incluyen ratones, ratas, hámsters, jerbos y cobayas. Los animales de compañía adecuados incluyen, entre otros, gatos, perros, conejos, erizos y hurones. Los ejemplos no limitantes de ganado incluyen caballos, cabras, ovejas, cerdos, vacas, llamas y alpacas. Los primates adecuados incluyen, pero no se limitan a, monos capuchinos, chimpancés, lémures, macacos, titíes, tamarinos, monos araña, monos ardilla y monos verdes. Los ejemplos no limitantes de aves incluyen pollos, pavos, patos y gansos. Un sujeto ejemplar es un ser humano.
El término fluido biológico puede referirse a todos los fluidos biológicos y excreciones aisladas de cualquier sujeto dado. Los ejemplos no limitantes de un fluido biológico pueden incluir sangre y fracciones de la misma, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, excrementos, semen, fluido seminal, plasma seminal, fluido prostático, fluido preeyaculatorio (fluido de Cowper), derrame pleural, lágrimas, saliva, esputo, sudor, biopsia, ascitis, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, linfa, médula, secreciones cervicales, secreciones vaginales, secreciones endometriales, secreciones gastrointestinales, secreciones bronquiales, secreciones mamarias, secreciones de quistes ováricos, líquido tisular, aspirante tumoral y tejido muestras de fluidos. En algunas realizaciones, un fluido biológico es suero sanguíneo. En otras realizaciones, un fluido biológico es plasma sanguíneo.
Los procedimientos para obtener una muestra de suero o plasma sanguíneo de un sujeto son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar la venopunción, con o sin catéter, para recoger una muestra de sangre para preparar suero. Los procedimientos para preparar plasma y suero a partir de una muestra de sangre son conocidos en la técnica. En general, una muestra de sangre es lo suficientemente grande para suministrar cantidades suficientes de plasma o suero para ser procesada como se describe más adelante. Una muestra de plasma o suero puede procesarse inmediatamente después de recoger la muestra. Alternativamente, una muestra de plasma o suero puede congelarse para su posterior procesamiento.
Se puede obtener una muestra de fluido biológico de un sujeto recolectando una muestra fresca. Alternativamente, se puede obtener una muestra de fluido biológico a partir de una muestra previamente recolectada y almacenada. Por ejemplo, cuando un fluido biológico es plasma sanguíneo o suero, se puede obtener una muestra de una colección de muestras de sangre almacenadas y conservadas. En algunas realizaciones, se obtiene una muestra recogiendo una muestra fresca. En otras realizaciones, se obtiene una muestra a partir de una muestra previamente recogida y almacenada.
En algunas realizaciones, una muestra de fluido biológico no está diluida. En otras realizaciones, una muestra de fluido biológico se diluye antes del aislamiento de miARN. El grado de dilución puede depender de una serie de factores que incluyen, entre otros, el miARN, el tipo de fluido biológico en la muestra, el sujeto, la enfermedad del sujeto, el tipo de ensayo utilizado para medir el miARN y los reactivos utilizados en el ensayo utilizado para medir el miARN. En una realización, una muestra de fluido biológico se diluye añadiendo un volumen de diluyente que oscila entre aproximadamente la mitad del volumen de la muestra original y aproximadamente 50.000 veces el volumen de la muestra original. El diluyente puede ser cualquier fluido que no interfiera con el aislamiento de miARN u otros procedimientos utilizados en las etapas de procesamiento posteriores. Los ejemplos no limitantes de diluyentes adecuados incluyen agua desionizada, agua destilada, solución salina, solución de Ringer, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con TRIS, citrato salino estándar y solución salina tamponada con HEPES.
(b) agente tensioactivo
Un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo (denominado alternativamente como "tensioactivo" o "detergente"). Como se usa en el presente documento, el término "agente tensioactivo" puede usarse para describir cualquier agente capaz de disociar componentes de fluidos biológicos que pueden comprender un miARN circulante. Los ejemplos no limitativos de componentes de fluidos biológicos que pueden comprender un miARN circulante incluyen vesículas extracelulares tales como lipoproteínas, exosomas, microvesículas, ectosomas, cuerpos apoptóticos y otras vesículas extracelulares.
Como apreciará un experto en la materia, cualquier agente tensioactivo capaz de disociar componentes fluidos biológicos puede usarse en los métodos de la divulgación, siempre que el agente tensioactivo no interfiera con la formación de un complejo de miARN inmunoprecipitado de la divulgación. Por ejemplo, un agente tensioactivo puede ser un agente tensioactivo aniónico, un agente tensioactivo catiónico, un agente tensioactivo zwitteriónico, un agente tensioactivo no iónico o combinaciones de los mismos. La identidad del agente tensioactivo de la invención puede variar y variará, dependiendo de la identidad de los componentes del fluido biológico en un fluido biológico que puede comprender un miARN circulante, el reactivo de proteína de unión anti-miARN y el miARN aislado.
En algunas realizaciones, un agente tensioactivo es un agente tensioactivo aniónico. Agentes tensioactivos aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, dodecilbencenosulfonato de amina; sulfato de caprileto de amonio; cumenosulfonato de amonio; estearato de dihidroxi de amonio; sulfonato de dodecilbenceno de amonio; sulfato de amonio laureth; sulfato de amonio laureth-30; lauril sarcosinato de amonio; laurilsulfato de amonio; lauril sulfosuccinato de amonio; lignosulfonato de amonio; sulfato de mireto de amonio; sulfonato de naftaleno amónico; nonoxinol-20 sulfato de amonio nonoxinol-30 sulfato de amonio; nonoxinol-4 sulfato de amonio; sulfato de nonoxinol-6 de amonio; sulfato de nonoxinol-9 de amonio; sulfato oleico de amonio; perfluorooctanoato de amonio; estearato de amonio; xilenosulfonato de amonio; sulfonato de butilnaftaleno; fosfato de butilo; sulfonato de dodecilbenceno de calcio; lactilato de estearoilo de calcio; sulfonato de tetrapropilenbenceno de calcio; ácido capryleth-9 carboxílico; fosfato de cetilo; ácido cumenosulfónico; fosfato de DEA-cetilo; sulfonato de DEA-dodecilbenceno; sulfato de DEA-cetilo; fosfato de deceth-4; lauril sulfosuccinato de diamonio; estearilsulfosuccinato de diamonio; sulfosuccinato de diamil sodio; sulfosuccinato de diciclohexilo y sodio; sulfosuccinato de diexhilo y sodio; sulfosuccinato de diisobutilo y sodio; citrato de dilaureth-7; dimeticonol; fosfato de dinonoxinol-4; sulfosuccinato de dioctilamonio; sulfosuccinato de dioctilo y sodio; sulfosuccinato de cetearil disódico; cocamido disódico MEA-sulfosuccinato; cocamido PEG-3 sulfosuccinato disódico; deceth-6 sulfosuccinato disódico; disulfonato de éter difenil decil disódico; sulfosuccinamato de dodeciloxipropilo disódico; sulfosuccinato de isodecilo disódico; laneth-5 sulfosuccinato disódico; lauramido disódico DEA-sulfosuccinato; lauramido disódico MEA-sulfosuccinato; laureth sulfosuccinato disódico; lauril sulfosuccinato disódico; miristamido disódico MEA-sulfosuccinato; oleamido MEA-sulfosuccinato de disodio oleamido PEG-2 sulfosuccinato de disodio; oleth-3 sulfosuccinato disódico; cocamido MIPA sulfosuccinato disódico PEG-4; ricinoleamido disódico MEA-sulfosuccinato; sulfosuccinamato de estearilo disódico; undecilenamido disódico MEA-sulfosuccinato; sulfosuccinato de ditridecilo sodio; anhídrido dodecenilsuccínico; ácido dodecil difenil éter disulfónico; ácido dodecil difenilóxido disulfónico; ácido dodecilbencenosulfónico; dioleato de glicerilo SE; diestearato de glicerilo SE; ricinoleato de glicerilo SE; citrato de estearato de glicerilo; estearato de glicerilo SE; estearato de glicol SE; fosfato de hexilo; fosfato de isopropilo; dodecilbencenosulfonato de isopropilamina; isoesteareth-2 fosfato; fosfato de isotrideceth-3; fosfato de isotrideceth-6; laureth-1 fosfato; ácido laureth-12 carboxílico; laureth-3 fosfato; laureth-4 fosfato; laureth-6 fosfato; citrato de laureth-7; laureth-9 fosfato; lauril fosfato; laurilsulfato de litio; laureth sulfato de magnesio; sulfato de cocamida PEG-3 de magnesio; MEA-laureth fosfato; MEA-lauril sulfato; MIPA-laureth sulfato; MIPA-lauril sulfato; miristoil sarcosina; sulfonato de naftaleno-formaldehído; nonoxinol-10 fosfato; fosfato de nonoxinol-12; nonoxinol-3 fosfato; nonoxinol-4 fosfato; sulfato de nonoxinol-4; nonoxinol-6 fosfato; fosfato de nonoxinol-7; fosfato de nonoxinol-8; fosfato de nonoxinol-9; nonil nonoxinol-10 fosfato; nonil nonoxinol-15 fosfato; nonil nonoxinol-7 fosfato; ácido oleth-10 carboxílico; oleth-10 fosfato; ácido oleth-3 carboxílico; oleth-4 fosfato; olethfosfato th-5; ácido oleth-6 carboxílico; oleth-7 fosfato; PEG-2 dilaurato SE; PEG-2 dioleato SE; diestearato de PEG-2 SE; laurato de PEG-2 SE; oleato de PEG-2 SE; estearato de PEG-2 SE; ácido carboxílico de estearamida PEG-9; cetilfosfato de potasio; fosfato de potasio deceth-4; sulfonato de dodecilbenceno de potasio; isoesteareth-2 fosfato de potasio; lauroilsarcosinato de potasio; laurilsulfato de potasio; oleato de potasio; sulfato oleico de potasio; perfluorooctoato de potasio; sulfato ricinoleico de potasio; laurato de PPG-2 SE; oleato de PPG-2 SE; PPG-2 estearato SE; PPG-5-ceteth-10 fosfato; laurato de propilenglicol SE; oleato de propilenglicol SE; ricinoleato de propilenglicol SE; estearato de propilenglicol SE; copolímero PVM/MA; fosfato de 2-etilhexilo de sodio; 2-etilhexilsulfato de sodio; un sulfonato de olefina de sodio; aliloxi hidroxipropil sulfonato de sodio; behenoil lactilato de sodio; butoxietoxiacetato de sodio; butil naftaleno sulfonato de sodio; sulfato de oleato de butilo de sodio; oleato de butilo sulfonato de sodio; fosfato de butilo de sodio; lactilato de caproilo de sodio; sulfonato de caprililo de sodio; cetilsulfato de sodio; colato de sodio; cumenosulfonato de sodio; sulfato de sodio deceth; sulfonato de decildifenil éter de sodio; decilsulfato de sodio; desoxicolato de sodio; sulfonato de dibutilnaftaleno de sodio; sulfonato de didodecilbenceno de sodio; sulfosuccinato de diisooctilo de sodio; diisopropil naftaleno sulfonato de sodio; citrato de dilaureth-7 de sodio; dinonil sulfosuccinato de sodio; disulfonato de dodecildifeniléter de sodio; disulfonato de dodecildifenilóxido de sodio; dodecilbencenosulfonato de sodio; sulfato de trioleato de glicerilo de sodio; disulfonato de hexadecildifenilo de sodio; disulfonato de hexadecilo difenilóxido de sodio; disulfonato de hexildifenilóxido de sodio; isotionato de sodio; sulfato de isodecilo de sodio; sulfato de isooctilo de sodio; lactilato de isoestearoilo sódico; sulfato de isotrideceth-15 de sodio; lactato de sodio; lauramido DEA-sulfosuccinato de sodio; laureth fosfato de sodio; laureth sulfato de sodio; laureth sulfosuccinato de sodio; laureth-10 fosfato de sodio; laureth-11 carboxilato de sodio; laureth-12 sulfato de sodio; laureth-13 acetato de sodio; laureth-13 carboxilato de sodio; laureth-3 carboxilato de sodio; laureth-4 carboxilato de sodio; laureth-4 fosfato de sodio; laureth-6 carboxilato de sodio; laureth-7 carboxilato de sodio; laureth-7 sulfato de sodio; sulfato de sodio laureth-8; lauroil glutamato de sodio; lactilato de lauroilo sódico; lactilato de lauroilo sódico; lauroil metilaminopropionato de sodio; lauroilsarcosinato de sodio; lauril fosfato de sodio; Lauril Sulfato de Sodio; lauril sulfoacetato de sodio; lignato de sodio; lignosulfonato de sodio; sulfonato de metalilo de sodio; metil lauroil taurato de sodio; metil miristoil taurato de sodio; metil oleoil taurato de sodio; metil palmitoil taurato de sodio; metil estearoil taurato de sodio; metilnaftalenosulfonato de sodio; mnitrobencenosulfonato de sodio; sulfato de mireto de sodio; miristoil glutamato de sodio; miristoil sarcosinato de sodio; sulfato de miristilo de sodio; sulfato de nonoxinol de sodio; nonoxinol-10 sulfato de sodio; nonoxinol-10 sulfosuccinato de sodio; nonoxinol-15 sulfato de sodio; nonoxinol-4 sulfato de sodio; nonoxinol-5 sulfato de sodio; nonoxinol-6 fosfato de sodio; nonoxinol-6 sulfato de sodio; nonoxinol-8 sulfato de sodio; nonoxinol-9 fosfato de sodio; nonoxinol-9 sulfato de sodio; sulfonato de etano-2 octoxinol sódico; sulfato de octoxinol-3 de sodio; octilsulfato de sodio; sulfonato de octilfenoxietoxietilo de sodio; sulfato oleico de sodio; fosfato de sodio oleth-7; fosfato de oleilo y sodio; oleilsulfato de sodio; oleil sulfosuccinamato de sodio; palmitoilsarcosinato de sodio; fenilsulfonato de sodio; sulfato de oleato de propilo de sodio; lactilato de estearoilo de sodio; estearilsulfosuccinato de sodio; sulfato de trideceth de sodio; trideceth-3 carboxilato de sodio; trideceth-6 carboxilato de sodio; trideceth-7 carboxilato de sodio; sulfato de tridecilo de sodio; sulfonato de tridecilbenceno de sodio; xilenosulfonato de sodio; estearoil sarcosina; TEA-lauroil glutamato; TEA-lauril sulfato; dicarboxietil estearil sulfosuccinamato de tetrasodio; TIPA-laureth sulfato; triceteareth-4 fosfato; fosfato de triceth-5; trideceth-2 fosfato; trideceth-3 fosfato; trideceth-5 fosfato; fosfato de tridecilo; y trilaureth-4 fosfato; y fosfato de trioctilo.
En otras realizaciones, un agente tensioactivo es un agente tensioactivo catiónico. Los ejemplos de agentes tensioactivos catiónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, bromuro de alquiltrimetilamonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencildimetilhexadecilamonio; cloruro de bencildimetiltetradecilamonio; bromuro de bencildodecildimetilamonio; tetracloroyodato de benciltrimetilamonio; bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB); bromuro de dimetildioctadecilamonio; bromuro de dodeciletildimetilamonio; bromuro de dodeciltrimetilamonio; bromuro de dodeciltrimetilamonio; cloruro de dodeciltrimetilamonio; bromuro de etilhexadecildimetilamonio; reactivo T de Girard; bromuro de hexadeciltrimetilamonio; bromuro de hexadeciltrimetilamonio; N,N',N'-polioxietilen(10)-N-sebo-1,3-diaminopropano; bromuro de tonzonio; y bromuro de trimetil(tetradecil)amonio.
En aún otras realizaciones, un agente tensioactivo es un agente tensioactivo zwitteriónico. Los agentes tensioactivos de ion híbrido adecuados incluyen, entre otros, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO); 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (CHAPS); 3-(4-Heptil)fenil-3-hidroxipropil)dimetilamoniopropanosulfonato (C7BzO); sal interna de propanosulfonato de 3-(N,N-dimetiloctilamonio) (SB3-8); sal interna de propanosulfonato de 3-(decildimetilamonio) (SB3-10; caprilil sulfobetaína); sal interna de propanosulfonato de 3-(dodecildimetilamonio) (SB3-12); 3-(N,N-dimetiltetradecilamonio)propanosulfonato (SB3-14); propanosulfonato de 3-(N,N-dimetilpalmitilamonio) (SB3-16); propanosulfonato de 3-(N,N-dimetiloctadecilamonio) (SB3-18); 3-[N,N-dimetil(3-miristoilaminopropil)amonio]propanosulfonato (ASB-14). Otros detergentes zwitteriónicos adecuados, dependiendo de la realización, incluyen: lecitina acetilada; betaína de albaricoamidopropilo; babassuamidopropil betaína; behenil betaína; glicinato de bis 2-hidroxietilo de sebo; alquil C12-14 dimetil betaína; canolamidopropil betaína; amidopropil betaína cáprico/caprílico; caprilamidopropil betaína; cetil betaína; cocamidopropil betaína; colágeno hidrolizado de cocamidopropil dimetilaminohidroxipropilo; sal potásica de N-[3-cocamido)-propil]-N,N-dimetilbetaína; cocamidopropil hidroxisultaína; cocamidopropil sulfobetaína; ácido cocaminobutírico; ácido cocaminopropiónico; ácido cocoanfodipropiónico; coco-betaína; cocodimetilamonio-3-sulfopropilbetaína; cocoiminodiglicinato; cocoiminodipropionato; coco/oleamidopropil betaína; cocoilsarcosinamida DEA; DEA-cocoanfodipropionato; glicinato de dihidroxietilo de sebo; dimeticona propil PG-betaína; ácido N,N-dimetil-N-láurico-amidopropil-N-(3-sulfopropil)-amonio betaína; N,N-dimetil-N-miristil-N-(3-sulfopropil)-amonio betaína; N,N-dimetil-N-palmitil-N-(3-sulfopropil)-amonio betaína; N,N-dimetil-N-estearamidopropil-N-(3-sulfopropil)-amonio betaína; N,N-dimetil-N-estearil-N-(3-sulfopropil)-amonio betaína; N,N-dimetil-N-sebo-N-(3-sulfopropil)-amonio betaína; caproanfodiacetato de disodio; caproanfodipropionato de disodio; capriloanfodiacetato de disodio; capriloanfodipropionato disódico; cocoanfodiacetato de disodio; cocoanfodipropionato disódico; isoestearoanfodipropionato de disodio; laureth-5 carboxianfodiacetato de disodio; lauriminodipropionato disódico; lauroanfodiacetato de disodio; lauroanfodipropionato disódico; octil b-iminodipropionato de disodio; oleoanfodiacetato de disodio; oleoanfodipropionato de disodio; PPG-2-isodeceth-7 carboxianfodiacetato de disodio; anfodiacetato de soja disódico; estearoanfodiacetato de disodio; tallanfodipropionato disódico; seboanfodiacetato de disodio; sebominodipropionato disódico; germanfodiacetato de trigo disódico; N,N-diestearil-N-metil-N-(3-sulfopropil)-amonio betaína; erucamidopropil hidroxisultaína; dipropionato de etilhexilo; etil hidroximetil oleil oxazolina; sulfato de etil PEG-15 cocamina; lecitina hidrogenada; proteína hidrolizada; isoestearamidopropil betaína; lauramidopropil betaína; lauramidopropil dimetil betaína; ácido lauraminopropiónico; ácido lauroanfodipropiónico; lauroil lisina; lauril betaína; lauril hidroxisultaína; lauril sultaína; linoleamidopropil betaína; lisolecitina; lípido de la leche amidopropil betaína; miristamidopropil betaína; dipropionato de octilo; octiliminodipropionato; oleamidopropil betaína; oleil betaína; 4,4(5H)-oxazoldimetanol, 2-(heptadecenil)-; palmitamidopropil betaína; óxido de palmitamina; ricinoleamidopropil betaína; copolímero de ricinoamidopropil betaína/IPDI; sesamidopropil betaína; alcoxipropil iminodipropionato de sodio C12-15; caproanfoacetato de sodio; capriloanfoacetato de sodio; sulfonato de capriloanfohidroxipropilo de sodio; capriloanfopropionato de sodio; carboximetil sebo polipropilamina sódica; cocaminopropionato de sodio; cocoanfoacetato de sodio; sulfonato de cocoanfohidroxipropilo de sodio; cocoanfopropionato de sodio; dicarboxietil cocofosfoetil imidazolina sódica; glicinato de dimetilo de sebo hidrogenado de sodio; isoestearoanfopropionato de sodio; lauriminodipropionato de sodio; lauroanfoacetato de sodio; oleoanfohidroxipropilsulfonato de sodio; oleoanfopropionato de sodio; estearoanfoacetato de sodio; talampopropionato de sodio; soyamidopropil betaína; estearil betaína; seboamidopropil hidroxisultaína; ácido seboanfopolicarboxipropiónico; cloruro de fosfato de acetato de PG de lauroanfo trisódico; undecilenamidopropil betaína; y germamidopropil betaína de trigo.
En otras realizaciones, un agente tensioactivo es preferentemente un agente tensioactivo no iónico. Los ejemplos de agentes tensioactivos no iónicos adecuados incluyen, entre otros, éter cetílico de polioxietileno (10) (BRIJ® 56); éter cetílico de polioxietileno (20) (BRIJ® 58); polioxietilenglicol dodecil éter (BRIJ® 35); polioxietileno (9) pt-octilfenol (NONIDET™ P-40); polioxietileno (4-5) pt-octilfenol (TRITON™ X-45); polioxietileno (7-8) pt-octil fenol (TRITON™ X-114); polioxietileno (9-10) fenol de pt-octilo (TRITON™ X-100); polioxietileno (9-10) nonilfenol (TRITON™ N-101); polioxietileno (20) sorbitol monolaurato (TWEEN® 20); polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitol (TWEEN®40); monooleato de polioxietileno (20) sorbitol (TWEEN®80); óxido de dimetildecilfosfina (APO-10); óxido de dimetildodecilfosfina (APO-12); ciclohexil-n-etil-p-D-maltósido; ciclohexil-n-hexil-p-D-maltósido; ciclohexil-n-metil-pmaltósido; n-decanoilsacarosa; n-decil-p-D-glucopiranósido; n-decil-p-maltopiranósido; n-decil-p-D-tiomaltósido; ndodecanoil sacarosa; éter monododecílico de decaetilenglicol; N-decanoil-N-metilglucamina; n-decil a-D-glucopiranósido; decil p-D-maltopiranósido; n-dodecanoil-N-metilglucamida; n-dodecil a-D-maltósido; n-dodecil p-D-maltósido; heptano-1,2,3-triol; monodecil éter de heptaetilenglicol; monododecil éter de heptaetilenglicol; monotetradecil éter de heptaetilenglicol; n-hexadecil p-D-maltósido; monododecil éter de hexaetilenglicol; éter monohexadecílico de hexaetilenglicol; éter monooctadecilo de hexaetilenglicol; éter monotetradecílico de hexaetilenglicol; metil-6-O-(N-heptilcarbamoil)-a-D-glucopiranósido; éter monododecílico de nonaetilenglicol; N-nonanoil-N-metilglucamina; N-nonanoil-N-metilglucamina; monodecil éter de octaetilenglicol; monododecil éter de octaetilenglicol; éter monohexadecílico de octaetilenglicol; éter monooctadecílico de octaetilenglicol; éter monotetradecílico de octaetilenglicol; octil-p-glucósido; octil-p-tioglucósido; octil-p-D-glucopiranósido; octil-p-D-1-tioglucopiranósido; éter monodecílico de pentaetilenglicol; éter monododecílico de pentaetilenglicol; éter monohexadecílico de pentaetilenglicol; éter monohexílico de pentaetilenglicol; éter monooctadecílico de pentaetilenglicol; monooctil éter de pentaetilenglicol; éter diglicidílico de polietilenglicol; éter de polietilenglicol; éter tridecílico de polioxietileno 10; estearato de polioxietileno (100); éter isohexadecílico de polioxietileno (20); éter oleílico de polioxietileno (20); estearato de polioxietileno (40); estearato de polioxietileno (50); estearato de polioxietileno (8); polioxietilen bis(imidazolil carbonilo); estearato de polioxietileno (25) propilenglicol; saponina de la corteza de Quillaja; tetradecil-p-D-maltósido; éter monodecílico de tetraetilenglicol; éter monododecílico de tetraetilenglicol; éter monotetradecílico de tetraetilenglicol; éter monodecílico de trietilenglicol; éter monododecílico de trietilenglicol; éter monohexadecílico de trietilenglicol; monooctil éter de trietilenglicol; éter monotetradecílico de trietilenglicol; tiloxapol; n-undecil p-D-glucopiranósido, (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL® CA-630); polioxietileno (5) nonilfeniléter (IGEPAL® CO-520); y polioxietileno (150) dinonilfenil éter (IGEPAL® DM-970). En una realización, un agente tensioactivo es polioxietileno (5) nonilfeniléter (IGEPAL® CO-520). En otra realización, un agente tensioactivo es polioxietileno (150) dinonilfenil éter (IGEPAL® DM-970). En una realización, un agente tensioactivo es preferentemente (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPa L® CA-630).
Como apreciará un experto en la materia, la cantidad de agente tensioactivo añadido al fluido biológico puede variar y variará dependiendo de la identidad de los componentes del fluido biológico en un fluido biológico que puede comprender un miARN circulante. En algunas realizaciones, la concentración final de agente tensioactivo en el fluido biológico puede oscilar entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 10 %. En una realización, la concentración de agente tensioactivo puede oscilar entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,01 %. En otra realización, la concentración de agente tensioactivo puede oscilar entre aproximadamente el 0,01 % y aproximadamente el 0,1 %. En otra realización más, la concentración de agente tensioactivo puede oscilar entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 1 %. En otra realización, la concentración de agente tensioactivo puede oscilar entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 5 %. En una realización adicional, la concentración de agente tensioactivo puede oscilar entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 10 %.
(c) reactivo de proteína de unión anti-miRNA
Un fluido biológico se pone en contacto con un reactivo de proteína de unión anti-miARN. Un reactivo anti-proteína de unión a miARN puede ser cualquier agente capaz de unirse a una proteína de unión a miARN asociada con los miARN circulantes. Una proteína de unión a miARN asociada con los miARN circulantes puede unirse a un miARN directamente o puede asociarse indirectamente con un complejo ARN-proteína que comprende miARN. Ejemplos no limitantes de proteínas de unión a miARN que pueden asociarse con miARN circulantes pueden incluir Argonaut, Dicer, proteína de unión de ARN de respuesta transactivante del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (TRBP), proteína activadora de la proteína quinasa inducida por interferón (PACT), la complejo SMN, proteína de retraso mental X frágil (FMRP), proteína que contiene el dominio de la nucleasa estafilocócica de Tudor (Tudor-SN), la ADN helicasa putativa MOV10 y la proteína que contiene el motivo de reconocimiento de ARN TNRC6B, u otros componentes del complejo RISC o que puede asociarse de forma transitoria o permanente con el complejo RISC.
En algunas realizaciones, un fluido biológico preferentemente se pone en contacto con un reactivo anti-Argonaut. Los ejemplos no limitantes de una proteína Argonaut pueden incluir Ago1, Ago2, Ago3 y Ago4. En una realización, un fluido biológico se pone en contacto con un reactivo anti-Ago1. En otra realización, un fluido biológico se pone en contacto con un reactivo anti-Ago2. En otra realización más, un fluido biológico se pone en contacto con un reactivo anti-Ago3. En una realización adicional, un fluido biológico se pone en contacto con un reactivo anti-Ago4. En otra realización, un fluido biológico preferentemente se pone en contacto con un reactivo capaz de unirse a más de una proteína Argonaut. Por ejemplo, un fluido biológico puede ponerse en contacto con un reactivo anti-Ago1 y anti-Ago2. En aún otra realización, un fluido biológico preferentemente se pone en contacto con un reactivo capaz de unirse a Ago1, Ago2, Ago3 y Ago4.
Un reactivo de proteína de unión anti-miARN puede ser un agente de unión de epítopos. Los ejemplos no limitantes de agentes de unión a epítopos adecuados, dependiendo de la molécula diana, incluyen agentes seleccionados del grupo que consiste en un aptámero, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una secuencia de ADN de doble cadena, ácidos nucleicos modificados, imitadores de ácidos nucleicos, un ligando, un fragmento de ligando, un receptor, un fragmento de receptor, un polipéptido, un péptido, una coenzima, un corregulador, una molécula alostérica y un ion.
En algunas realizaciones, un agente de unión al epítopo es un anticuerpo. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos que se pueden usar incluyen anticuerpos policlonales, ascitis, fragmentos Fab, fragmentos Fab', anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único, anticuerpos humanizados y otros fragmentos que contienen el sitio de unión al epítopo del anticuerpo.
En algunas realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un anticuerpo anti-Argonaut. En una realización, un fluido biológico se pone en contacto con un anticuerpo anti-Ago1. En otra realización, un fluido biológico se pone en contacto con un anticuerpo anti-Ago2. En otra realización más, un fluido biológico se pone en contacto con un anticuerpo anti-Ago3. En otra realización, un fluido biológico se pone en contacto con un anticuerpo anti-Ago4. En una realización adicional, un fluido biológico se pone en contacto con dos anticuerpos anti-Ago elegidos entre anticuerpos anti-Ago1, anti-Ago2, anti-Ago3 o antiAgo4. Por ejemplo, un fluido biológico se pone en contacto con anticuerpos anti-Ago1 y anti-Ago2. En una realización adicional, un fluido biológico se pone en contacto con tres anticuerpos anti-Ago elegidos entre anti-Ago1, anti-Ago2, anti-Ago3 o antiAgo4. En otra realización más, un fluido biológico se pone en contacto con los cuatro anticuerpos anti-Ago. En una realización adicional, un fluido biológico se pone en contacto con un anticuerpo capaz de reconocer más de una proteína Argonaut. Dichos anticuerpos pueden reconocer una, dos, tres o cuatro proteínas Argonaut. En una realización, un fluido biológico se pone en contacto con un anticuerpo anti-Argonaut capaz de reconocer las cuatro proteínas Argonaut humanas.
Poner en contacto un fluido biológico con un reactivo de proteína de unión anti-miARN de la divulgación forma complejos de miARN inmunoprecipitados. Como tal, un reactivo de proteína de unión anti-miARN normalmente se une a un soporte sólido para formar complejos de miARN inmunoprecipitados cuando un fluido biológico entra en contacto con el reactivo de proteína de unión anti-miARN inmovilizado. El soporte sólido puede ser un material que puede modificarse para contener sitios individuales discretos apropiados para la unión o asociación de un reactivo de proteína de unión anti-miARN. Los ejemplos no limitantes de materiales de soporte sólido incluyen vidrio, vidrio modificado o funcionalizado, plásticos que incluyen acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos o teflón, nailon, nitrocelulosa, polisacáridos, resinas, sílice o materiales a base de sílice, incluidos silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos y plásticos. El tamaño y la forma del soporte sólido pueden variar sin salirse del alcance de la invención. Un soporte sólido puede ser plano, un soporte sólido puede ser un pozo, es decir, una placa de 364 pozos o, alternativamente, un soporte sólido puede ser una perla o un portaobjetos. En algunas realizaciones, un soporte sólido es un pozo de una placa multipared. En otras realizaciones, un soporte sólido es una superficie interior de una punta de pipeta. En aún otras realizaciones, un soporte sólido es preferentemente una perla. En algunas realizaciones, un soporte sólido es preferentemente una perla magnética.
Un reactivo de proteína de unión anti-miARN se puede unir a un soporte sólido en una amplia variedad de formas, como apreciarán los especialistas en la técnica. Un reactivo de proteína de unión anti-miARN y un soporte sólido se pueden derivatizar con grupos funcionales químicos para la unión posterior de los dos. Por ejemplo, un soporte sólido se puede derivatizar con un grupo funcional químico que incluye, entre otros, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo o grupos tiol. Usando estos grupos funcionales, se puede unir un reactivo de proteína de unión anti-miARN usando grupos funcionales ya sea directamente o indirectamente usando enlazadores. Alternativamente, el reactivo de proteína de unión anti-miARN también se puede unir al soporte sólido de forma no covalente. Por ejemplo, se puede preparar un reactivo de proteína de unión anti-miARN biotinilado, que se puede unir a un soporte sólido recubierto covalentemente con estreptavidina, lo que da como resultado la unión. Los procedimientos adicionales para unir un reactivo de proteína de unión anti-miARN a un soporte sólido son bien conocidos en la técnica y pueden ser como se describen en los manuales de laboratorio publicados, como en "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3.a edición, 2001. En algunas realizaciones, se prepara un reactivo de proteína de unión anti-miARN biotinilado, que puede unirse a un soporte sólido de perlas recubierto covalentemente con estreptavidina, lo que da como resultado la unión. Como se describe en Sección I(d) a continuación, un reactivo de proteína de unión anti-miARN puede unirse a un soporte sólido antes de ponerse en contacto con un fluido biológico en un procedimiento de la divulgación. Alternativamente, un fluido biológico de la divulgación puede ponerse en contacto simultáneamente con un reactivo de proteína de unión anti-miARN y un soporte sólido, donde el reactivo de proteína de unión anti-miARN se une al soporte sólido. Un fluido biológico de la divulgación también puede ponerse en contacto con un reactivo de proteína de unión anti-miARN antes de poner en contacto el fluido biológico con un soporte sólido, donde el reactivo de proteína de unión anti-miARN se une al soporte sólido. Como apreciará un experto en la materia, la cantidad y concentración del reactivo de proteína de unión anti-miARN puede variar y variará dependiendo de la identidad del reactivo de proteína de unión anti-miARN, el volumen de fluido biológico utilizado, la concentración de un miARN en el fluido biológico y la proteína de unión a miARN, entre otros factores, y puede determinarse experimentalmente. Cuando un reactivo de proteína de unión anti-miARN es un anticuerpo purificado, se pueden usar de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 pg de anticuerpo por cada 0,2 ml de muestra de plasma o suero.
(d) contacto con fluido biológico y aislamiento de miARN
En un procedimiento de la divulgación, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN. Como apreciará un experto en la técnica, un fluido biológico puede ponerse en contacto con una variedad de otros agentes sin apartarse del alcance de la invención. Por ejemplo, un fluido biológico puede ponerse en contacto con un agente reductor de tiol para bloquear la formación de enlaces disulfuro e inhibir la actividad de la ribonucleasa durante el aislamiento de miARN. Los agentes reductores de tiol adecuados incluyen ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoetilamina y tris(carboxietil)fosfina (TCEP). Un fluido biológico también puede ponerse en contacto con un agente antiespumante. Los ejemplos de agentes antiespumantes incluyen Antifoam 204 y Antifoam O-30, Antifoam A, Antifoam B, Antifoam C, Antifoam Y-30 y Sag 471. Un fluido biológico también puede ponerse en contacto con inhibidores de la degradación de proteínas y ARN para preservar los complejos miARN y miARN-proteína.
En algunas realizaciones, se puede usar un agente tamponador para mantener un pH adecuado para aislar miARN. A modo de ejemplo no limitativo, los agentes tamponadores pueden incluir, entre otros, acetato de trizma, EDTA, tris, glicina y citrato.
En algunas realizaciones, un procedimiento de la divulgación comprende poner en contacto un fluido biológico con un agente tensioactivo para disociar los componentes del fluido biológico antes de poner en contacto el fluido biológico con un reactivo de proteína de unión anti-miARN para formar complejos de miARN inmunoprecipitados. En otras realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN simultáneamente.
En algunas realizaciones, una muestra sin diluir de fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN. En otras realizaciones, un fluido biológico se diluye antes de ponerse en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN. La dilución de un fluido biológico puede ser como se describe en la sección I(a) anterior.
El contacto entre un fluido biológico, un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN generalmente comprende un período de incubación para permitir la formación de complejos de miARN inmunoprecipitados. Un fluido biológico puede ponerse en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN e incubarse durante aproximadamente 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240 o 480 minutos o más. En algunas realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN y se incuba durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o unos 15 minutos. En otras realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN y se incuba durante aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o unos 30 minutos. En aún otras realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN y se incuba durante aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 8085, o unos 90 minutos. En otras realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN y se incuba durante aproximadamente 90, 120, 240 o 480 minutos o más. En una realización, un fluido biológico preferentemente se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN y se incuba durante aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o aproximadamente 60 minutos.
Un fluido biológico puede ponerse en contacto con un agente activo de superficie y un reactivo de proteína de unión anti-miARN a una temperatura de aproximadamente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o aproximadamente 30°C o más. En algunas realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN a una temperatura de aproximadamente 0, 1, 2, 3, 4, 5 o aproximadamente 6 °C. En otras realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN a una temperatura de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o aproximadamente 15°C. En otras realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN a una temperatura de aproximadamente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o aproximadamente 25°C. En aún otras realizaciones, un fluido biológico se pone en contacto con un agente superficialmente activo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN a una temperatura de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o unos 30°C.
Normalmente, un fluido biológico se pone en contacto con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN bajo agitación. Además, generalmente se puede eliminar un fluido biológico para aislar complejos de miARN inmunoprecipitados después de formar los complejos, y lavar los complejos de miARN inmunoprecipitados.
(e) liberar miARN
De acuerdo con un procedimiento de la divulgación, el miARN se libera de complejos de miARN inmunoprecipitados sin purificación poniendo en contacto, a temperatura ambiente, los complejos de miARN inmunoprecipitados con una proteasa. Los procedimientos para liberar un ácido nucleico tal como un miARN de un complejo proteico son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la digestión con proteasas y la desnaturalización de proteínas en un complejo ácido nucleico-proteína. En algunas realizaciones, el miARN se libera de complejos de miARN inmunoprecipitados mediante desnaturalización de proteínas. Por ejemplo, miARN puede liberarse de complejos de miARN inmunoprecipitados combinando complejos de miARN inmunoprecipitados con una solución de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. El miARN liberado se puede purificar luego por precipitación o mediante cromatografía en columna giratoria.
En otras realizaciones, el miARN se libera preferentemente de complejos de miARN inmunoprecipitados mediante digestión con proteasa. Los términos "proteasa", "proteinasa" y "peptidasa" se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren al grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos covalentes. Las enzimas proteasas son bien conocidas en la técnica y pueden incluir proteasas ácidas y serina proteasas. En algunas realizaciones, una proteasa que puede usarse para liberar miARN en un procedimiento de la divulgación es una proteasa ácida. En una realización, una proteasa ácida que puede usarse para liberar miARN en un procedimiento de la divulgación es la pepsina.
En otras realizaciones, una proteasa que puede usarse para liberar miARN en un procedimiento de la divulgación es una proteasa ácida. Se han identificado seis clanes de serina proteasas, los dos mayores de los cuales son los clanes similares a la quimotripsina y similares a la subtilisina. Se conoce un gran número de subtilasas. Algunas de las subtilasas que se han estudiado ampliamente incluyen las obtenidas de varias especies de Bacilo incluyendo subtilisina DY, subtilisina Carlsberg, subtilisina BPN' (también llamada nagarse), mesentericopeptidasa, así como proteinasa K que se obtiene a partir de Limber de Tritirachium album, y termitasa que se obtiene de Thermoactinomyces vulgaris. En determinadas realizaciones de la presente invención, se prefiere la proteinasa K como enzima proteasa. Sin embargo, también se pueden usar otras enzimas proteasas en ciertas realizaciones, como, por ejemplo, nagarse. Por lo tanto, la enzima proteasa puede ser cualquiera de varias proteasas que producen al menos una descomposición parcial de proteínas en complejos de miARN inmunoprecipitados de modo que se libera miARN. En algunas realizaciones, una proteasa que puede usarse para liberar miARN en un procedimiento de la divulgación es preferentemente la proteasa K.
En esencia, el miARN se libera de los complejos de miARN inmunoprecipitados al poner en contacto los complejos con una enzima proteasa. Como apreciará un experto en la materia, la cantidad de proteasa utilizada para liberar miARN puede variar y variará dependiendo de la proteasa, la abundancia de complejos de miARN inmunoprecipitados, la temperatura durante la digestión con proteasa, las condiciones del tampón utilizadas para la digestión y la duración de la digestión, entre otros factores. En general, los complejos de miARN inmunoprecipitados pueden ponerse en contacto con aproximadamente 0,3 unidades de actividad enzimática a aproximadamente 30 unidades de actividad enzimática. En determinadas realizaciones, la cantidad de proteasa que se pone en contacto con los complejos de miARN inmunoprecipitados puede oscilar entre 0,3 y 1 unidad, entre 1 y 3 unidades, entre 3 y 10 unidades, o entre 10 y 30 unidades.
En algunas realizaciones, usando digestión con proteasa a temperatura ambiente como se describe en el Ejemplo 1. Como se usa en el presente documento, el término "temperatura ambiente" se usa para describir una temperatura de alrededor de 10°C a alrededor de 30°C.
Los complejos de miARN inmunoprecipitados se pueden incubar con una proteasa durante aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 25 o unos 30 minutos o más. En algunas realizaciones, los complejos de miARN inmunoprecipitados se incuban con una proteasa durante aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4 o aproximadamente 5 minutos. En otras realizaciones, los complejos de miARN inmunoprecipitados se incuban con una proteasa durante aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o aproximadamente 15 minutos. En otras realizaciones más, los complejos de miARN inmunoprecipitados se incuban con una proteasa durante aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o aproximadamente 30 minutos o más.
El miARN liberado puede ser apropiado para su uso posterior sin purificación adicional. Alternativamente, el miARN liberado puede purificarse aún más para usos posteriores. Los procedimientos de purificación de ácidos nucleicos, como la cromatografía en columna giratoria o las técnicas de filtración, son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, según los procedimientos descritos en manuales de laboratorio publicados, como en "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, Nueva York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3.a edición, 2001.
El uso posterior del miARN liberado puede variar. Los usos no limitantes del miARN liberado incluyen PCR cuantitativa en tiempo real, análisis de micromatrices, secuenciación, análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), análisis de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), análisis de microsatélites, análisis de repetición corta en tándem (STR) e hibridación genómica comparativa (CGH).
II. Equipos
La invención describe además equipos que comprenden agentes tensioactivos, reactivos de proteína de unión antimiARN y otros reactivos que pueden usarse en un procedimiento de la divulgación. Según la invención, se proporciona un equipo para aislar miARN de un fluido biológico, equipo que comprende (a) un primer agente tensioactivo seleccionado entre un tensioactivo aniónico, un tensioactivo no iónico y combinaciones de estos; (b) un segundo agente tensioactivo que comprende desoxicolato de sodio y laurilsulfato de sodio; (c) un anticuerpo anti-Argonaut; y (d) proteinasa K. Los reactivos de proteína de unión anti-miARN y los agentes tensioactivos pueden ser como se describe en la sección (I) anterior. En algunas realizaciones, un reactivo de proteína de unión anti-miARN en un equipo es un anticuerpo anti-Ago unido a un soporte sólido. En ciertas realizaciones, un soporte sólido puede ser una perla, una perla magnética o un pozo de una placa multipared. En aún otras realizaciones, un soporte sólido puede ser una superficie interior de una punta de pipeta. En algunas realizaciones, un agente de superficie en un equipo es IGEPAL. Un equipo puede comprender además un medio para liberar miARN de complejos de miARN inmunoprecipitados. En algunas realizaciones, un equipo comprende una proteasa, por ejemplo, proteasa K, para liberar miARN de complejos de miARN inmunoprecipitados.
DEFINICIONES
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan al experto una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Tal como se usan en el presente documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a menos que se especifique lo contrario.
Cuando se introducen elementos de la presente divulgación o los aspectos preferidos de la misma, los artículos "un", "una", "el/a" y "dicho" pretenden significar que hay uno o más de los elementos. Los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser inclusivos y significan que puede haber elementos adicionales además de los elementos enumerados.
Como se usa en el presente documento, "microARN" o "miARN" significa una pequeña secuencia de ARN no codificante de 5 a 40 nucleótidos de longitud que puede detectarse en una muestra biológica. Algunos miARN se derivan de precursores de horquilla procesados, por ejemplo, por la enzima DICER en una especie madura, por ejemplo, aproximadamente 18-25 nucleótidos, preferentemente 21-23 nucleótidos. Las variantes de microARN son comunes, por ejemplo, entre diferentes especies animales. Además, la variación en los extremos 5' y 3' de los miARN es común y puede ser el resultado de una escisión imprecisa por parte de enzimas como DICER durante la maduración. Estas variantes demuestran un alcance de variación aceptable en la secuencia de los miARN que no afecta la función o la capacidad de detectar los miARN. Otro tipo de variante es la adición posterior al procesamiento de Dicer de nucleótidos no moldeados al extremo 3' del miARN (estos no están moldeados porque no coinciden con el genoma humano). Las variantes más comunes son la secuencia de miARN con una A o una U adicional añadida al extremo 3'.
Como se usa en el presente documento, el término "fluido biológico" o "fluido corporal" se puede usar indistintamente y referirse a un fluido aislado de un sujeto.
Los términos "fluido biológico", "muestra de fluido biológico" o "muestra biológica" se pueden usar indistintamente y se refieren a todos los fluidos biológicos y excreciones aisladas de cualquier sujeto dado. En el contexto de la invención, tales muestras incluyen, pero no se limitan a, sangre y fracciones de la misma, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, excrementos, semen, líquido seminal, plasma seminal, líquido prostático, líquido preeyaculatorio (líquido de Cowper), derrame pleural, lágrimas, saliva, esputo, sudor, biopsia, ascitis, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, linfa, médula, secreciones cervicales, secreciones vaginales, secreciones endometriales, secreciones gastrointestinales, secreciones bronquiales, secreciones mamarias, secreciones de quistes ováricos y tejido muestras de fluidos.
Un polinucleótido "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos un contaminante con el que normalmente se asocia en su fuente natural. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o configuración en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico específica tal como existe en las células naturales.
Dado que se pueden realizar varios cambios en los animales, las células y los procedimientos descritos anteriormente sin apartarse del alcance de la invención, se pretende que todo lo contenido en la descripción anterior y en los ejemplos proporcionados a continuación se interprete como ilustrativo y no en un sentido limitante.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar la divulgación. Los expertos en la técnica deberían apreciar que las técnicas descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por los inventores para funcionar bien en la práctica de la divulgación. Sin embargo, los expertos en la materia deben, a la luz de la presente divulgación, apreciar que se pueden realizar muchos cambios en la divulgación y aun así obtener un resultado similar o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la divulgación, por lo tanto, todo listo. adelante debe interpretarse como ilustrativo y no en un sentido limitante.
Ejemplo 1: Protocolo general de aislamiento de miARN.
Un protocolo representativo utilizado para aislar los miARN circulantes comprende realizar inmunoprecipitación de ARN (RIP) en presencia de un detergente para liberar los miARN asociados a las vesículas. En este protocolo, los miARN se separan de otros componentes celulares como otros ARN, proteínas plasmáticas, etc. sin el uso de fenol, caotropos o purificación en columna, y pueden completarse en 40 a 70 minutos.
El protocolo consta de tres etapas:
1) Los componentes del plasma se tratan con un detergente,
2) Los complejos miARN/proteína se inmunoprecipitan, y
3) El miARN se libera de los complejos de miARN inmunoprecipitados.
Se recubrieron perlas de proteína A (Sigma-Aldrich GE28-9670-56), proteína G (Sigma-Aldrich GE28-9670-66) o estreptavidina (Sigma-Aldrich GE28-9857-38) con anticuerpo anti-Ago transfiriendo 20 pl de perlas magnéticas (10 % de suspensión) a 0,1 ml de tampón de lavado RIP (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,05 % iGe PAL® CA-630), lavando las perlas con tampón de lavado RIP una vez y utilizando un soporte magnético para separar las perlas de la solución. A continuación, las perlas magnéticas lavadas se resuspendieron en 0,1 ml de tampón de lavado RIP antes de añadir 2,5-10 pg de anti-Ago biotinilado o no biotinilado (Sigma-Aldrich SAB4800048), anti-Ago2 (Sigma-Aldrich SAB4200085) o anticuerpo anti-Ago1 (Sigma-Aldrich SAB4200084). Las perlas y el anticuerpo se incubaron con rotación a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. A continuación, las perlas se separaron de la solución utilizando un soporte magnético. A continuación, las perlas de anticuerpo se lavaron dos veces con 0,5 ml de tampón de lavado RIP.
En la primera etapa del proceso de aislamiento de miARN, 0,2 ml de plasma, 8 pl de IGEPAL CA-630 al 25 % (Sigma-Aldrich I8896; 40 pl de IGEPAL al 25 % por ml de plasma para producir una concentración final del 1 %), 2 pl de inhibidor de la proteasa cóctel (PIC; Sigma-Aldrich P8340; 10 pl/ml de plasma) y 0,8 pl de inhibidor de RNasa (Sigma-Aldrich R1158; 4 pl/ml de plasma) se añadieron a las perlas de anticuerpo Ago preparadas. Alternativamente, el plasma se puede tratar con detergente e inhibidores mientras se preparan las perlas, y el plasma pretratado se puede agregar posteriormente a las perlas de anticuerpo.
En la segunda etapa, los complejos de miARN/proteína se inmunoprecipitaron incubando la muestra a temperatura ambiente durante 1 hora o 4 °C durante la noche con rotación. Las perlas se lavaron 5 veces con 1 ml de tampón RIP de lavado y se recogieron utilizando el soporte magnético para separar las perlas del sobrenadante. Las perlas se pueden centrifugar brevemente y devolver al soporte magnético para eliminar el sobrenadante residual.
En la tercera etapa, el miARN precipitado asociado con perlas de anticuerpos se liberó del complejo proteico y las perlas mediante extracción con TRI Reagent®BD o reactivo de lisis QIAzol seguido de precipitación con isopropanol con acetato de amonio y acrilamida lineal, como se describe en el Boletín técnico del equipo de inmunoprecipitación de ARN (RIP) Sigma-Aldrich Imprint, o purificado con el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen. Alternativamente, y preferentemente, el miARN se liberó mediante digestión con proteinasa K. Se agregaron veinte pl de mezcla de proteinasa K (14 pl de agua, 2 pl de tampón de liberación de proteinasa K 10X y 4 pl de proteinasa K P4850) a las perlas de la etapa dos y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos en vortex genie 2, configuración 4. El tampón de liberación de proteinasa K 10X comprende Tris 100 mM, pH 8,0, MgCl 15 mM2 , KCI 500 mM, DTT 100 mM e IGEPAL al 1 %. Inmediatamente después de la incubación, las perlas se retiraron colocándolas en un soporte magnético y transfiriendo el sobrenadante que comprende miARN libre a un tubo nuevo. A continuación, se inactivó la proteinasa K del sobrenadante incubando la muestra a 95 °C durante 5 minutos. Los miARN específicos se detectaron con los ensayos MystiCq RT-qPCR de Sigma-Aldrich usando 5 pl de cada preparación de miARN por 10 pl de reacción de cola poliA. Los miARN sintéticos, es decir, el ARN monocatenario con la misma secuencia que los miARN maduros enumerados en miRBase, se diluyeron en 0,02 mg/ml de acrilamida lineal hasta un número de copias conocido en función de la absorbancia de las soluciones madre a 260 nm, se analizaron en paralelo con los miARN preparados a partir de plasma, y se utilizan como estándares para la cuantificación absoluta.
Ejemplo 2: La inmunoprecipitación de miRNAs del plasma es más eficiente que Tri Reagent solo.
La eficiencia del aislamiento de miARN del plasma mediante inmunoprecipitación de ARN (RIP) se comparó con el aislamiento de miARN mediante el TRI Reagent®BD (Sigma-Aldrich). TRI Reagent® BD es un reactivo para usar en el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteínas a partir de derivados sanguíneos como suero, plasma o sangre total.
Aislamiento de miARN usando TRI Reagent®BD estaba de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 0,2 ml de plasma con TRI Reagent®BD y miARN se extrajo usando cloroformo para la separación de fases antes de la precipitación con isopropanol en presencia de acetato de amonio y acrilamida lineal, y el lavado del ARN para su análisis. El aislamiento de los miARN mediante RIP se realizó con 2,5 |jg de anticuerpo anti-Ago2 unido a 20 j l de perlas magnéticas de proteína A. miARN se recuperó de las perlas mediante extracción con TRI Reagent® BD y precipitación isopropanol en presencia de acetato de amonio y acrilamida lineal, como para la extracción directa de plasma.
El nivel de miARN let-7a-5p, miR23a-3p, miR191-5p, miR142-3p y miR451a en las muestras preparadas se determinó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. RIP de miARN del plasma fue de 5 a 600 veces más eficiente que TRI Reagent®BD (figura 1).
Ejemplo 3. Rendimiento RIP similar al rendimiento de un equipo comercial.
La eficacia del aislamiento de miARN del plasma mediante inmunoprecipitación de ARN (RIP) se comparó con el aislamiento de miARN mediante el equipo miRNeasy Serum/Plasma de Qiagen (Qiagen). Qiagen miRNeasy emplea columnas giratorias que contienen resina de sílice que se une selectivamente a ADN o ARN, y se recomienda para el aislamiento de miARN de < 0,2 ml de suero o plasma.
El aislamiento de miARN utilizando el equipo Qiagen miRNeasy Serum/Plasma se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 0,2 ml de plasma con el reactivo QIAzol y se purificó el miARN de la fase acuosa utilizando las columnas giratorias proporcionadas. El aislamiento de los miARN mediante RIP se realizó con 20 j l de perlas magnéticas de proteína A a las que se unieron 2,5 jg de anticuerpo anti-Ago2. Los miARN se liberaron de las perlas con el reactivo QIAzol y se purificaron con el equipo Qiagen, como para la extracción directa de plasma.
El nivel de miARN let-7a, miR23a, miR191, miR142 y miR451a en las muestras preparadas se determinó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. El rendimiento de miARN usando RIP fue similar al rendimiento de miARN usando solo el equipo Qiagen (figura 2).
Ejemplo 4. Comparación de RIP usando perlas de estreptavidina y anticuerpos anti-Ago biotinilados y no biotinilados.
Las perlas de proteína A y proteína G se unen a la IgG humana, que es extremadamente abundante en el plasma. Para evitar el coaislamiento de IgG, los anticuerpos anti-Ago (clon 2A8) y anti-Ago2 (clon 11A9) se biotinilaron con Pierce EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Thermo Scientific) para RIP con perlas de estreptavidina. Ago-RIP se realizó utilizando 2,5 jg del anticuerpo biotinilado anti-Ago2 (b-Ago2) o anti-Ago (b-Ago) y 20 j l de perlas magnéticas de estreptavidina, o con 2,5 jg de anticuerpo anti-Ago2 no biotinilado y 20 j l de microesferas de proteína A. RIP con anticuerpo anti-Ago2 biotinilado (b-Ago2) y perlas de estreptavidina dio el mismo rendimiento de miARN que RIP con anticuerpo anti-Ago2 con perlas de proteína A (ver figura 3). RIP con anti-Ago biotinilado dio rendimientos de miARN significativamente más bajos, como lo habían hecho con perlas de proteína A y anti-Ago sin biotinilar.
Ejemplo 5. La liberación de calor de miARN aislado mediante RIP afecta negativamente al rendimiento.
Se probó el calentamiento en agua libre de nucleasas como un medio para liberar miARN después de RIP. Ago-RIP se realizó con 0,2 ml de plasma y 2,5 jg de anticuerpo anti-Ago o anti-Ago2 no biotinilado en perlas magnéticas de proteína A, o anticuerpo anti-Ago o anti-Ago2 biotinilado en perlas magnéticas de estreptavidina. Se añadieron catorce j l de agua libre de nucleasas a las perlas y estas mezclas se calentaron a 40°, 50° o 60°C durante 2 minutos antes de retirar las perlas. El RIP seguido de la liberación de calor se comparó con el RIP seguido de la purificación de miARN con el equipo Qiagen miRNeasy Serum/Plasma y los miARN purificados directamente del plasma con el equipo Qiagen. Se añadió cel-miR-39-3p sintético (1,4e8 copias) después de agregar QIAzol para las preparaciones de Qiagen o en el agua añadida a las microesferas posteriores al RIP.
No se detectó la adición de cel-miR-39-3p sintético después de 2 minutos a 60 °C con producto RIP en perlas (figura 4). Tampoco se detectó miARN endógeno después de 2 minutos a 40°, 50° o 60°C. Se observaron resultados similares para miR23a, miR142, miR191 y miR451a. El miARN Let7a también se perdió cuando las muestras se calentaron a 50° o 60°C. La pérdida de miARN probablemente se deba a la contaminación por arrastre de ARNasa con RIP, ya que se sabe que la sangre contiene niveles extremadamente altos de ARNasa.
Ejemplo 6. Liberación de miARN mediante digestión con proteinasa K.
La digestión con proteinasa K se probó como un medio para liberar miARN después de Ago-RIP. El RIP se realizó con 0,2 ml de plasma y 2,5 |jg de anticuerpo anti-Ago2 biotinilado unido a 20 |jl de perlas magnéticas de estreptavidina. Después del RIP, las perlas se incubaron en tampón de digestión (20 j l de Tris-HCL 10 mM, pH 8,0, MgCl 1,5 mlVh, KCI 50 mM, DTT 10 mM, IGEPAL al 0,1 %) que contiene 4 j l de proteinasa K (Sigma-Aldrich P4850) a temperatura ambiente o 37 °C durante 10 minutos con agitación, o a 65 °C durante 2 minutos con agitación. Después de retirar las perlas, la proteinasa K se inactivó a 95 °C durante 5 minutos y se añadieron 5 j l de cada digerido de proteinasa K a una reacción de cola de poliA de 10 j l para la detección específica de miARN con los ensayos MystiCq RT-qPCR de Sigma-Aldrich. A modo de comparación, se extrajo una preparación paralela de perlas post-RlP con el reactivo de lisis QIAzol y se purificó con miRNeasy Serum/Plasma ("total", establecido en 100 %). Los niveles de miARN de RIP-proteinasa K se expresaron en relación con los de RIP en los que se liberaron miARN utilizando el equipo miRNeasy.
La liberación de miARN utilizando la digestión con proteinasa K a temperatura ambiente produjo más miARN que la liberación a temperaturas más altas (figura 5). En todos los casos, se perdió una cantidad significativa de miARN total. Lo más probable es que la pérdida se deba a la ARNasa residual en la muestra.
Se realizó un experimento similar usando digestión con pepsina en tampones a pH 2, 3 o 4 para la liberación de miARN en lugar de proteinasa K. La liberación de miARN usando pepsina recuperó menos del 1 % de miARN (datos no mostrados).
Ejemplo 7. Comparación de RIP con otros procedimientos para la extracción de miARN de biofluidos.
Los miARN se aislaron utilizando microesferas magnéticas anti-Ago2 biotiniladas y estreptavidina y liberación de proteasa K esencialmente como se describe en el Ejemplo 6. A modo de comparación, los miARN también se purificaron directamente del plasma utilizando el miRCury™ Kit de aislamiento de ARN - Biofluids de Exiqon, o el equipo de suero/plasma miRneasy de Qiagen (figura 6). Estos datos muestran que los rendimientos de miARN let7a del a Rn purificado usando el equipo de Exiqon fueron 3-4 veces más altos que los purificados usando el equipo de Qiagen. Los rendimientos de la mayoría de los miARN preparados con Ago-RIP y la liberación de proteinasa K fueron intermedios entre los de Exiqon y Qiagen en la mayoría de los experimentos. Los resultados para let7a se muestran en la figura 6 y la figura 7 , pero los de miR23a, miR142 y miR191 fueron similares. Por otro lado, los rendimientos de miR451a fueron similares para Ago-RIP y Exiqon. miR451a requiere la actividad de corte de Ago2 para procesar a un miARN maduro y, por lo tanto, solo ocurre en los complejos de Ago2. Otros miARN pueden asociarse con Ago1, Ago3 o Ago4 además de Ago2. Dado que el anticuerpo utilizado es específico para Ago2, aísla miR451a de manera más eficiente que todos los demás miARN maduros.
Ejemplo 8. RIP con o sin inhibidores de proteasa e inhibidores de ARNasa.
Se utilizó Ago-RIP para aislar miARN en presencia (inh) o ausencia (-inh) de inhibidores de proteasa e inhibidores de ARNasa, y los miARN se liberaron de las microesferas con proteasa K. Ago-RIP realizado en presencia de inhibidores produjo más let7a miRNA que las muestras que no fueron tratadas con inhibidores. Se encontraron resultados similares para miR191. No hubo diferencia significativa para miR451a (figura 8).
También se realizó un pretratamiento del suero con IGEPAL con o sin inhibidores (+pre) y se comparó con la adición de IGEPAL con o sin inhibidores al mismo tiempo que la adición de microesferas de anticuerpo (-pre). Los resultados muestran que el pretratamiento del suero con inhibidores de la proteasa y la ARNasa no mejoró los rendimientos de let7a o miR451a en comparación con el cotratamiento (figura 8).
Ejemplo 9. Recuperación de miARN con o sin detergente.
Para determinar el efecto del detergente en el aislamiento de los miARN, se realizó Ago-RIP (con 0,2 ml de plasma) en presencia o ausencia de detergente IGEPAL utilizando 10 jg de perlas magnéticas de estreptavidina/anticuerpo anti-Ago2 biotinilado. Se asumió que cualquier miARN aislado en ausencia de detergente estaba libre (es decir, no en una vesícula), y cualquier aislado en presencia de detergente era vesicular. El miARN total era el nivel de un miARN recuperado del plasma tratado con IGEPAL y se fijó en 100 %. El miARN libre (miARN no asociado con vesículas) fue el nivel de un miARN recuperado del plasma que no fue tratado con IGEPAL. El miARN asociado a vesículas se calculó como el nivel de un miARN en la muestra de miARN total restado por el nivel de dicho miARN en la muestra de miARN libre. La figura 9 muestra los niveles libres y asociados a vesículas de los miARN let7a, miR23a, miR142 y miR451a. Estos resultados muestran que el tratamiento con detergente puede ser deseable para recuperar algunos miARN de manera eficiente del plasma mediante RIP.
Ejemplo 10. RIP es escalable.
El RIP se realizó con 0,2 ml de plasma y 10 jg de perlas anti-Ago2/estreptavidina biotiniladas, o 0,4 ml de plasma y 20 jg de perlas anti-Ago2/estreptavidina biotiniladas, seguido de liberación con digestión con proteinasa K. A modo de comparación, los miARN se aislaron de 0,2 ml del mismo plasma con el equipo de aislamiento de ARN miRCury de Exiqon - Biofluids. Los rendimientos totales de let7a, miR191 y miR451a recuperados con cada procedimiento de preparación se muestran en la figura 10. Con Ago-RIP, el doble de plasma (es decir, 0,4 ml frente a 0,2 ml) produjo de 1,5 a 2 veces la cantidad de miARN analizados, mientras que los equipos basados en columnas (como los de Exiqon y Qiagen) tienen capacidad limitada y recomendar el uso de no más de 0,2 ml de plasma.
Ejemplo 11. Tiempos mínimos de incubación y lavado para RIP.
El RIP se realizó con 0,2 ml de plasma y 5 |jg de microesferas anti-Ago2/estreptavidina biotiniladas, incubadas con rotación a temperatura ambiente durante 5, 15, 30 o 60 minutos. Los que se incubaron durante 5, 15 o 30 minutos se lavaron todos 5 veces después de completar la incubación. Aquellos con incubaciones de 60 min se lavaron 5, 4, 3, 2 o 1 veces con el tampón de lavado RIP. Todos fueron liberados con proteinasa K. Los rendimientos para let7a se presentan en la figura 11. Los resultados muestran que parece ser necesario un período de incubación de más de 15 minutos para la máxima recuperación de miARN en las condiciones utilizadas (por ejemplo, tipo y cantidad de anticuerpo y microesferas), pero solo se necesita un lavado antes de la detección de miARN con ensayos MystiCq de Sigma-Aldrich (cola de poliA, RT, qPCR). Se obtuvieron resultados similares para miR122, miR191 y miR451a.
Ejemplo 12. RIP es específico para miRNA.
El siguiente ejemplo se realizó para determinar si Ago-RIP es específico para miRNA o si Ago-RIP también aísla otros RNA. Los aislamientos se realizaron con Ago-RIP (S), el equipo de aislamiento de ARN miRCury de Exiqon - Biofluuds (E) o el equipo de suero/plasma miRneasy de Qiagen (Q) a partir de 0,2 ml de plasma fresco (experimentos 1 y 2) o 0,2 ml de plasma congelado (experimento 3). El Experimento 1 se realizó con 2,5 jg de anticuerpo anti-ago2 biotinilado/20 j l de perlas de estreptavidina. Los experimentos 2 y 3 se realizaron con 2,5 jg de anticuerpo anti-ago2 biotinilado/20 j l de perlas de estreptavidina. Se usó la digestión con proteinasa K esencialmente como se describe anteriormente en el Ejemplo 6 para liberar los miARN de las perlas. Se detectaron miARN específicos (por ejemplo, let7a) y ARN nucleares o nucleolares pequeños específicos (por ejemplo, RNU6 o SNORD48) mediante ensayos MystiCq RT-qPCR, y ARNm o ARNr más largos (por ejemplo, g Ap DH, RN18S, RN28S) mediante ensayos KiCqStart® RT-qPCR (Sigma-Aldrich). ARN total de células HeLa (aislado usando TRI Reagent®BD) se utilizó para los estándares de cuantificación.
Como era de esperar, los miARN como let7a se aislaron usando Ago-RIP o cualquiera de los equipos basados en columnas (ver la figura 12A). Sin embargo, Ago-RIP no aisló otros ARN pequeños o ARN grandes, sino que se aislaron con los equipos Exiqon y Qiagen. Como se muestra en la figura 12B y la figura 12C, se aislaron pocos o ningún ARN RNU6, s No RD48, Ga PDH, RN18S o RN28S usando Ago-RIP, pero todos estos otros tipos de A r N se aislaron con los equipos Exiqon y Qiagen. Por lo tanto, Ago-RIP aísla específicamente solo miRNAs.
Ejemplo 13. El uso de anticuerpos anti-Ago1 y anti-Ago2 aumenta el rendimiento de RIP.
Dado que diferentes miARN se asocian con diferentes proteínas Ago, es posible que los rendimientos de ciertos miARN puedan mejorarse mediante el uso combinado de anticuerpos contra diferentes proteínas Ago. Por lo tanto, los miARN se aislaron de 0,2 ml de plasma usando 10 jg de anticuerpo anti-Ago1/20 j l de perlas de proteína A, 10 jg de anticuerpo anti-Ago2/20 j l de perlas de proteína A o 20 j l de una mezcla 1:1 de cada tipo de perla de anticuerpo La liberación de los miARN de las perlas se realizó utilizando el reactivo de lisis QIAzol y se purificó con el equipo Qiagen esencialmente como se describe anteriormente en el Ejemplo 3. Los miARN específicos (por ejemplo, let7a, miR142-3p, miR122, miR191 y miR451a) se detectaron mediante ensayos MystiCq RT-qPCR.
Como se muestra en la figura 13, los rendimientos usando ambos anticuerpos juntos fueron aproximadamente la suma de cada anticuerpo usado por separado. Para la mayoría de los miARN, el uso de anti-Ago2 resultó en un mayor rendimiento que el uso de anti-Ago1. Sin embargo, se recuperó más miR122 cuando se usó anti-Ago1, lo cual es consistente con Turchinovich et al., 2012, RNA Biology 9(8):1066-75). Además, miR451a solo se recuperó con anti-Ago2, como se explicó anteriormente en el Ejemplo 7.
RESUMEN
La presente divulgación proporciona procedimientos y equipos para aislar miARN de fluidos biológicos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para aislar microARN (miARN), comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto una muestra biológica con un agente tensioactivo y un reactivo de proteína de unión anti-miARN, en el que el agente tensioactivo disocia los componentes de la muestra y la proteína de unión anti-miARN el reactivo interactúa con una proteína de unión a miARN asociada con miARN para formar complejos de miARN inmunoprecipitados; y (b) poner en contacto, a temperatura ambiente, los complejos de miARN inmunoprecipitados con una proteasa para liberar miARN de los complejos de miARN inmunoprecipitados sin purificación.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica comprende miARN vesicular y miARN no vesicular.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la muestra biológica comprende sangre, plasma, tejido, células y combinaciones de los mismos.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica comprende sangre y fracciones de la misma, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, excrementos, semen, líquido seminal, plasma seminal, líquido prostético, líquido preeyaculatorio (líquido de Cowper), derrame pleural, lágrimas, saliva, esputo, sudor, biopsia, ascitis, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, linfa, médula, secreciones cervicales, secreciones vaginales, secreciones endometriales, secreciones gastrointestinales, secreciones bronquiales, secreciones mamarias, secreciones de quistes ováricos, líquido tisular, aspirado de tumor y muestras de fluido tisular.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el agente tensioactivo es un agente tensioactivo no iónico.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra biológica se pone en contacto con el agente tensioactivo y el reactivo de proteína de unión anti-miARN simultáneamente.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra biológica, el agente tensioactivo y el reactivo de proteína de unión anti-miARN se incuban durante aproximadamente 30 minutos.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra biológica, el agente tensioactivo y el reactivo de proteína de unión anti-miARN se incuban a temperatura ambiente.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el reactivo de proteína de unión antimiARN comprende un anticuerpo anti-Argonaut unido a un soporte sólido, opcionalmente en el que el soporte sólido son perlas magnéticas.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la proteasa es la proteinasa K.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los complejos de miARN inmunoprecipitados se ponen en contacto con proteasa durante aproximadamente 10 minutos.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el miARN liberado de los complejos de miARN inmunoprecipitados está libre de otros tipos de moléculas de ARN.
13. Un equipo para aislar microARN de una muestra biológica, comprendiendo el equipo:
(a) un primer agente tensioactivo seleccionado de un tensioactivo aniónico, un tensioactivo no iónico y combinaciones de los mismos;
(b) un segundo agente tensioactivo que comprende desoxicolato de sodio y laurilsulfato de sodio;
(c) un anticuerpo anti-Argonaut; y
(d) proteinasa K.
14. El equipo de la reivindicación 13, en el que el reactivo de proteína de unión anti-miARN comprende un anticuerpo anti-Argonaut unido a un soporte sólido, opcionalmente en el que el soporte sólido son perlas magnéticas.
15. El equipo de la reivindicación 13 o 14, en el que el anticuerpo anti-Argonaut es capaz de unirse a Ago1, Ago2, Ago3 y/o Ago4.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112016011770B1 (pt) 2013-11-27 2022-10-25 Sigma-Aldrich Co. Llc Método e kit para isolamento de microrna a partir de amostra biológica
CN107385014B (zh) * 2017-06-13 2020-12-22 深圳大学 一种直接定量检测循环miRNA的RT-qPCR方法
KR102003594B1 (ko) 2017-08-08 2019-07-24 숙명여자대학교산학협력단 염증 반응 매개 신혈관생성 질환 진단용 조성물
EP3681895A4 (en) * 2017-09-13 2021-05-26 Becton, Dickinson and Company METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS USING FERROUS PARTICLES
AU2019238322B2 (en) * 2018-03-22 2025-08-14 Idexx Laboratories, Inc. Methods for measuring bacteria in biological samples
CN109490533B (zh) * 2018-12-29 2022-02-15 南京澳林生物科技有限公司 一种胃蛋白酶原ⅱ(pgⅱ)检测试剂盒及生产工艺
EP4232574A4 (en) * 2020-10-26 2024-12-18 Eclipse Bioinnovations, Inc. METHODS AND KITS FOR THE ENRICHMENT OF POLYNUCLEOTIDES
US11795500B2 (en) 2021-08-19 2023-10-24 Eclipse Bioinnovations, Inc. Methods for detecting RNA binding protein complexes
CN113980954A (zh) * 2021-11-11 2022-01-28 德州学院 一种病毒rna保护剂及其制备方法与应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA06003886A (es) * 2003-10-08 2006-08-11 Ebioscience Reactivos de enlace de inmunoglobulina naturales y metodos de fabricacion y uso de los mismos.
JP5349838B2 (ja) * 2007-11-30 2013-11-20 和光純薬工業株式会社 ｓｍａｌｌＲＮＡの取得用担体、取得方法及び取得用試薬
US8841073B2 (en) * 2008-07-28 2014-09-23 The Rockefeller University Methods for identifying RNA segments bound by RNA-binding proteins or ribonucleoprotein complexes
US8846314B2 (en) * 2009-03-03 2014-09-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Isotachophoretic focusing of nucleic acids
US20130197206A1 (en) * 2010-09-24 2013-08-01 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for acquisition of small rna
JP2014507160A (ja) * 2011-02-22 2014-03-27 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス エス．アー．エール．エル． 循環バイオマーカー
JP6309450B2 (ja) * 2011-08-04 2018-04-11 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド セロトニン関連の医学的状態、アドレナリン関連の医学的状態、ノルアドレナリン関連の医学的状態、グルタミン酸関連の医学的状態および副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのミクロｒｎａおよび該ミクロｒｎａを含む組成物
CN102628038A (zh) * 2012-04-09 2012-08-08 武汉生命之美科技有限公司 一种改进的clip法鉴定rna结合蛋白的靶标rna的方法
CA2892490A1 (en) * 2012-11-26 2014-05-30 Caris Science, Inc. Biomarker compositions and methods
EP3027617B1 (en) * 2013-07-31 2026-02-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compounds useful in conditions related to repeat expansion
BR112016011770B1 (pt) 2013-11-27 2022-10-25 Sigma-Aldrich Co. Llc Método e kit para isolamento de microrna a partir de amostra biológica
WO2016161375A2 (en) * 2015-04-03 2016-10-06 University Of Massachusetts Methods of using oligonucleotide-guided argonaute proteins

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