BR112016011770B1 - Método e kit para isolamento de microrna a partir de amostra biológica - Google Patents

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Abstract

ISOLAMENTO DE MICRO RNA A PARTIR DE FLUIDO BIOLÓGICO A divulgação fornece métodos e kits para o isolamento de miRNA a partir de fluidos biológicos. Especificamente, o método compreende colocar um fluido biológico em contato com um agente tenso-ativo e um reagente de reagente de proteína de ligação ao anti-miRNA, em que o agente tensoativo dissocia os componentes do fluido biológico e o reagente de proteína de ligação ao anti-miRNA interage com uma proteína de ligação ao miRNA associada ao miRNA para formar complexos de imunoprecipitados de miRNA; e liberar miRNA a partir dos complexos de imunoprecipitados de miRNA. Exemplos de proteína de ligação ao miRNA que podem ser associadas com miRNAs circulantes são fornecidos adicionalmente.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a meios para isolar microRNAs de fluidos biológicos.
ANTECEDENTES
[0002] Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes, que influenciam a rede de transcrição pela regulação pós- transcricional de alvos de RNA mensageiro específico (mRNA), através de interações específicas de emparelhamento. miRNAs demonstraram estar presentes em fluidos biológicos humanos numa forma livre de células. Estes miRNAs isentos de células podem ser não vesiculares, ligados e protegidos por proteínas nos complexos proteína-miRNA, fechado em vesículas ligadas à membrana, tais como exossomas ou microvesículas, ou ambos. Dado o papel funcional importante de miRNA na doença, este conjunto de moléculas de ácido nucleico contém candidatos para o diagnóstico e o prognóstico da doença, e monitorização da resposta à terapia em uma grande variedade de pacientes e em sujeitos antes manifestando doença numa amostra biológica prontamente disponíveis, tais como soro de sangue e de plasma, urina ou saliva. Os métodos atuais de isolamento miRNAs são direcionados para miRNAs relativamente abundante em células e tecidos, utilizando colunas de rotação que não são facilmente automatizadas ou ampliadas, são complicadas e envolvem compostos tóxicos, ou podem isolar especificamente miRNAs quer vesiculares ou não vesiculares. Além disso, os miRNAs de interesse diagnóstico ou prognóstico muitas vezes estão presentes em baixa abundância em fluidos biológicos, tornando a sua detecção utilizando métodos de isolamento atuais desafiadores. Por conseguinte, existe uma necessidade de um método simples, eficiente, automatizável, e escalável para isolar a totalidade ou a maioria dos miRNAs em fluidos biológicos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0003] Um aspecto da presente invenção proporciona um método para o isolamento de microRNA (miRNA) a partir de um fluido biológico. O método compreende o contato do fluido biológico com um agente tensoativo e um reagente de proteína anti-miRNA de ligação, em que o agente tensoativo dissocia componentes fluidos biológicos e o reagente de proteína anti-miRNA de ligação interage com uma proteína de ligação a miRNA associado a miRNA para formar complexos de miRNA imunoprecipitados. O método compreende, ainda, liberação de miRNA a partir dos complexos de miRNA imunoprecipitados.
[0004] Outro aspecto da divulgação engloba um kit para isolar microRNA a partir de um fluido biológico. O kit compreende um agente tensoativo, um reagente anti-proteína de ligação a miRNA, e um reagente de libertação de miRNA.
[0005] Outros aspectos e iterações da divulgação são descritas mais detalhadamente abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0006] A FIG. 1 apresenta dois gráficos que comparam isolamento miRNA de 0,2 ml de plasma usando imunoprecipitação de Tri Reagente® BD ou RNA (RIP). As quantidades de miRNA isoladas por RIP são apresentadas como a diferença vezes a partir de miRNA isolada usando Tri Reagente® BD. (A) Representa os níveis de let-7a- 5p, 23a-3p, e 191-5p miRNAs e (B) mostra os níveis de 142-3p e 451a miRNAs.
[0007] A FIG. 2 apresenta três parcelas que mostram níveis de miRNAs isolados de plasma usando Ago-RIP ou um kit Qiagen de purificação em coluna (Q1, Q2). Os valores de miRNA isolados, como cópias de miR/μl eluídas, são mostrados para let-7a, 23a, e 142 miRNAs (A), 191 miRNA (B), e 451a miRNA (C).
[0008] A FIG. 3 apresenta três parcelas que mostram níveis de miRNAs isolados de plasma usando RIP com biotinilado (b-ago2 ou bAgo) ou anticorpos não biotinilados (ago2) com estreptavidina ou esferas de proteína A. São mostrados os valores de isolado miRNA representados como cópias de miR/μl eluídas para let-7a (A), 23a (B), E 191 (C) miRNAs. O anticorpo (clone entre parênteses) utilizado é anotado nos eixos x.
[0009] A FIG. 4 apresenta duas parcelas que mostram níveis de miRNAs isolados de plasma usando Ago-RIP com liberação de calor. Q representa purificação em coluna de Qiagen; RIP-Q representa imunoprecipitação seguido de purificação em coluna de Qiagen; bRIP- Q representa a imunoprecipitação utilizando o anticorpo biotinilado seguido por purificação em coluna Qiagen. (A) descreve os níveis de pico sintético em cel-miR-39-3p usando purificação em coluna Qiagen, RIP em combinação com purificação em coluna e RIP com protease de liberação K. Os níveis de pico são representados como a percentagem total de cel-miR-39-3p sintético cravado durante o isolamento. (B) descreve os níveis de miRNA let7a isoladas de plasma usando purificação em coluna Qiagen, RIP em combinação com purificação em coluna e RIP com protease de liberação K. Níveis de let7a são representados como cópias de let7a em 1 μl de amostra recuperada.
[0010] A FIG. 5 apresenta duas parcelas que mostram níveis de miRNAs isolados de plasma usando Ago-RIP com protease de liberação K a diferentes temperaturas. (A) descreve os níveis de miRNA let7a divulgados pela protease K (barra esquerda a cada temperatura), e os níveis acumulados nas contas (barra direita a cada temperatura). Níveis de let7a miRNA são representados como a percentagem total de let7a miRNA em 0,2 ml do mesmo plasma isolado com o kit de miRNeasy Soro/plasma da Qiagen. (B) descreve os níveis de miRNA miR451a divulgados pela protease K (barra esquerda a cada temperatura), e os níveis acumulados nas contas (barra da direita para cada temperatura). Níveis de miR451a miRNA são representados como a percentagem total de miR451a miRNA em 0,2 ml do mesmo plasma isolado com o kit de miRNeasy Soro/plasma da Qiagen.
[0011] A FIG. 6 apresenta duas parcelas que mostram níveis de let7a (A) ou miR451a (B) MiRNA isolada a partir de plasma utilizando métodos disponíveis comercialmente de miRNA isolamento, ou isolamento usando RIP com protease de liberação K em tubos padrão. E1 e E2 representam isolamento miRNA usando Isolação miRCury RNA de Kit-biofluidos de Exiqon. Q1 e Q2 representam o isolamento miRNA usando Kit miRNeasy Soro/Plasma da Qiagen. RIP-STD-Q representa imunoprecipitação seguido de purificação em coluna Qiagen. Os níveis de miRNA são representados como cópias totais recuperadas a partir de 0,2 ml de plasma.
[0012] A FIG. 7 apresenta duas parcelas que mostram níveis de miRNA let7a isoladas de plasma utilizando métodos disponíveis comercialmente de isolamento miRNA, ou o isolamento usando Ago- RIP com a liberação de protease K (RIP1-4). (A) Mostra ensaio 1 e (B) Mostra ensaio 2. E1 e E2 representam isolamento miRNA usando Isolação miRCury RNA de Kit-biofluidos de Exiqon. Q1 e Q2 representam o isolamento miRNA usando Kit miRNeasy Soro/Plasma da Qiagen. Os níveis de let7a são representados como cópias totais let7a recuperadas a partir de 0,2 ml de plasma.
[0013] A FIG. 8 apresenta dois gráficos que mostram os níveis de miRNA isolados a partir de plasma usando Ago-RIP seguido pela protease de libertação K com ou sem inibidores de protease e de RNase, e com ou sem pré-tratamento de detergente. +pre, +inh; Igepal e inibidores adicionado ao plasma e incubou-se ~ 30 minutos antes de adicionar às esferas Ago2. +pré, -inh; Igepal adicionado ao plasma sem inibidores e incubados ~ 30 minutos antes de adicionar às esferas Ago2. -pre, +inh; Igepal e inibidores adicionados ao plasma, ao mesmo tempo que às esferas Ago2. -pre, -inh; Igepal adicionado ao plasma sem inibidores, ao mesmo tempo que às esferas Ago2. (A) descreve cópias de let7a miRNA recuperados, e (B) descreve cópias de miRNA miR451a recuperados.
[0014] A FIG. 9 apresenta um gráfico que mostra os níveis de livre (barra da esquerda para cada miRNA) e vesicular (barra da direita para cada miRNA) para os miRNAs indicados como% de IGEPAL total de miRNAs tratados.
[0015] A FIG. 10 apresenta três parcelas que mostram níveis de miRNAs isolados de 0,2 ou 0,4 ml de plasma usando Ago-RIP seguido da protease de liberação K (RIP), ou de 0,2 ml de plasma usando Isolação de miRCury RNA do Kit-Biofluids de Exiqon (E). (A) descreve cópias de let7a miRNA recuperado, (B) mostra cópias de miR191 miRNA recuperados, e (C) descreve cópias de miRNA miR451a recuperado.
[0016] A FIG. 11 apresenta um gráfico que mostra os níveis de let7a isolados a partir de plasma usando Ago- RIP seguido pela protease de libertação K. As incubações RIP foram à temperatura ambiente durante 5, 15, 30, ou 60 minutos (5', 15', 30', 60'). Esses incubados 5, 15 ou 30 minutos foram todos lavados 5 vezes antes da proteinase de liberação K. Esses incubados 60 minutos foram lavados 5, 4, 3, 2 ou 1 vezes (5w, 4w, 3w, 2w, 1w). O rendimento total do let7a recuperado a partir de 0,2 ml de plasma é mostrado.
[0017] A FIG. 12A mostra os níveis de miRNA let7a isolados de plasma utilizando kits de isolamento miRNA baseados em colunas ou Ago-RIP. Três experiências diferentes (Exp) são apresentadas. S1 e S2 representam isolamento utilizando Ago-RIP; E1 e E2 representam isolamento utilizando Isolação miRCury RNA de Kit-Biofluids de Exiqon; e Q1 e Q2 representa isolamento utilizando Kit miRNeasy Soro/Plasma da Qiagen.
[0018] A FIG. 12B apresenta os níveis de RNA nuclear pequeno RNU6 e RNA nucleolar pequeno SNORD48 isolado a partir de plasma utilizando kits de isolamento miRNA baseados em colunas ou Ago-RIP. Três experiências diferentes são apresentadas. S1 e S2 representam isolamento utilizando Ago-RIP; E1 e E2 representam isolamento utilizando Isolação miRCury RNA de Kit-Biofluids de Exiqon; e Q1 e Q2 representa isolamento utilizando Kit miRNeasy Soro/Plasma da Qiagen.
[0019] A FIG. 12C mostra os níveis de RNA mensageiro de GAPDH, RN18S RNA ribossomal, e RN28S RNA ribossomal isolado a partir de plasma utilizando kits de isolamento de miRNA baseados em colunas ou Ago-RIP. Três experiências diferentes são apresentadas. S1 e S2 representam isolamento utilizando Ago-RIP; E1 e E2 representam isolamento utilizando Isolação miRCury RNA de Kit-Biofluidos de Exiqon; e Q1 e Q2 representa isolamento utilizando Kit miRNeasy Soro/Plasma da Qiagen.
[0020] A FIG. 13 apresenta um gráfico que mostra os níveis dos miRNAs indicados isolados a partir de plasma por meio de Ago-RIP utilizando anticorpos anti-Ago1, anticorpos anti-Ago2, ou uma combinação de ambos os anticorpos anti-Ago1 e anticorpos anti-Ago2. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0021] Um método eficiente e rápido para isolamento de miRNA circulantes foi descoberto. Como ilustrado nos exemplos, um método da divulgação pode isolar simultaneamente ambos associados de vesículas e não associados de vesículas miRNAs circulantes. Vantajosamente, os métodos e nos estojos da presente invenção permitem o isolamento rápido e específico de preparações puras de miRNAs sem contaminação por outros tipos de RNA. Além disso, os métodos e kits aqui descritos permitem o isolamento de miRNA com um rendimento elevado a partir de fluidos extracelulares diluídos. Além disso, os métodos da presente invenção podem se adaptar, permitindo o isolamento de miRNA volumes crescentes de fluidos biológicos extracelulares.
[0022] Níveis de miRNAs estão correlacionados com a doença, incluindo o câncer, doenças cardiovasculares, e em numerosas outras doenças e processos do desenvolvimento, incluindo esquizofrenia, doença de Alzheimer, o desenvolvimento das células imunes e de modulação tanto da imunidade adaptativa e inata, caule manutenção de células e pluripotência, o desenvolvimento do sistema nervoso, doenças endócrinas, incluindo a diabetes, o desenvolvimento do pâncreas, Síndrome X frágil, a cura da ferida cutânea, progressão do ciclo celular, rejeição de tecidos transplantados, hipoxia, diferenciação de músculo esquelético. Além disso, miRNAs também são expressas pelo vírus, e os genes alvo daqueles miRNA foram identificados. Como tal, métodos e kits da presente divulgação podem ser utilizados para preparar miRNA para ensaios para o diagnóstico de doenças ou estados de doença utilizando uma amostra biológica prontamente disponíveis, tais como sangue, soro ou plasma.
I. Método
[0023] A presente divulgação abrange um método para o isolamento de microRNA (miRNA) a partir de um fluido biológico. O método compreende o contato do fluido biológico com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação anti-miRNA. O agente tensoativo dissocia os componentes de fluidos biológicos e proteína de ligação a anti-miRNA interage com a proteína (s) de ligação de miRNA associada a miRNA para formar complexos de miRNA imunopre- cipitadas. O método compreende, ainda, liberação de miRNA a partir dos complexos de miRNA imunoprecipitados.
[0024] O método divulgado aqui especificamente miRNAs isoladas. Conforme detalhado no Exemplo 12 abaixo, outros tipos de pequenos RNAs (tais como RNAs nucleares pequenos ou RNAs nucleolares pequenos) não são isolados pelo método descrito, e moléculas de RNA de maiores (tais como RNAs mensageiros ou RNAs ribossomais) não são isolados pelo método divulgado.
(a) fluido biológico
[0025] Um método da presente invenção compreende o isolamento de miRNA extracelular que circula numa amostra de fluido biológico obtido de um sujeito. O termo "sujeito", tal como aqui utilizado, refere- se a um ser humano ou um animal. O sujeito pode ser um embrião, um adolescente ou um adulto. O sujeito pode ser do sexo masculino ou do sexo feminino. Os animais adequados incluem os vertebrados, tais como mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. Exemplos de mamíferos adequados incluem, sem limite, roedores, animais de estimação, gado e primatas. Exemplos de roedores não-limitativos incluem camundongos, ratos, hamsters, gerbilos, e porquinhos da Índia. Animais de estimação adequados incluem, mas não estão limitados a gatos, cães, coelhos, ouriços e furões. Exemplos não limitativos de gado incluem cavalos, cabras, ovelhas, porcos, gado, lhamas e alpacas. Primatas adequados incluem, mas não estão limitados aos macacos- prego, chimpanzés, lêmures, macacos, saguis, micos, macacos-aranha, macacos-esquilo e macacos-vervet. Exemplos de aves não-limitativas incluem galinhas, perus, patos e gansos. Um exemplar sujeito é um ser humano.
[0026] O termo "fluido biológico" pode referir-se a todos os fluidos biológicos e excreções isoladas a partir de um determinado sujeito. Exemplos de um fluido biológico não limitativos podem incluir sangue e suas frações, soro de sangue, plasma de sangue, urina, excreções, sêmen, fluido seminal, plasma seminal, fluido da próstata, fluido pré- ejaculatório (fluido de Cowper), derrame pleural, lágrimas, saliva, expectoração, suor, biópsia, ascite, fluido cerebrospinal, líquido amniótico, linfáticos, medula, secreções cervicais, secreções vaginais, secreções endometriais, secreções gastrintestinais, secreções brônquicas, secreções da mama, secreções de cisto no ovário, fluidos de tecidos, aspirante do tumor e amostras de fluido dos tecidos. Em algumas modalidades, um fluido biológico é soro sanguíneo. Em outras modalidades, um fluido biológico é um plasma sanguíneo.
[0027] Métodos de obtenção de um plasma de sangue ou amostra de soro de um indivíduo são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, punção venosa, com ou sem um cateter, pode ser utilizada para recolher uma amostra de sangue para a preparação de soro. Os métodos de preparação de plasma e de soro a partir de uma amostra de sangue são conhecidos na técnica. Em geral, uma amostra de sangue é grande o suficiente para fornecer uma quantidade suficiente de plasma ou soro a ser processados como descrito mais abaixo. Uma amostra de plasma ou soro pode ser processado imediatamente após a coleta da amostra. Alternativamente, uma amostra de plasma ou soro pode ser congelado para posterior processamento.
[0028] Uma amostra de fluido biológico pode ser obtida de um indivíduo através da coleta de uma amostra recentemente. Alternativamente, uma amostra de fluido biológico pode ser obtida a partir de uma amostra previamente colhida e armazenada. Por exemplo, quando um fluido biológico é plasma sanguíneo ou soro, a amostra pode ser obtida a partir de uma coleção das amostras de sangue armazenadas e preservadas. Em algumas modalidades, a amostra é obtida através da coleta de uma amostra recentemente. Em outras modalidades, a amostra é obtida a partir de uma amostra previamente coletada e armazenada.
[0029] Em algumas modalidades, uma amostra de fluido biológico é não diluída. Em outras modalidades, uma amostra de fluido biológico é diluída antes do isolamento de miRNA. O grau de diluição pode depender de um número de fatores, incluindo, mas não se limitando a miRNA, o tipo de fluido biológico na amostra, o sujeito, a condição da doença do paciente, o tipo de ensaio utilizado para medir a miRNA, e os reagentes utilizados no ensaio utilizado para medir a miRNA. Numa modalidade, uma amostra de fluido biológico é diluída pela adição de um volume de solvente variando de cerca de % do volume original da amostra a cerca de 50.000 vezes o volume da amostra original. O diluente pode ser qualquer líquido que não interfira com isolamento miRNA ou outros métodos utilizados nas etapas de processamento subsequentes. Exemplos não limitativos de diluentes adequados incluem a água deionizada, água destilada, solução salina, solução de Ringer, solução de salina tamponada com fosfato, solução de salina tamponada com TRIS, citrato de salina padrão e solução salina tamponada com HEPES.
(b) agente tensoativo
[0030] Um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo (alternativamente referido como um "agente surfactante" ou "detergente"). Tal como aqui utilizado, o termo "agente tendo-ativo" pode ser usado para descrever qualquer agente capaz de dissociar componentes de fluido biológico que pode compreender uma miRNA circulante. Exemplos não limitativos de componentes do fluido biológico, que podem compreender uma miRNA circulante incluindo vesículas extracelulares, tais como lipoproteínas, exossomas, microvesículas, ectossomas, corpos apoptóticos, e outras vesículas extracelulares.
[0031] Como será apreciado por um versado na técnica, quaisquer agentes tendo-ativos capazes de se dissociar componentes de fluidos biológicos podem ser utilizados em métodos da divulgação, desde que o agente tendo-ativo não interfira com a formação de um complexo de miRNA imunoprecipitado da divulgação. Por exemplo, um agente tensoativo pode ser um agente tensoativo aniônico, um agente tensoativo catiônico, um agente tensoativo zwitteriônico, um agente tensoativo não iônico, ou as suas combinações. A identidade do agente tensoativo da presente invenção pode e variará, dependendo da identidade dos componentes do fluido biológico num fluido biológico, que pode compreender um miRNA circulante, o reagente anti-proteína de ligação a miRNA, e miRNA isolado.
[0032] Em algumas modalidades, um agente tensoativo é um agente tensoativo aniônico. Agentes tensoativos aniônicos apropriados incluem, mas não estão limitados a sulfonato de dodecilbenzeno de amina; sulfato de amônio caprilete; cumenosulfonato de amônio; estearato de dihidroxi amônio; amônio sulfonato de dodecilbenzeno; lauril sulfato de amônio; lauril-12 sulfato de amônio; lauril-30 sulfato de amônio; lauril amônio sarcosinato; lauril sulfato de amônio; lauril sulfossuccinato de amônio; ligno-sulfonato de amônio; mireth-sulfato de amônio; sulfonato naftaleno de amônio; sulfato nonoxinol-20 de amônio; sulfato nonoxinol-30 de amônio; sulfato nonoxinol-4 de amônio; sulfato nonoxinol-6 de amônio; sulfato de nonoxinol-9 de amônio; sulfato oleico de amônio; perfluoro-octanoato de amônio; estearato de amônio; xilenossulfonato de amônio; butil naftaleno sulfonato; fosfato de butila; cálcio de sulfonato de dodecilbenzeno; cálcio de estearoil lactilato; cálcio tetrapropilenebenzeno de sulfonato; ácido carboxílico de caprileth-9; fosfato de cetila; ácido sulfônico de cumeno; fosfato de DEAcetila; sulfonato de dodecilbenzeno-DEA; sulfato de lauril-DEA; deceth- 4 fosfato; sulfosuccinato de lauril diamônio; sulfosuccinamato de estearílico diamônio ; sulfossuccinato de sódio diamila; diciclo-hexil sulfossuccinato de sódio; dihexil sulfossuccinato de sódio; di-isobutil sulfossuccinato de sódio; dilaureth-7 citrato; dimeticonol; dinonoxinol 4- fosfato; dioctilsulfossuccinato de amônio; dioctil sulfosuccinato de sódio; dissódico cetearil sulfosuccinamato; dissódico cocamido MEA- sulfossuccinato; cocamido dissódico PEG-3 sulfossuccinato; dissódico deceth-6 sulfossuccinato; dissódico decil difenil éter dissulfonato; dissódico propil dodeciloxi sulfosuccinamato; sulfosuccinato dissódico isodecila; sulfosuccinato dissódico laneth-5; sulfosuccinato-DEA dissódico lauramido; sulfosuccinato-MEA dissódico lauramido; sulfossuccinato laureth; sulfosuccinato dissódico laurila; sulfosuccinato- MEA dissódico miristamido; sulfosuccinato-MEA dissódico oleamido; sulfosuccinato dissódico oleamido PEG-2; sulfosuccinato dissódico oleth-3; sulfosuccinato dissódico PEG-4 cocamido MIPA; sulfossuccinato-MEA dissódico ricinoleamido; sulfossuccinato dissódico estearílico; sulfossuccinato-MEA dissódico undecilenamido; sulfossuccinato ditridecil de sódio; anidrido dodecenilsuccínico; éter difenílico de dodecil de ácido dissulfônico; difeniloxido dodecil do ácido dissulfônico; ácido dodecilbenzeno; dioleato de gliceril SE; diestearato de gliceril SE; ricinoleato de gliceril SE; citrato de estearato de glicerila; estearato de gliceril SE; estearato de glicol SE; fosfato de hexila; fosfato de isopropila; isopropilamina dodecilbenzenossulfonato; fosfato isosteareth-2; fosfato-3 isotrideceth; 6-fosfato isotrideceth; laureth-1 fosfato; laureth-12 do ácido carboxílico; lauret-3-fosfato; laureth-4 fosfato; laureth-6 fosfato; laureth-7, citrato; laureth-9 fosfato; fosfato de laurila; lauril sulfato de lítio; lauril sulfato de magnésio; sulfato de magnésio PEG-3 cocamida; fosfato de MEA-laureth; sulfato de lauril- MEA; sulfato de MIPA-laureth; sulfato de MIPA-laurila; miristoil sarcosina; sulfonato de naftaleno-formaldeído; fosfato de nonoxinol-10; fosfato de nonoxinol-12; fosfato de nonoxinol-3; fosfato de nonoxinol-4; sulfato nonoxinol-4; fosfato de nonoxinol-6; fosfato de nonoxinol-7; fosfato de nonoxinol-8; fosfato de nonoxinol-9; fosfato de nonil nonoxinol-10; fosfato de nonil nonoxinol-15; fosfato de nonil nonoxynol- 7; ácido carboxílico de oleto-10; fosfato de oleto-10; ácido carboxílico oleth-3; fosfato de oleto-4; fosfato de oleth-5; ácido carboxílico oleto-6; fosfato de oleto-7; PEG-2 dilaurato SE; PEG-2 dioleato SE; PEG-2 diestearato SE; PEG-2 laurato SE; PEG-2 oleato SE; PEG-2 estearato SE; PEG-9 de ácido carboxílico estearamida; cetil fosfato de potássio; fosfato de potássio deceth-4; sulfonato de potássio dodecilbenzeno; potássio isosteareth 2-fosfato; lauroilsarcosinato de potássio; lauril sulfato de potássio; oleato de potássio; sulfato de potássio oleico; perfluoro-octoato de potássio; sulfato de potássio ricinoleico; PPG-2 laurato SE; PPG-2 oleato SE; PPG-2 estearato SE; fosfato de PPG-5- ceteto-10; laurato de propilenoglicol SE; oleato de propilenoglicol SE; propileno glicol ricinoleato SE; propileno glicol estearato SE; PVM copolímero/MA; fosfato de 2-etil-hexil de sódio; sulfato de 2-etil-hexil de sódio; sulfonato de sódio de uma olefina; sulfonato de sódio aliloxi hidroxipropila; lactilato de sódio de behenol; acetato de sódio de butoxietóxi; sulfonato de sódio de butil naftaleno; sulfato de oleato de butil sódio; sulfato de oleato de butil sódio; fosfato de sódio butila; oleato; caproil lactilato de sódio; caprilil sulfonato de sódio; sulfato de cetil de sódio; colato de sódio; cumenossulfonato de sódio; deceth de sódio sulfato; sulfonato de sódio de decil difenil éter; sulfato de decil de sódio; deoxicolato de sódio; sulfonato de sódio de dibutil-naftaleno; didodecilbenzeno sulfonato de sódio; di-iso-octil sulfossuccinato de sódio; sulfonato de sódio di-isopropil naftaleno; citrato de sódio de dilaureth-7; sulfossuccinato de sódio de dinonila; disulfonato de sódio de dodecil difenil éter; dissulfonato de sódio de dodecil difeniloxido; dodecilbenzenossulfonato de sódio; sulfato de gliceril trioleato de sódio; dissulfonato de sódio de hexadecil difenila; dissulfonato de sódio de hexadecil difeniloxido; dissulfonato de sódio de hexil difeniloxido; isotionato de sódio; sulfato de sódio isodecila; sulfato de sódio iso-octilo isostearoil lactilato de sódio; sulfatoi de sódio de isotrideceth-15; lactato de sódio; lauramido de sódio DEA-sulfosuccinato; fosfato de sódio laureth; sulfato de sódio Laureth; sulfossuccinato de sódio laureth; fosfato de sódio laureth-10; carboxilato de metil laureth-11; sulfato de sódio laureth-12; acetato de sódio laureth-13; carboxilato de metil laureth-13; carboxilato de sódio laureth-3; carboxilato de sódio laureth- 4; fosfato de sódio laureth-4; carboxilato de sódio laureth-6; carboxilato de sódio laureth-7; sulfato de sódio laureth-7; sulfato de sódio laureth-8; lauroil glutamato de sódio; lauroil-lactilato de sódio; lauroil-lactilato de sódio; metilaminopropionato de metilo de lauroil de sódio; lauroilsarcosinato de sódio; fosfato de lauril e sódio; sulfato de lauril e sódio; sulfoacetato de sódio laurila; lignato de sódio; ligno-sulfonato de sódio; sulfonato de sódio metalila; lauroil metil taurato de sódio; miristoil metil taurato de sódio; oleoil metil taurato de sódio; palmitoil metil taurato de sódio; estearoil metil taurato de sódio; metilnaftalenossulfonato de sódio; m-nitrobenzenossulfonato de sódio; sulfato de sódio de miristil éter; glutamato de sódio de miristoila; sarcosinato de sódio de miristoila; sulfato de sódio de miristila; sulfato de sódio de nonoxinol; sulfato de sódio de nonoxinol-10; sulfossuccinato de sódio de nonoxinol-10; sulfato de sódio de nonoxinol-15; sulfato de sódio de nonoxinol-4; sulfato de sódio de nonoxinol-5; fosfato de sódio de nonoxinol-6; sulfato de sódio de nonoxinol-6; sulfato de sódio de nonoxinol-8; fosfato de sódio de nonoxinol-9; sulfato de sódio de nonoxinol-9; sulfonato de sódio octoxinol-2 etano; sulfato de sódio de octoxinol-3; sulfato de sódio octila; sulfonato de sódio octilfenoxietoxietila; sulfato de sódio oleico; fosfato de sódio oleto-7; fosfato de sódio oleílico; sulfato de de sódio oleila; sulfosuccinamato de sódio oleílico; sarcosinato de sódio de palmitoila; sulfonato de sódio de fenila; sulfato de sódio de oleato de propila; estearoillactilato de sódio; sulfosuccinamato de estearil de sódio; sulfato de sódio de trideceth; carboxilato de sódio trideceth-3; carboxilato de sódio trideceth-6; carboxilato de sódio trideceth-7; sulfato de sódio de tridecila; sulfonato de sódio de tridecila; xilenossulfonato de sódio; sarcosina estearoila; TEA-lauroil glutamato; sulfato de TEA-laurilo; tetrasódio dicarboxietil estearílico sulfosuccinamato; sulfato de TIPA- laureth; fosfato de triceteareth-4; fosfato de triceteth 5; fosfato de Trideceth-2; fosfato de Trideceth-3; fosfato de Trideceth-5; fosfato tridecila; e fosfato de trilaureth-4; e fosfato de trioctilo
[0033] Em outras modalidades, um agente tensoativo é um agente tensoativo catiônico. Exemplos de agentes tensoativos catiônicos adequados incluem, mas não estão limitados ao brometo de alquiltrimetilamônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzildimetilhexadecilamônio cloreto de benzildimetiltetradecilamônio; brometo de benzildodecildimetilamônio; benziltrimetilamônio tetracloroi- odato; brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB); brometo de dimetildioctadecilamônio; brometo de dodeciletildimetilamônio; brometo de dodeciltrimetilamônio; brometo de dodeciltrimetilamônio; cloreto de dodeciltrimetilamônio; brometo de etilhexadecildimetilamônio; reagente de Girard T; brometo de hexadeciltrimetilamônio; brometo de hexadeciltrimetilamônio; N,N', N'-polioxietileno (10) -N-sebo-1,3- diaminopropano; brometo de tonzônio; e brometo de trimetil(tetradecil)amônio.
[0034] Em outras modalidades ainda, um agente tensoativo é um agente tensoativo zwitteriônico. Agentes tensoativos zwitteriônicos adequados incluem, mas não estão limitados a, 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamônio] -2-hidróxi-1-propanossulfonato (CHAPSO); 3 - [(3- colamidopropil) dimetilamônio] -1-propanossulfonato (CHAPS); 3- (4- heptil) fenil-3-hidroxipropil) dimetilamôniopropanossulfonato (C7BzO); 3- (N,N -dimetiloctilamônio) sal interno propanossulfonato (SB3-8); 3- (decildimetilamônio) sal interno propanossulfonato (SB3-10; caprilil sulfobetaína); 3- (dodecildimetilamônio) sal interno propanossulfonato (SB3-12); 3- (N,N-dimetiltetradecilamônio) propanossulfonato (SB3-14); 3- (N,N-dimetilpalmitilamônio) propanossulfonato (SB3-16); 3- (N,N- dimetiloctadecilamônio) propanossulfonato (SB3-18); 3- [N,N-dimetil (3- miristoilaminopropil) amônio] propanossulfonato (ASB-14). Outros tetergentes zwitteriônicos apropriados, dependendo da modalidade, incluem: acetilado lecitina; apricotamidopropil betaína; babassuamidopropil betaína; behenil betaína; bis 2-hidroxietil glicinato de sebo; dimetil betaína alquil de C12-14; canolamidopropil betaína; cáprico/caprílico amidopropil betaína; capriloamidopropil betaína; cetil betaína; cocoamidopropil betaína; cocamidopropil dimetilaminohidroxipropil colágeno hidrolisado; N- [3-cocamido) -propil] -N,N-dimetil-betaína, sal de potássio; cocamidopropil hidroxisultaína; cocamidopropil sulfobetaína; ácido cocaminobutírico; ácido cocaminopropiônico; ácido cocoanfodipropiônico; coco-betaína; cocodimetilamônio-3-sulfopropilbetaína; cocoiminodiglicinato; cocoimi- nodipropionato; coco/betaína oleamidopropila; cocoil sarcosinamida DEA; cocoanfodipropionato DEA; hidroxietil sebo glicinato; dimeticona propil betaína PG; N,N-dimetil-N-ácido láurico-amidopropil-N- (3- sulfopropil) -amônio betaína; N,N-dimetil-N-miristil-N- (3-sulfopropil) - amônio betaína; N,N-dimetil-N-palmitil-N- (3-sulfopropil) -amônio betaína; N,N-dimetil-N-estearamidopropil-N- (3-sulfopropil) -amônio betaína; N,N-dimetil-N-estearil-N- (3-sulfopropil) -amônio betaína; N,N- dimetil-N-sebo-N- (3-sulfopropil)-amônio betaína; dissódico caproanfodiacetato; dissódico caproanfodipropionato; dissódico capriloanfodiacetato; dissódico capriloanfodipropionato; dissódico cocoanfodiacetato; dissódico cocoanfodipropionato; dissódico isostearoanfodipropionato; laureth-5 carboxianfodiacetato; dissódico lauriminodipropionato; dissódico lauroanfodiacetato; dissódico lauroanfodipropionato; dissódico octil b-iminodipropionato; dissódico oleoanfodiacetato; dissódico oleoanfodipropionato; dissódico PPG-2- isodeceth-7 carboxianfodiacetato; dissódico soyanfodiacetato; dissódico estearoanfodiacetato; dissódico tallanfodipropionato; dissódico tallowanfodiacetato; dissódico dipropionato tallowimino; dissódico diacetato wheatgermampho; N,N-diestearil-N-metil-N- (3- sulfopropil) -amônio betaína; erucamidopropil hidroxisultaína; etilhexil dipropionato; acetato hidroximetil oleíco oxazolina; acetato de PEG-15, sulfato de cocamina; lecitina hidrogenada; proteína hidrolisada; betaína isostearamidopropila; lauramidopropil betaína; lauramidopropil dimetil betaína; ácido lauraminopropiônico; ácido lauroafodipropiônico; lauroil de lisina; betaína laurila; hidroxisultaína laurila; sultaina laurila; linoleamidopropil betaína; lisolecitina; leite lipídico amidopropil betaína; miristamidopropil betaína; octil dipropionato; octiliminodipropionato; betaína oleamidopropila; betaína oleílico; 4,4 (5H) -oxazoledimetanol, 2- (heptadecenil) -; palmitamidopropil betaína; óxido de palmitamina; betaína ricinoleamidopropila; betaína ricinoleamidopropil/copolímero IPDI; sesamidopropil betaína; de sódio C12-15 alcoxipropil iminodipropionato; caproanfoacetato de sódio; capriloanfoacetato de sódio; capriloanfohidroxipropil sulfonato de sódio; capriloanfopropionato de sódio; carboximetilceluloso de sódio de sebo polipropilamina; cocaminopropionato de sódio; cocoanfoacetato de sódio; cocoanfohidroxipropil sulfonato de sódio; cocoanfopropionato de sódio; dicarboxietil cocofosfoetil imidazolina de sódio; sebo hidrogenado dimetil glicinato de sódio; isostearoanfopropionato de sódio; lauriminodipropionato de sódio; lauroanfoacetato de sódio; oleoanfohidroxipropilsulfonato de sódio; oleoanfopropionato de sódio; estearoanfoacetato de sódio; tallanfopropionato de sódio; soyamidopropil betaína; estearil betaína; sebo hidroxisultaína amido propila; ácido tallowanfopolicarboxipropiônico; lauroanfo trissódico cloreto de PG-fosfato de etila; betaína undecilenamidopropila; e gérmen de trigo amidopropil betaína.
[0035] Em outras modalidades, um agente tensoativo é preferivelmente um agente tensoativo não iônico. Exemplos de agentes tens-ativos não iônicos adequados incluem, mas não estão limitados a, monolaurato de polioxietileno (10) cetil éter (BRIJ® 56); polioxietileno (20) cetil éter (BRIJ® 58); polioxietilenoglicol dodecil éter (Brij® 35); polioxietileno (9) p-t-octilfenol (NONIDET™ P-40); polioxietileno (4-5) p-t- octilfenol (Triton ™ X-45); polioxietileno (7-8) p-t-octilfenol (Triton ™ X114); polioxietileno (9-10) p-t-octilfenol (Triton ™ X-100); polioxietileno (910) de nonilfenol (TRITON ™ N-101); polioxietileno (20) monolaurato de sorbitol (TWEEN ® 20); polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitol (TWEEN ® 40); polioxietileno (20) mono-oleato de sorbitol (TWEEN ® 80); óxido dimetildecilfosfina (APO-10); óxido dimetildodecilfosfina (APO- 12); -Ciclo-hexil-N-etil-β-D-malt0sido; -Ciclo-hexil-N-hexil-β-D- maltosídeo; -Ciclo-hexil-N-metil-β-maltosideo; N-decanoilsucrose; n- decil-β-D-glucopiranosideo; n-decil-β-maltopiranosideo; n-decil-β-D- tiomaltosídeo; sacarose n-dodecanoila; decaetileno éter monododecil glicol; N-decanoil-N-metilglucamina; n-decil α-D-glucopiranosideo; decil β-D-maltopiranosideo; n-dodecanoil-N-metilglucamida; n-dodecil-α-D- maltosídeo; n-dodeciie-D-maltosídeo; heptano-1,2,3-triol; heptaetileno éter glicol monodecila; heptaetileno éter monododecil glicol; heptaetileno éter glicol monotetradecila; N-hexadecil e-D-maltosídeo; hexaetileno éter monododecil glicol; hexaetileno-glicol éter monohexadecila; hexaetileno- glicol éter mono-octadecila; hexaetileno-glicol éter monotetradecila; metil- 6-O- (N-heptilcarbamoil) -a-D-glucopiranosídeo; nonaetileno éter monododecil glicol; N-nonanoil-N-metilglucamina; N-nonanoil-N- metilglucamina; octaetileno éter glicol monodecila; octaetileno éter monododecil glicol; octaetileno éter glicol monohexadecila; octaetileno éter glicol mono-octadecila; octaetileno éter glicol monotetradecila; octil- e-glucosídeo; octil-e-tioglucosídeo; octil-e-D-glucopiranosídeo; octil-β-D- 1-tioglucopiranosídeo; pentaetileno glicol éter monodecila; pentaetileno éter monododecil glicol; pentaetileno glicol éter monohexadecila; pentaetileno glicol éter mono-hexílico; pentaetileno glicol éter mono octadecila; pentaetileno glicol éter mono-octila; polietileno glicol éter de diglicidila; éter de polietileno-glicol; polioxietileno éter 10-tridecílico; polioxietileno (100) estearato; polioxietileno (20) éter isohexadecila; polioxietileno (20) éter oleílico; polioxietileno (40) estearato; polioxietileno (50) estearato; polioxietileno (8) estearato de; bis (polioxietileno imidazolilo carbonil); estearato de polioxietileno glicol (25) propileno; saponina de casca de árvore Quillaja; -Tetradecil-β-D maltosídeo; tetra- etileno-glicol éter monodecila; tetra-etileno-glicol éter monododecila; tetra-etileno-glicol éter monotetradecila; trietileno glicol éter monodecila; trietileno glicol éter monododecila; trietileno glicol éter monohexadecila; trietileno glicol éter mono-octila; trietileno glicol éter monotetradecila; tiloxapol; n-undecil β-D-glucopiranosideo, (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL® CA-630); polioxietileno (5) nonilfeniléter (IGEPAL® CO-520); e polioxietileno (150) éter dinonilfenil (IGEPAL® DM-970). Numa modalidade, um agente tensoativo E de polioxietileno (5) nonilfeniléter (IGEPAL® CO-520). Numa outra modalidade, um agente tensoativo E de polioxietileno (150) Éter dinonilfenil (IGEPAL® DM-970). Numa Modalidade, um agente tensoativo E de Preferência (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL® CA-630).
[0036] Como será apreciado por um versado na técnica, a quantidade de agente tensoativo adicionado ao fluido biológico pode e variará dependendo da identidade dos componentes do fluido biológico num fluido biológico, que pode compreender um miRNA circulante. Em algumas modalidades, a concentração final de agente tensoativo no fluido biológico pode variar de cerca de 0,001 a cerca de 10%. Numa modalidade, a concentração do agente tendo-ativo pode variar de cerca de 0,001 a cerca de 0,01%. Numa outra modalidade, a concentração do agente tensoativo pode variar de cerca de 0,01% a cerca de 0,1%. Em ainda outra modalidade, a concentração do agente tensotensoativo pode variar desde cerca de 0,1% a cerca de 1%. Numa outra modalidade, a concentração do agente tensoativo pode variar de cerca de 1% a cerca de 5%. Numa modalidade adicional, a concentração do agente tensoativo pode variar desde cerca de 5% a cerca de 10%.
(c) reagente da proteína de ligação anti-miRNA
[0037] Um fluido biológico é posto em contato com uma reagente proteína de ligação de anti-miRNA. Um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA pode ser qualquer agente capaz de se ligar a uma proteína de ligação a miRNA associada a circulação miRNAs. Uma proteína de ligação a miRNA associada a miRNAs circulantes podem ligar um miRNA diretamente, ou pode ser indiretamente relacionado com um complexode proteína RNA compreendendo miRNA. Exemplos de proteínas de ligação miRNA que podem ser associados a miRNAs circulantes podem incluir Argonauta, Dicer, vírus da imunodeficiência humana (HIV), proteína de ligação a RNA da resposta de transativação (TRBP), ativador de proteína da proteína quinase induzida de interferon (PACT) não limitativa, o complexo SMN, proteína retardo mental X frágil (FMRP), proteína contendo domínio de nuclease estafilocócica tudor (Tudor-SN), o DNA putativo MOV10 helicase, e a proteína contendo o motivo de reconhecimento RNA de TNRC6B, ou outros componentes do RISC complexo ou que pode associar transientemente ou permanentemente com o complexo RISC.
[0038] Em algumas modalidades, um fluido biológico é preferivelmente contatado com um reagente anti-Argonauta. Exemplos não limitativos de uma proteína Argonauta pode incluir Ago1, Ago2, Ago3 e Ago4. Numa modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um reagente anti-Ago1. Numa outra modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um reagente anti-Ago2. Em ainda outra modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um reagente anti-Ago3. Numa modalidade adicional, um fluido biológico é posto em contato com um reagente anti-Ago4. Numa outra modalidade, um fluido biológico é preferivelmente contatado com um reagente capaz de se ligar a mais do que uma proteína Argonauta. Por exemplo, um fluido biológico pode ser contatado com um anticorpo anti-Ago1 e um reagente anti-Ago2. Em ainda outra modalidade, um fluido biológico é preferivelmente contatado com um reagente capaz de ligar Ago1, Ago2, Ago3 e Ago4.
[0039] Uma reagente proteína de ligação de anti-miRNA pode ser um agente de ligação ao epítopo. Exemplos de agentes de ligação a epítopos adequados não limitativos, dependendo da molécula alvo, incluem agentes selecionados a partir do grupo que consiste de um aptâmero, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma sequência de DNA de cadeia dupla, os ácidos nucleicos modificados, imita de ácido nucleico, um ligante, um fragmento do ligante, um receptor, um fragmento do receptor, um polipeptídeo, um peptídeo, uma coenzima, um co-regulador, uma molécula alostérica, e um íon.
[0040] Em algumas modalidades, um agente de ligação de epítopo é um anticorpo. Os exemplos não limitativos de anticorpos que podem ser utilizados incluem anticorpos policlonais, ascite, fragmentos Fab, fragmentos Fab', anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeia simples, anticorpos de domínio simples, anticorpos humanizados, e outros fragmentos que contêm o local de ligação ao epítopo do anticorpo.
[0041] Em algumas modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um anticorpo anti-Argonauta. Numa modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um anticorpo anti-Ago1. Numa outra modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um anticorpo anti-Ago2. Em ainda outra modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um anticorpo anti-Ago3. Numa modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um anticorpo anti-Ago4. Numa modalidade adicional, um fluido biológico é posto em contato com dois anticorpos anti-Ago escolhidos a partir de anticorpos anti-Ago1, anti- Ago2, anti-Ago3, ou anti-Ago4. Por exemplo, um fluido biológico é posto em contato com anticorpos anti-Ago1 e anti-Ago2. Numa outra modalidade, um fluido biológico é posto em contato com três anticorpos anti-Ago escolhidos a partir de anti-Ago1, anti-Ago2, anti-Ago3, ou anti- Ago4. Em ainda outra modalidade, um fluido biológico é posto em contato com todos os quatro anticorpos anti-Ago. Numa outra modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um anticorpo capaz de reconhecer mais do que uma proteína Argonauta. Tais anticorpos podem reconhecer um, dois, três, ou quatro proteínas Argonauta. Numa modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um anticorpo anti-Argonauta capaz de reconhecer todas as quatro proteínas Argonauta humanas.
[0042] Entrando em contato com um fluido biológico com um reagente de proteína de ligação anti-miRNA das formas de divulgação dos complexos de miRNA imunoprecipitados. Como tal, um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA é normalmente ligado a um suporte sólido para formar complexos de miRNA imunoprecipitados quando um fluido biológico é posto em contato com o reagente de proteína de ligação imobilizada anti-miRNA. O suporte sólido pode ser um material que pode ser modificado para conter locais individuais discretos adequados para a fixação ou a associação de um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA. Exemplos não limitativos de materiais de suporte sólidos incluem vidro, modificados ou vidro funcionalizado, plásticos incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, ou TeflonJ, nylon, nitrocelulose, polissacarídeos, resinas, sílica ou materiais à base de sílica incluindo silício e silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos e plásticos. O tamanho e forma do suporte sólido pode variar sem nos afastarmos do escopo da invenção. Um suporte sólido pode ser planar, um suporte sólido pode ser um poço, ou seja, uma placa de 364 poços, ou, alternativamente, um suporte sólido pode ser uma conta ou uma lâmina. Em algumas modalidades, um suporte sólido é um poço de uma placa alveolar. Em outras modalidades, um suporte sólido é uma superfície interna de uma ponta de pipeta. Em ainda outras modalidades, um suporte sólido é de preferência uma conta. Em algumas modalidades, um suporte sólido é de preferência uma esfera magnética.
[0043] Um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA pode ser ligado a um suporte sólido em uma ampla variedade de formas, tal como será reconhecido por aqueles versados na técnica. Um reagente de proteína de ligação anti-miRNA e um suporte sólido pode ser derivatizado com grupos químicos funcionais para a subsequente ligação dos dois. Por exemplo, um suporte sólido pode ser derivatizado com um grupo químico funcional incluindo, mas não se limitando a grupos amino, grupos carboxil, grupos oxo ou grupos de tiol. Usando estes grupos funcionais, um reagente de proteína de ligação de anti- miRNA pode ser ligado por meio de grupos funcionais, quer direta, quer indiretamente utilizando ligantes. Alternativamente, o reagente de proteína de ligação de anti-miRNA pode também ser ligado ao suporte sólido de forma não covalente. Por exemplo, um reagente de proteína de ligação biotinilado de anti-miRNA pode ser preparado, o qual pode ligar a um suporte sólido covalentemente revestido com estreptavidina, resultando em anexo. Métodos adicionais de anexação de um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA para um suporte sólido são bem conhecidos na técnica e podem ser tal como descrito em manuais de laboratório tais como publicados em “Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001. Em algumas modalidades, um reagente de proteína de ligação biotinilado de anti-miRNA é preparado, o qual pode ligar a um suporte sólido de conta covalentemente revestido com estreptavidina, resultando em anexo. Tal como descrito em Seção I(d) abaixo, um reagente da proteína de ligação de anti-miRNA pode ser ligado a um suporte sólido antes de contatar um fluido biológico num método da divulgação. Alternativamente, um fluido biológico da divulgação podem ser contatados simultaneamente com um reagente da proteína de ligação de anti-miRNA e um suporte sólido, em que o reagente anti-proteína de ligação a miRNA atribui ao suporte sólido. Um fluido biológico da divulgação pode também ser posto em contato com um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA antes de contatar o fluido biológico com um suporte sólido, em que o reagente de proteína de ligação a anti- miRNA atribui ao suporte sólido. Como será apreciado por um versado na técnica, a quantidade e a concentração do reagente de proteína de ligação anti-miRNA pode e variará dependendo da identidade do reagente de proteína de ligação anti-miRNA, o volume de fluido biológico utilizado, a concentração de um miRNA no fluido biológico, e a proteína de ligação a miRNA entre outros fatores, e pode ser determinada experimentalmente. Quando um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA é um anticorpo purificado, cerca de 0,5 a cerca de 10 μg de anticorpo pode ser utilizado para cada 0,2 ml de amostra de plasma ou soro.
(d) contato do fluido biológico e isolamento miRNA
[0044] Num método da divulgação, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA. Como será apreciado por um versado na técnica, um fluido biológico pode ser contatado com uma variedade de outros agentes sem se afastarem do âmbito da invenção. Por exemplo, um fluido biológico pode ser contatado com um agente redutor de tiol para bloquear a formação de ligações dissulfureto e inibir a atividade de ribonuclease durante o isolamento miRNA. Agentes redutores de tiol adequados incluem ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, 2-mercaptoe- tilamina, e tris(carboxietil)fosfina (TCEP). Um fluido biológico também pode ser contatado com um agente anti-espumante. Exemplos de agentes anti-espuma incluem anti-espuma 204 e anti-espuma O-30, Antiespumante A, Anti-espumante B, Antiespuma C, Antiespumante Y- 30, e Sag 471. Um fluido biológico também pode ser contatado com inibidores de RNA e proteína de degradação para preservar complexos de miRNA e proteína miRNA.
[0045] Em algumas modalidades de um agente tamponante pode ser utilizado para manter um pH adequado para o isolamento de miRNA. A título de exemplo não limitativo, agentes tamponantes podem incluir, mas não estão limitados a acetato de Trizma, EDTA, Tris, glicina e citrato.
[0046] Em algumas modalidades, um método da invenção compreende o contato de um fluido biológico com um agente tensoativo para dissociar componentes de fluidos biológicos antes de contatar o fluido biológico com um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA para formar complexos de miRNA imunoprecipitados. Em outras modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA simultaneamente.
[0047] Em algumas modalidades, uma amostra não diluída do fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA. Em outras modalidades, um fluido biológico é diluído antes do contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA. A diluição de um fluido biológico pode ser como descrito na seção I(a) acima.
[0048] O contato entre um fluido biológico, um agente tensoativo, e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA compreende geralmente um período de incubação para permitir a formação de complexos de miRNA imunoprecipitados. Um fluido biológico pode ser contatado com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA e incubado durante cerca de 1, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240 ou 480 minutos ou mais. Em algumas modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA e incubado durante cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, ou cerca de 15 minutos. Em outras modalidade, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti- miRNA e incubado durante cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou cerca de 30 minutos. Em ainda outras modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti- miRNA e incubado durante cerca de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 85, ou cerca de 90 minutos. Em outras modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA e incubado durante cerca de 90, 120, 240 ou 480 minutos ou mais. Numa modalidade, um fluido biológico é preferivelmente contatado com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA e incubado durante cerca de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, ou cerca de 60 minutos.
[0049] Um fluido biológico pode ser contatado com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA a uma temperatura de cerca de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou cerca de 30°C ou mais. Em algumas modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA a uma temperatura de cerca de 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou cerca de 6°C. Em outras modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti- miRNA a uma temperatura de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou sobre 15°C. Em outras modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA a uma temperatura de cerca de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou cerca de 25°C. Em ainda outras modalidades, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação de anti-miRNA a uma temperatura de cerca de20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou cerca de 30°C.
[0050] Tipicamente, um fluido biológico é posto em contato com um agente tensoativo e um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA sob agitação. Além disso, um fluido biológico pode geralmente ser removido para isolar complexos de miRNA imunoprecipitados após a formação dos complexos, e os complexos de miRNA imunoprecipitados lavados.
(e) liberação de miRNA
[0051] De acordo com um método da divulgação, miRNA é liberado a partir de complexos de miRNA imunoprecipitados. Os métodos de libertação de um ácido nucleico, tais como um miRNA a partir de um complexo de proteínas são bem conhecidos na técnica e podem incluir a digestão da protease, e a desnaturação de proteínas em um complexo de proteína do ácido nucleico. Em algumas modalidades, miRNA é liberado a partir de complexos de miRNA imunoprecipitados por desnaturação da proteína. Por exemplo, miRNA pode ser liberado a partir de complexos de miRNA imunoprecipitados por combinação de complexos de miRNA imunoprecipitados com uma solução de clorofórmio-fenol de tiocianato guanidina. Autorização de miRNA pode então ser purificada por precipitação ou por cromatografia em coluna de centrifugação.
[0052] Em outras modalidades, miRNA é preferencialmente liberado a partir de complexos de miRNA imunoprecipitados por digestão com protease. Os termos "protease", "proteinase", e "peptidase" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se ao grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas covalentes. Enzimas proteases são bem conhecidas na técnica e podem incluir proteases ácidas e proteases de serina. Em algumas modalidades, uma protease que pode ser utilizada para liberar um miRNA no método da divulgação é uma protease ácida. Numa modalidade, uma protease ácida que pode ser utilizada para liberar um miRNA no método da divulgação é pepsina.
[0053] Em outras modalidades, uma protease que pode ser utilizada para liberar um miRNA no método da divulgação é uma protease ácida. Seis clãs de proteases de serina foram identificadas, os dois maiores dos quais são o tipo quimotripsina e subtilisina de clãs semelhantes. Um grande número de subtilases são conhecidos. Alguns dos subtilases que tenham sido extensivamente estudados incluem aqueles obtidos a partir de várias espécies de Bacilo incluindo subtilisina DY, a subtilisina Carlsberg, a subtilisina BPN' (também chamado nagarse), mesentericopeptidase, bem como de proteinase K, que é obtido a partir de album Tritirachium Limber, e termitase que é obtido a partir de Thermoactinomyces vulgaris. Em certas modalidades da presente invenção, é preferido proteinase K como uma enzima de protease. Outras enzimas de protease, no entanto, podem também serem usadas em determinadas modalidades, tais como, por exemplo, nagarse. A enzima protease pode, assim, ser qualquer um de uma série de proteases que produzem pelo menos uma desagregação parcial das proteínas imunoprecipitadas em complexos de miRNA tal que miRNA é liberado. Em algumas modalidades, uma protease que pode ser utilizada para liberar um miRNA no método da divulgação é preferencialmente protease k.
[0054] Em essência, miRNA é liberado a partir de complexos de miRNA imunoprecipitados por contatos complexos com uma enzima da protease. Como será apreciado por um versado na técnica, a quantidade de protease utilizada para liberar miRNA pode e variará de acordo com a protease, a abundância de complexos de miRNA imunoprecipitadaos, a temperatura durante a digestão com protease, as condições do tampão utilizado para a digestão e a duração da digestão, entre outros fatores. Em geral, os complexos de miRNA imunoprecipitados podem ser posto em contato com cerca de 0,3 unidades de atividade de enzima para cerca de 30 unidades de atividade de enzima. Em certas modalidades, a quantidade de protease contatada com complexos de miRNA imunoprecipitados pode variar de cerca de 0,3 a cerca de 1 unidade, de cerca de 1 a cerca de 3 unidades, a partir de cerca de 3 unidades a cerca de 10 unidades, ou de cerca de 10 unidades a cerca de 30 unidades.
[0055] Em algumas modalidades, utilizando digestão com protease, à temperatura ambiente, tal como descrito no Exemplo 1. Tal como aqui utilizado, o termo "temperatura ambiente" é utilizado para descrever uma temperatura de cerca de 10°C a cerca de 30°C.
[0056] Complexos de miRNA imunoprecipitados podem ser incubados com uma protease para cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, ou cerca de 30 minutos ou mais. Em algumas modalidades, os complexos de miRNA imunoprecipitados são incubados com uma protease para cerca de 0,5, 1, 2, 3, 4, ou cerca de 5 minutos. Em outras modalidades, os complexos de miRNA imunoprecipitados são incubados com uma protease para cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou cerca de 15 minutos. Em ainda outras modalidades, os complexos de miRNA imunoprecipitados são incubados com uma protease para cerca de 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, ou cerca de 30 minutos ou mais.
[0057] Autorização de miRNA pode ser apropriada para uso sem qualquer purificação adicional a jusante. Alternativamente, liberado de miRNA pode ser adicionalmente purificado para utilizações a jusante. Métodos de purificação de ácidos nucleicos, tais como cromatografia de filtração ou técnicas de coluna de centrifugação, são bem conhecidos na técnica, por exemplo, de acordo com métodos descritos em manuais de laboratório tais como publicados em "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 or "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001.
[0058] O uso a jusante do miRNA liberado pode variar. Utilizações de miRNA liberados não limitativos incluem quantitativa PCR em tempo real, análise de microensaio, sequenciamento, o polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP), polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), análise de microssatélites, análise a curto repetição em tandem (STR), e hibridação genômica comparativa (CGH).
II. Kits
[0059] A invenção proporciona ainda kits compreendendo agentes tensoativos, reagentes de proteínas de ligação de anti-miRNA, e outros reagentes que podem ser utilizados num método da divulgação. Em algumas modalidades, um kit é fornecido para o isolamento de miRNA a partir de um fluido biológico, o que inclui um kit de reagente de proteína de ligação de anti-miRNA um agente tensoativo. Os reagentes de proteína de ligação a anti-miRNA e agentes tensoativos podem ser conforme descrito na Seção (I) anterior. Em algumas modalidades, um reagente de proteína de ligação a anti-miRNA num kit é um anticorpo anti-Ago anexado a um suporte sólido. Em certas modalidades, um suporte sólido pode ser uma conta, uma esfera magnética, ou um poço de uma placa alveolar. Em outras modalidades, um suporte sólido pode ser uma superfície interna de uma ponta de pipeta. Em algumas modalidades, um agente tensoativo em um kit é IGEPAL. Um kit pode compreender ainda um meio para a libertação de miRNA dos complexos de miRNA imunoprecipitados. Em algumas modalidades, um kit compreende uma protease, por exemplo, protease K, para a libertação de miRNA dos complexos de miRNA imunoprecipitados.
DEFINIÇÕES
[0060] A não ser que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o significado que normalmente é entendido por uma pessoa versada na técnica à qual pertence esta invenção. As referências seguintes fornecem a um indivíduo versado na técnica com uma definição geral de muitos dos termos utilizados na presente invenção: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991 ); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991 ). Como usados aqui, os seguintes termos têm o significado atribuído a eles menos que especificado de outra forma.
[0061] Quando a introdução de elementos de divulgação presente ou aspectos preferidos dos mesmos, os artigos "um", "uma", "o" e "referido" destinam-se a dizer que existe um ou mais dos elementos. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais que não sejam os elementos listados.
[0062] Tal como aqui utilizado, "microRNA" ou "miRNA" significa uma sequência de RNA pequenos, não codificadores de 5 a 40 nucleotídeos de comprimento que podem ser detectados numa amostra biológica. Alguns miRNAs são derivados de precursores hairpin processados, por exemplo, pela enzima DICER a uma espécie maduras, por exemplo, cerca de 18-25 nucleotídeos, de preferência 21- 23 nucleotídeos. microRNA variantes são comuns, por exemplo, entre diferentes espécies animais. Além disso, a variação nas extremidades 5'e 3' de miRNAs são comuns, e pode ser o resultado de clivagem imprecisa por enzimas, tais como DICER durante a maturação. Estas variantes demonstram um alcance de variação aceitável na sequência dos miRNAs que não prejudicam a função ou a capacidade de detectar o miRNA (s). Outro tipo de variante é de adição de pós-processamento de Dicer dos nucleotídeos não modelado(s) para a extremidade 3' de miRNA (estes são não-modelados, porque eles não coincidem com o genoma humano). As variantes mais comuns são a sequência de miRNA com um A ou L adicional adicionado à extremidade 3'.
[0063] Tal como aqui utilizado, o termo "fluido biológico" ou "fluido corporal" podem ser utilizados alternadamente e referem-se a um fluido isolado de um indivíduo.
[0064] Os termos "fluido biológico", "amostra de fluido biológico" ou "amostra biológica" podem ser utilizados indiferentemente e referem-se a todos os fluidos biológicos e excreções isoladas a partir de um determinado sujeito. No contexto da invenção tal como exemplos incluem, mas não estão limitados ao sangue e suas frações, soro de sangue, plasma de sangue, urina, excreções, sêmen, fluido seminal, plasma seminal, fluido da próstata, fluido pré-ejaculatório (fluido de Cowper), derrame pleural, lágrimas, saliva, expectoração, suor, biópsia, ascite, fluido cerebrospinal, líquido amniótico, linfáticos, medula, secreções cervicais, secreções vaginais, secreções endometriais, secreções gastrintestinais, secreções brônquicas, secreções da mama, secreções de cisto no ovário e amostras de fluido dos tecidos.
[0065] Um polinucleotídeo "isolado" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos um contaminante com a qual está normalmente associada na sua fonte natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra que não sob a forma ou a configuração em que é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se, portanto, da molécula de ácido nucleico específica tal como existe em células naturais.
[0066] Como várias alterações podem ser feitas nas células, animais e métodos acima descritos sem partir do âmbito da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima e nos exemplos abaixo, devem ser interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitante.
EXEMPLOS
[0067] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar a divulgação. Deve ser apreciado pelos versados na técnica, que as técnicas divulgadas nos exemplos seguintes representam técnicas que os inventores descobriram funcionar bem na prática da divulgação. Indivíduos versados na técnica devem, contudo, à luz da presente divulgação, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas divulgações e ainda assim obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da divulgação, portanto, toda a matéria estabelecida deve ser interpretada como ilustrativa e não em sentido limitativo.
Exemplo 1: Geral protocolo de isolamento de miRNA.
[0068] Um protocolo representativo, utilizado para isolar miRNAs circulante compreendem realizar a imunoprecipitação de RNA (RIP), na presença de um detergente para liberar miRNAs associados a vesículas. Neste protocolo, miRNAs são separados de outros componentes celulares, tais como outros RNA, proteínas de plasma, etc., sem o uso de fenol, agentes caotrópicos, ou purificação em coluna, e pode ser completada em 40-70 minutos.
[0069] O protocolo consiste em três etapas: 1) Componentes do plasma são tratados com um detergente, 2) Complexos de miRNA/proteínas são imunoprecipitadas, e 3) miRNA é liberado a partir de complexos de miRNA imunoprecipitados.
[0070] Proteína A (Sigma-Aldrich GE28-9670-56), Proteína G (Sigma-Aldrich GE28-9670-66), esferas ou estreptavidina (Sigma-Aldrich GE28-9857-38) foram revestidas com anticorpo anti-Ago por transferência de 20 μL de esferas magnéticas (suspensão a 10%) a 0,1 ml de tampão de lavagem RIP (Tris-HCl a 50mM, pH 7,4, 0,05% IGEPAL® CA-630), lavagem das esferas com tampão de lavagem, uma vez RIP, e utilizando um suporte magnético para separar as esferas da solução. As esferas magnéticas lavadas foram então ressuspensas em 0,1 ml de tampão de lavagem antes da adição de RIP 2,5-10 μg não biotinilado ou biotinilado anti-Ago (Sigma-Aldrich SAB4800048), anticorpo anti-Ago2 (Sigma-Aldrich SAB4200085), ou anti-Ago1 (Sigma- Aldrich SAB4200084). As esferas e o anticorpo foram incubados com rotação à temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos. As esferas foram então separadas da solução usando um suporte magnético. As esferas de anticorpo foram então lavadas duas vezes com tampão de lavagem de 0,5 ml de RIP.
[0071] Na primeira etapa do processo de isolamento de miRNA, 0,2 ml de plasma, 8 μl de 25% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich I8896; 40 μl 25% de IGEPAL por ml de plasma para produzir uma concentração final de 1%), 2μl de inibidor de protease coquetel (PIC; Sigma-Aldrich P8340; 10μl/ml de plasma), e 0,8 μl de inibidor de RNase (Sigma-Aldrich R1158; 4 μl/ml de plasma) foram adicionados às esferas de anticorpo preparados Ago. Alternativamente, o plasma pode ser tratado com detergente e inibidores durante a preparação das contas, e o plasma pré-tratado posteriormente adicionado às contas de anticorpo.
[0072] Na segunda etapa, os complexos de miRNA/proteína foram imunoprecipitados por incubação da amostra à temperatura ambiente durante 1 hora ou durante a noite a 4°C com rotação. As esferas foram lavadas 5x com tampão de lavagem RIP 1 ml, e colhidas utilizando o suporte magnético para separar as esferas do sobrenadante. As esferas podem ser centrifugadas brevemente e devolvidas para o suporte magnético para remover o sobrenadante residual.
[0073] Na terceira etapa o precipitado miRNA associado a esferas de anticorpo foi liberado a partir do complexo de proteína e as contas de extração com Reagente TRI®BD ou QIAzol reagente de lise seguido por precipitação com isopropanol com acetato de amônio e acrilamida linear, como descrito no Boletim Técnico do Kit de imunoprecipitação RNA impresso Sigma-Aldrich (RIP), ou purificado com o kit de miRNeasy Soro / plasma da Qiagen. Em alternativa, e de preferência, miRNA foi liberado por digestão com proteinase K. Vinte μl da mistura de proteinase K (14 μl de água, 2 μl de 10X do tampão de libertação de proteinase K, e 4 μl P4850 proteinase K) foi adicionado às esferas de duas etapas, e incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos em vórtice Genie 2, posição 4. O 10X do tampão de liberação de proteinase K compreende 100 mM Tris, pH 8.0, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 100 mM DTT, e 1% IGEPAL. Imediatamente após a incubação, as esferas foram removidas por colocação num suporte magnético e transferindo o sobrenadante compreendendo miRNA livre para um tubo fresco. Proteinase K no sobrenadante foi então inativada por incubação da amostra a 95°C durante 5 minutos. miRNAs específicos foram detectados com os ensaios de RT-qPCR MystiCq da Sigma-Aldrich, utilizando 5 μl de cada preparação de miRNA por 10 μl de reação poliA- tailing. miRNAs sintéticos, isto é, RNA de cadeia simples com a mesma sequência que miRNAs maduros enumerados no miRBase, foram diluídos em 0,02 mg/ml de acrilamida linear de número de cópias conhecido com base na absorvância das soluções de reserva a 260 nm, ensaiado em paralelo com miRNAs preparados a partir do plasma, e utilizados como padrões para a quantificação absoluta.
Exemplo 2: A imunoprecipitação de miRNAs do plasma é mais eficaz do que isoladamente Tri Reagente.
[0074] A eficiência do isolamento de miRNA a partir de plasma usando imunoprecipitação de RNA (RIP) foi comparada com o isolamento de miRNA utilizando Reagente TRI®BD (Sigma-Aldrich). TRI Reagent®BD é um reagente para uso no isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteína a partir de derivados do sangue tais como soro, plasma ou sangue total.
[0075] Isolamento de miRNA utilizando Reagente TRI®BD foi de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 0,2 ml de plasma foi misturado com o Reagente TRI®BD, e miRNA foi extraído utilizando- se clorofórmio para a separação das fases antes da precipitação com isopropanol na presença de acetato de amônio e acrilamida linear, e a lavagem de RNA para a análise. Isolamento de miRNAs usando o RIP foi realizado com 2,5 μg de anticorpo anti-Ago2 ligado a 20 μl das esferas magnéticas da proteína A. miRNA foi recuperado a partir das esferas por extração com Reagente TRI®BD e precipitação com isopropanol na presença de acetato de amônio e acrilamida linear, como para a extração de plasma direto.
[0076] O nível de let-7a-5p, miR23a-3p, miR191-5p, miR142-3p, e miR451a miRNAs nas amostras preparadas foi determinado por quantitativo, em tempo real de RT-PCR. RIP de miRNA a partir do plasma foi de cerca de 5 a cerca de 600 vezes mais eficiente do que o TRI Reagent®BD (FIG. 1).
Exemplo 3. RIP de rendimento semelhante para produzir a partir de um kit comercial.
[0077] A eficiência do isolamento de miRNA a partir do plasma usando imunoprecipitação de RNA (RIP) foi comparada com o isolamento de miRNA utilizando o kit miRNeasy Soro/plasma da Qiagen (Qiagen). Qiagen miRNeasy emprega colunas de giro compreendendo resina de sílica que se liga seletivamente a DNA ou RNA, e é recomendado para o isolamento de miRNA < 0,2 ml de soro ou plasma.
[0078] Isolamento de miRNA utilizando o kit Qiagen miRNeasy Soro/plasma foi de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 0,2 mL de plasma foi misturado com o reagente QIAzol, e miRNA foi purificado a partir da camada aquosa utilizando as colunas de giro fornecidas. Isolamento de miRNAs usando RIP foi realizado com 20 μl das esferas magnéticas da Proteína A ao qual foi ligado 2,5 μg de anticorpos anti-Ago2. miRNAs foram liberados a partir das esferas com reagente QIAzol e purificado com o kit Qiagen, como para a extração de plasma direto.
[0079] O nível de let-7a, miR23a, miR191, miR142, e miR451a miRNAs nas amostras preparadas foi determinado por quantitativo, em tempo real de RT-PCR. Rendimento de miRNAs usando o RIP foi semelhante ao rendimento de miRNA usando o kit Qiagen sozinho (FIG. 2).
Exemplo 4. Comparando RIP usando anticorpos anti-Ago biotinilados e não biotinilados e esferas de estreptavidina.
[0080] Esferas da Proteína A e proteína G tanto de IgG humana ligam-se, o que é extremamente abundante no plasma. Para evitar o co- isolamento IgG, anti-Ago (clone 2A8) e anti-Ago2 (clone 11A9) anticorpos foram biotinilados com Pierce EZ-Link sulfo-NHS-LC-LC-Biotina (Thermo Scientific) para RIP com esferas de estreptavidina. Ago-RIP foi efetuado utilizando 2,5μg do anticorpo anti-Ago2 biotinilado (b-Ago2) ou anti-Ago (bAgo) e 20 μl de esferas magnéticas de estreptavidina, ou com 2,5 μg de anticorpo anti-Ago2 não biotinilado e 20 μl de esferas de Proteína A. RIP com anticorpo anti-Ago2 biotinilados (b-Ago2) e esferas estreptavidina deram o mesmo rendimento de miRNAs como RIP com anticorpo anti- Ago2 com esferas de Proteína A (ver FIG. 3). RIP com anti-Ago biotinilado deu significativamente mais baixos rendimentos miRNA, como eles tinham com anti-Ago não biotinilados e esferas de proteína A.
Exemplo 5. Liberação de calor de miRNA isolado utilizando RIP afeta negativamente a produtividade.
[0081] Aquecimento em água isenta de nuclease foi testado como um meio para liberar miRNAs seguindo RIP. Ago-RIP foi realizado com 0,2 ml de plasma e de 2,5 μg quer de anti-Ago não biotinilados, ou anticorpo anti-Ago2 nas esferas magnéticas da Proteína A, ou anticorpo anti-Ago biotinilado ou anti-Ago2 sobre esferas magnéticas de estreptavidina. Quatorze μl de água isenta de nuclease foi adicionado às esferas, e estas misturas foram aquecidas a 40°, 50 °, ou 60 °C durante 2 minutos antes de remover as esferas RIP seguido de libertação de calor foi comparado com RIP seguido por purificação miRNA com o Kit Qiagen miRNeasy Soro/plasma, e miRNAs purificados diretamente a partir do plasma com o kit Qiagen. cel-miR-39-3p sintética (1.4e8 cópias) foi cravado na adição após QIAzol para Qiagen prepara ou na água adicionada às esferas de pós-RIP.
[0082] cel-miR-39-3p sintética de pico foi sem ser detectado depois de 2 minutos a 60°C com o produto RIP em esferas (FIG. 4). Também não houve miRNA endógeno detectado depois de 2 minutos a 40 °, 50 ° ou 60°C. Resultados semelhantes foram observados para miR23a, miR142, miR191 e miR451a. Let7a miRNA também foi perdido, quando as amostras foram aquecidas a 50 ° ou 60°C. A perda de miRNA é provavelmente devido à RNase carry-over contaminação com RIP, uma vez que o sangue é conhecido por conter níveis extremamente elevados de RNase.
Exemplo 6. Liberação de miRNA utilizando digestão de proteinase K.
[0083] Digestão com proteinase K foi testada como um meio para liberar miRNA após Ago-RIP. RIP foi realizado com 0,2 ml de plasma e de 2,5 μg de anticorpo anti-Ago2 biotinilado ligado aos20 μl de esferas magnéticas de estreptavidina. Pós-RIP, as esferas foram incubadas em tampão de digestão (20 μl de 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, DTT 10 mM, 0,1% de IGEPAL) contendo 4 μL de proteinase K (P4850 Sigma-Aldrich) à temperatura ambiente ou a 37°C durante 10 minutos com agitação, ou a 65°C durante 2 minutos, com agitação. Depois de retirar as esferas, proteinase K foi inativada a 95°C durante 5 minutos e 5 μl de proteinase K a cada digestão foi adicionada a uma 10 μl de reação poliA-tailing para a detecção de miRNA específicos com os ensaios de RT-qPCR MystiCq da Sigma-Aldrich. Para efeito de comparação, uma preparação paralela de esferas pós-RIP foram extraídas com reagente de lise QIAzol e purificada com miRNeasy Soro/Plasma ( "total", fixado em 100%). níveis de miRNA de RIP-proteinase K foram expressos em relação aos de RIP em que miRNAs foram liberados usando o kit miRNeasy.
[0084] Liberação de miRNA utilizando digestão de proteinase K à temperatura ambiente produziu mais miRNAs do que libertação a temperaturas mais elevadas (FIG. 5). Em todos os casos, uma quantidade significativa de um total de miRNA foi perdida. A perda foi mais provável devido à RNAse residual na amostra.
[0085] Uma experiência semelhante foi realizada utilizando digestão com pepsina em tampões a pH 2, 3, ou 4 para a libertação de miRNA em vez de proteinase K. Libertação de miRNA utilizando pepsina recuperada menos de 1% de miRNA (dados não mostrados).
Exemplo 7. Comparando RIP com outros métodos de extração de miRNA a partir de fluidos biológicos.
[0086] miRNAs foram isolados utilizando esferas magnéticas estreptavidina e anti-Ago2 biotinilados e libertação de protease K essencialmente como descrito no Exemplo 6. Para comparação, miRNAs também foram purificadas diretamente a partir do plasma usando o Kit de Isolamento de RNA miRCury ™ - Biofluids de Exiqon, ou o Kit de miRneasy soro/plasma de Qiagen (FIG. 6). Estes dados mostram que os rendimentos de miRNA let7a de RNA purificado utilizando o kit de Exiqon foram 3-4 vezes mais elevados do que purificado utilizando o kit da Qiagen. Os rendimentos da maioria dos miRNAs preparados usando Ago-RIP e proteinase K liberados foram intermediários entre aqueles de Exiqon e Qiagen na maioria dos experimentos. Resultados para let7a estão apresentados FIG. 6 e FIG. 7, mas aqueles para miR23a, miR142 e miR191 foram semelhantes. Por outro lado, os rendimentos de miR451a foram semelhantes para Ago- RIP e Exiqon. miR451a requer uma atividade slicer Ago2 para processamento a um miRNA maduro e, portanto, só ocorre em complexos Ago2. Outros miRNAs podem associar com Ago1, Ago3 ou Ago4 além Ago2. Uma vez que o anticorpo utilizado é específico para Ago2, isola miR451a de forma mais eficiente do que todos os outros miRNAs maduros.
Exemplo 8. RIP com ou sem inibidores de protease e inibidores de RNAse.
[0087] Ago-RIP foi usado para isolar miRNAs na presença (+inh) ou ausência (-inh) de inibidores de protease e inibidores de RNase, e miRNAs foram liberados a partir das esferas com protease K. Ago-RIP realizado na presença de inibidores de miRNA let7a produziu mais do que as amostras que não foram tratadas com inibidores. Resultados semelhantes foram encontrados para miR191. Não houve diferença significativa para miR451a (FIG. 8).
[0088] O pré-tratamento de soro com IGEPAL com ou sem inibidores, também foi realizado (+ pré), e em comparação com a adição de IGEPAL com ou sem inibidores, ao mesmo tempo que a adição das esferas de anticorpo (-pre). Os resultados mostram que o tratamento prévio do soro com inibidores de protease e RNAse não melhoram o rendimento de um ou outro let7aor miR451a quando comparado com co-tratamento (FIG. 8).
Exemplo 9. Recuperação miRNA com ou sem detergente.
[0089] Para determinar o efeito do detergente no isolamento de miRNA, Ago-RIP foi realizado (com 0,2 ml de plasma) na presença ou ausência de detergente IGEPAL utilizando 10 μg de anticorpo anti-Ago2/ esferas magnéticas com estreptavidina biotiniladas. Supõe-se que qualquer miRNA isolado, na ausência de detergente estava livre (ou seja, não numa vesícula), e qualquer isolado na presença de detergente foi vesicular. Total de miRNA foi o nível de um miRNA recuperado a partir de plasma tratado com IGEPAL, e foi definido como 100%. miRNA livre (miRNA não associado a vesículas) foi o nível de um miRNA recuperado a partir do plasma que não foi tratado com IGEPAL. miRNA associada a vesículas foi calculada como o nível de um miRNA na amostra total miRNA subtraídas pelo nível do referido miRNA na amostra de miRNA livre. A FIG. 9 mostra os níveis livres e associados de vesículas de let7a, miR23a, miR142, e miR451a miRNAs. Estes resultados mostram que o tratamento com detergente pode ser desejável para recuperar alguns miRNAs eficientemente a partir do plasma por RIP.
Exemplo 10. RIP é escalável.
[0090] RIP foi realizada com 0,2 ml de plasma e 10 μg de esferas anti-Ago2/estreptavidina biotiniladas, ou 0,4 ml de plasma e 20 μg de esferas anti-Ago2/estreptavidina biotiniladas, seguido por libertação com digestão de proteinase K. Para comparação, miRNAs foram isoladas a partir de 0,2 ml de plasma com o mesmo kit de isolamento de RNA de miRCury Exiqon - Biofluidos. Total de rendimento de let7a, miR191, e miR451a recuperado com cada método de preparação estão apresentados na FIG. 10. Com Ago-RIP, o dobro do plasma (isto é, 0,4 ml em comparação com 0,2 ml) produziu-1,5-2 vezes mais dos miRNAs testados, a etapa que os kits baseados na coluna (tais como aqueles a partir de Exiqon e Qiagen) são de capacidade limitada e recomendam a utilização de não mais do que 0,2 ml de plasma.
Exemplo 11. Tempos de incubação e lavagem mínimas para RIP.
[0091] RIP foi realizada com 0,2 ml de plasma e 5 μg de esferas anti-Ago2/estreptavidina biotiniladas, incubados com rotação à temperatura ambiente durante 5, 15, 30, ou 60 minutos. Aqueles incubados durante 5, 15 ou 30 min foram todos lavados 5 vezes depois da incubação estar completa. Aqueles com 60 min incubações foram lavados 5, 4, 3, 2, ou 1 vezes com o tampão de lavagem RIP. Todos foram liberados com proteinase K. Os rendimentos para let7a são apresentados na FIG. 11. Os resultados mostram que um período de incubação de mais de 15 minutos parece ser necessário para a máxima recuperação de miRNA sob as condições utilizadas (por exemplo, o tipo e quantidades de anticorpo e esferas), mas apenas uma lavagem é necessária antes da detecção de miRNA com MystiCq da Sigma-Aldrich ensaios (poliA de decantação que RT, qPCR). Resultados semelhantes foram obtidos para miR122, miR191 e miR451a.
Exemplo 12. RIP é específico para miRNAs.
[0092] O exemplo que se segue foi realizado para determinar se Ago-RIP é específico para miRNAs ou se Ago-RIP também isola outros RNAs. Isolamentos foram realizados utilizando Ago-RIP (S), miRCury RNA Kit de Isolamento de Exiqon - Biofliudos (E), ou Kit de Soro miRneasy /Plasma da Qiagen (Q) de 0,2 ml de plasma fresco (experimentos 1 e 2) ou 0,2 ml de plasma congelado (experimento 3). Experimento 1 foi realizado com 2,5 μg biotinilados anticorpo anti- Ago2/20 μl de esferas de estreptavidina. Experimentos 2 e 3 foram realizados com 2,5 μg biotinilados anticorpo anti-Ago2/20 μl de esferas de estreptavidina. Digestão de proteinase K essencialmente como acima descrito no Exemplo 6 foi usado para liberar os miRNAs a partir das esferas. miRNAs específicos (por exemplo, let7a) e RNAs nucleolares ou nucleares específicos pequenos (por exemplo, RNU6 ou SNORD48) foram detectados utilizando ensaios MystiCq RT-qPCR, e mais longos ou mRNA rRNA (por exemplo, GAPDH, RN18S, RN28S) foram detectados utilizando ensaios KiCqStart® RT-qPCR (Sigma- Aldrich). O RNA total a partir de células HeLa (isolado utilizando Reagente TRI®BD) foi utilizado para os padrões de quantificação.
[0093] Como esperado, os miRNAs como let7a foram isolados usando Ago-RIP ou qualquer um dos kits baseados em colunas (ver FIG. 12A). No entanto, outros pequenos RNAs ou grandes RNAs não foram isolados por Ago-RIP, mas foram isolados com kits Exiqon e Qiagen. Como mostrado na FIG. 12B e FIG. 12C, pouco ou nenhum RNU6, SNORD48, GAPDH, RN18S, ou RN28S RNAS foram isolados utilizando Ago-RIP, mas todos estes tipos de RNA foram isolados com os kits Exiqon e Qiagen. Assim, Ago-RIP isola especificamente apenas miRNAs.
Exemplo 13. A utilização de ambos os anticorpos anti-Agol e anticorpos anti-Ago2 aumenta o rendimento RIP.
[0094] Desde diferentes miRNAs associados a diferentes proteínas Ago, é possível que os rendimentos de certos miRNAs poderiam ser melhorados através da utilização combinada de anticorpos contra proteínas diferentes Ago. Assim, miRNAs foram isolados a partir de 0,2 ml de plasma, utilizando 10 μg de anticorpo anti-Ago1/20 μl de esferas de Proteína A, 10 μg anticorpo anti-Ago2 /20 μl de esferas de Proteína A, ou 20 μl de uma mistura 1:1 de cada tipo de esfera anticorpo. A libertação dos miRNAs das esferas foi realizada utilizando QIAzol reagente de lise e purificado com o kit de Qiagen, essencialmente como descrito acima no Exemplo 3. miRNAs específicos (por exemplo, let7a, miR142-3p, miR122, miR191 e miR451a) foram detectados utilizando ensaios MystiCq RT-qPCR.
[0095] Como mostrado na FIG. 13, rendimentos utilizando ambos os anticorpos juntos foram aproximadamente a soma de cada anticorpo utilizado separadamente. Para a maioria dos miRNAs, o uso de anti- Ago2 resultou com um rendimento maior do que o uso de anti-Ago1. No entanto, mais miR122 foi recuperado quando se utilizou anti-Ago1, o que é consistente com Turchinovich et al., 2012, RNA Biology 9(8):1066- 75). Além disso, miR451a só foi recuperado com anti-Ago2, tal como explicado acima no Exemplo 7.

Claims (15)

1. Método para o isolamento de microRNA (miRNA) a partir de uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar em contato a amostra biológica com (i) um agente tensoativo selecionado a partir de um tensoativo aniônico, um tensoativo não-iônico, e combinações de tensoativo aniônico e/ou tensoativo não-iônico, em que a concentração do agente tensoativo na amostra biológica contatada é de 0,001 a 10%, e (ii) um anticorpo anti-Argonauta, em que 0,5 a 10 μg de anticorpo anti-Argonauta são usados para cada 0,2 mL de amostra biológica, em que o agente tensoativo dissocia componentes da amostra biológica e o anticorpo anti-Argonauta interage com uma proteína de ligação a miRNA associada a miRNA para formar complexos de miRNA imunoprecipitados, e em que a amostra biológica, o pelo menos um agente tensoativo e o anticorpo anti-Argonauta são colocados em contato a temperatura ambiente; e (b) colocar em contato os complexos de miRNA imunopreci- pitados com proteinase K a temperatura ambiente para liberar miRNA a partir dos complexos de miRNA imunoprecipitados sem purificação.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração do agente tensoativo na amostra biológica contatada é de 0,001 a 0,01%; de 0,01 a 0,1%; de 0,1 a 1%; de 1 a 5%; ou de 5 a 10%.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica compreende miRNA vesicular e miRNA não vesicular.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é plasma ou soro.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um agente tensoativo é selecionado a partir de polioxietileno (20) monolaurato de sorbitol; polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitol; polioxietileno (20) mono- oleato de sorbitol, desoxicolato de sódio, lauril sulfato de sódio e combinação dos mesmos.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é colocada em contato com o agente tensoativo e o anticorpo anti-Argonauta simultaneamente.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica, o agente tensoativo e o anticorpo anti-Argonauta são incubados por 30 minutos.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-Argonauta está ligado a um suporte sólido.
9. Método, de acordo, com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é esfera magnética.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o contato com a proteinase K procede por 10 minutos.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o miRNA liberado do complexo de miRNA imunoprecipitado é livre de outros tipos de moléculas de RNA.
12. Kit para isolamento microRNA de uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro agente tensoativo que compreende (octilfenoxi)polioxietanol, (b) um segundo agente tensoativo que compreende desoxicolato de sódio e lauril sulfato de sódio, (c) um anticorpo anti-Argonauta, e (d) proteinase K.
13. Kit, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-Argonauta está ligado a um suporte sólido.
14. Kit, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é uma esfera magnética.
15. Kit, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-Argonauta é capaz de se ligar a Ago1, Ago2, Ago3 e/ou Ago4.
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