CN107406892B - 捕获精子核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了方法，其中在样品中捕获精子脱氧核糖核酸(DNA)的方法包括使裂解溶液与至少包含精子细胞或精子细胞裂解物的样品接触以裂解精子细胞。精子细胞或精子细胞裂解物包含鱼精蛋白‑DNA复合物。该方法还包括向裂解的精子细胞施加至少一种鱼精蛋白特异性抗体，其中鱼精蛋白特异性抗体结合裂解的精子细胞的鱼精蛋白‑DNA复合物以形成抗体‑鱼精蛋白‑DNA复合物。抗体结合后，捕获抗体‑鱼精蛋白‑DNA复合物；并从捕获的抗体‑鱼精蛋白‑DNA复合物中分离和检测精子DNA。

Description

捕获精子核酸的方法
技术领域
本发明一般涉及从生物样品中捕获精子核酸的方法。本发明还涉及使用染色质免疫沉淀(CHIP)捕获精子脱氧核糖核酸(DNA)的方法。
背景
与性攻击相关而回收的样品通常是不同细胞类型的混合物，包括上皮细胞，红细胞，白细胞，各种阴道菌群(例如乳杆菌)，精子细胞和细菌，病毒或真菌污染物。当性攻击是例如口腔攻击或肛门攻击时，样品还可以包含口腔上皮细胞，口腔菌群，肠上皮细胞，结肠上皮细胞或存在于例如粪便中的其它细菌细胞。捕获和检测样品例如性攻击样品中的精子DNA是应用例如法医应用或诊断应用的主要要求。
已经开发了不同的技术来捕获和/或检测来自样品的精子DNA，包括：使用Y染色体探针来区分雄性DNA的DNA指纹，限制性片段长度多态性(RFLP)或可变数目串联重复序列(VNTR)以确定精子DNA的具体模式。核和细胞质染色也可能有助于鉴定精子细胞，然而，染色方法依赖于精子细胞的完整形状，当出现在性攻击样品中时，这可能无法获得。这些方法是复杂的，因为它们需要多个步骤并且需要大量的起始DNA。为了实现所需的起始DNA浓度，已经开发了多种技术，其可以包括靶DNA的扩增。在扩增中，污染物质也可能被扩增，并且基于扩增的检测缺乏检测扩增DNA的细胞来源的特异性。通常，在这些应用之前是从不想要的核酸和污染物中分离和纯化靶DNA，以减少下游应用中的干扰并达到期望的结果。然而，传统的纯化或分离方法和相关技术是复杂的、时间和劳动密集型的。
在精子细胞中，体细胞中发现的组蛋白蛋白质大部分被鱼精蛋白(PRM 1和PRM 2)所取代，并且允许在精子成熟过程中进一步进行DNA浓集。鱼精蛋白在人类精子中相对于体内其它细胞独特地表达，并且用作与精子细胞中的DNA相关的高度特异性因子。鱼精蛋白的存在在物种间是高度保守的。
染色质免疫沉淀(ChIP)是通过相关蛋白的亲和捕获分离特异性DNA的完全确定的方法。传统上ChIP已被用于转录因子作图到活性基因启动子区，最近已经适用于分析DNA和相关组蛋白蛋白质的表观基因组及其各自的修饰。ChIP已被用于分离鱼精蛋白DNA复合物，但从未用于从包含不同类型细胞的样品中纯化精子特异性DNA。
非常需要一种在混合的性攻击案件样品中从包含受害者细胞和攻击者细胞的样品中分离攻击者的DNA，特别是来自精子细胞的DNA，以进行后续分析的简化方法。
发明内容
本发明一般涉及用于从生物样品中捕获精子核酸的方法和试剂盒。在某些实施方案中，生物样品可以固定在固体支持物上。在其它实施方案中，生物样品可以来自射精后三天或更多天的精子。
在生物样品中捕获精子脱氧核糖核酸(DNA)的方法的一个实施方案包括使生物样品与裂解溶液接触，其中生物样品至少包含精子细胞或精子细胞裂解物，其中裂解的生物样品溶液包含鱼精蛋白-DNA复合物；向裂解的生物样品施加至少一种鱼精蛋白特异性抗体，其中鱼精蛋白特异性抗体结合裂解的精子细胞的鱼精蛋白-DNA复合物以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；和从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中检测精子DNA。
在生物样品中捕获精子脱氧核糖核酸(DNA)的方法的另一个实施方案包括提供至少包含精子细胞、部分裂解的精子细胞或精子细胞裂解物的样品，其中所述精子细胞、部分裂解的精子细胞或精子细胞裂解物包含鱼精蛋白-DNA复合物；使裂解溶液与样品接触以裂解精子细胞或部分裂解的精子细胞；向裂解的精子细胞施加至少一种鱼精蛋白特异性抗体，其中鱼精蛋白特异性抗体结合裂解的精子细胞的鱼精蛋白-DNA复合物以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；通过添加捕获剂捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；和通过DNA扩增反应从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中检测精子DNA。
在另一个实施方案中，从生物样品中纯化脱氧核糖核酸(DNA)的方法包括提供包含鱼精蛋白-DNA复合物的生物样品；向鱼精蛋白-DNA复合物施加至少一种鱼精蛋白特异性抗体以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；使用捕获剂捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；和从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中纯化DNA。
在另一个实施方案中，还提供用于捕获固定在固体基质上的生物样品中的精子脱氧核糖核酸(DNA)的试剂盒，其包含鱼精蛋白特异性抗体、捕获剂和裂解缓冲液，用于捕获精子核酸。
附图简述
图1是说明根据本发明实施方案的实例的方法的流程图。
图2是显示根据本发明实施方案的一个实例，用不同细胞裂解试剂在不同条件下的细胞裂解的百分数的图。
图3是说明根据本发明实施方案的实例，在不同条件下在拉下(pull-down)测定法后DNA产量的柱状图。
图4是显示根据本发明实施方案的另一实例，在不同条件下十二烷基硫酸钠(SDS)隔离的柱状图。
图5是显示精子基因组材料的超声处理结果的DNA凝胶电泳图。可以使用诸如超声处理的机械力来剪切精子染色质。
图6是显示侧向流动下小于10千碱基的DNA迁移的DNA凝胶电泳图。
图7是显示侧向流动下大小范围为8.3至48.5千碱基的DNA迁移的DNA凝胶电泳图。
图8是显示侧向流动下大于48.5千碱基的DNA迁移的DNA凝胶电泳图。
图9是蛋白质印迹的图像，显示根据本发明实施方案的实例，在不同条件下在拉下测定法后对样品的固定效果。
图10是DNA凝胶电泳图像，显示根据本发明实施方案的实例，在不同条件下对从拉下测定法中回收的DNA样品的固定效果。
图11是柱状图，显示根据本发明实施方案的另一个实例，来自包含不同细胞类型的样品的精子DNA的差异捕获。
图12是显示进行直接裂解(如在精子DNA捕获中)相对于在裂解之前从基质中分离细胞(如在差异提取中)的改善的DNA产量的图。
图13是显示用微球菌核酸酶处理来自上皮细胞和精子细胞(下图)的基因组材料的结果的DNA凝胶电泳图。
图14是显示用微球菌核酸酶处理来自精子细胞(下图)的基因组材料的结果的DNA凝胶电泳图。
图15是显示在性交后9天采集的样品的精子DNA捕获结果的图。
发明详述
各种实施方案提供了捕获来自包含非靶核酸和不需要的污染物的生物样品的靶核酸，例如精子脱氧核糖核酸(精子DNA)的适当方法。该方法还包括靶核酸的检测和分析。通过染色质免疫沉淀(ChIP)将靶核酸作为蛋白质-DNA复合物从生物样品分离，然后使用捕获剂捕获蛋白质-DNA复合物。
为了更清楚和简明地描述所要求保护的发明的主题，为具体术语提供以下定义，其用于以下描述和所附权利要求书。在整个说明书中，具体术语的例证应被视为非限制性实例。
单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。本文在整个说明书和权利要求书中使用的近似用语可用于修饰可允许变化而不导致与之相关的基本功能改变的任何定量表示法。因此，被术语例如“约”修饰的值不限于所规定的精确值。在某些情况下，近似语可与用于测量该值的仪器的精确度一致。需要时，可提供范围，且这些范围包括其之间的所有子范围。
本文提及的术语“核酸”包含所有形式的DNA (例如基因组DNA、mtDNA)或RNA(mRNA、tRNA、rRNA、小RNA、siRNA、miRNA、非编码RNA、动物RNA、植物RNA、病毒RNA或细菌RNA)以及重组RNA和DNA分子或使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可以是单链或双链的。核酸可包括编码或非编码链。该术语还包括可采用公开的提取方法回收的核酸例如天然存在的RNA或DNA的片段。核酸还可指核酸(例如RNA或DNA)的一部分。提取的核酸还可包含肽核酸(PNA)。
捕获的核酸，例如精子DNA可以是单链或双链的。捕获的精子DNA的分子量也没有限制，可任选为几个碱基对(bp)至几百万个碱基对(Mbp)的范围。
如本文所用，术语“精子DNA”是指由精子细胞贡献的雄性精液样品中特异性存在的DNA。精子DNA序列是雄性来源的，其期需被抗体捕获。期需从包含多种细胞和污染物的样品中检测精子DNA，并另外在扩增反应中扩增用于进一步分析。精子DNA可以从诸如体液(例如精液)的生物样品获得。精子DNA可以从被精子DNA污染或含有精子DNA的任何材料或生物样品获得，例如织物、皮革或组织、细胞、细胞裂解物、法医样品、古旧样品或被精子DNA污染的阴道拭子。生物样品含有或怀疑含有从人类来源获得的精子DNA。
在某些实施方案中，通过获得用于法医试验的样品，例如使用rape试剂盒加工，将生物样品固定在固体基质上。因此，基质可以包括但不限于纤维素材料或硝化纤维素、聚酯、天然或非天然纤维。基质可以是用于收集口腔、阴道或肛门样品的拭子的形式。基质也可以来自获得的衣服片，例如粗斜纹棉布、棉、聚酯、尼龙或其它织物，其可被认为被精子样品污染。仍然在其它实施方案中，基质可以是基于玻璃纤维或石英的。
“模板核酸”定义为可以被扩增的DNA。例如，模板DNA是从法医样品中捕获的精子DNA。在DNA扩增反应中可以通过DNA聚合酶扩增精子DNA，从而产生精子DNA的扩增产物。
如本文所用，术语“捕获剂”是指对鱼精蛋白特异性抗体具有亲和力的试剂、蛋白质、肽或核酸，所述鱼精蛋白特异性抗体进一步结合在鱼精蛋白-DNA复合物中。在一些实施方案中，在施加于样品之前，将捕获剂与本文中称为鱼精蛋白特异性抗体的第一抗体预偶联。捕获剂也可以单独加入到包含抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的样品中。例如，捕获剂对“抗体-鱼精蛋白-DNA复合物”具有亲和力。
如本文所用，dNTP混合物是指三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，其中N是包括A、C、G或T/U中的任一者的随机核苷酸。
如本文所用，“引物”或“引物序列”是指与靶核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA))杂交以引发核酸扩增反应的短线性寡核苷酸。引物可以是核糖核酸(RNA)寡核苷酸，DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物可以含有天然的、合成的或修饰的核苷酸。经验确定引物长度的上限和下限。引物长度的下限是在核酸扩增反应条件下与靶核酸杂交时形成稳定双链体所需的最小长度。非常短的引物(通常小于3-4个核苷酸长)在这种杂交条件下与靶核酸不形成热力学稳定的双链体。上限通常由在靶核酸中的预定核酸序列以外的区域中具有双链体形成的可能性来确定。作为非限制性实例，合适的引物长度通常在约4至约40个核苷酸长度的范围内。也可以使用引物捕获核酸序列。
如本文所用，术语“扩增”、“核酸扩增”或“扩增”是指产生核酸模板的多个拷贝，或产生与核酸模板互补的多个核酸序列拷贝。
如本文所用，术语“DNA聚合酶”是指以核酸链作为模板从头合成DNA链的酶。DNA聚合酶使用现有的DNA或RNA作为DNA合成的模板，并催化脱氧核糖核苷酸沿其读取的模板链的聚合。新合成的DNA链与模板链互补。DNA聚合酶可以仅向新形成的链的3'-羟基末端添加游离核苷酸。它通过将核苷单磷酸从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)转移到生长中的寡核苷酸链的3'-羟基来合成寡核苷酸。这导致新链在5＇→3＇方向的伸长。由于DNA聚合酶只能在预先存在的3'-OH基团上加入一个核苷酸，为了开始DNA合成反应，DNA聚合酶需要可以添加第一个核苷酸的引物。合适的引物包含RNA或DNA或核苷酸类似物的寡核苷酸。DNA聚合酶可以是具有上述活性的天然存在的DNA聚合酶或天然酶的变体。例如，其可以包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5＇→3＇核酸外切酶活性的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶或具有外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
本文提及的术语“还原剂”包括向另一种化学物质提供电子的任何化学物质。各种还原剂是本领域已知的。还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。此外，可以使用这些或其它还原剂的任何组合。在具体实施方案中，还原剂是DTT。
如本文所用，术语“扩增缓冲液”包括但不限于2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(Tris)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、柠檬酸盐缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)和磷酸盐缓冲液。扩增缓冲液还包括例如Tris-HCl、硫酸二铵、一价阳离子(例如KCl)、二价阳离子(例如MgSO4)或Tween®20。该可能的缓冲液列表仅用于说明目的。缓冲液的pH通常滴定在6至8的范围内。在一些实施方案中，缓冲液包含dNTP、BSA或其组合。
如本文所用，术语“分离(separate、separating或separation)”表示从样品溶液的非靶核酸和/或不需要的污染物分离或纯化靶核酸例如精子DNA的行为或行动。
术语“生物样品”旨在包括各种生理或临床生物来源，其包括核酸，特别是精子DNA。这些来源包括但不限于组织，包括活检材料和抽吸物；体液例如尿液、痰液、精液、分泌物和吸出细菌细胞；和DNA可能在其中的任何其它来源。术语“生物样品”在本文中可与“样品”互换使用。样品可以是性攻击法医样品，其可能具有来自多于一个供体的核酸。性攻击样品可包含来自受害者和攻击者的细胞。样品可以包含上皮细胞或上皮DNA、精子细胞或精子DNA、细菌细胞或病毒细胞污染物、微生物或其组合。
在广义上使用“包含至少一个精子细胞的生物样品”，并且旨在至少包括精子细胞、部分裂解的精子细胞或精子细胞裂解物。在精子细胞裂解物的情况下，精子细胞被裂解，细胞提取物可能存在于样品中。在一些实施方案中，样品含有精子头、精子尾巴、精子染色质、完整精子细胞或其组合。裂解的精子细胞或部分裂解的精子细胞通常存在于旧样品中。样品溶液是包含精子细胞、精子细胞组分或精子细胞提取物的溶液，其包含溶解、悬浮、混合或以其它方式包括在其中的DNA和RNA中的任一种或两种。
如本文所用，术语“裂解溶液”指能够裂解精子细胞的溶液。通常，精子头富含二硫键，因此对传统的裂解具有抗性。本文使用的裂解溶液包含还原剂和洗涤剂。裂解溶液可以包含二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。裂解溶液可以进一步包含选自十二烷基硫酸钠(SDS)的洗涤剂。在一些实施方案中，SDS的存在显示精子细胞、上皮细胞或其它不同细胞类型的快速裂解。
提供从生物样品中捕获精子DNA的方法的一个或多个实施方案。在这些实施方案中，该方法包括使裂解溶液与至少包含精子细胞或精子细胞裂解物的生物样品接触，其中精子细胞与裂解溶液接触时裂解。精子细胞或精子细胞裂解物通常包含鱼精蛋白-DNA复合物。在精子细胞裂解时，从精子细胞中提取出鱼精蛋白-DNA复合物。在这些实施方案中，该方法还包括向裂解的精子细胞(或精子细胞裂解物)施加至少一种鱼精蛋白特异性抗体。鱼精蛋白特异性抗体结合从裂解的精子细胞提取的鱼精蛋白-DNA复合物以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物。鱼精蛋白特异性抗体在本文中可与“第一抗体”互换使用。该方法还包括捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物并从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中检测精子DNA。
图1说明了不同的方法步骤，包括细胞裂解，处理以除去或中和过量的裂解溶液，随后加入抗体并与细胞裂解物孵育以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物，随后使用捕获剂纯化抗体-鱼精蛋白-DNA复合物例如第二抗体或珠。在一些实施方案中，可以洗涤捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物被重复洗涤。通过与离子交换树脂孵育从捕获剂中回收精子DNA，并且回收的精子DNA准备好进行扩增。
在该方法的一些实施方案中，将裂解溶液加入到至少包含精子细胞或精子细胞裂解物的样品中，其中精子细胞或精子细胞裂解物包含鱼精蛋白-DNA复合物。如上所述，样品可以至少包含精子细胞、部分裂解的精子细胞或精子细胞裂解物。活精子细胞或部分裂解的精子细胞可以通过使用裂解溶液完全裂解。当细胞与裂解溶液(或裂解试剂)接触时细胞被裂解，以从精子细胞提取核酸(精子DNA)。在一种方法的实例中，裂解溶液包含离液物质、洗涤剂和/或其它裂解试剂。
本文中术语“裂解溶液”可以与“裂解试剂”互换使用。如上所述，裂解溶液可以包括离液物质或离液剂。离液物质的实例包括但不限于盐酸胍、氯化胍、异硫氰酸胍/硫氰酸胍、硫氰酸钠、高氯酸钠、碘化钠、碘化钾、脲和/或其任何组合。典型的阴离子离液系列，以递减离液强度的顺序示出，包括：CCl3COO-、CNS-、CF3COO-、ClO4 -, I-、CH3COO-、Br-、Cl-或CHO2 -。裂解溶液可以包括浓度为0.1M至10M，或1M至10M的离液物质。
在一些实施方案中，裂解溶液还包含足够量的缓冲液。用于裂解溶液的缓冲液的实例包括三-(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、磷酸钠、乙酸钠、四硼酸钠-硼酸和甘氨酸-氢氧化钠。
在一些实施方案中，裂解溶液还可以包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂和/或其任何组合。示例性非离子表面活性剂包括但不限于叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100TM)、(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALTMCA-630/NP-40)、三乙二醇单月桂醚(BRIJTM 30)、去水山梨糖醇单月桂酸酯(SPANTM 20)或聚山梨酯家族的化学品，例如聚山梨酯20(即TWEENTM 20)、TWEENTM 40、TWEENTM 60和TWEENTM80 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.)。阳离子表面活性剂的实例包括十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵和氯化十六烷基吡啶鎓。裂解溶液中表面活性剂的浓度可以在不同的表面活性剂中略有变化，并且取决于要裂解的生物样品中的组分。在一些实施方案中，表面活性剂的浓度在约0.01重量％至约20重量％的范围内。
裂解溶液可以包含还原剂、洗涤剂或其组合。在一些实施方案中，裂解溶液包含选自二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合的还原剂。在一个实施方案中，裂解溶液包括DTT。裂解溶液可以包含40mM DTT。在一些实施方案中，裂解溶液包含选自十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠(SLS)或月桂酰肌氨酸钠(sarkosyl)的离子洗涤剂。裂解溶液可以包含0.5％至2％的SDS。裂解溶液可以包含0.5％至2％的SLS。裂解溶液可以包含0.5％至2％的sarkosyl。在一个实施方案中，裂解溶液包含40mM DTT、0.5％至2％十二烷基硫酸钠(SDS)或其组合。
精子细胞头富含二硫键，从而对传统的裂解具有抗性。裂解溶液可以使精子细胞快速裂解，其中裂解溶液包含洗涤剂例如SDS和/或还原剂，例如DTT。在一些实施方案中，SDS在裂解溶液中的存在显示精子细胞、上皮细胞或其它不同细胞类型的快速裂解。标准的组蛋白-DNA复合体通常被SDS处理破坏(S.Z Bathaie, A.A Moosavi-Movahedi, BRanjbar, A.A Saboury, A mechanistic study of the histone H1-DNA complexdissociation by sodium dodecyl sulfate, Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, Volume 28, Issue 1 1 April 2003, Pages 17-25, ISSN 0927-7765)。还使用包含DTT和TCEP的裂解溶液来确定所需的还原剂和最佳的裂解条件(图2)。向含有SDS的裂解溶液中加入DTT显示精子细胞的快速裂解(少于5分钟)(图2)。尽管精子细胞被含SDS的裂解溶液裂解，但令人惊讶的是，鱼精蛋白-DNA复合物不受使用相同裂解溶液影响，这是意想不到的结果，如图3所示。在同一个实验中，蛋白质-DNA复合物的稳定化也使用通常用于ChIP方法的固定试剂来测定。图3确定了鱼精蛋白-DNA复合物的免疫沉淀不需要固定条件的事实。图3进一步说明，在用含有SDS的缓冲液反复洗涤捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物之后，鱼精蛋白-DNA相互作用保持完整且不受影响，这是意想不到的结果。鱼精蛋白和DNA的相互作用足够强大以抵抗SDS处理，这提供了使用SDS进行精子细胞裂解的机会，而不会干扰提取的鱼精蛋白-DNA相互作用。
抗体结合和核酸扩增反应可能受到一种或多种抑制剂或污染物的影响。污染物可能由细胞裂解引起，例如细胞碎片或其它的细胞器，或污染物可能存在于添加的试剂中，例如裂解溶液。污染物可能对下游过程具有抑制作用，并且可能需要去除或中和。在一些实施方案中，通过洗涤除去污染物。在另一个实施方案中，通过加入试剂中和污染物的作用。在一个实施方案中，通过加入一种或多种试剂除去包含洗涤剂的过量裂解溶液。
在一个或多个实施方案中，使用洗涤步骤从样品中除去裂解溶液(裂解试剂)。在一些实施方案中，裂解溶液包含SDS，其对抗体与鱼精蛋白-DNA复合物结合的下游应用具有抑制作用。SDS也干扰使用DNA聚合酶的扩增反应。在这些实施方案中，需要在进行抗体结合和扩增反应之前消除裂解溶液的SDS。
在一些实施方案中，所述方法还包括在完全裂解精子细胞后从样品和裂解溶液的混合物中除去或隔离过量裂解溶液。在这些实施方案中，在将鱼精蛋白特异性抗体施加于样品之前，除去或隔离过量裂解溶液。向样品中加入裂解溶液后形成混合物，在本文中称为“裂解后溶液”。裂解后溶液通常包含裂解细胞、细胞提取物、细胞碎片、过量裂解溶液、过量洗涤剂和其它污染物。
在一些实施方案中，从裂解后溶液中除去过量的裂解溶液可以通过醇沉淀裂解后溶液中存在的核酸，然后洗涤沉淀来实现。洗涤的沉淀核酸可以使用缓冲液重构成核酸溶液。核酸溶液可以与鱼精蛋白特异性第一抗体孵育，用于抗体与鱼精蛋白-DNA复合物的结合。
在一些实施方案中，过量裂解溶液的洗涤剂自裂解后溶液隔离。在一些实施方案中，所述方法还包括在细胞裂解之后施加隔离剂以隔离裂解后溶液中存在的过量洗涤剂，然后将鱼精蛋白特异性抗体施加于包含裂解的精子细胞的裂解后溶液。在一些实施方案中，隔离剂包括用尺寸排阻壳涂覆的配体活化的核心珠、α-环糊精、尺寸排阻树脂或其组合。用尺寸排阻壳涂覆的配体活化的核心珠的实例是CaptoTM核心珠(GE HealthCare LifeSciences，Piscataway，NJ)。在这些实施方案中，洗涤剂例如裂解溶液的SDS可以使用不同的隔离剂，例如CaptoTM核心珠、α-环糊精、尺寸排阻树脂或其组合来进行特异性隔离。尺寸排阻树脂可以包括sephadex G-50，其可以用于从裂解后溶液中隔离洗涤剂。隔离过量裂解试剂(例如SDS)后的裂解后溶液在本文中称为“不含洗涤剂的样品溶液”。术语“不含洗涤剂的样品溶液”是指从溶液中大量去除洗涤剂，或者该去除足以使洗涤剂(SDS)的水平低于抑制浓度。添加CaptoTM核心700珠以隔离SDS足以使洗涤剂(SDS)的水平低于抑制浓度，如图4所示。
精子细胞的裂解导致提取精子细胞中存在的鱼精蛋白-DNA复合物。鱼精蛋白-DNA复合物是鱼精蛋白特异性抗体的靶标，然后从鱼精蛋白-DNA复合物分离和检测精子DNA。鱼精蛋白是一种小的富含精氨酸(碱性)的核蛋白，其介导正常的精子头浓集和DNA稳定化。鱼精蛋白在人类精子中相对于体内其它细胞独特表达，因此提供了与精子细胞中存在的DNA相关的高度特异性因子。通常人类具有两种或更多种不同的鱼精蛋白，例如鱼精蛋白1(PRM1)和鱼精蛋白2(PRM2)。人鱼精蛋白1基因编码51个氨基酸的蛋白质，而人鱼精蛋白2基因编码102个氨基酸的蛋白质。大部分的人类精子DNA与鱼精蛋白结合，只有一小部分与组蛋白结合。鱼精蛋白最终在精子发生的单倍体阶段后期替代组蛋白。在成熟的精子细胞中，DNA与鱼精蛋白形成复合物，其在本文中称为“鱼精蛋白-DNA复合物”。本方法的目的是从存在于不含洗涤剂的样品溶液中的鱼精蛋白-DNA复合物捕获和分离精子DNA，所述溶液还含有上皮细胞、其它不同的细胞类型或细胞裂解物。
如所指出的，所述方法还包括将至少一种鱼精蛋白特异性抗体施加于包含裂解的精子细胞的不含洗涤剂的样品溶液。术语“施加”可以包括使用管、拭子、移液管、导管(catheter)、注射器、导管(conduit)、自动注射器或使用任何其它适用的方式/工具，将至少一种鱼精蛋白特异性抗体接触或布置至裂解的精子细胞。在一些实施方案中，鱼精蛋白特异性抗体可以倒在裂解的精子细胞上。
含有裂解的精子细胞的不含洗涤剂的样品溶液，其中裂解的精子细胞或精子细胞裂解物包含鱼精蛋白-DNA复合物。用作抗原-抗体相互作用的抗原的鱼精蛋白，其中本文所用的抗体是鱼精蛋白特异性抗体(第一抗体)。鱼精蛋白特异性抗体对蛋白质“鱼精蛋白”具有亲和力，并且当鱼精蛋白特异性抗体与鱼精蛋白接触时与鱼精蛋白结合。在一个或多个实施方案中，鱼精蛋白特异性抗体与从裂解的精子细胞提取的“鱼精蛋白-DNA复合物”的鱼精蛋白结合。在这些实施方案中，鱼精蛋白特异性抗体形成“抗体-鱼精蛋白-DNA复合物”。
在一些实施方案中，包含裂解的精子细胞与鱼精蛋白特异性抗体的不含洗涤剂的样品溶液需要在某些条件下孵育一段时间，例如1小时至5小时以获得最大的鱼精蛋白-抗体结合。在约4℃至约37℃的温度下的孵育期间，鱼精蛋白特异性抗体可以结合鱼精蛋白-DNA复合物。鱼精蛋白特异性抗体可以在4℃下在约10分钟至约4小时范围内的时间段的孵育期间与鱼精蛋白-DNA复合物结合。在一些实施方案中，鱼精蛋白特异性抗体可以在4℃下在约10分钟至约30分钟范围内；在约10分钟至约1小时范围内；在约10分钟至约2小时范围内；在约10分钟至约3小时范围内的时间段的孵育期间与鱼精蛋白-DNA复合物结合。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物，其中通过使用捕获剂实现捕获。捕获剂捕获存在于不含洗涤剂的样品溶液中的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物。术语“捕获”可以包括但不限于抗体-鱼精蛋白-DNA复合物与捕获剂的物理相互作用或抗体-鱼精蛋白-DNA复合物与捕获剂的化学相互作用。捕获剂可以包含第二抗体、琼脂糖珠、磁珠、顺磁珠、蛋白A、链霉抗生物素蛋白、sephadex珠、玻璃珠或其组合。在一个实施方案中，捕获剂是对鱼精蛋白特异性抗体特异性的第二抗体，其中鱼精蛋白特异性抗体用作第一抗体。在一个实例中，使用蛋白质-A缀合的琼脂糖CL-4B珠(GE Healthcare)亲和纯化抗体-鱼精蛋白-DNA复合物。在该实例中，蛋白A与存在于抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中的抗体结合。在另一个实例中，使用山羊抗兔IgG缀合的磁珠亲和纯化兔抗鱼精蛋白IgG-鱼精蛋白-DNA复合物，其中山羊抗兔IgG相对于兔抗-鱼精蛋白IgG第一抗体用作第二抗体。
在一些实施方案中，捕获剂与鱼精蛋白特异性抗体预偶联。在这些实施方案中，抗体和捕获剂在将抗体施加于精子细胞裂解物(或裂解的精子细胞)之前偶联在一起。术语“偶联”是指捕获剂和抗体之间的物理附着、化学附着、键合或交联。抗体和捕获剂可以通过共价相互作用偶联。官能团，例如伯胺、巯基和糖基通常可用于抗体修饰，例如标记、交联或共价结合。
本文可与“第一抗体”互换使用的鱼精蛋白特异性抗体可以用可容易检测的试剂进行标记。在一些实施方案中，添加到样品中的抗体用可检测部分标记，其可以包括但不限于亲和标签、染料、酶底物或磁性探针。例如，具有马来酰亚胺或碘乙酰基的试剂对巯基引导的缀合是有效的。可以使用不同的生物素、荧光和酶标记试剂，其用马来酰亚胺基团预活化。在一个实例中，通过使用链霉抗生物素蛋白珠捕获生物素缀合的第一抗体。在说明性实施方案中，亲和探针是生物素，其是相对较小的(244.3道尔顿)配体，并且可以与对其生物活性改变最小的许多蛋白质和其它分子缀合。在另一个实施方案中，可以使用生物素标签来促进使用与酶、荧光团或其它报告分子缀合的生物素结合蛋白的检测。优化的生物素-探针比可以大大增加检测系统的信号输出，这为检测系统提供足够的信号。可以通过从样品溶液中离心或物理分离来纯化生物素结合的鱼精蛋白-DNA复合物。在另一个实施方案中，与抗鱼精蛋白IgG缀合的磁珠用于捕获鱼精蛋白-DNA复合物。然后在磁场下从溶液中纯化磁珠结合的鱼精蛋白-DNA复合物，其中分离磁珠结合和未结合的组分。在这些实施方案中，将捕获剂，例如磁珠预偶联到抗体。
在一些其它实施方案中，通过向包含抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的不含洗涤剂的样品溶液中加入捕获剂来实现抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的捕获。在这些实施方案中，捕获剂与鱼精蛋白特异性抗体结合。如上所述，可以向存在于不含洗涤剂的样品溶液中的第一抗体(鱼精蛋白特异性抗体)结合的鱼精蛋白-DNA复合物中加入捕获剂，例如第二抗体、琼脂糖珠、磁珠、顺磁珠、蛋白A、链霉抗生物素蛋白、sephadex珠、玻璃珠或其中两种或更多种的组合。捕获剂对鱼精蛋白特异性第一抗体具有亲和力，并结合抗体-鱼精蛋白-DNA复合物。捕获剂结合的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物在本文中称为“捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物”。
在另一个实施方案中，通常在性交后最多五天的窗口期收集的样品现在可以最多九天被收集。这是可以实现的，因为作用于鱼精蛋白结合的DNA，而不是摄入精子或精子头的测定性质。使用基于Y染色体特异性检测PCR的测定法，在相似的时间范围检测到雄性DNA。
在一些其它实施方案中，通过使包含鱼精蛋白-DNA复合物的不含洗涤剂的样品溶液流动通过捕获剂例如侧向流动条或亲和柱来实现鱼精蛋白-DNA复合物的捕获。在这些实施方案中，鱼精蛋白特异性抗体与捕获剂结合。具有结合的鱼精蛋白特异性第一抗体的捕获剂对鱼精蛋白-DNA复合物具有亲和力，并结合抗体-鱼精蛋白-DNA复合物。捕获剂结合的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物在本文中称为“捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物”。任选地，鱼精蛋白-DNA复合物可以在流动通过捕获剂例如侧向流动条或亲和柱之前经机械、化学或酶促剪切。剪切有助于DNA在侧向流动条中的最佳移动，因为较小的大小在多孔基质中更容易迁移。在一个实施方案中，所述剪切通过酶促手段进行。酶促剪切导致可控和可预测的剪切模式，例如如果使用序列特异性DNA切割酶。该酶促DNA剪切步骤可以作为干燥的材料掺入到侧向流动装置的第一样品施加区中，以将裂解步骤与酶促DNA剪切分离。这将允许裂解物在施加到侧向流动装置之前进行预处理。调节的流动相沿装置输送，直到被特异性抗鱼精蛋白或抗组蛋白抗体捕获。在流动通过捕获剂之前剪切的实例如图5所示的。图5是使用机械力剪切精子DNA的结果。可以通过改变超声处理方案将DNA剪切成不同的大小。
可以将第二抗体(检测抗体)加入到裂解物中，例如作为侧向流动膜中的干燥材料，并且该第二抗体可以与着色的纳米颗粒例如胶乳珠、胶体金、酶等偶联。指示精子或上皮细胞或两者的存在的适当信号将在装置中的特定窗口或位置生成，从而作为装置的控制，并且将立即给出样品中精子细胞的存在的指示。对于酶联抗体测试，不溶性底物可以浸渍或印在固体支持物上。
在其中所述捕获剂是侧向流动条的某些实施方案中，在使裂解溶液与生物样品接触的步骤之后，将样品施加到侧向流动条的第一区。在这样的实施方案中，当所述生物样品沿着所述侧向流动条行进远至所述侧向流动条的第二区时，将至少一种鱼精蛋白特异性抗体施加至裂解的精子细胞的步骤发生，所述第二区包含与侧向流动条结合的鱼精蛋白特异性抗体。侧向流动测定法是本领域已知的，通常在预制的多孔条上进行，其可以是膜，例如尼龙、硝化纤维素、聚醚砜、聚乙烯或纸或熔融二氧化硅，其含有通过添加流体样品而被活化的干燥试剂。这些类型的装置可用于诊断目的，例如确定怀孕、器官衰竭、致病性感染和滥用药物。没有完全塑料外壳的这种装置通常被称为“浸渍片”，并且通常使用侧向流动设计。侧向流动测定法目前用于定性和一定程度的定量监测，通常在去技能化实验室环境中。目前的应用包括在生物医学、植物检疫、兽医、饲料/食品和环境场景中对病原体、药物、激素和代谢产物进行测试，但是这些测试并未广泛用于法医分析。通常设计侧向流动测定法，其中开/关信号是足够的，并且通常在10-20分钟内获得结果。选择性和灵敏度通常通过组合小型化薄层色谱、使用分析物特异性抗体和潜在的DNA/RNA特异性序列、以及通过标记分析物或识别元件来实现。
本领域已知，DNA的分子量可以改变其流过捕获剂例如侧向流动条或亲和柱的能力，如图6-8所示。图6是显示在侧向流动下小于10千碱基的DNA的迁移的DNA凝胶电泳图，与之相比，图7是显示侧向流动下大小范围为8.3至48.5千碱基的DNA迁移的DNA凝胶电泳图。另外，图8是显示在侧向流动下大于48.5千碱基的DNA迁移的DNA凝胶电泳图。图6-8清楚显示了基于DNA大小的流动差异。
在一些实施方案中，将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物洗涤以除去未结合的物质并纯化精子DNA。在一些其它实施方案中，该方法还包括将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物在离子交换树脂中孵育以从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中释放和纯化精子DNA。在一些实施方案中，将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物与离子交换树脂在95℃孵育至少10分钟以从复合物中释放核酸。在一个实施方案中，将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物与离子交换树脂在95℃孵育约15分钟以从复合物中释放核酸。
捕获精子DNA，然后使用例如检测探针进行检测。捕获剂可以包含检测探针，或者检测探针可以在纯化精子DNA期间、之前或完成之后单独加入。在一个或多个实施方案中，检测探针是报告部分，其中报告部分与鱼精蛋白特异性抗体偶联。在这些实施方案中，报告部分的检测表明样品中精子DNA的存在。报告部分可以包含发色团部分、荧光部分、磷光部分、亲和探针、磁性探针、顺磁探针、金属探针或其组合。
“检测探针”可以使用一种或多种检测方法检测精子DNA。检测探针可以包括但不限于金颗粒、反义寡聚物、焦磷酸盐、磷酸酶、生物素-链霉抗生物素蛋白珠、抗体、荧光共振能量转移(FRET)探针、辣根过氧化物酶(HRP)探针和萤光素酶。反义寡聚物可以包含天然核苷酸或核苷酸类似物。寡核苷酸可以用FRET探针标记，例如荧光素、Cy5、Cy5.5和BIODPY®。在一些实施方案中，可以通过DNA印迹法检测精子DNA。捕获和分离的精子DNA可以通过比色检测方法、基于化学、热、电、pH、发光或荧光的检测方法进行检测。
检测探针可以包括第一检测探针、第二检测探针或其组合。该方法还包括通过使用第一检测探针来检测精子DNA。在一些实施方案中，捕获剂包括第一检测探针。第一检测探针还可以包含结合部分，例如生物素或抗体、链霉抗生物素蛋白、金颗粒或其组合。在不同的实施方案中，第一检测探针可以偶联到不同的分子、底物，或者可以单独加入。
在一些实施方案中，所述方法还包括将第二检测探针施加于样品溶液，其中样品已经包括第一检测探针。在这些实施方案中，第二检测探针与第一检测探针结合，其中第一检测探针先前与抗体-鱼精蛋白-DNA复合物结合。第一检测探针或第二检测探针可以包含发色团部分、荧光部分、磷光部分、亲和探针、磁性探针、顺磁探针或其组合。
在一些实施方案中，精子DNA的检测通过精子DNA的一个或多个扩增反应来实现。检测方法还包括分析扩增的DNA。在扩增反应中，从精子细胞样品的鱼精蛋白-DNA复合物分离的精子DNA在本文中用作模板DNA。可进一步分析扩增的精子DNA用于下游应用。检测过程可以包括对扩增的DNA的不同的法医分析以鉴定攻击者。
在一个或多个实施方案中，对精子DNA进行核酸扩增反应，其扩增样品中存在的精子DNA以形成扩增产物或扩增子。术语“扩增试剂”和“扩增试剂溶液”在下文中可互换使用。扩增试剂包括dNTP、寡聚物(引物)、酶(包括聚合酶)和扩增缓冲液的混合物。在一些实施方案中，当与模板核酸接触时，扩增反应混合物在扩增缓冲液的存在下开始扩增，所述模板核酸是从鱼精蛋白-DNA复合物分离的精子DNA。扩增试剂还可以包含修饰的核苷酸。
可以通过使用标准聚合酶链反应(PCR)来扩增精子DNA。在一些实施方案中，首先使用qPCR量化来自捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的回收的精子DNA。在一些实施方案中，然后对定量的精子DNA进行多重PCR用于短串联重复序列(STR)分析。在一些实施方案中，扩增精子DNA的扩增通过等温扩增反应发生。等温扩增可以包括但不限于：滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、乒乓扩增、交叉引发扩增(CPA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)和链置换扩增(SDA)。
如所述的，样品至少包含精子细胞、裂解的精子细胞或精子细胞提取物，其中样品还包含上皮细胞、体细胞、血细胞或其组合。样品可以是从包括精子细胞的生理或临床生物来源获得的生物样品。在一个或多个实施方案中，样品选自生物样品、法医样品或活检样品。一个或多个具体实例可以包括但不限于拭子和精液样品。在一些实施方案中，样品可以包括被精子细胞或精子DNA污染的衣服、亚麻制品、织物、皮革制品。
还提供了一种试剂盒，其包含用于进行捕获精子核酸的方法所需的试剂。在一个实施方案中，试剂盒包含鱼精蛋白特异性抗体、捕获剂和裂解缓冲液。
在其它实施方案中，捕获剂可以是侧向流动条、磁珠、琼脂糖珠或亲和柱。
在某些实施方案中，试剂盒可以进一步包含隔离剂，其在细胞裂解之后将裂解后溶液中存在的过量洗涤剂隔离，然后将鱼精蛋白特异性抗体施加于包含裂解的精子细胞的裂解后溶液。在一些实施方案中，隔离剂包括用尺寸排阻壳涂覆的配体活化的核心珠、α-环糊精、尺寸排阻树脂或其组合。用尺寸排阻壳涂覆的配体活化的核心珠的实例是CaptoTM核心珠。
在某些实施方案中，可以包括还原剂、洗涤剂或其组合。各种还原剂是本领域已知的。还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。此外，可以使用这些或其它还原剂的任何组合。在具体实施方案中，还原剂是DTT。在某些实施方案中，洗涤剂可以是十二烷基硫酸钠(SDS)。
当用于法医分析工作流程的一部分时，例如在犯罪实验室中，所述试剂盒可能是特别有用的。
包括以下实施例以给本领域普通技术人员提供在实践所要求保护的发明时的额外指导。这些实施例不限制所附权利要求书中限定的本发明。
实施例
实施例1：确定精子细胞的最佳细胞裂解过程
将裂解溶液加入到包含精子细胞或精子细胞裂解物的样品溶液中。加入裂解溶液并在37℃下孵育1小时，并监测该过程1小时。 用于ChIP过程的传统细胞裂解采用EZ-Zyme裂解缓冲液(Millipore，US)。精子细胞头富含二硫键，这使得它们抵抗使用EZ-Zyme裂解缓冲液的传统裂解。为了确定适合的精子细胞裂解溶液，测试了一系列裂解溶液。
使用含DTT的裂解溶液和含TCEP的裂解溶液，并比较裂解数据以确定对于精子细胞更好的裂解溶液。在预固定(+Fix)或无固定(-Fix)条件下进行裂解过程。通常使用诸如福尔马林的试剂进行固定以在ChIP过程中稳定蛋白质-DNA复合物。使用不同的裂解条件，包括EZ-Zyme裂解缓冲液(Millipore，US)，预固定条件下的含DTT的裂解缓冲液，无固定条件下的含DTT的裂解缓冲液，预固定条件下的含TCEP的裂解缓冲液和无固定条件下的含TCEP的裂解缓冲液(如图2所示)。
相对于用于ChIP的传统裂解，在所有还原条件下观察到有效的裂解，然而，用DTT和没有固定条件达到最快速的裂解。向含有SDS的裂解缓冲液中加入DTT显示出不到5分钟内精子细胞的快速裂解，如图2所示。用于快速裂解的裂解缓冲液由40mM二硫苏糖醇(DTT)和2％十二烷基硫酸钠(SDS)构成。
实施例2：样品溶液中的SDS隔离
由于SDS对抗体结合和DNA聚合酶功能的抑制作用，SDS在进行抗体孵育和结合的下一步骤之前被隔离。通常CaptoTM核心配体在宽范围的pH和盐浓度下与小(小于700kda)的带负电荷的分子结合。CaptoTM核心700(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)用于隔离SDS分子，证明其在填充床形式中是有效的。将裂解后溶液(样品和裂解溶液的混合物)与CaptoTM核心700以1:1的比例混合。将CaptoTM核心700加入裂解后溶液中，并在室温下孵育15分钟，以确保通过CaptoTM核心700珠完全结合SDS分子。将SDS分子与珠结合后，将珠与裂解后溶液分离。使用Stains-All染料(Sigma) SDS定量测定法，测量SDS浓度(Filippo Rusconi, Édouard Valton, Régis Nguyen, Erick Dufourc, Quantificationof Sodium Dodecyl Sulfate in Microliter-Volume Biochemical Samples by VisibleLight Spectroscopy, Analytical Biochemistry, Volume 295, Issue 1, 1 August2001, Pages 31-37, ISSN 0003-2697)。对于所有条件，加入CaptoTM核心700珠以隔离SDS足以使洗涤剂(SDS)的水平低于抑制浓度，如图4所示。
对于该实验，制备不同样品以确定隔离剂例如CaptoTM核心700的作用。对照样品由含0.25％(w/v) SDS的TNE缓冲液(10mM Tris pH8,100mM NaCl和0.1mM EDTA)构成，其中不添加隔离剂CaptoTM核心700。对于三个测试样品，在EZ-Zyme裂解缓冲液(Millipore)、含0.25％(w/v)SDS和40mM DTT的TNE、含0.25％(w/v)SDS和40mM TCEP的TNE的存在下，用隔离剂CaptoTM核心700进行隔离。在1％福尔马林(+ Fix)或无福尔马林(-Fix)的存在下，进行三个实验裂解条件(测试样品)中的每一个，如图4所示。图4进一步说明了用等体积的CaptoTM核心700珠处理后的结果，其中SDS浓度显著降低。确定隔离后，SDS的浓度显著降低，达到低于DNA扩增的抑制剂浓度。
实施例3：固定对免疫沉淀的影响
由于某些蛋白质-DNA复合物的相对弱的相互作用，福尔马林固定是常规ChIP方案的重要组成部分。鱼精蛋白-DNA复合物的细胞裂解和DNA隔离的结果表明，样品固定的包含或排除对过程都没有直接影响(图2和图4)。在免疫沉淀或使用捕获剂捕获期间，确定福尔马林固定对鱼精蛋白与DNA在鱼精蛋白-DNA复合物中的相互作用的影响。
免疫沉淀
使用蛋白A(Life Technologies)、生物素结合剂(Life Technologies)和千碱基结合剂(Life Technologies)进行抗体拉下测定法，其中在存在或不存在固定剂下制备的样品上进行实验。从拉下测定法的免疫沉淀反应测定DNA的产量。该实验使用大约17,500个细胞。将细胞固定在1％福尔马林(+ Fix)中或不含福尔马林(-Fix)。将具有固定或无固定的细胞与1微克鱼精蛋白2(PRM2)多克隆抗体(Bioss Inc，US)孵育用于蛋白A条件，或与生物素缀合的PRM2多克隆抗体(Bioss Inc，US)孵育用于生物素结合剂和千碱基结合剂条件。将所有样品在4℃下与含拥挤剂(crowding agent)的孵育缓冲液一起孵育4小时，形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物，用于进行免疫沉淀。含拥挤剂的孵育缓冲液包含0.001% SDS (s/v), 1.67 mM Tris pH8, 0.11% Triton X-100, 0.12 mM EDTA, 16.7 mM NaCl, 8%葡聚糖100kDa (w/v)。
基于磁珠的抗体拉下测定法
使用三种官能化磁珠来捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物。根据制造商的说明书，使用DynaMagTM-2 Magnet (Life Technologies)磁性微量离心管架，采用用蛋白A(LifeTechnologies)官能化的珠和用链霉抗生物素蛋白、生物素结合剂(Life Technologies)和千碱基结合剂(Life Technologies)官能化的两种不同的珠。在从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物进行DNA回收之前，将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物(通过施加磁珠)洗涤5次。在包含以下的缓冲液中依次洗涤捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物：0.01% SDS (w/v),20 mM Tris pH 8, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA和500mM NaCl, 0.01% SDS (w/v)，然后是包含20 mM Tris pH8, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA 150 mM NaCl的第二缓冲液，然后是包含250 mM LiCl, 10 mM Tris pH8, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 1%脱氧胆酸盐的第三缓冲液，接着在10 mM Tris, pH 8和1mM EDTA中再洗涤两次。然后将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物在10％(w/v) Chelex树脂(Biorad)中加热至95℃ 10分钟，以从复合物中释放DNA。从抗体-鱼精蛋白-DNA复合物释放的DNA适用于下游扩增，并使用Quantifiler Human(ABI)和Quantifiler Y(ABI)试剂盒进行分析。
回收的精子DNA的定量分析
使用制造商的用法说明，使用用于总DNA的Quantifiler Human试剂盒(ABI)和用于雄性特异性DNA的Quantifiler Y试剂盒(ABI)，定量回收的DNA产量。由于仅使用雄性特异性精子DNA作为本实验的样品，所以使用Quantifiler Human和Quantifilier Y的两种定量方法得到相当的DNA定量。图3中的结果显示当在所有三组中例如对于蛋白A、生物素结合剂和千碱基结合剂消除固定时，总DNA(人)和雄性特异性DNA(Y)的产量较高。该实验再次确定了这一事实：尽管对于鱼精蛋白-DNA复合物的免疫沉淀进行了固定并选择性纯化精子DNA，但固定不是必需的。
在释放DNA之前，将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物用含有SDS的缓冲液组合物洗涤几次。然而，鱼精蛋白-DNA相互作用在SDS处理后保持完整，且不受SDS处理的影响，这是意想不到的发现。鱼精蛋白与DNA的相互作用强大足以承受SDS处理。这表明该方案可以用于已经固定或未固定的样品，增加可用于该方案的样品类型。
抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的定性分析：蛋白质印迹分析
将来自上述实验的相同抗体-鱼精蛋白-DNA复合物样品进行蛋白质印迹(图9)和琼脂糖凝胶电泳(图10)用于定性分析。如上所述，用蛋白A、生物素结合剂和千碱基结合剂设计拉下测定法。在固定和无固定的抗体拉下测定法后从每组中收集沉淀物，并将沉淀物进行蛋白质印迹分析。在4-12％ Bis-Tris蛋白质梯度凝胶(Invitrogen)上分析抗体-鱼精蛋白-DNA复合物样品。根据制造商的用法说明，使用Trans-BlotSD Semi-Dry TransferCell (Biorad)将凝胶中的蛋白转移到硝化纤维素膜上。
转移后，硝化纤维素膜在室温下用25ml TBS (137mM氯化钠，20mM Tris，以pH 7.6提供)洗涤5分钟。将硝化纤维素膜在25ml封闭缓冲液(含有5％脱脂奶粉的TBS)中在室温下孵育1小时。然后将膜用15ml TBST(137mM氯化钠，20mM Tris，0.1％Tween-20，以pH 7.6提供)洗涤三次，每次5分钟。然后将硝化纤维素膜与驴抗兔Cy3标记的第二抗体(JacksonImmuno-Research)在10ml TBST中孵育，同时在4℃下轻轻搅拌过夜。将硝化纤维素膜用15ml TBST洗涤3次，每次5分钟。然后让硝化纤维素膜干燥，之后根据制造商的说明书，使用Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare)可视化。图9是印迹的图像，其显示在固定或无固定条件下具有相同强度的样品条带。蛋白A显示抗体拉下测定法的最高效率。通过该实验也确定了所有条件下抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的有效捕获，而不管是否固定。抗体拉下不受消除固定步骤的影响。
抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的定性分析：琼脂糖凝胶电泳
将使用Picogreen测定法(Life Technologies)定量的来自上述拉下测定法(图3)的20ng DNA样品加载到1％琼脂糖凝胶上以目测确认DNA的回收并评估DNA的大小。DNA凝胶的图像，图10，显示与从用固定条件处理的不同组拉下测定法中回收的DNA样品相比，从不经固定处理的不同组拉下测定法中回收的DNA样品没有降解。通常，当对DNA进行福尔马林固定时，DNA降解。由于鱼精蛋白-DNA相互作用比组蛋白-DNA相互作用相对较强，因此对于鱼精蛋白-DNA复合物的免疫沉淀可能不需要固定步骤。去除固定步骤节省了纯化之前的时间和下游反向交联。
实施例4：来自包含雌性上皮细胞的样品的精子DNA的差异捕获：
将包含精子细胞和雌性上皮细胞的样品用于该实验。在实验中测试了含有精子/上皮细胞混合物的两个不同样品，在两种条件下使用30,000个精子细胞，而一个样品中上皮细胞数量为100,000，另一个样品中为1,000,000。在一个对照组中，仅测试精子细胞，而在另一个对照组中，仅测试上皮细胞。使用相同的工作流程制备所有样品，其包括使用TNEw/SDS的快速裂解，使用CaptoCore珠去除过量SDS，使用拥挤剂进行抗体孵育以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物，随后重复洗涤，与Chelex树脂孵育以释放DNA，并使用如前的Quantifiler试剂盒(ABI)扩增释放的DNA。其中样品由精子和上皮细胞构成的该实验的DNA产量结果显示于图11。
差异捕获能够将不可用的67：1雌性上皮细胞与精子细胞比例(142:1 DNA比例)降低至2：1。DNA模板比例的急剧降低使得可能从分析中减去雌性标志。也从混合样品产生了STR分析(数据未显示)。差异捕获能够从完全裂解的雌性上皮细胞和精子细胞的混合物中特异性捕获精子DNA。
在拭子或基质上直接裂解样品
使用精子DNA捕获方法，在拭子切割和差异提取方法中使用直接裂解，制备来自同一拭子的重复四等分拭子切割的DNA，由此在裂解前分离拭子切割上的细胞。使用Quantifiler Human和Quantifiler Y定量试剂盒分析分离的DNA，DNA产量结果如图12所示。由于精子DNA捕获方法能够在拭子材料上直接裂解，获得了更高的产量。
DNA分子量改变侧向流动下的迁移
将DNA大小梯点样到由硝化纤维素构成的侧向流动条上，并使用由10mM Tris pH8和0.1mM EDTA构成的缓冲液使其经受侧向流动条件。侧向流动沿自原点位置的长度发生，其中将DNA大小梯点样到条带的末端，包括35毫米。在侧向流动完成后，从条带的原点到末端切割6毫米部分的条带。将每个6毫米的切割物放入琼脂糖凝胶的孔中并进行电泳以确定不同大小的DNA沿着侧向流动条的位置。分子量范围从500碱基对至10千碱基对的DNA的结果如图6所示。分子量范围为8.3千碱基对至48.52千碱基对的DNA的结果如图7所示。分子量大于48.5千碱基对至10千碱基对的DNA的结果如图8所示。侧向流动条件下DNA的迁移取决于DNA的分子量而改变。
核酸的剪切
精子细胞中存在的鱼精蛋白DNA复合物对使用酶促消化的DNA剪切具有抗性，但可以使用机械力剪切。图13显示使用微球菌核酸酶的上皮DNA和精子DNA的核酸酶消化的结果。上皮细胞中的DNA不与鱼精蛋白结合，并且易于用微球菌核酸酶消化。在重复反应中，上皮和精子DNA用六个不同水平的微球菌核酸酶处理，范围为零单位至四个单位的核酸酶。每个条件在37℃下孵育30分钟。将微球菌核酸酶处理的DNA在1％琼脂糖凝胶中在110伏下电泳45分钟，用SYBR Gold染色并在Typhoon扫描仪上显现。来自上皮细胞的核酸通过核酸酶消化迅速降解，而精子DNA鱼精蛋白复合物保护核酸免于降解。图14显示了使用CovarisUltrasonicer根据供应商的指南，使用机械力剪切精子DNA鱼精蛋白复合物的剪切结果。已知DNA分子量改变其在侧向流动下迁移的能力，并且修饰分子量的能力在一些实施方案中可能是至关重要的。
性交后9天的样品
精子DNA捕获使得能够在性交后九天的时间窗口特异性捕获混合物中的精子DNA。使用精子DNA捕获方法，9天后的精子特异性DNA捕获如图15所示。精子DNA捕获将在完整的精子头不再存在之后将精子DNA从混合物分开。因此，结果说明了使用该方法的回收和分析的时间窗口增加。该方法提供在射精后的相当长的时间内收集和随后的分析。在某些实施方案中，可以在射精后三天或更多天，以阳性结果获得生物样品。这可能部分原因在于，虽然可能不再有完整的精子细胞，但是该方法捕获与精子头相比存在更长持续时间的精子DNA。
虽然在典型的实施方案中说明和描述了本公开内容，但无意受限于所显示的细节，因为可进行不同的改动和替换而不以任何方式偏离本公开内容的精神。因此，只是采用常规实验，本领域技术人员便会想到本公开内容的更多改动和等同内容，并且所有这类改动和等同内容都视为在随附权利要求书中限定的本公开内容的精神和范围内。

Claims (32)

1.一种从生物样品中捕获精子脱氧核糖核酸(DNA)的方法，包括：
a) 将生物样品与裂解溶液接触，其中所述生物样品至少包含精子细胞或精子细胞裂解物，其中裂解的生物样品溶液包含鱼精蛋白-DNA复合物；
b) 向裂解的生物样品施加至少一种鱼精蛋白特异性抗体，其中鱼精蛋白特异性抗体结合裂解的精子细胞的鱼精蛋白-DNA复合物以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；
c) 捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；和
d) 从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中检测精子DNA，
其中所述裂解溶液包含洗涤剂或洗涤剂和还原剂的组合，并且在细胞裂解之后施加隔离剂以隔离洗涤剂，然后将所述鱼精蛋白特异性抗体施加于裂解的精子细胞，
其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)，并且其中所述隔离剂包括用尺寸排阻壳涂覆的配体活化的核心珠。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解溶液包含40mM二硫苏糖醇(DTT)、0.5％-2％十二烷基硫酸钠(SDS)或其组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述鱼精蛋白特异性抗体在孵育期间在4℃至37℃的范围内与鱼精蛋白-DNA复合物结合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述鱼精蛋白特异性抗体在孵育期间在10分钟至4小时的时间范围内与鱼精蛋白-DNA复合物结合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过捕获剂实现抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的捕获，其中捕获剂与鱼精蛋白特异性抗体预偶联。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体-鱼精蛋白-DNA复合物的捕获通过进一步添加捕获剂来实现，其中所述捕获剂与鱼精蛋白特异性抗体结合。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述捕获剂包含第二抗体、琼脂糖珠、顺磁珠、蛋白A、链霉抗生物素蛋白、玻璃珠、硝化纤维素、侧向流动条或其组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述捕获剂是侧向流动条，并且其中：
在如权利要求1定义的所述接触步骤之后，将所述裂解的生物样品施加到所述侧向流动条的第一区；并且
当所述裂解的生物样品沿着所述侧向流动条行进远至所述侧向流动条的第二区时，发生如权利要求1定义的步骤b)，所述第二区包含结合的鱼精蛋白特异性抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其还包括在如权利要求1定义的步骤b)之前在所述生物样品中剪切DNA的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述剪切步骤通过机械、化学或酶促手段进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述剪切步骤通过酶促手段进行。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述侧向流动条的所述第一区包括检测抗体。
13.根据权利要求6所述的方法，其中捕获剂是对鱼精蛋白特异性抗体特异性的第二抗体。
14.根据权利要求7所述的方法，其中洗涤捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物以除去未结合的物质，同时保留鱼精蛋白-DNA复合物。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括在离子交换树脂中孵育所捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中将捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物在95℃下孵育至少10分钟。
17.根据权利要求1所述的方法，其中报告部分与鱼精蛋白特异性抗体偶联，并且其中所述报告部分的检测表明样品中精子DNA的存在情况。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述报告部分包含发色团部分、荧光部分、磷光部分、亲和探针、磁性探针、金属探针或其组合。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述报告部分包含顺磁探针。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述精子DNA的检测包括精子DNA的一个或多个扩增反应。
21.根据权利要求20所述的方法，还包括分析扩增的DNA。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品进一步包含上皮细胞、血细胞或其组合。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品进一步包含体细胞。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品选自包含精子细胞的法医样品。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品固定在固体基质上。
26.根据权利要求1所述的方法，其中在射精后至少三天获取生物样品。
27.一种从生物样品捕获精子脱氧核糖核酸(DNA)的方法，包括：
提供至少包含精子细胞、部分裂解的精子细胞或精子细胞裂解物的生物样品，其中所述精子细胞、部分裂解的精子细胞或精子细胞裂解物包含鱼精蛋白-DNA复合物；
使裂解溶液与样品接触以裂解精子细胞或部分裂解的精子细胞；
向裂解的精子细胞施加至少一种鱼精蛋白特异性抗体，其中鱼精蛋白特异性抗体结合裂解的精子细胞的鱼精蛋白-DNA复合物以形成抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；
通过添加捕获剂捕获抗体-鱼精蛋白-DNA复合物；和
通过DNA扩增反应从捕获的抗体-鱼精蛋白-DNA复合物中检测精子DNA，
其中所述裂解溶液包含洗涤剂或洗涤剂和还原剂的组合，并且在细胞裂解之后施加隔离剂以隔离洗涤剂，然后将所述鱼精蛋白特异性抗体施加于裂解的精子细胞，
其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)，并且其中所述隔离剂包括用尺寸排阻壳涂覆的配体活化的核心珠。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物样品固定在固体基质上。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物样品在射精后至少三天获得。
30.一种用于捕获生物样品中的精子脱氧核糖核酸(DNA)的试剂盒，包括：
鱼精蛋白特异性抗体；
捕获剂；和
裂解缓冲液，其包含洗涤剂或洗涤剂和还原剂的组合，和
隔离剂，其隔离裂解后溶液中存在的洗涤剂；
其中所述捕获剂是侧向流动条，其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合，其中所述洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)，并且其中所述隔离剂包括用尺寸排阻壳涂覆的配体活化的核心珠；
其中所述侧向流动条包括
用于施加裂解的生物样品的第一区；以及
包含结合的鱼精蛋白特异性抗体的第二区。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述第一区包含用于在所述生物样品中剪切DNA的酶和/或检测抗体。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述酶和所述检测抗体呈干燥形式。
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