KR20200133369A - 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 개시는 일반적으로 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 개시는 수성 청소 용액을 사용하여 박테리아를 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하기 위한 방법

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 전체내용이 참조로서 포함되는 2018년 3월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/646,588호의 우선권의 이익을 주장한다.

1. 본 발명의 개시의 분야

본 발명의 개시는 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.

2. 기술 배경

유체 내의 박테리아, 효모 및 기타 유기체의 정량화는 의료 진단, 약물 개발, 산업 위생, 식품 안전 및 많은 다른 분야에 유용할 수 있다. 예를 들어, 소변 내의 박테리아의 양은 감염의 임상 진단에서 중요한 파라미터이다. 일반적으로, 소변에 10⁵/mL 이상의 박테리아의 존재는 양성 요로 감염의 기준으로 인식된다. 10³/mL 이하의 박테리아를 갖는 소변 샘플은 요로 감염에 대해 음성으로(즉, 정상적인 박테리아 세균총을 갖는 것으로) 간주된다. 그러나, 소변 샘플이 약 10⁴/mL 박테리아를 갖는 경우, 진단이 확립되지 않고, 샘플은 종종 재검사된다.

소변은 종종 침전물, 파편, 점액 실, 결정, 무정형 염, 환자 세포, 적혈구 및 세포 단편과 같은 오염물질을 함유한다. 많은 오염물질 중 일부가 도 1에 제공된다. 이들 물질은 다른 유형의 입자(특히, 박테리아)의 측정을 방해하므로, 박테리아의 수를 정확하게 계수하는 것이 어려웠다. 종래에는, 염색된 박테리아의 현미경적 검사에 의해 소변 내의 박테리아의 관찰이 수행되어 왔다. 박테리아 염색은 또한 오염물질이 동시에 염색되는 것을 발생시켜, 박테리아의 양의 정확한 측정을 방해한다.

따라서, 박테리아가 유체 샘플에 존재하는지 신속하게 결정하고, 박테리아의 양을 결정하는 개선된 시스템 및 방법이 필요하다. 또한, 박테리아가 존재하는 것으로 확인된 후 박테리아의 유형을 보다 신속하게 결정하는 개선된 시스템 및 방법이 필요하다.

본 발명의 개시의 일 양태는 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은,

생물학적 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소(clearance) 용액을 접촉시키는 단계; 및

샘플 내의 박테리아를 결정하는 단계를 포함한다.

이러한 양태의 특정 구현예에서, 계면활성제는 소듐 메틸 올레오일 타우레이트 또는 이의 유도체이다.

본 발명의 개시의 또 다른 양태는 생물학적 샘플로부터 비-박테리아성 미립자 물질을 청소하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 생물학적 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소 용액을 접촉시키는 것을 포함한다.

이러한 양태의 특정 구현예에서, 계면활성제는 소듐 메틸 올레오일 타우레이트 또는 이의 유도체이다.

본 발명의 개시의 또 다른 양태는 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은,

생물학적 샘플의 첫 번째 일부를 상기 첫 번째 일부 내의 박테리아에 대해 분석하는 단계;

비-박테리아성 미립자 물질의 존재 또는 양이 박테리아에 대한 분석을 방해하는지 결정하는 단계;

생물학적 샘플의 두 번째 일부와 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소 용액을 접촉시키는 단계; 및

생물학적 샘플의 두 번째 일부에서 박테리아를 결정하는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 개시의 방법은 생물학적 샘플에서 박테아를 측정하는 데 있어서 모호한 결과를 감소시킨다.

상기 요약은 단지 예시적인 것이며, 어떤 식으로든 제한하려는 것은 아니다. 상기 기재된 예시적 양태, 구현예 및 특징에 더하여, 추가의 양태, 구현예 및 특징이 도면 및 하기 상세한 설명을 참조하여 명백해질 것이다.

첨부된 도면은 본 발명의 개시의 방법 및 장치의 추가 이해를 제공하기 위해 포함되며, 본 명세서에 포함되고 이의 일부를 구성한다. 도면은 반드시 축척으로 그려진 것이 아니며, 명확성을 위해 다양한 요소의 크기가 왜곡될 수 있다. 도면은 본 발명의 개시의 하나 이상의 구현예(들)를 예시하고, 설명과 함께 본 발명의 개시의 원리 및 작업을 예시하는 역할을 한다.
도 1은 가장 일반적인 소변 오염물질을 예시한다.
도 2는 본 발명의 개시의 방법에 따른 혈액 스파이킹된 개 소변의 처리를 예시한다. 패널 A는 처리 전 샘플의 이미지이며; 패널 B는 실시예 1에 개시된 방법에 의한 처리 후의 이미지이다.
도 3은 실시예 2의 방법에 따른 개 전혈 및/또는 E. 콜리 샘플의 처리를 예시한다. 물 처리는 대조군으로 사용된다. RBC는 적혈구 수이다. BACc 및 BACr은 각각 박테리아-구균 세포 수 및 박테리아-막대균 세포 수이다.
도 4는 실시예 2의 방법에 따른 개 전혈 및/또는 E. 콜리 샘플의 처리를 예시한다.
도 5는 본 발명의 개시의 방법에 의해 처리된 소변 샘플의 이미지를 제공한다. 패널 A는 10x 광학 배율에서의 개 소변 및 소변 침전물의 이미지이다. 소변은 큰 결정성 파편뿐만 아니라 다수의 혈액 세포를 함유한다. 패널 B는 본 발명의 개시의 방법을 이용한 처리 후 10x 광학 배율에서의 소변 및 소변 침전물의 이미지이다.
도 6은 본 발명의 개시의 방법의 일 구현예에 따른 전혈 및/또는 E. 콜리가 있거나 없는 개 소변의 처리를 예시한다.
도 7은 본 발명의 개시의 방법의 일 구현예에 따른 개 소변 샘플의 처리를 예시한다.
도 8a는 상이한 킬레이트제 용액으로 처리된 소변 샘플의 자동화된 결정 수를 제시한다. 도 8b는 결정 수에 대한 분석 전 처리된 샘플의 5분 인큐베이션의 효과를 제시한다. 점선은 킬레이트제 용액 처리 전 소변 샘플 내의 결정 수를 나타낸다. 제시된 시약 농도는 소변 샘플의 첨가 전 킬레이트제 용액의 시약 농도이다. HPF = 고전력장.
도 9a는 본 발명의 개시의 방법의 일 구현예에 따른 결정성 파편 및 박테리아를 갖는 개 소변 샘플의 처리의 pH 값 및 전체 결정 수(CRY) 결과를 제시한다. 도 9b는 본 발명의 개시의 방법의 일 구현예에 따른 결정성 파편 및 박테리아를 갖는 개 소변 샘플의 처리 후의 상대 박테리아 수를 제시한다.
도 10a는 본 발명의 개시의 방법의 2개의 상이한 구현예에 따른 개 소변 샘플의 처리를 예시한다. 도 10b는 본 발명의 개시의 방법의 일 구현예에 따른 고도로 결정화된 개 소변 샘플의 처리를 예시한다.
도 11은 본 발명의 개시의 방법의 일 구현예에 의한 결정, 적혈구(RBC) 및 백혈구로 밀집된 고양이 소변의 처리를 예시한다.

본 발명의 개시는 생물학적 샘플 및 기타 샘플에서 박테리아 양의 측정을 개선하기 위한 물질, 방법 및 장치를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 개시는 측정의 정확도에 영향을 미칠 수 있는 오염물질의 영향을 최소화하기 위한 효율적이고, 정확하고, 비용 효과적인 방법을 기재한다. 예를 들어, 소변은 종종 도 1에 제시된 것과 같은 오염물질을 함유하며, 이는 박테리아 양의 정확한 측정을 방해한다. 따라서, 본 발명의 개시의 방법은 일반적인 소변 오염물질(예를 들어, 침전물, 파편, 점액 실, 결정, 무정형 염, 세포 단편, 적혈구 및 환자 세포)에 의해 야기되는 간섭을 제거하고, 박테리아의 정확한 측정을 허용한다. 본 발명의 개시의 방법의 특정 예는 박테리아의 정확한 측정만이 달성될 수 있도록 처리된 샘플에서 오염물질이 광학적으로 청소되도록 샘플을 처리하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 개시의 방법의 일부 구현예는 박테리아의 2가지 형태인 막대균 및 구균뿐만 아니라 쌍구균 및 구균 사슬과 같은 구균을 구별할 수 있다. 또한, 본 발명의 개시의 방법에서, 생물학적 샘플 내의 박테리아는 단일 샘플, 단일 이미지 및/또는 단일 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 결과로서, 본 발명의 개시의 방법은 다수의 시험 방법, 광범위한 샘플 취급, 배송 및 보관을 제거할 수 있다. 측정은 클리닉에서 실시간으로 수행될 수 있어 샘플에 대한 더 적은 변화를 발생시킨다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 박테리아를 "측정하는" 또는 박테리아의 "측정"은 제한하려는 것이 아니며, 박테리아의 양(예를 들어, 전체 세포 수 또는 농도)을 결정하고/하거나, 박테리아를 계수하고/하거나, 박테리아의 크기 및/또는 모양을 결정하고/하거나, 염색되거나 표지되는 박테리아의 능력을 결정하는 것을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 개시의 일 양태는 생물학적 샘플에서 박테리아의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소 용액을 접촉시키고; 샘플 내의 박테리아의 양을 결정하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하는 데 있어서 모호한 결과를 감소시킨다.

본 발명의 개시의 또 다른 양태는 생물학적 샘플로부터 비-박테리아성 미립자 물질을 청소하기 위한 방법을 제공한다. 비-박테리아성 미립자 물질은 침전물, 파편, 점액 실, 결정, 무정형 염, 세포 단편, 적혈구 및 환자 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 방법은 생물학적 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소 용액을 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하는 데 있어서 모호한 결과를 감소시킨다.

상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 생물학적 샘플에서 수행된다. 본 발명의 개시의 방법의 일부 구현예에서, 샘플은 소변 샘플이다. 본 발명의 개시의 방법의 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플(전혈, 혈청 또는 혈장)이다.

본 발명의 개시의 방법에서, 생물학적 샘플은 수성 청소 용액과 접촉된다. 물이 주로 본 발명의 개시의 수성 용액(예를 들어, 수성 청소 용액 또는 수성 킬레이트제 용액)에서 사용된다. 그러나, 물에 더하여, 수성 용액은 하나 이상의 유기 용매를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 수성 용액은 수용액이다. 특정 구현예에서, 수성 용액은 물 및 하나 이상의 유기 용매(예를 들어, 알콜, 디메틸 설폭시드, 디메틸포름아미드 및 아세톤)를 포함한다. 하나 이상의 유기 용매는 수성 용액에서 0 - 70% 부피/부피의 농도로 존재할 수 있다. 당업자는 부분적으로 용해도 한계에 기초하여 적합한 농도를 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 개시의 수성 청소 용액은 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 본원에서 일반적으로 단수로 기재되지만, 복수의 계면활성제가 함께 제형화되어 본 발명의 개시의 수성 청소 용액을 제공할 수 있다. 2개 이상의 계면활성제가 수성 청소 용액에 사용되는 경우, 2개의 상대량은 원하는 성능에 따라 본원의 개시에 기초하여 달라질 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 계면활성제 대 제2 계면활성제의 중량비는 1:9 내지 9:1 범위이다.

본원의 개시에 기초하여, 계면활성제는 일반적인 소변 오염물질에 의해 야기되는 간섭을 제거하는 데 바람직한 성능을 갖는 수성 청소 용액을 제공하도록 선택될 수 있다. 또한, 계면활성제는 본 발명의 개시의 방법 조건하에서 광학 현미경검사에 의해 볼 수 있는 마이셀의 형성을 피하도록(예를 들어, 방지하거나 야기시키지 않도록) 선택될 수 있다. 상기 마이셀은 간섭을 일으킬 수 있으며, 광학 현미경검사로 관찰하는 경우 박테리아와 실질적으로 유사하게 보인다. 따라서, 특정 구현예에서, 계면활성제는 광학 현미경검사에 의해 박테리아와 실질적으로 유사한 마이셀의 형성을 피하기 위해 선택될 수 있다.

다양한 계면활성제가 당 분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 적합하게 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 계면활성제는 N-메틸타우린 유도체(예를 들어, 지방산 아미드) 또는 이의 염이다. N-메틸타우린의 적합한 유도체는, 예를 들어, 불포화 탄화수소 사슬 및/또는 타우레이트 헤드 기(추가로 치환될 수 있음)와 같은 하기 제공되는 메틸 올레오일 타우레이트의 하나 이상의 화학 구조 특징을 갖는 화합물을 포함한다. 불포화된 탄화수소 사슬의 예는 올레산, 리놀레산, α-리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 도코사테트라엔산, 팔미톨레산, 파울린산, 곤도산, 에루스산, 네르본산, 미드산, 리놀레라이드산, 박센산, 엘라이드산, 미리스트올레산, 사피에닉산, 페트로셀린산, 도코센산 또는 가돌렌산으로부터 유래된 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

예를 들어, N-메틸타우린 유도체는 하기 일반식으로 표시될 수 있다:

상기 식에서, M⁺는 양이온이고, R은 단일불포화 또는 다중불포화 C₁₀-C₂₂ 하이드로카르빌이다.

본 발명의 개시의 목적을 위해, "하이드로카르빌"은 선형이거나 분지형일 수 있는 탄소 및 수소를 함유하는 1가 기인 것으로 정의된다. 단일불포화 하이드로카르빌은 하나의 이중 결합 또는 하나의 삼중 결합을 갖는 하이드로카르빌로 정의된다. 바람직한 구현예에서, 단일불포화 하이드로카르빌은 하나의 이중 결합을 갖는 하이드로카르빌이다. 다중불포화 하이드로카르빌은 2개 이상의 이중 결합, 삼중 결합 또는 이들의 조합을 갖는 하이드로카르빌로 정의된다. 하이드로카르빌 기의 임의의 이중 결합은 시스 또는 트랜스 입체형태일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 이중 결합 중 적어도 하나는 시스 입체형태이다.

특정 구현예에서, R은 단일불포화(예를 들어, 하나의 이중 결합을 가짐) C₁₀-C₂₂ 하이드로카르빌(예를 들어, C₁₀-C₂₀ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₈ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₆ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₄ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₂ 하이드로카르빌, C₁₄-C₂₂ 하이드로카르빌, C₁₄-C₂₀ 하이드로카르빌, C₁₄-C₁₈ 하이드로카르빌, C₁₄-C₁₆ 하이드로카르빌, C₁₆-C₂₂ 하이드로카르빌, C₁₆-C₂₀ 하이드로카르빌, C₁₆-C₁₈ 하이드로카르빌, C₁₈-C₂₂ 하이드로카르빌 또는 C₁₈-C₂₂ 하이드로카르빌)이다. 특정 구현예에서, R은 시스-단일불포화 C₁₀-C₂₂ 하이드로카르빌(예를 들어, C₁₀-C₂₀ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₈ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₆ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₄ 하이드로카르빌, C₁₀-C₁₂ 하이드로카르빌, C₁₄-C₂₂ 하이드로카르빌, C₁₄-C₂₀ 하이드로카르빌, C₁₄-C₁₈ 하이드로카르빌, C₁₄-C₁₆ 하이드로카르빌, C₁₆-C₂₂ 하이드로카르빌, C₁₆-C₂₀ 하이드로카르빌, C₁₆-C₁₈ 하이드로카르빌, C₁₈-C₂₂ 하이드로카르빌 또는 C₁₈-C₂₂ 하이드로카르빌)이다.

M⁺는 본원에 제공된 바와 같은 임의의 적합한 양이온일 수 있다. 예로는 Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ 및 NH₄ ⁺를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, M⁺는 Na⁺이다.

본원에 달리 기재되는 바와 같은 특정 구현예에서, 계면활성제는 메틸 올레오일 타우레이트의 염이다. 메틸 올레오일 타우레이트의 소듐 염(소듐 메틸 올레오일 타우레이트 또는 SMOT)은 하기 구조를 갖는다:

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특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 수성 청소 용액은 소듐 메틸 올레오일 타우레이트 또는 이의 유도체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 수성 청소 용액은 소듐 메틸 올레오일 타우레이트를 포함한다.

적합한 N-메틸타우린 유도체 및 이의 염의 다른 비제한적인 예는 하기 구조를 갖는 메틸 리놀레오일 타우레이트;

,

하기 구조를 갖는 메틸 리놀레노일 타우레이트;

,

하기 구조를 갖는 메틸 도코세노일 타우레이트;

,

하기 구조를 갖는 메틸 팔미톨레오일 타우레이트를 포함한다:

.

본원에 달리 기재된 바와 같은 특정 구현예에서, 계면활성제는 메틸 올레오일 타우레이트, 메틸 리놀레오일 타우레이트, 메틸 리놀레노일 타우레이트, 메틸 도코세노일 타우레이트, 메틸 팔미톨레오일 타우레이트 및 이들의 염 중 하나 이상으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 수성 청소 용액은 메틸 올레오일 타우레이트, 메틸 리놀레오일 타우레이트, 메틸 리놀레노일 타우레이트, 메틸 도코세노일 타우레이트 및 메틸 팔미톨레오일 타우레이트 또는 이들의 염으로부터 선택되는 하나의 계면활성제를 포함한다.

본원에 달리 기재되는 바와 같은 특정 구현예에서, 계면활성제는 담즙산 또는 이의 염이다. 특정 구현예에서, 담즙산은 콜랄산 및 이의 염(콜레이트)(예를 들어, 소듐 콜레이트), 데옥시콜산 및 이의 염(데옥시콜레이트)(예를 들어, 소듐 데옥시콜레이트), 케노데옥시콜산 및 이의 염(예를 들어, 소듐 케노데옥시콜레이트), 리토콜산 및 이의 염(예를 들어, 소듐 리토콜레이트) 및 우르소데옥시콜산 및 이의 염(예를 들어, 소듐 우르소데옥시콜레이트)로부터 선택된다.

하나 이상의 계면활성제는 다양한 양으로 본원에 기재된 청소 용액에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 0.0001% w/v 내지 약 50% w/v 범위의 농도로 청소 용액에 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 0.001% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 0.001% w/v 내지 25% w/v, 또는 0.001% w/v 내지 10% w/v, 또는 0.001% w/v 내지 7% w/v, 또는 0.001% w/v 내지 5% w/v, 또는 0.001% w/v 내지 2% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 1% w/v, 또는 0.001% w/v 내지 0.1% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 0.01% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 0.01% w/v 내지 약 25% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 7% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 5% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 2% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 1% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 0.1% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 0.5% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 0.5% w/v 내지 25% w/v, 또는 0.5% w/v 내지 10% w/v, 또는 0.5% w/v 내지 7% w/v, 또는 0.5% w/v 내지 5% w/v, 또는 0.5% w/v 내지 2% w/v, 또는 0.5% w/v 내지 1% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 1% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 1% w/v 내지 25% w/v, 또는 1% w/v 내지 10% w/v, 또는 1% w/v 내지 7% w/v, 또는 1% w/v 내지 5% w/v, 또는 1% w/v 내지 2% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 2% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 2% w/v 내지 25% w/v, 또는 2% w/v 내지 10% w/v, 또는 2% w/v 내지 7% w/v, 또는 2% w/v 내지 5% w/v, 또는 2% w/v 내지 3% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 3% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 3% w/v 내지 25% w/v, 또는 3% w/v 내지 10% w/v, 또는 3% w/v 내지 7% w/v, 또는 3% w/v 내지 5% w/v, 또는 3% w/v 내지 4% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 5% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 5% w/v 내지 25% w/v, 또는 5% w/v 내지 10% w/v, 또는 5% w/v 내지 7% w/v, 또는 7% w/v 내지 10% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 10% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 20% w/v 내지 50% w/v, 또는 30% w/v 내지 50% w/v, 또는 40% w/v 내지 50% w/v, 또는 10% w/v 내지 30% w/v, 또는 20% w/v 내지 40% w/v 범위의 농도로 존재한다.

물론, 예를 들어, 생물학적 샘플 및 청소 용액이 조합된 후 샘플 내의 하나 이상의 계면활성제의 농도는 청소 용액 내의 계면활성제의 농도보다 낮다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 생물학적 샘플 및 청소 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 0.0003% w/v 내지 약 10% w/v 범위의 농도로 샘플에 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 생물학적 샘플 및 청소 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 0.001% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 0.1% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 1% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 0.001% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 1% w/v 내지 약 2% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 생물학적 샘플 및 청소 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 0.001% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 1% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.001% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 1% w/v 내지 약 2% w/v 범위의 농도로 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 생물학적 샘플, 청소 용액 및 킬레이트제 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 0.0001% w/v 내지 약 10% w/v 범위의 농도로 샘플에 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 계면활성제는 생물학적 샘플, 청소 용액 및 킬레이트제 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 0.0003% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 0.001% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 0.005% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 0.1% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 10% w/v, 또는 약 1% w/v 내지 약 10% w/v 범위의 농도로 존재한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 계면활성제는 생물학적 샘플, 청소 용액 및 킬레이트제 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 0.0003% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.001% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.005% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.1% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 1% w/v 내지 약 3% w/v, 또는 약 0.001% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 0.1% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 0.5% w/v 내지 약 1% w/v, 또는 약 1% w/v 내지 약 2% w/v 범위의 농도로 존재한다.

청소 용액은 산성이거나 염기성일 수 있다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 산성이고; 예를 들어, 7 미만의 pH를 갖는다. 예를 들어, 청소 용액은 ≤ 6의 pH, 예를 들어, 약 3 내지 약 6, 또는 약 4 내지 약 6, 또는 약 5 내지 약 6의 pH를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 ≤ 5의 pH, 예를 들어, 약 3 내지 약 5, 또는 약 4 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 4의 pH를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 심지어 ≤ 3의 pH, 예를 들어, 약 2 내지 약 3의 pH를 가질 수 있다.

원하는 산성 pH를 갖는 청소 용액을 획득하기 위해, 적합한 산성 pH의 완충액이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 완충액은 하나 이상의 산을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 청소 용액은 인산과 같은 무기산 또는 유기산을 포함한다. 적합한 유기산은 포름산, 아스코르브산, 탄산, 카르복실산, 시트르산 및 아세트산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 유기산은 약산이다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 산의 pKa는 2.0 내지 6.4 범위일 수 있다. 특정 구현예에서, pKa는 약 3.0 내지 5.5, 또는 약 3.0 내지 6.0, 또는 약 3 내지 6.4의 범위이다. 특정 구현예에서, pKa는 약 2.0 내지 4.0, 또는 약 2.0 내지 5.0, 또는 약 2.0 내지 5.5, 또는 약 2.0 내지 6.0의 범위이다. 특정 구현예에서, pKa는 약 4.0 내지 5.0, 또는 약 4.0 내지 5.5, 또는 약 4.0 내지 6.0, 또는 약 4.0 내지 6.4의 범위이다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 카르복실산을 포함한다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 시트르산 또는 아세트산을 포함한다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 시트르산을 포함한다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 킬레이트 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 시트르산은 또한 샘플과 청소 용액의 접촉 동안 킬레이트제로서 작용할 수 있다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 적합한 킬레이트제(즉, 유기산에 더하여 또는 유기산 대신)를 포함할 수 있다. 킬레이트제의 예는 하기에 기재된다.

청소 용액 내의 산(예를 들어, 유기산)의 농도는 청소 용액의 원하는 pH를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 약 50 mM 내지 5 M 범위, 예를 들어, 약 200 mM 내지 5 M, 또는 350 mM 내지 5 M, 또는 500 mM 내지 5 M 범위이다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 약 50 mM 내지 1 M 범위, 예를 들어, 약 200 mM 내지 1 M, 또는 300 mM 내지 1 M, 또는 350 mM 내지 1 M, 또는 400 mM 내지 1 M, 또는 500 mM 내지 1 M 범위이다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 약 350 mM 내지 1 M 범위, 예를 들어, 약 400 mM 내지 1 M, 또는 450 mM 내지 1 M, 또는 500 mM 내지 1 M, 또는 750 mM 내지 1 M 범위이다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 약 300 mM 내지 500 mM 범위, 예를 들어, 약 320 mM 내지 500 mM, 또는 350 mM 내지 500 mM, 또는 370 mM 내지 500 mM 범위이다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 약 300 mM 내지 370 mM 범위, 예를 들어, 약 320 mM 내지 370 mM, 또는 340 mM 내지 370 mM, 또는 350 mM 내지 370 mM, 또는 340 mM 내지 360 mM 범위이다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 약 300 mM 내지 350 mM, 예를 들어, 약 320 mM 내지 350 mM 범위이다.

예를 들어, 생물학적 샘플 및 청소 용액이 조합된 후 샘플 내의 산의 농도는 청소 용액 내의 산의 농도보다 낮다. 따라서, 일부 구현예에서, 산은 생물학적 샘플 및 청소 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 5 mM 내지 250 mM 범위의 농도로 샘플에 존재할 수 있다. 예를 들어, 산의 농도는 생물학적 샘플 및 청소 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 10 mM 내지 250 mM, 또는 50 mM 내지 250 mM, 또는 100 mM 내지 250 mM, 또는 150 mM 내지 250 mM, 또는 200 mM 내지 250 mM 범위이다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 생물학적 샘플 및 청소 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 5 mM 내지 200 mM 범위, 예를 들어, 약 10 mM 내지 200 mM, 또는 50 mM 내지 200 mM, 또는 100 mM 내지 200 mM, 또는 150 mM 내지 200 mM 범위이다. 특정 구현예에서, 산의 농도는 생물학적 샘플 및 청소 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 10 mM 내지 150 mM 범위, 예를 들어, 약 50 mM 내지 150 mM, 또는 100 mM 내지 150 mM 범위이다.

특정 구현예에서, 청소 용액은 염기성이고; 예를 들어, 7 초과의 pH를 갖는다. 예를 들어, 청소 용액은 ≤ 14의 pH, 예를 들어, 약 10 내지 약 14, 또는 약 11 내지 약 14, 또는 약 12 내지 약 14의 pH를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 청소 용액은 ≥ 10의 pH, 예를 들어, 약 10 내지 약 11, 또는 약 10 내지 약 12, 또는 약 10 내지 약 13의 pH를 가질 수 있다. 원하는 염기성 pH를 갖는 상기 청소 용액을 획득하기 위해, 적합한 염기성 pH의 완충액이 포함될 수 있다. 적합한 염기성 완충액 및 농도는 킬레이트제 용액과 관련하여 하기에 기재된 바와 같을 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 방법은 샘플과 수성 킬레이트제 용액을 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 킬레이트제 용액과의 접촉은 청소 용액과의 접촉 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 킬레이트제 용액과의 접촉은 청소 용액과의 접촉 전에 수행된다.

킬레이트제 용액은 하나 이상의 킬레이트제를 포함할 수 있다. 킬레이트제는 소변에 나타나는 칼슘 및 마그네슘 함유 결정(옥살레이트 및 스트루바이트)과 같은 결정을 용해시키는 데 특히 유용하다. 탈결정화제이면 모든 종류의 제제가 사용될 수 있다. 킬레이트제의 일부 예는 에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 테트라소듐 염(EGTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 테트라소듐 염 데하이드레이트(EDTA), 1,2-사이클로헥실렌디니트릴로테트라아세트산(CDTA), 디하이드록시에틸글리신(DHEG), 디아미노하이드록시프로판테트라아세트산(DPTA-OH), 에틸렌디아민-N,N'-디아세트산(EDDA), 에틸렌디아민-N,N'-디-3-프로피오네이트(EDDP), 글리콜에테르디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산(GEDTA), 하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산(HEDTA), 리도페닌(HIDA), 메틸-EDTA, 트리소듐 니트릴로트리아세테이트(NTA), 펜테트산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 시트르산, 소듐 시트레이트, 크라운 에테르 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액은 에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 테트라소듐 염(EGTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 테트라소듐 염 데하이드레이트(EDTA) 또는 이들의 조합물을 포함한다.

킬레이트제 용액에서 하나 이상의 킬레이트제의 농도는 원하는 킬레이트 활성을 달성하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액 내의 각각의 킬레이트제의 농도는 약 3 mM 내지 2 M 범위, 예를 들어, 약 10 mM 내지 2 M, 또는 50 mM 내지 2 M, 또는 100 mM 내지 2 M, 또는 300 mM 내지 2 M, 또는 500 mM 내지 2 M 범위이다. 특정 구현예에서, 각각의 킬레이트제의 농도는 약 1 M 내지 2 M 범위, 예를 들어, 약 1.2 M 내지 2 M, 또는 1.5 M 내지 2M, 또는 1.7 M 내지 2M 범위이다. 특정 구현예에서, 각각의 킬레이트제의 농도는 약 100 mM 내지 1 M 범위, 예를 들어, 약 200 mM 내지 1 M, 또는 300 mM 내지 1 M, 또는 350 mM 내지 1 M, 또는 400 mM 내지 1 M, 또는 500 mM 내지 1 M 범위이다. 특정 구현예에서, 각각의 킬레이트제의 농도는 약 100 mM 내지 500 mM 범위, 예를 들어, 약 200 mM 내지 500 mM, 또는 약 300 mM 내지 500 mM, 또는 약 400 mM 내지 500 mM 범위이다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액 내의 각각의 킬레이트제의 농도는 약 200 mM 내지 370 mM 범위, 예를 들어, 약 250 mM 내지 370 mM, 또는 약 300 mM 내지 370 mM, 또는 약 350 mM 내지 370 mM, 또는 약 340 mM 내지 360 mM 범위이다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액 내의 각각의 킬레이트제의 농도는 약 300 mM 내지 350 mM, 예를 들어, 약 320 mM 내지 350 mM 범위이다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액 내의 하나 이상의 킬레이트제의 전체 농도는 약 1 mM 내지 3 M 범위, 예를 들어, 약 10 mM 내지 3 M, 또는 50 mM 내지 3 M, 또는 100 mM 내지 3 M, 또는 300 mM 내지 3 M, 또는 500 mM 내지 3 M 범위이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 킬레이트제의 전체 농도는 3 mM 내지 2 M, 예를 들어, 약 10 mM 내지 2 M, 또는 50 mM 내지 2 M, 또는 100 mM 내지 2 M, 또는 300 mM 내지 2 M, 또는 500 mM 내지 2 M 범위이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 킬레이트제의 전체 농도는 약 1 M 내지 2 M 범위, 예를 들어, 약 1.2 M 내지 2 M, 또는 1.5 M 내지 2M, 또는 1.7 M 내지 2M 범위이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 킬레이트제의 전체 농도는 약 100 mM 내지 1 M 범위, 예를 들어, 약 200 mM 내지 1 M, 또는 300 mM 내지 1 M, 또는 350 mM 내지 1 M, 또는 400 mM 내지 1 M, 또는 500 mM 내지 1 M 범위이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 킬레이트제의 전체 농도는 약 100 mM 내지 500 mM 범위, 예를 들어, 약 200 mM 내지 500 mM, 또는 약 300 mM 내지 500 mM, 또는 약 400 mM 내지 500 mM 범위이다.

예를 들어, 생물학적 샘플, 청소 용액 및 킬레이트제 용액이 조합된 후 샘플에서 하나 이상의 킬레이트제의 농도는 킬레이트제 용액 내의 하나 이상의 킬레이트제의 농도보다 낮다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 킬레이트제는 생물학적 샘플, 청소 용액 및 킬레이트제 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 2 mM 내지 500 mM 범위, 예를 들어, 10 mM 내지 500 mM, 또는 50 mM 내지 500 mM, 또는 100 mM 내지 500 mM, 또는 150 mM 내지 500 mM, 또는 200 mM 내지 500 mM, 또는 300 mM 내지 500 mM, 또는 400 mM 내지 500 mM 범위의 농도로 샘플에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 킬레이트제는 생물학적 샘플, 청소 용액 및 킬레이트제 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 20 mM 내지 100 mM 범위, 예를 들어, 25 mM 내지 100 mM, 또는 50 mM 내지 100 mM, 또는 75 mM 내지 100 mM 범위의 농도를 갖는다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 킬레이트제는 생물학적 샘플, 청소 용액 및 킬레이트제 용액의 전체 조합 부피를 기준으로 약 15 mM 내지 200 mM 범위, 예를 들어, 20 mM 내지 200 mM, 또는 50 mM 내지 200 mM, 또는 100 mM 내지 200 mM, 또는 150 mM 내지 200 mM 범위의 농도를 갖는다.

킬레이트제 용액은 산성 또는 염기성일 수 있다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액은 염기성이고; 예를 들어, 7 초과의 pH를 갖는다. 예를 들어, 킬레이트제 용액은 ≤ 14의 pH, 예를 들어, 약 10 내지 약 14, 또는 약 11 내지 약 14, 또는 약 12 내지 약 14의 pH를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액은 ≥ 10의 pH, 예를 들어, 약 10 내지 약 11, 또는 약 10 내지 약 12, 또는 약 10 내지 약 13의 pH를 가질 수 있다.

원하는 염기성 pH를 갖는 킬레이트제 용액을 획득하기 위해, 적합한 염기성 pH의 완충액이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 완충액은 하나 이상의 염기를 포함할 수 있다. 적합한 염기는 소듐 하이드록시드, 포타슘 하이드록시드, 칼슘 하이드록시드, 소듐 카르보네이트, 포타슘 카르보네이트, 칼슘 카르보네이트, 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄(TRIS), [트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판설폰산(TAPS), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 2-[[1,3-디하이드록시-2-(하이드록시메틸)프로판-2-일]아미노]에탄설폰산(TES), 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액은 소듐 하이드록시드 용액을 포함한다.

특정 구현예에서, 킬레이트제 용액은 산성이고; 예를 들어, 7 미만의 pH를 갖는다. 예를 들어, 킬레이트제 용액은 ≤ 6의 pH, 예를 들어, 약 3 내지 약 6, 또는 약 4 내지 약 6, 또는 약 5 내지 약 6의 pH를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액은 ≤ 5의 pH, 예를 들어, 약 3 내지 약 5, 또는 약 4 내지 약 5, 또는 약 3 내지 약 4의 pH를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액은 심지어 ≤ 3의 pH를 가질 수 있다. 원하는 산성 pH를 갖는 상기 킬레이트제 용액을 획득하기 위해, 적합한 산성 pH의 완충액이 포함될 수 있다. 적합한 산성 완충액 및 농도는 청소 용액과 관련하여 상기 기재된 바와 같을 수 있다.

본 발명의 개시의 방법은 유리하게는 유사한 분석물에 대한 전통적인 검정 방법보다 적은 부피의 샘플을 필요로 한다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 방법의 특정 구현예에서, 샘플 부피는 약 10 μL 내지 약 500 μL; 예를 들어, 약 10 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 10 μL 내지 약 100 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 200 μL이다.

본 발명의 개시의 청소 용액은 원하는 적용에 기초하여 특정 부피로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 방법의 특정 구현예에서, 청소 용액 부피는 약 1 μL 내지 약 500 μL; 예를 들어, 약 1 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 100 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 50 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 200 μL이다.

본 발명의 개시의 킬레이트제 용액은 원하는 적용에 기초하여 특정 부피로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 개시의 방법의 특정 구현예에서, 킬레이트제 용액 부피는 약 1 μL 내지 약 500 μL; 예를 들어, 약 1 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 100 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 50 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 50 μL 내지 약 200 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 500 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 300 μL, 또는 약 100 μL 내지 약 200 μL이다.

일 예시적 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 개시의 방법은 생물학적 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 산성 수성 청소 용액을 접촉시킨 후, 샘플과 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는 염기성 수성 킬레이트제 용액을 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 예시적 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 상기 방법은 샘플에서 박테리아의 양을 결정하는 것을 추가로 포함한다.

일 예시적 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 개시의 방법은 생물학적 샘플과 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는 염기성 수성 킬레이트제 용액을 접촉시킨 후 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 산성 수성 청소 용액을 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 예시적 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 상기 방법은 샘플에서 박테리아의 양을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플은 박테리아의 양을 결정하기 전에 원심분리된다. 일부 구현예에서, 원심분리는 청소 용액의 첨가 전 또는 후에 수행될 수 있다. 추가 구현예에서, 원심분리는 킬레이트제 용액의 첨가 전 또는 후에 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 샘플은 박테리아의 양을 결정하기 전에 원심분리되지 않는다.

청소 용액 및 킬레이트제 용액(사용되는 경우)으로 처리 후이나, 샘플 내 박테리아의 양을 결정하기 전에, 샘플은 일정 기간 동안 방해받지 않고 유지(즉, 인큐베이션)될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 샘플은 약 30초 내지 약 30분 동안 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 약 30초 내지 약 20분, 또는 약 30초 내지 약 10분, 또는 약 30초 내지 약 5분, 또는 약 30초 내지 약 2분, 또는 약 1분 내지 약 30분, 또는 약 1분 내지 약 20분, 또는 약 1분 내지 약 15분, 또는 약 1분 내지 약 10분, 또는 약 1분 내지 약 5분, 또는 약 5분 내지 약 30분, 또는 약 5분 내지 약 20분, 또는 약 5분 내지 약 15분, 또는 약 5분 내지 약 10분, 또는 약 2분 내지 약 8분, 또는 약 3분 내지 약 7분, 또는 약 2분 내지 약 13분, 또는 약 3분 내지 약 12분 동안 샘플을 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 방법은 샘플과 박테리아에 대한 염색 또는 염료를 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 염색 및 염료의 일부 예는 라이트(Wright) 염색(선택적으로 에오신과 함께 메틸렌 블루), 크리스탈 바이올렛 염료(예를 들어, 그램스 요오드(grams iodine) 및 사프라닌(safranin)을 가짐), 및 형광 분자로 태깅된 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 박테리아는 샘플과 염색 또는 염료의 접촉 전에 투과화된다. 물론, 특정 구현예에서, 샘플 내 박테리아의 양은 박테리아를 염색하거나 사멸시키지 않고 결정된다. 추가 구현예에서, 박테리아는 투과화되지 않는다.

박테리아의 양은 박테리아를 계수하거나 박테리아를 분석(예를 들어, 박테리아 모양 또는 크기에 대해)하여 결정될 수 있다. 상기 방법은 광학 현미경 하에서의 샘플 이미지의 분석을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 현미경 슬라이드, 모세관 또는 큐벳, 예를 들어, SediVue® 큐벳(IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine, U.S.A.)에 적용될 수 있다. 명시야, 암시야 및 형광 현미경검사와 같은 다양한 현미경검사 기술이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 계수는 수동으로(예를 들어, 컴퓨터 영상화의 도움 없이) 수행될 수 있다. 예를 들어, 현미경을 통해 직접 샘플을 보는 사람에 의해 수동 계수가 수행될 수 있다. 수동 계수는 현미경 슬라이드 등의 그리드 영역 당 박테리아의 수를 계수하고, 이러한 계수를 사용하여 소변의 부피 단위 당 박테리아의 수를 계산하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아는 모양(예를 들어, 쌍구균 및 구균 사슬과 같은 구균을 포함하는 구균, 또는 막대균)를 결정하고/하거나 크기를 결정하기 위해 현미경 하에서 분석될 수 있다. 일부 구현예에서, 분석은 수동으로(예를 들어, 컴퓨터 영상화의 도움 없이) 수행될 수 있다. 예를 들어, 현미경을 통해 직접 샘플을 보는 사람에 의해 수동 분석이 수행될 수 있다.

박테리아의 양은 또한,

카메라에 의해 접촉된 샘플의 이미지를 생성하는 단계;

이미지 내의 박테리아와 관련된 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및

샘플에서 박테리아의 양을 획득하기 위해 픽셀 수를 미리 결정된 픽셀 수와 상관시키는 단계에 의해 결정될 수 있다:

특정 구현예에서, 미리 결정된 픽셀 수는 공지된 양의 박테리아를 갖는 표준 샘플을 사용하여 독립적으로 경험적 실험을 수행하여 획득될 수 있다.

일부 구현예에서, 알고리즘, 프로그램 또는 소프트웨어를 사용하여 샘플 내의 박테리아의 양을 정량화할 수 있다. 일부 구현예에서, 카메라에 연결되거나 카메라와 통신하는 컴퓨팅 장치는 샘플 내의 박테리아의 양을 측정하기 위해 명령(예를 들어, 컴퓨팅 장치의 메모리에 저장된 명령)을 실행한다. 상기 명령은 육안 기술과 관련하여 상기 기재된 측정의 일부를 자동화하기 위해 컴퓨팅 장치의 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 명령은 샘플의 이미지에서 박테리와 관련된 픽셀의 수(예를 들어, 박테리아 세포 또는 박테리아 세포로 구성되는 이미지의 영역에 해당함)를 측정하거나 결정하여 샘플에서 박테리아의 양을 측정하도록 구성될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 명령은 컴퓨팅 장치가 박테리아를 포함하는 샘플의 이미지 영역을 측정함으로써 샘플 내의 박테리아의 양을 측정하도록 할 수 있다. 박테리아를 포함하는 영역을 측정하는 것은 박테리아와 관련된 이미지의 픽셀 수를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 박테리아를 이미지의 배경과 구별하는 것은 픽셀과 관련된 수치 값을 분석하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이미지 내의 각각의 픽셀은 수집된 빛의 양, 강도 수준, 밝기, 채색, 그레이스케일 또는 픽셀의 다른 광학 특성(예를 들어, 8-비트 이미지의 픽셀은 0 내지 255의 수로 표현될 수 있으며, 여기서 0은 흑색에 해당하고 0은 백색에 해당함)에 해당하는 값을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 역치보다 높은 값을 갖는 픽셀은 박테리아를 포함하는 것으로 간주되는 반면, 역치 값보다 낮은 값을 갖는 픽셀은 백그라운드로 간주되도록 역치 값이 설정될 수 있다. 이러한 경우, 박테리아와 관련된 픽셀의 수를 결정하는 것은 일부 역치 값보다 높거나 낮은 픽셀의 수를 결정하는 것을 포함할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 방법은, 예를 들어, 박테리아를 측정하기 위해 생물학적 샘플에서 수행된다. 일반적으로, 본 발명의 개시의 방법은 본 발명의 개시의 방법을 수행한 후, 예를 들어, 청소 용액, 킬레이트제 용액 또는 둘 모두와 접촉한 후 생물학적 샘플 내의 박테리아의 일부가 생존한 채로 남아있는 것을 가능하게 한다. 따라서, 특정 구현예에서, 샘플 내의 박테리아의 적어도 일부는 청소 용액, 킬레이트제 용액 또는 둘 모두와 접촉한 후에도 생존한 채로 남아 있는다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 샘플 내의 박테리아의 적어도 10%, 예를 들어, 10%-100%, 10%-80%, 10%-50%, 25-40%는 본 발명의 개시의 방법을 수행한 후 생존한 채로 남아 있는다. 특정 구현예에서, 샘플 내의 박테리아의 적어도 30%, 예를 들어, 30%-100%, 30-80% 또는 30-60%는 본 발명의 개시의 방법을 수행한 후 생존한 채로 남아 있는다. 특정 구현예에서, 샘플 내의 박테리아의 적어도 50%, 예를 들어, 50-100%, 50-85% 또는 60-100%는 본 발명의 개시의 방법을 수행한 후 생존한 채로 남아 있는다. 특정 구현예에서, 샘플 내의 본질적으로 모든 박테리아(예를 들어, 적어도 95%, 98% 또는 심지어 100%)는 본 발명의 개시의 방법을 수행한 후 생존한 채로 남아 있는다.

특정 구현예에서, 생물학적 샘플 내의 박테리아의 10% 미만은 본 발명의 개시의 방법을 수행한 후 살아 있는 채로 남아 있으며; 예를 들어, 본 발명의 개시의 방법을 수행한 후 5% 미만 또는 1% 미만의 박테리아가 살아 있는 채로 남아 있거나 본질적으로 어떠한 박테리아도 살아 있는 채로 남아있지 않는다.

특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 방법은 먼저 생물학적 샘플이 박테리아에 대한 분석을 방해하는 비-박테리아성 미립자 물질을 함유하는지 결정한 후, 본원에 기재된 바와 같은 방법(예를 들어, 생물학적 샘플과 수성 청소 용액을 접촉시키는 것 등)을 수행하는 것을 포함한다. 당업자는 생물학적 샘플의 일부만이 첫 번째 결정에 사용될 것이고, 생물학적 샘플의 상이한 일부가 수성 청소 용액과 접촉될 것임을 인식한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 개시의 방법은 샘플을 청소 용액과 접촉시키기 전에 생물학적 샘플의 일부를 회수하고, 박테리아에 대해 일부를 분석하고; 비-박테리아성 미립자 물질의 존재 또는 양이 박테리아에 대한 분석을 방해하는지 결정하는 것을 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 개시는,

생물학적 샘플의 첫 번째 일부를 상기 첫 번째 일부 내의 박테리아에 대해 분석하는 단계;

비-박테리아성 미립자 물질의 존재 또는 양이 박테리아에 대한 분석을 방해하는지 결정하는 단계;

생물학적 샘플의 두 번째 일부와 본원에 기재된 바와 같은 수성 청소 용액을 접촉시키는 단계; 및

두 번째 일부에서 박테리아를 결정하여 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 박테리아를 측정하기 위한 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 방법은 샘플에서 박테리아의 적어도 결정된 농도에 기초하여 환자의 건강 상태에 대한 결정을 내리는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 카메라와 통신하는 컴퓨팅 장치(예를 들어, 컴퓨터, 서버, 프로세서 또는 제어장치)는 결정된 박테리아 농도를 사용하여 건강 상태를 결정하거나, 질병(예를 들어, 감염)을 진단하거나, 위험 요소를 표현하거나, 환자의 건강에 대한 일부 기타 정보를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 건강 상태(예를 들어, 박테리아 감염)를 진단하는 것은 박테리아의 양이 역치 값을 초과하거나 미만인지를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 다른 건강 상태 및 분석은 당업자에 의해 구상된다. 일반적으로, 건강 상태는 요로 감염이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다" 및 "포괄하다" 및 변형(예를 들어, "-을 포함하다", "포유하는", "-을 포괄하다", "포괄하는")은 언급된 성분, 특징, 요소 또는 단계 또는 성분, 특징, 요소 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하나, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하지 않음이 이해될 것이다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지 표현될 수 있다. 상기 범위가 표현되는 경우, 또 다른 양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 앞에 "약"을 이용하여 값이 근사치로 표현되는 경우, 특정 값이 또 다른 양태를 형성하는 것이 이해될 것이다. 각각의 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점과 독립적으로 모두 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다.

본원에서 사용되는 "환자"는 온혈 동물, 예를 들어, 포유동물, 바람직하게는 인간, 고양이, 개, 설치류, 영장류 또는 말을 나타낸다. 환자는 건강할 수 있거나, 본원에 기재된 하나 이상의 질병 및 장애로 고통받거나 고통받을 잠재성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 개시의 생물학적 샘플은 환자로부터 획득되거나 유래될 수 있다.

본원에서 사용되는 "염"은 본 발명의 개시의 화합물의 산 부가염을 포함한다. 염은 알칼리 및 알칼리 토금속, 예를 들어, 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등 뿐만 아니라 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온, 비제한적인 예로, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 기반으로 한 양이온을 포함할 수 있다.

실시예

본 발명의 개시의 방법은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명의 개시를 특정 절차 및 이에 기재된 물질에 대한 범위 또는 사상으로 제한하는 것으로 해석되어선 안 된다.

실시예 1

신선하고 냉장된 소변을 분석 직전까지 2-8℃에서 보관하였다. 분석 전에 샘플을 실온(대략 25℃)으로 가온하였다. 샘플의 수령 후 가능한 한 신속히(예를 들어, 12시간 이내) 분석이 수행되어야 한다.

25 mL의 350 mM 시트르산에 875 mg의 소듐 메틸 올레오일 타우레이트(Solvay로부터 Geropon T77로서 이용 가능함, CAS RN 137-20-2)를 용해시켜 청소 용액을 제조하였다. 킬레이트제 용액을 500 mM 소듐 하이드록시드 내에 325 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 테트라소듐 염 데하이드레이트(EDTA, Sigma로부터 이용 가능함; CAS: 10378-23-1), 325 mM 에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 테트라소듐 염(EGTA, Sigma로부터 이용 가능함; CAS RN: 13368-13-3)을 갖도록 제조하였다.

박테리아를 확인하기 어렵게 만드는 충분히 밀집된 샘플 및 박테리아와 구별하기 어려운 작은 파편을 갖는 샘플이 이러한 절차에 특히 적합하다.

특히, 60 μL의 잘 혼합된, 회전되지 않은 소변 샘플을 적절한 편평 바닥 미세역가 웰에 넣었다. 이후, 15 μL의 청소 용액을 웰에 첨가하고, 불필요한 거품이 도입되지 않도록 주의하면서 위 아래로 5회 피펫팅하여 가볍게 혼합하였다. 이후, 15 μL의 킬레이트제 용액을 첨가하고, 불필요한 거품이 도입되지 않도록 주의하면서 위 아래로 5회 피펫팅하여 가볍게 혼합하였다. 이후, 샘플을 5-10분 동안 그대로 두어 침전시켰다. 위상차 필터, 10x 및 40x 대물 렌즈를 갖는 도립 광학 현미경을 사용하여 박테리아의 양을 결정하였다.

혈액 함유 개 소변을 상기 기재된 물질 및 절차를 사용하여 처리하였다. 도 2a에 제공된 바와 같이, 처리 전 샘플은 유의한 양의 혈액 세포 및 기타 오염물질을 함유하였다. 처리 후, 샘플은 혈액 세포 및 기타 오염물질이 광학적으로 청소되었다(도 2b).

실시예 2

LB 브로쓰에서 성장된 개 전혈 및/또는 E. 콜리를 0.2 μm 여과된 개 소변(본원에서 소변 여과액으로 언급됨)의 배지에 첨가하였다. 희석액은 4시간 E. 콜리 배양액의 60x였다. 혈액 샘플의 경우, 전체 희석액은 약 1200x였다. 물을 희석액 대조군으로 사용하고, 소변 여과액에 1:9의 비율로 첨가하였다. 청소 및 킬레이트제 용액 둘 모두는 수성이므로 물을 대조군으로 선택하였다. 청소 및 킬레이트제 용액을 실시예 1에 따라 제조하고, 동일한 절차를 따랐다.

도 3에 제공된 바와 같이, 본 발명의 개시의 방법은 박테리아를 온전하게 유지하면서 혈액 세포막을 파괴한다. 여기서, 본 발명의 개시의 방법을 이용한 처리는 혈액만 있는 샘플에서 박테리아의 부재, 및 E. 콜리를 갖는 샘플에서 박테리아의 존재를 나타내었다. 물 대조군은 혈액만 있는 샘플에서도 박테리아의 존재를 나타내었다(즉, 거짓 양성 결과였다). 결과의 이미지는 도 4에 제공된다.

실시예 3

큰 결정성 파편뿐만 아니라 다수의 혈액 세포 및 박테리아를 함유하는 개 소변을 SMOT의 10% w/v 용액과 19:1로 조합하고, 혼합하였다(즉, SMOT의 최종 농도는 0.5%였다). 생성된 혼합물을 500 mM EDTA 및 500 mM EGTA를 함유하는 용액과 19:1로 조합하고(즉, 최종 농도는 각각의 킬레이트제의 25 mM였음), 가볍게 혼합하여 처리된 샘플을 생성시켰다. 미처리된 소변 및 처리된 샘플은 맞춤형 반-자동화 현미경 시스템으로 관찰하고 사진 촬영하였다. 결과의 예시적 이미지는 도 5에 제공된다. 본 발명의 개시의 방법(즉, SMOT 및 킬레이트 용액을 이용한 처리)은 결정성 파편 및 혈액 세포의 소변을 청소하였으나, 박테리아는 가시적인 채로 남겼다.

실시예 4

3개의 시험 생물학적 샘플을 다음과 같이 제조하였다. 5 μL의 개 전혈을 3 mL의 여과된 멸균 개 소변에 첨가하여 "혈액" 샘플을 제조하였고; 4시간 E. 콜리 배양물을 함유하는 50 μL의 리소겐성 브로쓰(lysogeny broth; LB)를 3 mL의 여과된 멸균 개 소변에 첨가하여 "E. 콜리" 샘플을 제조하였고; 5 μL의 개 전혈 및 4시간 E. 콜리 배양물을 함유하는 50 μL의 LB를 3 mL의 여과된 멸균 개 소변에 첨가하여 "혈액 및 E. 콜리" 샘플을 제조하였다.

SMOT의 10% w/v 용액 및 물 중 소듐 콜레이트의 10% w/v 용액(CAS: 361-09-1)을 또한 물에서 제조하였다. 100 μL의 SMOT 용액, 100 μL의 콜레이트 용액 또는 100 μL의 평범한 물을 900 μL의 3개의 시험 생물학적 샘플 각각에 첨가하여 처리된 샘플을 획득하였다. 이후, 165 μL의 처리된 샘플을 SediVue Dx® 소변 침전물 분석기(IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, Maine에서 이용 가능함)에서의 분석을 위해 SediVue® 카트리지로 옮겼다.

결과는 도 6에 제시된다. 그래프의 좌측 패널은 기기로 측정된 박테리아(구균 및 막대균)의 수를 제시하며, x-축은 고전력장 당 평균 박테리아 수를 나타낸다. 그래프의 우측 패널은 기기로 측정된 적혈구(RBC)의 수를 제시하며, x-축은 상대적인 RBC 풍부도를 나타낸다. 대조군 샘플(물)에서, 기기는 혈액 함유 소변 샘플에서 박테리아를 보고하였다. 따라서, RBC는 거짓 양성 박테리아 수를 발생시켰다. SMOT 또는 소듐 콜레이트를 이용한 샘플의 처리 후, 혈액 함유 소변 샘플은 물 처리 샘플과 비교하여 전체 박테리아 수를 유의하게 감소시켰다. 따라서, SMOT 또는 소듐 콜레이트를 이용한 소변 샘플에 대한 본 발명의 개시의 처리 방법은 RBC 청소에 효과적이며, 박테리아 계수의 정확도를 개선시킨다.

실시예 5

SMOT를 포화시켜 다음과 같이 소듐 메틸 스테아로일 타우레이트(즉, 2-[메틸(옥타데카노일)아미노]에탄설포네이트 소듐 염 또는 SMST)를 획득하였다. 500 mg의 소듐-N-메틸-N-올레일 타우레이트(1.2 mmol), 암모늄 포르메이트(884 mg, 12 mmol, 10 eq) 및 10% Pd/C(380 mg, 0.3 mmol)를 비활성 대기(아르곤)하에서 메탄올(30 mL)에 현탁시켰다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 비활성 대기하에서 교반하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 셀라이트를 3 x 20 mL 에틸 아세테이트로 세척하였다. 조합된 유기물을 회전 증발 하에서 제거하여 황색 오일로서 생성물(소듐-N-메틸-N-스테아로일 타우레이트)을 제공하였다. SMOT 청소 용액을 350 mM 시트르산 중 3.5% w/v SMOT을 갖도록 제조하고; SMST 청소 용액을 350 mM 시트르산 중 2.2% w/v SMST를 갖도록 제조하고; 킬레이트 용액을 500 mM NaOH 중 325 mM EDTA, 325 mM EGTA를 갖도록 제조하였다. 개 소변 샘플(60 μL)을 먼저 15 μL의 청소 용액(즉, SMOT 또는 SMST)으로 처리하였다. SMOT 처리된 샘플 내의 SMOT의 농도는 0.7% w/v인 반면, SMST 처리된 샘플 내의 SMST의 농도는 0.44% w/v였다. 소변 샘플을 청소 용액으로 처리한 후, 15 μL의 킬레이트 용액을 첨가하였다. 처리된 샘플을 SediVue Dx® 소변 침전물 분석기에서의 분석을 위해 SediVue® 카트리지로 옮겼다.

도 7에 제공된 바와 같이, SMOT을 이용한 본 발명의 개시의 처리 방법은 샘플의 광학적 청소를 발생시켰다. 그러나, SMST를 이용한 처리는 샘플의 광학적 청소를 발생시키지 않았다.

비교예 6

6개의 상이한 킬레이트제 용액을 제조하였다: 200 mM EDTA 용액; 200 mM EGTA 용액; 1M EDTA 용액; 1M EGTA 용액; 100 mM/100 mM EDTA/EGTA; 및 500 mM/500 mM EDTA/EGTA.

각각의 킬레이트제 용액(5 μL)을 결정을 함유하는 195 μL의 개 소변에 개별적으로 첨가하였다. 따라서, 처리된 샘플의 최종 농도는 다음과 같았다: 5 mM EDTA; 5 mM EGTA; 25 mM EDTA; 25 mM EGTA; 2.5 mM/2.5 mM EDTA/EGTA; 및 12.5 mM/12.5 mM EDTA/EGTA. 이후, 165 μL의 처리된 샘플을 SediVue 분석기에서의 분석을 위해 SediVue® 카트리지에 첨가하였다. 여기에서, HPF(고전력장) 당 칼슘 옥살레이트 결정 및 마그네슘 암모늄 포스페이트(스트루바이트) 결정의 수를 평가하였다.

킬레이트제 용액을 이용한 결정 함유 소변 샘플의 처리 후 자동화 결정 계수의 결과가 도 8a에 제공된다. 각각의 킬레이트제 용액을 이용한 처리는 칼슘 옥살레이트 및 스트루바이트 결정 수의 감소를 발생시켰고, 더 높은 킬레이트제 농도에서 결정 수가 더 많이 감소하였다.

결정 수에 대한 인큐베이션 시간의 효과를 결정하기 위해, 5 μL의 킬레이트제 용액(1M EDTA; 1M EGTA; 또는 500 mM EDTA 및 500 mM EGTA)을 결정을 함유하는 195 μL의 개 소변에 개별적으로 첨가하고, 기기에서 분석 전 5분 동안 인큐베이션하였다. 스트루바이트 결정 수 결정의 결과는 도 8b에 제시된다. 각각의 킬레이트제 용액을 이용한 처리 후 5분의 인큐베이션 기간은 스트루바이트 결정 수의 추가 감소를 발생시켰다.

실시예 7

10% w/v SMOT의 200 μL 분취량을 다양한 양(0.2 μL에서 6.4 μL)의 4 M 시트르산 또는 4 M 아세트산과 조합하여 다양한 산도의 청소 용액을 생성시켰다. 16.5 μL의 각각의 청소 용액을 결정성 파편 및 박테리아를 갖는 165 μL의 개 소변에 가벼운 혼합과 함께 첨가하였다. 생성된 용액의 pH를 측정하고, 165 μL의 이러한 용액을 SediVue® 카트리지로 옮기고, SediVue 분석기를 사용하여 전체 결정 수(CRY)를 측정하였다.

pH 값 및 전체 결정 수(CRY)를 증가하는 양의 산에 대해 작도하고, 이들 결과는 도 9a에 제공된다. 시트르산 또는 아세트산의 첨가는 CRY 수의 감소를 발생시켰다. 적어도 0.2 μL의 시트르산(4.5의 최종 pH를 가짐)의 첨가, 또는 적어도 0.4 μL의 아세트산(5.0의 최종 pH를 가짐)의 첨가로 CRY 수가 0으로 떨어졌다. 그러나, 도 9b에 제시된 바와 같이, 아세트산은 4.5 미만의 pH 값에서 박테리아 수의 급격한 증가를 발생시켰고, 이는 아세트산을 이용한 처리가 박테리아로 잘못 계산되는 특징을 발생시키는 것을 시사한다. 따라서, 특정 구현예에서, 시트르산은 넓은 범위의 pH 값에서 청소 용액에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 아세트산은 ≥4.5의 pH에서 청소 용액에 사용될 수 있다.

실시예 8

결정성 파편(대부분 스트루바이트)을 갖는 165 μL 개 소변을 10 w/v % SMOT을 함유하고 154 mM 내지 1 M 시트르산 범위를 함유하는 16.5 μL의 일련의 청소 용액으로 처리한 후, 가볍게 혼합하였다. 이후, 165 μL의 이러한 혼합물을 16.5 μL의 물과 조합하고, 가볍게 혼합하였다. 이후, 165 μL의 생성된 혼합물을 SediVue® 카트리지에 넣고, SediVue 분석기를 사용하여 전체 결정 수를 측정하였다. 표 1에 제공된 바와 같이, 고전력장 당 전체 결정 수는 청소 용액에서 시트르산의 농도가 증가함에 따라 감소하였다.

표 1.

다음으로, 전체 결정 수에 대한 킬레이트제 용액에 대한 pH의 효과를 검사하였다. 165 μL의 개 소변을 16.5 μL의 물 또는 1M 시트르산 중 10% w/v SMOT를 함유하는 16.5 μL의 청소 용액과 조합한 후, 가볍게 혼합하였다. 이후, 165 μL의 이러한 혼합물을 500 mM EDTA, 500 mM EGTA 및 NaOH(0 mM, 500 mM 또는 2000 mM)를 함유하는 16.5 μL의 일련의 킬레이트제 용액과 조합하고, 가볍게 혼합하였다. 이후, 165 μL의 생성된 혼합물을 SediVue® 카트리지에 넣고, SediVue 분석기를 사용하여 전체 결정 수를 측정하였다. 표 2에 제공된 바와 같이, 고전력장 당 전체 결정 수는 EDTA 및 EGTA의 첨가에 따라 감소하였다. 전체 결정 수는 청소 용액에서 NaOH의 농도가 증가함에 따라(즉, pH가 증가함에 따라) 추가로 감소하였다.

표 2.

실시예 9

소변 결정, 박테리아 및 0.1% v/v의 개 혈액을 함유하는 165 μL의 개 소변을 16.5 μL의 청소 용액(1M 시트르산 중 10% w/v SMOT)과 조합하고, 가볍게 혼합하였다. 처리된 소변 샘플 내의 SMOT의 최종 농도는 0.9%w/v였고, 시트르산은 91 mM이었다. 이후, 이러한 혼합물 165 μL에 16.5 μL의 킬레이트제 용액(500 mM EGTA, 500 mM EDTA, 2M NaOH)을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 첨가 후 EGTA 및 EDTA의 최종 농도는 각각 45 mM이었고, NaOH는 182 mM이었다. 이후, 165 μL의 생성된 혼합물을 SediVue® 카트리지에 넣고, 즉시 또는 4분 인큐베이션 후 SediVue 분석기를 사용하여 분석하였다. 음성 대조군은 소변 결정, 박테리아 및 0.1% v/v의 개 혈액을 함유하는 미처리된 개 소변이었다.

도 10a는 처리 없이, 처리 및 즉시 분석과 함께, 및 4분 인큐베이션 후 처리와 함께한 소변의 현미경 이미지를 제시한다. 즉시 분석을 통해, 대부분의 적혈구(RBC) 및 결정이 샘플에서 청소되었으나, 박테리아는 여전히 눈에 띄었다. 4분 인큐베이션은 결정 및 세포 파편으로부터 샘플을 청소하는 데 있어서 추가 개선을 발생시켰으나, 박테리아는 여전히 눈에 띄었다. 예를 들어, 기기에 의해 계수(4분 인큐베이션 없이)되는 고장력장 당 RBC의 수는 미처리된 샘플에서 6.30 및 처리된 샘플에서 1.84였다. 따라서, 본 발명의 개시의 처리 방법은 71%의 RBC 수의 감소를 발생시켰다. 기기에 의해 계수되는 바와 같이 고장력장 당 전체 결정의 수(4분 인큐베이션 없이)는 미처리된 샘플에서 2.88이었고, 처리된 샘플에서 0.31이었다. 따라서, 본 발명의 개시의 처리 방법은 89%의 전체 결정 수의 감소를 발생시켰다.

다음으로, 박테리아를 함유하는 것으로 공지된 165 μL의 고도로 결정화된 개 소변을 상기 기재된 바와 같이 16.5 μL의 청소 용액으로 처리하고, 가볍게 혼합하였다. 165 μL의 이러한 혼합물에, 상기 기재된 바와 같은 16.5 μL의 킬레이트제 용액을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 처리된 최종 샘플의 분취량을 광학 현미경검사를 이용하여 미처리된 고도로 결정화된 개 소변과 비교하였다. 도 10b에 제시된 바와 같이, 소변 결정 및 박테리아는 미처리 소변에서 볼 수 있었다. 처리된 소변에서 결정이 아닌 박테리아만 보였다. 따라서, 본 발명의 개시의 처리 방법은 고도로 결정화된 샘플에서 결정을 용해시킬 수 있었다. 처리 방법은 광학 현미경검사로 결정시 결정의 소변을 청소하였고, 박테리아를 온전하게 유지하였고, 예를 들어, 추가 분석에 이용 가능하게 하였다.

점액, 세포 파편 및 박테리아를 함유하는 165 μL의 개 소변에 대해 상기 기재된 바와 같이 또 다른 실험을 수행하였다. 청소 용액 및 킬레이트제 용액은 상기 기재된 바와 같았다. 처리된 샘플의 분취량을 광학 현미경검사를 이용하여 미처리된 소변과 비교하였다. 점액, 세포 파편 및 박테리아(구균 사슬을 포함함)가 미처리된 소변에서 보였다. 처리된 소변에서, 구균 사슬을 포함하는 박테리아가 보였고; 점액 및 세포 파편은 보이지 않았다. 따라서, 본 발명의 개시의 처리 방법은 광학 현미경검사에 의해 결정시 점액 및 세포 파편의 소변을 청소하였고, 박테리아를 온전하게 유지하였다(분쇄되지 않은 구균 사슬을 포함함).

최종적으로, 처리 전후 기기에 의한 박테리아 인지 성능을 정량적 배양과 비교하였다. 본 실험에서 박테리아를 함유하는 것으로 공지된 162개의 신선한 소변 샘플을 사용하였다. 정량적 배양을 위해, 소변 샘플을 희석시키고, 당 분야에 널리 공지된 절차에 따라 혈액 아가 플레이트에 플레이팅하였다. 예를 들어, 소변 샘플을 1:49로 희석시키고, 50 μL의 희석액을 혈액 아가에 플레이팅하였다. 밤새 인큐베이션 후, 콜로니의 수를 계수하고, 소변 밀리리터 당 박테리아의 역가를 계산하였다. 이후, 샘플을 10⁶ 세포/mL, 10⁵ 세포/mL 및 10⁴ 세포/mL의 3개의 역치에 따라 양성/음성 빈(bin)으로 그룹화하였다. 예를 들어, 10⁶ 세포/mL의 역치에서, 10⁶ 박테리아/mL 이상의 소변 샘플은 양성으로 간주하였고, 10⁶ 박테리아/mL 미만의 소변 샘플은 음성으로 간주하였다. SediVue 분석기에서의 결정을 위해, 165 μL의 소변 샘플을 상기 기재된 바와 같은 16.5 μL의 청소 용액과 조합하고, 가볍게 혼합하였다. 165 μL의 이러한 혼합물에, 상기 기재된 바와 같은 16.5 μL의 킬레이트제 용액을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 이후, 165 μL의 생성된 혼합물을 SediVue® 카트리지에 넣고, SediVue 분석기를 사용하여 분석하였다. 분석기가 "양성" 또는 "음성" 호출을 반환하였다. 결과는 표 3에 제공된다.

표 3.

표 3에서, SediVue 분석기에 의해 이루어진 호출을 배양 결과와 비교하였다. 예를 들어, 10⁵ 박테리아/mL 농도에서, 84개의 샘플이 배양에 의해 음성이었다. 이들 중, 72개가 처리를 이용하여 분석기에 의해 음성으로 호출되었고, 12개가 처리를 이용하여 분석기에 의해 양성으로 호출되었다. 10⁵ 박테리아 농도에서, 78개의 샘플이 배양에 의해 양성이었다. 이들 중, 9개가 처리를 이용하여 기기에 의해 음성으로 호출되었고, 69개가 처리를 이용하여 기기에 의해 양성으로 호출되었다. 처리 전후 박테리아 배양과 비교하여 SediVue 분석기 호출의 성능은 다음과 같았다: 10⁶ 역치에서, 정확도는 77%에서 80%로 개선되었고, 민감성은 74%에서 96%로 증가하였고, 특이성은 79%에서 73%로 감소하였다. 10⁵ 역치에서, 정확도는 77%에서 87%로 증가하였고, 민감성은 67%에서 88%로 증가하였고, 특이성은 88%에서 86%로 감소하였다. 10⁴ 역치에서, 정확도는 71%에서 77%로 증가하였고, 민감성은 58%에서 73%로 증가하였고, 특이성은 89%에서 83%로 감소하였다. 이들 결과는 본 발명의 개시의 방법의 처리가 광범위한 비뇨기 박테리아 역가에 걸쳐 현미경 박테리아 계수 성능을 개선시킨 것을 나타낸다. 혈액 아가 방법은 생존 가능한 박테리아(즉, 콜로니 형성 단위)만 계수하는 반면, 기기의 광학 계수 방법은 생존할 수 없는 박테리아도 계수할 것을 인지하는 것이 중요하다.

실시예 10

본 발명의 개시의 방법에 따른 처리 전후 SediVue 분석기에 의한 박테리아 인지 성능을 정량적 배양과 비교하였다. 317개의 신선한 개 소변 샘플을 사용하였다. 정량적 배양을 위해, 소변 샘플을 희석시키고, 상기 기재된 바와 같이 혈액 아가 플레이트에 플레이팅하였다. 10⁵ 박테리아/mL 이상의 역가를 갖는 소변은 배양에 의해 양성으로 간주하였고, 10⁵ 박테리아/mL 미만은 배양에 의해 음성으로 간주하였다.

자동화된 현미경검사를 위해, 165 μL의 개 소변을 30 μL의 청소 용액(500 mM 시트르산 중 5% w/v SMOT)으로 처리하고, 가볍게 혼합하였다. 처리된 소변 샘플 내의 SMOT의 최종 농도는 0.8%w/v였고, 시트르산은 77 mM이었다. 이후, 이러한 혼합물 165 μL에 50 μL의 킬레이트제 용액(250 mM EGTA, 250 mM EDTA, 330 mM NaOH)을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 첨가 후 EGTA 및 EDTA의 최종 농도는 각각 58 mM이었고, NaOH는 77 mM이었다. 이후, 165 μL의 생성된 혼합물을 SediVue® 카트리지에 넣고, SediVue 분석기를 사용하여 분석하였다. 음성 대조군은 미처리된 개 소변이었다. 이러한 기기는 박테리아 수 결과를 음성, 양성 의심(즉, 모호함) 및 양성의 3개의 빈으로 분류하는 알고리즘을 사용하였다. 결과는 표 4에 제공된다.

표 4.

표 4에 제공된 바와 같이, 미처리(순) 소변의 경우, SediVue 알고리즘은 박테리아의 존재에 대해 32개의 샘플(10.1%)을 모호(±)하게 호출하였다. 처리된 소변으로, 모호한 호출의 수가 18개(5.7%)로 감소하였다. 따라서, 본 발명의 개시의 방법의 처리는 기기에 의해 이루어진 모호한 박테리아 호출의 수를 감소시켰다. 박테리아 배양에 비한 SediVue 호출의 성능은 다음과 같았다: 정확도는 79.8%에서 86.4%로 증가하였고, 민감성은 74.8%에서 80.9%로 증가하였고, 특이성은 82.7%에서 89.6%로 증가하였다. 요약하면, 상기 기재된 바와 같은 청소 용액 및 킬레이트제 용액을 사용한 본 발명의 개시의 방법은 현미경 박테리아 계수의 성능을 개선시켰다.

이후, 모호한 박테리아 호출이 있는 32개의 이전에 미처리된 소변을 추가 처리에 적용시켰다. 32개의 소변을 상기 기재된 바와 같이 청소 용액 및 킬레이트제 용액으로 처리하였다. 32개의 모호한 샘플 중 8개가 과밀(overcrowding)로 표시되었다. 이들 8개의 샘플을 별도로 A) 희석(2배 내지 10배)시키고, SediVue 분석기에서 재분석하고, B) 청소 용액 및 킬레이트제 용액으로 처리 전에 희석(2배 내지 10배)시키고, SediVue 분석기에서 재분석하였다. 분석의 결과가 표 5에 제시된다. 모호한 결과의 수는 처리 없이 32개(10.1%)에서 처리 후 4개(1.3%)로 감소하였다. 따라서, 희석 또는 희석 및 처리의 조합은 처리 단독에 비해 모호한 호출의 수를 추가로 감소시킬 수 있다.

표 5.

이전 실험은 결정성 파편을 함유하는 165 μL의 개 소변 또는 결정성 파편 및 점액을 함유하는 165 μL의 개 소변에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 청소 용액(30 μL) 및 킬레이트제 용액(50 μL)은 상기 기재된 바와 같았다. 생성된 최종 혼합물의 수동 광학 현미경검사는 처리가 결정성 파편을 함유하는 소변 샘플로부터의 결정성 파편을 청소한 것을 나타내었다. 결정성 파편 및 점액을 함유하는 소변 샘플로부터, 생성된 최종 혼합물의 수동 광학 현미경검사는 처리가 점액 및 결정성 파편 둘 모두를 청소한 것을 나타내었다.

실시예 11

3개의 여과된 개 소변 샘플에 0.1% v/v의 혈액을 첨가하여 혈액 함유 소변 샘플을 획득하였다. 이들 혈액 함유 소변 샘플(60 μL)을 각각 15 μL의 청소 용액(0% w/v, 0.006% w/v, 0.012% w/v 또는 0.024% w/v의 SMOT, 및 350 mM 시트르산)으로 처리하고, 가볍게 혼합하였다. 처리된 소변 샘플 내의 SMOT의 최종 농도는 0% w/v, 0.0012% w/v, 0.0024% w/v 또는 0.0049% w/v였다. 75 μL의 처리된 샘플에 15 μL의 킬레이트제 용액(325 mM EDTA, 325 mM EGTA 및 500 mM NaOH)을 첨가한 후, 가볍게 혼합하였다. 생성된 최종 혼합물의 수동 광학 현미경검사는 3개 모두의 소변에서 모든 결정, 파편 및 RBC가 청소된 것을 나타내었다. 생성된 최종 혼합물의 수동 광학 현미경검사는 0.0024% w/v 이상의 최종 SMOT 농도가 소변 샘플로부터 RBC를 청소하기에 충분한 것을 나타내었다.

다음으로, 결정 및 파편이 심하게 밀집된 5개의 개 소변 샘플에 0.1% v/v의 혈액을 첨가하여 혈액 함유 소변 샘플을 획득하였다. 60 μL의 이들 각각의 혈액 함유 소변 샘플에 15 μL의 청소 용액(350 mM 시트르산 및 0.001% 증분의 0.005% w/v 내지 0.050 %w/v 범위의 SMOT)을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 처리된 소변 샘플 내의 SMOT의 최종 농도는 0.001% 증분의 0.001% w/v 내지 0.010% w/v 범위였다. 75 μL의 처리된 샘플에 15 μL의 킬레이트제 용액(325 mM EDTA, 325 mM EGTA 및 500 mM NaOH)을 첨가한 후, 가볍게 혼합하였다. 생성된 최종 혼합물의 수동 광학 현미경검사는 소변 샘플에 따라 소변이 0.002% w/v 이상, 0.007% w/v 이상, 0.005% w/v 이상, 0.010% w/v 이상 및 0.010% w/v 이상의 최종 SMOT 농도에서 결정, 파편 및 RBC가 청소된 것을 나타내었다. 따라서, 결정, 파편 및 RBC로부터 심하게 밀집된 소변 샘플을 청소하는 데 필요한 SMOT의 최종 농도는 0.002% w/v 내지 0.01 0% w/v 범위일 수 있다.

추가 실험에서, 결정 및 파편이 심하게 밀집된 것으로 공지된 개 소변 샘플에 0.1% v/v의 혈액을 첨가하였다. 각각의 60 μL의 혈액 함유 소변에 15 μL의 청소 용액(3.5% w/v SMOT 및 350 mM 시트르산)을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 75 μL의 처리된 샘플에 15 μL의 킬레이트제 용액(325 mM EDTA, 325 mM EGTA 및 500 mM NaOH)을 첨가한 후, 가볍게 혼합하였다. 생성된 최종 혼합물의 수동 광학 현미경검사는 샘플 소변에서 모든 결정, 파편 및 RBC가 청소된 것을 나타내었다.

최종 실험에서, 결정 및 파편이 심하게 밀집된 개 소변 샘플에 0.1% v/v의 혈액을 첨가하였다. 각각의 60 μL의 혈액 함유 소변에 15 μL의 청소 용액(0.05% w/v SMOT 및 pH 3.3을 갖는 500 mM 시트레이트 완충액)을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 75 μL의 처리된 샘플에 15 μL의 킬레이트제 용액(1 M EDTA 및 1 M NaOH)을 첨가한 후, 가볍게 혼합하였다. 생성된 최종 혼합물의 수동 광학 현미경검사는 샘플 소변에서 모든 결정, 파편 및 RBC가 청소된 것을 나타내었다.

실시예 12

결정, RBC 및 백혈구로 밀집된 165 μL의 고양이 소변을 30 μL의 청소 용액(500 mM 시트르산 중 5% w/v SMOT)과 조합하고, 가볍게 혼합하였다. 이후, 이러한 처리된 샘플 165 μL에 50 μL의 킬레이트제 용액(250 mM EGTA, 250 mM EDTA, 330 mM NaOH)을 첨가하고, 가볍게 혼합하였다. 생성된 최종 혼합물을 광학 현미경검사로 관찰하였다.

도 11에 제시된 바와 같이, 소변 결정, RBC 및 백혈구가 미처리된 고양이 소변에서 보였다. 본 발명의 개시의 방법으로 처리된 고양이 소변에서, 박테리아만이 보였고, 결정, RBC 및 백혈구는 보이지 않았다. 본 발명의 개시의 방법에 따른 처리는 광학 현미경검사에 의해 결정된 바와 같이 결정, RBC 및 백혈구의 소변을 청소하였다.

본 발명의 개시는 다양한 양태의 예시로서 의도된 본 출원에 기재된 특정 구현예의 관점에서 제한되지 않는다. 당업자에게 명백한 바와 같이 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남이 없이 다수의 변형 및 변화가 이루어질 수 있다. 본원에 열거된 것에 더하여 본 발명의 개시의 범위 내의 기능적으로 동등한 방법 및 장치는 상기 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다. 상기 변형 및 변화는 첨부된 청구범위의 범위 내에 해당하는 것으로 의도된다.

본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적상 참조로서 본원에 포함된다.

Claims (38)

1. 생물학적 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소(clearance) 용액을 접촉시키는 단계; 및
   샘플 내의 박테리아의 양을 결정하는 단계를 포함하는,
   생물학적 샘플에서 박테리아의 양을 측정하는 방법.
2. 생물학적 샘플과 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소 용액을 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 비-박테리아성 미립자 물질을 청소하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 계면활성제가 음이온성 계면활성제인 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 계면활성제가 N-메틸타우린의 지방산 아미드 유도체 또는 이의 염인 방법.
5. 제4항에 있어서, 지방산이 단일불포화 C₁₀-C₂₂ 지방산인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 소듐 메틸 올레오일 타우레이트인 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 계면활성제가 담즙산 또는 이의 염인 방법.
8. 제7항에 있어서, 계면활성제가 콜랄산(cholalic acid), 소듐 콜레이트, 데옥시콜산 및 소듐 데옥시콜레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 청소 용액 내의 하나 이상의 계면활성제의 양이 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 0.0001% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 0.001% w/v 내지 50% w/v, 0.01% w/v 내지 50% w/v, 0.001% w/v 내지 10% w/v, 0.01% w/v 내지 7% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 5% w/v, 0.01% w/v 내지 2% w/v, 0.01% w/v 내지 1% w/v, 또는 0.01% w/v 내지 0.1% w/v 범위인 방법.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 청소 용액 내의 하나 이상의 계면활성제의 양이 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 0.5% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 0.5% w/v 내지 10% w/v, 0.5% w/v 내지 7% w/v, 0.5% w/v 내지 5% w/v, 0.5% w/v 내지 2% w/v, 또는 0.5% w/v 내지 1% w/v 범위인 방법.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 청소 용액 내의 하나 이상의 계면활성제의 양이 청소 용액의 전체 부피를 기준으로 약 1% w/v 내지 약 50% w/v 범위, 예를 들어, 1% w/v 내지 10% w/v, 1% w/v 내지 7% w/v, 1% w/v 내지 5% w/v, 1% w/v 내지 2% w/v, 2% w/v 내지 10% w/v, 2% w/v 내지 7% w/v, 2% w/v 내지 5% w/v, 또는 2% w/v 내지 3% w/v 범위인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 청소 용액이 산성이고; 예를 들어, 약 3 내지 약 6의 pH를 갖는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 청소 용액이 카르복실산 또는 이의 염을 포함하는 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 청소 용액이 시트르산 또는 이의 염을 포함하는 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 청소 용액 내의 산의 농도가 약 300 mM 내지 1M, 예를 들어, 300 mM 내지 400 mM, 300 mM 내지 500 mM, 또는 500 mM 내지 1M의 범위인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플과 수성 킬레이트제 용액을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 킬레이트제 용액과의 접촉이 청소 용액과의 접촉 후인 방법.
18. 제16항에 있어서, 킬레이트제 용액과의 접촉이 청소 용액과의 접촉 전인 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제 용액이 에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 테트라소듐 염, 에틸렌디아민테트라아세트산 테트라소듐 염 데하이드레이트 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 청소 용액이 염기성이고; 예를 들어, 약 10 내지 약 14의 pH를 갖는 방법.
21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이트제 용액이 소듐 하이드록시드 용액을 포함하는 방법.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내 박테리아의 양을 결정하기 전에 샘플을 약 30초 내지 약 30분 동안 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아와 염색 또는 염료를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 박테리아의 양을 결정하기 전에 샘플이 염색 또는 염료와 접촉하지 않는 방법.
25. 제1항 또는 제3항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 결정이 박테리아를 계수하고/하거나 박테리아를 분석(예를 들어, 광학 현미경 하에서의 분석)하는 것을 포함하는 방법.
26. 제25항에 있어서, 결정이 명시야 현미경검사, 암시야 현미경검사 또는 형광 현미경검사를 이용하는 것인 방법.
27. 제1항 또는 제3항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 결정이,
    카메라에 의해 접촉된 샘플의 이미지를 생성하는 단계;
    이미지 내의 박테리아와 관련된 픽셀의 수를 측정하는 단계; 및
    샘플에서 박테리아의 양을 획득하기 위해 픽셀 수를 미리 결정된 픽셀 수와 상관시키는 단계를 포함하는,
    방법.
28. 제27항에 있어서, 사용자 인터페이스 상에 샘플의 이미지를 제시하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 미리 결정된 픽셀 수가 공지된 양의 박테리아를 갖는 표준 샘플을 사용하여 독립적으로 경험적 실험을 수행하여 획득될 수 있는 방법.
30. 제1항 또는 제3항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 박테리아 모양(예를 들어, 막대균 또는 쌍구균 및 구균 사슬과 같은 구균을 포함하는 구균)을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
31. 제1항 또는 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아의 적어도 10%가 샘플을 수성 청소 용액, 수성 킬레이트제 용액 또는 둘 모두와 접촉시킨 후에 생존 가능한 방법.
32. 제31항에 있어서, 박테리아의 적어도 50%가 생존 가능한 방법.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 소변 샘플인 방법.
34. 제33항에 있어서, 소변 샘플이 침전물, 파편, 점액 실, 결정, 무정형 염, 세포 단편, 적혈구 및 환자 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 오염물질을 포함하는 방법.
35. 제1항 또는 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플과 수성 청소 용액의 접촉 전에,
    생물학적 샘플의 일부를 회수하는 단계;
    박테리아에 대해 상기 일부를 분석하는 단계; 및
    비-박테리아성 미립자 물질의 존재 또는 양이 박테리아에 대한 분석을 방해하는지 결정하는 단계를 추가로 포함하는,
    방법.
36. 제2항에 있어서, 비-박테리아성 미립자 물질이 침전물, 파편, 점액 실, 결정, 무정형 염, 세포 단편, 적혈구 및 환자 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 내 적어도 박테리아의 양을 기준으로 건강 결정을 내리는 단계를 추가로 포함하는 방법.
38. 생물학적 샘플의 첫 번째 일부를 상기 첫 번째 일부 내의 박테리아에 대해 분석하는 단계;
    비-박테리아성 미립자 물질의 존재 또는 양이 박테리아에 대한 분석을 방해하는지 결정하는 단계;
    생물학적 샘플의 두 번째 일부와 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 수성 청소 용액을 접촉시키는 단계; 및
    생물학적 샘플의 두 번째 일부에서 박테리아를 결정하는 단계를 포함하는,
    생물학적 샘플에서 박테리아의 양을 측정하는 방법.

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