JP2021512923A - 医薬組成物、組成物の添加剤及び組成物の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、合成カンナビジオールを含有する医薬組成物、及び神経障害の治療のための薬物を得るためのその使用、並びにその製造プロセスで使用される主要な賦形剤、さらに小規模、中規模、及び大規模でのその調製プロセスを記載する。より具体的には、本発明は、ヒト又は動物集団における神経障害の治療のための、特にパーキンソン病の治療における、神経保護作用のための３００〜８５０ｍｇ／日の範囲又は１００〜１７５０ｍｇ／日の一日用量での組成物の使用を開示する。本発明は、薬学および医学の分野に関する。

Description

本発明は、好ましくはヒトに投与される神経障害の治療のための医薬としての組成物及びその使用を開示し、動物の治療にも使用することができる。本発明は、薬学及び医学の分野にある。

パーキンソン病は、１０００人に１人が罹患し、患者の生活の質に直接影響する慢性の進行性疾患である。それは、特発性の病因を有する、黒質からのドーパミン産生ニューロンの死に起因する病理である。それは、その外観が環境的及び遺伝的要因に由来すると考えられており、相互作用して神経変性の発生に寄与し得る。

兆候及び症状が検出された場合、約６０％のドーパミン作動性ニューロンの喪失がおそらくすでに起こっており、線条体中のドーパミン含有量はすでに正常よりも約８０％低い。これを踏まえると、パーキンソン病の治療のための薬物の開発とより詳細な研究が関連している。

この疾患の主な症状は、遅さ、こわばり、受動的運動への抵抗、姿勢のバランスの困難及び振戦である。進行した段階では、認知症、認知障害、及び脳の病的プロセスの拡大が起こり得る。市場で入手可能な治療法は症状を治療するが、変性プロセスを変えることはない。時間が経つとともに、患者の臨床状態が悪化するにつれて、症状を制御することがより困難になる。

パーキンソン病に現在適応されている主な薬物は、とりわけ、塩酸トリエキシフェニジル、レボドパ＋塩酸ベンセラジド、メシル酸ラサギリン、レボドパ＋カルビドパなどである。

カンナビジオールはいくつかの神経障害の有望な代替品であり、非常に効果的で、精神毒性やその他の副作用がないことが示されている。本発明で提案される神経保護作用は、パーキンソン病及び他の神経疾患の進行を遅らせ、患者の臨床状態の悪化を最小限に抑え、ドーパミン作動性システムに関連する病的過程の他の脳領域への広がりを減少させるもので、これらは前例がない。

過去１０年間、主にその抗炎症作用、抗酸化作用、及び神経保護作用の発見に刺激されて、カンナビジオールに関する科学刊行物が著しく増加した。これらの研究は、さまざまな治療適応における資産の幅広い治療効果の可能性を示唆している。

６‐ヒドロキシドーパミン毒素を用いたラットの線条体病変モデルを使用した前臨床研究からのデータがあり、有効成分はドーパミン作動性ニューロンの変性とミクログリア細胞の活性化を減少させた。ただし、これらの効果の原因となるメカニズムは解明されていない。

パーキンソン病の治療におけるカンナビジオールの治療上の可能性を特徴付ける十分な前臨床試験がないこと、及びそのような適応症のための医薬製剤がないことを考慮して、本発明は、これらの一般的及び予備的教示を超えて、そのような適応症の製剤の実現可能性を説明及び証明する。

通常パーキンソン病に伴う機能的運動分析と併存症は、合成カンナビジオール、植物起源のカンナビジオール、及び／又は関連性を用いて証明する必要がある。

科学文献及び特許文献における最新技術の検索において、主題を扱っている以下の文献が見出された。

「経口カンナビノイド液体製剤及び治療方法」というタイトルの文献ＷＯ２００９／０２０６６６は、溶媒が水性であり、市販のゼラチンカプセルよりも効率的な生体内吸収プロファイルを有するカンナビノイドの液体経口組成物を開示する。

「医薬製剤」と題された米国特許第７０２５９９２号は、水和すると乳化剤によって吸収が促進される粉末カンナビノイドの製剤を開示する。

「テルペン及びカンナビノイド製剤」というタイトルの文献ＷＯ２０１５／０６８０５２は、カンナビノイド及びテルペンを含むリポソームを開示する。

「カンナビノイドを理解する経口医薬組成物、その調製及び使用のためのプロセス」というタイトルの文献ＢＲ １０ ２０１５ ０２４１６５ ８は、カンナビノイドを含む経口医薬組成物、その調製及び使用のためのプロセスを開示する。

したがって、研究された文献に応じて、本発明の教示を予測又は示唆する文献は見出されなかったので、本明細書で提案される製剤は、最新技術に照らして新規性及び進歩性を有する。

簡単に言えば、神経障害の治療のためのいくつかの製剤が指摘されている。

したがって、本発明は、合成及び植物起源のカンナビジオール（ＣＢＤ）をそれぞれ含み、驚くべき神経保護活性を有するとともに、いくつかの神経障害の治療のための２つの新しい製剤を記載する。

第一の目的において、本発明は、合成起源の活性成分カンナビジオール、及び、最大０．０６％のカンナビノール、最大０．０６％のデルタ‐８‐テトラヒドロカンナビノール、最大０．０６％のデルタ‐９‐テトラヒドロカンナビノール、最大０．０６％のカンナビジオール酸メチルエステル、最大０．０６％のメンタジエノール、及び最大０．０６％のオリベトール酸メチル（methyl olivetolate）を含む医薬組成物を開示する。

第二の目的において、本発明は、植物、動物又は鉱物起源の油又はそれらの組み合わせを含む組成物のための賦形剤を開示する。

第三の目的において、本発明は、神経保護作用を有する医薬組成物の使用を開示する。

第４の態様では、本発明は、神経障害の治療用の医薬を調製するための医薬組成物の使用を開示する。

本発明のこれら及び他の目的は、当業者によって直ちに認識され、以下で詳細に説明される。

以下の図が示されている：

図１は、投与後最初の８時間の間にＣＢＤ‐ＳＩＮＴで急性処置されたラット（雄及び雌）の一般的な外観データ及び行動変化を含む表を示す。

図２は、投与後最初の８時間の間にＣＢＤ‐ＳＩＮＴで急性処置されたマウス（雄及び雌）における一般的な外観データ及び行動変化を含む表を示す。

図３は、１４日間の暴露後のラット（雄及び雌）の絶対（ｇ）及び相対（％）臓器重量及び最終体重に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴによる急性処置の効果に関するデータを含む表を示す。相対重量（％）＝（絶対臓器重量ｘ１００）／最終体重。値は、平均±平均の標準誤差として表される（ｎ＝６）。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネットの検定。

図４は、１４日間の曝露後のマウス（雄及び雌）の絶対（ｇ）及び相対（％）臓器重量及び最終体重に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴによる急性処置の効果に関するデータを含む表を示す。相対重量（％）＝（絶対臓器重量ｘ１００）／最終体重。値は、平均±平均の標準誤差として表される（ｎ＝６）。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くダネットの検定。

図５は、小核試験中に得られた異なる実験群の間の小核多染性赤血球（ＭＮＰＣＥ）の平均数を示す。

図６は、雄及び雌ラットのＤＮＡに対する損傷指数（Ａ及びＢ）及び損傷頻度（Ｃ及びＤ）に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴ及びシクロホスファミドによる急性処置の効果を示す。

図７は、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）の２つの株（ＴＡ９８及びＴＡ１００）の代謝活性化を伴う（＋Ｓ９）及び伴わない（−Ｓ９）ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ変異原性データを含む表を示す。値は平均±標準偏差として表される。陰性対照（Ｃ−）＝蒸留水。陽性対照（Ｃ＋）＝ＴＡ９８（−Ｓ９）ニトロフェニレンジアミン；ＴＡ９８（＋Ｓ９）２‐アントラミン；ＴＡ１００（−Ｓ９）アジ化ナトリウム；ＴＡ１００（＋Ｓ９）２‐アントラミン。^＊＊＊ｐ＜０．００１（一元配置分散分析とそれに続くダネットの検定）。

図８は、サルモネラ・チフィムリウムの２つの株（ＴＡ９８及びＴＡ１００）の代謝活性化を伴う（＋Ｓ９）及び伴わない（−Ｓ９）ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ変異原性比（ＲＭ）データを含む表を示す。

図９は、修正Ｉｒｗｉｎ試験で観察された臨床行動及び徴候に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴによる急性処置の効果に関するデータを含む表を示す。評価時間は、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ又はプラセボの急性投与後０〜１５分、１５、３０、６０、１２０、１８０分、及び２４時間であった。（−）：症状がない。

図１０は、呼吸数、ガス、電解質、及び血液代謝産物に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴによる急性処置の効果に関するデータを含む表を示す。ＰＣＯ２：二酸化炭素の分圧；ＰＯ２：酸素分圧；ＳＯ２：酸素によるヘモグロビン飽和；Ｈｔｃ：ヘマトクリット；ｔＨｂ：ヘモグロビン；Ｎａ＋：ナトリウム；Ｋ＋：カリウム；Ｃａ＋＋：カルシウム；Ｃｌ−：塩化物；Ｏ２Ｈｂ：Ｏｘヘモグロビン；ＨＨｂ：デオキシヘモグロビン；Ｐ５０：最大ヘモグロビン飽和の半分；Ｈ＋：解離した水素イオン；ＢＥ：過剰な塩基；ＢＥｅｃｆ：細胞外液体コンパートメント内の過剰な塩基；ＢＢ：バッファー塩基。ｃＨＣＯ３：重炭酸塩濃度；ｃｔＣＯ２（Ｂ）：全血中の総二酸化炭素濃度；ｃｔＣＯ２（Ｐ）：血漿中の総二酸化炭素濃度；ｃｔＯ２：総酸素濃度。

図１１は、１７、５１及び１７０ｍｇ／ｋｇの用量のプラセボ又はＣＢＤ‐ＳＩＮＴで処置されたウサギの代表的な心電図及び定量的データを示す。

図１２は、対照群の動物において記録された収縮期、拡張期、及び平均動脈圧から得られた結果を示す。

図１３は、神経毒ＭＰＴＰの投与後１日目から１０日目まで毎日行われた記憶試験（モリス水迷路）で使用されたスキームを示す。

図１４は、神経毒６‐ＯＨＤＡの投与後１８日目から２８日目まで毎日行われた記憶試験（モリス水迷路）で使用されたスキームを示す。

図１５は、オープンフィールド試験で使用されたモデルを示す。

図１６は、モリス水迷路で使用されたモデルを示す。

図１７は、ＭＰＴＰ投与後２４時間後及び１０日後のオープンフィールド試験における動きを開始するための待ち時間を示す。

図１８は、ＭＰＴＰで処置されたすべての実験群の間の持ち上げの頻度を示す。

図１９は、ＭＰＴＰで処置されたすべての実験群間の運動頻度を示す。

図２０は、ＭＰＴＰでの処置から得られた不動時間を示す。

図２１は、ＭＰＴＰでの処置による記憶に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴの効果から得られた結果を示す。

図２２は、ＭＰＴＰで処置された異なる実験群間のドーパミン、ＤＯＰＡＣ及び線条体ＡＶＭのレベルについて見出された値を示す。

図２３は、６‐ＯＨＤＡ毒素で処置されたすべての実験群の間の不動時間を示す。

図２４は、６‐ＯＨＤＡ毒素で処置された動物によって示される運動までの潜在時間を示す。

図２５は、６‐ＯＨＤＡ毒素で処置された異なる実験群の運動頻度を示す。

図２６は、６‐ＯＨＤＡ毒素で処置された異なる実験群の持ち上げ頻度を示す。

図２７は、モリス水迷路試験でプラットフォームを見つけるために、６‐ＯＨＤＡ及びそのそれぞれの対照で処置された異なる実験群に必要な待ち時間を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、５０〜４００ｍｇの合成起源の活性成分カンナビジオールを、最大で０．０６％のカンナビノール、最大で０．０６％のデルタ‐８‐テトラヒドロカンナビノール、最大で０．０６％のデルタ‐９‐テトラヒドロカンナビノール、最大で０．０６％のカンナビジオール酸メチルエステル、最大で０．０６％のメンタジエノール、及び最大で０．０６％のオリベトール酸メチルとともに含む医薬組成物を開示する。本発明はまた、カンナビジオールが１００〜１７５０ｍｇ／日の範囲の用量で経口投与される、その神経保護作用による神経障害を治療するための薬物の調製におけるこの組成物の使用を開示する。

本発明は、バイオアベイラビリティに有利に働き、及び／又はその放出を調節して、一日用量の投与を低減し、治療に対する患者のコンプライアンスに有利な組成物を開示する。

本発明は、活性成分の官能特性を改善するための組成物を開示する。

本発明は、ハードゼラチンカプセル、ソフトカプセル、錠剤、コーティング錠、口腔内崩壊錠、発泡錠、ロゼンジ、シロップ、懸濁液及び／又は溶液の経口医薬形態での組成物の経口投与を開示する。

本発明は、難治性てんかん、てんかん、統合失調症、睡眠障害、心的外傷後障害、神経障害性疼痛、慢性疼痛緩和及び自閉症などの神経障害の治療、好ましくはパーキンソン病の治療に関連する治療適応症に適応され、好ましくはヒトの治療に適応され、小、中、及び大動物が関与する病状に適応されることができる。

本説明は、発明概念に関する詳細を深め、それの認識／理解を容易にする例を提供し、創造の発明概念を実施するいくつかの方法に関する正確な技術データを提供することを目的とする。詳細な説明は、発明者／出願人がここで解決した技術的問題を解決するために行った広範な実験、金融投資、時間、及び知的活動の第三者による繰り返しを避けることも目的としている。

合成カンナビジオールを得るプロセス
合成カンナビジオールを得るプロセスにおいて、以下の工程を含む：
ａ．カンナビジオール酸メチルエステルを得るための、化合物メンタジエノールとオリベトール酸メチルから始まる縮合反応。
ｂ．以前に得られたカンナビジオール酸メチルエステルから出発して、粗製合成カンナビジオールを得るための脱炭酸鹸化反応。
ｃ．得られた粗カンナビジオールの濾過。
ｄ．得られた粗カンナビジオールの結晶化。
ｅ．得られた粗カンナビジオールの再結晶。
ｆ．得られた粗カンナビジオールの乾燥。

合成カンナビノイドである合成カンナビジオールと、植物起源のカンナビジオールであるカンナビジオール植物医薬品とを含む組成物の開発が本発明の範囲と考えられる。

本発明の目的のために、合成カンナビノイドは、カンナビノイド受容体と相互作用することができ、内因的にも植物にも見られない化合物である。

また、本発明の範囲内には、上記の化合物の薬学的塩及び酸、並びに他のカンナビノイドとのその混合物がある。

カンナビジオールに基づく製剤からの経口投与の治療用量は、単回投与又は１日を通して分割して、１００〜１７５０ｍｇ／日の範囲であり、好ましくは３００〜８５０ｍｇ／日の範囲である。

本発明の経口組成物は、この特許の分析方法論の目的で設定された明細書内のカンナビジオール濃度を有し、貯蔵期間及び呼気期間を含む長期間安定であり、デルタ‐９‐テトラヒドロカンナビノール又は他の精神活性化合物のような分解物の顕著な出現はない。

本発明の組成物で使用される賦形剤は、従来技術で一般的に見られ、製薬分野の当業者に知られている賦形剤である。非限定的な例には、抗酸化剤、甘味料、防腐剤、乳白剤、潤滑剤、崩壊剤、希釈剤及びそれらの組み合わせが含まれる。

抗酸化剤は、アセチルシステイントコフェロール、α‐トコフェロール、ｄ‐α‐トコフェロール、ＤＬ‐α‐トコフェロール、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、システイン、システイン塩酸塩、没食子酸プロピル、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、チオグリセロール、クエン酸、酒石酸、ＥＤＴＡ及びその塩、ヒドロキシキノリン硫酸塩、リン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウム、ｔ‐ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）及びそれらの組み合わせから選択できる。

甘味料は、スクラロース、サッカリン、サッカリンナトリウム、シクラミン酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール、スクロース、グリセロール、ネオヘスペリジン、アスパルテーム及びそれらの組み合わせから選択することができる。

保存剤は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなどのようなパラベンエステル（ヒドロキシ安息香酸）、及びそれらの組み合わせから選択することができる。

崩壊剤は、クロスポビドン、クロスカルメロース、デンプングリコール酸、ポリアクリリンカリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、又はそれらの組み合わせから選択することができる。

潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、クエン酸ナトリウム、又はそれらの組み合わせから選択することができる。

希釈剤は、様々なポリオール（例えば、マルチトール、マンニトール及びキシリトール）、微結晶セルロース、デンプン、タルク、マルトデキストリン、スクロース及びデキストロース、植物、動物、又は鉱物起源の油、又はそれらの組み合わせから選択することができる。

油性溶媒は、ブドウ種子油、ゴマ油、トウモロコシ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、キャノーラ油、クルミ油、亜麻仁油、アボカド油、ミント油、落花生油、水素化ヒマシ油、ココナッツ油、アサイ油、アンディロバ油、ババス油、ブリチ油、ブラジルナッツ油、コパイバ油、パッションフルーツ、プラカクシ油、パタウア油、トリグリセリド、サクラソウ油、ベニバナ油、アーモンド油、ルリヂサ油、ザクロ種子油、シーバックソーン油、ニンニク油、オキアミ油、肝油タラ、パーム油、魚油、硬化ヒマシ油、マカダミア油、ローズヒップ油、綿油、及びそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。

好ましくは、油性溶媒はトウモロコシ油である。

医薬組成物の調製プロセス
製造プロセスは、固体の医薬品形態の調製のための通常の機器、たとえば、振動ふるい、医薬品ミキサー（「Ｖ」ミキサー、ダブルコーンミキサー、ＢＩＮミキサー、及び／又は高剪断ミキサー）、流動床、ストーブ、ローラーコンパクター、回転式医薬品プレス及びカプセル化装置、コーティング機（ドリルパン及び粉振り器）、攪拌機、コロイド／ｕｌｔｒａ‐ｔｕｒｒａｘミルを使用する。

製造プロセスは、振動スクリーン、キャスター、調製タンク、製薬ミキサー、上部及び下部スプレー流動床、押出機、球形化装置及びカプセル化装置などのペレットの調製のための通常の装置を使用する。

製造プロセスは、振動スクリーン、製薬ミキサー、反応器、攪拌機タンク、コロイドミル、カプセル化装置、乾燥トンネル、温室、及び空調チャンバーなどのソフトカプセルの調製のための通常の機器を使用する。この製造プロセスは、基本的に４つのステップで構成されている。１．溶融ゼラチン素材の調製；２．有効成分を充填する準備；３．カプセル化；及び４．カプセルを乾燥させる。各段階で必要な材料の量は、調製するカプセルの数に比例する。

本発明の組成物を調製するためのプロセスは、以下のステップを含む：
ａ．有効成分を溶媒又は共溶媒に溶解し、その後、他のアジュバントを添加し、加熱して、又は加熱せずに均質化する、及び／又は
ｂ．有効成分を溶剤又は共溶剤に溶解した後、他のアジュバントを添加し、均質化し、経皮投与のためのサポート内に組み込む、及び／又は
ｃ．有効成分を溶媒又は共溶媒に溶解又は懸濁し、その後、他のアジュバントを添加し、均質化し、経鼻及び／又は肺投与のサポート内に組み込む、及び／又は
ｄ．有効成分と賦形剤の添加、均質化、及びカプセル化、及び／又は
ｅ．有効成分と賦形剤の添加、微小球形化、均質化、及びカプセル化。
ｆ．有効成分と賦形剤の添加、微小球形化、均質化と圧縮、及び／又は
ｇ．有効成分と賦形剤の添加、均質化、圧縮、コーティング、及び／又は
ｈ．有効成分と賦形剤の添加、均質化、造粒、及び圧縮、
ｉ．リポソーム系、ナノ粒子及び／又はナノカプセルへの活性物質の組み込み。

本発明のさらなる目的は、ナノテクノロジー、リポソーム、ペレット、マイクロエマルジョン及び接着剤を使用する調製プロセスである。

提案された製剤は、正当に検証された大規模生産プロセスを通じて、適切な再現性を有するべきである。

第一の目的において、本発明は、合成起源の有効成分カンナビジオールと、最大で０．０６％のカンナビノール、最大で０．０６％のデルタ‐８‐テトラヒドロカンナビノール、最大で０．０６％のデルタ‐９‐テトラヒドロカンナビノール、最大で０．０６％のカンナビジオール酸メチルエステル、最大で０．０６％のメンタジエノール、及び最大で０．０６％のオリベトール酸メチルを含む医薬組成物を有する。

組成物の１つの実施形態において、それは、５０から４００ｍｇの間の範囲の合成起源のカンナビジオールを有する。

組成物の１つの実施形態において、それは、ハードゼラチンカプセル、錠剤、コーティング錠、口腔内崩壊錠、発泡錠、ロゼンジ、シロップ、懸濁液及び／又は溶液、特にソフトゼラチンカプセルの経口剤形を有する。

第二の目的において、本発明は、植物、動物、又は鉱物起源の油、又はそれらの組み合わせを含む組成物のための賦形剤を有する。

賦形剤の一実施形態では、油は、ブドウ種子油、ゴマ油、トウモロコシ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、キャノーラ油、クルミ、亜麻仁油、アボカド油、ミント油、ピーナッツ油、水素化ヒマシ油、ココナッツ油、アサイ油、アンディロバ油、ババス油、ブリチ油、ブラジルナッツ油、コパイバ油、パッションフルーツ油、プラカキシ油、パタウア油、トリグリセリド、プリムローズ油、ベニバナ油、アーモンド油、ルリヂサ油、ザクロ種子油、シーバックソーン油、ニンニク油、ニンニク油オキアミ、タラ肝油、パーム油、魚油、硬化ヒマシ油、マカダミア油、ローズヒップ油、綿油、又はそれらの組み合わせを含む群から選択することができる。

賦形剤の実施形態では、選択された油はトウモロコシ油である。

第３の目的において、本発明は、神経保護作用を有する医薬組成物の使用を有する。

神経保護作用の一実施形態では、それは、１００〜１７５０ｍｇ／日の用量で投与される。

第４の目的において、本発明は、神経障害を治療するための薬物の調製のための医薬組成物の使用を有する。

神経障害の一実施形態では、それらは、難治性てんかん、てんかん、統合失調症、睡眠障害、心的外傷後障害、アルツハイマー病、不安、鬱病、双極性障害、神経障害性疼痛、慢性疼痛緩和、自閉症、慢性疼痛緩和、及びパーキンソン病であり得る。

神経障害の１つの実施形態では、それは好ましくはパーキンソン病である。

カンナビジオール用量の実施形態において、それは、好ましくは、３００〜８５０ｍｇ／日の範囲である。

カンナビジオール用量の一実施形態では、それは単回用量であるか、又は一日を通して分割することができる。

本発明において、それは以下によって理解される：

神経保護活性：本明細書で使用される場合、「神経保護」活性という用語は、神経保護、すなわち、中枢神経系に影響を及ぼす疾患から生じる損傷からニューロンを保護するために使用されるメカニズム及び戦略を指す。

神経障害：本明細書で使用される場合、「神経障害」という用語は、脳、脊椎、及びそれらを接続するそのそれぞれの神経に影響を及ぼす疾患を指す。いくつかの例には、難治性てんかん、てんかん、統合失調症、睡眠障害、心的外傷後障害、アルツハイマー病、不安、うつ病、双極性障害、神経障害性疼痛、慢性疼痛緩和、自閉症、及びパーキンソン病などがある。

単回投与（急性）毒性研究：本明細書で使用される場合、「単回投与（急性）毒性研究」という用語は、動物に対する所定の化合物の短期投与安全性を評価するための試験を指す。

遺伝毒性研究：本明細書で使用される場合、「遺伝毒性研究」という用語は、遺伝物質に毒性及び遺伝毒性の効果をもたらす任意の物理的、化学的、又は生物学的物質の作用の研究を指す。

小核試験：本明細書で使用される場合、「小核試験」という用語は、遺伝毒性損傷をバイオモニタリングするための細胞遺伝学的試験を指す。

コメットアッセイ：本明細書で使用される場合、「コメットアッセイ」という用語は、遺伝毒性損傷をバイオモニタリングするための細胞遺伝学的試験を指す。

ＡＭＥＳ試験：本明細書中で使用される場合、「ＡＭＥＳ試験」という用語は、遺伝子変異を誘発する可能性のある物質を同定することを目的とする短期変異誘発アッセイを指す。

オープンフィールド試験：本明細書で使用される場合、「オープンフィールド試験」という用語は、所与の動物の運動活動の評価のための試験を指す。

モリス水迷路（手がかり試験）：本明細書で使用する場合、「モリス水迷路（手がかり試験）」という用語は、学習及び記憶に関連する海馬を評価することを目的とした試験を指す。

本明細書に示される例は、本発明を実施する無数の方法のうちの１つを例示することのみを意図しているが、その範囲を限定するものではない。

例１．ラット及びマウスにおける単回投与（急性）毒性研究
単回投与（急性）毒性研究は、ラット及びマウス（雄及び雌）の異なる群を用いて、ＯＥＣＤ（２００１）及びＡＮＶＩＳＡ（２０１３）によって推奨された手順に従って行われた。

６時間の絶食期間の後、動物の体重が測定され、合成ＣＢＤの用量が計算された。合成ＣＢＤの２回の単回投与（１０００及び２０００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与（強制飼養プローブを使用）し、ラットとマウスの異なる群（雄と雌）に腹腔内投与した。げっ歯類の他の異なる群をプラセボで処置し、対照群と見なした。

動物を、処置後の最初の８時間以内、及び１４日間毎日、毒性徴候について注意深く観察した。１５日目にすべての動物を安楽死させ、処置後１５日目にそれぞれの解剖病理学的調査を行った。

全体的な外観及び行動の変化に対するラット及びマウスにおけるＣＢＤ‐ＳＩＮＴの急性投与効果を図１及び２に示す。

観察の最初の８時間の間、１０００ｍｇ／ｋｇ及び２０００ｍｇ／ｋｇの用量のＣＢＤ‐ＳＩＮＴで腹腔内に処置された動物は、その活性の有意な減少を示した。さらに、時折の腹部の捻れも観察された。この期間（８時間）の後、すべての動物は活動的で、通常の行動を示した。１４日間の観察が終了するまで、外観又は一般的な行動パターンに有意な変化はなかった。ＣＢＤ‐ＳＩＮＴのＬＤ５０は、経口又は腹腔内投与で２０００ｍｇ／ｋｇまでの用量で処置された動物で死亡が観察されなかったため、示されていない。

異なる用量のＣＢＤを用いて、経口及び腹腔内経路により処置された雄及び雌のラット及びマウスの最終体重を、それぞれ図３及び４に示す。

処置期間全体にわたる最終体重及び体重増加は、プラセボ又はＣＢＤ‐ＳＩＮＴを受けた群間で類似していた。さらに、プラセボと比較して、毎日の飼料と水の消費量に変化はなかった。

１４日間の処置後にＣＢＤ又はプラセボで処置したラット及びマウスから単離されたすべての臓器の絶対（ｇ）又は相対（％）重量に有意差はなかった（図３及び４）。

生命維持に必要な臓器の肉眼検査では、すべての実験群間で異常は明らかにされなかった。調査したすべての組織で、炎症、出血、体液の蓄積、又は病変を示唆するその他の変化の兆候は観察されなかった。組織病理学的分析では、有意な変化は確認されず、使用した用量でのＣＢＤ‐ＳＩＮＴの急性毒性がないことが示唆された。

例２．ラットにおける遺伝毒性研究
使用したＣＢＤの用量は、薬物開発に必要な非臨床毒性学及び薬理学的安全性研究を実施するためのガイド（ＡＮＶＩＳＡ、２０１３年、バージョン１．２）-短期プロトコルから決定された。次の試験が実行された。

小核試験
小核試験（Ｓｃｈｍｉｄ、１９７６）を実施するために、ラットの異なる群（雄及び雌；ｎ＝１０）は、ＣＢＤ（５００、１０００及び２０００ｍｇ／ｋｇ）の３回用量を経口投与された。陰性対照群は強制経口投与によりプラセボを投与され、陽性対照は腹腔内にシクロホスファミド一水和物（２０ｍｇ／ｋｇ‐Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置された。処置終了後２４時間（シクロホスファミド）及び４８時間（ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ及びビヒクル）後、断頭により動物を安楽死させた。大腿骨を取り除き、近位骨端を取り除いて髄管を露出させ、１３ｘ４．５ｍｍの針と３ｍＬのＮａＣｌ溶液（１５０ｍＭ）を用いて骨髄を取り除き、髄管をＮａＣｌ溶液で洗浄した。材料をガラス管に移し、１０００ｒｐｍ／５分で遠心分離した。遠心分離後、上澄みを廃棄し、沈殿物を４％ホルムアルデヒド溶液で再懸濁し、パスツールピペットを使用してわずかに均質化した。この細胞懸濁液を一滴、きれいな乾いたスライドの上に置き、次いで塗抹標本を作製した。スライドを室温で乾燥させ、２４時間後、リーシュマンエオシン‐メチレンブルーで染色し、顕微鏡分析にかけた。小核の数を決定するために、光学顕微鏡を使用して４００倍の倍率で、動物ごとに２０００個の多色赤血球（各スライドで１０００個）をカウントした。スライドの分析はブラインドであり、一人の評価者によって行われた。

コメットアッセイ
コメットアッセイを実施するために、ラットの異なる群（雄及び雌；ｎ＝１０）は、３回の用量のＣＢＤ‐ＳＩＮＴ（５００、１０００及び２０００ｍｍｇ／ｋｇ）を経口投与された。陰性対照群は強制経口投与によりプラセボを投与され、陽性対照は腹腔内にシクロホスファミド一水和物（２０ｍｇ／ｋｇ‐Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）で処置された。処置の終了後、２４時間（シクロホスファミド）及び４８時間（ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ及びビヒクル）の後、動物を安楽死させる前に末梢血のサンプルを採取した。ＤＮＡ損傷の評価のために電気泳動ゲル上で実行される細胞を含むスライドの取得は、Ｋｌａｕｄｅら（１９９６）によって記載された技術に従って行われた。３７℃で１２０μＬの５％ＬＭＰアガロースと混合して得られた合計１０μＬの細胞懸濁液を、通常のアガロース（１．５％）でプレカバーされたスライドに載せ、アガロース硬化のために４℃で１０分間（カバースリップで覆って）冷蔵した。スライドに細胞を加えた後、さらなるＤＮＡ損傷を防ぐために、直接光への曝露（照射）を避けた。カバースリップを注意深く取り除き、スライドを冷蔵庫（４℃）の溶解液に１時間保存した。溶解時間後、スライドを取り出して水平電気泳動槽に入れ、アルカリ電気泳動バッファーを加えて覆い、その後、ＤＮＡ変性のために槽を氷の入った容器（４°Ｃ）に２５分間浸した。次に、２５ボルト及び３００ミリアンペアで電気泳動を開始した。走行時間は約２５分であった。電気泳動後、スライドを取り外し、５ｍＬの緩衝液で５分間中和し、この手順を２回繰り返した。スライドを乾燥させた後、それらをエタノールで５分間固定し、分析まで冷蔵庫に保管した。分析のために、スライドを臭化エチジウム１００μＬで染色し、カバースリップで覆い、約５分後に分析した。ＤＮＡ損傷を視覚化するために、５１５〜５６０ｎｍの励起フィルターと５９０ｎｍのバリアフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用して、スライドを４００倍の倍率で観察した。各動物から１００個の細胞を分析した。

ＡＭＥＳ試験
ＡＭＥＳ試験では、サルモネラ・チフィムリウムのＴＡ１００及びＴＡ９８株を使用した。ＤＮＡの塩基対置換を引き起こす変異原を検出するＴＡ１００株は、最初のヒスチジン生合成酵素をコードするｈｉｓＧ遺伝子（ｈｉｓＧ４６）に突然変異を含み、ＣＧペアが逆転のための好ましいポイントとなる。ＴＡ９８株は、ｈｉｓＤ遺伝子に８つの反復ＧＣ残基を逆転させる変異があり、変異原性化合物を検出してＤＮＡリーディングフレームをシフトさせる。Maron and Ames（１９８３）によって開発されたプレートへの直接取り込みの方法論によれば、異なる濃度のＣＢＤ‐ＳＩＮＴ（３７５、２５０、１２５及び６２．５μｇ／プレート）を、０．１ｍＬの細菌培養液と２ｍＬの表面寒天（トップアガー）とともに混合し、微量のヒスチジンとビオチンを補充した。代謝活性化を伴う試験では、ラット肝臓の均質化ミクロソーム画分Ｓ９ ０．５ｍＬ（酵素誘導剤ａｒｏｃｈｌｏｒｏｒ １２５４で処理された齧歯類の肝臓から調製された、補因子が補充されたミトコンドリア後画分）（ＭＯＬＴＯＸ‐Molecular Toxicology、米国）が追加された。陰性対照として、二回蒸留水（ビヒクル）を使用した。ＴＡ９８の陽性対照として、ＤＭＳＯに溶解した４‐ニロフェニレンジアミン（ＮＰＤ）を１０μｇ／プレートの濃度で使用した。ＴＡ１００株については、１．２５μｇ／プレートの濃度で再蒸留水に溶解したアジ化ナトリウムを、代謝活性化なしの試験で使用した。代謝活性化を伴うアッセイでは、２‐アントラミン（２‐ＡＮＴＲ）を変異原として濃度３μｇ／プレートでＴＡ１００及びＴＡ９８に使用した。各チューブの内容物をわずかに均質化し、最小限のグリコシル化寒天を含むプレートの表面に注いだ。トップアガーが固化した後、プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。この期間の後、プレートあたりの反転コロニーの数を数えた。アッセイは三重に行った。

小核試験に関して、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ（５００、１０００及び２０００ｍｇ／ｋｇ）を受けたすべての動物（雄及び雌）は、プラセボ（Ｃ−）のみで処置された動物に見られるのと同様にＭＮＰＣＥ数を有した。一方、シクロホスファミド（Ｃ＋）で処理された動物は、ＭＮＰＣＥの平均数の有意な増加を示し、この物質の変異原性の可能性を示す。

前述のデータと同様に、多染色性／正常染色性赤血球の比（ＰＣＥ／ＮＣＥ比）は、すべての実験群（雄及び雌）におけるシクロホスファミドでの処置によって有意に変化した。したがって、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴによる処置では、プラセボのみで処置された動物と比較して、このパラメーターに有意な変化はなかった（図５）。

コメットアッセイに関して、陰性対照（プラセボ）で処置された動物と比較した場合、試験された用量のＣＢＤ‐ＳＩＮＴのいずれも有意な変化を誘発しなかった。一方、シクロホスファミドは、試験したすべての群で、損傷の指数と頻度を約１００％増加させることができた（図６）。

ＡＭＥＳ試験に関して、図７は、得られた結果を示し、これは代謝活性化の存在下及び不在下でのサルモネラチフィムリウムＴＡ９８及びＴＡ１００の株を用いて、試験した異なる濃度での、対照群（Ｃ＋及びＣ−）及びＣＢＤについて、ｈｉｓ＋／プレート反転の数の平均及び標準偏差を示している。

図８は、変異原性比（ＭＲ）を示す。ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ濃度の増加に伴う可逆的変異体の頻度の増加は見られず、変異原性比はすべて２未満であり、これは変異原性がないことを示す。

例３．中枢神経系、呼吸器系、及び心血管系の薬理学的安全性試験
雄のニュージーランドウサギ（群あたりｎ＝６）を薬理学的安全性試験に使用した。すべての試験は経口で行われ（ヒトに推奨される経路）、調査されたパラメーターはＣＢＤ‐ＳＩＮＴの単回投与後に決定された。ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ用量は、ヒト患者で使用された平均用量（２５ｍｇ／ｋｇ）からの相対成長外挿によって決定された。

中間用量として５１ｍｇ／ｋｇの用量を使用し、より高い用量及びより低い用量を規定した。The Guide for Conducting Non-Clinical Toxicology and Pharmacological Safety Studies Necessary for Drug Development（医薬品開発に必要な非臨床毒性学及び薬理学的安全性研究実施ガイド）（ＡＮＶＩＳＡ、２０１３、バージョン１．２）に従って、３つの用量範囲が使用された。したがって、使用した用量は、１７、５１、及び１７０ｍｇ／ｋｇのＣＢＤ‐ＳＩＮＴであった。

３つのシステムへの効果が評価された：

中枢神経系への効果
中枢神経系への効果は、修正されたアーウィン試験（Roux et al.,２００５）に従って雄ウサギで評価された。

６時間の絶食後、３回の用量のＣＢＤ（１７、５１及び１７０ｍｇ／ｋｇ）を強制飼養により雄ウサギの異なる群に投与した。プラセボを対照群に投与した（１ｍＬ／ｋｇ）。固形食は、処理の１時間後に動物に放出された。

臨床効果及び行動効果は、投与後０〜１５分、１５、３０、６０、１２０及び１８０分並びに２４時間で評価された。

考えられる行動的及び生理学的変化を観察するために、以下のパラメーターが記録された：発作、振戦、自発運動、跳躍、恐怖関連行動、接触に対する反応性、攻撃性、首の収縮、ステレオタイプ（頭の動き、そしゃく、嗅ぐ、引っかく）、カタレプシー、無動症、歩行、運動協調、牽引、腹部の捻れ、鎮痛、眼瞼下垂、外眼症、縮瞳、散瞳、立毛、排便、下痢、唾液分泌、涙、呼吸及び体温。

呼吸器系への効果
６時間の絶食後、３回の用量のＣＢＤ‐ＳＩＮＴ（１７、５１及び１７０ｍｇ／ｋｇ）を強制飼養により雄ウサギの異なる群に投与した。プラセボを対照群に投与した（１ｍＬ／ｋｇ）。処置の１時間後、すべてのウサギは腹臥位で意識を保った。呼吸数は、Ｋｏｆｒａｎｙｉ‐Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ呼吸計を使用して決定された（Ｍｕｒｐｈｙ、２００２）。動脈血ガス分析のために、動脈血サンプルを耳の中心動脈から採取し、すぐに処理した。以下のすべてのパラメーターは、Ｃｏｂａｓ ｂ ２２１マルチパラメトリック血液ガス分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）で決定された：ｐＨ、ＰＣＯ２（ｍｍＨｇ）、ＰＯ２（ｍｍＨｇ）、ＳＯ２（％）、Ｈｔｃ（％）、ｔＨｂ（ｇ／ｄＬ）、Ｎａ＋（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｋ＋（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｃａ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｃｌ−（ｍｍｏｌ／Ｌ）、グルコース（ｍｇ／ｄＬ）、乳酸塩（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｏ２Ｈｂ（％）、ＨＨｂ（％）、Ｐ５０（ｍｍＨｇ）、Ｈ＋（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＢＥ（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＢＥｅｃｆ（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＢＢ（ｍｍｏｌ／Ｌ）、ｃＨＣＯ３（ｍｍｏｌ／Ｌ）、ｃｔＣＯ２（Ｂ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、ｃｔＣＯ２（Ｐ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、及びｃｔＯ２（体積％）。

心血管系への効果
心臓血管系への効果は、２つの試験により評価された：

ａ）心電図検査、６時間の絶食後、３用量のＣＢＤ（１７、５１及び１７０ｍｇ／ｋｇ）が雄ウサギの異なる群に強制飼養により投与された。プラセボを対照群に投与した（１ｍＬ／ｋｇ）。処置の１時間後、すべてのウサギは仰臥位で意識を維持した。４つの電極（ＲＬ、ＲＡ、ＬＬ、ＬＡ）を両肘と両膝のひだに配置した。Ｖ１電極は、胸骨の右側の４番目の肋間スペースに配置された。Ｖ２電極は、胸骨の左側の４番目の肋間スペースに配置された。Ｖ３電極はＶ２とＶ４電極の中間に配置された。Ｖ４電極は、ヘミ鎖骨ラインの５番目の肋間スペースに配置された。Ｖ５電極は、Ｖ４電極と同じレベルで腋窩線の内側に配置された。Ｖ６電極は、Ｖ４及びＶ５電極と同じレベルで中央の腋窩線上に配置された。少量の７０％ゲルアルコールを各電極インターフェイスに適用して、干渉を減らし、電気伝導を向上させた。５分の順応時間を待ってから、心電図の電波を５分間記録した。心電図はＥＣＧレコーダー（ＷｉｎＣａｒｄｉｏ、Ｍｉｃｒｏｍｅｄ、ブラジリア、ブラジル）で記録された。

ｂ）血圧測定、６時間の絶食後、３回の用量のＣＢＤ‐ＳＩＮＴ（１７、５１及び１７０ｍｇ／ｋｇ）を雄ウサギの異なる群に強制飼養により投与した。プラセボを対照群に投与した（１ｍＬ／ｋｇ）。処理の４０分後、すべてのウサギを１１５ｍｇ／ｋｇのケタミンと筋肉内に組み合わせた１０ｍｇ／ｋｇのジアゼパムで麻酔した。次に、動物にヘパリン（５０ＩＵ）のボーラス注射を皮下投与した。動物が自発的に呼吸できるように気管切開を行った。次に、左頸動脈を分離し、カニューレを挿入し、ＰｏｗｅｒＬａｂ記録システム（Ｃｈａｒｔ ５．０、ＡＤＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ、オーストラリア）に接続された圧力トランスデューサーに接続した。血行力学的安定化のために１５分後、収縮期血圧（ＳＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）及び平均動脈圧（ＭＡＰ）がさらに２０分間記録された。

中枢神経系への効果に関して、雄ウサギで得られた結果を図９に示す。

観察期間全体（２４時間）の間、実験動物のどれも不活性でもなく、食物又は水を消費することも拒否しなかった。さらに、２４時間の終わりまで、動物の行動又は生理学的状態に有意な変化は観察されなかった。

呼吸数への効果及び動脈血ガスの分析に関して、得られた結果を図１０に示す。

プラセボのみで処置されたウサギの平均呼吸数は、５７±６．０１ｂｐｍであった。ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ（１７ｍｇ／ｋｇ：５５±６．４８；５１ｍｇ／ｋｇ：５７±５．４３；１７０ｍｇ／ｋｇ：５６±５．６６）の急性投与後、呼吸数の増加又は減少は観察されなかった。動脈血ガスの分析により、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴのどの用量もプラセボのみで処置した動物と比較して、ｐＨ、ＰＣＯ２（ｍｍＨｇ）、ＰＯ２（ｍｍＨｇ）、ＳＯ２（％）、Ｈｔｃ（％）、ｔＨｂ（ｇ／ｄＬ）、Ｎａ＋（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｋ＋（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｃａ２＋（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｃｌ‐（ｍｍｏｌ／Ｌ）、グルコース（ｍｇ／ｄＬ）、乳酸（ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｏ２Ｈｂ（％）、ＨＨｂ（％）、Ｐ５０（ｍｍＨｇ）、Ｈ＋（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＢＥ（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＢＥｅｃｆ（ｎｍｏｌ／Ｌ）、ＢＢ（ｍｍｏｌ／Ｌ）、ｃＨＣＯ３（ｍｍｏｌ／Ｌ）、ｃｔＣＯ２（Ｂ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）、ｃｔＣＯ２（Ｐ）（ｍｍｏｌ／Ｌ）又はｃｔＯ２（体積％）を変えなかった。

心電図への効果に関して、異なる実験群間のＰＲ、ＱＲＳ、又はＱＴセグメントに有意な変化は観察されなかった。さらに、プラセボのみで処置した動物と比較した場合、Ｐ、Ｒ、又はＴ波の振幅に変化は見られなかった（図１１）。

血圧への効果に関して、安定化期間（１５分）後の対照群（プラセボで処置）の動物で記録された収縮期、拡張期及び平均動脈圧は、それぞれ、１０１±６．７ｍｍＨｇ、６１±３．９ｍｍＨｇ、及び７２±３．９ｍｍＨｇ（図１２）であった。

ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ（１７、５１又は１７０ｍｇ／ｋｇ）の経口投与は、対照群と比較して血圧レベルを有意に変化させなかった（図１２Ａ〜Ｃ）。同様に、心拍数は実験群間で有意差はなかった。陰性対照（プラセボ）とＣＢＤ‐ＳＩＮＴ群（１７、５１、１７０ｍｇ／ｋｇ）の平均値は、それぞれ２７０±１５ｂｐｍ、２８５±１８ｂｐｍ、２７９±２０ｂｐｍ、及び２７５±１７ｂｐｍであった（図１２Ｄ）。

例４．１‐メチル‐４‐フェニル‐１，２，３，６‐テトラヒドロピリジン及び６‐ＯＨＤＡの投与により誘発される行動変化に対する神経保護研究
群あたりの動物の数は１０の被験体であった。この数は、国際的に認められ、科学的に検証されたプロトコルに基づいて推定された。ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ製剤の用量は、ヒト患者で使用された平均用量（６００ｍｇ／日、７０ｋｇの個人では約９ｍｇ／ｋｇを表す）から相対測定外挿法により決定され、ラットで平均用量〜３６ｍｇ／ｋｇＣＢＤを得た。

３つの用量の計算のために、中間用量を参照として使用し、その後、より高い用量及びより低い用量を対数スケールで規定した。最低用量を規定するために、中央値の１／３を使用した。高用量では、低用量の１０倍の安全率が使用された。したがって、この試験で使用されたＣＢＤ‐ＳＩＮＴの用量は、１２、３６及び１２０ｍｇ／ｋｇであった。

ＭＰＴＰ（神経保護）を用いた実験のために、動物を以下の実験群に分けた：
‐ＭＰＴＰ＋プラセボ
‐ＭＰＴＰ＋ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ １２ｍｇ／ｋｇ
‐ＭＰＴＰ＋ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ ３６ｍｇ／ｋｇ
‐ＭＰＴＰ＋ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ １２０ｍｇ／ｋｇ
‐シャム＋プラセボ
‐ナイーブ

ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ及びプラセボは、定位手術による神経毒の投与前の１８日間、及び手術後のさらに１０日間、経口投与（強制経口投与）した。神経毒の投与後、行動（自発運動）と生化学的（脳ドーパミンの投与量）のパラメーターを２４時間後と１０日後に評価した。記憶試験（モリス水迷路）は、神経毒の投与後１日目から１０日目まで毎日実施された（図１３）。

６‐ＯＨＤＡを用いた実験のために、動物を以下の群に分けた：
‐６‐ＯＨＤＡ＋プラセボ
‐６‐ＯＨＤＡ＋ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ １２ｍｇ／ｋｇ
‐６‐ＯＨＤＡ＋ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ ３６ｍｇ／ｋｇ
‐６‐ＯＨＤＡ＋ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ １２０ｍｇ／ｋｇ
‐シャム＋プラセボ
‐ナイーブ

６‐ＯＨＤＡの投与のための定位手術後、ラットは、処置の開始まで７日の回復期間を有した。

回復期間後、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴ及びプラセボを２８日間経口投与（強制経口投与）した。自発運動試験は、処置の最後（２８日目）にのみ実施された。記憶試験（モリス水迷路）は、１８日目から２８日目まで毎日実行された（図１４）。

定位手術を受けた動物は、最初に、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせで腹腔内投与されて麻酔された。麻酔後、動物の頭蓋骨を覆う真皮に０．１０ｍＬのＧ‐プロカインペニシリン（２０，０００Ｕ／０．０５ｍＬ-ｉｍ）、硫酸アトロピン（０．４ｍｇ／ｋｇ-ｉｐ）、及びリドカイン（０．２ｍＬと２％血管収縮薬-ｓｃ）。

ラットを定位手術（定位‐David Kopf、モデル９５７Ｌ）に付し、黒質に直接ＭＰＴＰ又は６‐ＯＨＤＡ（異なる群のラット）の両側マイクロインフュージョン（微量注入）を受けた。手術には、以下の定位座標を使用した。前後：前項（ブレグマ）から５．０ｍｍ；正中外側：正中線と背腹から±２．１ｍｍ：頭蓋骨から−７．７ｍｍ（Ｐａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ、１９８６）。次に、１００μｇＭＰＴＰ（０．３３μＬ／分の流量で１μＬ生理食塩水で希釈）又は８μｇ６‐ＯＨＤＡ（０．２μｇ／μＬアスコルビン酸を含む２μＬ生理食塩水に、流速０．３３μＬ／分で希釈）が注入された。マイクロインフュージョンは、１０ｍＬマイクロシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、米国）に適合したポリエチレンチューブに接続された針（３０ゲージ）を使用して実行され、次に、注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、米国）に取り付けられた。マイクロインフュージョンの終了後、神経毒の逆流を防ぐために、針をさらに２分間固定した。次に、頭皮を縫合し、動物を定位固定から外した。次に、ラットを元のケージに入れた。シャム群の動物は同じ外科的処置を受けたが、神経毒を受けず、同じ定位座標でのみ針に導入された。ナイーブ群のラットは定位手術を受けなかったが、数時間の取り扱いのために収容ケージから取り出された。

行動観察を行うために、動物を３つの試験に供した：

ａ）オープンフィールド試験（自発運動量）
動物をオープンフィールドの中心円上に置き、その行動を５分間評価した。この評価には、歩行の頻度（４本の脚がすべて部屋に入る）、立ち上がる（アリーナの床に対して体幹が垂直になり、後脚でのみサポート）、不動の期間（自発運動なし、完全に麻痺している）及び潜在時間（動物がアリーナの中心円に配置されてから動き始めるのにかかる時間）が含まれていた。各動物を個別に評価し、動物間で５％アルコール溶液でデバイスを洗浄した（図１５）。

ｂ）モリス水迷路（手がかり試験／記憶バージョン）
すべての実験群は、モリス水迷路で試験された。

迷路は、直径１７０ｃｍ、高さ５０ｃｍの黒の円形タンクからなり、深さ３２ｃｍの水で満たされている。水温と室温は制御されており、約２２±２℃である。当初、ラットの出発点として機能する４つの位置が確立された。それは、北、南、東、西である。したがって、表面を４つの等しい象限（北東、南東、北西、南西）に分割できる。実験が行われた部屋では、試験中に動物を支援するために、壁、窓、及びドアに固定された数字など、タンクの周りに視覚的な手がかり（キュー）がある。

試験のために、透明なアクリルのプラットホーム（１１×１４×２９ｃｍ）とともに、上半分を黒で塗装し、下半分を白とした、アクリル製のプラットホームに固定した直径７ｃｍの球を使用した（図１６）。

実験中、球体はラットに見える状態であったが、プラットフォームは水面下２ｃｍに沈められたままであった。試験日に、球体のあるプラットフォームは、それぞれ北東、南東、北西、南西の４つの象限のいずれかに固定されたが、動物はそれぞれ南、東、北、西の４つの開始点の１つにプラットフォームが見つかるまで泳がせられた。動物はプラットフォームを最大６０秒以内に見つける必要がある。最大時間に達したとき、動物は実験者によって球のあるプラットフォーム（視覚的手掛かり）にそっと案内された。ラットが手がかりを見つけた後、ラットは２０秒間球に留まり、その後、動物をプラットフォームから外し、水迷路の外の飼育ケージに３０秒間入れた。この期間中、プラットフォームは実験者によって位置が変更された。

４つの開始点が完了するまで、動物に同じ手順を施した。開始位置とプラットフォーム位置は、遠位と近位の距離が交互になるように計画された。潜在時間（動物がプラットフォームを見つけるのにかかる時間）と動物の速度は、２０２０ Ｐｌｕｓ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアによって定量化された。

ｃ）ドーパミンレベルとその代謝産物３，４‐ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）の測定
最後の一連の実験の後、ＭＰＴＰによる黒質線条体処置からの動物及びそのそれぞれの対照を断頭により安楽死させた。ドーパミン（ＤＡ）とその代謝産物３，４‐ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）のレベルは、Luo et al.(2009)により、電気化学検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ‐ＥＣＤ）によって測定された。

手短に言えば、線条体を解剖し、秤量し、０．２Ｍの冷過塩素酸中でホモジナイズした。次に、サンプルを４℃で１５分間、１４，０００ｇで２回遠心分離した。上清を収集し、０．２２μｍミリポアフィルターでろ過し、ＨＰＬＣシステムに注入して分析した。

ＭＰＴＰの投与により誘発される行動変化に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴの神経保護効果に関して、３つの要因を考慮した結果が得られた。

ｄ）自発運動（ＭＰＴＰ）に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴの効果
結果は、ＭＰＴＰの注入の２４時間後、陰性対照群（Ｃ−：ＭＰＴＰ＋プラセボ）は、動きの開始に対する潜在時間が有意に増加したことを示した。実際、ナイーブ群及びシャム群と比較して、この群では自発運動量が有意に低下していることがわかり、ラットのＭＰＴＰモデルがモデルに期待されるように動物の活動量の低下をもたらしたことを示す。

データは、損傷の２４時間後、陰性対照群は、ナイーブ群及びシャム群と比較して、立ち上がりの頻度の有意な減少を示した。１０日後、ＭＰＴＰ＋プラセボ（Ｃ−）群は、ナイーブ群又はシャム群と比較して、立っている頻度に有意な増加を示した。

２４時間後、陰性対照動物（Ｃ−：ＭＰＴＰ＋プラセボ）は、運動の頻度の有意な減少を示し、値は、ナイーブ又はシャム群のラットで見られたものよりも有意に低かった。

一方、陰性対照群の動物に見られるＭＰＴＰ投与１０日後の運動の頻度は、２４時間後に観察されたものとはかなり異なっていた。２４時間後、自発運動が大幅に減少した場合、１０日後、結果はかなり異なった。

不動時間は、手術の２４時間後に、ＭＰＴＰ＋プラセボ群が他の実験群のいずれとも統計的に異ならなかったことを示した。一方、１０日目に、陰性対照群は、ナイーブ群及びシャム群と比較して、不動性が大幅に減少した。

動物へのＣＢＤ‐ＳＩＮＴ投与により引き起こされる効果に関して、３６ｍｇ／ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴは、上記のすべての要因において、ナイーブ又はシャム群の動物と同様の値を示したが、潜在時間と立ち上がりの頻度の因子に驚くべき効果があり、同じ濃度のＣＢＤ‐ＦＩＴＯの効果、つまり有機的な効果と比較して、濃度が低いほど効果的な結果が得られた（図１７〜２０）。

上記のデータは、この例で得られた結果とともに、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴがこの実験モデルと比較して有意な神経保護効果を持っていることを推測し、パーキンソン病の症状の制御に対するこれらの化合物の使用の展望を開くことができる。

ｅ）ＣＢＤ‐ＳＩＮＴの記憶への効果（ＭＰＴＰ）
図２１（Ａ及びＢ）に示されるように、ＭＰＴＰ＋プラセボ群（陰性対照；Ｃ−）のラットは、動物のナイーブ又はシャム群と比較した場合、プラットフォームを発見するための潜在時間の有意な増加を示した。これらの変化は、トレーニングの５日目から始まり、１０日目まで続いた。

３６及び１２０ｍｇ／ｋｇ用量のＣＢＤ‐ＳＩＮＴでの処置は、この欠損を防ぎ、同じ濃度のＣＢＤ‐ＦＩＴＯで見られるように、ＭＰＴＰを受けなかった動物のものと統計的に類似した値で潜在時間を維持した。

ｆ）ドーパミン、ＤＯＰＡＣ及びＡＶＭ（ＭＰＴＰ）の線条体レベルに対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴの効果
異なる実験群間のドーパミン、ＤＯＰＡＣ及び線条体ＡＶＭのレベルについて見出された値を図２２に示す。

ＭＰＴＰ毒素の黒質内投与は、ナイーブ又はシャム群と比較した場合、測定されたすべてのマーカーのレベルの有意な減少をもたらした。一方、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴを１２ｍｇ／ｋｇの用量で処置すると、ドーパミンとＤＯＰＡＣのレベルを大幅に増加させることができたが、３６及び１２０ｍｇ／ｋｇの用量では、評価したすべてのマーカーの線条体濃度が増加した。

すべてのマーカーのレベルは、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴでの処置後に上昇しているが、見出された値は、ナイーブ及びシャム群の動物で特定された値よりも統計的に低かった。

６‐ＯＨＤＡの投与によって誘発された行動変化に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴの効果に関して、３つの要因に対する効果が考慮された。

ｇ）自発運動に対するＣＢＤ‐ＳＩＮＴの効果（６‐ＯＨＤＡ）
データは、損傷の３５日後、陰性対照群が、ナイーブ群及びシャム群と比較して、このパラメーターの有意な増加を示したことを示す。

陰性対照群（Ｃ−：６‐ＯＨＤＡ＋プラセボ）の動物は、ナイーブ群又はシャム群と比較した場合、運動潜在時間の有意な増加を示した。

陰性対照群の動物は、６‐ＯＨＤＡの投与の３５日後に運動の有意な減少を示した。

すべての実験群の中で、陰性対照（Ｃ−：６‐ＯＨＤＡ＋プラセボ）ｍｇ／ｋｇの動物は、ナイーブ群、シャムよりも有意に低い立ち上がりの頻度を有する。

動物へのＣＢＤ‐ＳＩＮＴ投与により引き起こされる効果に関して、３６ｍｇ／ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＣＢＤ‐ＳＩＮＴは、上記のすべての因子において、ナイーブ又はシャム群の動物と同様の値を示し、不動時間因子に驚くべき効果があることが観察された（図２３〜２６）。

ｈ）ＣＢＤ‐ＳＩＮＴの記憶への効果（６‐ＯＨＤＡ）
図２７は、モリス水迷路試験でプラットフォームを見つけるために、６‐ＯＨＤＡ及びそのそれぞれの対照で処置された異なる実験群に必要な潜在時間を示す。

陰性対照群（６‐ＯＨＤＡ＋プラセボ：Ｃ−）のすべての動物は、安全プラットフォームを見出すための潜在時間の有意な増加を示し、試験５日から１０日までの重要な記憶欠損を示した。

驚くべきことに、３６又は１２０ｍｇ／ｋｇの用量のＣＢＤ‐ＳＩＮＴで処置されたすべての群は、この欠損を示さず、ナイーブ又はシャム群の動物と同様の潜在期間を示した。

Claims (13)

1. 合成起源のカンナビジオール、最大で０．０６％のカンナビノール、最大で０．０６％のデルタ‐８‐テトラヒドロカンナビノール、最大で０．０６％のデルタ‐９‐テトラヒドロカンナビノール、最大で０．０６％のカンナビジオール酸メチルエステル、最大で０．０６％のメンタジエノール及び最大で０．０６％のオリベトール酸メチルを含むことを特徴とする医薬組成物。
2. 合成起源のカンナビジオールが５０〜４００ｍｇの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 硬ゼラチンカプセル、錠剤、コーティング錠、口腔内崩壊錠、発泡錠、ロゼンジ、シロップ、懸濁液及び／又は溶液の経口医薬形態、特に軟ゼラチンカプセルであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
4. 植物、動物又は鉱物起源の油又はそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物のための賦形剤。
5. 油が、ブドウ種子油、ゴマ油、トウモロコシ油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、キャノーラ油、クルミ油、亜麻仁油、アボカド油、ミント油、ピーナッツ油、水素化ヒマシ油、ココナッツ油、アサイ油、アンディロバ油、ババス油、ブリチ油、ブラジルナッツ油、コパイバ油、パッションフルーツ油、プラカキシ油、パタウア油、トリグリセリド、プリムローズ油、ベニバナ油、アーモンド油、ルリヂサ油、ザクロ種子油、シーバックソーン油、ニンニク油、オキアミ油、タラ肝油、パーム油、魚油、硬化ヒマシ油、マカダミア油、ローズヒップ油、綿油、又はそれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の賦形剤。
6. 油性溶媒がトウモロコシ油を含むことを特徴とする、請求項５に記載の賦形剤。
7. 神経保護作用を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
8. 投与が１００〜１７５０ｍｇ／日の用量であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物の使用。
9. 神経障害を治療するための医薬を調製するためのものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
10. 神経障害が難治性てんかん、てんかん、統合失調症、睡眠障害、心的外傷後障害、アルツハイマー病、不安神経症、うつ病、双極性障害、神経障害性疼痛、慢性疼痛緩和、自閉症、慢性疼痛緩和、及びパーキンソン病であることを特徴とする請求項９に記載の組成物の使用。
11. 神経障害がパーキンソン病であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
12. カンナビジオールの用量が３００〜８５０ｍｇ／日であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
13. 用量が単回用量であるか、又は一日を通して分割されることができることを特徴とする、請求項７又は９に記載の使用。

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