JP2021508834A - 抗ｃｄ２６リガンドの生物活性を決定するための細胞内定量法 - Google Patents

Abstract

本発明は抗ＣＤ２６リガンド、好ましくはベゲロマブなどの抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の効果をインビトロで決定するための細胞内定量法に関する。

Description

本発明は抗ＣＤ２６リガンド、好ましくはベゲロマブなどの抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の効果をインビトロで決定するための細胞内定量法に関する。

ＣＤ２６は細胞表面型と可溶型の両方で発現される１１０ｋＤａの多機能性糖タンパク質である。ＣＤ２６抗原は肺、内皮、心臓、脳、肝臓、腸、腎臓、胎盤、膵臓、及び骨格筋などの様々な組織と器官によって発現される（Ａｂｂｏｔｔ Ｃ．Ａ．ら著、１９９４年）。細胞レベルではＣＤ２６の発現はリンパ球集団、具体的には活性化Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、及びＢリンパ球における強力な共刺激活性を有することが分かっている（Ｃｏｒｄｅｒｏ ＯＪら著、２００７年）。実際に特定のメモリーＴ細胞の小集団ではＴ細胞自体の活性化に続いてＣＤ２６の発現が増加する（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｃ．ら著、１９８９年）。Ｔ細胞上でのＣＤ２６の発現は、これらの細胞が細胞分裂刺激に応答して大量のＩＬ−２を産生し、且つ、大いに増殖する能力と関連付けられている。しかしながら、ＣＤ２６の発現はヘルパーＴリンパ球の活性と負の相関がある（Ｍａｔｔｅｒｎ Ｔ．ら著、１９９１年）。

ＣＤ２６はジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）酵素活性を特徴とする。具体的には、上記酵素活性はＸ−Ｐｒｏという位置のＮ末端側アミノ酸と隣接するアミノ酸との間のペプチド結合の加水分解を促進する（Ｇｏｒｒｅｌ Ｍ．Ｄ．ら著、２００１年）。ＣＤ２６はサイトカイン、ポリペプチド、ホルモン、及びケモカインなどの生物学的活性のある多くの基質からＮ末端ジペプチドを切断することができるオリゴペプチダーゼの一サブセットに属する（Ｄｅ Ｍｅｅｓｔｅｒ Ｉ．ら著、１９９９年、Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ Ｍ．ら著、２０００年）。

ヒトでは、ＣＤ２６はアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）との結合にも関与する（Ｆｒａｎｃｏ Ｒ．ら著、１９９８年）。ＡＤＡ欠損は免疫不全疾患の素因になり、それは免疫調節不全の一般的なメカニズムばかりかプリン代謝の有害な代謝物の細胞内蓄積をも介したものである（Ｓａｕｅｒ Ａ．Ｖ．ら著、２０１２年）。

実際には、局所的な細胞外アデノシン濃度の変化によって細胞表面のアデノシン受容体を介してＴ細胞内で負のシグナルが生じることが、ＣＤ２６とＡＤＡとの間の結合のあり得る効果である。幾つかのＣＤ２６特異的モノクローナル抗体はインビトロで活性化シグナルをＴ細胞に伝達し、免疫応答を調節することができる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｃ．及びＳｃｈｌｏｓｓｍａｎ Ｓ．Ｆら著、１９９８年）。したがって、ＣＤ２６は炎症、免疫内分泌、及び神経機能と関連付けられており、ＡＩＤＳの病態生理学とも関連付けられている。

ＣＤ２６は広範に分布するため、多くの疾患状態がそれぞれの疾患状態の重症度に関してＣＤ２６の発現及び／又は活性の異常と相関ありとされている。これらの疾患は少なくとも５種類の区分、すなわち自己免疫及び炎症性疾患、悪性血液腫瘍、精神神経内分泌障害、感染症、及び固形腫瘍に類別可能である。様々な免疫介在性疾患においてＣＤ２６の血清中酵素活性レベルが変化しているようであることが多くの研究者によって観察されている（Ｋｌｅｍａｎｎ Ｃ．ら著、２０１６年）。臨床研究ではＣＤ２６の発現／活性の変化がリウマチ性関節炎、多発性硬化症、Ｉ型真性糖尿病、及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）などの様々な自己免疫疾患に関与していることが観察されている。

非常に選択的なＣＤ２６阻害剤を投与した様々な研究によって糖尿病発症の遅延、膵島炎の減少、調節性Ｔ細胞数の増加が示され、免疫調節におけるＣＤ２６の重要な役割が示唆された。

リウマチ性関節炎を患う患者に関する幾つかの報告によってＣＤ２６の発現／酵素活性、前記疾患の重症度、及び治療の間に相関があることが示されている。これらの発見はＣＤ２６の酵素活性の阻害を標的とする新しい治療アプローチのための基礎となる可能性がある。さらに、多発性硬化症を患う患者の血液と脳脊髄液の中にあるＴ細胞の表面上でＣＤ２６の発現が高いことが観察されている（Ｏｈｎｕｍａ Ｋ．ら著、２０１１年）。ＧｖＨＤは多くの血液疾患にとって重要な治療法である造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後の主な合併症である（Ｆｅｒｒａｒａ Ｊ．Ｌ．Ｍ．ら著、２００９年）。ＧｖＨＤは発症の時期に基づいて急性又は慢性に分類可能であり、提供者の骨髄に由来するナイーブＴ細胞が移植され、受容者の組織に損傷を与えることにより引き起こされる（Ｈｅｎｄｅｎ Ａ．Ｓ．、Ｈｉｌｌ Ｇ．Ｒ．著、２０１５年）。ＧｖＨＤは救命治療法としての骨髄移植の利用を強く制限するものである（Ｗｅｌｎｉａｋ Ｌ．Ａ．ら著、２００７年）。

ＧｖＨＤの発生には、（１）提供者の骨髄は免疫担当細胞を含有していなくてはならない、（２）受容者は提供者には存在しない組織抗原を発現していなくてはならない、及び（３）受容者は移植細胞を破壊することになる効果的応答を引き起こすことが可能であってはならない、という３条件が一般に必要である。

ＧｖＨＤは（１）第１相では放射線療法及び化学療法のために宿主において組織が損傷を受け、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γなどの炎症誘発性サイトカインが放出される、（２）第２相である活性化相では受容者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が露出する抗原によって提供者のアロ反応性Ｔ細胞が活性化され、（３）最後の相では細胞増殖が起こり、さらに細胞傷害性Ｔ細胞とエフェクターＴ細胞の両方が産生したサイトカインが分泌されるという明確に異なる３相を特徴とする（Ｆｅｒｒａｒａ Ｊ．Ｌ．Ｍ．ら著、２００９年）。

急性ＧｖＨＤ（ａＧｖＨＤ）の病態、重症度、及び器官特異性はＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７という異なるＴリンパ球亜集団間のバランスによって決定される。実際には、宿主のＡＰＣ細胞と相互作用した後、且つ、ヘルパーＴ細胞へ分化する前の時点である提供者のＴ細胞の活性化の時点におけるサイトカイン環境に他のサブタイプに対するＴｈ１サブタイプの出現頻度が依存することが示されている。

主なＴｈ１サイトカインはＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αである。ＴＮＦ及びＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインには炎症反応を促進することができるケモカイン及び受容体の上方制御を誘導する能力があるため、それらのサイトカインの量の増加が比較的に早期、且つ、重症の前記疾患の発症と関連付けられている。Ｔｈ２サイトカインはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３である。Ｔｈ２細胞による応答の妨害には胃腸症状の増加と肝臓及び皮膚の損傷レベルの低下が付随することが観察されている。ＩＬ−６は炎症誘発性サイトカインであり、Ｔｈ１７細胞と調節性Ｔ細胞との間のバランスを制御する。ＨＣＴにおいてＩＬ−６の阻害は免疫寛容を誘導してａＧｖＨＤの重症度を低下させるための潜在的に有効な戦略である可能性がある（Ｈｅｎｄｅｎ Ａ．Ｓ．、Ｈｉｌｌ Ｇ．Ｒ．著、２０１５年）。

したがって、Ｔ細胞応答及びサイトカインレベルの変化におけるＣＤ２６の役割を明らかにすることがＧｖＨＤの発症現象と進行の理解に疑いなく役立つことになるだろう（Ｈｅｎｄｅｎ Ａ．Ｓ．、Ｈｉｌｌ Ｇ．Ｒ．著、２０１５年、Ｙｉ Ｔ．著、２００９年）。

この前提に基づくと、ＧｖＨＤの発症を防止するための新しい治療アプローチは抗ＣＤ２６モノクローナル抗体の使用を基礎とする（Ｈａｔａｎｏ Ｒ．著、２０１３年、Ｂａｃｉｇａｌｕｐｏ Ａ．著、２０１６年）。近年、ＧｖＨＤの動物モデルにおいてこの疾患の発症を防止するために抗ＣＤ２６抗体が前臨床モデルで開発された。ＧｖＨＤにおけるＣＤ２６／ＤＰＰＩＶの役割をさらに研究する必要があるが、ヒトＣＤ２６に対するマウス抗体（すなわちベゲロマブ）を使用する治療がステロイド抵抗性急性ＧｖＨＤを患う患者の治療に有効であることが報告されている（米国特許第９３７６４９８号明細書）。したがって、モノクローナル抗体によるＣＤ２６の不活化が自己反応性Ｔ細胞亜集団を根絶するために有効な治療アプローチであり、結果としてＧＶＨＤが解消することが臨床データから確認されている。

以上を踏まえると新しい治療アプローチにおける分子標的としてのＣＤ２６受容体の重要性は明らかである。

力価試験によって特定の薬品の生物活性の定量的測定値が明らかになり、力価試験は薬品分子の開発過程における重要な品質パラメーターである。

様々なアプローチがリガンド受容体アッセイ、動物アッセイ、インビトロ細胞アッセイ、又は他の生化学的アッセイ（例えば、酵素アッセイ）をはじめとする力価試験の開発に使用され得る。力価試験はその力価試験が特定の薬品の作用機序を再現する場合に特に適切である。

生物学的製剤についてはリガンド受容体アッセイ又はインビトロ細胞実験を使用することが好ましい。前者のアッセイは薬品の分子標的への親和性の直接的測定値を与えることができるので力価試験にも適切であり得る。

しかしながら、単純に力価試験は前記薬品の作用機序に基づいて開発されるべきであるが、この情報は特にモノクローナル抗体については常に利用可能であるわけではないため、これらの種類のアッセイが常に利用可能であるわけではない。生物学的薬品はインビボで複数の作用機序を有することが多いのでこのアプローチは特に複雑であり、例えばインビトロ系で再現することが特に難しい。

現在、本発明の著者らは抗ＣＤ２６モノクローナル抗体（ベゲロマブ）が「キャッピング」として知られる作用機序による特異的結合の後にＣＤ２６受容体の内部移行を誘導することができることを発見している。内部移行現象により、炎症誘発性サイトカインの放出が阻害され、その阻害が炎症誘発過程において重要な役割を果たし、その重要な役割が前記抗ＣＤ２６リガンドによって誘導される直接的な下流機能である。説明されたこの作用機序はあらゆる自己免疫疾患における全てのモノクローナル抗体の適用を裏付けるものであり、これらの適用では免疫能を維持したまま自己反応性Ｔリンパ球を失活させることが必須である。

したがって、試料中の活性化合物の量を実用的に決定することを目的として医薬品の力価試験を開発する場合、ＣＤ２６の内部移行と炎症性サイトカインの分泌阻害は両方ともあらゆる抗ＣＤ２６リガンド、好ましくは治療用途及び／又は診断用途のために開発されているモノクローナル抗体の効力を評価するために使用され得る新規検査になる。

説明された前記アプローチはベゲロマブの作用機序の画期的な発見に基づいたあらゆる抗ＣＤ２６の効力を評価するために適用可能である。さらに、この方法を利用することでＣＤ２６の内部移行とサイトカインの分泌／産生の阻害の両方の定量的測定値を得ることができる。

まとめると、これらの発見によって（１）再現性、（２）抗ＣＤ２６リガンドがベゲロマブとして既知であるにしても新たに同定されるにしても、そのリガンドの活性の特定の試料における定量が簡易である、及び（３）前記抗ＣＤ２６リガンドの活性の定量的測定、の点で非常に有利な力価試験が作成される。

したがって、本発明は、以下の工程を含む抗ＣＤ２６リガンドの効力をインビトロで決定するための方法に関する。
（ａ）７５％より高いパーセンテージでＣＤ２６受容体を発現するヒトＴリンパ球の集団を０．００１μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌの範囲、好ましくは０、０１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの範囲、さらにより好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌの範囲の濃度の抗ＣＤ２６リガンドと共に３７℃でインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記抗ＣＤ２６リガンドが認識するエピトープとは異なるＣＤ２６受容体上のエピトープを認識する蛍光色素標識抗ＣＤ２６抗体と共にインキュベートする工程、
（ｃ）細胞蛍光測定分析により前記抗ＣＤ２６リガンドで処理された細胞の試料について測定されたＣＤ２６のＭＦＩ値（蛍光強度中央値）（ＭＦＩ_Ｔ）と未処理細胞のＭＦＩ値（ＭＦＩ_ＮＴ）を決定する工程、
（ｄ）以下の式



に従い、前記抗ＣＤ２６リガンドで処理された細胞の試料について測定されたＣＤ２６のＭＦＩ値（ＭＦＩ_Ｔ）と未処理細胞のＭＦＩ値（ＭＦＩ_ＮＴ）との間の比を１００倍し、その次に１００からその値を引いたものとして計算されるＲＦＩ（基底状態に対して正規化されたＭＦＩ値である相対蛍光強度）としてのＣＤ２６受容体の内部移行率を評価する工程
を含み、「％ｉｎｔＣＤ２６」又はＲＦＩがＣＤ２６の内部移行率であり、「ＭＦＩ_Ｔ」がＣＤ２６リガンドで処理された細胞（検査細胞）のＭＦＩ値であり、「ＭＦＩ_ＮＴ」がＣＤ２６リガンドで処理されない細胞（基準細胞）のＭＦＩ値であり、 このパーセンテージ（％ｉｎｔＣＤ２６又はＲＦＩ）が、
２０％未満である場合に前記抗ＣＤ２６リガンドの効力が低いことを示し、
２０％〜３０％の範囲である場合に前記抗ＣＤ２６リガンドの効力が中程度であることを示し、
３０％より高い場合に前記抗ＣＤ２６リガンドの効力が高いことを示す。

図１２のパネルＡでは「低い」効力、「中程度の」効力、及び「高い」効力の基準をそれぞれ指定するために用いられる数字が示されている。特に、ＣＤ２６内部移行率（％）に関する応答がＳ字形（シグモイド状）の用量依存性であり、前記リガンド（この図では「ＲＳ」として表される）の濃度が低くなるほどこの応答は低い「％ｉｎｔＣＤ２６」値を有し、逆に前記リガンドの濃度が高くなるほどこの応答は３０％〜３５％という最大値（平坦域）までは高い「％ｉｎｔＣＤ２６」値を有することが観察されている。この平坦域が１００％の「％ｉｎｔＣＤ２６」であると考えらえる場合、図１２のパネルＢで示されるような曲線の全ての値を正規化することが可能である。

この意味で内部移行が０％から開始して１００％までの曲線が観察され、したがって、
１．「低い効力」は、平坦域に関して０％〜５０％の範囲の内部移行率を有するリガンドを示し、」
２．「中程度の効力」は、平坦域に関して５０％〜９０％の範囲の内部移行率を有するリガンドを示し、
３．「高い効力」は、平坦域に関して９０％より高い内部移行率を有するリガンドを示す。という３つの異なる効力範囲を規定することができる。

言い換えると、この考え方は次の表１に要約され得る。

本発明の代替的な実施形態では、工程（ａ）のヒトリンパ球集団は室温でインキュベートされ得る。

前記抗ＣＤ２６リガンドは、ＣＤ２６受容体に特異的に結合することができるあらゆる分子、好ましくは抗ＣＤ２６モノクローナル抗体又はその抗体の断片、より好ましくはベゲロマブである。

本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ａ）の抗ＣＤ２６リガンドの濃度は０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、又は２μｇ／ｍｌである。

本発明の方法の好ましい実施形態では工程（ｂ）の抗ＣＤ２６抗体は、ＡＰＣ蛍光色素結合マウス抗ヒトＣＤ２６抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カタログ番号５６３６７０、クローン番号Ｍ−Ａ２６１）であり、２．５μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートされる。

本発明の方法のその他の好ましい実施形態によると、工程（ｂ）において使用される蛍光色素はＦＩＴＣ、ＡＰＣ、ＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７、ＰｅｒＣＰ、及びＰＥ−Ｃｙ５．５からなる群より選択される、細胞蛍光測定分析に使用され得るいずれかの蛍光色素である。前記蛍光色素はＡＰＣであることが好ましい。

また、本発明の方法の好ましい実施形態によると、工程（ａ）の前記ＣＤ２６＋Ｔリンパ球集団は、初代Ｔリンパ球集団及び腫瘍細胞系列のヒトＴリンパ球集団から選択される。好ましくは、前記腫瘍細胞系列のヒトＴリンパ球はＫａｒｐａｓ２９９細胞株である。

本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ｃ）の細胞蛍光測定分析はＦＡＣＳにより実施される。

本発明の方法は、抗ＣＤ２６リガンドによるサイトカイン放出の阻害試験を提供する上記リガンドの効力の追加の検証工程も提供し、前記サイトカインは、工程（ａ）のＣＤ２６＋ヒトＴリンパ球集団に対して効果を及ぼすＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αからなる群より選択される。好ましい実施形態では、前記サイトカインはＩＬ−８及び／又はＩＬ−１βである。工程（ａ）の前記ＣＤ２６＋ヒトＴリンパ球集団は、初代Ｔリンパ球集団及び腫瘍細胞系列のヒトＴリンパ球集団から選択される。好ましくは、前記腫瘍細胞系列のヒトＴリンパ球はＫａｒｐａｓ２９９細胞株である。

好ましい実施形態ではサイトカイン産生の前記阻害試験はメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイによって実施される。

これより、添付図面を特に参照し、好ましい実施形態に従って本発明を例示的で非限定的な目的のために説明する。

ＭＳＤアッセイによる炎症誘発性サイトカインレベルの分析のための細胞培養の実験スキームを示す図である。 初代末梢血単核細胞及び精製ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ａ）、並びにヒトＴ細胞株Ｋａｒｐａｓ２９９内（Ｂ）ＣＤ４＋細胞（暗色のカラム）及びＣＤ２６＋細胞（明色のカラム）のパーセンテージの細胞蛍光測定分析を示す図である。 ４℃及び３７℃で８時間にわたるインキュベート後のＫａｒｐａｓ２９９細胞（パネルＡ）におけるＣＤ２６受容体の内部移行に対するベゲロマブの効果を示す図である。 ４℃及び３７℃で８時間にわたるインキュベート後の、６時間及び２４時間にわたってインキュベートされた初代ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（パネルＢ、パネルＣ、パネルＤ）におけるＣＤ２６受容体の内部移行に対するベゲロマブの効果を示す図である。 Ｔ細胞株Ｋａｒｐａｓ２９９（パネルＡ）におけるサイトカイン類ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αのレベルのベゲロマブによって誘導される阻害を示す図である。グラフ中、電気化学発光シグナルが縦軸の左側に示されており、一方で対応する濃度が横軸に示されている。 初代Ｔ細胞（パネルＢ）におけるサイトカイン類ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αのレベルのベゲロマブによって誘導される阻害を示す図である。グラフ中、電気化学発光シグナルが縦軸の左側に示されており、一方で対応する濃度が横軸に示されている。 ベゲロマブで２４時間処理した後のＫａｒｐａｓ２９９細胞におけるＣＤ２６に対応する蛍光の減少を示す図である。 ０．０００５μｇ／ｍｌ（３×１０^−１２Ｍ）という低用量から１５０μｇ／ｍＬ（１×１０^−６Ｍ）という高い濃度までのベゲロマブで２４時間処理した後のＫａｒｐａｓ２９９細胞におけるＣＤ２６に対応する蛍光の減少を示す図である。

異なる温度条件下に置かれたベゲロマブ試料に対して実施されたＦＡＣＳ分析を介して得られたＣＤ２６の内部移行（ＲＦＩ）の用量応答性曲線を示す図である（ＳＶＩ−ＳＴＢは効力が低下した試料であり、極度に安定な状態で６か月にわたって３２．５℃に置かれた試料である）。

異なる細胞蛍光測定機上で実施されたＦＡＣＳ分析を介して得られたＣＤ２６内部移行曲線（ＲＦＩ）を示す図である。 ベゲロマブ（ＷＳ−ＢＥＧ−０１３）に対して観察されたマウスモノクローナル抗ｈＣＤ２６抗体（クローン２０２．３６）の相対的効力を示す図である。 ベゲロマブ（ＷＳ−ＢＥＧ−０１３）に対して観察されたＩｇＧ２ｂマウスκアイソタイプ抗体（クローンＭＧ２ｂ−５７）の相対的効力を示す図である。 ＴＥＳＴという名称の任意の未知試料の標準試料（ＲＳ）に対する相対活性がどれくらい定量的に測定できるか決定するため、標準試料ＲＳ（ベゲロマブ）に対して算出された検査試料（ＴＥＳＴ）の効力値を示す図である。 低い効力、中程度の効力、又は高い効力を決定するために適用される基準についての２種類の例となるグラフを示す図である。

本発明をさらに例示するために以下の実施例をこれより提示するが、これらの実施例は例であり、本発明を限定しないと理解されるべきである。

実施例１：モノクローナル抗体ベゲロマブの作用機序についての研究
ベゲロマブ（抗ＣＤ２６）の有効性をインビトロで評価するための試験を作成するために、前記抗体の作用機序を研究した。

生物活性は、早期開発段階、後期開発段階、及びマーケティング段階において、バッチリリース検査としての品質管理の範囲内にある分子の品質管理の必須要素であるため、力価試験と呼ばれる試験の開発は、所与の薬品の生物活性の測定にかなり重要である。

具体的には、モノクローナル抗体などの多くの生物学的製剤は、細胞標的又は可溶性標的への結合を介して機能を発揮し、続いてその分子標的の下流にある適切な細胞的事象を誘起させる。

したがって、以下の項目を評価した。
・ヒトＴ細胞株及びヒト初代Ｔ細胞におけるＣＤ２６の発現／過剰発現。
・ベゲロマブとの結合後のＣＤ２６の内部移行。
・炎症性サイトカインの産生と放出に対するベゲロマブの効果。

材料と方法
初代細胞及び細胞株
ヒトＴ細胞株はＳＩＧＭＡ社から購入したＫａｒｐａｓ２９９リンパ腫のＴ細胞（カタログ番号０６０７２６０４−１ＶＬ）に由来する。ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号７２４００）を含み、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｆ２４４２、当研究室で熱不活化を実施）、１ＩＵ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号１５１４０）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号２５０３）、及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社、カタログ番号Ｍ３１４８）を添加したＲＰＭＩ１６４０中でＫａｒｐａｓ２９９細胞を培養した。融解後に前記細胞を培養し、そして凍結保存した。

マイコプラズマの存在を調べるために前記細胞株を分析し（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）、Ｌｏｎｚａ社、カタログ番号ＬＴ−０７）、マイコプラズマについて陰性であることが分かった。サン・ラファエル倫理委員会（ＩＲＢ）により承認されたプロトコルに従ってインフォームドコンセントの後に得られた３人の健常提供者のバフィーコートからフィコール・ハイパック分離濃度勾配（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、フレゼニウス社）によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。細胞生存度を評価するためにこれらのＰＢＭＣをトリパンブルー染色し、ビルケルチャンバー内で計数した。実験を開始する前に低用量のＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ−７（５μｇ／ｍＬ）を含む完全培地（ＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、及びグルタミン）中にこれらのＰＢＭＣを３７℃で終夜培養した。

ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴ細胞株の細胞表面上でのＣＤ２６の発現を測定するため、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ２６抗体クローンＢＡ５ｂ（バイオレジェンド社、カタログ番号３０２７０４）を購入した。細胞蛍光測定に最適の濃度を決定するために前記３人の提供者の初代Ｔ細胞とＫａｒｐａｓ２９９細胞に対してある希釈範囲の前記抗体を試験した。ヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴ細胞株上でのＣＤ２６の発現率の決定、及びＣＤ２６の内部移行アッセイにこの最適濃度を使用する。

Ｔ細胞株及びヒト初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２６の発現
９６ウェルＶ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ社、カタログ番号３５９８）内で０．２％ＢＳＡ（ミルテニー社、カタログ番号１３０−０９１−３７６）を添加したａｕｔｏＭＡＣＳ緩衝液（ミルテニー社、カタログ番号１３０−０９１−２２２）中に２人の提供者に由来する初代ＣＤ４＋細胞及びＫａｒｐａｓ２９９細胞を１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。これらの細胞を２．５μｇ／ｍｌ〜３１．３ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＦＩＴＣ結合抗ＣＤ２６抗体又はＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ａ抗体（バイオレジェンド社、カタログ番号４００２０８）と１５分間にわたってインキュベートした。その後、これらの細胞を洗浄し、４％ホルムアルデヒド中で固定した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを使用する細胞蛍光測定によりＣＤ２６陽性細胞のパーセンテージを決定した。非特異的結合を判定するためにＩｇＧ−ＦＩＴＣを使用した。

ヒト初代細胞及びＴ細胞株上でのＣＤ２６発現の定量
初代末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞膜上、及びＫａｒｐａｓ２９９細胞株上で発現したＣＤ２６の量を決定するために細胞蛍光測定を使用した。ＣＤ４＋標識をＴ細胞マーカーとして加えた。９６ウェルＶ底プレート内でＭＡＣＳ緩衝液中に前記３人の提供者に由来する初代ＣＤ４＋Ｔ細胞とＫａｒｐａｓ２９９細胞を１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。これらの細胞を１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合抗ＣＤ２６及び２．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４抗体と共に１５分間にわたってインキュベートした。ゲーティングを行うために１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ａ抗体及び２．５μｇ／ｍｌのＡＰＣ結合抗ＩｇＧ２ｂ抗体（バイオレジェンド社、カタログ番号４００６１２）を添加した。その後、これらの細胞を洗浄し、４％ホルムアルデヒド中で固定した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩを使用する細胞蛍光測定によりＣＤ４＋細胞とＣＤ２６＋細胞のパーセンテージを決定した。

ＣＤ２６の内部移行アッセイ
Ｔ細胞（ヒト初代Ｔ細胞と前記Ｔ細胞株の両方）においてＣＤ２６受容体の内部移行を誘導するベゲロマブの能力を細胞蛍光測定分析により決定した。２回の独立した実験でこのアッセイを実施した。一回の実験につき３人分のバフィーコートからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。その後、ＰＢＭＣと前記単離細胞の両方を抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ２６抗体で標識して前記単離細胞集団の純度、並びにＣＤ２６細胞のパーセンテージを実験前に決定した。さらに、生存率測定用染料を添加して生細胞に対して実験が実施されることを確実にした。これらの細胞を細胞蛍光測定により分析した。

前記ＣＤ４＋集団の純度が９５％を超えることが分かったので前記ＣＤ４＋細胞の品質を良好と評価した。前記ＣＤ４＋集団中のＣＤ２６＋細胞のパーセンテージは７５％より上であった。前記Ｔ細胞株を２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、それぞれカタログ番号１６−００３７−８５及び１６−０２８９−８５）で被覆された９６ウェル平底プレート（コーニング・コースター社、カタログ番号３５９８）内に１００，０００細胞／ウェルの密度で一晩にわたって播種し、それらを３７℃で２時間にわたってインキュベートした。一晩にわたってインキュベートした後に培地を交換して全量で１００μｌの０．０３ｍｇ／ｍｌ（２×１０^−７Ｍ）のベゲロマブ、対照としてのＩｇＧ２ｂ（シグマアルドリッチ社、カタログ番号ＳＡＢ４７００７２９又はバイオレジェンド社、カタログ番号４０１２０２）、又は対照ベヒクルとしてのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号１００１０）と共に前記細胞をインキュベートした。各条件を三組検査した（３細胞ウェル／条件）。処理を４℃及び３７℃で８時間にわたって実施した。その後、前記細胞を標識し、細胞蛍光測定によりＣＤ４＋細胞中のＣＤ２６＋細胞のパーセンテージを決定した。さらに、ゼロ時点でのＣＤ４＋ＣＤ２６＋細胞のパーセンテージを決定するために処理の開始前に一群の細胞を標識し、分析した。実験当日にＰＢＭＣを１，５００ｒｐｍで５分間にわたる遠心分離により単離し、様々な濃度のベゲロマブと共にそれぞれ６時間及び２４時間にわたってインキュベートした。ベゲロマブとインキュベートした後に前記ＰＢＭＣを洗浄し、次のモノクローナル抗体、すなわちＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｈ７が結合したＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ２６に対するヒト抗体（バイオレジェンド社）で標識した。ＣＤ２６に対する前記モノクローナル抗体がベゲロマブのエピトープとは異なるエピトープに結合可能であることは以前に示されている。ベゲロマブのものに対応するアイソタイプに対する前記フルオロフォア結合抗体（ＩｇＧ２ｂ）を常に陰性対照として使用した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して前記試料を分析した。Ｆｌｏｗ Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）で全てのデータを分析し、ＣＤ４＋細胞又はＣＤ８＋細胞に対する相対蛍光強度（ＲＦＩ）として表した。この値は抗ＣＤ２６抗体で標識された試料の平均蛍光強度を対応するアイソタイプ対照で除算することにより計算される。

炎症誘発性サイトカインに対する９重ＭＳＤアッセイ
Ｔ細胞の活性化におけるベゲロマブの効果を評価するために炎症誘発性サイトカインの産生を調べた。
この目的のためにメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイ、すなわち９重アッセイをヒト炎症誘発性サイトカインについて用いた（カタログ番号１５００７Ｂ−２）。上記（第４．１．１．２節）のように抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体で被覆された９６ウェル平底プレート内に前記初代Ｔ細胞とＫａｒｐａｓ２９９ Ｔ細胞株の両方を１００，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩にわたってインキュベートした。

ＧｌｕｔａＭＡＸを含み、且つ、１０％ＨＩ−ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを添加されたＲＰＭＩ１６４０培地中に前記細胞を維持した。図１に記載されているように前記細胞をＩＬ−１２とベゲロマブで処理した。簡単に説明すると、前記細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号２１９−ＩＬ−００５９）及び対照ベヒクル（０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ社、カタログ番号Ａ２１５３−１ｋｇ）−ＰＢＳ）と共に一晩にわたって予備インキュベートするか、又はＩＬ−１２／対照ベヒクル抜きで一晩にわたってインキュベートした。翌日、ＩＬ−１２と一晩にわたって予備インキュベートしなかった前記細胞を２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２と共に２時間にわたってインキュベートした。その後、全ての前記細胞を０．０３ｍｇ／ｍｌ（２×１０^−７Ｍ）のＩｇＧ２ｂ（バイオレジェンド社）、ベゲロマブ、又はＰＢＳ対照ベヒクルと共に６時間又は２４時間にわたってインキュベートした。全ての実験において予期された時間の後に上清を収集し、新たに分析されるまで−８０℃で凍結した。

抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による「被覆」のサイトカイン分泌に対する効果を検査するため、前記細胞を被覆プレート及び未被覆プレート上でＩＬ−１２と一晩にわたって予備インキュベートし、その後でベゲロマブ／ＩｇＧ２ｂ／ＰＢＳで２４時間にわたって処理して検査した。

サイトカインＭＳＤ分析はインターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、及びＩＬ−１２ｐ７０のレベルを検出する。製造業者の指示に従ってＭＳＤサイトカインアッセイを行い、実際には前記プレートを室温で１時間にわたってブロックする代わりに４℃で一晩にわたってブロックして潜在的な非特異的結合を防止した。実験の細胞段階中に採用した培地を使用して標準曲線を作成した。ＭＳＤ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ４．０．１２ソフトウェアを標準曲線の作成とサイトカイン濃度（ｐｇ/ｍｌ）の計算のために使用した。前記標準曲線に前記試料の値を入力してこれらの値が範囲内にあるかどうか決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を用いて全てのサイトカインについてグラフを作成した。最初に統計解析を行うためにＩｇＧ２ｂ対照よりも２倍高いベゲロマブによる阻害を閾値レベルとして任意に設定した。

しかしながら、１．９倍の阻害が様々な条件により示されたのでこの閾値を１．９に変更した。処理条件内での統計学的有意差を評価するためにＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０内で二元配置ＡＮＯＶＡ検定をポストホック・テューキー検定と共に使用し、多重検定で調整されたｐ値を得た。

結果
ヒトＴ細胞株及びヒト初代Ｔ細胞におけるＣＤ２６の発現／過剰発現
図２は初代末梢血単核細胞集団内、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内、及びＫａｒｐａｓ２９９株内のＣＤ４＋細胞とＣＤ２６＋細胞のパーセンテージを示している。細胞蛍光測定により得られた結果から初代単核細胞中のＣＤ４＋細胞とＣＤ２６＋細胞のパーセンテージはそれぞれ約４５％超と約３５％超であることが示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離後にはこれらのパーセンテージはそれぞれ９５％超と７５％超になる（図２パネルＡ）。Ｋａｒｐａｓ２９９細胞のほとんど全てがＣＤ４（９５％超）を発現し、同様に高レベルのＣＤ２６（９５％超）を発現する（図２パネルＢ）。まとめると、前記単離初代ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内、及び前記Ｋａｒｐａｓ２９９細胞株内のＣＤ２６陽性細胞のパーセンテージはそれぞれ約７５％及び約９５％である。上記パーセンテージは後続の実験工程におけるＣＤ２６レベルの測定にも充分である。

ＣＤ２６の内部移行
初代Ｔ細胞及びＴ細胞株におけるベゲロマブ誘導性のＣＤ２６の内部移行を測定するために細胞蛍光測定分析を用いた。存在するＣＤ２６の減少とベゲロマブの濃度との間の用量依存的な関係の特定にも同じ分析を用いた。前記Ｋａｒｐａｓ２９９ Ｔ細胞株においてＣＤ２６＋細胞のパーセンテージ並びに前記ＣＤ４＋集団中のＣＤ２６＋の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。前記Ｋａｒｐａｓ２９９ Ｔ細胞株では８時間後に３７℃でのみ前記ＣＤ４＋集団中のＣＤ２６ ＭＦＩの低下が観察された（図の中で報告されていないデータであるが、４時間後では７％の阻害であり、８時間後では２２．３％の阻害である）（図３パネルＡ）。インキュベーションが４℃で行われたとき、すなわち全ての生物学的過程が低温により阻害されるときに対し、３７℃でベゲロマブと共に８時間にわたってインキュベートした後に測定された前記ＣＤ４＋集団中のＣＤ２６のＭＦＩのこの低下は統計学的に有意である。単一の細胞当たりのＣＤ２６受容体の数がＫａｒｐａｓ２９９細胞において３７℃でベゲロマブとの結合後に減少することが得られたデータにより示されている。同じ生物学的現象が４℃では観察されなかったので、ベゲロマブとの結合後のＣＤ２６受容体の内部移行はＫａｒｐａｓ２９９ Ｔ細胞株における前記抗体の作用機序を表していると結論することができる。ベゲロマブとの結合によって誘導されるＫａｒｐａｓ２９９細胞におけるＣＤ２６受容体の内部移行を臨床開発のためにバッチリリース用の力価試験として使用することができることを確実にするために用量応答性実験を実施した。上記の実験において３７℃でベゲロマブの濃度を上昇させて、具体的には０．５μｇ／ｍｌ（３×１０^−９Ｍ）、５μｇ／ｍｌ（３×１０^−８Ｍ）、及び３０μｇ／ｍｌ（２×１０^−７Ｍ）でＫａｒｐａｓ２９９細胞を２４時間にわたって処理した（図５）。抗ＣＤ２６抗体の濃度上昇は膜に発現したＣＤ２６の内部移行の漸増を誘導することができることが分かっているので得られた結果は非常に興味深い。具体的には、それぞれ３×１０^−９Ｍ、３×１０^−８Ｍ、及び２×１０^−７Ｍである０．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、及び３０μｇ／ｍｌという用量のベゲロマブが２６．９％、３４．５％、及び４３．８％という内部移行率に対応する。この用量応答作用は力価試験の開発に必要な条件である。

初代Ｔ細胞に対するベゲロマブの効果を評価するため、末梢血単核細胞を３７℃で６時間及び２４時間にわたってベゲロマブと共に３種類の異なる条件下（それぞれ４×１０^−８Ｍ、２×１０^−７Ｍ、及び１×１０^−６Ｍである６μｇ／ｍｌ；３０μｇ／ｍｌ、及び１５０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。インキュベートした後に前記細胞を直ぐに標識してＣＤ２６の発現について調べた。対照として前記単核細胞を最高の濃度のベゲロマブ（１５０μｇ／ｍｌ、すなわち１×１０^−６Ｍ）と共に４℃でインキュベートした。６時間後にＣＤ２６（ＲＦＩ）の内部移行レベルの有意ではないがかなりの低下がＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２６のベースラインレベルと比較して観察された（図３パネルＢ）。しかしながら、２４時間の時点で特にＣＤ８＋Ｔ細胞について統計学的に有意な結果（＊、Ｐ＜０．０５）が得られた（図３パネルＣ）。Ｋａｒｐａｓ２９９細胞株について以前に観察されたように、前記単核細胞をベゲロマブと共に４℃でインキュベートするとＣＤ２６の下方制御の効果が減少し（図３パネルＤ）、これは前記抗体ＣＤ２６複合体の内部移行の能動的ブロッキング現象を示唆している。簡単に説明すると、ベゲロマブとの２４時間のインキュベーション後に３０μｇ／ｍｌ（２×１０^−７Ｍ）の濃度のベゲロマブで処理されるとＫａｒｐａｓ２９９細胞においてＣＤ２６の発現が４３．８％まで低下し、この現象は抗ＣＤ２６抗体の用量に依存している（図５）。予期されたように４℃では分析した前記細胞の表面上においてＣＤ２６の発現に何の変化も観察されなかった。ＣＤ２６受容体がベゲロマブとの結合に応答して内部移行し、結果としてＣＤ２６＋Ｔ細胞亜集団に対する重要な活性化シグナルが排除されることが得られた結果から明確に示されている。

炎症誘発性サイトカインの放出
ＣＤ２６の内部移行がＴ細胞活性化に対して様々な下流作用を有し得ることを考慮して初代Ｔ細胞及びＫａｒｐａｓ２９９細胞におけるベゲロマブ処理後の幾つかの炎症誘発性サイトカインのレベルを調べた。

炎症性サイトカインは（１）急性炎症に関与するグループと（２）慢性炎症の原因であるグループの２群に分類され得る。ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−８、他のケモカイン、Ｇ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン類は１番目のグループに属する。２番目のグループはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、及びＩＬ−１３などの液性応答に介在するサイトカイン類とＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン、トランスフォーミング増殖因子−β、並びに腫瘍壊死因子α及びβなどの細胞性応答に介在するサイトカイン類にさらに分割可能である（Ｓｈａｉｋｈ ＰＺ著、２０１１年）。

炎症誘発性サイトカインはリウマチ性関節炎、多発性硬化症、ＧｖＨＤなどの一連の自己免疫疾患に関与する分子である。ＣＤ２６はこれらの疾患の発病において、具体的には炎症過程において重要な役割を果たす。この理由のため、ベゲロマブによる幾つかの炎症誘発性サイトカインの阻害を調べた。より具体的には、以下のサイトカイン、すなわちインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、及びＩＬ−１２ｐ７０のレベルを分析した。前記アッセイにおける予備検査として上清試料の一連の希釈を行い、シグナルとしてＩＬ−１２に曝露されたＩＬ−１２ｐ７０細胞の上清における結果を除き（示さず）、非希釈試料は全てのサイトカイン類について標準曲線の範囲内にあることが結果から示された。この理由のため、２５μｌの非希釈標準上清をＭＳＤアッセイで検査した。両方の実験で全てのアッセイプレート中の全てのサイトカイン類の検量線がよく校正された曲線を示した。ｒ

前記分析試料を前記標準チャートに導入してそれらの分析試料が検出範囲内にあるかどうか決定した。サイトカインレベルの変化が初代Ｔ細胞提供者とＫａｒｐａｓ２９９ Ｔ細胞株との間で観察され、ある条件下では検出限界未満のレベルであったが、ＩＬ−１２ｐ７０を除く全てのサイトカイン類のレベルを測定し、分析した。ＩＬ−１βとＩＬ−６のレベルは両方の実験で分析された全ての細胞集団で非常に低かった。ＩＬ−１２による前記細胞の処理は以前に文献（Ｖａｃａｆｌｏｒｅｓ Ａ．ら著、２０１６年）中で報告されているように複数の条件でＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０の産生を明らかに誘導する。したがって、ベゲロマブによる処理後のサイトカイン産生の阻害はＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−６、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）について観察された（図４）。

Ｋａｒｐａｓ２９９細胞と初代Ｔ細胞の両方でベゲロマブとインキュベートした後のＩＬ−８レベルとＩＬ−１βレベルの大幅な低下が同じ条件下で観察された。

次の表２は初代Ｔ細胞及びＫａｒｐａｓ２９９細胞における様々なサイトカインの分泌におけるベゲロマブの阻害効果の概要を提示しており、特に前記細胞を３７℃で６時間又は２４時間にわたってインキュベートした後にベゲロマブによって誘導された炎症誘発性サイトカインレベルの抑制を示している。

さらに、サイトカイン分泌に対する「被覆」の効果を検査するために抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体での被覆プレート及び未被覆プレート上で前記細胞をＩＬ−１２、ベゲロマブ、又は「材料と方法」節に記載された前記適切な対照ベヒクルで処理して検査した。概して被覆プレートに対して未被覆プレートではサイトカインレベルは検出できないレベル、又はより低いレベルであることが観察された。このことは被覆がサイトカインレベルの評価においてベゲロマブの効果を調べるためのアッセイウィンドウの作成に必須であることを示している。したがって、未被覆プレートを使用するサイトカインレベルの測定に対するベゲロマブの効果をさらに分析しなかった。この実験に基づくと、ベゲロマブは初代Ｔ細胞とＫａｒｐａｓ２９９細胞の両方においてＩＬ−８、ＩＬ−１β及びＩＬ−６などの特定のサイトカインの産生を強力に減少させられることが得られた結果から示され、これにより自己免疫疾患の治療における抗ＣＤ２６抗体（ベゲロマブ）の作用機序が強調された。

実施例２：抗ＣＤ２６リガンドの効力を決定するための細胞アッセイの構築
本実験部分の目的は公知の抗ＣＤ２６モノクローナル抗体であるベゲロマブから始めて抗ＣＤ２６リガンドの活性に対する細胞アッセイを構築することである。

ベゲロマブは同種異系間の移植において提供者のＴリンパ球の活性化を阻害することを臨床上の目標とするハイブリドーマ細胞により産生される抗ＣＤ２６モノクローナル抗体である。

本アッセイの目標はインビトロでベゲロマブの濃度を上昇させて処理した後にヒトＴリンパ球（Ｋａｒｐａｓ２９９細胞、ＣＤ４陽性）の細胞膜上に存在するＣＤ２６のレベル変化を測定することである。

ＣＤ２６はＴリンパ球の活性化に関与するジペプチジルペプチダーゼ活性を有する膜糖タンパク質である。２４時間の処理後にヒトＴリンパ球及びＫａｒｐａｓ２９９細胞の表面上でＣＤ２６の内部移行を誘導するベゲロマブの能力が先行する研究データから示されている。

具体的には、ベゲロマブの濃度を上昇させて３７℃で２４時間にわたって前記細胞をインキュベートし、その後でそれぞれ受容体ＣＤ４とＣＤ２６受容体に結合することができ、且つ、異なる波長で発光するフルオロフォアと結合している２種類の抗体で染色する。ＦＡＣＳ分析において、検査されるそれぞれの濃度のベゲロマブについて蛍光強度がそれぞれ個々の細胞の細胞表面上に存在するＣＤ２６の量に比例して測定される。その後、このパラメーターは陽性ＣＤ４細胞集団について選択された２０，０００回の単一蛍光シグナル収集イベントの中央値を算出することにより機器によって数量化される。

細胞試料の染色プロトコルとＦＡＣＳ分析
事前に設定されたベゲロマブとのインキュベーション時間の満了時に以下の染色プロトコルに従い、前記細胞試料をフルオロフォア結合抗体で処理し、その後で表面のＣＤ２６発現についてＦＡＣＳにより分析する。
・各ウェルの内容物を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移す。
・１０，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離する。
・沈殿物を１ｍＬの冷ＤＰＢＳで洗浄する。
・１０，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離する。
・沈殿物を乾燥し、下の表３に記載されるＦＡＣＳ分析用のインキュベーションプロトコルに従って次の抗体で染色する。

・試料をボルテックスで混合し、暗所において室温で３０分間にわたってインキュベートする。
・１ｍＬのＤＰＢＳを添加し、１０，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離する。
・上清を捨て、沈殿物を１ｍＬの冷１×ＤＰＢＳで洗浄する。
・１０，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離する。
・細胞沈殿物をＤＰＢＳ−５％ＦＢＳ中に０．７−１Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、ＦＡＣＳ分析までそれらの試料を暗所において＋４℃で保存する。当日中に分析を行うことができない場合、０．３６％の終濃度でパラホルムアルデヒドを添加して前記細胞を固定する。

ＦＡＣＳ分析において、検査されるそれぞれの濃度のベゲロマブについて蛍光強度がそれぞれ個々のＣＤ４陽性細胞の細胞表面上に存在するＣＤ２６の量に関連して測定される。その後、このパラメーターはＣＤ４陽性細胞集団内で選択された２０，０００回のイベントの蛍光を収集して得られる平均値として機器によって数量化される。２種類のフルオロフォアが異なる波長で発光するため、ＦＩＴＣ及びＡＰＣに付随する２種類の蛍光を収集するために補正を実施する必要はない。

その後、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａプログラムを使用してデータを再処理し、収集中に記録された（ＣＤ４陽性細胞集団内で選択された）全てのイベントの平均値としてＣＤ２６の発現レベルをそのプログラムに算出させる。

結果
Ｋａｒｐａｓ２９９細胞の細胞膜表面上に存在するＣＤ２６の内部移行を誘導する能力としてベゲロマブの生物活性を測定した。

ベゲロマブの濃度を上昇させて処理した後に内部移行したＣＤ２６の量は、前記細胞膜の表面上に発現しているＣＤ２６に結合した特定の抗体（ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ２６抗体、クローンＭ−Ａ２６１ ＲＵＯ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社、コード番号５６３６７０）によって放出される蛍光の平均値の減少として測定された。

実用標準（ＷＳ）で前記細胞を処理することにより得られた濃度反応曲線と比較される各バッチの生成物についての濃度反応曲線をそのロットとＷＳ間の比較力価試験により作成することが目的であり、その比較力価試験ではそれらの曲線の平行性が前記アッセイの適格性の必要条件である（ＰＬＡ．３分析ソフトウェアを用いて実施された平行性検定）。

図５のグラフから分かるように、ベゲロマブを使用する２４時間の処理後にＫａｒｐａｓ２９９細胞についてＣＤ２６に付随する蛍光の約４０％の減少が存在する。

さらに、Ｋａｒｐａｓ２９９細胞におけるこの効果は、細胞アッセイの開発に必要であると考えられる条件である濃度反応性であることが分かる。

ＩｇＧ２ｂプール（ベゲロマブが属するＩｇＧクラス）は検査された条件のいずれの下でもＣＤ２６の内部移行を誘導していないので観察された効果はベゲロマブに特異的である。

前記生物学的効果の評価にとって最適な増殖条件を達成するために２４時間にわたるベゲロマブとのインキュベーションを繰り返し続けること、及びダイナビーズ・ヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏキット、ライフテクノロジーズ社、コード番号１１１３１Ｄ）を使用する刺激後のＣＤ３＋Ｔリンパ球を使用することを決定した。

ＣＤ２６の内部移行率
図６のグラフから分かるように、ベゲロマブを使用する２４時間の処理後、最も高い濃度のベゲロマブ（１５０μｇ／ｍＬ又は１×１０^−６Ｍに等しい）を使用して処理した後のＫａｒｐａｓ２９９細胞についてＣＤ２６に付随する蛍光の約４８％の減少が存在する。

濃度反応曲線の拡張により０．０１μｇ／ｍＬ（７×１０^−１１Ｍ）に相当する反応の下限に達する。

ＩｇＧ２ｂプール（陰性対照として使用された）の効果が無いことが確認された。

後続のアッセイは、（前記曲線が単相性パターンを有するのか、又は複相性パターンを有するのか確かめるために）前記曲線の複雑さを減少させるように設計された。

異なる試料のベゲロマブの効力評価
次に３種類のベゲロマブ試料の効力評価を行ったが、それらのうちの１つは３２．５℃で６か月間にわたって極度に安定な条件下で保存された（ＳＶＩ−ＳＴＢの調製）。

ＦＡＣＳ分析から、ロット１及びロット２という２種類の独立した調製物の間にＣＤ２６の内部移行カイネティクスに関して実質的な差は存在しない。

逆に、３２．５℃で６か月間にわたるインキュベーションにより分解したベゲロマブ試料であるＳＶＩ−ＳＴＢ調製物は、ＣＤ２６内部移行の誘導について他の試料よりも効果が低いようである（図７）。この結果は改変されたベゲロマブ試料を挟み取る本方法の能力を裏付けている。

図７のグラフから分かるように、４℃で保存されたベゲロマブ試料と長期間にわたって３２．５℃への熱サイクルを受けたベゲロマブ試料の曲線の中央の領域において、選択された８種類の濃度のベゲロマブが大きな変化を示している。

両方とも４℃の最適条件下で保存された２種類のベゲロマブ試料はこの曲線の中央の領域で変化を示していない。

異なるフローサイトメーターを使用する効力評価
抗Ｃ２６抗体とのインキュベーション後のＣＤ２６の内部移行について得られた結果が分析技術を変更しても再現可能であることを確認するため、我々は異なる製造業者の２種類の細胞蛍光測定機を使用して内部移行実験を行った。

異なる細胞蛍光測定機に属する技術によって内部移行曲線の結果が変更されないことが得られた結果（図８）から明確に示されている。

具体的には、最適ではない条件下で保存された両方の実験においてベゲロマブ試料（ＳＶＩ−ＳＴＢ）が容易に特定可能であり、このベゲロマブ試料は最適条件下で保存された他の２種類のベゲロマブ試料の曲線と比較すると曲線の中央の部分で大きな変化を示している。

結論
ベゲロマブ誘導性の膜上ＣＤ２６の内部移行に基づく細胞アッセイが臨床用に使用される薬品のバッチリリース検査機能を満たすための全ての特徴を有していることがＫａｒｐａｓ２９９細胞株を使用することによって実施された実験的試験により実証された。

特に、ベゲロマブのインキュベーション後のＣＤ２６の内部移行に基づく前記試験により、臨床用に使用されるように発売される薬品の特徴のあらゆるあり得る逸脱が具体的、且つ、再現性よく特定されることになる。

実施例３：他の抗ＣＤ２６抗体を使用する効力アッセイの検証
２種類の他の抗ＣＤ２６抗体、すなわち
・マウス抗ｈＣＤ２６モノクローナル抗体（クローン２０２．３６）Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、コード番号ＭＡ１−３５１４７、ロット番号３１１０３０Ｆ
・陰性対照としてのＩｇＧ２ｂ、マウスκアイソタイプ（クローンＭＧ２ｂ−５７）バイオレジェンド社、コード番号Ｍ１３９５
を使用して前記効力アッセイを試験した。

膜におけるＣＤ２６の検出のため、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社のコード番号５６３６７０、ロット番号８１１６６４５のＡＰＣ結合マウス抗ヒトＣＤ２６抗体（クローンＭ−Ａ２６１）を使用した。

図９と図１０はベゲロマブ（ＷＳ−ＢＥＧ−０１３）に対して観察された相対的力価を示している。得られた結果から、抗体クローン２０２．３６は約０．０１の相対的力価を示し、一方で抗体クローンＭＧ２ｂ−５７は活性が完全に無いことを示している。観察することができるように、本発明の力価試験はしたがって他のＣＤ２６リガンドにも適用可能である。

また、図９では基準化合物ＷＳ−ＢＥＧ−０１３の漸近線に到達するまであと少しの濃度（２μｇ／ｍＬ）でのＣＤ２６の内部移行を比較しており、３０％を超えるＣＤ２６の最大の内部移行がＷＳ−ＢＥＧ−０１３についてのみ観察され（３２．５％）、一方で具体的に検査された前記抗体についてはクローン２０２．３６が２０％よりもずっと低く（１１．５％）、表明済みの基準に従うとその抗体は低い能力を有する、すなわち内部移行率が２０％未満（すなわち、平坦域の５０％未満の％）の抗体であることが確認される。

図１１は、ベゲロマブと比較して相対活性がどのように定量的に測定可能であるのか示すために標準試料（ＲＳ）に対して計算された検査試料（ＴＥＳＴ）の力価を示している。この事例では前記標準試料（ＲＳ）は１．８ｍｇ／ｍＬの濃度のベゲロマブであり、一方で前記ＴＥＳＴ試料は１．２６ｍｇ／ｍＬ、すなわち前記ＲＳ濃度の７０％の濃度のベゲロマブであり、予期されるＲＳに対する相対的効力は濃度比ＴＥＳＴ／ＲＳ（例えば１．２６／１．８＝０．７、すなわち７０％）に等しい。図１１ではどのように７０％の濃度比において７０％の相対的効力が予期されたように観察されることが示されている（ＰＬＡ３．０ソフトウェアを介して米国薬局方ガイドライン１０３４「生物学的アッセイの分析」に従って計算を実施）。

図１１のグラフにおいて、１７０というＭＦＩ値は膜ＣＤ２６の最大の発現値（最大の水平漸近線）を表し、一方で１１０という値はＣＤ２６の内部移行が最大に達するときのＭＦＩ値を表し、したがって最小の膜発現（最小の水平漸近線）に対応する値を表す。この範囲内で各アッセイにおいて絶対値で規定され、ベゲロマブ基準曲線からの検査曲線の相対的距離を測定することにより効力の推定が実施される。

前記グラフに示されるヒストグラムは最大のＭＦＩ測定値（１７０）で表されるＣＤ２６の最大の膜発現に対するＣＤ２６の内部移行率を示している。検査化合物を参照するとこのパーセンテージは相対的効力に関連付けられており、
・ＭＦＩ値が１３０のとき、ＲＳは膜に存在するＣＤ２６の２３．１％を内部移行させ、それに対して検査化合物はわずかに１８．５％を内部移行させ（検査／基準比率＝０．８０）、
・ＭＦＩ値が１１０（膜ＣＤ２６の存在が最小）のとき、ＲＳは膜に存在するＣＤ２６の１２．１％を内部移行させ、それに対して検査化合物はわずかに９．９％を内部移行させる（検査／基準比率＝０．８２）。

前記力価は単に１つの時点での内部移行率の比ではなく、２つのＥＣ_５０、すなわち基準化合物の０．０４３４２μｇ／ｍＬと前記試験化合物の０．０６６４４μｇ／ｍＬとの間の相対比として計算されることが観察され得る。

本実施例で計算された力価は実際には０．６５に等しい値を生じるＥＣ_５０ＲＳ／ＥＣ_{５０Ｔｅｓｔ}として推定可能であり、すなわち前記検査化合物の効力がＲＳの効力の約７０％であることが確認され得る。

さらに、ＲＳについての最小の水平漸近線に到達するまであと少しの濃度（２μｇ／ｍＬ）でのＣＤ２６の内部移行を比較することにより、３０％を超えるＣＤ２６の最大の内部移行がＲＳ（３６％）と検査化合物（３５．９％）の両方について観察され、表明済みの基準に従うと両方の事例で高い効力である、すなわち３０％超の内部移行率であることが確認される。

参照文献
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Claims (11)

1. 以下の工程を含む、抗ＣＤ２６リガンドの効力をインビトロで決定するための方法：
   （ａ）７５％より高いパーセンテージでＣＤ２６受容体を発現するヒトＴリンパ球の集団を０．００１μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度の抗ＣＤ２６リガンドと共に３７℃又は室温でインキュベートする工程；
   （ｂ）工程（ａ）において使用された前記抗ＣＤ２６リガンドが認識するエピトープとは異なるＣＤ２６エピトープを認識する蛍光色素標識抗ＣＤ２６抗体と共にインキュベートする工程；
   （ｃ）細胞蛍光測定分析により前記抗ＣＤ２６リガンドで処理された細胞の試料について測定されたＣＤ２６のＭＦＩ値（ＭＦＩ_Ｔ）と未処理細胞のＭＦＩ値（ＭＦＩ_ＮＴ）を決定する工程；
   （ｄ）以下の式
   
   に従って計算されるＣＤ２６受容体の内部移行率（％ｉｎｔＣＤ２６）又はＲＦＩを評価する工程を含み、％ｉｎｔＣＤ２６の値が、２０％未満である場合に前記抗ＣＤ２６リガンドの効力が低いことを示し、２０％〜３０％の範囲にある場合に前記抗ＣＤ２６リガンドの効力が中程度であることを示し、３０％より高い場合に前記抗ＣＤ２６リガンドの効力が高いことを示す。
2. 工程（ａ）の前記抗ＣＤ２６リガンドの濃度が０．０１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの範囲、さらにより好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌの範囲にある、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）の前記抗ＣＤ２６リガンドが、抗体又はその抗体の断片である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記抗ＣＤ２６抗体がモノクローナル抗体ベゲロマブである、請求項３に記載の方法。
5. 工程（ｂ）の蛍光色素がＦＩＴＣ、ＡＰＣ、ＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７、ＰｅｒＣＰ、及びＰＥ−Ｃｙ５．５からなる群より選択され、好ましくはＡＰＣである、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 工程（ａ）のヒトＣＤ２６＋Ｔリンパ球集団が初代Ｔリンパ球集団又はヒトＴリンパ球の腫瘍細胞株のから選択される、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ヒトＴリンパ球腫瘍細胞株がＫａｒｐａｓ２９９細胞株である、請求項６に記載の方法。
8. 工程（ｃ）の前記細胞蛍光測定分析がＦＡＣＳにより実施される、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の方法。
9. ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αからなる群より選択される炎症性サイトカインの産生阻害のアッセイ工程を、工程（ａ）のヒトＣＤ２６＋Ｔリンパ球集団に対して実施することをさら含む、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記サイトカインの産生阻害がメソスケールディスカバリーアッセイによって評価される、請求項９に記載の方法。
11. 前記ヒトＣＤ２６＋Ｔリンパ球集団がＫａｒｐａｓ２９９細胞株である、請求項９又は請求項１０に記載の方法。