JP7366925B2 - 抗cd26リガンドの生物活性を決定するための細胞内定量法 - Google Patents
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Description
(a)75%より高いパーセンテージでCD26受容体を発現するヒトTリンパ球の集団を0.001μg/ml~150μg/mlの範囲、好ましくは0、01μg/ml~100μg/mlの範囲、より好ましくは0.01μg/ml~2μg/mlの範囲、さらにより好ましくは0.01μg/ml~0.5μg/mlの範囲の濃度の抗CD26リガンドと共に37℃でインキュベートする工程、
(b)工程(a)の前記抗CD26リガンドが認識するエピトープとは異なるCD26受容体上のエピトープを認識する蛍光色素標識抗CD26抗体と共にインキュベートする工程、
(c)細胞蛍光測定分析により前記抗CD26リガンドで処理された細胞の試料について測定されたCD26のMFI値(蛍光強度中央値)(MFIT)と未処理細胞のMFI値(MFINT)を決定する工程、
(d)以下の式
に従い、前記抗CD26リガンドで処理された細胞の試料について測定されたCD26のMFI値(MFIT)と未処理細胞のMFI値(MFINT)との間の比を100倍し、その次に100からその値を引いたものとして計算されるRFI(基底状態に対して正規化されたMFI値である相対蛍光強度)としてのCD26受容体の内部移行率を評価する工程
を含み、「%intCD26」又はRFIがCD26の内部移行率であり、「MFIT」がCD26リガンドで処理された細胞(検査細胞)のMFI値であり、「MFINT」がCD26リガンドで処理されない細胞(基準細胞)のMFI値であり、 このパーセンテージ(%intCD26又はRFI)が、
20%未満である場合に前記抗CD26リガンドの効力が低いことを示し、
20%~30%の範囲である場合に前記抗CD26リガンドの効力が中程度であることを示し、
30%より高い場合に前記抗CD26リガンドの効力が高いことを示す。
1.「低い効力」は、平坦域に関して0%~50%の範囲の内部移行率を有するリガンドを示し、」
2.「中程度の効力」は、平坦域に関して50%~90%の範囲の内部移行率を有するリガンドを示し、
3.「高い効力」は、平坦域に関して90%より高い内部移行率を有するリガンドを示す。という3つの異なる効力範囲を規定することができる。
ベゲロマブ(抗CD26)の有効性をインビトロで評価するための試験を作成するために、前記抗体の作用機序を研究した。
・ヒトT細胞株及びヒト初代T細胞におけるCD26の発現/過剰発現。
・ベゲロマブとの結合後のCD26の内部移行。
・炎症性サイトカインの産生と放出に対するベゲロマブの効果。
初代細胞及び細胞株
ヒトT細胞株はSIGMA社から購入したKarpas299リンパ腫のT細胞(カタログ番号06072604-1VL)に由来する。GlutaMAX(Gibco社、カタログ番号72400)を含み、10%加熱不活性化ウシ胎児血清(Sigma社、カタログ番号F2442、当研究室で熱不活化を実施)、1IU/mlのペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco社、カタログ番号15140)、2mMのL-グルタミン(Gibco社、カタログ番号2503)、及び50μMのβ-メルカプトエタノール(シグマアルドリッチ社、カタログ番号M3148)を添加したRPMI1640中でKarpas299細胞を培養した。融解後に前記細胞を培養し、そして凍結保存した。
96ウェルV底プレート(Costar社、カタログ番号3598)内で0.2%BSA(ミルテニー社、カタログ番号130-091-376)を添加したautoMACS緩衝液(ミルテニー社、カタログ番号130-091-222)中に2人の提供者に由来する初代CD4+細胞及びKarpas299細胞を100,000細胞/ウェルの密度で播種した。これらの細胞を2.5μg/ml~31.3ng/mlの濃度範囲のFITC結合抗CD26抗体又はFITC結合抗IgG2a抗体(バイオレジェンド社、カタログ番号400208)と15分間にわたってインキュベートした。その後、これらの細胞を洗浄し、4%ホルムアルデヒド中で固定した。FACSCanto IIを使用する細胞蛍光測定によりCD26陽性細胞のパーセンテージを決定した。非特異的結合を判定するためにIgG-FITCを使用した。
初代末梢血単核細胞(PBMC)及びCD4+T細胞の細胞膜上、及びKarpas299細胞株上で発現したCD26の量を決定するために細胞蛍光測定を使用した。CD4+標識をT細胞マーカーとして加えた。96ウェルV底プレート内でMACS緩衝液中に前記3人の提供者に由来する初代CD4+T細胞とKarpas299細胞を100,000細胞/ウェルの密度で播種した。これらの細胞を10μg/mlのFITC結合抗CD26及び2.5μg/mlの抗CD4抗体と共に15分間にわたってインキュベートした。ゲーティングを行うために10μg/mlのFITC結合抗IgG2a抗体及び2.5μg/mlのAPC結合抗IgG2b抗体(バイオレジェンド社、カタログ番号400612)を添加した。その後、これらの細胞を洗浄し、4%ホルムアルデヒド中で固定した。FACSCanto IIを使用する細胞蛍光測定によりCD4+細胞とCD26+細胞のパーセンテージを決定した。
T細胞(ヒト初代T細胞と前記T細胞株の両方)においてCD26受容体の内部移行を誘導するベゲロマブの能力を細胞蛍光測定分析により決定した。2回の独立した実験でこのアッセイを実施した。一回の実験につき3人分のバフィーコートからCD4+T細胞を単離した。その後、PBMCと前記単離細胞の両方を抗CD4抗体と抗CD26抗体で標識して前記単離細胞集団の純度、並びにCD26細胞のパーセンテージを実験前に決定した。さらに、生存率測定用染料を添加して生細胞に対して実験が実施されることを確実にした。これらの細胞を細胞蛍光測定により分析した。
T細胞の活性化におけるベゲロマブの効果を評価するために炎症誘発性サイトカインの産生を調べた。
この目的のためにメソスケールディスカバリー(MSD)アッセイ、すなわち9重アッセイをヒト炎症誘発性サイトカインについて用いた(カタログ番号15007B-2)。上記(第4.1.1.2節)のように抗CD3抗体/抗CD28抗体で被覆された96ウェル平底プレート内に前記初代T細胞とKarpas299 T細胞株の両方を100,000細胞/ウェルの密度で播種し、一晩にわたってインキュベートした。
ヒトT細胞株及びヒト初代T細胞におけるCD26の発現/過剰発現
図2は初代末梢血単核細胞集団内、精製CD4+T細胞集団内、及びKarpas299株内のCD4+細胞とCD26+細胞のパーセンテージを示している。細胞蛍光測定により得られた結果から初代単核細胞中のCD4+細胞とCD26+細胞のパーセンテージはそれぞれ約45%超と約35%超であることが示され、CD4+T細胞の単離後にはこれらのパーセンテージはそれぞれ95%超と75%超になる(図2パネルA)。Karpas299細胞のほとんど全てがCD4(95%超)を発現し、同様に高レベルのCD26(95%超)を発現する(図2パネルB)。まとめると、前記単離初代CD4+T細胞集団内、及び前記Karpas299細胞株内のCD26陽性細胞のパーセンテージはそれぞれ約75%及び約95%である。上記パーセンテージは後続の実験工程におけるCD26レベルの測定にも充分である。
初代T細胞及びT細胞株におけるベゲロマブ誘導性のCD26の内部移行を測定するために細胞蛍光測定分析を用いた。存在するCD26の減少とベゲロマブの濃度との間の用量依存的な関係の特定にも同じ分析を用いた。前記Karpas299 T細胞株においてCD26+細胞のパーセンテージ並びに前記CD4+集団中のCD26+の平均蛍光強度(MFI)を決定した。前記Karpas299 T細胞株では8時間後に37℃でのみ前記CD4+集団中のCD26 MFIの低下が観察された(図の中で報告されていないデータであるが、4時間後では7%の阻害であり、8時間後では22.3%の阻害である)(図3パネルA)。インキュベーションが4℃で行われたとき、すなわち全ての生物学的過程が低温により阻害されるときに対し、37℃でベゲロマブと共に8時間にわたってインキュベートした後に測定された前記CD4+集団中のCD26のMFIのこの低下は統計学的に有意である。単一の細胞当たりのCD26受容体の数がKarpas299細胞において37℃でベゲロマブとの結合後に減少することが得られたデータにより示されている。同じ生物学的現象が4℃では観察されなかったので、ベゲロマブとの結合後のCD26受容体の内部移行はKarpas299 T細胞株における前記抗体の作用機序を表していると結論することができる。ベゲロマブとの結合によって誘導されるKarpas299細胞におけるCD26受容体の内部移行を臨床開発のためにバッチリリース用の力価試験として使用することができることを確実にするために用量応答性実験を実施した。上記の実験において37℃でベゲロマブの濃度を上昇させて、具体的には0.5μg/ml(3×10-9M)、5μg/ml(3×10-8M)、及び30μg/ml(2×10-7M)でKarpas299細胞を24時間にわたって処理した(図5)。抗CD26抗体の濃度上昇は膜に発現したCD26の内部移行の漸増を誘導することができることが分かっているので得られた結果は非常に興味深い。具体的には、それぞれ3×10-9M、3×10-8M、及び2×10-7Mである0.5μg/ml、5μg/ml、及び30μg/mlという用量のベゲロマブが26.9%、34.5%、及び43.8%という内部移行率に対応する。この用量応答作用は力価試験の開発に必要な条件である。
CD26の内部移行がT細胞活性化に対して様々な下流作用を有し得ることを考慮して初代T細胞及びKarpas299細胞におけるベゲロマブ処理後の幾つかの炎症誘発性サイトカインのレベルを調べた。
本実験部分の目的は公知の抗CD26モノクローナル抗体であるベゲロマブから始めて抗CD26リガンドの活性に対する細胞アッセイを構築することである。
事前に設定されたベゲロマブとのインキュベーション時間の満了時に以下の染色プロトコルに従い、前記細胞試料をフルオロフォア結合抗体で処理し、その後で表面のCD26発現についてFACSにより分析する。
・各ウェルの内容物を1.5mLエッペンドルフチューブに移す。
・10,000rpmで5分間にわたって遠心分離する。
・沈殿物を1mLの冷DPBSで洗浄する。
・10,000rpmで5分間にわたって遠心分離する。
・沈殿物を乾燥し、下の表3に記載されるFACS分析用のインキュベーションプロトコルに従って次の抗体で染色する。
・1mLのDPBSを添加し、10,000rpmで5分間にわたって遠心分離する。
・上清を捨て、沈殿物を1mLの冷1×DPBSで洗浄する。
・10,000rpmで5分間にわたって遠心分離する。
・細胞沈殿物をDPBS-5%FBS中に0.7-1E6細胞/mLの濃度で再懸濁し、FACS分析までそれらの試料を暗所において+4℃で保存する。当日中に分析を行うことができない場合、0.36%の終濃度でパラホルムアルデヒドを添加して前記細胞を固定する。
Karpas299細胞の細胞膜表面上に存在するCD26の内部移行を誘導する能力としてベゲロマブの生物活性を測定した。
図6のグラフから分かるように、ベゲロマブを使用する24時間の処理後、最も高い濃度のベゲロマブ(150μg/mL又は1×10-6Mに等しい)を使用して処理した後のKarpas299細胞についてCD26に付随する蛍光の約48%の減少が存在する。
次に3種類のベゲロマブ試料の効力評価を行ったが、それらのうちの1つは32.5℃で6か月間にわたって極度に安定な条件下で保存された(SVI-STBの調製)。
抗C26抗体とのインキュベーション後のCD26の内部移行について得られた結果が分析技術を変更しても再現可能であることを確認するため、我々は異なる製造業者の2種類の細胞蛍光測定機を使用して内部移行実験を行った。
ベゲロマブ誘導性の膜上CD26の内部移行に基づく細胞アッセイが臨床用に使用される薬品のバッチリリース検査機能を満たすための全ての特徴を有していることがKarpas299細胞株を使用することによって実施された実験的試験により実証された。
2種類の他の抗CD26抗体、すなわち
・マウス抗hCD26モノクローナル抗体(クローン202.36)Thermo Fisher社、コード番号MA1-35147、ロット番号311030F
・陰性対照としてのIgG2b、マウスκアイソタイプ(クローンMG2b-57)バイオレジェンド社、コード番号M1395
を使用して前記効力アッセイを試験した。
・MFI値が130のとき、RSは膜に存在するCD26の23.1%を内部移行させ、それに対して検査化合物はわずかに18.5%を内部移行させ(検査/基準比率=0.80)、
・MFI値が110(膜CD26の存在が最小)のとき、RSは膜に存在するCD26の12.1%を内部移行させ、それに対して検査化合物はわずかに9.9%を内部移行させる(検査/基準比率=0.82)。
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<付記>
本発明は以下の態様を含む。
<項1>
以下の工程を含む、抗CD26リガンドの効力をインビトロで決定するための方法:
(a)75%より高いパーセンテージでCD26受容体を発現するヒトTリンパ球の集団を0.001μg/ml~150μg/mlの範囲の濃度の抗CD26リガンドと共に37℃又は室温でインキュベートする工程;
(b)工程(a)において使用された前記抗CD26リガンドが認識するエピトープとは異なるCD26エピトープを認識する蛍光色素標識抗CD26抗体と共にインキュベートする工程;
(c)細胞蛍光測定分析により前記抗CD26リガンドで処理された細胞の試料について測定されたCD26のMFI値(MFIT)と未処理細胞のMFI値(MFINT)を決定する工程;
(d)以下の式
に従って計算されるCD26受容体の内部移行率(%intCD26)又はRFIを評価する工程を含み、%intCD26の値が、20%未満である場合に前記抗CD26リガンドの効力が低いことを示し、20%~30%の範囲にある場合に前記抗CD26リガンドの効力が中程度であることを示し、30%より高い場合に前記抗CD26リガンドの効力が高いことを示す。
<項2>
工程(a)の前記抗CD26リガンドの濃度が0.01μg/ml~100μg/mlの範囲、より好ましくは0.01μg/ml~2μg/mlの範囲、さらにより好ましくは0.01μg/ml~0.5μg/mlの範囲にある、<項1>に記載の方法。
<項3>
工程(a)の前記抗CD26リガンドが、抗体又はその抗体の断片である、<項1>又は<項2>に記載の方法。
<項4>
前記抗CD26抗体がモノクローナル抗体ベゲロマブである、<項3>に記載の方法。
<項5>
工程(b)の蛍光色素がFITC、APC、PE、PE-Cy7、APC-H7、PerCP、及びPE-Cy5.5からなる群より選択され、好ましくはAPCである、<項1>~<項4>のいずれか1項に記載の方法。
<項6>
工程(a)のヒトCD26+Tリンパ球集団が初代Tリンパ球集団又はヒトTリンパ球の腫瘍細胞株のから選択される、<項1>~<項5>のいずれか1項に記載の方法。
<項7>
前記ヒトTリンパ球腫瘍細胞株がKarpas299細胞株である、<項6>に記載の方法。
<項8>
工程(c)の前記細胞蛍光測定分析がFACSにより実施される、<項1>~<項7>のいずれか1項に記載の方法。
<項9>
IL-8、IL-1β、IL-6、IL-2、GM-CSF、IL-6、及びTNF-αからなる群より選択される炎症性サイトカインの産生阻害のアッセイ工程を、工程(a)のヒトCD26+Tリンパ球集団に対して実施することをさら含む、<項1>~<項8>のいずれか1項に記載の方法。
<項10>
前記サイトカインの産生阻害がメソスケールディスカバリーアッセイによって評価される、<項9>に記載の方法。
<項11>
前記ヒトCD26+Tリンパ球集団がKarpas299細胞株である、<項9>又は<項10>に記載の方法。
Claims (10)
- 以下の工程を含む、ベゲロマブの効力をインビトロで決定するための方法:
(a)75%より高いパーセンテージでCD26受容体を発現するヒトTリンパ球の集団を0.001μg/ml~150μg/mlの範囲の濃度のベゲロマブと共に37℃又は室温でインキュベートする工程;
(b)工程(a)において使用された前記ベゲロマブが認識するエピトープとは異なるCD26エピトープを認識する蛍光色素標識抗CD26抗体と共にインキュベートする工程;
(c)細胞蛍光測定分析により前記ベゲロマブで処理された細胞の試料について測定されたCD26のMFI値(MFIT)と未処理細胞のMFI値(MFINT)を決定する工程;
(d)以下の式
に従って計算されるCD26受容体の内部移行率(%intCD26)又はRFIを評価する工程を含み、%intCD26の値が、20%未満である場合に前記ベゲロマブの効力が低いことを示し、20%~30%の範囲にある場合に前記ベゲロマブの効力が中程度であることを示し、30%より高い場合に前記ベゲロマブの効力が高いことを示す。 - 工程(a)の前記ベゲロマブの濃度が0.01μg/ml~100μg/mlの範囲にある、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の前記ベゲロマブが、モノクローナル抗体又はそのモノクローナル抗体の断片である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 工程(b)の蛍光色素がFITC、APC、PE、PE-Cy7、APC-H7、PerCP、及びPE-Cy5.5からなる群より選択される、請求項1~請求項3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(a)のヒトCD26+Tリンパ球集団が初代Tリンパ球集団又はヒトTリンパ球の腫瘍細胞株のから選択される、請求項1~請求項4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒトTリンパ球腫瘍細胞株がKarpas299細胞株である、請求項5に記載の方法。
- 工程(c)の前記細胞蛍光測定分析がFACSにより実施される、請求項1~請求項6のいずれか1項に記載の方法。
- IL-8、IL-1β、IL-6、IL-2、GM-CSF、IL-6、及びTNF-αからなる群より選択される炎症性サイトカインの産生阻害のアッセイ工程を、工程(a)のヒトCD26+Tリンパ球集団に対して実施することをさら含む、請求項1~請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記サイトカインの産生阻害がメソスケールディスカバリーアッセイによって評価される、請求項8に記載の方法。
- 前記ヒトCD26+Tリンパ球集団がKarpas299細胞株である、請求項8又は請求項9に記載の方法。
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