JP2021502813A5

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Publication number: JP2021502813A5
Application number: JP2020526394A
Authority: JP
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2021-12-23
Anticipated expiration: 2038-11-15

Description

ウイルス形質移入及び組織調製
ＡＡＶ投与のため、麻酔した動物の眼球をレンズに近い強膜中で鋭利な３０ゲージ針により穿刺した。２マイクロＬのＡＡＶ粒子懸濁液をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジにより網膜下注射した。３週間後、単離網膜をＰＢＳ中４％のＰＦＡ中で３０分間固定し、次いで洗浄ステップをＰＢＳ中で４℃において行った。全網膜をＰＢＳ中１０％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００により室温において１時間処理した。ＰＢＳ中３％のＮＤＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００中のモノクローナルラット抗ＧＦＰＡｂ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．；１：５００）及びポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：１：２００）による処理を、室温において５日間実施した。二次ロバ抗ラットＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８Ａｂ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．；１：２００）、抗ヤギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６３３及びヘキストによる処理を２時間行った。切片を洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄ退色防止試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ．）によりスライドガラス上にマウントし、ＺｅｉｓｓＬＳＭ７００ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒＺ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓＩｎｃ．）を使用して撮影した。

以下の態様を包含し得る。
［１］霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させる方法であって、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子を、前記霊長類の前記網膜色素上皮の細胞に送達するステップを含み、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす方法。
［２］前記単離核酸分子が、最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］前記単離核酸分子が、発現カセットの一部である、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記発現カセットが、ベクターの一部である、上記［３］に記載の方法。
［５］前記ベクターが、ウイルスベクターである、上記［４］に記載の方法。
［６］霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させるための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子の使用であって、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす使用。
［７］前記単離核酸分子が、最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含む、上記［６］に記載の使用。
［８］前記単離核酸分子が、発現カセットの一部である、上記［６］又は［７］に記載の使用。
［９］前記発現カセットが、ベクターの一部である、上記［８］に記載の使用。
［１０］前記ベクターが、ウイルスベクターである、上記［９］に記載の使用。
［１１］網膜色素上皮と関連する疾患の治療における使用のための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす単離核酸分子。
［１２］網膜色素上皮と関連する前記疾患は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症及び網膜色素上皮肥大症からなる群から選択される、上記［１１］に記載の使用のための単離核酸分子。

Claims

霊長類の網膜色素上皮の細胞中で外因性遺伝子を発現させる方法であって、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列を含む単離核酸分子を、前記霊長類の前記網膜色素上皮の細胞に送達するステップを含み、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にドライブするのに効果的である、方法。
少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％の全体同一性を有する、請求項１に記載の方法。
少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列が、配列番号１の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記単離核酸分子が、外因性遺伝子に作動可能に結合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記単離核酸分子が、最小プロモーターをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記最小プロモーターが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
前記単離核酸分子が、発現カセットの一部である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記発現カセットが、ベクターの一部である、請求項７に記載の方法。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項８に記載の方法。
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８に記載の方法。
霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させるための単離核酸分子の使用であって、前記単離核酸分子が、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列を含み、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にドライブするのに効果的である、使用。
少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％の全体同一性を有する、請求項１１に記載の使用。
少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列が、配列番号１の核酸配列を含む、請求項１１に記載の使用。
前記単離核酸分子が、外因性遺伝子に作動可能に結合している、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
前記単離核酸分子が、最小プロモーターをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
前記最小プロモーターが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１５に記載の使用。
前記単離核酸分子が、発現カセットの一部である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
前記発現カセットが、ベクターの一部である、請求項１７に記載の使用。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１８に記載の使用。
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１８に記載の使用。
網膜色素上皮と関連する疾患の治療における使用のための医薬組成物であって、単離核酸分子を含み、前記単離核酸分子が、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列を含み、前記単離核酸分子が、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にドライブするのに効果的である、医薬組成物。
網膜色素上皮と関連する前記疾患は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症及び網膜色素上皮肥大症からなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列が、配列番号１の核酸配列と少なくとも９５％の全体同一性を有する、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
少なくとも４００塩基対であり、かつ配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する核酸配列が、配列番号１の核酸配列を含む、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
前記単離核酸分子が、外因性遺伝子に作動可能に結合している、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記単離核酸分子が、最小プロモーター配列をさらに含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記最小プロモーター配列が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
前記単離核酸分子が、発現カセットの一部である、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記発現カセットが、ベクターの一部である、請求項２８に記載の医薬組成物。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２９に記載の医薬組成物。
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２９に記載の医薬組成物。
前記外因性遺伝子が、チャネルロドプシンまたはハロロドプシンをコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の使用、または請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。