JP2021130716A - 組換えアデノ随伴ウイルス９の髄腔内送達 - Google Patents

Abstract

【課題】中枢神経系にポリヌクレオチドを送達するための方法およびベクターを提供する。【解決手段】本発明は、ポリヌクレオチドの髄腔内送達（すなわち、脳もしくは脊髄のくも膜の下にある空間への送達）に有用なアデノ随伴ウイルス９型の方法および物質を提供する。上記方法および物質の使用は、例えば、下位運動ニューロン疾患（例えば、ＳＭＡおよびＡＬＳ）、ならびにポンペ病およびリソソーム蓄積症の処置に関して示される。【選択図】なし

Description

（関連出願の引用）
この出願は、２０１２年８月１日に出願された米国仮出願第６１／６７８，４５８号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。

（政府の権利に関する陳述）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって付与されたＲＣ２ ＮＳ６９４７６−０１の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

（電子提出された物件の参照による援用）
本明細書と同時に提出されかつ以下：「４７０９９ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と称されるＡＳＣＩＩテキストファイル（８，９５４バイト、２０１３年７月３１日作製）のとおりに識別されるコンピューター読み取り可能な形態での配列表は、その全体において本明細書に参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、ポリヌクレオチドの髄腔内送達（すなわち、脳もしくは脊髄のくも膜の下にある空間への送達）に有用なアデノ随伴ウイルス９型の方法および物質に関する。上記方法および物質の使用は、例えば、下位運動ニューロン疾患（例えば、ＳＭＡおよびＡＬＳ）、ならびにポンペ病およびリソソーム蓄積症の処置に関して示される。

（背景）
大型分子薬物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切らず、小型分子のうちの９８％は、この関門を通過できず、それによって、多くのＣＮＳ障害の薬物開発の努力が制限されている［Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ， Ｗ．Ｍ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １： １３１−１３９ （２００２）］。遺伝子送達は、ＢＢＢを迂回するための方法として近年提唱された［Ｋａｓｐａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１： ８３９−８４２ （２００３）］；しかし、脳および脊髄への広く行き渡る送達は、困難であった。運動ニューロン疾患に関する成功裡の遺伝子治療の開発は、脊髄および運動皮質内の広く行き渡る形質導入をおそらく必要とする。最も一般的な運動ニューロン疾患のうちの２つは、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）であり、これらはともに、それぞれ、小児および成人を衰弱させる障害であり、今までのところ有効な治療はない。ＳＭＡおよびＡＬＳの齧歯類モデルでの近年の研究は、筋肉内注射の後に逆行して輸送されるウイルスを使用する遺伝子送達を含む［Ｋａｓｐａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１： ８３９−８４２ （２００３）； Ａｚｚｏｕｚら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１４： １７２６−１７３１ （２００４）； Ａｚｚｏｕｚら、Ｎａｔｕｒｅ ４２９： ４１３−４１７ （２００４）； Ｒａｌｐｈら、Ｎａｔ Ｍｅｄ １１： ４２９−４３３ （２００５）］。しかし、脊髄、脳幹および運動皮質全体にわたって神経変性が広く行き渡った領域を標的としてこれら疾患を有効に処置するために多くの注射が必要とされることを考慮すれば、臨床開発は困難であり得る。ＡＡＶベクターはまた、神経学的障害についての近年の多くの臨床試験で使用されてきており、持続する導入遺伝子発現、比較的安全なプロフィール、および有望な機能的応答を示すが、外科的な実質組織内注射（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を要した［Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｌａｎｃｅｔ ３６９： ２０９７−２１０５ （２００７）； Ｍａｒｋｓら、Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ ７： ４００−４０８ （２００８）； Ｗｏｒｇａｌｌら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ （２００８）］。

ＳＭＡは、生後６ヶ月以内に弛緩性麻痺によって特徴付けられる小児期早期の神経変性障害である。この疾患の最も重篤な症例では、麻痺によって呼吸不全がもたらされ、通常２歳までに死亡する。ＳＭＡは、新生児６０００人に１人の発生率で嚢胞性線維症に隠れた２番目に一般的な小児の常染色体劣性疾患である。ＳＭＡは、脊髄全体の長さに沿って下位運動ニューロン（ＬＭＮ）喪失が存在することによって特徴付けられる遺伝性障害である。ＳＭＡは、骨格筋の脱神経（ｄｅｎｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ）および顕著な筋萎縮を生じる、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質の発現の低下によって引き起こされる。ＳＭＮは、Ｕ ｓｎＲＮＰ生物発生において機能する、遍在的に発現されるタンパク質である。

ヒトでは、ＳＭＮ遺伝子の２つの非常によく似たコピーが存在し、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２といわれる。上記２つの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、同一である。しかし、エキソン７において生じるエキソン７のＳＭＮ２におけるサイレントな単一ヌクレオチド変化は、ＳＭＮ２からの転写物のうちの８０〜９０％で排除される。得られた短縮型のタンパク質（ＳＭＮΔ７といわれる）は、安定性が低く、急速に分解される。ＳＭＮ２の転写物のうちの残りの１０〜２０％が、全長ＳＭＮタンパク質をコードする。ＳＭＮ１の全てのコピーが失われ、ＳＭＮ２のみが残されて全長ＳＭＮタンパク質を生成するときに疾患が生じる。よって、ＳＭＮ２は、より高いＳＭＮ２コピー数を有する患者は一般にはより遅い発症および重篤度がより低い疾患を示すという点において、ＳＭＡにおける表現型調節因子（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）として作用する。

ＳＭＡの治療的アプローチは、ＳＭＮレベルを増大させるかまたは残りのＳＭＮ機能を増強するための薬物開発に主に焦点が当てられてきた。数年間のスクリーニングにも拘わらず、どの薬物も、回復治療としてＳＭＮレベルを増大させるために十分に有効ではなかった。多くのマウスモデルがＳＭＡに関して開発されてきた。Ｈｓｉｅｈ−Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２４ （１）： ６６−７０ （２０００）； Ｌｅら、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １４ （６）： ８４５−８５７ （２００５）； Ｍｏｎａｎｉら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １６０ （１）： ４１−５２ （２００３）およびＭｏｎａｎｉら、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， ９ （３）： ３３３−３３９ （２０００）を参照のこと。近年の研究は、マウスモデルにおいて全長ＳＭＮ ｃＤＮＡを発現させ、著者らは、ニューロンにおけるＳＭＮの発現がＳＭＡの症状に対して顕著に影響を有し得ると結論づけた。Ｇａｖｒｉｌｉｎａら、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １７（８）：１０６３−１０７５ （２００８）を参照のこと。

ＡＬＳは、筋肉および／もしくは筋機能の喪失を生じるもう１つの疾患である。これは、１８６９年にＣｈａｒｃｏｔによって最初に特徴付けられ、１００，０００個体のうちの約５個体に影響を及ぼす広く行き渡った成人発症の神経変性疾患である。ＡＬＳは、随意運動を司る脳および脊髄の中の特定の神経細胞が徐々に変性するときに生じる。臨床上の発症から２〜５年以内に、これらの運動ニューロンの喪失によって、骨格筋の進行性の萎縮が生じ、それは、麻痺、発語欠陥、および呼吸不全に起因する死亡を生じる筋機能の喪失を生じる。

ＡＬＳ発症を引き起こすかもしくはその素因がある遺伝子異常は未知であるが、ＳＯＤ−１遺伝子におけるミスセンス変異が家族性ＡＬＳ症例のうちの約１０％で起こっており、そのうちの最大で２０％までが、第２１染色体に位置するＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子に変異を有する。ＳＯＤ−１は、フリーラジカルスーパーオキシドアニオンを過酸化水素および分子酸素へと変換することによって、酸化的ストレスの調節において通常は機能している。現在まで、ＳＯＤ−１遺伝子の全てのエキソンにわたって９０を超える変異が同定されてきた。これら変異のうちのいくつかは、変異型ヒトＳＯＤ−１を発現するトランスジェニックマウスの系統を作って、ＡＬＳの進行性の運動ニューロン疾患および病因のモデル化するために使用されてきた。

ＳＭＡおよびＡＬＳは、最も一般的な運動ニューロン疾患のうちの２つである。ＳＭＡおよびＡＬＳの齧歯類モデルにおける近年の研究は、筋肉内注射の後に逆行して輸送されるウイルスを使用する遺伝子送達による処置を試験した。Ａｚｚｏｕｚら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １１４： １７２６−１７３１ （２００４）； Ｋａｓｐａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０１： ８３９−８４２ （２００３）； Ａｚｚｏｕｚら、Ｎａｔｕｒｅ， ４２９： ４１３−４１７ （２００４）およびＲａｌｐｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １１： ４２９−４３３ （２００５）を参照のこと。脊髄、脳幹および運動皮質全体にわたる神経変性を標的とするために多くの注射が必要とされることを考慮すれば、このような処置の臨床使用は困難であり得る。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その中の１本鎖ＤＮＡゲノムは、長さ約４．７ｋｂであり、１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ， ７５： ３３８５−３３９２ （１９９４）によって訂正されたが、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ４５： ５５５−５６４ （１９８３）で示された。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド化／パッケージングおよび宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用性配列は、上記ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（それらそれぞれのマップ位置にちなんでｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と称される）は、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、１つのＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７での）差次的スプライシングと合わせて、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ ７８、ｒｅｐ ６８、ｒｅｐ ５２、およびｒｅｐ ４０）の生成を生じる。Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノム複製を最終的に担う複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、それは、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、上記３つの関連キャプシドタンパク質の生成を担う。１つのコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環および遺伝的特質は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５８： ９７−１２９ （１９９２）において総説されている。

ＡＡＶは、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして（例えば、遺伝子治療において）それを魅力的にする特有の特徴を有する。培養における細胞のＡＡＶ感染は、非細胞障害性であり、ヒトおよび他の動物の自然な感染は、無症状かつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、多くの異なる組織をインビボで標的とする可能性がある。さらに、ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞をゆっくりと形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｐｉｓｏｍｅ）（染色体外エレメント）として本質的にそれら細胞の寿命にわたって残っている。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実行可能にするプラスミド中のクローニングされたＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムキャプシド化および組み込みを指示するシグナルはＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、上記ゲノムの内部の約４．３ｋｂのうちのいくらかもしくは全て（複製および構造的キャプシドタンパク質、ｒｅｐ−ｃａｐをコードする）は、外来ＤＮＡ（例えば、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット）で置き換えられ得る。上記ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、これが極めて安定なかつ強いウイルスであることである。上記ウイルスは、アデノウイルスを不活化するために使用される条件（数時間にわたって５６℃〜６５℃）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存をそれほど不可欠にしない。ＡＡＶは、さらに凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重感染に対して耐性ではない。

ＡＡＶには複数の血清型があり、種々の組織向性を表す。既知の血清型としては、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１が挙げられる。ＡＡＶ９は、米国特許第７，１９８，９５１号およびＧａｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７８： ６３８１−６３８８ （２００４）に記載されている。ＡＡＶ６およびＡＡＶ８の送達の進歩は、簡単な全身静脈内注射もしくは腹腔内注射の後に骨格筋および心筋のこれら血清型による形質導入を可能にした。Ｐａｃａｋら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ９９（４）： ３−９ （１００６）およびＷａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ２３（３）： ３２１−８ （２００５）を参照のこと。しかし中枢神経系内の細胞タイプを標的とするためにＡＡＶを使用することは、外科的な実質組織内注射を要した。Ｋａｐｌｉｔｔら、前出； Ｍａｒｋｓら、前出およびＷｏｒｇａｌｌら、前出を参照のこと。

米国特許第７，１９８，９５１号明細書

Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ（２００２）１：１３１〜１３９ Ｋａｓｐａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：８３９〜８４２

従って、中枢神経系にポリヌクレオチドを送達するための方法およびベクターが当該分野で未だに必要である。

（要旨）
本発明は、組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）をベクターとして使用する、中枢神経系へのポリヌクレオチドの髄腔内送達に有用な方法および物質を提供する。

より具体的には、本発明は、必要な患者の中枢神経系にポリヌクレオチドを送達するための方法を提供し、上記方法は、上記患者へのｒＡＡＶ９および非イオン性の低浸透性造影剤の髄腔内送達を包含し、ここで上記ｒＡＡＶ９は、上記ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む。上記ポリヌクレオチドは、例えば、脳、脊髄、グリア細胞、星状細胞および／もしくは下位運動ニューロンに送達される。上記非イオン性の低浸透性造影剤は、例えば、イオビトリドール（ｉｏｂｉｔｒｉｄｏｌ）、イオヘキソール（ｉｏｈｅｘｏｌ）、イオメプロール（ｉｏｍｅｐｒｏｌ）、イオパミドール（ｉｏｐａｍｉｄｏｌ）、イオペントール（ｉｏｐｅｎｔｏｌ）、イオプロミド（ｉｏｐｒｏｍｉｄｅ）、イオベルソール（ｉｏｖｅｒｓｏｌ）もしくはイオキシラン（ｉｏｘｉｌａｎ）である。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）ポリヌクレオチドである。

本発明はまた、必要な患者における神経学的疾患を処置するための方法を提供し、上記方法は、上記患者へのｒＡＡＶ９および非イオン性の低浸透性造影剤の髄腔内送達を包含し、ここで上記ｒＡＡＶ９は、治療用ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む。上記神経学的疾患は、例えば、脊髄性筋萎縮症もしくは筋萎縮性側索硬化症のような神経変性疾患である。上記治療用ポリヌクレオチドは、例えば、ＳＭＮポリヌクレオチドである。上記ＳＭＮポリヌクレオチドは、例えば、脳、脊髄、グリア細胞、星状細胞および／もしくは下位運動ニューロンに送達される。上記非イオン性の低浸透性造影剤は、例えば、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ポリヌクレオチドの送達を必要とする患者の中枢神経系にポリヌクレオチドを送達する方法であって、該方法は、該患者へのｒＡＡＶ９および非イオン性の低浸透性造影剤の髄腔内送達を包含し、ここで該ｒＡＡＶ９は、該ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む、方法。
（項目２）
前記ポリヌクレオチドが、脳に送達される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ポリヌクレオチドが、脊髄に送達される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ポリヌクレオチドが、グリア細胞に送達される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記グリア細胞が、星状細胞である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ポリヌクレオチドが、下位運動ニューロンに送達される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオヘキソールである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ポリヌクレオチドが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）ポリヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
神経学的疾患の処置を必要とする患者において神経学的疾患を処置する方法であって、該方法は、該患者へのｒＡＡＶ９および非イオン性の低浸透性造影剤の髄腔内送達を包含し、ここで該ｒＡＡＶ９は、治療用ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む、方法。
（項目１１）
前記神経学的疾患が、レット症候群である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記神経学的疾患が、神経変性疾患である、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記治療用ポリヌクレオチドが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）ポリヌクレオチドである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記神経変性疾患が、脊髄性筋萎縮症である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症である、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記ポリヌクレオチドが、脳に送達される、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記ポリヌクレオチドが、脊髄に送達される、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
前記ポリヌクレオチドが、グリア細胞に送達される、項目１０に記載の方法。
（項目１９）
前記グリア細胞が、星状細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ポリヌクレオチドが、下位運動ニューロンに送達される、項目１０に記載の方法。
（項目２１）
前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランである、項目１０に記載の方法。
（項目２２）
前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオヘキソールである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記患者が、前記ｒＡＡＶ９の髄腔内送達後に、トレンデレンブルグ体位に置かれる、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。

（詳細な説明）
従って、一局面において、本発明は、患者の中枢神経系へのポリヌクレオチドの髄腔内送達のための方法を提供し、上記方法は、上記ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するｒＡＡＶ９を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、非イオン性の低浸透性造影剤はまた、上記患者に投与される。上記非イオン性の低浸透性造影剤は、上記患者の中枢神経系における標的細胞の形質導入を増大させる。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、自己相補性ゲノムである。他の実施形態において、上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、１本鎖ゲノムである。

いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、脳に送達される。送達が企図される脳の領域としては、運動皮質および脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、脊髄に送達される。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、下位運動ニューロンに送達される。本発明の実施形態は、ポリヌクレオチドを神経およびグリア細胞に送達するためにｒＡＡＶ９を使用する。いくつかの実施形態において、上記グリア細胞は、小グリア細胞、希突起膠細胞もしくは星状細胞である。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶ９は、ポリヌクレオチドをシュワン細胞に送達するために使用される。

本発明の方法および物質の使用は、例えば、下位運動ニューロン疾患（例えば、ＳＭＡおよびＡＬＳ）、ならびにポンペ病、リソソーム蓄積症、多形膠芽腫およびパーキンソン病の処置に関して示される。リソソーム蓄積症としては、アクチベーター欠損（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）／ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（乳児型、乳児後期型／若年型、成人／慢性型）、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児型遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年型ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病（乳児発症型、後期発症型）、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症（偽ハーラー多発性ジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ、ＭＰＳ Ｉハーラー症候群、ＭＰＳ Ｉシャイエ症候群、ＭＰＳ Ｉハーラー・シャイエ症候群、ＭＰＳ ＩＩハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ型／ＭＰＳ ＩＩＩ Ｄ、モルキオＡ型／ＭＰＳ ＩＶＡ、モルキオＢ型／ＭＰＳ ＩＶＢ、ＭＰＳ ＩＸヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳ ＶＩマロトー・ラミー、ＭＰＳ ＶＩＩスライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型）、多発性スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）、神経セロイドリポフスチノーシス（ＣＬＮ６疾患（不定型乳児後期型、後期発症型変種、早期若年型）、バッテン・シュピールマイアー・フォークト（Ｂａｔｔｅｎ−Ｓｐｉｅｌｍｅｙｅｒ−Ｖｏｇｔ）／若年型ＮＣＬ／ＣＬＮ３疾患、フィンランド変種乳児後期型ＣＬＮ５、ジャンスキー・ビールショウスキー病／乳児後期型ＣＬＮ２／ＴＰＰ１疾患、クフス／成人発症型ＮＣＬ／ＣＬＮ４病、北方癲癇（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ）／変種乳児後期型ＣＬＮ８、サンタビューリ・ハルティア（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ−Ｈａｌｔｉａ）／乳児型ＣＬＮ１／ＰＰＴ疾患、β−マンノシドーシス、ポンペ病／糖原病ＩＩ型、濃化異骨症（Ｐｙｃｎｏｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）、サンドホフ病／成人発症型／ＧＭ２ガングリオシドーシス、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス-乳児型、サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス-若年型、シンドラー病、サラ病／シアル酸蓄積症、テイ・サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシス、ウォルマン病が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる実施形態において、上記方法および物質の使用は、神経系疾患（例えば、レット症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病）の処置に関して、または神経系損傷（脊髄および脳の外傷／損傷、脳卒中、および脳の癌が挙げられる）の処置に関して示される。

別の局面において、本発明は、ｒＡＡＶゲノムを提供する。上記ｒＡＡＶゲノムは、ポリペプチド（ＳＭＮポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない）をコードするか、またはそれらの遺伝子の変異したタンパク質もしくは制御配列に指向されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、および／もしくはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに隣接する１個以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。上記ポリヌクレオチドは、遺伝子カセットを形成するために標的細胞において機能的である転写制御ＤＮＡ、具体的には、プロモーターＤＮＡおよびポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結される。上記遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞で発現される場合に、ＲＮＡ転写物のプロセシングを促進するために、イントロン配列を含み得る。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、神経系損傷（脊髄および脳の外傷／損傷、脳卒中、および脳の癌が挙げられる）とともに、神経変性障害（アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病が挙げられるが、これらに限定されない）の処置のための栄養因子もしくは保護因子をコードする。公知の神経系増殖因子の非限定的例としては、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、ニューロトロフィン−６（ＮＴ−６）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子ファミリー（例えば、ＦＧＦの１〜１５）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン様増殖因子ファミリーの特定のメンバー（例えば、ＩＧＦ−１）、ニュルツリン、パーセフィン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、イムノフィリン、増殖因子のトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）ファミリー、ニューレグリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子ファミリー（例えば、ＶＥＧＦ １６５）、フォリスタチン、Ｈｉｆ１などが挙げられる。本明細書で企図される栄養因子もしくは保護因子の各々を調節するジンクフィンガー転写因子もまた、一般に企図される。さらなる実施形態において、神経−免疫機能を調節するための方法が企図される（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、もしくはｍｉＲＮＡによる例えば、ＮＦｋＢ阻害、または神経保護（種々の細胞型におけるＮＦｋＢおよび関連経路の二重活性化）のためのＮＦｋＢを介する小グリア細胞活性化および大グリア細胞活性化の阻害が挙げられるが、これらに限定されない）。なおさらなる実施形態において、上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、アポトーシスインヒビター（例えば、ｂｃｌ２、ｂｃｌｘＬ）をコードする。栄養因子もしくは脊髄損傷調節タンパク質（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）または軸索成長のインヒビターのサプレッサー（例えば、Ｎｏｇｏのサプレッサー［Ｏｅｒｔｌｅら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ２３（１３）：５３９３-５４０６ （２００３）］をコードするｒＡＡＶ９の使用はまた、脊髄損傷を処置するために企図される。

神経変性障害（例えば、パーキンソン病）の処置のために、上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、種々の実施形態において芳香族酸ドパデカルボキシラーゼ（Ａｒｏｍａｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｏｐａ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）（ＡＡＤＣ）、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ｇｔｐｃｈ１）、アポトーシスインヒビター（例えば、ｂｃｌ２、ｂｃｌｘＬ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、抑制性神経伝達物質−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、またはドパミン生合成に関与する酵素をコードする。さらなる実施形態において、上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、例えば、Ｐａｒｋｉｎおよび／もしくはシヌクレインの調節因子をコードし得る。

神経変性障害（例えば、アルツハイマー病）の処置のために、いくつかの実施形態において、アセチルコリン生成を増大させるための方法が企図される。いくつかの実施形態において、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のレベルを増大させるか、またはアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）の活性を阻害するための方法が、企図される。

上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、いくつかの実施形態において、神経変性障害（例えば、ハンチントン病）を処置するために、変異型ハンチントンタンパク質（ｈｔｔ）発現を減少させるための方法において使用するために、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、および／もしくはｍｉＲＮＡをコードする。

上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、種々の実施形態において、神経変性障害（例えば、ＡＬＳ）の処置において使用するために、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス、および／もしくはｍｉＲＮＡをコードする。処置は、疾患の分子マーカー（例えば、ＴＮＦα、一酸化窒素、ペルオキシ亜硝酸、および／もしくは一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ））の発現における減少を生じる。

いくつかの実施形態において、上記ベクターは、変異タンパク質（例えば、ＡＬＳについてのスーパーオキシドジスムターゼ）、または神経栄養因子（例えば、ＡＬＳもしくはパーキンソン病についてのＧＤＮＦもしくはＩＧＦ１）に指向されるショートヘアピンＲＮＡをコードする。

いくつかの実施形態において、本発明の物質および方法の使用は、神経発生障害（例えば、レット症候群）を処置することに関して示される。レット症候群に関する実施形態について、上記ｒＡＡＶ９ゲノムは、例えば、メチルシトシン結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）をコードし得る。

「処置」は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量、もしくは有効複数回用量を必要な動物（ヒトが挙げられる）に、髄腔内経路を介して投与する工程を包含する。上記用量が障害／疾患の発生前に投与される場合、上記投与は、予防的である。上記用量が障害／疾患の発生後に投与される場合、上記投与は、治療的である。本発明の実施形態において、有効用量は、処置されている上記障害／疾患の状態と関連する少なくとも１つの症状を緩和する（除去するかもしくは低減するかのいずれか）、障害／疾患の状態への進行を遅らせるかもしくは予防する、障害／疾患の状態の進行を遅らせるかもしくは予防する、疾患の程度を縮小させる、疾患の寛解（部分的もしくは全体）を生じる、ならびに／または生存を延ばす用量である。本発明の方法による処置が企図される疾患の状態の例は、上記に示される。

組み合わせ治療はまた、本発明によって企図される。組み合わせは、本明細書で使用される場合、同時の処置もしくは逐次的な処置の両方を含む。本発明の方法と標準的医療処置（例えば、ＡＬＳにおけるリルゾール）との組み合わせが、新規治療との組み合わせと同様に、具体的に企図される。

生後必要な個体への送達が企図される一方で、胎児への子宮内送達もまた、企図される。

ｒＡＡＶでの形質導入はまた、インビトロで行われ得る。一実施形態において、所望の標的細胞は、被験体から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、被験体へと再導入される。あるいは、同系細胞もしくは異種細胞は、それら細胞が被験体において不適切な免疫応答を生じない場合に使用され得る。

被験体への形質導入および形質導入した細胞の再導入に適した方法は、当該分野で公知である。一実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶと上記細胞とを、例えば、適切な培地中で合わせ、目的のＤＮＡを有する細胞を、従来の技術（例えば、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲ）を使用して、または選択マーカーを使用することによってスクリーニングすることによって、インビトロで形質導入され得る。形質導入された細胞は、次いで、薬学的組成物へと処方され得、上記組成物は、種々の技術によって（例えば、脊髄への注射によって）被験体へと導入され得る。

本発明のｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ ＤＮＡおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いている。上記ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡ（例えば、ＩＴＲ）は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ血清型 ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０およびＡＡＶ−１１が挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得る。上記ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該分野で公知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ−２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ_＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ４５： ５５５−５６４ ｛１９８３）に提供され；ＡＡＶ−３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ−４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ−６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００ １８６２に提供され；ＡＡＶ−７およびＡＡＶ−８ゲノムのうちの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供され；ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７８： ６３８１−６３８８ （２００４）に提供され；ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．， １３（１）： ６７−７６ （２００６）に提供され；そしてＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ３３０（２）： ３７５−３８３ （２００４）に提供される。

別の局面において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドを提供する。上記ＤＮＡプラスミドは、上記ｒＡＡＶゲノムを、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子へとアセンブリするために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）での感染を可能にする細胞に移される。ｒＡＡＶ粒子を生成する技術（ここでパッケージされる予定のＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される）は、当該分野で標準的である。ｒＡＡＶの生成は、以下の成分が単一の細胞（本明細書でパッケージング細胞と称される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、上記ｒＡＡＶゲノムとは別個（すなわち、その中にはない）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ ０１／８３６９２（その全体において本明細書に参考として援用される）に開示される。種々の実施形態において、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えベクターの送達を増強するために改変され得る。キャプシドタンパク質の改変は、当該分野で一般に公知である。例えば、ＵＳ ２００５／００５３９２２およびＵＳ ２００９／０２０２４９０（これらの開示は、それら全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

パッケージング細胞を生成するための方法は、ＡＡＶ粒子生成に必須の成分を全て安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別個のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ならびに選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を含むプラスミド（もしくは複数のプラスミド）は、細胞のゲノムへと組みこまれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテール化（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ６． ＵＳＡ， ７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８３， Ｇｅｎｅ， ２３：６５−７３）のような手順によって、または直接の平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５９：４６６１−４６６６）によって、細菌プラスミドへと導入されてきた。上記パッケージング細胞株は、次いで、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、上記細胞が選択可能でありかつｒＡＡＶの大規模生成に適していることである。適切な方法の他の例は、パッケージング細胞へとｒＡＡＶゲノムならびに／もしくはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を導入するために、プラスミドよりむしろ、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスを使用する。

ｒＡＡＶ生成の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ， １９９２， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５３３−５３９；およびＭｕｚｙｃｚｋａ， １９９２， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８：９７−１２９）に総説されている。種々のアプローチが、以下に記載されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２ （１９８４）； Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６４６６ （１９８４）； Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏ１． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１ （１９８５）； ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６２：１９６３ （１９８８）；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ７：３４９ （１９８８）． Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６３：３８２２−３８２８）； 米国特許第５，１７３，４１４号； ＷＯ ９５／１３３６５および対応の米国特許第５，６５８．７７６号； ＷＯ ９５／１３３９２； ＷＯ ９６／１７９４７； ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００； ＷＯ ９７／０９４４１ （ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）； ＷＯ ９７／０８２９８ （ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）； ＷＯ ９７／２１８２５ （ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）； ＷＯ ９７／０６２４３ （ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）； ＷＯ ９９／１１７６４； Ｐｅｒｒｉｎら、（１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４−１２５０； Ｐａｕｌら、（１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９−６１５； Ｃｌａｒｋら、（１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；および米国特許第６，２５８，５９５号。前述の文書は、ｒＡＡＶ生成に関する文書のそれら節を特に強調して、それらの全体において本明細書に参考として援用される。

本発明は、従って、感染性ｒＡＡＶを生成するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、安定に形質転換された癌細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞およびＰｅｒＣ．６細胞（同起源の２９３株））であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞（例えば、継代数が少ない２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換したヒト胎児腎臓細胞）、ＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ−３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎臓細胞）およびＦＲｈＬ−２細胞（アカゲザル胎仔肺細胞））である。

他の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ９（すなわち、感染性キャプシド化ｒＡＡＶ９粒子）を提供する。本発明の一局面において、上記ｒＡＡＶゲノムは、自己相補性ゲノムである。

別の局面において、ｒＡＡＶが提供される（例えば、「ｒＡＡＶ ＳＭＮ」と称したｒＡＡＶ９）。上記ｒＡＡＶ ＳＭＮゲノム（配列番号１のヌクレオチド９８０−３３３６）は、順に、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチンプロモーターとサイトメガロウイルスエンハンサー、ＳＶ４０イントロン、ＳＭＮコードＤＮＡ（（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０００３４４．２）に示される）、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列およびもう１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを有する。ＳＭＮ ＤＮＡの保存的ヌクレオチド置換もまた、企図される（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０００３４４．２の６２５位でのグアニンからアデニンへの変化）。ゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ ＤＮＡおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、上記ゲノムのＩＴＲの間にＡＡＶ ｒｅｐ ＤＮＡもｃａｐ ＤＮＡも存在しない。企図されるＳＭＮポリペプチドとしては、ＮＣＢＩタンパク質データベース番号ＮＰ＿０００３３５．１に示されるヒトＳＭＮ１ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ＳＭＮ１調節因子ポリペプチドプラスチン−３（ＰＬＳ３）もまた企図される［Ｏｐｒｅａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０（５８７５）： ５２４−５２７ （２００８）］。他のポリペプチドをコードする配列は、ＳＭＮ ＤＮＡに関して置換され得る。

上記ｒＡＡＶは、当該分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーもしくは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ｒＡＡＶベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １０（６）： １０３１−１０３９ （１９９９）； Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， ６９： ４２７−４４３ （２００２）； 米国特許第６，５６６，１１８号およびＷＯ ９８／０９６５７に開示される方法を含む。

別の局面において、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。一実施形態において、本発明の組成物は、ＳＭＮポリペプチドをコードするｒＡＡＶを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、目的の種々のポリペプチドをコードする２つ以上のｒＡＡＶを含み得る。

本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアの中にｒＡＡＶを含む。上記組成物はまた、希釈剤およびアジュバントのような他の成分を含み得る。受容可能なキャリア、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、使用される投与量および濃度で不活性であり、緩衝剤（例えば、ホスフェート、シトレート、もしくは他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンが挙げられる）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／または非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ブルロニックもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む。

本発明の方法において投与される予定のｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、処置目標、個体、および標的となる細胞型に依存して変動し、当該分野で標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、約１×１０^６から、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４以上までのＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）／ｍｌの範囲に及び得る。投与量はまた、ウイルスゲノムのユニット（ｖｇ）単位で表され得る。投与量はまた、ヒトへの投与のタイミングに基づいて変動し得る。ｒＡＡＶのこれら投与量は、約１×１０^１１ ｖｇ／ｋｇから、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、約１×１０^１５、約１×１０^１６以上のウイルスゲノム／ｋｇ 成人体重までの範囲に及び得る。新生児については、ｒＡＡＶの投与量は、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約３×１０^１２、約１×１０^１３、約３×１０^１３、約１×１０^１４、約３×１０^１４、約１×１０^１５、約３×１０^１５、約１×１０^１６、約３×１０^１６以上のウイルスゲノム／ｋｇ 体重の範囲に及び得る。

別の局面において、標的細胞（神経細胞もしくはグリア細胞が挙げられるが、これらに限定されない）をｒＡＡＶで形質導入するための方法は、本発明によって企図される。

用語「形質導入」とは、レシピエント細胞による機能的ポリペプチドの発現を生じる本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介して、ポリヌクレオチドを標的細胞にインビボもしくはインビトロのいずれかで、投与／送達することをいうために使用される。

本発明のｒＡＡＶでの細胞の形質導入は、上記ｒＡＡＶによってコードされるポリペプチドもしくはＲＮＡの持続的な発現を生じる。本発明は、従って、動物もしくはヒト患者に本発明のｒＡＡＶ（例えば、ＳＭＮタンパク質をコードする）を投与／送達するための方法を提供する。これら方法は、神経細胞および／もしくはグリア細胞を１以上の本発明のｒＡＡＶで形質導入する工程を包含する。形質導入は、組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、プロモーターは、ニューロン内で特異的にもしくは星状細胞内で特異的に発現を可能にする。例としては、ニューロン特異的エノラーゼおよびグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。摂取された薬物の制御下での誘導性プロモーターもまた、開発され得る。

いくつかの局面において、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本開示のベクターが本明細書で記載されるとおりに造影剤と組み合わせて使用される場合に細胞の形質導入が増大されることは、予期される。種々の実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合に、少なくとも約１％、もしくは少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％以上増大される。さらなる実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合、約１０％〜約５０％、もしくは約１０％〜約１００％、もしくは約５％〜約１０％、もしくは約５％〜約５０％、もしくは約１％〜約５００％、もしくは約１０％〜約２００％、もしくは約１０％〜約３００％、もしくは約１０％〜約４００％、もしくは約１００％〜約５００％、もしくは約１５０％〜約３００％、もしくは約２００％〜約５００％増大される。

いくつかの局面において、細胞の形質導入は、本開示のベクターが造影剤と組み合わせて使用される場合および患者がトレンデレンブルグ体位（頭を低くした姿勢（ｈｅａｄ ｄｏｗｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ））に置かれる場合に、さらに増大されることが企図される。いくつかの実施形態において、例えば、上記患者は、髄腔内ベクター注入の間もしくは後に、約１度〜約３０度、約１５〜約３０度、約３０〜約６０度、約６０〜約９０度、もしくは約９０度を超えて約１８０度までで頭を低くした姿勢に傾けられる。種々の実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合に、少なくとも約１％、もしくは少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％以上増大される。さらなる実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合に、約１０％〜約５０％、もしくは約１０％〜約１００％、もしくは約５％〜約１０％、もしくは約５％〜約５０％、もしくは約１％〜約５００％、もしくは約１０％〜約２００％、もしくは約１０％〜約３００％、もしくは約１０％〜約４００％、もしくは約１００％〜約５００％、もしくは約１５０％〜約３００％、もしくは約２００％〜約５００％増大される。

本開示はまた、本開示のベクターおよび造影剤の、必要な患者の中枢神経系への髄腔内投与が、本開示のベクターが上記造影剤の非存在下で投与される場合の患者の生存と比較して、上記患者の生存の増大を生じる局面を提供する。種々の実施形態において、本開示のベクターおよび造影剤の、必要な患者の中枢神経系への投与は、本開示のベクターが上記造影剤の非存在下で投与される場合の上記患者の生存と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％以上の上記患者の生存の増大を生じる。

本開示はまた、本開示のベクターおよび造影剤の、トレンデレンブルグ体位に置かれた必要な患者の中枢神経系への髄腔内投与が、本開示のベクターが上記造影剤の非存在下およびトレンデレンブルグ体位をとらずに投与される場合の患者の生存と比較して、上記患者の生存のさらなる増大を生じる局面を提供する。種々の実施形態において、本開示のベクターおよび造影剤の、トレンデレンブルグ体位に置かれた必要な患者の中枢神経系への投与は、上記造影剤の非存在下およびトレンデレンブルグ体位をとらずに本開示のベクターが投与される場合の患者の生存と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％以上の患者の生存の増大を生じる。

本発明の材料および方法を使用して送達されるポリヌクレオチドが当該分野で公知のシステムを使用して調節制御下に置かれ得ることは、当業者によって理解される。非限定的例によれば、テトラサイクリン（ＴＥＴ オン／オフ）システム［例えば、ＴＥＴシステムに対する近年の改善についてはＵｒｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７（１４）：７９６３-７９６８ （２０００）を参照のこと］およびエクジソンレセプター調節可能システム［Ｐａｌｌｉら、Ｅｕｒ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７０： １３０８−１３１５ （２００３］のようなシステムが誘導性ポリヌクレオチド発現を提供するために利用され得ることは、理解される。本明細書で企図される方法および材料のうちのいずれかの組み合わせが神経変性疾患を処置するために使用され得ることはまた、当業者によって理解される。

本発明は、以下の実施例によって例証され、ここで実施例１は、例示的ｒＡＡＶ９の生成を記載し、実施例２は、ｒＡＡＶ９の髄腔内投与を記載し、実施例３は、ｒＡＡＶ９ ＳＭＮと造影剤との脳室内（ＩＣＶ）注入後のＳＭＮ変異体マウスの生存の増大を記載し、実施例４は、カニクイザルにおけるｒＡＡＶ９での運動ニューロン形質導入を記載する。

実施例１
ｒＡＡＶ９が中枢神経系を標的として、そこでタンパク質を発現する能力を、インビボモデル系で評価した。ｒＡＡＶゲノムは、先にＢｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， １９（１１）： １９７１−１９８０ （２０１１）に記載されるように、順に、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチンプロモーターとサイトメガロウイルスエンハンサー、ＳＶ４０イントロン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＤＮＡ、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列およびもう１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含んだ。

自己相補性ＡＡＶ９（ＡＡＶ９ ＧＦＰ）を、２９３細胞においてアデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）とともに以前に記載されるようにＲｅｐ２Ｃａｐ９配列をコードするプラスミドと、２本鎖ＡＡＶ２−ＩＴＲベースのＣＢ−ＧＦＰベクターを使用する一過性トランスフェクション手順によって生成した［Ｇａｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７８： ６３８１-６３８８ （２００４）］。血清型９配列を、配列決定によって確認したところ、以前に記載されるものと同一であった。ウイルスを、実験のために３つの別々のバッチで生成し、２回の塩化セシウム密度勾配精製工程によって精製し、ＰＢＳに対して透析し、０．００１％ プルロニック−Ｆ６８とともに処方して、ウイルス凝集を防止し、４℃で貯蔵した。全てのベクター調製物を、Ｔａｑ−Ｍａｎ技術を使用する定量的ＰＣＲによって力価測定した。ベクターの純度を、４-１２％ ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動および銀染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）によって評価した。

実施例２
いくつかの神経学的障害は、遍在的に発現されるタンパク質の欠損によって引き起こされるものの、他の障害においては、ＣＮＳのみにおける遺伝子発現が実質的な影響を有し得る。本発明は、ＣＳＦへの遺伝子送達が脳脊髄軸に沿った形質導入と、必要とされる用量を潜在的に低下させるという付加的な利益を生じ得ることを企図する。従って、より局所化したＣＮＳ送達をもたらすために、５．２×１０^１２ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９ ＧＦＰおよび非イオン性の低浸透性造影剤の、５日齢のブタ（各々ｎ＝３）への髄腔内注入および／もしくは槽内注入を行い、それらの脳および脊髄を、ＧＦＰ発現について試験した。

髄腔内注射。農場で繁殖した雌ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）を、地域の農場から得た。５日齢（Ｐ５）の子豚に、０．５ｃｃ／ｋｇ ケタミン導入麻酔を受けさせ、次いで、酸素中５％ イソフルランのマスク吸入によって維持した。体温、心電図、および呼吸数を手順の間中モニターした。腰椎穿刺のために、子ブタをうつぶせにし、椎骨間腔を拡げるために脊椎を弯曲させた。上前腸骨棘を触診し、２点を繋ぐ線を視覚化した。この線の吻側にある椎骨間腔は、ほぼＬ５-Ｌ６である。手術中にＸ線透視で吻側−尾側および中外側軌跡を確認した。滅菌技術を使用して、１ｍｌシリンジに取り付けた２５ゲージ針を挿入した。ＣＳＦの透明な飛び出しが見えるまでニードルを進めながら、軽い陰圧を上記シリンジに加えた。大槽穿刺のために、気道の完全性を維持しながら子ブタの頭部を弯曲させた。Ｘ線透視で適切な軌跡を再び確認した。２５ゲージ針を後頭骨の直ぐ尾側に入れ、透明なＣＳＦが飛び出てくることから、大槽に入ったのを確認した。

ベクターもしくはコントロールの送達のために、上記針を適所に保持すると同時に上記シリンジを外した。ウイルス溶液（５．２×１０^１２ ｖｇ／ｋｇ）もしくはＰＢＳのいずれかを含む第２の１ｃｃシリンジを固定し、上記溶液を、ゆっくりと一定の速度で髄腔内空間へと注入した。送達後、約０．２５ｍｌの滅菌ＰＢＳを、試薬の完全な送達を確実にするように、脊椎の針を通して一気に流し込んだ。イオヘキソール放射線不透過性薬剤［ＯｍｎｉｐａｑｕｅＴＭ（イオヘキソール、Ｎ，Ｎ’−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−５−［Ｎ（２，３−ジヒドロキシプロピル）−アセトアミド］−２，４，６−トリヨード（ｔｒｉｏｌｄｏ）−イソフタルアミド）， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｗａｕｋｅｓｈａ， ＷＩ］およびリアルタイム連続Ｘ線透視での髄腔内での拡散の記録。

灌流および組織処理。全ての被験体を注入後２１日〜２４日の間の屠殺した。被験体を、テラゾール、続いて、プロポフォールの筋肉内注射によって深麻酔した。胸骨正中開胸術（ｍｉｄｖｅｎｔｒａｌ ｓｔｅｒｎａｌ ｔｈｏｒａｃｏｔｏｍｙ）を行い、カニューレを左心室を通して大動脈に挿入した。右心房を開き、０．５〜１リットルのＰＢＳを、重力流によってカニューレを通して注入し、続いて、リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４）中の４％ パラホルムアルデヒド１リットルで灌流した。器官を取り出し、組織学切片形成のためにさらに処理する前に４％ パラホルムアルデヒド中で４８時間後固定するか、または０．１％ ＮａＮ_３ ＰＢＳ溶液中で長期間貯蔵した。

組織学および鏡検。脊髄セグメントを３％ アガロース中に包埋し、その後、Ｌｅｉｃａ ＶＴ１２００バイブレーティングミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ）を使用して４０μｍ水平切片へと切断した。切片を、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水中に移し、処理するまで４℃で貯蔵した。１０％、２０％、および３０％のスクロース溶液中で逐次的なインキュベーションをすることによって、脳を低温保護した。いったん十分に低温保護（３０％ スクロース溶液中に浸漬させる）した後、脳を凍結し、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ）中で改変Ｌｅｉｃａ ＳＭ ２０００Ｒスライディングミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に全体をマウントし、４０μｍ冠状面切片へと切断した。

形質導入した細胞タイプの免疫蛍光決定のために、浮遊切片を、ブロッキング溶液（１０％ ロバ血清、Ｔｒｉｓ緩衝化食塩水中１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）の中に１時間沈め、続いて一次抗体溶液中、４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体をこの研究で使用した：ウサギ抗ＧＦＰ（１：５００； Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヤギ抗ＣｈＡＴ（１：１００； Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）、モルモット抗ＧＦＡＰ（１：１，０００； Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｌｏｎｇ Ｂｅａｃｈ， ＣＡ）およびウサギ抗Ｉｂａ１（１：５００； Ｄａｋｏ， Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ， ＣＡ）。一次抗体を、Ｆｉｔｃ結合体化、Ｃｙ３結合体化、もしくはＣｙ５結合体化二次抗体（１：１，０００； Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）を使用して検出し、ＰＶＡ−ＤＡＢＣＯ媒体にマウントした。

免疫組織化学染色のために、切片を、０．５％ Ｈ_２Ｏ_２／１０％ ＭｅＯＨ溶液中で室温においてインキュベートし、その後、ブロッキングし、ウサギ抗ＧＦＰで一晩上記のように染色した。抗ＧＦＰ抗体を、ビオチン化ロバ抗ウサギ二次抗体（１：２００； Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検出し、提供されたプロトコルに従って、Ｖｅｃｔｏｒ ＮｏｖａＲｅｄを使用して発色させた（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）。次いで、切片をＣｙｔｏｓｅａｌ ６０媒体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｋａｌａｍａｚｏｏ， ＭＩ）にマウントした。

非神経組織を、約１ｃｍの３ブロックに切断し、３０％ スクロース溶液中で一晩インキュベートすることによって低温保護した。次いで、それらをトラガカントガムの中に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結した。サンプルを、１０〜１２μｍ切片へとクリオスタットで切断し、スライドを−２０℃で貯蔵した。ＧＦＰ発現を、上記と類似の免疫蛍光プロトコルによって二次抗体溶液（１：１，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にＤＡＰＩを添加して検出した。

蛍光画像を、ＴＲＩＮＣＨに配置したＺｅｉｓｓ ７１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ， Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ， ＮＹ）を使用して捕捉し、ＬＳＭソフトウェアで処理した。

全脳切片を、Ａｐｅｒｉｏ自動化スライドスキャナー（Ａｐｅｒｉｏ， Ｖｉｓｔａ， ＣＡ）を使用して、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの研究所にあるＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｒｅの中のＢｉｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒで×４０解像度までスキャンし、得られた画像をＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアで処理した。

全ての動物において、ＧＦＰ発現は、後根神経節、ならびに脊髄の灰白質および白質において認められた。重要なことには、頭蓋基部の槽空間もしくはＬ５の髄腔内空間のいずれかへのＡＡＶ９ ＧＦＰ注入は、インサイチュハイブリダイゼーションによって試験される場合、広範囲な運動ニューロン形質導入および脊髄の全てのレベルでグリアを生じた。大きな前角ニューロンはまた、脊髄の全てのレベルでの免疫組織化学によればＧＦＰ発現陽性であった。免疫蛍光によって、ＧＦＰ＋細胞が運動ニューロンマーカーＣｈＡＴを発現することが確認された。

最後に、５歳のブタへのＡＡＶ９−ＧＦＰの槽内注入もしくは髄腔内注入後の発現のパターンをさらに特徴付けるために、脳を、ＧＦＰ免疫蛍光を使用して、再び導入遺伝子発現について調べた。最高レベルのＧＦＰ発現を有する領域は、小脳プルキンエ細胞、髄質内の神経線維、ならびにオリーブ核のような不連続核であった。脳の残りの中での発現は、髄膜表面近くの散在した細胞に制限された。末梢器官におけるＧＦＰ発現の試験から、目に見えるＧＦＰ発現を生じなかった。このことは、ウイルスの大部分がＣＮＳに局在したことを示す。

従って、若いブタの脳脊髄液へのＡＡＶ９注入は、運動ニューロンを効率的に標的とした。

実施例３
ＳＭＮ変異体マウスの脳脊髄液（ＣＳＦ）へのｒＡＡＶ９ ＳＭＮ［Ｆｏｕｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（３）： ２７１−２７４ （２０１０）および本明細書中上記の説明を参照のこと。ここでベクターゲノム挿入物の配列は、配列番号１のヌクレオチド９８０〜３３３６として示される）］および造影剤のインビボ送達の効果を試験した。

簡潔には、上記ｒＡＡＶ９ ＳＭＮを造影剤と混合し、続いて、ＩＣＶ注入して、上記組成物をＳＭＮ変異体マウスのＣＳＦへと配置した。コントロール実験として、上記ｒＡＡＶ９ ＳＭＮベクターを、造影剤なしで別の群のＳＭＮ変異体マウスへと注入した。

結果から、約１０^８ ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ９ ＳＭＮと造影剤との注入が、２０日というＳＭＮ変異体マウスのメジアン生存を生じる一方で、造影剤の非存在下での等量のｒＡＡＶ９ ＳＭＮの注入は生存を生じないことを示した。

約１０^９ ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ９ ＳＭＮと造影剤との注入は、７０日を超えるＳＭＮ変異体マウスのメジアン生存を生じた。対して、造影剤の非存在下で等量のｒＡＡＶ９ ＳＭＮを注入したＳＭＮ変異体マウスの生存は認められなかった。

最後に、約１０^１０ ｖｇ／ｋｇのｒＡＡＶ９ ＳＭＮと造影剤との注入は、１００日を超えるＳＭＮ変異体マウスのメジアン生存を生じた。対して、造影剤の非存在下で等量のｒＡＡＶ９ ＳＭＮを注入したＳＭＮ変異体マウスでは、７０日のメジアン生存を生じた。

従って、造影剤の非存在下でのｒＡＡＶ９ ＳＭＮの注射後のＳＭＮ変異体マウスの生存と比較して、ＳＭＮ変異体マウスの生存は、ｒＡＡＶ９ ＳＭＮと造影剤との注射後に増大する。

実施例４
３匹の１歳のカニクイザルに、１×１０^１３ ｖｇ／ＫｇのｓｈＲＮＡおよびＧＦＰをコードするｒＡＡＶ９の髄腔内注入を受けさせた。上記注入を、腰椎髄腔（ｌｕｍｂａｒ ｔｈｅｃａｌ ｓａｃ）のくも膜下腔への腰椎穿刺によって行った。上記ｒＡＡＶ９を、オムニパーク（イオヘキソール）（臨床状況で慣用的に使用されるヨウ素化化合物）とともに再懸濁した。イオヘキソールを、くも膜下腔カニューレ挿入が成功したことを確認するために使用し、用量１００ｍｇ／Ｋｇを投与した。被験体を側臥位に配置し、ほぼＬ４／５レベルの後正中線注入部位（脊髄円錐の下）を確認した。滅菌条件下で、スタイレット付きの脊髄穿刺針（ｓｐｉｎａｌ ｎｅｅｄｌｅ）を挿入し、くも膜下カニューレ挿入を針から透明なＣＳＦが流れ出てくることで確認した。くも膜下腔での圧力を減らすために、０．８ｍｌのＣＳＦを排出し、直後に２．１ｍＬのウイルスと混合した０．７ｍＬ イオヘキソール（３００ｍｇ／ｍｌ 処方物）を含む混合物（合計２．８ｍｌ）を注入した。上記ウイルスの吻側流動分布が頸部領域の細胞形質導入を改善し得るか否かを調査するために、ある被験体を側臥位で回復させ、第２の被験体および第３の被験体を、トレンデレンブルグ体位（頭を低くした姿勢）にて傾けた。これは、ヒト被験体でＣＴミエログラムを行う場合の慣用的手順である。

ウイルスを注入したカニクイザルを、注射後２週間で安楽死させた。動物に、８０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量において静脈内でペントバルビタールナトリウムで麻酔し、生理食塩水で灌流した。脳および脊髄の解剖を直ぐに行い、組織を、核酸単離のために処理するか（急速凍結）、または４％ パラホルムアルデヒド中で後固定し、その後、３０％ スクロースで低温保護し、イソペンタン中で−６５℃で凍結した。上記ウイルスによって形質導入された細胞を同定するために緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いた、そして運動ニューロンを同定するためにコリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｔ）を用いた遊離浮遊免疫染色のためにクリオスタットを使用して１２μｍ冠状面切片を腰髄から集めた。二重陽性細胞を、頚髄、胸髄（ｔｈｏｒａｃｉｃ ｃｏｒｄ）および腰髄の１０個の切片で計数し、それらの数を、同じセグメントの中のＣｈａｔ陽性細胞の総数に対して正規化した。

細胞計数から、ウイルス注入後に被験体を傾けると、胸椎レベルおよび頚椎レベルでの運動ニューロン形質導入の２倍（１００％）の改善を生じることが明らかにされた。

本発明は、種々の実施形態および実施例に関して記載されてきたが、変形および改善他当業者に想起されることは理解される。従って、特許請求の範囲において現れるような限定のみが、本発明に対して定められるべきである。

本明細書で言及される全ての文書は、それらの全体において参考として援用される。

Claims (30)

1. （ａ）治療用ポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）ゲノムと、（ｂ）非イオン性の低浸透性造影剤と、を含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、神経セロイドリポフスチノーシス（ＣＬＮ）疾患を処置するためのものであり、前記ＣＬＮ疾患は、ＣＬＮ１疾患、ＣＬＮ２疾患、ＣＬＮ３疾患、ＣＬＮ４疾患、ＣＬＮ５疾患、ＣＬＮ６疾患およびＣＬＮ８疾患からなる群より選択され、前記造影剤は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシランおよびこれらの組み合わせからなる群より選択され、前記組成物は、患者の脳または脊髄に送達される、組成物。
2. 前記非イオン性の低浸透性造影剤がイオヘキソールである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが一本鎖ゲノムである、請求項１または２のいずれか一項に記載の組成物。
4. 前記ｒＡＡＶ９ゲノムが自己相補性ゲノムである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ１疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ２疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ３疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ４疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ５疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ６疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ８疾患である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記組成物が、前記患者に髄腔内送達する前に前記ｒＡＡＶ９ゲノムと前記造影剤とを合わせることによって形成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記ｒＡＡＶ９ゲノムと前記造影剤とが逐次的に送達される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
14. （ａ）治療用ポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）ゲノムを含む組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）と、（ｂ）非イオン性の低浸透性造影剤と、を含む、必要とする患者において神経セロイドリポフスチノーシス（ＣＬＮ）疾患を処置するための組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、ＣＬＮ疾患を処置するためのものであり、前記組成物は、前記患者の脳または脊髄に送達されるものであることを特徴とし、前記ＣＬＮ疾患が、ＣＬＮ１疾患、ＣＬＮ２疾患、ＣＬＮ３疾患、ＣＬＮ４疾患、ＣＬＮ５疾患、ＣＬＮ６疾患またはＣＬＮ８疾患であり、前記造影剤は、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソール、イオキシランおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、組成物。
15. 前記組成物が、髄腔内注射、槽内注射または脳室内注射によって送達される、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記患者が、前記組成物の髄腔内注射後にトレンデレンブルグ体位に置かれる、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記非イオン性の低浸透性造影剤がイオヘキソールである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記ＣＬＮ疾患がＣＬＮ１疾患である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
19. 前記ＣＬＮ疾患がＣＬＮ２疾患である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記ＣＬＮ疾患がＣＬＮ３疾患である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
21. 前記ＣＬＮ疾患がＣＬＮ４疾患である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
22. 前記ＣＬＮ疾患がＣＬＮ５疾患である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
23. 前記ＣＬＮ疾患がＣＬＮ６疾患である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記ＣＬＮ疾患がＣＬＮ８疾患である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
25. 前記脳または脊髄への送達が、脳幹への送達を含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記脳または脊髄への送達が、運動皮質への送達を含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
27. 前記脳または脊髄への送達が、神経細胞、グリア細胞または両方への送達を含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
28. 前記脳または脊髄への送達が、ニューロン、下位運動ニューロン、小グリア細胞、希突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞またはこれらの組み合わせへの送達を含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
29. 前記組成物が、前記患者に髄腔内送達する前に前記ｒＡＡＶ９と前記造影剤とを合わせることによって形成される、請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
30. 前記ｒＡＡＶ９ゲノムと前記造影剤とが逐次的に送達される、請求項１４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。