ES2341555T3 - Terapia con profarmaco enzimatico para la reparacion de una articulacion. - Google Patents

Abstract

Uso de un producto que comprende una combinación de: a)al menos un vector, que comprende un polinucleótido aislado que codifica una enzima capaz de convertir un profármaco en un compuesto activo citotóxico, expresión de la enzima que es controlada por un promotor ligado operacionalmente; y; b) un profármaco susceptible de ser convertido en un compuesto citotóxico activo por dicha enzima para la fabricación de un medicamento combinado para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos.

Description

Terapia con profármaco enzimático para la reparación de una articulación prostética.

Campo de la invención

La invención se refiere al uso de la terapia genética en el tratamiento del aflojamiento aséptico de las prótesis ortopédicas. Particularmente, describe métodos para recolocar tales prótesis sin cirugía de revisión abierta.

Antecedentes de la invención

Aproximadamente 1 millón de operaciones de reemplazo total de cadera (artroplastia total de cadera) se realizan al año en todo el mundo, realizándose solamente más de 120.000 de éstas en los E.E.U.U., y cerca de 35.000 en Inglaterra (Datos del Consenso NIH, 1994 de NIH; Revista NHS de 1996). Esto es probable que aumente a aproximadamente 3 millones anuales en todo el mundo en la década próxima. Los reemplazos de la cadera se realizan muy a menudo en pacientes mayores y, entre este grupo, el aflojamiento de uno de los componentes de la prótesis o de ambos, que da como resultado una restricción severa de la movilidad, ocurre en el plazo de 15 años en alrededor de un tercio de los pacientes. En los casos en los que ocurre un aflojamiento prostético, los pacientes experimentan un dolor y una dificultad para caminar creciente y tienen un riesgo más alto de dislocaciones y de fracturas patológicas. Al cabo de unos 10 años, aproximadamente el 10% de todos los pacientes requieren una cirugía de revisión, que tiene una alta tasa de complicaciones y de fallos (Hellman y otros, 1999).

La causa más común de fallo del implante es el aflojamiento aséptico como resultado de la osteolisis de inducida por partículas (tratada por Gallo y otros, en Biomed Papers 148(2) 21-28 (2002)). Partículas de desgaste, tales como partículas de polietileno, Metacrilato de Polimetilo, restos de titanio, cobalto, cromo o cerámica, dependiendo del tipo de prótesis, estimulan una respuesta inflamatoria llamada osteolisis periprostética (Goldring y otros, 1986). La fagocitosis de las partículas de desgaste por macrófagos las activa, llevando a la secreción de las citoquinas inflamatorias IL-1, TNF-\alpha, e IL-6 (tratadas por Schwarz y otros en Arthritis Research 2002 2:165-178). La respuesta inflamatoria crónica resultante produce eventualmente una pseudomembrana de tejido interfacial granulomatoso, que incluye macrófagos activados, fibroblastos, células gigantes y osteoclastos, similares al pannus característico de las articulaciones artríticas. El resultado final de este complejo inflamatorio y de la respuesta proliferativa del cuerpo extraño es la resorción del hueso por medio del osteoclasto, la cual conduce al aflojamiento de uno o ambos componentes del implante prostético. Las prótesis para la artroplastia total de cadera consisten en dos componentes. Una base artificial, o componente acetabular, se establece en la cavidad preparada en el acetábulo de la pelvis. Éste se articula con un componente femoral que comprende una bola unida a un proceso, que se introduce en una cavidad preparada en la médula
del fémur. Existen muchas variaciones de ambos componentes, y pueden ser retenidas con cementos o sin ellos.

El aflojamiento aséptico lleva eventualmente a un grado inaceptable de dolor, inmovilidad o dificultades para caminar e inestabilidad, con un riesgo más alto de dislocaciones y de fracturas patológicas. En algunos pacientes se puede realizar una cirugía de revisión para quitar el tejido inflamatorio y sustituir la prótesis. Sin embargo, la cirugía de revisión es muy costosa y tiene una alta tasa de morbilidad y de mortalidad, especialmente en pacientes mayores (que son la mayoría). En pacientes con insuficiencia cardiaca, la cirugía de revisión tiene a menudo complicaciones importantes, tales como fallos del miocardio o trastornos de la arteria coronaria (Strehle y otros, 2000). Muchos pacientes no son aptos para la cirugía de revisión porque se considera que el riesgo de mortalidad es demasiado alto. No hay tratamiento alternativo para este tipo de pacientes, que entonces quedan relegados a la silla de ruedas. La necesidad clínica de una alternativa menos traumática a la cirugía de revisión para el tratamiento de las prótesis aflojadas están por tanto claras. Actualmente las aproximaciones experimentales a este problema son preventivas antes bien que terapéuticas. Una tal aproximación preventiva para controlar el aflojamiento aséptico implica el uso de compuestos de bisfosfonatos, especialmente el alendronato, bien como medicación sistémica o como un componente de un cemento utilizado para fijar tales prótesis (Patentes US 5.972.913, WO 96/39107, Shanbhag y otros, 1997, Leung y otros, 1999). Sin embargo, aunque se conoce que los bisfosfonatos producen un aumento en la densidad esquelética del hueso, no se ha demostrado que tengan un efecto significativo en el tratamiento de la artritis reumatoide, que comparte muchas características patológicas similares con la osteolisis periprostética, ni en la propia osteolisis periprostética (Ralston y otros, 1989; Eggelmeijer y otros, 1996; Ulrich-Vinther, 2002). Queda por tanto por ver si los bisfosfonatos tienen un papel útil a jugar en la prevención del aflojamiento aséptico.

En un intento por prevenir directamente la resorción periprostética del hueso debida a los osteoclastos, se ha descrito una aproximación preventiva alternativa implica la terapia genética (tratada por Wooley y Schwarz, 2004), usando una proteína inhibitoria de los osteoclastos, la osteoprotegerina, proporcionada por medio del vector de virus adenoasociado (UIrich-Vinther, 2002). La osteoprotegerina es un inhibidor competitivo de un factor de diferenciación de los osteoclastos, activador del receptor del factor nuclear de ligando kB (RANKL), que se une a un receptor expresado en la superficie de células de precursor de osteoclastos derivadas de macrófagos, conocidas como activador de receptor del factor nuclear kB (RANK). El RANKL es segregado por los osteoblastos, las células del estroma y las células T activadas en una etapa temprana de la respuesta inflamatoria iniciada por la fagocitosis por macrófagos de las partículas de desgaste (Teitelbaum, 2000). La unión de RANKL A RANK lleva a la activación de las células precursoras de osteoclastos, a la diferenciación, y al estímulo de la resorción del hueso. La unión de RANK por la osteoprotegerina falla en la activación de las células precursoras de osteoclastos con el resultado de que la osteoprotegerina inhibe competitivamente el RANKL.

Ulrich-Vinther y otros usaron un vector de virus adenoasociado (rAAV) recombinante para expresar la osteoprotegerina e inhibir la resorción inducida por partículas de titanio en un modelo de resorción calvárica en ratón. Se implantaron partículas de titanio en la bóveda calvárica (huesos de la bóveda del cráneo) y el vector administrado por inyección intramuscular en el cuádriceps. El efecto inhibitorio de la osteoprotegerina fue por tanto sistémico, con perceptibles aumentos en los niveles de suero, y esto parecía ser acertado en la inhibición de la osteoclastogénesis experimental inducida por titanio y de la resorción del hueso vista en los controles no tratados. Aunque sea interesante, queda por ver si este modelo formará la base de un preventivo viable para la osteolisis periprostética clínica. Incluso si es eficaz, no está claro que efectos sistémicos puede tener a largo plazo las elevaciones prolongadas en los niveles del osteoprotegerina del suero. Por ejemplo, tal estrategia necesitaría demostrar una carencia de efectos deletéreos sobre la función normal de los osteoclastos en el remodelado del hueso.

Sigue siendo una necesidad contar con tratamientos eficaces para la condición común y debilitante de la osteolisis periprostética y del aflojamiento aséptico resultante.

Una aproximación para matar preferentemente las células patológicas, utilizada más ampliamente para tratar el cáncer, es introducir un gen en las células objetivo que codifique una enzima capaz de convertir un profármaco de relativamente baja toxicidad en una droga citotóxica potente. La administración sistémica del profármaco se tolera entonces puesto que se convierte solamente en el derivado tóxico localmente, por ejemplo dentro de un tumor, por las células que expresan la enzima profármaco-que convierte. Esta aproximación se conoce como terapia de profármaco de enzima genedirigida (GDEPT), o cuando el gen se proporciona por medio de un vector viral recombinante, terapia de profármaco virusdirigido (VDEPT) (McNeish y otros, 1997, también tratada por Xu y otros Clin Cancer Res tomo 7 3314-3324 de (2001)).

Un ejemplo de un sistema de enzima/profármaco es la nitroreductasa y el profármaco aziridinilo CB 1954 (5 (aziridina-1-ilo)-2,4-dinitrobenzamida) (Knox y otros 1988). Después de la observación de que la variedad de células de carcinoma de la rata Walker era particularmente sensible al CB 1954, se demostró que esto era debido a la expresión de la nitroreductasa DT diaforasa de la rata. Sin embargo, puesto que el CB 1954 es un sustrato pobre para la forma humana de esta enzima, las células tumorales humanas son mucho menos sensibles al CB 1954. Se concibió el GDEPT como una manera de introducir una nitroreductasa adecuada, preferiblemente con mayor actividad frente al CB 1954, para sensibilizar las células objetivo. La nitroreductasa de Escherichia Coli (EC 1.6.99.7, alternativamente conocida como la nitroreductasa insensible al oxígeno NAD(P)H o reductasa de dihidropteridina, y abreviado a menudo como NTR) codificada por el gen NFSB (conocida alternativamente como NFNB, NFSI, o DPRA) ha sido ampliamente utilizada para este propósito (tratado por Grove y otros, 1999). La nitroreductasa codificada NFSB (NTR) es un homodímero que une dos moléculas mononucleótidas de cofactor de flavina (FMN). Usando la NADH o NADPH como donante de electrones, y la FMN ligada como reducido intermedio, la NTR reduce uno o otro de los dos nitrogrupos de CB 1954 para dar bien el derivado de la hidroxilamina altamente tóxico 4 o la relativamente no tóxica hidroxilamina 2. Dentro de las células, la 5(aziridina-1-ilo)-4-hidroxilamina-2-nitrobenzamida, probablemente vía un metabolito tóxico adicional, llega a ser muy genotóxica (Knox y otros, 1991). La naturaleza exacta de la lesión causada es confusa, pero es improbable que esté causada por otros agentes. Particularmente tiene lugar una alta tasa de enlaces transversales de interlineamiento y las lesiones parecen estar mal reparadas, con el resultado de que el CB 1954 es un agente antitumoral excepcionalmente efectivo (Friedlos y otros, 1992).

El objeto de la GDEPT es obtener la conversión eficiente de un profármaco tal como el CB 1954 en células objetivo a fin de matar no sólo las células de expresión de NTR, sino también las células tumorales presente en la persona que no pudieron ser transfectadas o transducidas con éxito.

Otro sistema de profármaco de enzimas usado de esta manera es el del citocromo P450 como enzima para convertir un profármaco y el acetaminofeno como el profármaco, según lo descrito en la solicitud internacional WO 00/40271. Cierto número de enzimas de citocromo P450, naturalmente expresadas en el hígado (por ejemplo CYP1A2, CYP2E1 y CYP3A4) son capaces de convertir el acetaminofeno en un metabolito altamente citotóxico, la N-acetil-benzoquinona-imina (NABQI). Se ha propuesto este sistema para una variedad de usos clínicos, especialmente en el campo de la terapia del cáncer. Las enzimas de citocromo P450 son también capaces de activar varios profármacos citotóxicos convencionales, por ejemplo la ciclofosfamida y la ifosfamide (Chen y Waxman, 2002).

Se utiliza ampliamente cierto número de otros sistemas de profármacos con enzima, incluyendo la timidina cinasa HSV y el genciclovir (Moolten, 1986), la desaminasa de la citosina y la 5-fluorocitosina (Mullen y otros, 1992).

Goossens y otros (1999) describen una aproximación de terapia por genes virales para infectar y matar células sinoviales aisladas cultivadas in vitro, y matar el tejido del pannus en un modelo de artritis inducido por colágeno en un mono en el cual son inducidas juntas inflamadas por inyecciones del colágeno. Las articulaciones inflamadas en tales animales contienen un tejido hiperplástico que resulta de inflamación crónica llamado pannus.

Resumen de la invención

Tal como se utiliza aquí:

"Selectivo en Tipo de Células" significa: que facilita la expresión preferentemente en una gama limitada de tejidos. Preferiblemente, tal expresión se limita sustancialmente a un solo tipo de tejido o de célula.

Un "promotor ligado operativamente" es uno sustancialmente en una relación-cis adyacente, donde dicho promotor dirige la expresión del elemento ligado operativamente.

"Periprostética" se refiere al espacio que rodea cualquier pieza de una prótesis implantada.

"Osteolisis Periprostética" es sinónimo de "aflojamiento aséptico" y se refiere a cualquier aflojamiento progresivo de una prótesis implantada no asociada con la infección franca o trauma.

"Tejido interfacial" es sinónimo de "membrana osteolítica" y significa el tejido inflamatorio del espacio periprostético alrededor de una prótesis implantada, implicado en la osteolisis periprostética.

"Próstesis" o "Implante ortopédico" según se utiliza aquí significa cualquier material o dispositivo implantado quirúrgico en una estructura ósea de un animal o humano.

Un objeto de la invención es proporcionar una alternativa no quirúrgica a la cirugía de revisión para el tratamiento de prótesis aflojadas que destruyen el tejido interfacial (y las células que en él están implicadas en los procesos inflamatorios y en la resorción del hueso) y permita que se cementar el implante de nuevo.

La invención busca alcanzar esto usando una estrategia de terapia de profármaco con enzima usando un vector de terapia genética para proporcionar un profármaco enzima que convierta a las células en tejido interfacial, sensibilizándolas así a un profármaco particular. La administración del profármaco lleva a su conversión en una droga citotóxica activa en las células objetivo, matando el tejido interfacial. El desprendimiento de la droga citotóxica activa de las células de interfaz objeto de lisis pueden también matar las células de interfaz vecinas o inflamatorias "matar las que están ``en espera"), lo cual es ventajoso porque las células que han escapado el suministro directo vectorial (por transducción, vectores forvirales, o transfección para vectores no-virales) también son eliminadas.

En una estrategia, se inyecta un vector viral que porte ácido nucleico que codifica la enzima en el espacio intra-articular, y posteriormente el profármaco es administrado a través de un pequeño orificio practicado, que se puede también utilizar para inyectar el cemento a fin de recolocar la prótesis in situ. Alternativamente, se puede administrar el profármaco por inyección intra-articular. La artrografía ha mostrado que el tejido interfacial forma un compartimiento cerrado continuo alrededor de la prótesis aflojada, lo cual permite una alta concentración local tanto de vector como de profármaco que se alcanzará con muy poco riesgo de escape sistémico. El concepto ofrece así unas circunstancias más favorables en términos de eficiencia y seguridad que la inyección intratumoral en enfermos de cáncer, un procedimiento con el cual hay considerable experiencia clínica. En el caso al menos de los vectores adenovirales, puede ser preferible quitar el líquido existente en el espacio intra-articular/periprostética antes de introducir los vectores, para reducir la posibilidad de neutralizar los anticuerpos en el fluido que hace inactivo el vector y que impide niveles satisfactorios de transducción.

Preferiblemente, después de la introducción del profármaco y la consiguiente matanza de las células de tejido interfacial, se retira dicho tejido. Esto se puede ayudar por la introducción simultánea, o subsiguiente a la introducción del profármaco, de una o más enzimas capaces de digerir los componentes extracelulares del tejido interfacial, tales como colagenasa, elastasa o hialuronidasa, metaloproteasas o catepsinas de la matriz. Otros compuestos útiles con este fin incluyen los agentes quelantes EDTA (Etilenodiamina-n, N, N', N'-ácido tetra-acético) y EGTA (Etilen-glicol-bis-(2-aminoetill)-N, N, N', N'-ácido tetra-acético). un tratamiento de este tipo digiere y afloja el tejido interfacial, de tal modo que puede ser expulsado por chorro hacia fuera a través de un orificio practicado adecuado o vía una aguja de orificio ancho introducida en el espacio intra-articular.

El implante completamente aflojado y desembridado se vuelve a cementar a continuación, para reunir sólidamente todos los componentes aflojados y restaurar una articulación prostética completamente funcional.

Alternativamente, especialmente con los profármacos tales como el acetaminofeno con toxicidad sistémica muy baja, se puede inyectar localmente el vector de codificación del profármaco que convierte la enzima (tal como el citocromo P450), para que solamente se puedan transducir células dentro del tejido interfacial/del compartimiento común, mientras que el profármaco se administra posteriormente de manera sistémica.

En un aspecto de la invención, la aproximación es matar las células residentes en el tejido interfacial, con independencia de su tipo. En la práctica, las células predominantes son fibroblastos responsables de producir las proteínas de matriz extracelular que forman gran parte del tejido, y células de la línea monocito/macrófago responsables de los efectos inflamatorios. En este caso, la expresión de la enzima codificada por el vector es controlada por un promotor específico fuerte de tipo no-célula, proporcionando la expresión de alto nivel en una variedad de tipos de células y tejidos, tales como el citomegalovirus promotor temprano/inmediato y el efecto citotóxico se limita a las células del tejido interfacial por las limitaciones físicas del espacio en el cual se inyectan el vector y/o el profármaco. Las células normales de mayor preocupación desde el punto de vista de la seguridad son los osteoblastos responsables de la regeneración del hueso. En la mayoría de los casos, y con la mayoría de los vectores de suministro de gene, estas células son inaccesibles al vector inyectado en el espacio periprostética, y por lo tanto no son transducidas o transfectadas, no expresan el profármaco que convierte la enzima incluso con un promotor de tipo no celular específico, y por lo tanto no se matan con la posterior administración del profármaco.

Ejemplos de tales promotores no-celulares específicos incluya: promotor inmediato/temprano de citomegalovirus, Repetición terminal larga de virus de sarcoma de Rous (RSV LTR), virus endémico de la leucemia LTR, promotores tempranos o tardíos del virus 40 (SV40) de la leucemia del simio, promotor de cinasa (tk) timidina del virus simplex de herpes (HSV), promotores de actinia o ubiquitina.

En algunas circunstancias puede ser ventajoso lograr una matanza más selectiva de células, en este caso la enzima codificada por el vector se puede expresar bajo el control de un promotor selectivo de tipo tejido o célula. El uso 45 de tal promotor permite la matanza selectiva de células de linajes particulares, tales como los fibroblastos, las células de linaje macrófago/monocito o, más específicamente, las células de un fenotipo particular, tales como las células precursoras de osteoclastos, u osteoclastos completamente diferenciados.

Los ejemplos de promotores adecuados para expresar un gen de manera preferente, tal como un gene de codificación de un profármaco que convierte una enzima, en células de linaje monocito/macrófago incluyen, los c-fes y el CD68. Los promotores caracterizados por contener uno o más puntos de enlace para el factor de transcripción PU.1 son generalmente adecuadas (Greaves y Gordon, 2002).

Los promotores adecuados para expresar preferentemente un gen en osteoclastos o precursores de osteoclastos incluyen el promotor ácido tartrato-resistente de la fosfatasa (TRAP), el promotor RANK y el promotor de la catepsina K. Los Promotores caracterizados por contener uno o más puntos de enlace (cajas-E, contienen las secuencias de enlace de consenso 5-CA (T/G)(GTG) para familia de factores de transcripción de microftalmia (MITF, TFE3, TFEB y TFEC), que contienen también opcionalmente los puntos de enlace para la transcripción del factor PU.1 son generalmente adecuados (Motyckova y otros, 2001; Mansky y otros, 2002, Greaves y Gordon, 2002).

Mediante el uso de tales promotores específicos, la expresión de la enzima puede ser restringida a las células blanco particulares, tales como las responsables de colocar proteínas extracelulares de matriz tales como el colágeno (fibroblastos), las responsables de secretar citokinas inflamatorias (por ejemplo macrófagos) o las responsables directamente de la resorción de huesos (osteoclastos), mientras que protegen los otros tipos de células (por ejemplo los osteoblastos, responsables de depositar nuevo hueso).

Las diversas combinaciones posibles de administración local del vector y/o del profármaco con o sin expresión selectiva de tejido permite el tratamiento no quirúrgico de las prótesis aflojadas y la recementación del implante, superando las limitaciones de los métodos de la técnica anterior que tenían como objetivo la prevención del aflojamiento periprostético por la administración sistémica de compuestos tales como bisfosfonatos, o de expresión sistémica de moléculas altamente bioactivas tales como la osteoprotegerina.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona el uso de un producto que comprende una combinación de: al menos un vector, que comprende un polinucleótido aislado que codifica una enzima capaz de convertir un profármaco en un compuesto citotóxico activo, siendo controlada la expresión de la enzima por un promotor ligado operacionalmente; y un profármaco susceptible de ser convertido en un compuesto citotóxico activo por dicha enzima. Los ejemplos preferidos de promotores incluyen los promotores de dichos genes tales como c-fes y CD68. Los promotores caracterizados por contener uno o más puntos de enlace para el factor de transcripción PU.1 son generalmente adecuados.

Alternativamente, la expresión se restringe a los fibroblastos.

Más preferiblemente, la expresión se restringe a los osteoclastos o a los precursores de osteoclastos. Entre los promotores adecuados que proporcionan una expresión de este tipo están los naturalmente ligados de manera funcional a los genes tales como la fosfatasa ácida resistente a los tartratos (TRAP), el activador del receptor del factor nuclear kB (RANK) y la catepsina K.

Los promotores caracterizados por contener uno o más puntos de enlace (cajas-E, que contienen las secuencias de ligazón de consenso 5'-CA (T/G)GTG) para la familia de factores de transcripción de la microftalmia (MITF, TFE3, TFEB y TFEC), que contienen opcionalmente también los puntos de enlace para el factor PU.1 de transcripción son generalmente adecuados.

Preferiblemente, la enzima codificada es una nitroreductasa, preferiblemente una nitroreductasa adecuada para la activación del profármaco CB 1954(5-(aziridina-1-yl)-2,4-dinitrobenzamida). Alternativamente, es un citocromo P450. Otros sistemas adecuados de enzima/profármaco incluyen la timidina cinasa HSV y el ganciclovir (Moolten, 1986), la citosina desaminasa y la fluorocitosina 5 (Mullen y otros, 1992).

En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratar el aflojamiento aséptico de los implantes ortopédicos que comprende administrar a un paciente un vector de codificación de una enzima capaz de convertir un profármaco en un compuesto citotóxico activo, el cual permite la expresión de dicha enzima en células objetivo, y la administración de un profármaco adecuado.

El vector puede ser cualquier vector capaz de transferir el ADN a una célula. Preferiblemente, el vector es un vector de integración o un vector episomal.

Los vectores de integración preferidos incluyen vectores retrovirales recombinantes. Un vector retroviral recombinante incluirá el ADN al menos de una porción de un genoma retroviral cuya porción sea capaz de infectar las células objetivo. El término "infección" se utiliza para significar el proceso por el cual un virus transfiere material genético a su huésped o a su célula objetivo. Preferiblemente, el retrovirus usado en la construcción de un vector de la invención se hace también defectuoso en la réplica para quitar el efecto de la réplica viral sobre las células objetivo. En tales casos, el genoma defectuoso de réplica viral se puede empaquetar por un virus auxiliar de acuerdo con técnicas convencionales. Generalmente, cualquier retrovirus que cumpla los criterios anteriores de contagiosidad y capacidad de transferencia funcional del gen se puede emplear en la práctica de la invención. Son especialmente preferidos los vectores lentivirales.

Los vectores retrovirales adecuadas incluyen pero sin estar limitados a ellos, el pLJ, pZip, pWe y PEM, bien conocidos por los expertos en la técnica. Las líneas de virus adecuadas para el empaquetado de retrovirus defectuosos de réplica incluyen, por ejemplo, \PsiCrip, \PsiCre, \Psi2 y \PsiAm.

Otros vectores útiles en la presente invención incluyen el adenovirus, los virus adeno-asociados, el virus SV40, el virus vacunal, los vectores de HSV y de poxvirus. Un vector episomal preferido es el adenovirus. Los vectores de adenovirus son bien conocidos para los expertos en la materia y han sido utilizados para proporcionar genes a los numerosos tipos de células, incluyendo el epitelio de vías aéreas, el músculo esquelético, el hígado, el cerebro y la piel (Hitt y otros, 1997; Anderson, 1998).

Otro vector preferido es el vector adenoasociado (AAV). Los vectores AAV son bien conocidos para los expertos en la técnica y se han utilizado para transducir de manera estable los linfocitos-T humanos, fibroblastos, pólipos nasales, músculo esquelético, cerebro, células madre eritroides y hematopoyéticas para usos de terapia genética (Philip y otros, 1994; Russell 50 y otros, 1994; Flotte y otros, 1993; Walsh y otros, 1994; Miller y otros, 1994; Emerson, 1996). La solicitud de patente internacional WO 91/18088 describe vectores específicos basados en AAV.

Otros vectores episomales preferidos incluyen los vectores episomales transitorios no-replicantes y los vectores episomales autoreplicantes con funciones derivadas de orígenes virales de réplica tales como los de EBV, el papovavirus humano (BK) y el BPV-1. Tales vectores de integración y episomales son bien conocidos para los expertos en la materia y se describen completamente en el cuerpo de literatura bien conocido para los expertos en la técnica. Particularmente, los vectores episomales adecuados se describen en el documento WO98/07876.

También se pueden utilizar como vectores en la presente invención cromosomas artificiales mamíferos. El uso de cromosomas artificiales mamíferos es tratado por Calos (1996).

En otra encarnación preferida, el vector de la presente la invención es un plásmido. El plásmido puede ser un plásmido no replicante, no integrante.

El término "plásmido" según se utiliza aquí se refiere a cualquier ácido nucléico que codifique un gene expresable e incluye los ácidos nucléicos lineales o circulares y ácidos nucléicos trenzados dobles o simples. El ácido nucléico puede ser ADN o ARN y puede comprender los nucleótidos o ribonucleótidos modificados, y puede ser modificado químicamente por medios tales como la metilación o la inclusión de grupos de protección o estructuras de cabeza o de cola.

Un plásmido no replicante, de no-integración es un ácido nucléico que cuando es transfectado a una célula huésped no la réplica y no se integra específicamente en el genoma de las células del huésped (es decir, no se integra con altas frecuencias y no se integra en sitios específicos).

Los plásmidos replicantes se pueden identificar usando ensayos normalizados que incluyen el análisis normalizado de réplica de Ustav y de Stenlund (1991).

La presente invención puede también emplear una célula huésped transfectada con el polinucleótido o el vector aislado que comprende el polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede ser cualquier célula eucariótica. Preferiblemente es una célula mamífera. Preferiblemente, es una célula humana y, más preferiblemente, es una célula autóloga derivada del paciente y transfectada o transducida bien in vivo o ex vivo.

Se conocen numerosas técnicas y son útiles según la invención para proporcionar los vectores aquí descritos a las células, incluyendo el uso agentes de condensación del ácido nucléico, la electroporación, la formación de complejos con amianto, polibreno, celulosa de DEAE, dextrano, liposomas, liposomas catiónicos, lipopoliaminas, poliornitina, bombardeo con partículas y microinyección directa (tratados por Kucherlapati y Skoultchi, 1984; Keown y otros, 1990; Weir, 1999; Nishikawa y Huang, 2001).

Se puede proporcionar a la célula huésped un vector de la invención no específicamente o específicamente (es decir, a un subconjunto señalado de células huésped) vía unos medios virales o no virales de suministro. Los métodos preferidos de suministro de origen viral incluyen líneas de células de empaquetado productoras de partículas virales como recipientes de la transfección para el vector de la presente invención en las cuales se han organizado señales de empaquetado viral, tales como las correspondientes a adenovirus, virus de herpes y papovavirus. Los medios y los métodos preferidos de suministro de genes de base no viral se pueden también utilizar en la invención e incluyen la inyección simple directa de ácido nucléico, péptidos y no péptidos de condensación de ácido nucléico, liposomas catiónicos y encapsulación en liposomas.

Se ha descrito el suministro directo del vector al tejido y se ha alcanzado alguna expresión genética, sobre todo a corto plazo. En la técnica anterior se describe claramente el suministro directo del vector al tiroides (Sikes y otros, 1994), melanoma (Vile y otros, 1993), piel (Hengge y otros, 1995), hígado (Hickman y otros, 1994) y después de la exposición del epitelio de vías aéreas (Meyer y otros, 1995). La inyección directa de ADN en el músculo ha mostrado dar una expresión a más largo plazo (Wolff y otros, 1990).

Se han utilizado diversos péptidos derivados de secuencias de aminoácido de proteínas de envoltura viral en la transferencia de genes cuando se administran conjuntamente con complejos de ADN de polilisina (Plank y otros, 1994; Trubetskoy y otros, 1992; WO 91/17773; WO 92/19287) y Mack y otros, (1994) lo cual sugiere que la co-condensación de conjugados de la polilisina con los lípidos catiónicos pueden llevar a la mejora en eficiencia de la transferencia genética. La Solicitud de Patente Internacional WO 95/02698 describe el uso de componentes virales para intentar aumentar la eficiencia de la transferencia genética de lípidos catiónicos.

Los agentes de condensación de ácido nucléico útiles en la invención incluyen la espermina, derivados de la espermina, histonas, péptidos catiónicos, no péptidos catiónicos por ejemplo polietilenoimina (PEL) y polilisina. Los "Derivados de la Espermina" se refieren a productos análogos y derivados de la espermina e incluyen los compuestos según lo dispuesto en la Patente Internacional Uso WO 93/18759 (publicada el 30 de septiembre de 1993).

Se han utilizado los enlaces de disulfuro para ligar componentes peptídicos de un vehículo de suministro (Cotten y otros, 1992); véase también Trubetskoy y otros (supra).

Se conocen en la técnica vehículos de suministro para proporcionar construcciones de ADN a las células e incluyen complejos policatiónicas de ADN que son específicos para un receptor de superficie de la célula, según lo descrito, por ejemplo, por Wu y Wu, 1988; Wilson y otros, 1992; y la Patente US No. 5.166.320.

El suministro de un vector según la invención se contempla usando los péptidos de condensación de ácido nucléico. Los péptidos de condensación del ácido nucléico, que son particularmente útiles para condensar el vector y proporcionar el vector a una célula, se describen en la solicitud de patente internacional WO 96/41606. Los grupos funcionales pueden estar ligados a los péptidos útiles para el suministro de un vector según la invención, según lo descrito en el documento WO 96/41606. Estos grupos funcionales pueden incluir un ligando que contemple como objetivo un tipo específico de célula, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, insulina, transferina, asialoglicoproteina, o un azúcar. El ligando puede apuntar así a células de manera no específica o de manera específica que se restringe con respecto al tipo de célula.

Los grupos funcionales también pueden comprender un lípido, tal como palmitoilo, oleilo, o estearoilo; un polímero hidrofílico neutro tal como polietilen-glicol (PEG), o polivinilpirrolidina (PVP); un péptido fusogénico, por ejemplo el péptido HA del virus de la gripe; o una recombinasa o una integrasa. El grupo funcional también puede comprender una proteína de tráfico intracelular tal como una secuencia nuclear de localización (NLS), una señal de escape endosómico por ejemplo un péptido rompedor de membrana, o una señal que dirige una proteína directamente al citoplasma.

El aflojamiento puede ser de componente acetabular o de componente femoral, o de ambas. La invención no se restringe a las prótesis de cadera, sino que puede ser aplicada a cualquier implante intraóseo donde puede ocurrir un aflojamiento aséptico. Por consiguiente, se considera específicamente su uso para las prótesis usadas en la artroplastia de la rodilla, del codo, del hombro, o de cualquier otra articulación del esqueleto.

Tal uso no necesita ser restringido al uso humano. El método es igualmente aplicable al aflojamiento de prótesis de articulaciones animales, particularmente de los caballos y de los perros.

Preferiblemente, la enzima de tal producto es una nitroreductasa, preferiblemente una nitroreductasa adecuada para la activación del CB 1954. Más preferiblemente, el profármaco es el CB 1954.

Alternativamente, la enzima es un citocromo P450 de un tipo aquí descrito. Más preferiblemente el profármaco es el acetaminofeno.

La expresión que controla el promotor la enzima de conversión del profármaco puede ser un tipo específico de promotor no celular. Preferiblemente, dicho promotor da niveles de expresión en una variedad de tipos de tejidos y de células. Más preferiblemente, se selecciona al menos de uno de los siguientes: el promotor inmediato/temprano de CMV, RSV LTR), virus endémico de la leucemia LTR, promotores tempranos o finales SV40, promotor HSV tk. En otra realización preferida, se trata del promotor inmediato/temprano del citomegalovirus humano. Alternativamente, se trata del promotor inmediato temprano del citomegalovirus del ratón.

En una realización alternativa, la expresión de la enzima es controlada por un promotor ligado operativamente, el cual proporciona sustancialmente la expresión específica de tipo de célula.

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Más preferiblemente, la expresión se restringe a las células de linaje de monocitos/macrófagos o los fibroblastos, en cuyo caso el promotor puede estar ligado naturalmente a un gen expresado selectivamente en células de uno de estos linajes, como se describe anteriormente.

Más preferiblemente la expresión se restringe a los osteoclastos o a los precursores de osteoclastos, como se describe anteriormente.

Preferiblemente, la enzima es una nitroreductasa, y más preferiblemente una nitroreductasa adecuada para activar el CB 1954. En este caso, se prefiere que el profármaco sea el CB 1954.

Alternativamente, la enzima puede ser un citocromo P450 según lo aquí descrito. En este caso se prefiere que el profármaco sea acetaminofeno. Alternativamente, puede ser un citotóxico convencional, especialmente ciclofosfamida o ifosfamida.

Como será apreciado por los expertos en la técnica, las dosificaciones se determinan por parámetros clínicos claramente entendidos. Sin embargo, se prefiere que la dosis el viral por articulación tratada esté entre 10^{5} y 10^{12} pfu, más preferiblemente entre 10^{6} y 10^{12} pfu, y todavía más preferiblemente entre 10^{7} y 10^{12} pfu e incluso más preferiblemente entre 10^{9} y 10^{12} pfu. Semejantemente, la dosis de profármaco depende de los parámetros clínicos. En el caso del CB 1954, se prefiere que la dosis esté entre 5 y 40 mg m-2, preferiblemente entre 5 y 30 mg m^{-2}, todavía preferiblemente entre 10 y 25 mg m^{-2}, más preferiblemente entre 15 y 25 mg m^{-2}, y más preferiblemente 24 mg m^{-2} dado por inyección intra-articular.

Se prefiere que los vectores virales no sean coadministrados con un medio de contraste que contenga yodo, puesto que tales medios pueden inhibir la transducción viral de las células objetivo. En los casos en los que la inyección deba ser dirigida con visualización artroscópica, se prefiere que se realice un artrograma en aire, o se utilice un medio de contraste que no inhiba la transducción viral.

Preferiblemente, el vector es administrado por inyección intra-articular o periprostética.

También se prefiere que el profármaco sea administrado por inyección intra-articular o periprostética. Alternativamente, se pueden administrar el profármaco sistémicamente, preferiblemente de manera parenteral. Al menos algunos profármacos, particularmente el acetaminofeno, se pueden administrar oralmente.

En una realización preferida, la expresión de la enzima de conversión del profármaco es controlada por un promotor que proporciona la expresión específica de tipo no celular. En este caso la expresión no se restringe a un tejido o tipo de célula particular. Según lo descrito aquí, se prefiere que tales promotores den niveles de expresión en una variedad tipos de célula. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor inmediato/temprano de citomegalovirus, el repetidor terminal largo del virus del sarcoma de Rous (RSV LTR), el virus endémico de la leucemia LTR, los promotores tempranos o tardíos del virus 40 (SV40) del simio, el promotor de cinasa timidina (tk) del virus de herpes simplex (HSV) 30.

En una realización preferida alternativa, la expresión del profármaco de conversión de enzima es controlada por un promotor que proporciona sustancialmente la expresión específica de tipo de célula. Preferiblemente, esto está restringido sustancialmente a las células del linaje del monocito/macrófago. Aquí se describen promotores adecuados. Alternativamente, se restringe a la expresión en fibroblastos. Más preferiblemente, se restringe sustancialmente a los osteoclastos o a los precursores de osteoclastos. Los promotores adecuados y preferidos incluyen TRAP, RANK, y promotores de la catepsina K.

Como se ha descrito aquí, las enzimas preferidas de conversión del profármaco incluyen las nitroreductasas, particularmente las adecuadadas para activar el CB 1954, y las enzimas del citocromo P450, particularmente las más adecuadas para activar el acetaminofeno a NABQI. Los profármacos preferidos por consiguiente incluyen el CB 1954 y el acetaminofeno. Sin embargo, en el caso de las enzimas de citocromo P450, los profármacos citotóxicos convencionales tales como la ciclofosfamida son también adecuados.

En un aspecto adicional se proporciona un kit para el tratamiento del aflojamiento aséptico de los implantes ortopédicos que comprende:

a)

Un polinucleótido aislado o un vector de codificación de enzima capaz de convertir un profármaco en un compuesto citotóxico activo, cuya enzima de expresión es controlada por un promotor ligado operativamente, en un tampón aceptable farmacéuticamente;

b)

Un profármaco capaz de ser convertido en un compuesto citotóxico activo por dicha enzima, en un tampón farmacéutico aceptable;

c)

Una disolución digestora de tejidos que comprende al menos una enzima seleccionada de la lista formada por colagenasa, elastasa, hialuronidasa, en un tampón aceptable farmacéuticamente; y/o un quelador tal como EDTA, EGTA etc.

d)

Un cemento adecuado para la recolocación de dicho implante ortopédico.

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Descripción detallada de la invención Descripción de las Figuras

La Figura 1 representa el aflojamiento aséptico de una prótesis de cadera. A es una radiografía de una prótesis aflojada in situ. B es un artrograma de una articulación de cadera con una prótesis aflojada. El medio de contraste se inyecta en el espacio de la articulación bajo guiado fluoroscópico. La Figura muestra que una parte del área alrededor de la prótesis (espacio periprostético) se llena de medio de contraste. Esto prueba que la prótesis está aflojada en esa área. C muestra una representación esquemática de una articulación de cadera con una prótesis aflojada. El área gris indica el espacio de la articulación, que es continuo con el espacio periprostético. Al inyectar un fluido en el espacio de la articulación, éste se esparcirá a través del área que está marcada en gris en la imagen.

La Figura 2 muestra el efecto de matanza de la infección con los vectores adenovirales de codificación de la nitroreductasa y la subsiguiente exposición al profármaco CB 1954 en las concentraciones mostradas en las células interfaciales del tejido tomado de dos pacientes de cirugía de revisión según lo descrito en el ejemplo 3. La Figura 2a muestra datos del pacientes L 1003 P3 y la Figura 2b muestra datos del paciente L 1002 P4.

La Figura 3 muestra los resultados de la coloración X-Gal de muestras de tejido interfacial intacto tomado del paciente L 1014 infectado con diversas dosis de un vector adenoviral de codificación ZLac, según lo descrito en el ejemplo 4. Los pozos numerados contienen tejido tratado como se indica a continuación:

1. Tejido interfacial no infectado

2. Tejido interfacial + 3.6 x 10^{4} pfu Ad.CMV.LacZ

3. Tejido interfacial + 3.6 x 10^{5} pfu Ad.CMV.LacZ

4. Tejido interfacial + 3.6 x 10^{6} pfu Ad.CMV.LacZ

5. Tejido interfacial + 3.6 x 10^{7} pfu Ad.CMV.LacZ

6. Tejido interfacial + 3.6 x 10^{8} pfu Ad.CMV.LacZ

7. Tejido interfacial + 3.6 x 10^{9} pfu Ad.CMV.LacZ

La Figura 4 muestra la transducción de las células interfaciales siguiendo la incubación con seis concentraciones diferentes de de Ad.CMV.LacZ (0,25, 50, 100, 200 y 400 pfu/célula). Después de tres días, las células fueron fijadas y tintadas con una mezcla de reacción X-gal. Se contó el porcentaje de células transducidass (azules). La Figura muestra las desviaciones media y estándar de 12 experimentos independiente.

La Figura 5 muestra la carencia de toxicidad del medio de contraste iotrolán (Isovist) en las células interfaciales. Las células interfacial fueron expuestas al medio de contraste (iotrolán) durante 4 horas. Después de 3 días se midió la viabilidad de cultivo de las células (n=12).

La Figura 6 muestra el efecto del iotrolán sobre la transducción por HAdV5 de las células interfaciales. Las células fueron expuestas a diversas concentraciones de Ad.CMV.LacZ: ((\ding{115})0 pfu/célula, (\blacksquare) 25 pfu/célula; (\medbullet) 100 pfu/célula; (\blacklozenge) 200 pfu/ célula. (n=4)) y horas de medio de contraste durante cuatro horas, después de lo cual las células eran fijadas y tintadas con gal X. El porcentaje de células transducidas se determinó contando las células azules.

La Figura 7 muestra imágenes previas (a) y posteriores (b) a la inyección del paciente 1 que muestran una masa cementación creciente en la mayor parte de la región trocantérica.

La Figura 8 muestra imágenes previas (a) y posteriores a la inyección (b) del paciente 2.

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Ejemplo 1 Procedimiento para el tratamiento con CTL 102 (Ad5-NTR y CB 1954) Materiales

El producto de droga, inyección de CTL 102, es una disolución acuosa líquida estéril, clara o virtualmente clara, que contiene viriones de CTL 102 con una potencia media nominal de 2x10^{11} ml^{-1} en tampón de pH 7,4.

El CB 1954 se formula como disolución estéril en solvente (N-metil pirrolidona: polietilen-glicol, 2:7 v/v con 17,8 mg de CB 1954 ml^{-1}). Inmediatamente antes de su uso, el profármaco se diluye en solvente salino estéril a una concentración máxima final de CB 1954 de 5 mg ml^{-1}.

Para estabilizar la prótesis, Se utiliza un cemento de hueso de viscosidad baja (SimpleX® P con tobramicina de Howmedica Inc. de Rutherford, NJ, USA). Este cemento de huesos opaco a las radiaciones es una mezcla de un componente de monómero de líquido (2 ml 97.4% metilmetacrilato, 2,6% N, N-dimetil-p-toluidina, 75 ppm de hidroquinona) y un polvo de polímero (6 g de polimetilmetacrilato, 30 g de copolímero de metilmetacrilato-estireno, 4 g de sulfato de bario, 1 g de sulfato de tobramicina). Los componentes se mezclan en vacío (0,9 bar, 1 minuto) inmediatamente antes de su uso.

Para la artrografía, se utiliza el medio de contraste Hexabrix 320 (meglumine de ioxaglato de sodio Guerbet, Roissy Charles de Gaulle Cedex, Francia).

Procedimiento

Después de chorrear cuidadosamente la articulación para quitar líquido sinovial y exudado inflamatorio que pueda contener anticuerpos anti-adenovirus de neutralización, se inyecta intra-articularmente 3x10^{9} pfu de CTL 102 dando como resultado el suministro del vector a las células a través del espacio periprostético. Después de 48 horas, para permitir la transducción de las células objetivo y la expresión del transgén de nitroreductasa, se inyecta intra-articularmente CB 1954 (a una dosificación de 24 mg m^{-2}). Para asegurar el acceso libre de CTL 102 y CB 1954 al espacio periprostético se prefiere seleccionar a pacientes que tengan un artrograma que muestre un medio de contraste alrededor de la prótesis. Es probable, por tanto, que los pacientes experimenten generalmente tres artrografías (una para asegurar el acceso del medio, una para inyectar el vector viral, y una de contraste para inyectar el profármaco CB 1954).

En algunas circunstancias, después de un número de días se puede quitar el tejido interfacial muerto limpiando con un chorro o por desbridamiento físico, como resulte apropiado. Cuando se disminuya con éxito el tejido interfacial, se recoloca la prótesis. Para volver a anclar la prótesis al hueso, se inyecta cemento en el espacio periprostético. Para limpiar con chorro el espacio periprostético e inyectar el cemento, se perfora cierto número de agujeros a través del hueso en el espacio periprostético. Esto depende del diseño de la prótesis utilizada. En muchos diseños comunes, el mínimo es cuatro, porque son necesarios tres agujeros para el componente femoral a fijar en el espacio 3D y es necesario uno para fijar el acetábulo. Como las biopsias de hueso son algo dolorosas y el hueso no puede ser anestesiado localmente, estos procedimientos se realizan bajo anestesia general o espinal.

Ejemplo 2 Producción de CTL 102 (Ad5-NTR) Materiales y métodos

Se construyó el CTL 102 según lo descrito en Djeha y otros (2001) por la recombinación homóloga de células auxiliares PerC6. Las células fueron transfectadas al 90% de confluencia con una mezcla equimolar del vector pTX0375 de transferencia y el vector pPS1160 de espina dorsal formando complejo con reactivo de transfección de Lipofectamina (Life Technologies).

El pTX0375 se construyó en dos etapas: (i) se extirpó el promotor de CMV/reforzador fusionado con el gen NTR del pTX0340 como fragmento 1,5 kb BamHI-parcial BglII y se clonó en el sitio único BamHI-parcial de pSW107, el cual es un vector de base pBluescript (Stratagene) que contiene la b-globina humana IVS II fusionada con la secuencia de poliadenilación del gen 2 de complemento humano adyacente al sitio BamHI. Un plásmido, el pTX0374, que contiene el fragmento de CMV.NTR en la orientación requerida, fue identificado por PCR usando el cebado T3 (5'- ATTAACCCT-CAC- TAAAG-3') que recuece CMV al promotor/reforzador, y un cebador de NTR, ECN2 (5'-TCTGCTCG-GCCTGTTCC-3'). (ii) Se extirpó el módulo completo de expresión de NTR del pTX0374 como un fragmento Spel 2,5 kb y se clonó en el sitio único de Spel del vector suprimido E1 de transferencia de adenovirus pPS1128 en una orientación de izquierda a derecha con respecto a las secuencias Ad5. El pPS1128 es un plásmido de base pUC19 que contiene secuencias Ad5 del ITR izquierdo a nucleótidos a (nt.) 359 fusionados al NT 3525-10589.

Se construyó el pPS1160 por linearización Pacl de pPS1128, ligadura con un adaptador compatible con Pacl (5'- TACATCTAGATAAT-3' + 5'-P-TTATCTAGAT-GTA-3') que contiene un sitio Xbal, seguida por la digestión de Xbal para soltar un fragmento de Xbal de 7 kb que contiene las secuencias Ad5 3524-10589. Ëste fue entonces clonado en pPS1022 linealizado por Xbal, un plásmido basado en pUC19 que contiene las secuencias Ad5 de nt. 10589 al ITR de la derecha pero en el que falta NT 28592 a 30470 (región E3). Se identificaron recombinantes que contienen el fragmento en la orientación requerida por PCR usando los cebadores que flanquean el sitio de Xbal en 10589 (a la derecha, 5'- TCGAGTCAAATACGTAGTCGT-3'; a la izquierda, 5'- TGTTICCGGAGGAATTTGCAA-3'). Un plásmido, pPS1160/18, se confirmó que contenía una única copia del fragmento de Xbal (pPS 1160/18) por digestión de HindIII y PstI.

Las células de PerC6 transfectadas fueron cosechadas después de la aparición de extensos CPE (unos 7-9 días después de la transfección) y se soltó el virus recombinante mediante tres ciclos congelación-descongelación en el medio de infección (DMEM, 1% de FCS, 2 mM de MgCl_{2}). Después de dos rondas de purificación de placa en células PerC6, se hicieron crecer los virus a gran escala y fueron purificados por centrifugación de densidad de CsCl. El virus unido fue dializado contra un exceso de tampón de almacenamiento (10 mM Tris, pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,6 mM Na_{2}HPO_{4}, 0,9 mM CaCl_{2}, 0,5 mM MgCl_{2}, y 5% de sacarosa), fraccionado por congelación en partes alícuotas en nitrógeno líquido, y almacenado a -280ºC. Las concentraciones de partículas se determinaron usando el Reactivo de Análisis de Proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL) y el factor de conversión 1 mg/ml = 3,4x10^{12} partículas de virus/ml. Se determinaron los títulos infecciosos por análisis de placa. Se aisló el ADN genómico del adenovirus fragmentado por digestión con la proteinasa KlSDS, extracción con fenol-cloroformo, y precipitación por etanol y caracterizado por digestión de restricción.

Ejemplo 3 Matanza en el tejido interfacial de pacientes con CTL 102 y CB 1954

Para mostrar la viabilidad de usar un sistema de enzima-profármaco proporcionado viralmente para matar células de interfaz, se cultivaron in vitro células tomadas de dos pacientes durante la cirugía de la revisión, fueron incubadas con CTL 102 en un intervalo de MOIs y fueron expuestas posteriormente al CB 1954. Entonces se determinó la viabilidad de las células usando un análisis metabólico de actividad.

Método Muestras de tejido interfacial

Para todos los experimentos descritos, se usaron células interfaciales. Se retiró tejido interfacial del espacio periprostético durante la cirugía de revisión por un cirujano ortopédico y se recogió en fosfato estéril protegido salino (PBS). El tejido conectivo y la grasa se limpiaron a fondo y el tejido interfacial fue digerido durante al menos dos horas a 37ºC usando la colagenasa 1A (1 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA). Las células fueron cosechadas entonces filtrando la sustancia de tejido/colagenasa con un filtro de 200 \mum (NPBI, Emmer-Compascuum, Países Bajos). Las células fueron cultivadas en frascos de 75 cm^{3} (Cellstar, Greiner, Alphen aan de Rijn, Países Bajos) con un medio de Dulbecco modificado con Iscove (IMDM; Biowitthaker, Verviers, Bélgica), complementado con glutamax (GibcoBRL, Paisley, Reino Unido), penicilina y estreptomicina (Boehringer, Mannheim, Alemania), y suero fetal de ternera al 10% (FCS; GibcoBRL, Paisley, Reino Unido) a 37ºC y con un 5% de CO_{2}.

Antes de cada experimento se separaron las células de interfaz de los frascos usando tripsina al 0,25% (GibcoBRL, Paisley, Reino Unido). Las células fueron contadas en un contador Bürker y las células muertas fueron excluidas por azul tripán. Las células se sembraron en una placa de 96 pozos (fondo plano) con una densidad de 5.000 células por pozo. Las células fueron incubadas durante la noche para permitir su fijación al fondo. Antes de cada experimento los pozos fueron lavados dos veces con IMDM. Se utilizaron para los experimentos células interfaciales de paso 2 a 4. La microscopia de luz indicó que más del 95% de las células eran células interfaciales.

Protocolo de ensayo de transducción y matanza de células

Día 0: Se sembraron células interfaciales de 2 pacientes a 5000 células/pozo en IMDM (FCS al 10%) en placas de 96 pozos, 100 \mul por pozo.

Día 1: Las células fueron infectadas con CTL 102 (o diluyente) en 0, 1, 5, 25, 100, 200 IU/célula en IMDM (FCS al 10%), 50 \mul por pozo.

Día 2: Las células fueron lavadas dos veces con IMDM (FCS al 10%), a continuación se incubaron las células durante 2 horas o 24 horas con CB 1954 (o vehículo) a 0, 0,1, 0,5, 1,5 y 50 \muM 40 en IMDM (FCS al 10%, HS al 10%), 50 \mul por pozo.

Día 2/3: Las células fueron lavadas una vez con IMDM (FCS al 10%) y luego incubadas en IMDM (FCS a1 10%, HS al 10%), 5 \mul por pozo.

Día 4: Se tomaron fotografías. Se restauró el medio con IMDM (FCS al 10%), se agregó 10 \mul de reactivo WST (Roche) y las placas fueron incubadas durante 2 horas. A continuación se midió la absorbencia a 415 nm.

Resultados

Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, se observó una matanza, dependiente de la dosis virus y de CB 1954, para las células de ambos pacientes. De manera importante, se observó una matanza eficiente (del 90%) con las dosis de virus y de CB 1954 (200 virus pfu/célula y una concentración de CB 1954 de 50 \muM) que son fácilmente obtenibles en la clínica.

Estos resultados demuestran que las células interfaciales puede ser transducidas por un vector HAdV-5 y matadas por la aproximación de NTR/CB 1954. El adenovirus humano 5 es capaz de infectar una gama amplia de células humanas divisibles y no divisibles incluyendo fibroblastos y macrófagos (Djeha y otros, 2001).

La matanza de células por GDEPT se ha estudiado antes en diversas variedades de células, usando diversas aproximaciones. La aproximación de NTR/CB 1954 es atractiva para la evaluación clínico por varias razones: (1) genera un agente tóxico que puede matar tanto las células divisibles como las no divisibles, (2) la inducción de la muerte celular ocurre por un mecanismo independiente del p53, y (3) el CB 1954 se tolera bien en el hombre (Djeha y otros, 2001). La matanza de células por la aproximación de NTR/CB 1954 ha demostrado ser efectiva en una variedad de células cancerígenas humanas (Chungkin-Faye y otros, 2001; Bilsland y otros, 2003, Green y otros, 2003; McNeish y otros, 1998; Shibata y otros, 2002; Weedon y otros, 2000; Wilson y otros, 2002), pero no se ha estudiado previamente en células sinoviales o interfaciales. El presente estudio muestra que se pueden matar con eficiencia células interfaciales por la aproximación de NTR/CB 1954.

Para el presente estudio se utilizaron células interfaciales de paso 2 a 4. Estos pasos fueron utilizados para reducir al máximo los artefactos de cultivo. Por una parte, en pasos muy bajos (0 y 1) existe un riesgo de presencia de células contaminantes (especialmente macrófagos), que disminuye con pasos más altos. Por otra parte, en pasos superiores existe el riesgo de una sustancial alteración/selección del crecimiento in vitro (especialmente en pasos superiores a 4) (Zimmerman y otros, 2001). En el presente estudio, se utilizaron células interfaciales cultivadas de diversos pacientes. Para la interpretación de los resultados se reunieron los datos de todos los pacientes. Sin embargo, se debe destacar que se observaron diferencias individuales de transducibilidad.

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Ejemplo 4 Infección eficiente del tejido interfacial intacto con vectores de adenovirus

El experimento descrito en el ejemplo 3 confirmó que las células interfaciales cultivadas son infectables con Ad5. Sin embargo, cuando una célula está presente en un tejido intacto, el acceso del virus a la superficie de la célula puede ser evitado, por ejemplo por la matriz extracelular y por la baja tasa de difusión del virus a través del espacio extracelular. A la vista de esto, se examinó la infectabilidad del tejido interfacial intacto usando un adenovirus de expresión LacZ y la coloración Xgal del tejido de LacZ-expresión. Usando este aproximación, se observó un aumento dependiente de la dosis de virus en la expresión genética, con fuertes niveles de expresión genética con las dos dosis de virus más altas ensayadas (Figura 3).

Método

Se obtuvo tejido interfacial (LI014) de una operación de revisión de la cadera de un paciente de artritis reumatoide. El tejido fue cortado en 7 pedazos y los pedazos fueron introducidos en tubos de fondo redondo de 10 ml. Se añadieron concentraciones diferentes de Ad.CMV.LacZ (0, 3,6x10^{4}, 3,6x10^{5}, 3,6x10^{6}, 3,6x10^{7}, 3,6x10^{8} pfu, 3,6x10^{9}) en 200\mul de IMDM/FCS al 10%. Los tejidos fueron incubados a 37ºC durante 2 horas, los tubos fueron sacudidos cada 10 a 15 minutos. A continuación, se agregó 5 ml de IMDM/FCS al 10% y después de una incubación durante la noche se aclaró los tejidos 3 veces con PBS y posteriormente fueron introducidos en 5 ml de disolución de colorante Xgal e incubados por 3,5 horas a 37ºC. Los tejidos fueron aclarados 3 veces con PBS y fijados en formalina al 10%.

Resultados

Los tejidos con las cantidades agregadas de Ad.CMV.LacZ más altas presentan áreas de coloración azul marino, que revelan una evidente infección a 3,6x10^{7} pfu Ad.CMV.LacZ, mostrando que es efectiva la infección de células en el tejido interfacial intacto.

Las secciones embebidas en parafina de los tejidos fueron examinadas microscópicamente y se confirmó la presencia de células tintadas, infectadas.

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Ejemplo 5 Transducción del tejido interfacial y efecto del medio de contraste

Para ensayar adicionalmente la susceptibilidad de las células interfaciales al adenovirus humano 5 (HAdV-5) en base a vectores, cultivos primarios de células interfaciales fueron expuestas al vector de HAdV-5 Ad.CMV.LacZ. Veinticuatro horas después de la infección, las células fueron tintadas con la disolución X-gal para la expresión genética informante de la \beta-galactosidasa. La eficiencia de la transducción aumentó al aumentar la concentración del vector. A 400 unidades/célula formando placa el porcentaje de células que expresa el gen informante era del 88% (sd 4,0) (Fig. 4). De este modo los vectores HAdV-5 pueden transducir las células interfaciales.

Materiales y métodos Vectores adenovirales

El vector Ad.CMV.LacZ (van der Eb y otros, 2002) es idéntico al CTL 102, pero el gen E Coli lacZ sustituye al gen ntr.

Análisis de la transducción

Para estudiar la transducibilidad de las células interfaciales por el HAdV-5, se infectó células interfaciales con el vector Ad.CMV.LacZ (en concentraciones de 0, 25, 50, 100.200.400 pfu/célula). Veinticuatro horas después de la infección las células fueron lavadas dos veces con IMDM, y cultivado durante dos días. El medio fue restaurado cada día. El día tres, los cultivos de una sola capa fueron lavados dos veces con PBS y fijados con aldehído glutárico al 0,2% y formaldehído al 2% en PBS durante 10 minutos a 4ºC. Posteriormente las células fueron lavadas dos veces con PBS y tintadas para detectar la actividad de la p-galactosidasa en una mezcla de reacción de 50 \mul (1 mg/ml de X-gal (Eurogentec, Seraing, Bélgica), 5 mM de ferrocianuro potásico, 5 mM de ferricianuro potásico, 2 mM de MgCl_{2} en PBS) durante 2 horas a 37ºC. Se determinó el porcentaje de células transducidas contando al menos 100 células interfaciales, usando microscopia de luz. Todas las condiciones fueron ensayadas dos veces.

Efecto del medio de contraste sobre las células interfaciales

Se sembraron células interfaciales en placas de 96 pozos. En cada uno de los pozos se agregó 50 \mul de IMDM con FCS al 20% y 50 \mul de una disolución que contiene medio de contraste y NaCl al 0,9% en diversas concentraciones (con medio de contraste al 0, 12,5, 25, y 50%). El medio de contraste usado el iotrolán dímero no iónico (Isovist; Schering, Berlín, Alemania) de baja acción osmótica. Después de cuatro horas de exposición al medio de contraste, las células fueron lavadas dos veces e incubadas en IMDM con FCS al 10%. Las células fueron cultivadas durante tres días más, cambiando el medio de cultivo cada día. El día cuatro, se determinó la viabilidad de la célula con el Kit de análisis de viabilidad de células WST-1 (Roche, Mannheim, Alemania) según el protocolo de los fabricantes.

Efecto del medio de contraste sobre la transducción con HAdV-5 de células interfaciales

Las células interfaciales se sembraron en placas de 96 pozos. Después de su incubación durante la noche las células fueron infectadas con Ad.CMV.LacZ (concentraciones de 0, 25, 100, y 200 pfu/célula) en IMDM con FCS al 20%, 50 \mul por pozo. Se añadió cincuenta \mul de iotrolán (Isovist) con NaCl al 0,9% en concentraciones de 0, 25, 50, y 100%. (Cuando se diluyó en el medio de cultivo estas concentraciones disminuyeron a 0, 12,5, 25, y 50%).Cuatro horas después de la infección, las células fueron lavadas dos veces con IMDM e incubadas durante el resto del día en IMDM con FCS al 10% a 37ºC y CO_{2} al 5%. Las células transducidas con Ad.CMV.LacZ fueron cultivadas durante tres días después de retirar el vector y el medio de contraste. Posteriormente, las células fueron fijadas y tintadas para determinar la actividad de la p-galactasidasa. La tasa de transducción fue determinada como se describe anteriormente.

Análisis estadístico

Se usó un análisis univariante de varianza y correlación de Spearman para estudiar la interacción entre el vector y el profármaco y entre el vector y el medio de contraste y estudiar el efecto del CB 1954 sobre la viabilidad de las células. Se realizó una prueba de Mann-Whitney para grupos independientes a fin de determinar la diferencia en matanza de células entre las células que fueron expuestas al medio de contraste y las células no expuestas. En el experimento para estudiar el efecto de la exposición transitoria al medio de contraste en la transducción del vector de HAdV-5 se ensayó la correlación de Spearman entre el tiempo de contacto y la viabilidad y entre el tiempo de tardanza y la viabilidad. Para todos los análisis estadísticos el nivel de significación estadística fue p<0,05.

Resultados Efecto del medio de contraste sobre las células interfaciales

Se evaluó la toxicidad del medio de contraste (iotrolán) en las células interfaciales (Fig. 5). El iotrolán no afecta a la viabilidad de las células en cualquier concentración (p=0.563). La adición del medio de contraste a las células interfaciales durante cuatro horas no produce la matanza de las células.

Efecto del medio de contraste sobre la transducción de HAdV-5 en las células interfaciales

El efecto del medio de contraste (iotrolán) sobre la transducción de HAdV5 en las células interfaciales fue investigado con Ad.CMV.LacZ. La transducibilidad de las células aumenta con la concentración del vector HAdV-5. Sin embargo, el medio de contraste tiene una influencia restrictiva en la eficiencia de la transducción. Con concentraciones más altas de iotrolán, la concentración del vector HAdV-5 tiene menos efecto sobre la eficiencia de la transferencia genética. Con una concentración del medio de contraste del 50% no resultó transducida ninguna de las células (Fig. 6). El efecto del iotrolán sobre la transducción es estadísticamente significativo (p (p<0.001). Además, se han observado diferencias entre las células de diferentes individuos (n=6). Para evaluar el efecto del medio de contraste sobre la matanza de células por NTR/CB 1954, se repitió el experimento previamente descrito sobre la eficiencia de la matanza de células en presencia del medio de contraste. Los resultados mostraron que, en presencia del medio de contraste, las células no mueren por la aproximación del NTR/CB 1954 (resultados no mostrados). La presencia del medio de contraste Hexabrix 320 también inhibió la transducción viral (datos no mostrados). En resumen, los resultados de estos experimentos demuestran la incompatibilidad de la administración viral en combinación con la administración de dos medios de contraste de uso general. Esta incompatibilidad puede ser debida a la presencia de yodo en los medios de contraste. La investigación de todos los medios de contraste disponibles puede permitir la determinación de un medio de contraste compatible con la transducción viral.

Se investigó la influencia de la exposición transitoria al medio de contraste en la transducción de las células interfaciales. Las células interfaciales fueron expuestas al medio de contraste durante 0 a 120 minutos y se varió el período entre el lavado ara retirar el medio de contraste y la ejecución la aproximación del NTR/CB 1954 para matar las células. La matanza de células no se correlacionó con el tiempo de contacto (corr -0,033, p = 0,691) o con la longitud del período entre la retirada del medio de contraste y la adición del vector (corr -0,004, p = 0,962). La matanza de las células no expuestas al medio de contraste y de las expuestas de manera transitoria fue equivalente.

Exposición

En este estudio la influencia del medio de contraste en la matanza de células por el NTR/CB 1954 fue investigada con vistas a futuros estudios clínicos. Los resultados muestran que el medio de contraste no parece tener ninguna influencia en las células interfaciales. Sin embargo, la transducción de células por el vector adenoviral, en presencia del medio de contraste, es casi insignificante. El vector adenoviral es hecho inactivo por la presencia del medio de contraste. En un estudio clínico supuesto, el vector viral se inyectará en el espacio de la articulación. Normalmente, el medio de contraste se utiliza para verificar la posición de la aguja en la articulación. Los resultados de este estudio muestran sin embargo que se disuade el uso del medio de contraste conjuntamente con un vector viral. Así pues, para un estudio clínico, proponemos que se empleen métodos alternativos para la visualización de la aguja, por ejemplo la inyección de aire para crear un "artrograma de aire".

En conclusión, este ejemplo muestra que las células interfaciales se pueden matar por la aproximación del la profármaco /enzima NTR/CB 1954.

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Ejemplo 6 Resultados clínicos

Se encuentran disponibles los datos de los dos primeros pacientes de un estudio de fase 1 de 12 pacientes con una cadera aflojada que experimentaban dolor debilitante y comorbilidad significativa. El día 1 se inyectó el vector en la articulación de cadera y el día 3 se inyectó el profármaco, como se describe anteriormente. En el día 10 se perforaron tres orificios en el fémur y uno en el acetábulo. Se tomaron biopsias del espacio periprostético y se inyectó cemento de baja viscosidad (Osteopal, Biomet Merck, Sjöbo, Suecia) bajo guiado fluoroscópico.

El paciente 1 es una mujer de 82 años de edad con aflojamiento de ambas prótesis de cadera, clasificada como ASA IV (riesgo de mortalidad del 20,3%, según la clasificación de estado físico de la American Society of Anesthesiologists, Saklad, 1941). No hubo efectos nocivos a partir de la inyección del vector (3x10^{9} partículas) y 24 horas después de la inyección no era perceptible ningún desprendimiento de virus. Doce horas después de la inyección del profármaco, el paciente experimentó náuseas, (grado 1 de la WHO) lo cual era conocido como reacción al profármaco. También dolor de cadera creciente, que fue anticipado puesto que la terapia inicial pretende causar un mayor aflojamiento. Se inyectaron 16 ml de cemento en el espacio periprostético (véase la Figura 7B) que indica que la destrucción significativa del tejido interfacial crea un vacío en el cual podría ahora introducirse el cemento. El paciente pasó a ser ambulante el día después de la cirugía.

Al cabo de dos y cuatro semanas después de la inyección de cemento, el paciente no tenía ningún dolor en la cadera tratada, y siguió todavía mejorando. La distancia máxima que caminaba había aumentado desde 4-5 metros a 30 metros. La distancia caminada subjetiva reconocida por el paciente (0: 0 metros, 100: distancia caminada ilimitada) creció de 4 a 66. El marcador de dolor del paciente (0: ningún dolor, 100: dolor insoportable) disminuyó desde 81 previamente a la operación a 2. Además, podrían ahora dormir sobre su costado sin dolor, cosa que no había podido hacer durante cuatro años. En términos de dependencia percibida (0: totalmente dependiente de otros, 100: totalmente independiente) el marcador disminuyó desde 95 a 54.

El paciente 2 es una mujer de 72 años con aflojamiento de su prótesis izquierda de cadera y con una clasificación ASA II (riesgo de mortalidad 2,8%). Una vez más no había perceptible ningún desprendimiento de virus 24 horas después de la inyección del vector. Se inyectó cemento 18 ml de cemento siguiendo un procedimiento similar (Figura 8B). Al cabo de cuatro semanas después del tratamiento el marcador de dolor había disminuido desde 43 a 22 (reflejando probablemente la presencia de un hematoma postoperatorio, que requirió 4-5 semanas para su resolución). Específicamente el dolor relacionado con la articulación de cadera desapareció. La distancia máxima caminada creció de 500 a 2000 metros. En el seguimiento al cabo de tres meses, el hematoma se había resuelto totalmente y el marcador de dolor había disminuido adicionalmente a 7. El paciente continúa mejorando en términos de capacidad funcional para caminar y otras actividades.

El presente estudio es el primero en utilizar transferencia genética con mediación adenoviral intra-articular in vivo en un entorno clínico. Los resultados preliminares sugieren que la terapia genética y la inyección de cemento para la recolocación de prótesis de cadera es clínicamente factible.

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Claims (17)

1. Uso de un producto que comprende una combinación de:

a)

al menos un vector, que comprende un polinucleótido aislado que codifica una enzima capaz de convertir un profármaco en un compuesto activo citotóxico, expresión de la enzima que es controlada por un promotor ligado operacionalmente; y;

b)

un profármaco susceptible de ser convertido en un compuesto citotóxico activo por dicha enzima

para la fabricación de un medicamento combinado para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos.

2. Uso de un producto según la reivindicación 1, en el que el promotor proporciona la expresión específica de tipo no celular.

3. Uso de un producto según la reivindicación 2, en el que el promotor es un promotor de citomegalovirus.

4. Uso de un producto según la reivindicación 1, en el que el promotor proporciona sustancialmente la expresión específica de tipo celular.

5. Uso de un producto según la reivindicación 4, en el que la expresión se restringe sustancialmente a las células del linaje del monocito/macrófago.

6. Uso de un producto según la reivindicación 5 en el que la expresión se restringe sustancialmente a los osteoclastos y células precursoras de osteoclastos.

7. Uso de un producto según la reivindicación 6, en el que el promotor está naturalmente ligado de manera funcional a un gen que es seleccionado de la lista que consiste en: TRAP, RANK, catepsina K.

8. Uso de un producto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la enzima es una nitroreductasa.

9. Uso de un producto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el profármaco es el CB 1954.

10. Uso de un producto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la enzima es un citocromo P450.

11. Uso de un producto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de la reivindicación 10, en el que el profármaco es acetaminofeno.

12. Un producto que comprende:

a)

al menos un vector, que comprende un polinucleótido aislado que codifica una enzima capaz de convertir un profármaco en un compuesto activo citotóxico, expresión de la enzima que es controlada por un promotor ligado operacionalmente; y;

b)

un profármaco susceptible de ser convertido en un compuesto citotóxico activo por dicha enzima como medicamento combinado para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento del aflojamiento aséptico de implantes ortopédicos.

13. Un producto según la reivindicación 12, en el que la enzima es una nitroreductasa.

14. Un producto según la reivindicación 12 ó 13, en el que el profármaco es el CB 1954.

15. Un producto según la reivindicación 12, en el que la enzima es un citocromo P450.

16. Un producto según la reivindicación 12 ó 15, en el que el profármaco es el acetaminofeno.

17. Un kit para el tratamiento del aflojamiento aséptico de los implantes ortopédicos que comprende:

a)

Un polinucleótido aislado o vector que codifica una enzima capaz de convertir un profármaco en un compuesto citotóxico activo, expresión de cuya enzima es controlada por un promotor ligado operacionalmente, en un tampón aceptable farmacéuticamente;

b)

Un profármaco susceptible de ser convertido en un compuesto citotóxico activo por dicha enzima, en un tampón aceptable farmacéuticamente;

c)

Una disolución digestora de tejidos que comprende al menos una enzima seleccionada de la lista que consiste en colagenasa, elastasa, hialuronidasa, en un tampón aceptable farmacéuticamente;

d)

Un cemento adecuado para la recolocación de dicho implante ortopédico.