CN1929866B - 用于假体关节修复的酶前体药物治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因治疗在矫形假体无菌性松弛的治疗中的应用，本分还公开了无需开放的校正手术重新装设这种假体的方法。尤其是，本发明提供了前体药物和包含编码前体药物转换酶的基因的腺病毒载体用于同时，单独或者顺序用于破坏的接触面组织，从而以最低限度侵入的方式随后对松弛假体再粘固。

Description

用于假体关节修复的酶前体药物治疗

发明领域

本发明涉及基因治疗在矫形假体无菌性松弛治疗中的应用。尤其是，本发明公开了不用开放的校正手术即可重新装设上述假体的方法。

发明背景

全世界每年进行大约有1百万例完全髋关节置换手术(完全髋关节成形术)，其中美国超过120,000例，并且仅英国大约有35,000例(NIH共识声明(NIH Consensus Statement)，1994；NHS综述1996)。在下一个十年内全世界每年可能增加到大约3百万。髋关节置换经常在老年病人中进行，在这些人群中，大约三分之一的病人15年内假体的一个或两个部件发生松弛，导致严重的活动受限。当假体松弛发生时，病人经受加剧的疼痛和行走困难，并且发生脱位与病理性骨折的危险较高。所有病人中大约有10％在10年内需要校正手术，这种手术出现并发症和失败的比例很高(Hellman等，1999)。

植入物失败最常见的原因是微粒诱导的骨质溶解导致无菌性松弛。诸如基于假体类型的聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、钛、钴铬或陶瓷碎片颗粒的磨损颗粒刺激产生被称为假体周围骨质溶解的炎症反应(Goldring等，1986)。巨噬细胞对磨损颗粒的吞噬激活它们，导致分泌炎症细胞因子IL-1，TNF-α和IL-6。所导致的慢性炎症反应最终产生包括活化的巨噬细胞，成纤维细胞，巨细胞和破骨细胞肉芽肿的“接触面组织”的假膜，与关节炎关节的关节翳特征相似。这种复杂的炎症与增生性异物反应的最终结果是破骨细胞介导的骨吸收，导致假体植入物的一个或两个部件的松弛。完全髋关节成形术的假体由两个部件组成。人造接受腔，或者髋臼部件位于事先准备好的骨盆髋臼腔中。这个接受腔与包含与突起连接的球状物的股骨部件以关节连接，这个球状物被置入事先准备好的股骨髓腔内。两个部件均存在许多变化，而且有或没有接合剂它们都可被保持。

无菌性松弛最终导致无法接受的疼痛，无法行动或行走困难以及不稳定性，发生脱位和病理性骨折的危险较高。在一些病人中需要施行校正手术来除去炎症组织并且置换假体。然而，校正手术非常昂贵而且发病率和死亡率较高，尤其是老年病人(他们占大多数)。在心功能不全的病人中校正手术通常有较多的并发症诸如心肌衰竭或冠心病(Strehle等，2000)。因为死亡率危险太高，许多病人不适于校正手术。对于这种病人没有可选择的治疗，后来只能坐轮椅。因此很明显临床需要用创伤较小的替代校正手术的方法对松弛的假体进行治疗。针对这个问题目前的实验方法是预防性的而不是治疗性的。一种控制无菌性松弛的预防性方法包括利用二膦酸盐化合物，尤其是阿仑膦酸钠(alendronate)，或者作为一种全身的药剂或者作为用于固定这种假体的接合剂的组分(美国专利5,972,913，WO 96/39107，Shanbhag等，1997，Leung等，1999)。然而，尽管已知二膦酸盐可引起骨密度的增加，但是既没有在治疗类风湿性关节炎上显示出显著的效果，对假体周围骨质溶解本身也没有显示出显著的效果，类风湿性关节炎与假体周围骨质溶解共有许多相似的病理特征(Ralston等，1989；Eggelmeijer等，1996；Ulrich-Vinther，2002)。因此二膦酸盐对预防无菌性松弛是否有用尚待分晓。

为了直接预防破骨细胞介导的假体周围的骨吸收，可选择的预防方法包括基因治疗(Wooley和Schwarz综述，2004)，利用腺病毒相关病毒载体递送的破骨细胞抑制蛋白，骨保护素(osteoprotegerin)已被描述(Ulrich-Vinther，2002)。骨保护素是破骨细胞分化因子，核因子κB配体(RANKL)的受体活化剂的竞争性抑制剂，骨保护素与已知作为核因子κB(RANK)受体活化剂的巨噬细胞来源的破骨细胞前体细胞表面表达的受体结合。RANKL是由成骨细胞、基质细胞以及活化的T细胞在巨噬细胞吞噬磨损颗粒引发的炎症反应早期分泌的(Teitelbaum，2000)。RANKL与RANK结合导致破骨细胞前体细胞活化、分化并且刺激骨吸收。骨保护素与RANK结合不能活化破骨细胞前体细胞，从而引起骨保护素竞争性地抑制RANKL。

Ulrich-Vinther等在小鼠颅盖骨吸收模型中利用重组体腺病毒相关病毒(rAAV)载体来表达骨保护素并且抑制钛颗粒诱导的骨吸收。钛颗粒被植入到颅盖上(颅骨的拱顶骨)并且通过将载体肌肉注射入四头肌来给药。因此骨保护素的抑制作用是全身的，可检测到血清水平的增加，并且在未经处理的对照组中观测到成功地抑制试验性钛诱导的破骨细胞生成与骨吸收。尽管有趣，但是这个模型是否形成对于临床假体周围骨质溶解的可行的预防措施的基础尚待证实。即使有效，血清骨保护素水平持续的升高有怎样的长期全身的效果仍不清楚。例如，需要证明这种策略在骨质重塑中不会对正常的破骨细胞功能产生有害影响。

对于假体周围骨质溶解的普通的和使人虚弱症状及其所导致的无菌性松弛仍然需要有效的治疗。

广泛用来治疗癌症的优选杀伤病理性细胞的方法是将基因导入靶细胞，靶细胞编码的酶能够将相对低毒的前体药物转变成有效的细胞毒性药物。前体药物的全身性的给药是可以忍受的因为前体药物仅仅在局部例如在肿瘤中被表达前体药物转换酶的细胞转变成毒性衍生物。这种方法被称作基因导向的酶前体药物治疗(GDEPT)，或者当通过重组体病毒载体递送基因时病毒导向的前体药物治疗(VDEPT)(McNeish等，1997)。

一个酶/前体药物系统的例子是硝基还原酶和氮杂环丙烯基前体药物CB1954(5-(氮杂环丙烷-1-基)))-2，4-二硝基苯甲酰胺))(Knox等1988)。接着观测到Walker大鼠癌细胞系对CB1954特别敏感，表明这是由于大鼠硝基还原酶DT黄递酶(diaphorase)的表达。然而，因为CB1954是这种酶的人体形式的较差(poor)底物，所以人肿瘤细胞对CB1954非常不敏感。GDEPT被认为是引入合适的硝基还原酶，优先地对CB1954有更强的活性的方法以使靶细胞致敏。NFSB基因(或者被称为NFNB，NFSI，或者DPRA)编码的大肠杆菌硝基还原酶(ECl.6.99.7，或者被称为氧不敏感的NAD(P)H硝基还原酶或二氢喋啶还原酶，而且通常被缩写成NTR)已经广泛地被用作此目的(Grove等综述，1999)。NFSB编码的硝基还原酶(NTR)是结合两个黄素单核苷酸(FMN)辅因子分子的同型二聚体。NADH或NADPH作为电子供体，而且结合FMN作为还原中间物，NTR还原CB1954双硝基中的一个或另一个硝基以供给高毒性的4-羟胺衍生物或者相对无毒性的2-羟胺。在细胞内，或许通过另外的毒性代谢物，5-(氮杂环丙烷-1-基)-4-羟氨基-2-硝基苯甲酰胺变得具有非常强的基因毒性(Knox等，1991)。引起损害的确切本质不清楚，但不象是被其他因子引起的。发生中间链交联的比例特别高而且损害的修复较差，因此CB1954是特别有效的抗肿瘤剂(Friedlos等，1992)。

GDEPT的目标是在靶细胞中实现将诸如CB1954的前体药物有效转变以便不仅杀伤表达NTR的细胞而且杀伤尚未被成功转染或转导的旁观者肿瘤(bystander tumor)细胞。

另一个被用于这种方法的酶-前体药物系统是细胞色素P450作为前体药物转换酶而将对乙酰氨基苯酚(acetaminophen)作为前体药物，正如在国际申请WO 00/40271中所描述的(在此完全引用)。肝脏中自然表达的大量细胞色素P450酶(例如CYP1A2，CYP 2E1和CYP3A4)能够将对乙酰氨基苯酚转变成一种高细胞毒性的代谢物，N-乙酰基苯并醌亚胺(NABQI)。这个系统已经被计划进行广泛的临床应用，特别是在癌症的治疗领域。细胞色素P450酶也能够活化一些通常的细胞毒性前体药物，例如环磷酰胺和异环磷酰胺(Chen和Waxman，2002)。

许多其他的酶-前体药物系统被广泛的使用，包括HSV胸腺嘧啶核苷激酶胸苷激酶和9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(Moolten，1986)，胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶(Mullen等，1992)。

Goossens等(1999)描述了一种在体外感染并且杀伤分离培养的滑膜细胞的病毒基因治疗方法，以及在通过注射胶原诱导的炎症关节的猴胶原诱导的关节炎模型中杀伤关节翳组织。上述动物中的炎症关节包含源于被称作关节翳的慢性炎症的增生组织。

发明内容

此处使用的：

“细胞类型选择性”意思是优选在限定的组织中促进表达。优选地，这种表达基本上限于单一组织或细胞类型。

“可操作性连接的启动子”基本上是邻近的顺式关系，其中上述的启动子促进可操作性连接元件的表达。

“假体周围”涉及围绕植入假体的任一部分的空间。

“假体周围骨质溶解”和“无菌性松弛”是同义的而且指植入假体与明显的感染或创伤无关的任一渐进性松弛。

“接触面组织”与“溶骨膜”是同义的而且意思是参与假体周围骨质溶解，围绕植入假体的假体周围空间的炎症组织。

此处使用的“假体”或“矫形植入物”意思是指外科植入动物或人体骨结构中的任一材料或装置。

本发明的目的之一是提供一种非手术的方法来替代校正手术治疗破坏接触面组织(以及接触面组织中的细胞，其参与炎症过程和骨吸收)的松弛的假体而且允许植入物被再粘固。

本发明设法通过利用基因治疗载体将前体药物转换酶递送到接触面组织中的细胞，从而使这些细胞对特定的前体药物敏感的酶前体药物治疗策略达到这个目的。前体药物给药导致其在靶细胞中转变成活性细胞毒性药物，杀伤接触面组织。从溶解的接触面细胞中释放的活性细胞毒性药物也能杀伤邻近的接触面或炎症细胞(杀伤“旁观者”)，这是有利的，因为那些已经避开直接载体递送的细胞(通过病毒载体的转导，或非病毒载体的转染)也被除去。

在一个策略中，携带编码酶的核酸的病毒载体被注入到关节间隙内，而且接着通过一个小钻孔施用前体药物，小钻孔也被用于注射接合剂以便在原位重新装设假体。或者，前体药物可通过关节内注射给药。关节造影显示接触面组织在松弛的假体围绕形成连续封闭的腔，这就允许载体和前体药物在局部达到较高的浓度以使全身流逝的危险降低。因此这一观点与需要相当临床经验的癌症患者肿瘤内注射相比，在效力和安全性方面提供了更有利的环境。至少在腺病毒载体的情况下，在引入载体前应该优先地除去关节内/假体周围区域存在的液体，以减少中和液体中灭活载体的抗体以及阻止令人满意水平的转导的可能性。

优选地，在导入前体药物并随后杀伤接触面组织的细胞后除去上述的组织。可以通过在同时或者之后引入前体药物，一种或多种能够消化接触面组织细胞外组分的酶，诸如胶原酶，弹性蛋白酶或透明质酸酶，基质金属蛋白酶或组织蛋白酶辅助除去上述的组织。对这个目的有用的其他化合物包括试剂EDTA(乙二胺-N，N，N′，N′-四-乙酸)和EGTA(乙二醇-二(2-氨乙酸)-N，N，N′，N′-四乙酸)。上述的治疗措施消化接触面组织并使之松弛，以致于能够通过一个合适的钻孔或一个被置入关节间隙内的大孔针将其冲走。

被充分松弛和清创的植入物然后被再粘固，以便将所有松弛的部件重新坚固地附着在一起并且完全地复原假体关节的功能。

或者，特别是与那些诸如对乙酰氨基苯酚的全身毒性极低的前体药物一起，编码前体药物转换酶(诸如细胞色素P450)的载体可以被局部注射，以致仅仅在接触面组织/关节腔内的细胞被转导，而随后系统施用前体药物。

本发明一个方面的方法是杀伤接触面组织中驻留的细胞而不管它们的类型。事实上，主要的细胞是产生组成许多组织的细胞外基质蛋白质的成纤维细胞，以及对炎症效应起作用的单核细胞/巨噬细胞系中的细胞。在这种情况下，载体编码的酶的表达受到一种强非细胞类型特异性启动子的控制，这种启动子在各种类型的细胞和组织中提供高水平的表达，诸如巨细胞病毒早期/即时启动子而且细胞毒性效应限于载体和/或前体药物被注射入的间隙物理限制的接触面组织的细胞。从安全角度最注重考虑的正常细胞是对骨再生起作用的成骨细胞。大多数情况下，以及大多数递送基因的载体，这些细胞难以接近被注入到假体间隙周围的载体，因此不被转导或转染，即使有非细胞类型特异性启动子时也不表达前体药物转换酶，而且因此在随后施用前体药物后也没有被杀伤。

这种非细胞特异性启动子的例子包括：巨细胞病毒即时/早期启动子，Rous肉瘤病毒长末端重复序列(RSV LTR)，鼠白血病病毒LTR，猿猴病毒40(SV40)早期/晚期启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶核苷激酶(tK)启动子，肌动蛋白或泛素启动子。

在一些情况下，实现更具选择性杀伤细胞是有利的，在这种情况下，在组织或细胞类型选择性启动子的控制下可以表达载体编码的酶。使用这种启动子可以允许选择性杀伤特殊株系的细胞，诸如成纤维细胞，单核细胞/巨噬细胞系的细胞或者，更具体地，特殊表型的细胞，诸如破骨细胞前体细胞，或完全分化的破骨细胞。

单核细胞/巨噬细胞系中适合于优选表达诸如编码前体药物转换酶基因的启动子的例子包括c-fes和CD68。以含有一个或多个转录因子PU.1结合位点为特征的启动子通常是合适的(Greaves和Gordon，2002)。

适合于在破骨细胞或破骨细胞前体中优选表达基因的启动子包括耐酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)启动子，RANK启动子和组织蛋白酶K启动子。以含有一个或多个小眼畸形转录因子家族(MITF，TFE3，TFEB和TFEC)结合位点(E-boxes，含有共通结合序列5′-CA(T/G)GTG)为特征，同样任选含有对转录因子PU.1的结合位点的启动子通常是合适的(Motyckova等，2001；Mansky等，2002，Greaves和Gordon，2002)。

通过使用这种特异性启动子，酶的表达可能限于特定靶细胞，诸如对铺设细胞外基质蛋白质起作用的特定靶细胞诸如胶原细胞(成纤维细胞)，对分泌炎症细胞因子起作用的特定靶细胞(诸如巨噬细胞)，或直接对骨吸收起作用的特定靶细胞(破骨细胞)而同时又保护其他细胞类型(诸如对新骨的沉淀起作用的成骨细胞)。

有或者没有组织选择性表达的载体和/或前体药物局部给药的多种可能组合允许松弛假体的非手术治疗以及植入物的再粘固，克服了现有技术中为了防止假体周围松弛而采取例如二膦酸盐的化合物，或者诸如骨保护素全身表达的高生物活性分子的全身给药的方法的局限性。

因此，本发明提供了编码能够将前体药物转变成活性细胞毒性化合物的酶的分离多核苷酸，酶的表达受到基本上提供细胞类型选择性表达的可操作性连接的启动子的控制。表达优选限于单核细胞/巨噬细胞系的细胞。这种启动子的优选例子包括诸如c-fes和CD68基因的启动子。以含有一个或多个转录因子PU.1结合位点为特征的启动子通常是合适的。

或者，表达限于成纤维细胞。

更优先的表达限于破骨细胞或者破骨细胞前体。其中提供上述表达的合适的启动子是被自然功能性地连接到基因诸如耐酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)，核因子κB受体活化剂(RANK)和组织蛋白酶K上的启动子。以含有一个或多个小眼畸形转录因子家族(MITF，TFE3，TFEB和TFEC)结合位点(E-boxes，含有共通结合序列5′-CA(T/G)GTG)为特征，同样选择性地含有转录因子PU.1的结合位点的启动子通常是合适的。

优先地，所编码的酶是硝基还原酶，优选适用于活化前体药物CB1954(5-(氮杂环丙烷-1-基)-2，4-二硝基苯甲酰胺)的硝基还原酶。或者是细胞色素P450。其他合适的酶/前体药物系统包括HSV胸腺嘧啶核苷激酶和9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(Moolten，1986)，胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶(Mullen等，1992)。

另一方面，本发明提供了包含上述多核苷酸的载体。载体是任一能够将DNA转移入细胞的载体。优选地，载体是整合型载体或游离型载体。

优选的整合型载体包括重组体逆转录病毒载体。重组体逆转录病毒载体包括逆转录病毒基因组至少一部分的DNA，所述部分能够感染靶细胞。术语“感染”用于指病毒将遗传物质转移至其宿主或靶细胞的过程。优选地，被用于构建本发明中载体的逆转录病毒也表现出复制缺陷从而去除靶细胞的病毒复制的效应。在这种情况下，根据传统的技术复制缺陷的病毒基因组能够被辅助病毒包装。通常，能够符合上述感染标准而且有转移功能基因能力的任一逆转录病毒可以用于本发明的实践中。尤其优选慢病毒(Lentiviral)载体。

合适的逆转录病毒载体包括但不限于本领域技术人员熟知的pLJ，pZip，pWe和pEM。合适的包装复制缺陷的逆转录病毒的病毒系包括，例如，ΨCrip，ΨCre，Ψ2和ΨAm。

本发明中其他有用的载体包括腺病毒，腺病毒相关病毒，SV40病毒，牛痘病毒，HSV和天花病毒载体。优选的游离型载体是腺病毒。腺病毒载体是本领域技术人员熟知的而且已经被用于将基因递送到许多种细胞，包括气管上皮，骨骼肌，肝脏，脑和皮肤中(Hitt等，1997；Anderson，1998)。

另外优选的载体是腺病毒相关病毒(AAV)载体。AAV载体是本领域技术人员熟知的而且在基因治疗的应用中已经被用于稳定转导人T淋巴细胞，成纤维细胞，鼻息肉，骨骼肌，脑，类红细胞和造血干细胞(Philip等，1994；Russell等，1994；Flotte等，1993；Walsh等，1994；Miller等，1994；Emerson，1996)。国际专利申请WO 91/18088描述了基于AAV的特异性载体。

其他优选的游离型载体包括瞬时非复制游离型载体和自我复制的游离型载体，这些载体的功能源自诸如EBV，人乳头多瘤空泡病毒(BK)和BPV-1病毒的复制起点。上述整合型和游离型载体是本领域技术人员熟知的而且在那些本领域技术人员熟知的论著中被充分描述。尤其是，合适的游离型载体描述在WO 98/07876中。

哺乳动物人工染色体也可用作本发明中的载体。哺乳动物人工染色体的应用由Calos论述(1996)。

在另外优选的实施方案中，本发明的载体是质粒。质粒可能是非复制型，非整合型质粒。

此处使用的术语“质粒”是指编码可表达基因的任一核酸而且包括线型或环形的核酸以及双链或单链核酸。核酸可以是DNA或RNA，而且可以包含修饰的核苷酸或核糖核苷酸，并且可以用上述的甲基化或保护基团或帽子或尾部结构包涵体的方法进行化学修饰。

非复制型、非整合型质粒是当被转染入宿主细胞时不复制也不特异性整合入宿主细胞的基因组的核酸(即不进行高频整合而且也不在特异位点进行整合)。

用包括Ustav和Stenlund(1991)标准的复制试验的标准试验可以鉴定复制质粒。

本发明也提供了用分离的多核苷酸或包含本发明上述多核苷酸的载体转染的宿主细胞。宿主细胞能够是任一真核细胞。优选哺乳动物细胞。更优选人体细胞而且最优选源于病人并且或在体内或在体外被转染或转导的自体细胞。

许多技术是已知的而且根据本发明可用于将此处所描述的载体递送到细胞，所述技术包括使用核酸缩合剂剂，电穿孔法，与石棉，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物，DEAE纤维素，葡聚糖，脂质体，阳离子脂质体，脂多氨，聚鸟氨酸复合，粒子轰击和直接显微注射(Kucherlapati和Skoultchi综述，1984；Keown等，1990；Weir，1999；Nishikawa和Huang，2001)。

通过病毒或非病毒的递送方法，本发明的载体可以被特异性或非特异性递送到宿主细胞(即被递送到指定的宿主细胞亚群)。病毒起源的优选递送方法包括产生病毒颗粒的包装细胞系作为本发明载体的转染受体，病毒的包装信号已经被设计到这些载体中，诸如腺病毒，疱疹病毒和乳头多瘤空泡病毒的载体。优选的基于非病毒基因递送方式和方法也可以在本发明中被使用而且包括直接裸核酸注射，核酸缩合肽和非肽，阳离子脂质体以及包封在脂质体中。

直接将载体递送到组织已被描述而且主要在近期获得一些基因的表达。直接将载体递送到甲状腺(Sikes等，1994)黑素瘤(Vile等，1993)，皮肤(Hengge等，1995)，肝脏(Hickman等，1994)以及后来暴露气管上皮(Meyer等，1995)在现有技术中已被清楚描述。直接将DNA注入肌肉显示可以长期的表达(Wolff等，1990)。

当与多赖氨酸DNA复合物共同给药时，源自病毒包膜蛋白质的氨基酸序列的各种肽已被用于基因转移(Plank等，1994；Trubetskoy等，1992；WO 91/17773；WO 92/19287)而且Mack等(1994)暗示多赖氨酸结合物与阳离子脂质的共缩合作用能够引起基因转移效率的改进。国际专利申请WO 95/02698公开了使用病毒成分以试图提高阳离子脂质基因转移的效率。

用于本发明的核酸缩合剂包括精胺，精胺衍生物，组蛋白，阳离子肽，诸如聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸的阳离子非肽。“精胺衍生物”是指精胺的类似物和衍生物而且包括国际专利申请WO 93/18759(1993年9月30日出版)阐述的化合物。

二硫键被用于连接递送载体的肽组分(Cotten等，1992)；参见Trubetskoy等(supra)。

向细胞递送DNA构建物的递送载体是本领域公知的而且包括对细胞表面受体具有特异性的DNA/聚阳离子复合物，例如Wu和Wu，1988；Wilson等，1992；以及美国专利5,166,320所描述。

根据本发明载体的递送预计使用核酸缩合肽。对缩合载体以及将载体递送到细胞特别有用的核酸缩合肽描述在国际专利申请WO96/41606中。功能基团可与用于递送本发明，载体的的肽结合，如WO96/41606所描述。这些功能基团可包括靶向特异性细胞型的配体，诸如单克隆抗体，胰岛素，转铁蛋白，脱唾液酸糖蛋白或糖。因此，配体可以非特异性方式或者根据细胞类型限定的特异性方式靶向细胞。

功能基团同样可包含诸如棕榈酰基，油基，或硬脂酰基的脂质；诸如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷(PVP)的中性亲水聚合物；诸如流感病毒HA肽的融合肽；或者重组酶或整合酶。功能基团同样可包含诸如核定位序列(NLS)的细胞内运输蛋白质，诸如膜破裂肽的核内体逃避信号，或者指引蛋白质直接进入细胞质的信号。

本发明提供了一种包含分离的多核苷酸，本发明所述的载体或者宿主细胞的药物组合物，以及药用赋形剂，载体，稀释剂或者缓冲液。

在另一方面，本发明提供了含有分离的多核苷酸，本发明所述的载体或宿主细胞以及能够由所述核苷酸或载体编码或由所述宿主细胞表达的酶转换成活性细胞毒性化合物的前体药物的组合的前体药物，作为同时，单独或者顺序用于治疗矫形植入物的无菌松弛，诸如用于完全髋关节成形术的假体的组合药物。松弛的可以是髋臼部件或者股骨部件或者二者。本发明不限于髋部假体，可应用于任一可能发生无菌松弛的骨内植入物。因此，将其用于膝，肘，肩或者任一骨骼的其他关节的关节成形术的假体应该给予特殊的正视。

上述的使用无须只限于人类的使用。该方法同样适用于动物关节假体的松弛，特别是马和狗。

优选地，上述产品的酶是硝基还原酶，更优选适用于活化CB1954的硝基还原酶。最优选前体药物是CB1954。

或者，酶是此处描述的细胞色素P450。最优选，前体药物是对乙酰氨基苯酚。

本发明更进一步的方面，提供了包含至少一种载体的组合的产品的应用，该载体包含分离的多核苷酸，编码将前体药物转变成活性细胞毒性化合物的酶，酶的表达受到可操作性连接的启动子的控制；而且前体药物能够由上述的酶转换成活性细胞毒性化合物，用于制造在矫形植入物的无菌性松弛治疗中同时，单独或者顺序使用的组合药剂。

控制前体药物转换酶表达的启动子可能是非细胞类型特异性启动子。优选，上述的启动子在各种组织和细胞中提供高水平表达。更优选，选自至少下列中的一种：CMV即时/早期启动子，RSV LTR)，鼠白血病病毒LTR，SV40早期或晚期的启动子，HSV tk启动子。在另外优选的实施方案中，启动子是人巨细胞病毒即时/早期启动子。或者，启动子是小鼠巨细胞病毒即时/早期启动子。

在用于矫形植入物的无菌性松弛的治疗中同时，单独或者顺序使用的组合药剂的生产中的优选产品中，酶的表达受到可操作性连接的启动子控制，这种可连接的启动子基本上提供了细胞类型特异性的表达。  更优选的表达限于单核细胞/巨噬细胞系的细胞或者成纤维细胞，在这种情况下，启动子被自然连接到如上所述的这些细胞系之一的细胞中选择性表达的基因。

最优选的表达限于如上所述的破骨细胞或破骨细胞前体。

优选地，酶是硝基还原酶，而且最优选适用于活化CB1954的硝基还原酶。在这种情况下，优选的前体药物是CB1954。

或者，酶可以是此处描述的细胞色素P450。在这种情况下，优选前体药物是对乙酰氨基苯酚。或者，前体药物具有通常的细胞毒性，尤其是环磷酰胺或异环磷酰胺。

本发明另外的方面提供了一种治疗矫形植入物无菌性松弛的方法，所述方法包括给病人施用编码能将前体药物转换成活性细胞毒性化合物的酶的载体，容许上述的酶在靶细胞中表达，并且施用合适的前体药物。

本领域技术人员可以认识到，通过清楚明了的临床参数可以确定剂量。然而，每个治疗的关节的优选病毒剂量在10⁵到10¹²pfu之间，更优优选在10⁶到10¹²pfu之间，更进一步优选在10⁷到10¹²pfu之间而且最优选在10⁹到10¹²pfu之间。类似地，前体药物的剂量取决于临床参数。在CB1954的情况下，优选的剂量应该在5到40mg m^-2之间，优选在5到30mg m^-2之间，更进一步优选在10到25mg m^-2之间，更优选在15到25mg m^-2之间，并且最优选的关节内注射剂量是24mg m^-2。

优选地，病毒载体不与含碘造影剂共同给药，因为这种造影剂可以抑制靶细胞的病毒转导。注射的位置由关节镜显像引导，优选进行空气关节造影，或者使用不抑制病毒转导的造影剂。

优选地，通过关节内或者假体周围注射载体进行给药。

同样优选通过关节内或者假体周围注射施用前体药物。或者，前体药物可以全身给药，更优选的是胃肠外给药。然而，一些前体药物，特别是对乙酰氨基苯酚可以口服给药。

在一个优选的实施方案中，前体药物转换酶的表达受到提供非细胞类型特异性表达的启动子的控制。在这种情况下，表达不限于特殊的组织或细胞类型。正如此处的描述，优选这种启动子在多种细胞类型中高水平的表达。合适的启动子的例子包括巨细胞病毒即时/早期启动子，Rous肉瘤病毒长末端重复序列(RSV LTR)，鼠白血病病毒LTR，猿猴病毒40(SV40)早期或晚期启动子，单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶核苷激酶(tk)启动子。

在另一优选的实施方案中，前体药物转换酶的表达受到基本上提供细胞类型特异性表达的启动子的控制。优选地，这基本上限于单核细胞/巨噬细胞系的细胞。合适的启动子描述在本发明中。或者，限于成纤维细胞中表达。更优选地，它基本上限于破骨细胞或破骨细胞前体。合适而且优选的启动子包括TRAP，RANK以及组织蛋白酶K启动子。

此处描述的优选的前体药物转换酶包括硝基还原酶，特别是那些适用于活化CB1954的酶，以及细胞色素P450酶，特别是那些最适用于将乙酰氨基酚活化为NABQI的酶。因此，优选的前体药物包括CB1954和对乙酰氨基苯酚。然而，在细胞色素P450酶的情况下，诸如环磷酰胺常规细胞毒性前体药物也是合适的。

本发明另外的方面，分离的多核苷酸，或者包含上述多核苷酸的载体或者包含二者之一的宿主细胞能够编码，或者表达对细胞有直接毒性的蛋白质或者肽。在这种情况下，不要求前体药物的给药。因为被接触面组织围绕的关节/假体周围间隙自我限制的特性，所以可以将载体引入这个病理性间隙，以致于那里的细胞被转染或转导，从而使它们表达毒性产物。能够用这种方法编码并且使用的毒素是蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，白喉毒素，假单胞菌属外毒素，脱氧核糖核酸酶，核糖核酸酶和肉毒毒素。

优选地，上述直接的毒性分子的表达受到此处描述的基本上提供细胞类型特异性表达的启动子的控制。以这种方式，毒素的表达限于靶细胞，而靶细胞由载体被引入的物理限制区域以及转染或转导的细胞表现型所限定。以这种方式，成纤维细胞，或炎症细胞诸如活化的单核细胞/巨噬细胞系的细胞，或者特异性细胞诸如对骨吸收起作用的破骨细胞及其前体细胞被靶向。

因此，可以提供编码毒性肽或蛋白质的分离多核苷酸，其中毒素的表达受到基本上提供细胞类型特异表达的启动子的控制。优选地，这样的表达限于单核细胞/巨噬细胞系的细胞中。或者，表达限于纤维母细胞中。更优选地，表达限于破骨细胞以及破骨细胞前体细胞中。如同此处所描述，合适而且优选的启动子包括c-fes和CD68启动子以提供巨噬细胞的特异性表达，而且还包括TRAP，RANK以及组织蛋白酶K启动子以提供破骨细胞的特异性表达。合适而且优选的编码的毒素包括蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，白喉毒素，假单胞菌属外毒素，脱氧核糖核酸酶，核糖核酸酶和肉毒毒素。

本发明还提供了包含上述多核苷酸的载体，以及包含分离多核苷酸或载体之一的宿主细胞以及包含此处描述的分离的多核苷酸或者载体的药物组合物以及药用赋形剂，载体，稀释剂或者缓冲液。

在另外的实施方案中提供了包含分离的多核苷酸，编码或表达此处描述的毒性肽或蛋白质的载体或者宿主细胞的产品作为矫形植入物无菌性松弛治疗的药剂。上述的表达可受到在多种细胞中提供高水平表达的非细胞类型特异性启动子的控制。优选地，上述的表达受到此处描述的基本上提供细胞类型特异性表达的启动子的控制。

本发明还提供了这种产品在制造用于矫形植入物的无菌性松弛治疗的药剂中的应用。

在另外的方面，本发明提供了用于治疗矫形植入物无菌性松弛的试剂盒，包含：

a)药用缓冲液中编码能够将前体药物转换成活性细胞毒性化合物的酶的分离的多核苷酸或者载体，所述酶的表达受到可操作性连接的启动子的控制；

b)药用缓冲液中可被上述酶转换成活性细胞毒性化合物的前体药物；

c)药用缓冲液中组织消化液，包含至少一种选自胶原酶，弹性蛋白酶，透明质酸酶的酶；和/或诸如EDTA，EGTA等的螯合剂；

d)适用于上述矫形植入物重新装设的接合剂。

发明详述

附图说明

图1描述了髋部假体的无菌性松弛。A是松弛的假体的原位放射照片。B是髋关节松弛假体的关节造影片。在荧光镜指导下造影剂被注入关节间隙内。该图显示假体周围的一部分区域(假体周围区域)被造影剂填充。这证明假体的那个区域是松弛的。C显示的是髋关节松弛假体的示意图。灰色区域象表示与假体周围区域相连的关节间隙。

当液体注入关节间隙内时，液体将扩散通过影像中标记的灰色区域。

图2显示硝基还原酶编码的腺病毒载体感染而且随后暴露于实施例3中描述的两个校正手术病人获得的组织接触面细胞中显示的浓度的前体药物CB1954的杀伤效果。图2a显示的数据来自病人LI003 P3而图2b显示的数据来自病人LI002 P4。

图3显示实施例4描述的被不同剂量的Lac Z编码的腺病毒载体感染的病人LI014获得的完整的接触面组织样本的X-Gal染色的结果。

编号的孔含有进行如下处理的组织：

1.未感染的接触面组织

2.接触面组织+3.6×10⁴pfu Ad.CMV.LacZ

3.接触面组织+3.6×10⁵pfu Ad.CMV.LacZ

4.接触面组织+3.6×10⁶pfu Ad.CMV.LacZ

5.接触面组织+3.6×10⁷pfu Ad.CMV.LacZ

6.接触面组织+3.6×10⁸pfu Ad.CMV.LacZ

7.接触面组织+3.6×10⁹pfu Ad.CMV.LacZ

图4显示在与6种不同浓度的Ad.CMV.LacZ(0，25，50，100，200以及400pfu/细胞)一起温育后接触面细胞的转导个。三天后，固定细胞并用X-gal反应混合物进行染色。计数转导细胞(蓝色)的百分比。该图显示了12个独立实验的平均值和标准差。

图5显示接触面细胞上缺乏碘曲伦(iotrolan)(Isovist)造影剂的毒性。接触面细胞暴露于造影剂(碘曲伦)4小时。细胞培养3天后测量细胞的存活率(n＝12)。

图6显示碘曲伦对HAdV5转导的接触面细胞的影响。细胞被暴露于不同浓度的Ad.CMV.LacZ：((▲)0pfu/细胞，(■)25pfu/细胞；(●)100pfu/细胞；(◆)200 pfu/细胞。(n＝4))以及造影剂4小时，之后固定细胞并用X-gal染色。通过计数蓝色细胞来测定转导的细胞的百分比。

图7显示病人1注射前(A)和注射后(B)的图像，显示在较大的转子区接合剂的量增加。

图8显示病人2注射前(A)和注射后(B)的图像。

实施例1用CTL102(Ad5-NTR和CB1954)的治疗程序

材料

药物产物CTL102注射剂是无菌，澄清或者目测澄清的水溶液，含有CTL102病毒颗粒，标称平均效价为2×10¹¹个颗粒/ml，在pH 7.4缓冲。

CB1954在溶剂(N-甲基吡咯烷酮∶聚乙二醇，2∶7 v/v，含17.8mg的CB1954/ml)被配制成无菌溶液。使用之前，将溶剂中的前体药物在无菌的盐水中稀释至CB1954的最大终浓度为5mg/ml。

为了稳定假体，使用低粘度的骨接合剂(含有妥布霉素的SimplexeP，获自Howmedica公司，Rutherford，NJ，美国)。这种不透射线的骨接合剂是流体单体组分(2ml 97.4％甲基丙烯酸甲脂，2.6％N，N-二甲基-对-甲苯胺，75ppm氢醌)和聚合物粉末(6g聚甲基丙烯酸甲酯，30g甲基丙烯酸甲脂-苯乙烯共聚物，4g硫酸钡，1g妥布霉素硫酸盐)的混合物。组分在使用前立即在真空中混合(0.9巴，1分钟)。

对于关节造影，使用Hexabrix320(碘克沙酸葡胺钠葡甲胺(ioxaglate sodium meglumine)，Guerbet，Roissy Charles de GaulleCedex，法国)造影剂。

过程

在仔细冲洗关节除去滑液和可能含有中和抗腺病毒抗体的炎症渗出液之后，将3×10⁹pfu CTL102注入关节腔内将载体递送到整个假体周围区域的细胞。48小时后，为了使靶细胞转导以及硝基还原酶转基因表达，关节内注射CB1954(剂量为24mg/m²)。为了确保CTL 102和CB 1954自由进入假体周围区域，优选选择关节造影片显示假体周围存在造影剂的病人。因此，病人通常很可能经历三次关节造影(一次为了确保造影剂的进入，一次为了注入病毒载体，以及一次为了注入CB1954前体药物)。

在一些情况下，通过适当的冲洗或者物理的清创，数天后坏死的接触面组织可以被除去。当接触面组织被成功缩小时，假体被重新装设。为了将假体重新锚定到骨，将接合剂注入假体周围区域。为了冲洗假体周围区域和注入接合剂，钻大量通经过骨进入假体周围区域的孔。这取决于所使用的假体的设计。在许多通常的设计中，最少是四个孔，因为在三维空间内固定股骨部件必须需要三个孔而固定髋臼需要一个孔。因为骨活检相当痛苦并且骨不能被局部麻醉，所以这些过程是在全身麻醉或脊髓麻醉下进行的。

实施例2 CTL102(Ad5-NTR)的生产

材料和方法

如Djeha等(2001)所述，CTL102是在PerC6辅助细胞中通过同源重组而构建的。用转移载体pTX0375和骨干载体pPS1160的等克分子混合物与lipofectamine转染试剂(Life Technologies)复合进行以90％的铺满培养转染细胞。

pTX0375分两个阶段构建：(i)融合到NTR基因的CMV启动子/增强子作为1.5kb BamH1-部分Bglll片段从pTX0340切下而且被克隆到pSW107的独特BamHI位点，pSW107是含有人b-球蛋白IVS II的基于pBluescript的载体(Stratagene)，而人b-球蛋白IVS II融合到临近BamHI位点的人补体2基因的聚腺苷酸化序列。在需要的方向中含有CMV.NTR片段的质粒pTX0374通过使用退火形成CMV启动子/增强子的T3引物(5′-ATTAACCCTCAC-TAAAG-3′)以及NTR引物，ECN2(5′-TCTGCTCGGCCTGTTCC-3′)的PCR进行鉴定。(ii)全部的NTR表达盒作为2.5kb Spel片段从pTX0374切下而且从左到右的方向根据Ad5序列被克隆到E1-缺失的腺病毒转移载体pPS1128的独特SpeI位点。pPS1128是基于pUC19的质粒，含有从左手ITR到融合于NT3525-10589的核苷酸(nt.)359的Ad5序列。

通过pPS1128的Pacl线性化，用含有XbaI位点的PacI相容的连接物(5′-TACATCTAGATAAT-3′+5′-P-TTATCTAGAT-GTA-3′)连接，接着用XbaI消化释放含有Ad5序列3524-10589的7-kb XbaI片段，构建pPS1160。然后克隆入XbaI线性化的pPS1022，它是基于pUC19的质粒，含有从nt.10589到右手ITR的Ad5序列但缺少NT 28592到30470(E3区域)。在需要的方向，含有该片段的重组体通过使用在10589侧接XbaI位点的引物(向右，5′-TCGAGTCAAATACGTAGTCGT-3′；向左，5′-TGTTTCCGGAGGAATTTGCAA-3′)的PCR进行鉴定。通过HindIII和PstI的消化，质粒pPS1160/18被证实含有XbaI片段(pPS1160/18)的单一拷贝。

随着感染培养基中(DMEM，1％FCS，2mM MgCl₂)中大量CPE(转染后大约7-9天)和三个冻融循环释放的重组病毒的出现，收获转染的PerC6细胞。在PerC6细胞上噬菌斑纯化两轮后，病毒大规模生长而且通过CsCl密度离心进行纯化。将离心呈条带的病毒在过量的储存缓冲液中(10mM Tris，pH 7.4，140mM NaCl，5mM KCl，0.6mMNa₂HPO₄，0.9mM CaCl₂，0.5mM MgCl₂以及5％蔗糖)透析，等分样品在液氮中迅速冷冻，并在-280℃中储存。用BCA蛋白质分析试剂(Pierce，Rockford，IL)以及1mg/ml＝3.4×10¹²病毒颗粒/ml的换算系数测定粒子浓度。用菌斑分析确定传染的滴度。通过用蛋白酶K/SDS消化，石炭酸-氯仿萃取，以及乙醇沉淀和限制性消化表征，从离心呈条带的腺病毒分离基因组DNA。

实施例3  用CTL102和CB1954杀伤取自病人的接触面组织

为了证明使用病毒递送的酶前体药物系统杀伤接触面细胞的可行性，将取自校正手术过程中两个病人的细胞进行体外培养，在MOIs范围内用CTL102温育而且随后暴露于CB1954。然后利用代谢活性分析确定细胞的存活率。

方法

接触面组织样本

对于所有描述的实验，施用接触面细胞。在校正手术过程中由矫形外科医生从假体周围区域取出接触面组织并收集在无菌磷酸盐缓冲盐水中(PBS)。完全除去结缔组织和脂肪并在37℃利用胶原酶1A(1mg/ml；Sigma，St Louis，MO，USA)消化接触面组织至少2小时。然后用200μm过滤器(NPBI，Emmer-Compascuum，荷兰)过滤组织/胶原酶物质收获细胞。细胞在37℃，5％CO₂条件下，用补充有glutamax(GibcoBRL，Paisley，英国)，青霉素和链霉素(Boehringer Mannheim，德国)，以及10％胎牛血清(FCS；GibcoBRL，Paisley，英国)Iscove的改性Dulbecco′s培养基(IMDM；Biowitthaker，Verviers，比利时)在75cm²的玻璃瓶(Cellstar，Greiner，Alphen aan de Rijn，荷兰)中培养。

在每个实验之前，用0.25％胰蛋白酶(GibcoBRL，Paisley，英国)将接触面细胞从玻璃瓶中剥离。在b

rker计数器中对细胞计数并由锥虫蓝排除死亡的细胞。将细胞接种于96孔板(平底)中，密度为每个孔5,000个细胞。细胞温育过夜使其附着于瓶底。在每个实验之前，每个孔用IMDM冲洗两次。试验中使用传代2到4次的接触面细胞。光学显微镜检查显示超过95％的细胞为接触面细胞。

转导以及细胞杀伤分析方案

第0天：来自2个病人的接触面细胞以5000个细胞/孔接种于96孔板的IMDM(10％FCS)中，每孔100μl。

第1天：用在IMDM(10％FCS)中的CTL102(或稀释剂)以0，1，5，25，100，200IU/细胞感染细胞，每孔50μl。

第2天：细胞用IMDM(10％FCS)冲洗两次，此后细胞与CB1954(或介质)以0，0.1，0.5，1，5和50μM在IMDM(10％FCS，10％HS)中温育2小时或24小时，每孔50μl。

第2/3天：细胞用IMDM(10％FCS)冲洗一次，然后温育在IMDM(10％FCS，10％HS)中中，每孔5μl。

第4天：照相。用IMDM(10％FCS)更新培养基，添加10μl WST试剂(Roche)并温育培养板2小时。此后在415nm测定吸光度。

结果

如图2A和2B所示，从两个病人的细胞中可观察到病毒和CB1954剂量依赖性的杀伤。重要的是，使用病毒和CB1954剂量(200个病毒pfu/细胞和浓度为50μM的CB1954)可以观察到90％的杀伤效率，而这个剂量对临床来说是很容易实现的。

这些结果证明接触面细胞可以被HAdV-5-载体转导而且能够通过NTR/CB1954方法杀伤。人腺病毒5能够感染大量的包括成纤维细胞和巨噬细胞在内的人分裂和不分裂的细胞(Dieha等，2001)。

在此之前在不同的细胞系中，用不同的方法已经对GDEPT杀伤细胞进行了研究。NTR/CB 1954方法对于临床评估是有吸引力的，原因如下：(1)它产生既能杀伤分裂的细胞又能杀伤不分裂的细胞的毒剂，(2)通过p53独立机制可诱导细胞死亡，以及(3)人对CB1954有良好的耐受性(Djeha等，2001)。用NTR/CB1954方法杀伤细胞在多种人癌细胞中被证明有效(Chung-Faye等，2001；Bilsland等，2003，Green等，2003；McNeish等，1998；Shibata等，2002；Weedon等，2000；Wilson等，2002)，但是这种方法在滑膜或接触面细胞中的作用先前尚未被研究。目前的研究表明接触面细胞可以通过NTR/CB1954方法有效杀伤。

2到4次传代的接触面细胞被用于目前的研究。使用这些传代细胞可以最大限度地减少培养物的假象。一方面，较少次数的传代细胞中(0到1代)，具有存在污染细胞(特别是巨噬细胞)的危险，而较多传代次数的传代细胞中这种危险可被降低。另一方面，较多传代次数的传代细胞中存在体外显著改变/生长选择的危险(特别是在多于4代的传代细胞中)(Zimmerman等，2001)。在目前的研究中，使用培养的不同病人的接触面细胞。为了解释结果，合并所有病人的数据。然而，必须注意观察到转导率的个体差异。

实施例4  腺病毒载体有效感染完整的接触面组织

实施例3中概述的实验证实培养的接触面细胞是可以被Ad5感染的。然而，当细胞存在于完整的组织内时，例如通过细胞外基质和病毒低速率扩散通过细胞外间隙可以阻止病毒进入细胞表面。鉴于此，用表达LacZ的腺病毒以及Xgal染色的表达LacZ的组织来检测新鲜完整的接触面组织的感染率。用这种方法，观察到基因表达中病毒剂量依赖的增加，所检验的两个最高的病毒剂量表现显著水平的基因表达(图3)。

方法

接触面组织(LI014)获自类风湿性关节炎病人的髋部校正手术。组织被切成7块而且各块被装入10ml的圆底试管中。添加200μlIMDM/10％FCS中不同浓度的Ad.CMV.LacZ(0，3.6×10⁴，3.6×10⁵，3.6×10⁶，3.6×10⁷，3.6×10⁸，3.6×10⁹pfu)。组织在37℃温育2小时，每10到15分钟振动试管一次。此后添加5ml的IMDM/10％FCS，温育过夜后，用3×PBS漂洗组织而且随后被置入5ml Xgal染色液中并在37℃温育3.5小时。用3×PBS漂洗组织并固定在10％福尔马林中。

结果

被加入最高量Ad.CMV.LacZ的组织出现深蓝色的染色区域，在降至用3.6×10⁷pfu Ad.CMV.LacZ感染是明显的。证明在完整的接触面组织中细胞的感染是有效的。在显微镜下检查组织的石蜡包埋切片并且证实存在染色的被感染的细胞。

实施例5  接触面组织的转导以及造影剂的影响

为了进一步测试接触面细胞对基于人腺病毒5(HAdV-5)的载体的易感性，将原代培养的接触面细胞暴露于HAdV-5载体Ad.CMV.LacZ。感染后24小时，用X-gal溶液对细胞染色检测β-半乳糖苷酶报道基因的表达。转导效率随着载体浓度的增加而增加。在400噬菌斑形成单位/细胞中表达受体基因的细胞的百分比是88％(标准差为4.0)(图4)。因此HAdV-5载体能转导接触面细胞。

材料和方法

腺病毒载体

Ad.CMV.LacZ(van der Eb等，2002)载体与CTL102相同，只是用E.coli lacZ基因替换了ntr基因。

转导试验

为了研究HAdV-5对接触面细胞的转导率，用Ad.CMV.LacZ载体(浓度为0，25，50，100，200，400pfu/细胞)感染接触面细胞。感染后24小时，用IMDM冲洗细胞两次，并培养两天。每天更新培养基。第3天，用PBS冲洗单层培养物两次并且用在PBS中的0.2％戊二醛和2％甲醛4℃固定10分钟。随后细胞用PBS冲洗两次并且在50μl的反应混合液中(PBS中1mg/ml X-gal(Eurogentec，Seraing，比利时)，5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，2mM MgCl₂)在37℃染色2小时测定β-半乳糖苷酶的活性。用光学显微镜检查计数至少100个接触面细胞来评定转导细胞的百分比。所有的条件都一式两份进行试验。

造影剂对接触面细胞的影响

接触面细胞接种至96孔板内。每个孔中加入50μl IMDM/20％FCS和50μl含有不同浓度的造影剂和0.9％NaCl的溶液(0，12.5，25，以及50％的造影剂)。所使用的造影剂是低重量克分子渗透浓度(osmolarity)，非电离的碘曲伦二聚体(碘曲伦；Schering，Berlin，德国)。暴露于造影剂4小时后，冲洗细胞两次并孵育在IMDM/10％FCS中。细胞培养3天以上，每天更换培养基。第4天，根据厂商的说明书用WST-1细胞存活率分析试剂盒(Roche，Mannheim，德国)确定细胞的存活率。

造影剂对HAdV-5转导接触面细胞的影响

接触面细胞接种在96孔板内。孵育过夜后用IMDM/20％FCS中的Ad.CMV.LacZ(浓度为0，25，100，以及200pfu/细胞)感染细胞，每孔中50μl。添加浓度为0，25，50，以及100％的50μl碘曲伦(碘曲伦)的0.9％NaCl溶液。(当在培养基中稀释时，浓度减少至0，12.5，25以及50％)。感染后4小时，用IMDM冲洗细胞两次并且这天剩余的时间在37℃以及5％CO₂条件下于IMDM/10％FCS中温育细胞。除去载体和造影剂后培养Ad.CMV LacZ转导的细胞3天。接着，固定细胞并染色测定β-半乳糖苷酶的活性。如上所述评估转导率。

统计分析

方差和Spearman’s相关性的单变量分析被用来研究载体和前体药物之间以及载体和造影剂之间的相互作用以及研究CB1954对细胞存活率的影响。进行独立组的Mann-Whitney试验来确定暴露于造影剂的细胞和未暴露的细胞之间细胞杀伤的差异。在研究瞬时暴露于造影剂对HAdV-5载体转导的影响的实验中，检验接触时间和存活率之间以及延迟时间和存活率之间的Spearman’s相关。在所有统计分析中，p＜0.05是统计显著的水平。

结果

造影剂对接触面细胞的影响

评价造影剂(碘曲伦)对接触面细胞的毒性(图5)。任一浓度的碘曲伦不影响细胞的存活率(p＝0.563)。对接触面细胞增加造影剂4小时不会引起杀伤细胞。

造影剂对HAdV-5转导的接触面细胞的影响

用Ad.CMV.LacZ来研究造影剂(碘曲伦)对HAdV5转导的接触面细胞的影响。细胞的转导率随着HAdV-5载体浓度的增加而增加。然而，造影剂对转导率有抑制作用。较高浓度的碘曲伦时，HAdV-5载体浓度对基因转移效率的影响较少。造影剂浓度为50％时，没有细胞被转导(图6)。碘曲伦对转导的影响统计上是显著的(p＜0.001)。此外，已经观察到来自不同个体(n＝6)细胞间的差异。为评价造影剂对NTR/CB1954杀伤细胞的影响，在造影剂存在的情况下重复先前描述的杀伤细胞的效率实验。结果表明在造影剂存在的情况下，细胞不被NTR/CB1954方法杀伤(结果未显示)。Hexabrix320造影剂的存在同样抑制病毒转导(数据未显示)。总之，这些实验的结果证明病毒给药与两种通常使用的造影剂协同给药的不相容性。这种不相容性可能是由于造影剂中存在碘的缘故。筛选所有可用的造影剂可以确定与病毒转导相容的造影剂。

研究瞬时暴露于造影剂对接触面细胞转导的影响。接触面细胞暴露于造影剂0到120分钟而且改变冲走造影剂与进行NTR/CB1954杀伤细胞方法之间的时间。细胞杀伤与接触时间(corr-0.033，p＝0.691)或者冲走造影剂与添加载体之间的时间长度(corr-0.004，p＝0.962)不相关。未暴露于造影剂和瞬时暴露于造影剂的细胞的杀伤是相当的。

讨论

在这个研究中，为了未来的临床研究，深入研究了造影剂对NTR/CB1954杀伤细胞的影响。结果表明造影剂对接触面细胞似乎没有任何的影响。然而，在造影剂存在的情况下，腺病毒载体转导细胞几乎是可以忽略的。腺病毒载体在造影剂存在的情况下被灭活。在假定的临床研究中，病毒载体被注入关节腔内。通常，造影剂被用来证实注射针在关节中的位置。然而研究结果表明不主张造影剂与病毒载体的联合使用。因此，对于临床研究，我们建议采用替代目测注射针的方法，诸如注入空气来产生“空气关节造影片”。

总之，这个实施例显示接触面细胞可被NTR/CB1954酶前体药物法杀伤。

实施例6  临床结果

可从12个经受使人虚弱的疼痛和显著病态的髋部松弛的第1阶段研究的最初的两个病人获得数据。如上所述，在第1天载体注入髋关节，而在第3天注射前体药物。第10天，在股骨上钻3个孔而在髋臼上转1个孔。从假体周围区域采集活组织并在荧光显微镜下注入低粘度的接合剂(Osteopal，Biomet Merck，Sjbo，瑞典)。

病人1是一位82岁的ASA IV型(死亡危险率为20.3％，美国麻醉医师协会的身体状况评分的标准(American Society ofAnesthesiologists physical status classification)，Saklad，Saklad，1941)双髋假体松弛的女性。注入载体(3×10⁹颗粒)没有副作用而且注入24小时后没有检测到病毒的释放。前体药物注入12小时后，病人感觉恶心，(WHO 1级)，这是已知的对前体药物的反应。髋部疼痛增加是可以预见的，因为最初治疗的目的是加重松弛。将16ml接合剂注入到假体周围区域(参见图7B)表明接触面组织的显著破坏并产生一个接合剂可以进入的空隙。手术后次日移走病人。

注入接合剂后2和4周，病人不会感到被治疗的髋关节疼痛，而且病情逐渐改善。最远的步行距离从4-5米增加到30米。病人主观评定的步行距离从4米增加到66米(0：0米，100：不受限制的步行距离)。病人的疼痛值从手术前的81降低到2(0：无疼痛，100：无法忍受的疼痛)。此外，她现在可以侧卧睡觉而不感到疼痛，她已经有4年不能侧卧睡觉了。根据可感觉到的依赖性(0：完全依赖别人，100：完全独立)数值从95降至54。

病人2是一位72岁左侧髋部假体松弛的妇女而且ASA分类为II型(死亡危险率为2.8％)。注入载体24小时后又一次没有检测到病毒的释放。根据相似的过程，注射18ml的接合剂(图8B)。治疗后4周疼痛值从43降至22(或许反映了手术后血肿的存在，血肿消散需要4-5周)。特别是髋关节相关的疼痛消失。最远的步行距离从500米增加到2000米。在接下来的3个月，血肿完全消散而且疼痛值进一步降至7。从行走表现以及其它活动的角度来看病人继续在改善。

目前的研究是体内关节内腺病毒介导的基因转移在临床研究中的首次应用。初步的结果暗示对于髋部假体重新装设的基因治疗和接合剂注入在临床上是可行的。

参考文献

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Claims (19)

1.包含如下组合的产品在生产用于同时，单独或者顺序用于矫形植入物的无菌性松弛治疗的组合药剂中的应用：

a)至少一种载体，其包含编码硝基还原酶的分离的多核苷酸，硝基还原酶的表达受到可操作性连接的启动子的控制；以及

b)前体药物CB1954，其能够由上述硝基还原酶转换成活性细胞毒性化合物。

2.权利要求1的产品的应用，其中启动子提供了非细胞类型特异性的表达。

3.权利要求2的产品的应用，其中启动子是巨细胞病毒启动子。

4.权利要求1的产品的应用，其中启动子提供了细胞类型特异性的表达。

5.权利要求4的产品的应用，其中表达限于单核细胞/巨噬细胞系的细胞。

6.权利要求5的产品的应用，其中表达限于破骨细胞和破骨细胞前体细胞。

7.权利要求6的产品的应用，其中启动子被自然地功能性连接于选自TRAP，RANK和组织蛋白酶K的基因。

8.权利要求1至7任一项的应用，其中载体是病毒载体。

9.权利要求8的应用，其中病毒载体选自腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒和慢病毒。

10.包含如下组合的产品在生产用于同时，单独或者顺序用于矫形植入物的无菌性松弛治疗的组合药剂中的应用：

a)分离的多核苷酸，其编码硝基还原酶，硝基还原酶的表达受到可操作性连接的启动子的控制；或者宿主细胞，其包含所述的分离的多核苷酸；或者药物组合物，其包含所述的分离的多核苷酸，或者包含所述的分离的多核苷酸的载体或宿主细胞；以及

b)前体药物CB1954，其能够由上述硝基还原酶转换成活性细胞毒性化合物。

11.用于治疗矫形植入物的无菌性松弛的试剂盒，包含：

a)药用缓冲液中的分离的多核苷酸或者载体，其编码硝基还原酶，所述酶的表达受到可操作性连接的启动子的控制；

b)药用缓冲液中的前体药物CB1954，其能够由上述硝基还原酶转换成活性细胞毒性化合物；

c)药用缓冲液中的组织消化溶液，包含至少一种选自胶原酶，弹性蛋白酶和透明质酸酶的酶；

d)适于所述矫形植入物重新装设的接合剂。

12.权利要求11的试剂盒，其中启动子提供了非细胞类型特异性的表达。

13.权利要求11的试剂盒，其中启动子是巨细胞病毒启动子。

14.权利要求11的试剂盒，其中启动子提供了细胞类型特异性的表达。

15.权利要求11的试剂盒，其中表达限于单核细胞/巨噬细胞系的细胞。

16.权利要求11的试剂盒，其中表达限于破骨细胞和破骨细胞前体细胞。

17.权利要求11的试剂盒，其中启动子被自然地功能性连接于选自TRAP，RANK和组织蛋白酶K的基因。

18.权利要求11的试剂盒，其中载体是病毒载体。

19.权利要求11的试剂盒，其中病毒载体选自腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒和慢病毒。

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