JP2021130659A - ＡｕＣ含有物質、並びにその製造方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】金クラスター及び金クラスター含有物質の医薬品使用、並びにそれらの製造方法及び使用を提供する。【解決手段】ＡｕＣとＡｕＣの外側を覆うリガンドＹとを含む、ＡｕＣ含有物質であって、ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満、好ましくは０．５ｎｍ〜２．６ｎｍであり、リガンドＹは、例えば、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、並びにその他のチオール含有化合物の１つ以上を含む、ＡｕＣ含有物質である。開示されたＡｕＣ及びＡｕＣ含有物質は、Ａβ及びα−ｓｙｎの凝集を阻害することができ、細胞モデル及び動物モデルのレベルで優れた効果を有し、かつアルツハイマー病及び／又はパーキンソン病を予防及び治療するための薬物を製造するために使用することができる。【選択図】図１２

Description

本発明は、ナノメートルのナノ薬物の技術分野に関し、特に金クラスター（ＡｕＣ）含有物質、並びにその製造方法及びその使用に関する。

神経変性疾患は、ヒトの健康への大きな脅威の１つである。それらの共通した病理学的特徴は、タンパク質の異常な絡み合い及び神経細胞におけるそのアミロイドーシス、並びに関連する神経細胞アポトーシス及び神経学的障害である。アルツハイマー病（ＡＤ）及びパーキンソン病（ＰＤ）は、その中でも最も典型的な２つである。ＡＤの臨床徴候は、記憶機能障害及び認知機能障害並びに人格及び行動の変化を特徴とする一方で、ＰＤの臨床徴候は、主として振戦、運動緩慢、筋硬直、起立性歩行障害、及びその他の運動障害を含む。ＡＤ及びＰＤは両方とも主として高齢者の間で起こり、年齢と共に罹患率は高まる。ＡＤを例にとると、６５歳を超えた人達の間での罹患率は５％であるが、８０歳を超えた人達の間では３０％を上回る。したがって、これらの２つの疾患を患う患者の数は、寿命が延長して人口の高齢化が高まるにつれ絶え間なく増加している。特に群を抜いてＡＤには４千万人を超える患者が罹患しており、２０５０年には１億５千万人に達すると考えられる。米国だけでも、年間に癌の２倍にあたる２０００億米ドル超がＡＤ患者の治療に費やされており、それは世界で最も費用のかかる疾患となっている。世界のＰＤ患者の数は、控えめに見積もっても１０００万人を超えている。しかしながら、これらの２つの疾患の病因は未だに知られていない。臨床的治療に関しては、軽度及び中等度のＡＤ又はＰＤの治療のために幾つかの薬物が米国ＦＤＡにより承認されているが、これらの薬物は、患者の認知機能又は運動機能を一時的にしか改善し得ない神経伝達物質調節薬である。それらの薬物を中断するとすぐに症状が元に戻ることとなる。今までのところ、これらの２つの疾患の病理学的過程を終結又は回復させることができる薬物は存在しない。したがって、ＡＤ又はＰＤの治療のための新たな薬物を開発することは極めて意義のあることである。

研究により、ＡＤ患者の脳内のアミロイドタンパク質は、主としてβ−アミロイド（Ａβ）タンパク質及びタウタンパク質、並びに少量のα−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）であり、初期発症部位は、脳内の記憶及び学習並びに空間定位の機能を発揮する海馬であることが分かっている。ＰＤ患者の脳損傷は、体性運動機能に役割を担う黒質から始まる。初期発症部位の違いがこれらの２つの疾患を伴う患者の異なる症状を決定づける。しかしながら研究により、ＡＤ患者の半分より多くが後期段階に運動障害を伴い、殆どのＰＤ患者も後期段階にＡＤ患者と同じ症状を共有することが指摘されている。これらの現象は、上記２つの疾患が発症原因及び疾患進行に固有の相関があることを示唆している。

脳内の老人斑の形成は、ＡＤの基本的な病理学的特徴の１つである。老人斑における主要構成物質として、Ａβは３６個〜４３個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、該ポリペプチドはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の加水分解産物であり、その際、Ａβ（１−４０）の含量はＡβの全体量の９０％超を占めている。最近の研究により、Ａβは正常な生理学的機能を有し、コリンエステラーゼの触媒活性の調節によりシナプス間のアセチルコリン作動性シグナル伝達を調節することができるが、脳内のＡβの過剰な凝集及び線維化は、シナプス機能不全と、引き続いての二次的な炎症応答とを引き起こす場合があり、こうしてニューロン機能の喪失及びニューロン死がもたらされることが明らかになった。したがって、Ａβの凝集及び線維化を阻害し得るとともに、その神経毒性を遮断し得る物質の開発は、ＡＤ医薬の研究及び開発のための重要なアプローチの１つである。

ＰＤの病理学的特徴は、レビー小体の生成を伴って、主として黒質線条体系におけるドーパミン（ＤＡ）作動性ニューロンの進行性消失として現れる。レビー小体は、主として変性されたα−ｓｙｎの凝集により形成される中空の放射状のアミロイド線維を含む。α−ｓｙｎは、ニューロンのシナプス前膜終末に位置し、上記小体中での自然状態は、可溶性の未フォールディング状態である。α−ｓｙｎのミスフォールディングは病理学的状態のもとに起こり、それによりβ−シート構造物が生じ、該構造物が更に凝集され、フィブリル化されることで、レビー小体病変が形成される。研究により、α−ｓｙｎのアミロイドーシスは、該疾患の病理学的過程に主要な役割を担うことが指摘されている。したがって、α−ｓｙｎの凝集及び線維化の阻害は、ＰＤの予防及び治療のための医薬の研究及び開発におけるアプローチの１つとなっている。他方で、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は神経毒である。ＭＰＴＰ自体は毒性ではないが、脳に入った後にその代謝から生成される１−メチル−４−フェニルピリジンカチオン（ＭＰＰ^＋）が黒質中のＤＡ作動性ニューロンを破壊し得る。同時にＭＰＰ^＋は、ミトコンドリア代謝の呼吸鎖における重要な物質であるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを妨害し得るため、それにより細胞死及びフリーラジカルの蓄積が引き起こされる。この過程により引き起こされるＤＡ作動性ニューロンの大量死は、大脳皮質の運動制御に重大な影響を及ぼすため、ＰＤと同様の症状がもたらされる。したがって、ＭＰＴＰ及びＭＰＰ^＋は、ＰＤ関連動物モデル及び細胞モデルの樹立、並びにＰＤ医薬の研究及び開発において広く使用される。

金ナノ粒子はナノスケールの金粒子である（研究で使用される金ナノ粒子の金コアの直径は、一般的に３ｎｍより大きい）。独特の光学的特性及び電気的特性、良好な生体適合性、並びに簡便な表面修飾のため、金ナノ粒子は、生物学及び関連の医療分野、例えばバイオセンサ、医用イメージング、及び腫瘍検出において広く使用される。化学的不活性及び大きな比表面積及び低濃度での血液−脳関門の透過能力により、金ナノ粒子は、薬物の指向性輸送及び制御可能放出等の研究における薬物担体としても使用される。近年では、金ナノ粒子と、線維性タンパク質の凝集を阻害する特定のリガンド（例えば、ヘテロポリ酸及び特定の配列のポリペプチド）との結合について研究がなされ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質線維化阻害実験において一定の効果を上げている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、細胞モデルの結果により、金ナノ粒子（金コアサイズは５ｎｍ超である）が、フィブリン損傷細胞に対して保護効果を有する化合物と一緒に使用される場合に、細胞生存性に相乗効果が見られるが（非特許文献４）、それらが単独で使用される場合にはその効果は明白ではないことが示されている。動物モデルのレベルでのＡＤ実験は、まだ報告されていない。さらに、これらの研究では、金ナノ粒子は、主として有効成分としてではなく薬物担体として使用された。

金クラスター（ＡｕＣ）は、金コアの直径が３ｎｍ未満である超微細な金ナノ粒子である。それは数個だけの金原子ないし数百個の金原子を含み、従来の金ナノ粒子中の金原子の面心立方充填構造の崩壊及びエネルギー準位の分裂が引き起こされ、こうして３ｎｍを上回る従来の金ナノ粒子とは全く異なる分子様の特性を示す。一方で、エネルギー準位の分裂のため、ＡｕＣは、表面プラズモン効果及び従来の金ナノ粒子で得られる光学的特性を有さずに、半導体量子ドットと類似した優れた蛍光発光特性を示す。他方ではＡｕＣの紫外−可視吸収スペクトルにおいて、５２０±２０ｎｍでのプラズモン共鳴ピークが消失し、その一方で１つ以上の新たな吸収ピークが５６０ｎｍより高いところで現れるが、そのような吸収ピークは、従来の金ナノ粒子では観察することができない。したがって、紫外−可視吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴吸収ピーク（５２０±２０ｎｍ）の消失及び５６０ｎｍより高いところでの新たな吸収ピークの出現は、ＡｕＣの製造に成功したかどうかを判断するための重要な指標である（非特許文献５）。ＡｕＣはまた、従来の金ナノ粒子とは大幅に異なる磁気的特性、電気的特性、及び触媒的特性、並びに光熱効果を有するため、ＡｕＣは、単分子光電子工学、分子触媒作用、及び光熱変換の分野において
広い応用の見通しがある。

さらに、ＡｕＣはまた、それらの優れた蛍光発光特性のためバイオプローブ及び医用イメージングの分野においても使用されている。例えば、Sandeep Vermaのチームは、核イ
メージングのための緑色蛍光プローブとしてプリン修飾されたＡｕＣを使用している（非特許文献６）。この種類の文献は、ＡｕＣの蛍光特性を利用するものであり、ＡｕＣ自体の医薬活性を必要とするものではない。

Y. H. Liao, Y. J. Chang, Y. Yoshiike, Y. C. Chang, Y. R. Chen, Small 2012, 8, 3631 Y. D. Alvarez, J. A. Fauerbach, J. V. Pellegrotti, T. M. Jovin, E. A. Jares-Erijman, F. D. Stefani, Nano Letters 2013, 13, 6156 S. Hsieh, C. W. Chang, H. H. Chou, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2013, 112, 525 N. Gao, H. Sun, K. Dong, J. Ren, X. Qu, Chemistry-A European Journal 2015, 21, 829 H.F. Qian, M.Z. Zhu, Z.K. Wu, R.C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470 J. R. Wallbank, D. Ghazaryan, A. Misra, Y. Cao, J. S. Tu, B. A. Piot, M. Potemski, S.Wiedmann, U. Zeitler, T. L. M. Lane, S.V. Morozov, M. T. Greenaway, L. Evaes, A. K. Geim, V. I. Falko, K. S. Novoselov, A. Mishchenko, ACS Applied Materials & Interfaces 2014, 6, 2185

本発明の目的は、従来技術における技術的不利点に取り組むことである。

第１の態様においては、本発明は、ＡｕＣとＡｕＣの外側を覆うリガンドＹとを含む医薬活性を有するＡｕＣ含有物質を提供する。

上記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満、好ましくは０．５ｎｍ〜２．６ｎｍである。

リガンドＹには、限定されるものではないが、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、並びにその他のチオール含有化合物の１つ以上が含まれる。

上記Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体は、好ましくはＬ（Ｄ）−システイン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、又はＮ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）である。

上記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、好ましくはシステイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、又はシステイン含有テトラペプチドである。

上記システイン含有ジペプチドは、好ましくはＬ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−システインジペプチド（ＨＣ）、又はＬ−システイン−Ｌ−ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）である。

上記システイン含有トリペプチドは、好ましくはグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ−プロリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ−リジン−Ｌ−システイン−Ｌ−プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、又はＬ−グルタチオン（ＧＳＨ）である。

上記システイン含有テトラペプチドは、好ましくはグリシン−Ｌ−セリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、又はグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−セリン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）である。

その他のチオール含有化合物は、好ましくは１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ−３−トロロボール、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）−グリシン、又はドデシルメルカプタンである。

上記物質は、粉末又は綿状である。

第２の態様においては、本発明は、ＡｕＣ含有物質を製造する方法であって、以下の工程：
（１）ＨＡｕＣｌ_４をメタノール、水、エタノール、ｎ−プロパノール、及び酢酸エチルの１つに溶解させることで、ＨＡｕＣｌ_４の濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである溶液Ａを得る工程と、
（２）リガンドＹを溶剤中に溶解させることで、リガンドＹの濃度が０．０１Ｍ〜０．１８Ｍである溶液Ｂを得る工程と、
（３）工程（１）における溶液Ａと工程（２）における溶液Ｂとを、ＨＡｕＣｌ_４とリガンドＹとの間のモル比１：（０．０１〜１００）（好ましくは１：（０．１〜１０）、より好ましくは１：（１〜１０））で混合し、それらを氷浴中で０．１時間〜４８時間（好ましくは０．１時間〜２４時間、より好ましくは０．５時間〜２時間）にわたり撹拌し、０．０２５Ｍ〜０．８ＭのＮａＢＨ_４溶液（好ましくはＮａＢＨ_４の水溶液、ＮａＢＨ_４のエタノール溶液、又はＮａＢＨ_４のメタノール溶液）を添加し、次いで氷水浴中で０．１時間〜１２時間（好ましくは０．１時間〜２時間、より好ましくは１時間〜２時間）にわたりＮａＢＨ_４とリガンドＹとの間のモル比１：（０．０１〜１００）（好ましくは１：（０．１〜８）、より好ましくは１：（１〜８））で撹拌し続ける工程と、
（４）工程（３）における反応溶液を８０００回転／分〜１７５００回転／分で１０分間〜１００分間にわたり遠心分離することで、ＡｕＣ沈降物を種々の平均粒度で得る工程、好ましくはＭＷＣＯが３Ｋ〜３０Ｋの限外濾過チューブを使用して、工程（３）における反応溶液を８０００回転／分〜１７５００回転／分で１０分間〜１００分間にわたり勾配により遠心分離することで、ＡｕＣを種々の平均粒度で得る工程と、
（５）工程（４）において得られた種々の平均粒度のＡｕＣ沈降物を水中に溶解させ、それを透析バッグに入れて、水中にて室温で１日間〜７日間にわたり透析する工程と、
（６）上記透析バッグ中のＡｕＣ溶液を１２時間〜２４時間にわたり凍結乾燥させることで、ＡｕＣ含有物質を得る工程と、
を含む、方法を提供する。

工程（２）における溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール、及び酢酸プロピルの１つ以上である。

第３の態様においては、本発明は、触媒製造又は分子触媒作用、キラル認識、分子検出、生物医学的検出、及びイメージングの分野における近赤外蛍光プローブへのＡｕＣ含有物質の使用を提供する。

第４の態様においては、本発明は、Ａβの凝集及び線維化と関連する疾患、並びにα−ｓｙｎの凝集及び線維化と関連する疾患のための薬物の製造における上記ＡｕＣ含有物質の使用を提供する。

第５の態様においては、本発明は、ＡＤの予防及び治療のための薬物の製造におけるＡｕＣ含有物質の使用を提供する。

第６の態様においては、本発明は、ＰＤの予防及び治療のための薬物の製造におけるＡｕＣ含有物質の使用を提供する。

第７の態様においては、本発明は、Ａβの凝集及び線維化と関連する疾患のための薬物の製造におけるＡｕＣの使用を提供する。

上記Ａβの凝集及び線維化と関連する疾患は、ＡＤである。

上記ＡｕＣは、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、又はＬ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−Ｃｙｓ）で修飾されている。

第８の態様においては、本発明は、α−ｓｙｎの凝集及び線維化と関連する疾患のための医薬の製造におけるＡｕＣの使用を提供する。

上記Ａβの凝集及び線維化と関連する疾患は、ＰＤである。

上記ＡｕＣは、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、又はＬ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−Ｃｙｓ）で修飾されている。

本発明により提供されるＡｕＣ含有物質は、Ａβ及びα−ｓｙｎの凝集の阻害のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験においてＡβ及びα−ｓｙｎの凝集の阻害に対して優れた効果を示し、そしてＡβ誘導された細胞ＡＤモデル及びＭＰＰ^＋誘導された細胞ＰＤモデルの実験において細胞生存性の改善に対して優れた効果を示す。ＡＤのトランスジェニックマウスモデルにおいて、上記ＡｕＣ含有物質は、病気のマウスの認知行動能力を大幅に改善することができ、マウスの海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４０）斑及びＡβ（１−４２）斑の形成の阻害に大きな役割を担う。ＭＰＴＰ誘導されたＰＤマウスモデルにおいて、上記ＡｕＣ含有物質は、ＭＰＴＰ病変モデルマウスの運動異常障害を大幅に改善及び治療し、病気のマウスの運動能力を改善し、そしてマウスの黒質及び線条体のＤＡ作動性ニューロンのＭＰＴＰ誘導された特異的アポトーシスを本質的に阻害することができる。そしてまた上記ＡｕＣ含有物質は、細胞レベル及び動物レベルで良好なバイオセーフティを有
する。上記結果は、本発明により提供されるＡｕＣ含有物質が、線維性タンパク質の凝集及び線維化に影響を及ぼすだけでなく、より深いレベルで神経変性疾患の過程にも、例えば神経細胞のエネルギー代謝及び神経伝達物質代謝に関連するシグナル伝達機能にも影響することを指摘している。したがって、本発明により提供されるＡｕＣ含有物質は、神経変性疾患、例えばＡＤ及び／又はＰＤのための新たな医薬の研究及び開発のために重要である。

他方で、リガンド分子は、Ａβの凝集のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害のための動態実験、及びＡβ病変ＡＤ細胞モデル試験において全く阻害効果を示さず、又はＡβ病変細胞ＡＤモデル及びＭＰＰ^＋病変ＰＤ細胞モデルにおいて全く細胞生存性の増加を示さないので、ＡＤ及びＰＤへの効力がリガンドではなくＡｕＣに起因することが示唆される。ＡｕＣ自体の医薬活性に基づいて、競争力のある新たな医薬の開発が期待される。

種々の粒度を有するリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の紫外−可視（ＵＶ）スペクトル、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像、及び粒度分布図を示す。 種々の粒度を有するリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの紫外−可視スペクトル、ＴＥＭ像、及び粒度分布図を示す。 種々の粒度を有するリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの赤外スペクトルを示す。 Ａβ（１−４０）とリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子又はＡｕＣとを一緒に４８時間にわたりインキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーを示す。 種々の粒度及び種々の濃度のリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子及びＡｕＣのＡβ線維化の動態曲線を示す。 種々の粒度及び種々の濃度のリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子又はＡｕＣの、Ａβ誘導されたＡＤ細胞モデルの細胞生存性に対する効果を示している図を示す。 リガンドＣＲで修飾されたＡｕＣ（ＣＲ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。 リガンドＲＣで修飾されたＡｕＣ（ＲＣ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。 １−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（すなわち、Ｃａｐ）で修飾されたＡｕＣのＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。 リガンドＧＳＨで修飾されたＡｕＣ（ＧＳＨ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。 リガンドＤ−ＮＩＢＣで修飾されたＡｕＣ（Ｄ−ＮＩＢＣ−ＡｕＣ）のＵＶ、赤外、ＴＥＭ、及び粒度分布図を示す。 種々のリガンドで修飾されたＡｕＣの、Ａβ（１−４０）の凝集及び線維化に対する阻害効果の曲線を示す。 実施形態５における水迷路実験装置の概略図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスモデルの認知行動（投与１５０日目）に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるマウスの海馬及び大脳皮質中でのＡβ（１−４０）の発現（投与１００日目）に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるマウスの海馬及び大脳皮質中でのＡβ（１−４２）の発現（投与１００日目）に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるマウスの海馬及び大脳皮質中でのＡβ（１−４０）の発現（投与１５０日目）に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＡＰＰ／ＰＳ１二重トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおけるマウスの海馬及び大脳皮質中でのＡβ（１−４２）の発現（投与１５０日目）に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質のα−ｓｙｎ線維化の動態に対する効果を示している図である。 ＡｕＣ含有物質の、ＭＰＰ^＋病変ＰＤ細胞（ＳＨ−ｓｙ５ｙ）モデルの細胞生存性に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞（ＰＣ１２）モデルの細胞アポトーシスに対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＭＰＴＰ病変モデルマウスの自発運動に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＭＰＴＰ病変モデルマウスの遊泳能力に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＭＰＴＰ病変モデルマウスのロータロッド行動に対する効果を示している図を示す。 ＡｕＣ含有物質の、ＭＰＴＰ病変モデルマウスの黒質及び線条体におけるＤＡ作動性ニューロンに対する効果を示している図を示す。 種々の粒度及び種々の濃度のＡｕＣ含有物質の、ＳＨ−ｓｙ５ｙ神経芽腫細胞生存性に対する効果を示している図を示す。

一定のリガンドを有する金ナノ粒子のＡβの凝集に対する効果を研究することにより、本発明者らは、金ナノ粒子の金コア直径を大きいものから小さいものへと変更した場合に、同じリガンドで表面が修飾された金ナノ粒子のＡβの凝集に対する促進効果は、阻害効果へと切り替わり、その粒度がＡｕＣとなるのに十分に小さい場合に、Ａβの凝集の完全な阻害が達成され得ることを見出した。さらに、ＡｕＣがα−ｓｙｎに対する完全な阻害効果を有することも判明した。この効果においては、リガンドではなくＡｕＣ自体が阻害の役割を担う。

一般的に、上記研究で使用される金ナノ粒子の金コア直径は、３ｎｍより大きく、該金コアの直径が３ｎｍより小さい場合に、金ナノ粒子はＡｕＣと呼ばれる。紫外−可視吸収スペクトルにおけるプラズモン共鳴吸収ピーク（５２０±２０ｎｍ）の消失及び５６０ｎｍより高いところでの新たな吸収ピークの出現は、ＡｕＣの製造に成功したことを示している。リガンドを有しないと、ＡｕＣは溶液中で安定に存在することができない。ＡｕＣがチオール含有リガンドと結合することで、リガンド修飾されたＡｕＣ（又はＡｕＣと呼ばれる）がＡｕ−Ｓ結合を介して形成される。

文献に開示される現存のリガンド修飾されたＡｕＣには、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）等で修飾されたＡｕＣが含まれる。製造方法は、文献（H. F. Qian, M. Z. Zhu, Z. K. Wu, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470、C. Gautier, T. Buergi, Journal of the American Chemical Society 2006, 128,11079）に示されており、それらは、主として触媒作用、キラル認識、分子
検出、バイオセンシング、薬物送達、及びバイオイメージングの分野において適用される（G. Li, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2013, 46, 1749、H. F. Qian, M.
Z. Zhu, Z. K. Wu, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470、J. F. Parker, C. A. Fields-Zinna, R. W. Murray, Accounts of Chemical Research 2010, 43, 1289、S. H. Yau, O. Varnavski, T. Goodson, Accounts of Chemical Research 201
3, 46, 1506）。

本発明では、ＡｕＣのＡＤ及び／又はＰＤに対する効果が調査され、最初に、種々のリガンド（Ａβの凝集に対して阻害効果を有しないリガンド）を含む種々のサイズのＡｕＣを研究対象として使用することを少なくとも含む。Ａβの凝集及びα−ｓｙｎの凝集の阻害についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験と、Ａβ誘導されたＡＤ細胞モデル及びＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞モデルの実験と、ＡＤトランスジェニックマウスモデル及びＭＰＴＰ誘導されたＰＤマウスモデルの実験とを含む３段階の実験での研究、そしてＡｕＣ細胞毒性を考慮してマウスにおける急性毒性実験、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ分布実験等によって、リガンド修飾されたＡｕＣが提供され、ＡＤ及びＰＤを治療する薬物の製造におけるそれらの用途が見出され、そしてそれらの結果を、金ナノ粒子の実験結果と比較することで、３ｎｍより大きい直径を有する金ナノ粒子は、この目的のために望ましい効果を有さず、ＡＤ又はＰＤを治療する薬物の製造に使用することができないが、その一方でリガンド修飾されたＡｕＣは、ＡＤ及び／又はＰＤを治療する薬物の製造に使用することができることが示された。

以下で、本発明を更に実施形態において詳説するが、それらの実施形態は、本発明に何らかの限定を行うものと解釈されるべきではない。

以下の実施形態で使用される原材料の純度は、化学的純度又はそれより高いものとする。それらは全て市場から購入することができる。

実施形態１：リガンド修飾されたＡｕＣの製造
この実施形態は、リガンド修飾されたＡｕＣを製造する方法であって、以下の工程：
（１）ＨＡｕＣｌ_４をメタノール、水、エタノール、ｎ−プロパノール、及び酢酸エチルの１つに溶解させることで、ＨＡｕＣｌ_４の濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである溶液Ａを得る工程と、
（２）リガンドＹを溶剤中に溶解させることで、リガンドＹの濃度が０．０１Ｍ〜０．１８Ｍである溶液Ｂを得る工程と、
リガンドＹには、限定されるものではないが、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその他のシステイン誘導体、例えばＮ−イソブチリル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＩＢＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＩＢＣ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン及びＮ−アセチル−Ｄ−システイン、限定されるものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むシステイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、例えばＬ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ−プロリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン−Ｌ−セリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−セリン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）並びにその他のチオール含有化合物、例えば１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ−３−トロロボール及びドデシルメルカプタンの１つ以上が含まれ、上記溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール及び酢酸プロピルの１つ以上である；
（３）溶液Ａと溶液Ｂとを、ＨＡｕＣｌ_４とリガンドＹとの間のモル比が１：（０．０１
〜１００）であるように混合し、それらを氷浴中で０．１時間〜４８時間にわたり撹拌し、０．０２５Ｍ〜０．８ＭのＮａＢＨ_４の水溶液、エタノール溶液、又はメタノール溶液を添加し、氷水浴中で撹拌し続けて、０．１時間〜１２時間にわたり反応させる工程と、
ＮａＢＨ_４とリガンドＹとの間のモル比は１：（０．０１〜１００）である；
（４）ＭＷＣＯが３Ｋ〜３０Ｋの限外濾過チューブを使用して、上記反応溶液を８０００回転／分〜１７５００回転／分で反応完了後１０分間〜１００分間にわたり勾配により遠心分離することで、リガンド修飾されたＡｕＣ沈降物を種々の平均粒度で得る工程（具体的な勾配遠心分離は、実施形態２の（４）に記載される通りである。種々のＭＷＣＯの限外濾過チューブのための濾過膜の開口が、その膜を通過し得るＡｕＣのサイズを直接的に決定する）と、
この工程は省くことができる。言い換えれば、工程（３）の完了後に、工程（５）を直接開始することで、混合されたＡｕＣが種々のサイズで得られる；
（５）工程（４）において得られた種々の平均粒度のＡｕＣ沈降物を水中に溶解させ、それを透析バッグに入れて、水中にて室温で１日間〜７日間にわたり透析する工程と、
（６）ＡｕＣを透析後１２時間〜２４時間にわたり凍結乾燥させることで、粉末状物質又は綿状物質、すなわちリガンド修飾されたＡｕＣを得る工程と、
を含む、方法を開示している。

検出されるように（具体的な検出方法は、実施形態２に示されている）、上記方法により得られた粉末状物質又は綿状物質の粒度は、３ｎｍより小さい（一般的に０．５ｎｍ〜２．６ｎｍに分布している）。紫外−可視吸収スペクトルは、５６０ｎｍより高いところで１つ以上の吸収ピークを有し、５２０ｎｍには明らかな吸収ピークを有しない。得られた粉末状物又は綿状物がＡｕＣであることが決定づけられる。

実施形態２：種々のリガンドで修飾されたＡｕＣの製造及び確認
リガンドＬ−ＮＩＢＣを例にとって、リガンドＬ−ＮＩＢＣで修飾されたＡｕＣの製造及び確認を詳説する。
（１）１．００ｇのＨＡｕＣｌ_４を秤量し、それを１００ｍＬのメタノール中に溶解させることで、０．０３Ｍの溶液Ａを得る。
（２）０．５７ｇのＬ−ＮＩＢＣを秤量し、それを１００ｍＬの氷酢酸（酢酸）中に溶解させることで、０．０３Ｍの溶液Ｂを得る。
（３）１ｍＬの溶液Ａを計量し、それをそれぞれ０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬの溶液Ｂ（すなわち、ＨＡｕＣｌ_４とＬ−ＮＩＢＣとの間のモル比はそれぞれ１：０．５、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５である）と混合し、氷浴中で撹拌しながら２時間にわたり反応させ、溶液が山吹色から無色に変わったら１ｍＬの新たに調製した０．０３Ｍ（１１．３ｍｇのＮａＢＨ_４を秤量し、それを１０ｍＬのエタノール中に溶解させることにより調製される）のＮａＢＨ_４水溶液を素早く添加し、溶液が暗褐色に変わった後３０分間にわたりその反応を継続させ、そして１０ｍＬのアセトンを添加することで、その反応を止める。
（４）上記反応後に、その反応溶液を勾配遠心分離にかけることで、種々の粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ粉末が得られる。具体的な方法：上記反応が完了した後に、その反応溶液を、ＭＷＣＯが３０Ｋの５０ｍＬの容量を有する限外濾過チューブに移し、１００００回転／分で２０分間にわたり遠心分離し、内側チューブ中の保持液を超純水中に溶解させることで、約２．６ｎｍの粒度を有する粉末が得られる。次いで、外側チューブ中の混合された溶液を５０ｍＬの容量を有するＭＷＣＯが１０Ｋの限外濾過チューブに移し、１３０００回転／分で３０分間にわたり遠心分離する。その内側チューブ中の保持液を超純水中に溶解させることで、約１．８ｎｍの粒度を有する粉末が得られる。次いで、外側チューブ中の混合された溶液を５０ｍＬの容量を有するＭＷＣＯが３Ｋの限外濾過チューブに移し、１７５００回転／分で４０分間にわたり遠心分離する。その内側チューブ中の保持液を超純水中に溶解させることで、約１．１ｎｍの粒度を有する粉末が得ら
れる。
（５）勾配遠心分離により得られた３つの異なる粒度の粉末を沈降させ、それぞれ溶剤を除去し、粗生成物をＮ_２で風乾させ、それを５ｍＬの超純水中で溶解させ、それを透析バッグ（ＭＷＣＯは３ＫＤａである）中に入れ、それを２Ｌの超純水中に入れ、１日おきに水を交換し、７日間にわたり透析させ、それを凍結乾燥させ、後で使用するために保持する。

特性評価実験は、上記で得られた粉末（リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ）について実施した。一方で、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子がコントロールとして使用される。Ｌ−ＮＩＢＣであるリガンドを有する金ナノ粒子の製造方法は、参考文献（W. Yan, L. Xu, C. Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang and N. A. Kotov, Journal of the
American Chemical Society 2012, 134, 15114、X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan and J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, 4623）を参照する。

１． 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による形態の観察
試験粉末（実施形態２で製造されたＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料及びＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子試料）を、試料として超純水中に溶解させて２ｍｇ／Ｌとし、次いで試験試料をハンギングドロップ法によって製造した。具体的な方法：５μＬの試料を超薄カーボンフィルム上に滴り落とし、水滴が消えるまで自然に蒸発させ、次いで該試料の形態を、ＪＥＭ−２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出型高分解能ＴＥＭにより観察した。

リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の４つのＴＥＭ像は、図１のパネルＢ、パネルＥ、パネルＨ、及びパネルＫに示されており、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの３つのＴＥＭ像は、図２のパネルＢ、パネルＥ、及びパネルＨに示されている。

図２における画像は、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料が均一な粒度及び良好な分散性を有し、かつＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの平均直径（金コアの直径を指す）がそれぞれ１．１ｎｍ、１．８ｎｍ、及び２．６ｎｍであることを示しており、図２のパネルＣ、パネルＦ、及びパネルＩにおける結果とよく合致している。比較すると、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子試料は、より大きな粒度を有する。それらの平均直径（金コアの直径を指す）は、それぞれ３．６ｎｍ、６．０ｎｍ、１０．１ｎｍ、及び１８．２ｎｍであり、図１のパネルＣ、パネルＦ、パネルＩ、及びパネルＬにおける結果とよく合致している。

２． 紫外（ＵＶ）−可視（ｖｉｓ）吸収スペクトル
試験粉末を、濃度が１０ｍｇ・Ｌ^−１になるまで超純水中に溶解させ、室温でＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルにより測定した。スキャン範囲は、１９０ｎｍ〜１１００ｎｍであり、試料セルは、１ｃｍの光路を有する標準的な石英キュベットであり、参照セルは、超純水で満たした。

異なるサイズを有する４つのリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子試料のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルは、図１のパネルＡ、パネルＤ、パネルＧ、及びパネルＪに示されており、粒度の統計分布は、図１のパネルＣ、パネルＦ、パネルＩ、及びパネルＬに示されており、異なるサイズを有する３つのリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルは、図２のパネルＡ、パネルＤ、及びパネルＧに示されており、かつ粒度の統計分布は、図２のパネルＣ、パネルＦ、及びパネルＩに示されている。

図１は、表面プラズモン効果により、リガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子が、
約５２０ｎｍに吸収ピークを有したことを示している。その吸収ピークの位置は、粒度と関連している。粒度が３．６ｎｍである場合に、ＵＶ吸収ピークは５１６ｎｍに現れ、粒度が６．０ｎｍである場合に、ＵＶ吸収ピークは５１７ｎｍに現れ、粒度が１０．１ｎｍである場合に、ＵＶ吸収ピークは５２０ｎｍに現れ、そして粒度が１８．２ｎｍである場合に、その吸収ピークは５２３ｎｍに現れる。上記４つの試料のいずれも、５６０ｎｍより高いところに吸収ピークを一切有しない。

図２は、実施形態２における異なる粒度を有する３つのリガンドＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料のＵＶ吸収スペクトルにおいて、５２０ｎｍでの表面プラズモン効果の吸収ピークが消失し、２つの明らかな吸収ピークが５６０ｎｍより高いところに出現し、吸収ピークの位置は、ＡｕＣの粒度と共に僅かに変化したことを示している。この理由は、ＡｕＣが面心立方構造の崩壊のため分子様の特性を示し、それによりＡｕＣの状態の密度の不連続性がもたらされ、エネルギー準位が分裂し、プラズモン共鳴効果が消失し、長波長方向に新たな吸収ピークが現れるからである。実施形態２において得られた異なる粒度における３つの粉末試料は、全てリガンド修飾されたＡｕＣであると結論付けることができた。

３． フーリエ変換赤外分光分析法
赤外スペクトルは、Bruker社により製造されたＶＥＲＴＥＸ８０Ｖフーリエ変換赤外分光計において固体粉末の高真空の全反射モードで測定した。スキャン範囲は４０００ｃｍ^−１〜４００ｃｍ^−１であり、スキャン数は６４である。実施形態２において製造されたＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ試料を例にとると、該試験試料は、３つの異なる粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ乾燥粉末であり、コントロール試料は、純粋なＬ−ＮＩＢＣ粉末であった。それらの結果を図３に示す。

図３は、種々の粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの赤外スペクトルを示す。純粋なＬ−ＮＩＢＣ（先頭の曲線）と比較すると、種々の粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣのＳ−Ｈ伸縮振動の全ては２５００ｃｍ^−１〜２６００ｃｍ^−１で完全に消失したが、一方で、Ｌ−ＮＩＢＣのその他の特徴的なピークは依然として観察されるため、Ｌ−ＮＩＢＣ分子は、Ａｕ−Ｓ結合を介してＡｕＣの表面にうまくつながっていることが分かる。その図は、リガンド修飾されたＡｕＣの赤外スペクトルがそのサイズと無関係であることも示している。

その他のリガンドＹにより修飾されたＡｕＣを、上記方法と同様であるが、但し、溶液Ｂの溶剤、ＨＡｕＣｌ_４とリガンドＹとの間の供給比、反応時間、及び添加されるＮａＢＨ_４の量が僅かに調節された方法により製造した。例えば、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＩＢＣ）又はＮ−イソブチリル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＩＢＣ）がリガンドＹとして使用される場合に、溶剤として酢酸が選択され、ジペプチドＣＲ、ジペプチドＲＣ又は１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリンがリガンドＹとして使用される場合に、溶剤として水が選択される等であり、その他の工程は同様であるため、それらは本明細書では詳細に記載しないものとする。

本発明では、上記方法により一連のリガンド修飾されたＡｕＣが製造及び取得された。リガンド及び製造方法のパラメータを、表１に示す。

表１に列挙される実施形態における試料は、上記方法により確認される。図７〜図１１は、リガンドＣＲ、ＲＣ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（略語：Ｃａｐ）、ＧＳＨ、及びＤ−ＮＩＢＣで修飾されたＡｕＣのＵＶスペクトル（図７〜図１１におけるパネルＡ）、赤外スペクトル（図７〜図１１におけるパネルＢ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図７〜図１１におけるパネルＣ）、及び粒度分布（図７〜図１１におけるパネルＤ）である。

それらの結果は、表１から得られる種々のリガンドで修飾されたＡｕＣの直径が全て３ｎｍより小さいことを示している。紫外スペクトルはまた５２０±２０ｎｍでのピークの
消失と、５６０ｎｍより高いところでの吸収ピークの出現を示す。この吸収ピークの位置は、リガンド及び粒度とともに僅かに変化するにすぎない。一方で、フーリエ変換赤外スペクトルはまた、リガンドのチオールの赤外吸収ピーク（図７〜図１１のパネルＢにおける点線の間）の消失を示すが、一方でその他の赤外の特徴的なピークは全て維持されるので、全てのリガンド分子はＡｕＣの表面にうまくつながっており、かつ本発明では、表１中に列挙されるリガンドで修飾されたＡｕＣを得ることに成功したことが示唆される。

実施形態３：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡβの凝集動態実験
この実施形態は、Ａβの凝集動態のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験によりリガンド修飾されたＡｕＣの機能を確認し、リガンド修飾された金ナノ粒子及びリガンド分子の独立した使用によるＡβの凝集動態に対する効果を比較することで、その機能がリガンドではなくＡｕＣに起因するものであることが分かった。それらの実験では、Ａβ（１−４０）の凝集及び線維化の動態を特性評価するためにＴｈＴ蛍光標識法が使用された。

チオフラビンＴ（略記：ＴｈＴ）は、アミロイド線維を特異的に染色するための色素である。ＴｈＴをポリペプチド又はタンパク質の単量体と一緒にインキュベートする場合に、その蛍光はほぼ変化しない。ＴｈＴが線維構造を有するアミロイドポリペプチド又はタンパク質に出くわすと、そのアミロイドポリペプチド又はタンパク質と直ちに結合し、その蛍光強度は指数関数的に増加することとなる。まさにこの特性のため、ＴｈＴは、ペプチド又はタンパク質のアミロイドーシスをモニタリングするためのマーカーとして広く使用されている。Ａβ（１−４０）の線維化過程はまた、核形成に制御される重合過程でもある。したがって、ＴｈＴ蛍光標識法により測定されるＡβ（１−４０）線維の成長曲線は、主として３つの段階、すなわち初期段階、成長段階、及びプラットフォーム段階に分けられる。初期段階は、主としてＡβ（１−４０）がコンフォメーション遷移を受けることでミスフォールディングが形成され、その後に凝集及び核形成する段階である。成長段階は、Ａβ（１−４０）単量体がオリゴマーのコア上に軸方向に沿って蓄積することで、線維を形成し、素早く成長する段階である。プラットフォーム段階は、全てのＡβ（１−４０）分子が完全な長い線維を形成している段階、すなわち線維がもはや成長しない段階である。ＴｈＴ蛍光標識法は、Ａβ（１−４０）分子の線維性凝集の動態的過程を簡便にモニタリングすることができる。

１）Ａβ（１−４０）単量体の前処理
アミロイドポリペプチドＡβ（１−４０）の凍結乾燥粉末（Invitrogen Corp.社）を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）中に溶解させることで、１ｇ／ＬのＡβ（１−４０）溶液を得て、その溶液を、密封後に室温で２時間〜４時間にわたりインキュベートし、次いでＨＦＩＰを、高純度窒素（Ｎ２、９９．９％）を用いて適切な流速でドラフトチャンバ内にて風乾（約１時間にわたり）させた。最後に、乾燥されたＡβ（１−４０）を２００μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、密封後にその溶液を、後に使用するために１週間以内にわたり冷凍機中で−２０℃に保った。使用前に、アミロイドポリペプチドのＤＭＳＯ溶液を、Ａβ（１−４０）の濃度が２０μＭに達するまで、大量のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で希釈することで、Ａβ（１−４０）ＰＢＳ溶液を得た。実験のための全てのＡβ（１−４０）ＰＢＳ溶液は新たに調製された。

２）試料の調製及び検出
リガンド修飾されたＡｕＣ及び金ナノ粒子を、それぞれ２０μＭのＡβ（１−４０）ＰＢＳに添加することで、種々の濃度及び種々の粒度の、種々のリガンドで修飾されたＡｕＣの試料を形成し、相応して種々のリガンドで修飾された金ナノ粒子の試料を形成した。それらの試料を、９６ウェルプレート中で３７℃においてＴｈＴ蛍光標識法によって連続的にインキュベートし、蛍光強度をマイクロプレートリーダにより１０分毎に１回モニタリングした。Ａβ（１−４０）凝集の動態過程を、ＴｈＴの蛍光強度の変化によって特性
評価した。

実施形態２においてそれぞれ製造された２．６ｎｍ、１．８ｎｍ、及び１．１ｎｍの粒度を有する３つのサイズのＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを、実験群として使用した。それぞれ１８．２ｎｍ、１０．１ｎｍ、６．０ｎｍ、及び３．６ｎｍの粒度を有する４つのサイズのＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子、並びにＡｕＣ又は金ナノ粒子と結合されていないＬ−ＮＩＢＣ分子を、コントロール群として使用した。全てのサイズのＡｕＣ又は金ナノ粒子は、それぞれ６つの濃度で存在し、それぞれ０ｐｐｍ（ブランクコントロールとしてＡｕＣ、金ナノ粒子、又はＬ−ＮＩＢＣを含有していない）、０．１ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ、５．０ｐｐｍ、１０．０ｐｐｍ、及び２０．０ｐｐｍであった。それぞれ１．０ｐｐｍ及び１０．０ｐｐｍである２つの濃度でＬ−ＮＩＢＣ分子を使用した。

それらの結果を図４及び図５に示す。

図４は、それぞれの実験群及びコントロール群を４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡβ（１−４０）のＡＦＭトポグラフィーを示す。パネルＡは、Ａβ（１−４０）を単独で４８時間にわたりインキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。パネルＢは、Ａβ（１−４０）をＬ−ＮＩＢＣと一緒に４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。パネルＣ及びパネルＤは、Ａβ（１−４０）をそれぞれ６．０ｎｍ及び３．６ｎｍの平均粒度を有する金ナノ粒子（Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されている）と一緒に４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。そして、パネルＥは、Ａβ（１−４０）を１．８ｎｍの平均粒度におけるＡｕＣ（Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されている）と一緒に４８時間にわたり同時インキュベートした後のＡＦＭトポグラフィーである。

図５において、Ｌ−ＮＩＢＣの種々の濃度におけるＡβ（１−４０）のアミロイドーシス動態曲線がパネルＡに示されている。それぞれ１８．２ｎｍ、１０．１ｎｍ、６．０ｎｍ、及び３．６ｎｍのサイズを有する金ナノ粒子の種々の濃度におけるＡβ（１−４０）のアミロイドーシス動態曲線がパネルＢ〜パネルＥに示されている。それぞれ２．６ｎｍ、１．８ｎｍ、及び１．１ｎｍのサイズを有するＡｕＣの種々の濃度におけるＡβ（１−４０）のアミロイドーシス動態曲線がパネルＦ〜パネルＨに示されている。パネルＡ〜パネルＨにおけるＡβのアミロイドーシス動態曲線は、Ａβ（１−４０）を種々の濃度において金ナノ粒子又はＡｕＣと同時インキュベートした場合の曲線であり、□は０ｐｐｍ（すなわち、金ナノ粒子及びＡｕＣなし）を表し、○は０．１ｐｐｍを表し、△は１ｐｐｍを表し、▽は５ｐｐｍを表し、◇は１０ｐｐｍを表し、☆は２０ｐｐｍを表した。

図４から、コントロールとしてＡβ線維がパネルＡ中に張り巡らされており、パネルＢも同じであり、線維が或る程度は減少したが、長い線維は依然としてパネルＣ中に見ることができ、長い線維は存在しないが、多くのＡβの短い線維が依然としてパネルＤ中に存在することが見て取れる。Ｌ−ＮＩＢＣはＡβ（１−４０）線維の形成に対して明らかな効果を有しないことが示された。Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された小さなサイズの金ナノ粒子の添加は、Ａβ（１−４０）のアミロイドーシス過程を遅延させ得るが、完全に阻害し得なかった。それというのも、上記短い線維は、更なる時間後に長い線維へと成長し続けることとなるからである。図４のパネルＥには、長い線維も短い線維も存在しないので、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣはＡβ（１−４０）のアミロイドーシス過程を完全に阻害し得ることが示唆される。

図４は、定性的実験であるが、図５は、定量的実験である。図５の結果は、Ｌ−ＮＩＢＣの添加が、Ａβ（１−４０）アミロイドーシスの動態に明らかな効果を有さず（図５のパネルＡ）、粒子直径が１０．１ｎｍ以上である場合の金ナノ粒子については、Ｌ−ＮＩ
ＢＣ修飾された金ナノ粒子の添加がＡβの凝集動態の成長段階及びプラットフォーム段階の両方を前倒すので（金ナノ粒子の濃度が２０ｐｐｍである場合に、Ａβの凝集動態の成長段階は第１２時間目まで前倒され、そしてプラットフォーム段階は第１６時間目まで前倒された）、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子はＡβの凝集を加速させ得ることが示唆され（図５のパネルＢ及びパネルＣ）、金ナノ粒子の直径が６．０ｎｍ以下である場合には（図５のパネルＤ及びパネルＥ）、Ａβの凝集の開始時間が遅延され得るので（Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の濃度が２０ｐｐｍである場合に、Ａβの凝集動態の成長段階は第５４時間目まで遅延された）、金ナノ粒子はＡβの凝集に対して阻害効果を有することが示唆されることを示している。しかしながら、図５は、上記濃度が非常に高い（２０．０ｐｐｍ）としても、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の添加は完全に阻害する（すなわち、成長段階は現れず、蛍光曲線は完全に平坦にする）ことができなかったことを示している。他方で、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の添加後に、ＴｈＴの蛍光発光ピークは５１５ｎｍに位置している一方で、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子のプラズモン共鳴吸収ピークは５２０ｎｍ近くに位置するので、ここで観察されたＴｈＴ蛍光強度の減少は、該金ナノ粒子のＴｈＴ蛍光に対するプラズモン共鳴効果の部分的クエンチングであり、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子のＡβ（１−４０）凝集に対する阻害効果によるものではないはずである。

図５のパネルＦ〜パネルＨは、全てのＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣが、Ａβの凝集を大幅に阻害し得た（成長段階の開始時間が延期された。Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの濃度が５ｐｐｍである場合に、２０μＭのＡβの凝集動態における成長段階の開始時間が、５０時間より後に遅延され得た）ことを示している。Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの濃度が１０ｐｐｍ以上である場合に、Ａβの凝集は、完全に阻害され得た（成長段階は現れず、蛍光曲線は完全に平坦であった）。完全な阻害のために必要とされるＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの最小濃度は、リガンド型及びＡｕＣの直径に関連している。１．１ｎｍ、１．８ｎｍ、及び２．６ｎｍのサイズを有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの最小濃度は、それぞれ５．０ｐｐｍ、５．０ｐｐｍ、及び１０．０ｐｐｍであった。さらに、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣはプラズモン共鳴効果を有しないので、それらはＴｈＴ蛍光に対してクエンチング効果を有しない。したがって、ここで観察される蛍光強度における減少は、もっぱらＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣのＡβ（１−４０）凝集に対する阻害効果によるものであった。図５の定量的結果は、図４の定性的結果とよく合致している。

この実験は、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子のサイズが６．０ｎｍ以下である場合に、該金ナノ粒子は、Ａβの凝集及び線維化に対して一定の阻害効果を有するが、それは限定的であり、またＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣは、Ａβの凝集及び線維化を完全に阻害する機能を有することを示している。Ｌ−ＮＩＢＣ分子自体はＡβの凝集及び線維化に影響を及ぼし得ないので（図４のパネルＢ及び図５のパネルＡの点からみて）、この機能はＡｕＣに起因するものであり、Ｌ−ＮＩＢＣリガンドに起因するものではない。このことは、本発明により定義されるＡｕＣ含有物質として分類することができる、Ａβの凝集及び線維化に関連する疾患のための医薬を形作るための基礎を成す。

また、この実施形態により、表１に列挙されるその他のリガンドで修飾されたＡｕＣの機能が確認される。例えば、図１２のパネルＡ〜パネルＨは、ＣＲ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＡＣ）、ＧＳＨ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、Ｄ−ＮＩＢＣ、ＲＣ又はＬ−システイン及びＤ−システインで修飾されたＡｕＣ（用量は１０ｐｐｍである）の、Ａβ（１−４０）の凝集及び線維化に対する阻害効果を示している。同様の現象が、種々のリガンドで修飾されたＡｕＣについて観察され、同じ結論となり得る。これらのリガンド自体は、Ａβの凝集及び線維化に影響を及ぼすことができず、３ｎｍより大きいサイズを有するリガンド修飾された金ナノ粒子は、Ａβの凝集及び線維化に対して限られた阻害効果しか有さず、
そしてより大きい金ナノ粒子は、Ａβの凝集及び線維化の促進さえもするが、しかしながら、リガンド修飾されたＡｕＣは、Ａβの凝集及び線維化に対して優れた阻害効果を有し、かつその濃度が５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍを上回る場合に、完全な阻害のために必要とされる最小濃度は、リガンド及びＡｕＣの粒度に伴い僅かに変動するが、完全な阻害効果が達成され得る。同様に、これらのリガンド修飾されたＡｕＣは、本発明において定義されるＡｕＣ含有物質に分類される。

実施形態４：Ａβ誘導されたＡＤ細胞モデルの実験
細胞生存性を、この実施形態の実験における指標として使用した。ＣＣＫ−８法の試験結果により、リガンド修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子試料のＡβ（１−４０）の毒性に対する効果を反映し、リガンド修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子が、アミロイドタンパク質のミスフォールディングの病因に対する神経保護効果を有するかどうかが示された。その実験で使用される細胞は、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞系統であった。Ａβ誘導されたＡＤ細胞モデルは、文献（R. Liu, H. Barkhordarian, S. Emadi, C. B. Park, M. R. Sierks, Neurobiology of Disease 2005, 20, 74）での記載に従って樹立した。具体的な方法：
１）対数増殖期におけるＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞（細胞は６世代まで継代培養した）を、完全培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）で希釈して、５×１０^４／ｍＬの密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬで接種し、５％ＣＯ_２を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。細胞がウェルに接着されたときに、試料を添加した。

２）それぞれ種々の粒度並びに０．０４ｐｐｍ、０．４ｐｐｍ、４ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ及び８０ｐｐｍの濃度の、維持培地（ＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）により溶解された１００μＬのリガンド修飾されたＡｕＣ試料又はリガンド修飾された金ナノ粒子試料を、工程１）から得られたインキュベートされた懸濁液中に添加した。インキュベーター中で２時間にわたりインキュベートした後に、１００μＬの８０μＭのＡβ（１−４０）を添加し、次いでその混合物をインキュベーター中で２４時間にわたりインキュベートした。こうしてリガンド修飾されたＡｕＣ又はリガンド修飾された金ナノ粒子の最終濃度は、それぞれ０．０１ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、及び２０ｐｐｍであったが、Ａβ（１−４０）の最終濃度は、２０μＭであった。一方で、以下の群が存在した：ブランクコントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を含まず、ネガティブコントロール群はＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を含むが、リガンド修飾されたＡｕＣ又はリガンド修飾された金ナノ粒子及びＡβ（１−４０）を含まず、細胞モデルコントロール群はＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞及びＡβ（１−４０）（最終濃度は２０μＭであった）だけを含み、そしてリガンドコントロール群はＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞、Ａβ（１−４０）（最終濃度は２０μＭであった）及びＬ−ＮＩＢＣ（最終濃度は２０ｐｐｍであった）を含んだ。培養培地を除去し、１０％ＣＣＫ−８を含有する維持培地（ＭＥＭ）を１００μＬ／ウェルで添加し、４時間にわたりインキュベートし、それぞれのウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定することで、リガンド修飾されたＡｕＣのＡβ（１−４０）病変の予防効果及び治療効果が反映された。

実施形態２におけるＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとり、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子をＡｕＣと比較した。それらの結果を図６に示す。

図６のパネルＡ〜パネルＣはそれぞれ、１．１ｎｍ、１．８ｎｍ、又は２．６ｎｍの粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの、種々の濃度でのＡβ誘導されたＡＤ細胞モデルにおける細胞生存性に対する効果を示し、パネルＤ〜パネルＦはそれぞれ、３．６ｎｍ、６．０ｎｍ、又は１０．１ｎｍの粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子の、種々の濃度でのＡβ誘導されたＡＤ細胞モデルの細胞生存性に対する効果を示す。

図６に示されるように、Ｌ−ＮＩＢＣ単独の添加は、細胞生存性を改善しなかった。種々のサイズ（平均サイズは、それぞれ１．１ｎｍ、１．８ｎｍ、及び２．６ｎｍであった）を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣは、Ａβ誘導ＡＤ細胞モデルにおいて、非常に低い用量（例えば０．１ｐｐｍ〜１ｐｐｍ）でさえも、細胞生存性をほぼ６０％から９５％超へと高めた（図６のパネルＡ〜パネルＣにおいて、Ｐ値は全て０．０５未満であった）。３．６ｎｍの平均直径におけるＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子は、ＡＤ細胞モデルにおいて濃度の増加に伴い或る程度は細胞生存性を高めたが（図６のパネルＤ）、明白には高めなかった（Ｐ＞０．０５）。それぞれ６．０ｎｍ及び１０．１ｎｍの平均直径におけるＬ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子は、細胞生存性に対する効果を有しなかった（図６のパネルＥ及びパネルＦ）。上記結果により、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣは、Ａβ誘導されたＡＤ細胞モデルにおいて顕著な薬効を有するが、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾された金ナノ粒子は、明らかな効力を有しないことが示された。

様々なサイズにおける表１に列挙されるその他のリガンドで修飾されたＡｕＣでの実験を、この実施形態において実施した。それらの結果によっても、リガンド修飾されたＡｕＣが、Ａβ誘導されたＡＤ細胞モデルにおいて細胞生存性を大幅に改善することが示された。種々のリガンドで修飾されたＡｕＣは、少なくとも細胞モデルのレベルでＡＤに対して優れた治療効果を有し、それは本発明において定義されるＡｕＣ含有物質に分類することができ、そしてＡＤ治療のために使用することができることが示された。

実施形態５：ＡＤトランスジェニックマウスモデルの実験
実験１：
１）表１に列挙されるリガンドで修飾されたＡｕＣをそれぞれ１．０ｇ秤量し、水１００ｍＬ中にストック溶液として溶解させ、後で使用するために４℃で貯蔵した。小容量のストック溶液を取り、使用前に水中で希釈した。

２）１８０匹のＢ６／Ｊ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ，ＰＳＥＮ１ｄｅ９）８５Ｄｂｏ／ＭｍＮｊｕ系統のトランスジェニックマウス（南京大学のモデル動物研究センターから購入）を、コントロール群、低用量群、及び高用量群を含む３つの群に１群当たり６０匹のマウスで無作為に分けた。マウスが１００日齢となったときに、コントロール群内のマウスには通常通りに毎日給餌し、低用量群内のマウスには１日につき水中の０．５ｇ／ＬのＡｕＣを２００μＬで経口投与し、そして高用量群内のマウスには１日につき水中の２ｇ／ＬのＡｕＣを２００μＬで経口投与した。

３）コントロール群内、低用量群内、及び高用量群内のマウスをそれぞれ７つの集団に無作為に分けた。マウスがそれぞれ１４０日齢、１６０日齢、１８０日齢、２００日齢、２３０日齢、２６０日齢、及び２９０日齢となったときに、迷路実験、オープンフィールド実験、及び新奇物体認識実験を、マウスの学習行動及び記憶行動における変化を研究するために採用した。最初の４つの集団においては、各群のマウスは６匹であり、最後の３つの集団においては、各群のマウスは６匹〜８匹である（マウスの給餌過程で一定の死亡率があることを考慮して、以下同様）。

４）上記の各々の集団のマウスの行動研究の後に、血中のＡβの含量を検出した。血液は眼窩静脈叢から採取し、Ａβの含量及びＡβの凝集を、血清Ｅｌｉｓａ法により検出した。

５）上記各々の集団のマウスの血中のＡβの含量を検出した後に、海馬内に分布しているＡβアミロイド沈着を検出した。上記マウスを、眼血を得た後に麻酔し、心臓灌流を介して固定した。マウスの全脳を採集し、スクロース中で勾配により沈降させた。次いで脳
を凍結させ、切片にした。海馬内のＡβアミロイド沈着の分布を、免疫組織化学法により調べた。

それらの結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣが、ＡＤトランスジェニックマウスの認知行動を大幅に改善することができ、脳内の老人斑の形成及び疾患の発生を抑え得るため、それはＡＤを治療するためにＡｕＣ含有物質として使用され得ることが示された。

実験２：
１． 表１に列挙されるリガンドで修飾されたＡｕＣをそれぞれ１．０ｇ秤量し、水１００ｍＬ中にストック溶液として溶解させ、後で使用するために４℃で貯蔵した。小容量のストック溶液を取り、使用前に水中で希釈した。該ストック溶液は、２週間に１回調製した。

２． ９０匹のＢ６／Ｊ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ，ＰＳＥＮ１ｄｅ９）８５Ｄｂｏ／ＭｍＮｊｕ系統のトランスジェニックマウス（南京大学のモデル動物研究センターから購入）を、３つの群、すなわちモデルコントロール群、低用量群、及び高用量群に１群につき３０匹のマウスで無作為に分けた（この系統のトランスジェニックマウスは給餌過程において約３０％の死亡率を有することを考慮して、この実験の終わりに十分なマウスを保証するために、この実験の終わりよりも多くのマウスが初期に存在した）。マウスが１００日齢になったときに、モデルコントロール群内のマウスには通常通りに毎日給餌し、低用量群内及び高用量群内のマウスには２日に１回で腹腔内注射により、それぞれ５ｍｇ／体重ｋｇ及び２０ｍｇ／体重ｋｇの用量でＡｕＣ溶液を経口投与した。

３． マウスの認知行動を、水迷路実験を使用して試験した。モリス水迷路（ＭＷＭ）実験は、試験される動物を泳がせて、水中に隠れたプラットフォームを見つけるように学習させるものである。ＭＷＭは主として、試験される動物の空間位置及び方向知覚の学習能力及び記憶能力を試験するために使用され、ＡＤ医薬の開発及び評価の研究において広く採用されている。逃避潜時がより短いこと、プラットフォームの除去後にそこを横切る回数がより多いこと、対象となる四分円中での遊泳距離がより長いこと、そしてマウスが対象となる四分円中に留まる時間がより長いことは、該マウスが空間位置及び方向知覚のより良い記憶能力を有することを意味する。投与から１５０日後に、それぞれのマウスの行動を、モリス水迷路実験で試験した。この実験方法は、文献（C. V. Vorhees, M. T. Williams, Nature Protocols 2006, 1, 848）を参照している。詳細は以下の通りであった。

（１）位置付けナビゲーション実験（Positioning navigation experiment）：ＭＷＭ
の試験システムは、円形プール及び自動型ビデオ及び分析システムからなっていた。プールの上方にあるカメラは、コンピュータに接続されていた（図１３に示される）。水迷路は、直径１２０ｃｍ及び高さ６０ｃｍの円形プール、並びに直径９ｃｍのプラットフォームからなっていた。液体の水準はプラットフォームより０．５ｃｍ高く、水温は２２±０．５℃であった。白色色素を使用して、水を乳白色に染めた。該位置付け実験を使用することで、水迷路中のマウスの学習能力及び記憶能力を測定し、それを４日間にわたり継続した。図１３に示されるように、水迷路を東（Ｅ）、西（Ｗ）、南（Ｓ）及び北（Ｎ）の４つの方向で十字形として４つの四分円に分けた。プラットフォームは、ＳＷ四分円の真ん中に位置しており、その位置は実験を通して固定した。トレーニング中に、マウスは、頭をプール壁に向けて内壁の近くで、異なる四分円において１／２ラジアンから優しく水中に入れた。マウスが隠れたプラットフォームに登るのに費やした時間（逃避潜時）を、カメラ追跡システムにより記録するか、又は記録時間が６０秒間に達したら実験を止めた。マウスは、プラットフォーム上に登った後３０秒間にわたりそのプラットフォーム上で
留まらせた。マウスが６０秒間以内にプラットフォームを見つけられなかった場合に（この場合に逃避潜時は６０秒として記録した）、実験者はそのマウスをプラットフォームに登るよう誘導し、３０秒間にわたりプラットフォーム上で留まらせるものとする。実験後に、全てのマウスを取り出し、優しくぬぐって乾かした。それぞれのマウスは、４連日にわたり１日に４回、トレーニング期間の合間に１５分〜２０分の間隔を設けてトレーニングした。

（２）空間探索試験：第４日目のトレーニングが完了した後に、第５日目にプラットフォームを除去し、マウスを、プール壁に向け、ＮＥ円弧の中点（プラットフォームから最も遠い地点）から優しく水中に入れ、マウスの６０秒間の運動軌道をカメラにより記録し、そしてマウスがプラットフォームを横切る回数、対象となる四分円中に留まる時間、及び対象となる四分円中での遊泳距離を、ソフトウェアにより分析した。

４． 免疫組織化学実験を使用して、海馬及び大脳皮質中のＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）のアミロイド沈着の分布を検出した。大脳皮質及び海馬におけるニューロンの外側のＡβの病理学的沈着は、ＡＤの主要な病理学的特徴である。なかでも、Ａβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）は、脳内の老人斑の重要な成分であり、それらは神経毒性であり、進行性認知機能不全及び記憶喪失を引き起こし得る。この実験において、海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４０）斑及びＡβ（１−４２）斑の形成の変化は、免疫組織化学法により調査した。

具体的な方法：マウスに１００日間及び１５０日間にわたり連続的に投与した後に、１０匹〜１２匹のマウスを各々の群から取り出して、海馬及び大脳皮質の免疫組織学法を行った。ここで、１５０日間の投与を行ったマウスは、ＭＷＭ実験を終えたマウスであった。該マウスに、５％の抱水クロラール（１０μＬ／ｇ）の腹腔内注射により麻酔をし、四肢を実験台上で固定し、開胸することで、心臓を完全に露出させた。開胸術の間に肝臓を切らないように注意する。左心室を、まずは５０ｍＬの０．１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳで５分間にわたり洗浄して血液を除去し、次いで４％のパラホルムアルデヒドを含む０．１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳを使用して、６分間にわたり灌流固定した。灌流固定の後に、脳を取り出し、それを４℃で４％のパラホルムアルデヒド中に入れ、一晩固定した。それらの組織を、１０％、２０％、及び３０％のスクロース溶液を勾配により順番に用いて脱水し、後で使用するために−８０℃で貯蔵した。それらの組織をパラフィンで包埋した。中脳、海馬、及び大脳皮質（８μｍ厚）を、マウスの脳マップを参照してスライスし、それを免疫組織化学染色のために使用した。該工程は以下の通りである。凍結した８μｍ厚のスライスを３０分間にわたり室温に保ち、４℃のアセトン中で２０分間にわたり固定し、ＰＢＳで３回（毎回５分間）にわたり洗浄し、次いでペルオキシダーゼ活性を無くすために３％のＨ_２Ｏ_２中で１０分間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで３回（１回につき５分間）洗浄した後に、それらのスライスを、１０％の正常ヤギ血清を用いて室温で４０分間にわたりブロッキングした（Ａβ（１−４２）免疫組織化学法のために使用されるスライスは、ブロッキング前に１０％のギ酸中で１０分間にわたりインキュベートして、抗原活性を回復させた）。その血清を捨て、抗Ａβ（１−４０）（ａｂ２００６８、１：２０希釈）又は抗Ａβ（１−４２）作業液（ａｂ１２２６７、１：２００希釈）を、上記スライスへと添加し、それらを室温で２時間にわたりインキュベートし、ＰＢＳで３回（１回につき５分間）洗浄した。セイヨウワサビ酵素標識されたストレプトアビジン（ＰＢＳで希釈）を、二次抗体作業溶液に滴加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳで３回（１回につき５分間）洗浄した後に、硫酸ニッケルで増感されたＤＡＢ青色反応法を、発色のために１０分間にわたり採用した。陽性の生成物が暗青色で、バックグラウンドが澄明となったら、それを蒸留水で３回にわたりすすいで、発色を止めた。ヘマトキシリンで１分間にわたり対比染色した後に、それを水道水ですすぎ、換気された場所で乾燥させ、中性ガムを用いて封止した。全海馬及び大脳皮質中のＡβ斑の数を観察し、共焦点顕微
鏡により計数した。各々の試料は、左心室及び右心室の両方を含む２つのスライスを並行試料として含んでいた。統計分析のために平均値を計算した。全てのデータをＳＰＳＳソフトウェア（ＳＰＳＳ ２１）により処理し、それらのｔ検定又は１元配置分散分析を行った。Ｐ＜０．０５が、統計学的に有意差があることを意味した。

実施形態２における１．８ｎｍの平均サイズを有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとり、投与から１５０日後の水迷路実験の結果を図１４に示した。それらの結果により、モデルコントロール群並びに高用量群及び低用量群におけるマウス間で、位置付けナビゲーション試験の１日目〜２日目に逃避潜時における統計的な差がないことが示された（Ｐ＞０．０５、ｎ＝１０匹〜１２匹／群）（図１４のパネルＡ）。トレーニング時間が増えると、高用量群におけるマウスの逃避潜時は、３日目及び４日目にモデル群における逃避潜時よりも明らかに短くなり（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５）、そして低用量群における逃避潜時は、モデル群における逃避潜時より短くなったが、統計学的な差はなかった（Ｐ＞０．０５、図１４のパネルＡを参照）。マウスの位置付けナビゲーション実験の完了後に、プラットフォームを取り除き、空間探索実験（space search experiment）を
開始した。それらの結果により、モデルコントロール群内のマウスと比較して、高用量群内のマウスが、プラットフォームを横切る回数及び対象となる四分円中での遊泳距離において大幅な増加を示し（Ｐ＜０．０５）、そして対象となる四分円内に留まる時間もまた大幅な増加を示す（Ｐ＝０．０５）ことが示された。モデルコントロール群内のマウスと比較して、低用量群内のマウスは、プラットフォームを横切る回数、対象となる四分円中での遊泳距離、及び対象となる四分円内に留まる時間において増加を示したが、有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）（図１４のパネルＢ〜パネルＤ）。上記結果により、ＡｕＣの１５０日間の投与後に、ＡｕＣは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスが空間位置及び方向知覚を学習及び記憶する能力を大幅に改善することが示された。そしてこの効果は用量依存的であった。

海馬及び大脳皮質中のＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）のアミロイド沈着の分布を検出するための免疫組織化学実験の結果を、図１５〜図１８に示す。

図１５のパネルＡ、パネルＢ、及びパネルＣは、投与の第１００日目における高用量群、低用量群、及びモデルコントロール群における海馬及び大脳皮質のＡβ（１−４０）の典型的な免疫組織化学的スライスの結果であった。図１５のパネルＤは、統計学的結果であった。それらの実験結果により、モデルコントロール群と比較して、高用量群内のマウスが、投与の第１００日目に海馬においてＡβ（１−４０）斑の大幅な減少を伴い（４４．６±１２．２％、Ｐ＜０．０５）、大脳皮質においてはＡβ（１−４０）斑の大幅な減少を伴わない（Ｐ＞０．０５）ことが示された。低用量群は、海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４０）斑の形成に対して大きな効果を有しなかった（Ｐ＞０．０５）。図１６は、Ａβ（１−４２）の対応する結果を示した。それにより、高用量での投与は、大脳皮質におけるＡβ（１−４２）斑の形成を大幅に減少させ得るが（６１．５±１１．４％だけ減少、Ｐ＜０．０５）、海馬においては大幅に減少させない（Ｐ＞０．０５）ことが示された。低用量での投与は、海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４２）斑の形成に対して大きな効果を有しない（Ｐ＞０．０５）。これらの結果により、投与の第１００日目に、ＡｕＣがＡβ（１−４０）斑及びＡβ（１−４２）斑の形成に対して大きな阻害効果を示し、この効果は明らかな用量依存的な関係を示すことが示された。

投与時間及びマウスの齢の増加とともに、マウスの海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４０）斑及びＡβ（１−４２）斑の形成は、投与１００日と比較して、投与１５０日でのモデルコントロール群において大幅に増加した。具体的には、Ａβ（１−４０）は海馬において５７．２±７．２％増加し（Ｐ＜０．０５）、大脳皮質において４９．１±１９．６％増加し（Ｐ＜０．０５）、そしてＡβ（１−４２）は海馬において７４．４±７．
０％増加し（Ｐ＜０．０５）、大脳皮質において６５±１１．１％増加した（Ｐ＜０．０５）。モデルマウスがより高齢になるほど、記憶機能及び認知機能に対する影響はより大きくなるであろうことが示唆された。図１７のパネルＡ、パネルＢ、及びパネルＣは、それぞれ投与の第１５０日目における高用量群、低用量群、及びモデルコントロール群における海馬及び大脳皮質のＡβ（１−４０）の典型的な免疫組織化学的スライスの結果であった。図１７のパネルＤは、統計学的結果であった。それらの結果により、高用量群においては、Ａβ（１−４０）は、マウスの海馬及び大脳皮質の両方において明らかに減少し（海馬において５９．０±１１．１％（Ｐ＜０．０５）だけ減少し、かつ大脳皮質において３６．４±４．５％（Ｐ＜０．０５）だけ減少した）、一方で、低用量での投与は、海馬においてＡβ（１−４０）斑の形成に対して大きな効果を有しなかったが（Ｐ＞０．０５）、大脳皮質においてはＡβ（１−４０）斑は大幅に減少した（２６．９±２．１％（Ｐ＜０．０５）ことが示された。ＡｕＣは、第１５０日目にＡβ（１−４０）斑の形成に対して大幅な阻害効果を有することが示された。この効果はまた、用量依存的な関係性を示した。さらに、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して、１５０日目の水迷路実験におけるＡβ（１−４０）斑の数とプラットフォームを横切る回数との間の相関を分析した。その分析により、海馬及び大脳皮質中のＡβ（１−４０）斑の数が、プラットフォームを横切る回数と大きな負の相関を有することが明らかになった（海馬：Ｒ＝−０．８４８、Ｐ＜０．０１、大脳皮質：Ｒ＝−０．８０２、Ｐ＜０．０５）。さらに、この結果により、ＡｕＣ投与により誘導された海馬及び大脳皮質中のＡβ（１−４０）斑の減少と、ＡｕＣ投与により誘導されたマウスの記憶能力及び学習能力の改善との間の相関が確認された。

図１８は、１５０日のＡｕＣ投与によるＡβ（１−４２）の対応する結果を示す。それらの結果により、高用量でのＡｕＣ投与は、海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４２）斑の形成を明らかに阻害することが示された（海馬において５１．１±６．７％（Ｐ＜０．０５）だけ減少させ、大脳皮質において６２．８±４．６％（Ｐ＜０．０５）だけ減少させた）。低用量での投与は、マウスの海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４２）斑の形成に対して明らかな効果を有しなかった（Ｐ＞０．０５）。ＡｕＣは、第１５０日目にＡβ（１−４２）斑の形成に対して大きな阻害効果を有することが示された。この効果は、用量依存的な関係性を示した。ＳＰＳＳによる相関統計分析により、海馬及び大脳皮質中のＡβ（１−４２）斑の数が、プラットフォームを横切る回数と大きな負の相関を有することが明らかになった（海馬：Ｒ＝−０．７９４、Ｐ＜０．０５、大脳皮質：Ｒ＝−０．８０２、Ｐ＜０．０５）。さらに、この結果により、ＡｕＣ投与により誘導された海馬及び大脳皮質中のＡβ（１−４２）斑の減少と、ＡｕＣ投与により誘導されたマウスの記憶能力及び学習能力の改善との間の相関が確認された。

まとめると、ＡｕＣは、ＡＤモデルマウスの認知行動を大幅に改善し、海馬及び大脳皮質におけるＡβ（１−４０）斑及びＡβ（１−４２）斑の形成を阻害することができ、したがってＡｕＣは、病気のマウスの病状の発症を抑え、ＡｕＣ含有物質としてＡＤの予防及び治療のために使用することができた。

表１に列挙されるその他のリガンドで修飾されたＡｕＣは同様の効果を有するので、それらは本明細書で詳細に記載しなかった。

実施形態６：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのα−ｓｙｎの凝集動態の実験
この実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのα−ｓｙｎの凝集動態実験によりリガンド修飾されたＡｕＣの機能を確認し、それを、リガンド分子を単独で使用した場合のそのα−ｓｙｎの凝集動態に対する効果と比較し、こうしてその機能がリガンドではなくＡｕＣに起因するものであることが実証された。

チオフラビンＴ（略記：ＴｈＴ）は、アミロイド線維を特異的に染色するための色素で
ある。ＴｈＴをポリペプチド又はタンパク質の単量体と一緒にインキュベートする場合に、その蛍光はそれほど変化しない。ＴｈＴが線維構造を有するアミロイドポリペプチド又はタンパク質に出くわすと、そのアミロイドポリペプチド又はタンパク質と直ちに結合し、その蛍光強度は指数関数的に増加することとなる。この理由のため、ＴｈＴは、ペプチド又はタンパク質のアミロイドーシスをモニタリングするためのマーカーとして広く使用されている。この実施形態は、ＡｕＣの存在下でのα−ｓｙｎの線維化凝集の動態的過程をモニタリングするためにＴｈＴ蛍光標識法を利用する。具体的な実験方法は、以下の通りであった。

α−ｓｙｎ単量体の前処理：α−ｓｙｎの凍結乾燥粉末（Bachem Corp.社）をＨＦＩＰ中に溶解させて、１ｇ／Ｌのα−ｓｙｎ溶液を得た。その溶液を、密封後に室温で２時間〜４時間にわたりインキュベートし、次いでＨＦＩＰを高純度窒素によりドラフトチャンバ内で風乾させた。最後に、乾燥されたα−ｓｙｎを２００μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、密封後にその溶液を、後に使用するために１週間以内にわたり冷凍機中で−２０℃に保った。使用前に、α−ｓｙｎのＤＭＳＯ溶液を、α−ｓｙｎの濃度が２０μＭに達するまで、大量のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で希釈することで、α−ｓｙｎのＰＢＳ溶液を得た。その実験における全てのα−ｓｙｎのＰＢＳ溶液は新たに調製された。

試料の調製及び検出：表１に列挙される種々の濃度におけるリガンド修飾されたＡｕＣを、それぞれ３５μＭのα−ｓｙｎのＰＢＳ溶液に添加し、９６ウェルプレート中で３７℃においてＴｈＴ蛍光標識法によって連続的にインキュベートし、蛍光強度をマイクロプレートリーダにより１０分毎に１回モニタリングした。α−ｓｙｎの凝集の動態過程を、ＴｈＴの蛍光強度の変化によって特性評価した。実施形態２で製造された１．８ｎｍの粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを、例えば実験群とした。ＡｕＣと結合されていないＬ−ＮＩＢＣ分子を、リガンドコントロール群として使用した。それぞれ０ｐｐｍ（モデルコントロール群として、α−ｓｙｎのみを含み、ＡｕＣ又はＬ−ＮＩＢＣを含まない）、１．０ｐｐｍ、５．０ｐｐｍ、及び１０．０ｐｐｍの４種の濃度のＡｕＣを採用する。それぞれ１．０ｐｐｍ及び１０．０ｐｐｍである２つの濃度においてＬ−ＮＩＢＣ分子を使用した。

それらの結果を図１９に示した。それらの結果により、３５μＭのα−ｓｙｎの３７℃でのインキュベート過程において、ＴｈＴ標識された蛍光強度が第４８時間目から迅速に増加することが示された。α−ｓｙｎの凝集及び線維化が起こったことが裏付けられた。これは、文献（V. N. Uversky, J. Li, P. Souillac, I. S. Millett, S. Doniach, R. Jakes, M. Geodert, A. L. Fink, Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 11970）に報告される結果と合致していた。リガンドコントロール群の結果により、Ｌ−ＮＩＢＣのみが使用されると、α−ｓｙｎの凝集の動態に対して明らかな効果を有しないことが示された（図１９のパネルＡ）。ＡｕＣを低濃度（例えば１．０ｐｐｍ及び５．０ｐｐｍ）で添加した実験群において、ＴｈＴ標識された蛍光強度は、ＡｕＣを添加しなかったモデルコントロール群及びリガンドコントロール群と比較して大幅に減少し、開始時間は明らかに遅延した（図１９のパネルＢ）。ＡｕＣの添加は、α−ｓｙｎの凝集及び線維化を大幅に阻害し得ることが示唆された。ＡｕＣ濃度が１０ｐｐｍに達したときに、ＴｈＴ標識された蛍光強度は、実験の１６８時間を通して一切増大することなくベースライン近くに留まった（図１９のパネルＢ）。ＡｕＣ濃度が十分に高い場合に、α−ｓｙｎの凝集及び線維化は完全に阻害され得ることが示唆された。

この実験において、表１に列挙されるその他の種々のリガンドで修飾されたＡｕＣも研究した。例えば、図１９のパネルＣ〜パネルＪでは、Ｄ−ＮＩＢＣ、ＣＲ、ＲＣ、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）
、ＧＳＨ、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＡＣ）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）及びＤ−システイン（Ｄ−Ｃｙｓ）で修飾されたＡｕＣ（用量は全て１０ｐｐｍであった）の、α−ｓｙｎの凝集及び線維化に対する阻害効果が示された。種々のリガンドで修飾されたＡｕＣについても同様の現象が観察され、同じ結論に達し得た。これらのリガンド自体は、α−ｓｙｎの凝集及び線維化に影響を及ぼし得ないが、リガンド修飾されたＡｕＣは、α−ｓｙｎの凝集及び線維化に対して優れた阻害効果を有した。その濃度が１０ｐｐｍに達した場合には、完全な阻害効果を全てが達成し得た。完全な阻害のために必要とされる最小濃度は、種々のリガンドで僅かに変動する。同様にこれらのリガンド修飾されたＡｕＣは、本発明において定義されるＡｕＣ含有物質に分類された。表１に列挙されるその他のＡｕＣは、同様の効果を有していた。α−ｓｙｎの凝集及び線維化の完全な阻害のために必要とされるＡｕＣの濃度だけは異なっていた。それは詳細に記載しないこととする。

実施形態７：ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞（ＳＨ−ｓｙ５ｙ）モデルの実験
実験１：
この実験は、細胞生存性を指標として使用する。ＣＣＫ−８法から得られた試験結果は、リガンド修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子の、ＰＤのＳＨ−ｓｙ５ｙ神経細胞モデルにおけるＭＰＰ^＋（よく使用される神経毒）の毒性効果に対する抵抗効果を反映し、こうして、それらのＰＤに対する神経保護効果が裏付けられる。ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞モデルは、文献（Cassarino, D S; Fall, C P; Swerdlow, R H; Smith, T S; Halvorsen, E
M; Miller, S W; Parks, J P; Parker, W D Jr; Bennett, J P Jr. Elevated reactive oxygen species and antioxidant enzyme activities in animal and cellular models of Parkinson's disease. Biochimica et biophysica acta.1997.1362.77-86）での記載に従って樹立される。具体的な方法は以下の通りであった。

１）対数増殖期におけるＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を、完全培地で希釈して、５×１０^４／ｍＬの細胞密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬで接種し、５％ＣＯ_２を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。細胞がウェルに接着されたときに、試料を添加した。

２）種々の粒度及び種々の濃度を有する、１００μＬのリガンド修飾されたＡｕＣ試料（表１に列挙される）又はリガンド修飾された金ナノ粒子試料を、維持培地中に溶解させ、第１の群として添加して、最終濃度をそれぞれ０．０１ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、及び２０ｐｐｍにした。第１の群は、投与群であった。リガンド修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子での前処理の２時間後に、ＭＰＰ^＋（最終濃度は１ｍＭであった）を、それぞれ投与群及び細胞コントロール群に同時に添加し、ブランクコントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を含まない群であり、ネガティブコントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を含むが、ＡｕＣ又は金ナノ粒子及びＭＰＰ^＋を含まない群であり、細胞コントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞及び１ｍＭのＭＰＰ^＋のみを含む群であり、そしてリガンドコントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞及び１ｍＭのＭＰＰ^＋並びに対応するリガンド分子（最終濃度は２０ｐｐｍであった）を含む群であり、次いで全ての群における試料を、３７℃で２４時間にわたりインキュベートし、遠心分離することで、培養培地を除去し、１０％のＣＣＫ−８を含有する１００μＬの維持培地を各々のウェル中に添加し、４時間にわたりインキュベートし続け、その後に各々のウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定することで、リガンド修飾されたＡｕＣのＭＰＰ^＋病変に対する事前保護効果及び治癒効果が反映された。

種々のリガンドで修飾されたＡｕＣ及び金ナノ粒子のための実験を実施するために同じ工程を採用した。それらの結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣがＰＤに対して神経保護効果を有することが示された。この効果もリガンドではなく
ＡｕＣに起因するものであった。それらは、ＰＤを抑えるためにＡｕＣ含有物質として使用することができる。

実験２：
この実験は、細胞生存性を指標として使用する。ＣＣＫ−８法から得られた試験結果は、リガンド修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子の、ＰＤのＳＨ−ｓｙ５ｙ神経細胞モデルにおけるＭＰＰ^＋（よく使用される神経毒）の毒性効果に対する抵抗効果を反映し、それらのＰＤに対する神経保護効果が裏付けられる。ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞モデルは、参考文献（D. S. Cassarino, C.P. Fall, R. H. Swerdlow, T. S. Smith, E. M. Halvorsen, S. W. Miller, J. P. Parks, W. D. Jr. Parker, J. P. Jr. Bennett, Biochimica et Biophysica Acta 1997, 1362, 77）での記載に従って樹立される。具体的な方法：
１）対数増殖期におけるＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を、完全培地で希釈して、５×１０^４／ｍＬの細胞密度で細胞懸濁液を得た。その懸濁液を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２００μＬで接種し、５％ＣＯ_２を有するインキュベーター中にて３７℃で培養した。細胞がウェルに接着されたときに、試料を添加した。

２）種々の粒度及び種々の濃度を有する、１００μＬのリガンド修飾されたＡｕＣ試料（表１に列挙される）又はリガンド修飾された金ナノ粒子試料を、維持培地中に溶解させ、第１の群として添加して、最終濃度をそれぞれ０．０１ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、及び２０ｐｐｍにした。第１の群は、投与群であった。リガンド修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子での前処理の２時間後に、ＭＰＰ^＋（最終濃度は１ｍＭであった）を、それぞれ投与群及び細胞コントロール群に同時に添加し、ブランクコントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を含まない群であり、ネガティブコントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞を含むが、ＡｕＣ又は金ナノ粒子及びＭＰＰ^＋を含まない群であり、細胞コントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞及び１ｍＭのＭＰＰ^＋のみを含む群であり、ＡｕＣコントロール群、そしてリガンドコントロール群は、ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞及び１ｍＭのＭＰＰ^＋並びに対応するリガンド分子（最終濃度は２０ｐｐｍであった）を含む群であり、次いで全ての群における試料を、３７℃で２４時間にわたりインキュベートし、遠心分離することで、培養培地を除去し、１０％のＣＣＫ−８を含有する１００μＬの維持培地を各々のウェル中に添加し、４時間にわたりインキュベートし続け、その後に各々のウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定することで、リガンド修飾されたＡｕＣのＭＰＰ^＋病変に対する事前保護効果及び治癒効果が反映された。

Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣ又は金ナノ粒子の実験結果は、例えば図２０に示されるように解釈された。それらの結果により、培養の２４時間後に、ＭＰＰ^＋を有しない１００ｍＭのＡｕＣを添加したＡｕＣコントロール群の細胞生存性が、ブランクコントロール群（１００％として定める）に対して１０８．５±７．１％に高まることが示されたので（Ｐ＜０．０１）、ＡｕＣは無毒性であることが示唆される。１ｍＭのＭＰＰ^＋を添加したがＡｕＣを有しないモデルコントロール群の細胞生存性は、６５．１±４．０％に減少し（ブランクコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）、リガンドコントロール群の細胞生存性は６１．５±３．８％であったので（ブランクコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）、リガンド単独は、ＭＰＰ^＋誘導された細胞モデルの生存性を高めないことが示唆される。それぞれ１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ及び４０ｐｐｍのＡｕＣを添加した投与群の細胞生存性は、それぞれ９７．９±２．８％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）、９９．７±４．０％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．００１）、９５．３±１．７％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）、及び９３．２±０．４％（モデルコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１）に増大したので、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣがＰＤにおいて神経細胞に対して保護効果を有し、この効果もリガンドではなくＡｕＣに起因するものであることが示唆される。他方で、同じリガンドを有する対応する金ナノ粒子は、全ての実験濃度でモデル細胞の生存性
の改善を補助しなかったので、金ナノ粒子は、ＰＤの予防及び治療のための医薬として使用することはできないことが示される。

表１に列挙される種々のリガンドで修飾されたＡｕＣのための実験を実施するために同じ工程を採用した。それらの効果は同様であったので、それは本明細書では詳細に記載しないこととする。

実施形態８：ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞（ＰＣ１２）モデルの実験
ＰＣ１２細胞のＭＰＰ^＋（１００ｍＭ）誘導されたアポトーシスのモデルを、フローサイトメトリー技術と組み合わせて使用して、この実験においてＡｕＣのＭＰＰ^＋誘導された細胞の傷害及びアポトーシスに対する保護効果を観察した。具体的な方法：ブランクコントロール群は、ＭＰＰ^＋及びＡｕＣを添加しない群であり、ＭＰＰ^＋モデル群は、ＭＰＰ^＋のみを添加した群であり、ＡｕＣコントロール群は、ＡｕＣのみを添加した群であり、そして実験群は、ＭＰＰ^＋及びＡｕＣの両方を添加した群であった。実験群において、１．８ｎｍの平均粒度を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの溶液を、ＰＣ１２細胞懸濁液（ＡｕＣの最終濃度は２０ｐｐｍであった）に添加し、半時間後にＭＰＰ^＋を添加し、その混合物を２４時間にわたりインキュベートし、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ／ＰＩ細胞アポトーシス検出キット（Roche社から購入）及びＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロー
サイトメーターを使用して、細胞の増殖活性及びアポトーシスを検出し、そのデータを取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏにより分析した。

それらの実験結果を図２１に示した。細胞サイトメトリー検出結果により、細胞サイトメトリー検出において示されるように、ＭＰＰ^＋と一緒に２４時間にわたりインキュベートした後に、ＭＰＰ^＋を添加しなかったブランクコントロール群の細胞アポトーシスのパーセントは、２３．５％±２．８％であることが示された。２０ｐｐｍのＡｕＣ単独を、ＰＣ１２細胞と一緒に同時インキュベートした場合に、細胞アポトーシスのパーセントは、２８．４７±３．２％であり、ブランクコントロール群と有意差を示さなかったので、ＡｕＣは明らかな細胞毒性作用を有しないことが示唆される。ＭＰＰ^＋モデル群の細胞アポトーシスのパーセントは、４９．５±１０．１％であり、それは、ブランクコントロール群と比較して大幅に増大した（Ｐ＜０．００１）。ＰＣ１２細胞をＡｕＣと一緒にＭＰＰ^＋の添加前に半時間にわたりインキュベートし、それらを２４時間にわたり同時インキュベートした場合に、細胞アポトーシスのパーセントは、ＭＰＰ^＋モデル群と比較して３５．９±２．２％に減少し、細胞アポトーシスは大幅に減少した（Ｐ＜０．０５）。

表１に列挙される種々のリガンドで修飾されたＡｕＣのための実験を実施するために同じ工程を採用した。それらの効果は同様であったので、それは本明細書では詳細に記載しないこととする。

実施形態７と実施形態８との結果を合わせることで、ＡｕＣが細胞生存性を効果的に改善し、ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞モデルの細胞アポトーシスを大幅に阻害し得ることが示された。

実施形態９：ＭＰＴＰ誘導されたＰＤマウスモデルの実験
実験１：
実験動物：８週齢の体重２５ｇ〜３０ｇの８０匹のＣ５７ｂｌ／６雄マウス；各々のケージ中の３匹のマウスを全て、室温２２℃〜２７℃の環境下で、１２時間の概日リズムで、飲食を自由にして飼育し、７日間にわたり馴化させた。

ＭＰＴＰ誘導されたＰＤマウスモデル：マウスを、ブランクコントロール群、ＡｕＣ正常コントロール群、ＭＰＴＰモデル群、及びＡｕＣ処置群を含む４つの群に１群当たり２
０匹のマウスで無作為に分けた。ＭＰＴＰモデル群及びＡｕＣ処置群において、２０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）ＭＰＴＰを、２時間毎に１回で４回にわたり皮下注射した。ブランクコントロール群においては、２０ｍｇ／ｋｇの生理食塩水を、２時間毎に１回で４回にわたり皮下注射した。最後の注射より８時間後に、ブランクコントロール群及びＭＰＴＰモデル群において、１０μＬの生理食塩水を毎日静脈注射し、一方で、ＡｕＣ正常コントロール群及びＡｕＣ処置群においては、表１中に列挙されるリガンド修飾されたＡｕＣの１０μＬの生理食塩溶液（ＡｕＣ濃度は１０ｇ／Ｌ）を、それぞれ毎日腹腔内注射した。上記注射は、７日間にわたり継続した。それらの動物を、清浄なパディングを有する給餌ボックス中に入れ、水と食料とを自由に与えた。

行動試験：ロータロッド試験、ロータロッド試験は、動物がローラー上でバランスを保ち、動き続けることを必要とする。その試験は、運動協調性を試験するために広く使用される試験である。ローラーの直径は６ｃｍであり、回転速度は２０ｒｐｍである。動物を５回にわたりローラーに順応させた後に、試験を１分間の間隔で開始した。ロータロッドから落下するまでの潜時を５回にわたり連続的に記録し、それらの平均値を計算した。

神経伝達物質測定：行動試験の後に、それらの動物を屠殺し、マウスの線条体を取り、−８０℃で貯蔵した。測定に際してその線条体を１０μＬ／ｍｇ（線条体）のホモジェネート（０．１Ｍの過塩素酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａ）で処理し、氷浴中で超音波により３０分間にわたり破砕し、冷却式遠心分離器中で１００００回転／分で１０分間にわたり遠心分離した。上清を取り、０．２５μｍのフィルタで濾過し、ＨＰＬＣの液体クロマトグラフィーカラム中に注入した。線条体中のドーパミン（ＤＡ）伝達物質並びにその代謝産物である３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）及びホモバニリン酸（ＨＶＡ）のレベルを、研究室において高性能液相システムにより検出した。クロマトグラフィーカラムは、各試験前に２時間にわたり、新たに調製された移動相で維持せねばならない。ＨＰＬＣ条件：流速：１ｍＬ／分、カラム温度３０℃、蛍光検出器の励起波長及び吸収波長は、それぞれ２８０ｎｍ及び３３０ｎｍであった。

チロシンヒドロキシラーゼの測定：脳組織を取り出し、４重量％ＰＦＡ＋２重量％スクロース中で４時間〜６時間にわたり固定し、次いで３０重量％スクロース溶液中に浸漬させ、該組織が底に沈んだ後にＯＣＴで包埋し、凍結スライサーにより連続的な冠状断面で切片にし、ＡＢＣ（アビジン・ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Avidibiotin-peroxidase complex））法で染色し、黒質の凍結組織を取り出し、それらを切片にし、ＴＨ中で染色し、ジフェニルアミンで発色させ、顕微鏡下で観察し、写真を撮影した。

それらの結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣが、ＭＰＴＰ誘導されたＰＤモデルマウスの運動行動を大幅に改善し、ドーパミン作動性ニューロンの数を増大させ、ドーパミン神経伝達物質の脳内レベルを改善し得ることが示された。それらは、ＰＤを治療するためにＡｕＣ含有物質として使用することができた。

実験２：
実験動物：８週齢の体重２５ｇ〜３０ｇの８０匹のＣ５７ｂｌ／６雄マウス；各々のケージ中の３匹のマウスを全て、室温２２℃〜２７℃の環境下で、１２時間の概日リズムで、飲食を自由にして飼育し、７日間にわたり馴化させた。

ＭＰＴＰ誘導されたＰＤマウスモデル：マウスを、ブランクコントロール群、ＡｕＣコントロール群（ＡｕＣの用量に基づいて、それらを低用量群及び高用量群に分類した）、ＭＰＴＰモデル群、ＡｕＣ処置群（ＡｕＣの用量に基づいて、それらを低用量群及び高用量群に分類した）を含む４つの群に１群当たり２０匹のマウスで無作為に分けた。ＭＰＴＰモデル群及びＡｕＣ実験群において、３０ｍｇ／ｋｇ（遊離塩基）ＭＰＴＰを、１日に
１回で７日間にわたりそれぞれ連続的に腹腔内注射した。ブランクコントロール群においては、３０ｍｇ／ｋｇの生理食塩水を、１日に１回で７日間にわたり連続的に皮下注射した。低用量ＡｕＣコントロール群及び低用量ＡｕＣ処置群においては、１．８ｎｍの平均粒度を有する１ｇ／ＬのＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの１００μＬの生理食塩溶液を、それぞれ１日に１回で腹腔内注射し、一方で、高用量ＡｕＣコントロール群及び高用量ＡｕＣ処置群においては、１．８ｎｍの平均粒度を有する４ｇ／ＬのＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの１００μＬの生理食塩溶液を、それぞれ１日に１回で７日間にわたり連続的に腹腔内注射した。それらの動物を、清浄なパディングを有する給餌ボックス中に入れ、水と食料とを自由に与えた。

１． 行動試験：
（１）自発運動試験：動物をケージから自発運動検出装置に移した。それらの動物を新しい環境に５分間にわたり順応させた後に、それらの自発運動及び変化を５分間内で記録した。それらの動物の５分間内での運動距離及び移動速度を用いて、動物の運動量を測定した。

（２）遊泳試験：ドナンの試験法（G. A. Donnan, G. L. Willis, S. J. Kaczmarezyk,
P. Rowe, Journal of the Neurological Science 1987, 77, 185）を参照して、試験マ
ウスをモリスの水槽中に入れた。水の深さは６０ｃｍであり、温度は２２℃であった。それらの動物の１０分間内での遊泳距離及び遊泳時間を記録して、それらの動物の運動量を測定した。

（３）ロータロッド試験：ロータロッド試験は、動物がローラー上でバランスを保ち、動き続けることを必要とする。その試験は、運動協調性を試験するために広く使用される。ローラーの直径は６ｃｍであり、回転速度は２０ｒｐｍである。動物を５回にわたりローラーに順応させた後に、全ての試験を１分間の間隔で実施した。ロータロッドから落下するまでの潜時を記録した。それらの試験を５回にわたり連続的に行い、それらの平均値を計算した。

２． 線条体及び黒質における免疫組織化学的検出：
行動試験の後に、各々の群内の５匹のマウスを取り出し、黒質及び線条体における免疫組織化学的検出を行った。１ｍＬの０．５％のペントバルビタールナトリウムにより腹部麻酔をした後に、開胸し、１５ｍＬの０．９％の生理食塩水を使用して、最初に大動脈からの血液をすすぎ、次いで４％のパラホルムアルデヒドを含む１００ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）を使用して、灌流（最初は速く、その後ゆっくり）及び固定を１時間にわたり行った。灌流固定の後に脳を取り出し、４％のパラホルムアルデヒド中に入れ、パラフィンで包埋し、マウスの脳マップを参照して黒質及び線条体を冠状断面で切片にした。脳スライスの厚さは、３μｍ／切片であった。得られた脳スライスを、免疫蛍光による超高感度の２段階免疫組織化学法及びその他の実験において使用した。免疫化学的染色工程は、以下の通りであった。得られた脳スライスを、３０分間にわたり０．３％のＨ_２Ｏ_２メタノール溶液（３０％Ｈ_２Ｏ_２ １ｍＬ＋メタノール ８０ｍＬ＋ＰＢＳ １９ｍＬ）中に入れ、３０分間にわたり０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ＰＢＳ中に入れ、マウス抗チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）モノクローナル抗体（１：２００）又はＩＢａ１（希釈比１：２５０）中に浸漬させ、４８時間（４℃）にわたりインキュベートし、ビオチニル化ウサギ抗マウス二次抗体（１：５００）中に浸漬させ、２時間（室温）にわたりインキュベートした。それらを蒸留水で素早くすすぎ、２０分間〜３０分間にわたる硫酸ニッケルアンモニウムで増感されたＤＡＢ青色反応法により発色させた。陽性の生成物が暗青色で、バックグラウンドが澄明となったら、それらの脳スライスを蒸留水で３回にわたりすすいで、発色を止めた。上記工程のそれぞれの後に、上記脳スライスは、０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳにより３回にわたり毎回１０分間に
わたってすすぐべきである。そしてここで使用された一次抗体は、１％ウシ血清及び０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳで希釈され、二次抗体及びＡＢＣの複合体は、ＰＢＳで希釈された。脳スライスの付着、脱水、及び透明な中性ガムでの封止を行った。

３． タンパク質イムノブロッティング（ＷＢ）アッセイ：
チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）は、ドーパミン（ＤＡ）の生合成経路における主要な酵素であり、ＴＨの免疫組織化学法は、黒質及び線条体中のＤＡ作動性ニューロンにおいて変化を示す（D. Luo, J. Zhao, Y. Cheng, S. M. Lee, J. Rong, Molecular Neurobiology 2017, DOI: 10.1007/s12035-017-0486-6）。行動試験の後に、各々の群から５匹のマウスを取り出し、線条体のＷＢ検出を行い、必要とされる脳組織を氷上に取り出し、ＲＩＰＡ溶解物中で破砕し、４℃及び１２０００ｇで３０分間にわたり遠心分離して均質化し、タンパク質を抽出して試料を調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を５５Ｖ〜６０Ｖで４．５時間にわたり行い、そしてタンパク質を、セミドライ法により６０ｍＡの一定電流で約１．５時間にわたりメンブレンに転写させた。上記メンブレンを、５％のスキムミルクを用いて室温で１時間にわたりブロッキングし、ＴＢＳＴ希釈されたウサギＴＨ抗体（希釈比１：３００）を添加し、４℃で一晩静置し、抗体を回収し、そのメンブレンをＴＢＳＴで３回にわたり毎回１０分間洗浄し、ＴＢＳＴ希釈されたＩＲＤｙｅ
Ｒ ６８０ＲＤヤギ抗ウサギ（希釈比１：３０００）を添加し、そのメンブレンをＴＢＳＴで３回にわたり毎回１０分間洗浄し、タンパク質シグナルを、２色赤外線レーザーイメージングシステムによりスキャンした。

マウスの自発運動の試験結果を図２２に示した。ＭＰＴＰの投与から３分〜５分後に、マウスは、振戦、運動の減少、弓状に曲がった背中、後脚の開放、歩行の不安定性、垂直に延びた尻尾、及び逆立った毛を示した。個々の癲癇性発作は、約３０分〜６０分後に起こった。上記症状は徐々に軽減し、マウスは２４時間後に通常に戻った。しかしながら、投与回数が増えると、急性期反応は和らぐが、それは２４時間後であり、運動能力は減少し、歩行の不安定性、及び緩慢な応答は、より明白となった。７日間にわたるＭＰＴＰの連続的投与後に、マウスの自発運動距離及び移動速度は、運動緩慢の症状を示すブランクコントロール群のそれよりも大幅に低かった（Ｐ＜０．０１）。ＡｕＣ単独の投与は、正常なマウスの自発運動距離及び移動速度に対して大きな効果を有しなかった（図２２のパネルＡ及びパネルＣ）。ＭＰＴＰモデルのマウスにおけるＡｕＣの併用投与（高用量）は、マウスの自発運動距離及び移動速度を大幅に増大させることができたので（図２２のパネルＢ及びパネルＤ）、ＡｕＣが、ＭＰＴＰモデルマウスの自発運動の改善に大きな役割を担うことが示唆される。ＭＰＴＰモデル群と比較して有意差があった（自発運動距離：Ｐ＜０．０５、移動速度：Ｐ＜０．０１）。

マウスの遊泳試験の結果を図２３に示した。連続的なＭＰＴＰ注射の７日後に、マウスを水槽に入れて、遊泳試験を行った。マウスのより長い遊泳時間及びより長い遊泳距離は、そのマウスが四肢のより良好な運動協調性を有することを示す。ブランクコントロール群及びＡｕＣコントロール群は、マウスの遊泳時間及び遊泳距離に対して大きな効果を有しなかった（図２３のパネルＡ及びパネルＣ）。ブランクコントロール群と比較して、ＭＰＴＰモデル群は、１０分間での遊泳距離の大幅な減少（Ｐ＜０．０５）、水槽における遊泳時間の大幅な減少（Ｐ＜０．０５）を示したので、ＭＰＴＰがマウスに関する遊泳の運動能力を大幅に減少させることが示唆される。ＭＰＴＰモデル群と比較して、ＡｕＣ（高用量）及びＭＰＴＰの投与を伴うＡｕＣ処置群は、遊泳距離の増加（Ｐ＜０．０５）、及び遊泳時間の大幅な増加（Ｐ＜０．０５）を示したので（図２３のパネルＢ及びパネルＤ）、ＡｕＣがマウスに関する遊泳のＭＰＴＰ誘導された運動行動障害を大幅に改善することが示唆される。

マウスのロータロッド試験の結果を図２４に示した。マウスに７日間にわたりＭＰＴＰを連続的に注射した後に、それらのマウスにロータロッド試験を行った。生理食塩水が投与されたブランクコントロール群においては、ロータロッドから落下するまでの潜時及びロータロッドから落下するマウスのパーセントは、１２．１±４．６分及び３３．３±１．５％であった（図２４のパネルＡ及びパネルＣ）。ブランクコントロール群と比較して、ＭＰＴＰモデル群におけるマウスのロッド落下潜時は、５．５±３．７分に大幅に短くなり、ロッド落下パーセントは、８３．３±３．４％に大幅に増加した。ＭＰＴＰの投与後に、マウスの運動協調性は減少し、それらのマウスはロッドをしっかり掴むことができず、ロータロッドから落下し易くなることが示された（図２４のパネルＢ及びパネルＤ）。ＡｕＣ単独の投与は、マウスの落下潜時に大きな効果を有しなかったが（図２４の画像Ａ）、長時間のローラー運動の間に、ロータロッドから落下するマウスのパーセントは大幅に増大した（Ｐ＜０．００１、ブランクコントロール群に対して）。ＡｕＣの投与自体は、マウスのローラー行動に対して一定の効果を有することが示された（図２４のパネルＣ）。しかしながら、ＭＰＴＰモデル群と比較して、ＭＰＴＰ及びＡｕＣの両方を投与したＡｕＣ処置群は、ロータロッドから落下するまでの潜時の明らかな増大（低用量群：Ｐ＜０．０１、高用量群：Ｐ＜０．０５）、及びロータロッドから落下するパーセントの大幅な減少（Ｐ＜０．００１、高用量群及び低用量群の両方について）を示した。それらの結果を図２４のパネルＢ及びパネルＤに示した。これにより、ＡｕＣがＭＰＴＰ誘導された運動協調性機能障害を改善する効果を有することが示された。

黒質及び線条体における免疫組織化学的検出並びに線条体のＷＢ検出の結果を図２５に示した。ブランクコントロール群と比較して、ＭＰＴＰモデル群は、黒質中のＴＨ免疫陽性ニューロン（すなわち、ＤＡ作動性ニューロン）の数の明らかな減少と共に、残りのニューロンの収縮及び神経突起の減少又は消失、並びに線条体中のＴＨ免疫陽性ニューロンの減少及び神経線維密度の減少を示した。ＷＢ分析の結果により、線条体中のＤＡ作動性ニューロンが５５．８±５．６％（ブランクコントロール群：１００％）に減少することが示された（ブランクコントロール群に対して、Ｐ＜０．０１、図２５のパネルＣを参照）。ＡｕＣ単独の投与は、黒質及び線条体中のＴＨ免疫陽性ニューロン及び神経線維の密度に対して大きな効果を有しなかった（図２５のパネルＡ及びパネルＢ）。ＡｕＣ及びＭＰＴＰの併用投与は、黒質及び線条体の細胞及びニューロフィラメント中でのＴＨ免疫陽性発現のＭＰＴＰ誘導された下方調節を大幅に阻害し得た。ＷＢ分析の結果により、低用量ＡｕＣが採用された場合に、線条体中のＤＡ作動性ニューロンの比率がブランクコントロール群の６５．６±６．３％であり（Ｐ＜０．０１、ＭＰＴＰモデル群に対して、図２５のパネルＣを参照）、高用量ＡｕＣが採用された場合に、線条体中のＤＡ作動性ニューロンの比率はブランクコントロール群の８４．７±４．５％に達することが示された（Ｐ＜０．００１、ＭＰＴＰモデル群に対して）。それらの結果により、ＡｕＣがＭＰＴＰ細胞毒性への抵抗に対して大きな効果を有し、黒質及び線条体におけるＤＡ作動性ニューロン損失に対して顕著な保護効果を示すことが示される。

表１に列挙される種々のリガンドで修飾されたＡｕＣを使用した実験を実施するためにも同じ工程を採用した。それらの効果は同様であったので、それは本明細書では詳細に記載しないこととする。

上記結果により、本発明において提供されるリガンド修飾されたＡｕＣが、ＭＰＴＰ誘導されたＰＤモデルマウスの自発運動、運動能力、及び身体協調性能力を大幅に改善することができ、黒質及び線条体におけるＤＡ作動性ニューロン損失に対して大きな保護効果を有することが示されたので、ＡｕＣ含有物質が、ＰＤの治療のために使用され得ることが示される。

実施形態１０：バイオセーフティ評価
１． ＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞系統を、ＡｕＣ含有物質のバイオセーフティを細胞レベルで評価するために採用した。

具体的な方法：細胞の対数増殖期にあるＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞（第６代継代の細胞）を収集した。細胞懸濁液の濃度を調節し、それぞれのウェル中に１００μＬで添加した。それらの細胞を撒いて、細胞密度を１ウェル当たり１０００個〜１００００個に調節した。細胞培養プレート（９６ウェルプレートの縁のウェルを細胞培養培地で満たした）を、細胞インキュベーター中に入れ、細胞が壁部に接着するように５％のＣＯ_２中で３７℃の環境で２４時間にわたりインキュベートした。該９６ウェルプレートを取り出し、次いでアルコールによる殺菌後にバイオセーフティキャビネット中に入れた。当初の細胞培養培地を吸い出し、次いで表１に列挙されるリガンド修飾されたＡｕＣの溶液を添加し、それらを細胞培養培地で希釈して、それぞれ１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、及び５００ｐｐｍの最終濃度を得た。等容量の新しい細胞培養培地をコントロール群（ＡｕＣなし）に添加した。そしてそれを細胞インキュベーター中に入れ、４８時間にわたりインキュベートした。実験群及びコントロール群のそれぞれについて、６個の重複ウェルを用意した。４８時間のインキュベートの後に、培養培地を遠心分離により除去し、次いでＰＢＳで２回〜３回にわたり洗浄した。１００μＬの新しい培養培地及び２０μＬのメチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液（５ｍｇ／ｍｌ、すなわち０．５％のＭＴＴ）を各ウェルに添加し、４時間にわたり培養し続けた。培養を止め、９６ウェルプレートを取り出し、１０分間にわたり遠心分離（１０００回転／分）した。上清を吸い出し、２００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、振盪台上に載せ、ウェル中の色が均一になり、結晶が完全に溶解するまで低速で１０分間にわたり振動させた。各ウェルの吸光度を、マイクロプレートリーダにより４９０ｎｍで測定した。上記作業は、滅菌環境で実施せねばならない。検出を除き、全ての工程はバイオセーフティキャビネット中で完結させた。実験用品は、使用前にオートクレーブ中で殺菌せねばならない。

実施形態２におけるＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとり、それらの結果を図２６に示した。そこではパネルＡ〜パネルＣは、２．６ｎｍ、１．８ｎｍ又は１．１ｎｍの粒度を有するＡｕＣの、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ又は５００ｐｐｍの最終濃度でのＳＨ−ｓｙ５ｙ細胞生存性に対する効果を示した。かなり高い濃度（例えば１００ｐｐｍ）では、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの添加は、細胞生存性に対して殆ど何ら影響を及ぼさないことが示された。より高い濃度（例えば２００ｐｐｍ及び５００ｐｐｍ）では、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣの添加は、僅かしか細胞の傷害をもたらさないこととなる（細胞死の率は２０％未満である）。１００ｐｐｍはＡｕＣの最小効果濃度（０．１ｐｐｍ〜１ｐｐｍ以下）よりもはるかに高いので、Ｌ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣは、細胞レベルで高い安全性を有すると結論付けることができた。

表１に列挙される種々のサイズを有するその他のリガンド修飾されたＡｕＣはまた、同様の効果を有していた。それらは本明細書では詳細に記載しないこととする。

２． ＡｕＣ含有物質の急性毒性を評価するためのマウス急性毒性研究の採用
具体的な方法：表１に列挙される種々のリガンド修飾されたＡｕＣ（実施形態２における１．８ｎｍの平均直径を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとる）に関して、６０匹の成体マウスを選び、各々の群内に１５匹のマウスで、１つのコントロール群及び３つの実験群である４つの群に分けた。コントロール群においては、マウスには通常の給餌を行ったが、３つの実験群においては、マウスには、経口投与（強制栄養により）により、それぞれ１日につき０．１ｇ／体重ｋｇ、０．３ｇ／体重ｋｇ、及び１ｇ／体重ｋｇの用量で通常の食餌条件下で１週間にわたりＡｕＣを供給した。ＡｕＣの供給が終わった後に、それらのマウスには３０日間にわたり通常の給餌を行った。マウスの異常な応答を観察した。

上記のマウス実験において、種々のサイズを有するＡｕＣの３つの濃度での摂取は、マウスの生存及び活動に影響を及ぼさなかった。１ｇ／体重ｋｇの高用量摂取の場合でさえも、マウスは依然として健康なままであった。

表１に列挙されるその他のリガンド修飾されたＡｕＣはまた、同様の結果を有していた。それらは本明細書では詳細には記載しないこととする。上記結果に基づいてＡｕＣが非常に安全であると結論付けることができた。

実施形態１１：マウスにおけるＣｕＣ含有物質の組織分布及び代謝分布
実験１：
作業工程：８０匹のマウスを、各々の群内に２０匹のマウスで４つの群に無作為に分け、表１に列挙されるリガンド修飾されたＡｕＣを経口投与（強制栄養により）により上記群においてそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１ｍｇ／ｋｇの用量で供給した。ＡｕＣを供給した後で、各々の群内の２０匹のマウスを、各小群内に５匹のマウスを有する４つの小群に無作為に分けた。それらのマウスを、供給後のそれぞれ２時間、６時間、２４時間、及び４８時間の時点で屠殺した。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び脳の組織を別々に採取した。各組織を秤量し、２ｍＬの水を添加して均質化し、次いで２ｍＬの王水を添加し、ボルテックス混合し、振動装置上で７２時間にわたり振動させた。２重量％の硝酸溶液を添加して１０ｍＬの最終容量にし、１５０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。４ｍＬの上清を吸引し、組織液中の金元素の含量を、原子吸光分光法により測定した。

それらの結果により、ＡｕＣが血液−脳関門を通過することができ、脳に到達することが示された。それらは時間の経過と共に体外へ排出され得るので、体内での明らかな蓄積を有しなかった。したがって、本発明において提供されるＡｕＣ含有物質は、ＡＤ又はＰＤを治療する医薬を製造する用途において良好な展望を有した。

実験２：
作業工程：８０匹のマウスを、各々の群内に２０匹のマウスで４つの群に無作為に分け、表１に列挙されるリガンド修飾されたＡｕＣを腹腔内注射した。各群におけるＡｕＣの用量（１．８ｎｍの平均直径を有するＬ−ＮＩＢＣ修飾されたＡｕＣを例にとる）は、それぞれマウスの体重の１００ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、５ｐｐｍ、及び１ｐｐｍであった。ＡｕＣを注射した後で、各々の群内の２０匹のマウスを、各小群内に５匹のマウスを有する４つの群に無作為に分けた。それらのマウスを、供給後のそれぞれ２時間、６時間、２４時間、及び４８時間の時点で屠殺した。心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び脳の組織を別々に採取した。各組織を秤量し、２ｍＬの水を添加して均質化し、次いで２ｍＬの王水を添加し、ボルテックス混合し、振動装置上で７２時間にわたり振動させた。２重量％の硝酸溶液を添加して５ｍＬの最終容量にし、１５０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離した。１ｍＬの上清を吸引し、組織液中の金元素の含量を、原子吸光分光法により測定した。

表１に列挙されるその他のリガンドで修飾されたＡｕＣについて実験を実施するために上記工程を採用した。

それらの結果により、２時間後に、脳内の金元素の含量が初期濃度の１％〜１０％に達することが示された。６時間後に、脳内の含量は同様のレベルで維持され得た。２４時間後に、脳内の含量は大きく減少した。４８時間の時点で、上記含量は１００ｐｐｍの用量での検体を除き、検出限界近く又はそれを下回るまで減少した。それらの結果により、ＡｕＣ含有物質が動物レベルで良好なバイオセーフティを有し、血液−脳関門を通過するこ
とができ、体内での明らかな蓄積を有しないことが示された。

まとめると、上記実験結果は、以下の点を明らかにした（以下に挙げられる「金ナノ粒子」及び「ＡｕＣ」は全て、リガンド修飾を伴う場合を指す）。

（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡβの凝集についての実験（実施形態３）において、金ナノ粒子のＡβの凝集動態に対する効果が、サイズに関連することが判明した。粒径が１０．１ｎｍ以上である場合に、金ナノ粒子の添加は、Ａβの凝集を促進し得て、粒度が６．０ｎｍ以下である場合に、Ａβの凝集は阻害されるが、Ａβの凝集の完全な阻害は達成され得なかった。しかしながら、ＡｕＣが使用される場合に（平均直径は３ｎｍ未満である）、全てのＡｕＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡβの凝集を大幅に阻害し、この効果は、ＡｕＣの濃度に関連していた。ＡｕＣの濃度が５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍに達した場合に、Ａβの凝集は完全に阻害され得て、完全な阻害のために必要とされる最小濃度は、リガンドの種類及びＡｕＣの直径に関連していた。α−ｓｙｎの凝集の阻害についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験（実施形態６）においては、ＡｕＣがα−ｓｙｎの凝集及び線維化の完全な阻害の同じ効果を有することも判明した。

（２）Ａβ誘導された細胞ＡＤモデル及びＭＰＰ^＋誘導された細胞ＰＤモデルの実験（実施形態４、実施形態７、及び実施形態８）において、小さい粒度を有する金ナノ粒子（例えば、３．６ｎｍ又は６．０ｎｍの平均直径を有する金ナノ粒子）が、Ａβ誘導された細胞ＡＤモデル及びＭＰＰ^＋誘導された細胞ＰＤモデルの細胞生存性の改善に大きな効果を有しないことが分かったので、金ナノ粒子は、ＡＤ及びＰＤに対して細胞レベルで明らかな薬効を示さず、そのためそれらはＡＤ又はＰＤを治療する医薬を製造するために有効成分として直接的に使用することができないことが示唆される。しかしながら、本発明において使用される種々のサイズを有する種々のリガンド修飾されたＡｕＣ（平均直径は３ｎｍ未満であった）の場合には、非常に低い用量のＡｕＣ（例えば０．１ｐｐｍ〜１ｐｐｍ）であっても、２つのモデルの細胞生存性を、５０％〜６５％から９５％超まで上昇させ得ることが判明した。細胞レベルでは、ＡｕＣの薬効は顕著であることが示された。リガンドはＡβの凝集及び２つの細胞モデルの両方に対して効果を有しなかったので（実施形態４、実施形態７、及び実施形態８）、ＡｕＣの薬効がＡｕＣ自体に起因すると結論付けることができた。これは、ＡｕＣの利用のための新しいアプローチを提供した。

（３）さらに、トランスジェニックＡＤマウスモデル及びＭＰＴＰ誘導されたＰＤマウスモデル（実施形態５及び実施形態９）を本発明において使用して、さらにＡｕＣの薬効を確かめ、こうしてＡｕＣが、マウスの認知行動能力及び運動行動能力の改善、脳内の老人斑の形成の阻害、並びに黒質及び線条体におけるＭＰＴＰにより誘導されたＤＡ作動性ニューロンの特異的なアポトーシスの阻害において大きな役割を担い、かつ関連疾患のための予防医薬又は治療医薬として使用され得ることが示された。

（４）バイオセーフティの更なる評価のための実験において（実施形態１０）、１００ｐｐｍ（重量基準）の濃度でのＡｕＣが神経細胞と同時培養された場合に、それらは細胞の生存性に明らかな影響を及ぼさず、その濃度が１００ｐｐｍを超過した場合に（ＡｕＣの最小効果濃度よりはるかに高い）、細胞生存性は僅かに減少した。ＡｕＣの最小効果濃度（０．１ｐｐｍ〜１ｐｐｍ）は１００ｐｐｍよりはるかに低いので、ＡｕＣが細胞レベルで優れたバイオセーフティを有すると結論付けることができた。マウス急性毒性試験においては、１日１回で７日間にわたり連続的に投与された１ｇ／体重ｋｇ（１０００ｐｐｍに相当）の用量のＡｕＣは、有害作用を及ぼさないことが判明した。マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ分布及び薬物動態の研究において（実施形態１１）、脳内の金元素の含量が、２時間後に初期濃度の１％〜１０％に達した。６時間後に、脳内の含量は、同様のレベルで維持された。２４時間後に、脳内の含量は大きく減少した。４８時間の時点で、上記
含量は、１００ｐｐｍの用量での検体を除き、検出限界を下回るまで減少した。上記の結果により、ＡｕＣ含有物質が動物レベルでも良好なバイオセーフティを有し、血液−脳関門を通過することができ、体内での明らかな蓄積を有しないことが示され、こうしてＡＤ又はＰＤを治療する医薬の製造での用途において良好な展望を有した。

（５）現行技術と比較して、本発明で使用されるリガンドは、Ａβ及びα−ｓｙｎの凝集挙動のために特別に設計されておらず、対比実験により、使用されるリガンドが、Ａβ及びα−ｓｙｎの凝集に対して明らかな効果を有しないことが示された（実施形態３）。しかしながら、ＡｕＣのサイズはそのタンパク質自体のサイズより小さいので、Ａβ及びα−ｓｙｎの凝集は、サイズ効果及び弱い分子相互作用の組み合わせにより大きく阻害され得た。Ａβ誘導されたＡＤ細胞モデル及びトランスジェニック動物モデルにおける優れた効力により、さらにＡＤの治療のための医薬の製造におけるＡｕＣ含有物質の可能性が確認された。さらに、ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞モデル及びＭＰＴＰ誘導されたＰＤ動物モデルにおけるＡｕＣ含有物質の優れた効力により、ＡｕＣ含有物質がまた、その他の神経変性疾患を治療する医薬の製造において幅広い利用の展望を有することが示された。さらに、ＭＰＰ^＋誘導されたＰＤ細胞モデル及びＭＰＴＰ誘導されたＰＤ動物モデルは、タンパク質線維化を伴わず、エネルギー代謝及び神経細胞の神経伝達物質代謝に関連するシグナル伝達の機能を含むより深い機構に作用するので、ＡｕＣ含有物質がタンパク質線維化に影響を及ぼすだけでなく、神経変性疾患の過程により深いレベルで影響し得ると推測され得た。ＡｕＣ含有物質は、神経変性疾患のための新たな医薬の研究及び開発のために非常に重要となる。

本発明において提供されるＡｕＣ含有物質は、マウスの認知行動及び運動行動能力を改善し、ＡＤトランスジェニックマウスモデル及びＭＰＴＰ誘導されたＰＤマウスモデルにおいて脳内の老人斑の形成を阻害し、動物レベルで良好なバイオセーフティを有し得る。ＡｕＣ含有物質は、産業上の利用のために適している。

Claims (22)

1. ＡｕＣとＡｕＣの外側を覆うリガンドＹとを含む、ＡｕＣ含有物質。
2. 前記ＡｕＣの金コア直径は、３ｎｍ未満、好ましくは０．５ｎｍ〜２．６ｎｍである、請求項１に記載の物質。
3. 前記リガンドＹは、限定されるものではないが、Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体、システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体、並びにその他のチオール含有化合物の１つ以上を含む、請求項１又は２に記載の物質。
4. 前記Ｌ（Ｄ）−システイン及びその誘導体は、好ましくはＬ（Ｄ）−システイン、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、又はＮ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）等である、請求項３に記載の物質。
5. 前記システイン含有オリゴペプチド及びそれらの誘導体は、好ましくはシステイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド、又はシステイン含有テトラペプチドである、請求項３に記載の物質。
6. 前記システイン含有ジペプチドは、好ましくはＬ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ−ヒスチジン−Ｌ−システインジペプチド（ＨＣ）、又はＬ−システイン−Ｌ−ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）等である、請求項５に記載の物質。
7. 前記システイン含有トリペプチドは、好ましくはグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ−プロリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ−リジン−Ｌ−システイン−Ｌ−プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、又はＬ−グルタチオン（ＧＳＨ）等である、請求項５に記載の物質。
8. 前記システイン含有テトラペプチドは、好ましくはグリシン−Ｌ−セリン−Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、又はグリシン−Ｌ−システイン−Ｌ−セリン−Ｌ−アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等である、請求項５に記載の物質。
9. 前記その他のチオール含有化合物は、好ましくは１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ−３−トロロボール、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）−グリシン、又はドデシルメルカプタン等である、請求項３に記載の物質。
10. 前記物質は、粉末又は綿状である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の物質。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡｕＣ含有物質の製造方法であって、
    以下の工程：
    （１）ＨＡｕＣｌ_４をメタノール、水、エタノール、ｎ−プロパノール、及び酢酸エチルの１つに溶解させることで、ＨＡｕＣｌ_４の濃度が０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである溶液Ａを得る工程と、
    （２）リガンドＹを溶剤中に溶解させることで、リガンドＹの濃度が０．０１Ｍ〜０．１８Ｍである溶液Ｂを得る工程と、
    （３）工程（１）における溶液Ａと工程（２）における溶液Ｂとを、ＨＡｕＣｌ_４とリガンドＹとの間のモル比１：（０．０１〜１００）（好ましくは１：（０．１〜１０）、よ
    り好ましくは１：（１〜１０））で混合し、その混合物を氷浴中で０．１時間〜４８時間（好ましくは０．１時間〜２４時間、より好ましくは０．５時間〜２時間）にわたり撹拌し、０．０２５Ｍ〜０．８ＭのＮａＢＨ_４溶液（好ましくはＮａＢＨ_４の水溶液、ＮａＢＨ_４のエタノール溶液、又はＮａＢＨ_４のメタノール溶液）を添加し、次いでその反応系を、氷浴中で０．１時間〜１２時間（好ましくは０．１時間〜２時間、より好ましくは１時間〜２時間）にわたりＮａＢＨ_４とリガンドＹとのモル比１：（０．０１〜１００）（好ましくは１：（０．１〜８）、より好ましくは１：（１〜８））で撹拌する工程と、
    （４）工程（３）における反応溶液を８０００回転／分〜１７５００回転／分で１０分間〜１００分間にわたり遠心分離することで、種々の平均粒度を有するＡｕＣ沈降物を得る工程、好ましくはＭＷＣＯが３Ｋ〜３０Ｋのチューブ型限外濾過器を使用して、工程（３）における反応溶液を８０００回転／分〜１７５００回転／分で１０分間〜１００分間にわたり勾配により遠心分離することで、種々の平均粒度を有するＡｕＣを得る工程と、
    （５）工程（４）において得られた種々の平均粒度を有するＡｕＣ沈降物を水中に溶解させ、それを透析バッグに入れて、水中にて室温で１日間〜７日間にわたり透析する工程と、
    （６）前記透析バッグ中のＡｕＣ溶液を１２時間〜２４時間にわたり凍結乾燥させ、ＡｕＣ含有物質を得る工程と、
    を含む、方法。
12. 工程（２）における溶剤は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ−プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ペンタノール、エタノール、酢酸ブチル、トリブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２−メチル−１−プロパノール、及び酢酸プロピルの１つ以上である、請求項１１に記載の方法。
13. 触媒製造又は分子触媒作用、キラル認識、分子検出、生物医学的検出、及びイメージングの分野における近赤外蛍光プローブへの請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡｕＣ含有物質の使用。
14. Ａβの凝集及び線維化、及び／又はα−ｓｙｎの凝集及び線維化と関連する疾患のための医薬の製造における請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡｕＣ含有物質の使用。
15. ＡＤの予防及び治療のための医薬の製造における請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡｕＣ含有物質の使用。
16. ＰＤの予防及び治療のための医薬の製造における請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＡｕＣ含有物質の使用。
17. Ａβの凝集及び線維化と関連する疾患のための医薬の製造におけるＡｕＣの使用。
18. 前記Ａβの凝集及び線維化と関連する疾患は、ＡＤである、請求項１７に記載の使用。
19. 前記ＡｕＣは、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、又はＬ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−Ｃｙｓ）等で修飾されている、請求項１７又は１８に記載の使用。
20. α−ｓｙｎの凝集及び線維化と関連する疾患のための医薬の製造における、ＡｕＣの使用。
21. 前記Ａβの凝集及び線維化と関連する疾患は、ＰＤである、請求項２０に記載の使用。
22. 前記ＡｕＣは、Ｌ−グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−アセチル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＡＣ）、Ｎ−イソブチリル−Ｌ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−ＮＩＢＣ）、Ｌ−システイン−Ｌ−アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ−アルギニン−Ｌ−システインジペプチド（ＲＣ）、１−［（２Ｓ）−２−メチル−３−チオール−１−オキソプロピル］−Ｌ−プロリン（Ｃａｐ）、又はＬ（Ｄ）−システイン（Ｌ（Ｄ）−Ｃｙｓ）等で修飾されている、請求項２０又は２１に記載の使用。

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