ES2908466T3 - Sustancia que contiene agrupación de oro y método de preparación y uso de la misma - Google Patents

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Abstract

Agrupaciones de oro (AuC) o sustancias que contienen las agrupaciones de oro (AuC) para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedad de Alzheimer (EA) o enfermedad de Parkinson (EP), en las que las AuC o sustancias comprenden AuC y ligando Y que recubre externamente las AuC, en las que el diámetro de núcleo de oro de las AuC es menor de 3 nm, en las que el ligando Y incluye, sin limitación, uno o más de L(D)-cisteína y sus derivados, oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados, y otros compuestos que contienen tiol.

Description

DESCRIPCIÓN
Sustancia que contiene agrupación de oro y método de preparación y uso de la misma
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo técnico de los nanofármacos nanométricos, particularmente a sustancias que contienen agrupaciones de oro (AuC) y a un método de preparación y a la aplicación de las mismas.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades neurodegenerativas son una de las principales amenazas para la salud humana. Sus características patológicas habituales son enmarañamiento anómalo de proteínas y sus amiloidosis en células nerviosas, y apoptosis neuronal y deterioro neurológico asociados. La enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) son las dos más típicas. Las manifestaciones clínicas de la EA se caracterizan por disfunción cognitiva y de la memoria y cambios en la personalidad y el comportamiento, mientras que las manifestaciones clínicas de la EP incluyen principalmente temblor estático, bradicinesia, hipertonía, trastorno postural de la marcha y otra discinesia. Tanto la EA como la EP se producen principalmente entre los ancianos, y la incidencia aumenta con la edad. Tomando como ejemplo la EA, la incidencia entre las personas mayores de 65 años es del 5%, pero superior al 30% entre las personas mayores de 80 años. Por tanto, el número de pacientes que padecen estas dos enfermedades aumenta sin cesar a medida que se prolonga la esperanza de vida y se intensifica el envejecimiento de la población. La EA, en particular, ha afectado con diferencia a más de 40 millones de pacientes, que alcanzarían los 150 millones en el 2050. Para los Estados Unidos solo, se gastan más de 200 mil millones de dólares estadounidenses al año en la atención de pacientes con EA, el doble que el cáncer, lo que la convierte en la enfermedad más costosa del mundo. El número de pacientes con EP en el mundo, según una estimación conservadora, ha superado los 10 millones. Sin embargo, la etiología de estas dos enfermedades sigue siendo desconocida. En cuanto al tratamiento clínico, aunque la FDA de los Estados Unidos ha aprobado varios fármacos para tratar EA o EP leve y moderada, estos fármacos son fármacos de regulación de neurotransmisores que sólo pueden mejorar temporalmente las funciones cognitivas o motoras del paciente. Los síntomas repuntarán tan pronto como cesen los fármacos. Hasta la fecha, ningún fármaco puede terminar ni revertir el proceso patológico de estas dos enfermedades. Por tanto, es extremadamente importante desarrollar nuevos fármacos para el tratamiento de EA o EP.
La investigación halla que: las proteínas amiloides en los cerebros de pacientes con EAson principalmente la proteína P-amiloide (Ap) y la proteína Tau, así como una pequeña cantidad de a-sinucleína (a-syn), y el sitio inicial de aparición es el hipocampo que realiza las funciones de memoria y aprendizaje y orientación espacial en el cerebro. El daño cerebral de pacientes con EP comienza en la sustancia negra, que es la responsable de la función motora somática. La diferencia en el sitio inicial de aparición determina los diferentes síntomas de los pacientes con estas dos enfermedades. Sin embargo, los estudios indican que más de la mitad de los pacientes con EA presentan discinesia en el estadio más tardío, y la mayoría de los pacientes con EP también comparten los mismos síntomas que los pacientes con EA en el estadio más tardío. Estos fenómenos sugieren que las dos enfermedades tienen correlaciones intrínsecas en la patogenia y el avance de la enfermedad.
La formación de placas seniles en el cerebro es una de las características patológicas básicas de la EA. Como principal sustancia constituyente en las placas seniles, el Ap es un polipéptido que consiste en 36-43 aminoácidos, que es un producto de hidrólisis de la proteína precursora amiloidea (PPA), en la que el contenido de Ap(1-40) representa más del 90% de la cantidad total de Ap. El estudio actual ha aclarado que, aunque el Ap tiene funciones fisiológicas normales y puede regular la señalización acetilcolinérgica entre sinapsis mediante la regulación de la actividad catalítica de la colinesterasa, una agregación y fibrosis excesivas por Ap en el cerebro pueden provocar disfunción sináptica y una respuesta inflamatoria secundaria posterior, lo que conduce a pérdida de la función neuronal y muerte de las neuronas. Por tanto, el desarrollo de sustancias que puedan inhibir la agregación y fibrosis de Ap así como bloquear su neurotoxicidad es uno de los enfoques importantes para la investigación y el desarrollo de medicamentos para la EA.
Las características patológicas de la EP se manifiestan principalmente como pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas (DA) en el sistema nigroestriatal, junto con la producción de cuerpos de Lewy. Los cuerpos de Lewy comprenden principalmente fibras amiloides radiales huecas formadas por la agregación de a-syn desnaturalizada. La a-syn se ubica en el terminal de la membrana presináptica de las neuronas, y el estado natural en el cuerpo es un estado soluble y desplegado. El plegamiento erróneo de a-syn se produce en condiciones patológicas, genera estructuras de lámina p, que a su vez se agregan y fibrilan para formar lesiones con cuerpos de Lewy. La investigación indica que la amiloidosis de a-syn desempeña un papel clave en el proceso patológico de la enfermedad. Por tanto, la inhibición de la agregación y fibrosis de a-syn se ha convertido en uno de los enfoques en la investigación y el desarrollo de medicamentos para la prevención y el tratamiento de EP. Por otro lado, la 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) es una neurotoxina. No es tóxica por sí misma, pero después de entrar en el cerebro, el catión 1 -metil-4-fenilpiridina (MPP+) generado a partir de su metabolismo puede destruir las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Al mismo tiempo, el MPP+también puede interferir con la NADH deshidrogenasa, una sustancia importante en la cadena respiratoria del metabolismo mitocondrial, lo que provoca la muerte celular y la acumulación de radicales libres. La muerte masiva de neuronas dopaminérgicas provocada por este proceso afecta gravemente al control del movimiento de la corteza cerebral, dando como resultado síntomas similares a los de EP. Por tanto, la MPTP y el MPP+ se usan ampliamente en el establecimiento de modelos celulares y modelos animales relacionados con EP, así como la investigación y el desarrollo de medicamentos para la EP.
Las nanopartículas de oro son partículas de oro a escala nanométrica (el diámetro de los núcleos de oro de las nanopartículas de oro usadas en investigación es, en general, mayor de 3 nm). Debido a las propiedades ópticas y eléctricas únicas, la buena biocompatibilidad, así como la modificación superficial conveniente, las nanopartículas de oro se usan ampliamente en biología y campos médicos relacionados, tales como biosensores, obtención de imágenes médicas y detección de tumores. Debido a la inercia química y la gran área de superficie específica y a la capacidad para penetrar la barrera hematoencefálica a bajas concentraciones, las nanopartículas de oro también se usan como portadores de fármaco en la investigación del transporte direccional y la liberación controlable de fármacos, etc. En los últimos años, se investiga la unión de nanopartículas de oro con ligandos específicos (tales como heteropoliácidos y polipéptidos de secuencia específica) que inhiben la agregación de proteínas fibróticas, logrando determinados efectos in vitro en experimentos de inhibición de fibrosis de proteínas (Y. H. Liao, Y. J. Chang, Y. Yoshiike, Y. C. Chang, Y. R. Chen, Small 2012, 8, 3631; Y. D. Alvarez, J. A. Fauerbach, J. V. Pellegrotti, T. M. Jovin, E. A. Jares-Erijman, F. D. Stefani, Nano Letters 2013, 13, 6156; S. Hsieh, C. W. Chang, H. H. Chou, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2013, 112, 525), pero los resultados del modelo celular indican que aunque existe un efecto sinérgico sobre la viabilidad celular cuando se usan nanopartículas de oro (el tamaño de núcleo de oro es superior a 5 nm) junto con compuestos que presentan un efecto protector sobre las células dañadas por fibrina (N. Gao, H. Sun, K. Dong, J. Ren, X. Qu, Chemistry-A European Journal 2015, 21, 829), el efecto no resulta obvio cuando se usan solas. Aún no se han notificado experimentos en EAa nivel de modelo animal. Además, en estas investigaciones, las nanopartículas de oro se usaron principalmente como portadores de fármaco además de como principios activos.
Las agrupaciones de oro (AuC) son nanopartículas de oro ultrafinas con un núcleo de oro de menos de 3 nm de diámetro. Sólo contienen de unos pocos a cientos de átomos de oro, lo que hace que colapse la estructura de empaquetamiento cúbica centrada en las caras de los átomos de oro en las nanopartículas de oro convencionales y se divida el nivel de energía, mostrando de ese modo propiedades similares a una molécula que son completamente diferentes de las nanopartículas de oro convencionales superiores a 3 nm. Por otro lado, debido a la división del nivel de energía, las AuC no poseen el efecto de plasmón superficial y las propiedades ópticas derivadas de las nanopartículas de oro convencionales, pero sí presentan excelentes propiedades de emisión de fluorescencia similares a los puntos cuánticos semiconductores. Por otro lado, en el espectro de absorción ultravioleta-visible de las AuC, desaparece el pico de resonancia de plasmón a 520+20 nm, mientras que aparecen uno o más picos de absorción nuevos por encima de 560 nm, y tales picos de absorción no pueden observarse en nanopartículas de oro convencionales. Por tanto, la desaparición del pico de absorción de resonancia de plasmón (520+20 nm) y la aparición de los nuevos picos de absorción por encima de 560 nm en el espectro de absorción UV-visible son indicadores importantes para juzgar si las AuC se preparan con éxito (H.F. Qian, M.Z. Zhu, Z.K. Wu, R.C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470). Las AuC también tienen propiedades magnéticas, eléctricas y catalíticas y efectos fototérmicos que son significativamente diferentes de los de las nanopartículas de oro convencionales, por lo que tienen amplias perspectivas de aplicación en los campos de optoelectrónica de molécula única, catálisis molecular y conversión fototérmica.
Además, las AuC también se han usado en los campos de biosondas y obtención de imágenes médicas debido a sus excelentes propiedades de emisión de fluorescencia. Por ejemplo, el equipo de Sandeep Verma usa AuC modificadas con purina como sondas fluorescentes verdes para la obtención de imágenes del núcleo (J. R. Wallbank, D. Ghazaryan, A. Misra, Y. Cao, J. S. Tu, B. A. Piot, M. Potemski, S. Wiedmann, U. Zeitler, T. L. M. Lane, S.V. Morozov, M. T. Greenaway, L. Evaes, A. K. Geim, V. I. Falko, K. S. Novoselov, A. Mishchenko, ACS Applied Materials & Interfaces 2014, 6, 2185). Esto tipo de bibliografía utiliza las propiedades de fluorescencia de las AuC y no implica la actividad medicinal de las propias AuC.
Se han descrito nanopartículas de oro recubiertas con ligando (>3 nm) o agrupaciones de oro recubiertas con ligando en Gautier et al. (2006), J. Am. Chem. Soc., 128(34):11079-11087, Gautier et al. (2005), Chem. Commun., págs. 5393­ 5395, Majouga et al. (2010), JMTM, 21(8):950-955, Sousa et al. (2016), Nanoscale, 8(12):6577-6588, el documento WO 2021/174287 A1, You et al. (2008), Chem. Eur. J., 14(1):143-150, Guha et al. (2009), AFM Journal, 19(12):1949-1961, Jana et al. (2010), Langmuir, 26(9):6503-6507, Maya et al. (2002), Langmuir, 18(6):2392-2397, Fasasi et al. (2011), Appl. Spectroscopy, 65(7):741-745, Hunad et al. (2002), Langmuir, 18(18):7077-7081, el documento WO 00/33079 A1, el documento US 2013/236981 A1, el documento WO2004/012855, el documento TW I542710B, el documento WO 01/73150A1, Gao et al. (2017), Nanoscale, 9:4107-4113, o Antosova et al. (2012), Materials Science and Engineering C, 32:2529-2535.
Sumario de la invención
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. El objetivo de la presente invención es abordar los defectos técnicos en la técnica anterior. En el primer aspecto, la presente invención proporciona agrupaciones de oro (AuC) o sustancias que contienen las agrupaciones de oro (AuC) para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedad de Alzheimer (EA) o enfermedad de Parkinson (EP), en las que las AuC o sustancias comprenden AuC y ligando Y que recubre externamente las AuC, en las que el diámetro de núcleo de oro de las AuC es menor de 3 nm, en las que el ligando Y incluye, sin limitación, uno o más de L(D)-cisteína y sus derivados, oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados, y otros compuestos que contienen tiol.
El diámetro de núcleo de oro de las AuC es preferiblemente de 0,5-2,6 nm.
La L(D)-cisteína y sus derivados son preferiblemente L(D)-cisteína, N-isobutiril-L(D)-cisteína (L(D)-NIBC) o N-acetil-L(D)-cisteína (L(D)-NAC).
Los oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados son preferiblemente dipéptidos que contienen cisteína, tripéptidos que contienen cisteína o tetrapéptidos que contienen cisteína.
Los dipéptidos que contienen cisteína son preferiblemente dipéptido L-cisteína-L-arginina (CR), dipéptido L-arginina-L-cisteína (RC), dipéptido L-histidina-L-cisteína (HC) o dipéptido L-cisteína-L-histidina (CH).
Los tripéptidos que contienen cisteína son preferiblemente tripéptido glicina-L-cisteína-L-arginina (GCR), tripéptido L-prolina-L-cisteína-L-arginina (PCR), tripéptido L-lisina-L-cisteína-L-prolina (KCP) o L-glutatión (GSH).
Los tetrapéptidos que contienen cisteína son preferiblemente tetrapéptido glicina-L-serina-L-cisteína-L-arginina (GSCR) o tetrapéptido glicina-L-cisteína-L-serina-L-arginina (GCSR).
Otros compuestos que contienen tiol son preferiblemente 1-[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropil]-L-prolina, ácido tioglicólico, mercaptoetanol, tiofenol, D-3-trolovol, N-(2-mercaptopropionil)-glicina o dodecilmercaptano.
La sustancia puede ser un polvo o un flóculo.
Las AuC o la sustancia que contiene AuC proporcionadas por la presente invención muestran un efecto excelente sobre la inhibición de la agregación de Ap y a-syn en el experimento in vitro para la inhibición de la agregación de Ap y a-syn y muestra un efecto excelente sobre la mejora de la viabilidad celular en experimentos de modelo celular de EA inducida por Ap y modelo celular de EP inducida por MPP+. En el modelo de ratón transgénico con EA, la sustancia que contiene AuC puede mejorar significativamente la capacidad conductual cognitiva de los ratones enfermos y desempeña un papel significativo en la inhibición de la formación de placas Ap(1-40) y Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral de los ratones. En el modelo de ratón de EP inducida por MPTP, la sustancia que contiene AuC puede mejorar y corregir significativamente el trastorno discinético de los ratones del modelo de lesión por MPTP, mejorar las capacidades motoras de los ratones enfermos e inhibir sustancialmente la apoptosis específica inducida por MPTP de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y el cuerpo estriado de los ratones. Y también presenta una buena bioseguridad a nivel celular y a nivel animal. Los resultados anteriores indican que las AuC y la sustancia que contiene AuC para su uso mediante la presente invención no sólo afecta a la agregación y fibrosis de proteínas fibróticas, sino que también influye en el proceso de las enfermedades neurodegenerativas a niveles más profundos tales como funciones de señalización relacionadas con el metabolismo de energía y el metabolismo de neurotransmisores de células nerviosas. Por tanto, la sustancia que contiene AuC para su uso mediante la presente invención es importante para la investigación y el desarrollo de nuevos medicamentos para enfermedades neurodegenerativas tales como la EA y/o la EP.
Por otro lado, puesto que las moléculas de ligando no mostraron ningún efecto inhibidor ni en el experimento cinético para la inhibición in vitro de la agregación de Ap ni en la prueba de modelo celular de EA con lesión por Ap, ni ningún aumento en la viabilidad celular en el modelo celular de EA con lesión por Ap y modelo celular de EP con lesión por MPP+, esto sugiere que la eficacia para EA y EP proviene de las AuC en lugar de los ligandos. Basándose en la actividad medicinal de las propias AuC, se espera el desarrollo de nuevos medicamentos competitivos.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra espectros de ultravioleta-visible (UV), imágenes de microscopio electrónico de transmisión (TEM) y diagramas de distribución de tamaño de partícula de nanopartículas de oro modificadas con ligando L-NIBC con diferentes tamaños de partícula.
La figura 2 muestra espectros de ultravioleta-visible, imágenes de TEM y diagramas de distribución de tamaño de partícula de AuC modificadas con ligando L-NIBC con diferentes tamaños de partícula.
La figura 3 muestra espectros de infrarrojos de AuC modificadas con ligando L-NIBC con diferentes tamaños de partícula.
La figura 4 muestra topografías de AFM después de incubar conjuntamente Ap(1-40) y nanopartículas de oro o AuC modificadas con ligando L-NIBC durante 48 h.
La figura 5 muestra curvas cinéticas de fibrosis de Ap de nanopartículas de oro y AuC modificadas con ligando L-NIBC de diferentes tamaños de partícula y diferentes concentraciones.
La figura 6 muestra diagramas que muestran los efectos de nanopartículas de oro o AuC modificadas con ligando L-NIBC de diferentes tamaños de partícula y diferentes concentraciones sobre la viabilidad celular de un modelo celular de EA inducida por Ap.
La figura 7 muestra diagramas de UV, infrarrojos, TEM y distribución de tamaño de partícula de AuC modificadas con ligando CR (CR-AuC).
La figura 8 muestra diagramas de UV, infrarrojos, TEM y distribución de tamaño de partícula de AuC modificadas con ligando RC (RC-AuC).
La figura 9 muestra diagramas de UV, infrarrojos, TEM y distribución de tamaño de partícula de AuC modificadas con ligando 1-[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropil]-L-prolina (es decir, Cap).
La figura 10 muestra diagramas de UV, infrarrojos, TEM y distribución de tamaño de partícula de AuC modificadas con ligando GSH (GSH-AuC).
La figura 11 muestra diagramas de UV, infrarrojos, TEM y distribución de tamaño de partícula de AuC modificadas con ligando D-NIBC (D-NIBC-AuC).
La figura 12 muestra curvas del efecto inhibidor de AuC modificadas con diferentes ligandos sobre la agregación y fibrosis de Ap(1-40).
La figura 13 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo de experimento de laberinto acuático en el ejemplo 5.
La figura 14 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre el comportamiento cognitivo (día 150 de administración) de un modelo de ratón C57BL/6 doblemente transgénico PPA/PS1.
La figura 15 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la expresión de Ap(1-40) en el hipocampo y la corteza cerebral de los ratones en un modelo de ratón C57BL/6 doblemente transgénico PPA/PS1 (día 100 de administración).
La figura 16 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la expresión de Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral de los ratones en un modelo de ratón C57BL/6 doblemente transgénico PPA/PS1 (día 100 de administración).
La figura 17 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la expresión de Ap(1-40) en el hipocampo y la corteza cerebral de los ratones en un modelo de ratón C57BL/6 doblemente transgénico PPA/PS1 (día 150 de administración).
La figura 18 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la expresión de Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral de los ratones en un modelo de ratón C57BL/6 doblemente transgénico PPA/PS1 (día 150 de administración).
La figura 19 es un diagrama que muestra el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la cinética de fibrosis de a-syn.
La figura 20 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la viabilidad celular de un modelo celular (SH-sy5y) de EP con lesión por MPP+.
La figura 21 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la apoptosis celular de un modelo celular (PC12) de Ep inducida por MPP+.
La figura 22 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la actividad locomotora de los ratones del modelo con lesión por MPTP.
La figura 23 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre la capacidad de nado de los ratones del modelo con lesión por MPTP.
La figura 24 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre el comportamiento en cilindro giratorio de los ratones del modelo con lesión por MPTP.
La figura 25 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC sobre las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y el cuerpo estriado de los ratones del modelo con lesión por MPTP.
La figura 26 muestra diagramas que muestran el efecto de una sustancia que contiene AuC de diferentes tamaños de partícula y diferentes concentraciones sobre la viabilidad de células de neuroblastoma SH-sy5y.
Descripción detallada
Cuando se estudia el efecto de las nanopartículas de oro con determinados ligandos sobre la agregación de Ap, los inventores hallaron que, cuando el diámetro de núcleo de oro de las nanopartículas de oro se cambiaba de grande a pequeño, el efecto promotor de las nanopartículas de oro modificadas con el mismo ligando en sus superficies sobre la agregación de Ap se convirtió en uno inhibidor; cuando el tamaño de partícula era lo suficientemente pequeño como para ser AuC, pudo lograrse una inhibición completa de la agregación de Ap. Además, también se halló que las AuC también tenían un efecto inhibidor completo sobre a-syn. En este efecto, son las propias AuC en lugar de los ligandos las que desempeñan un papel inhibidor.
Generalmente, el diámetro de núcleo de oro de las nanopartículas de oro usadas en la investigación es mayor de 3 nm, y cuando el diámetro del núcleo de oro es menor de 3 nm, se denominan AuC. La desaparición del pico de absorción de resonancia de plasmón (520+20 nm) y la aparición de nuevos picos de absorción por encima de 560 nm en el espectro de absorción UV-visible indican que las AuC se preparan con éxito. Sin ligandos, las AuC no pueden existir de manera estable en una disolución. Se combina con ligando que contiene tiol para formar AuC modificadas con ligando (o denominadas AuC) a través del enlace Au-S.
Las AuC modificadas con ligando existentes divulgadas en la bibliografía incluyen AuC modificadas con L-glutatión (GSH), N-acetil-L(D)-cisteína (L(D)-NAC), N-isobutiril-L(D)-cisteína (L(D)-NIBC), etc. El procedimiento de preparación se muestra en la bibliografía (H. F. Qian, M. Z. Zhu, Z. K. Wu, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470; C. Gautier, T. Bürgi, Journal of the American Chemical Society 2006, 128,11079); se aplican principalmente en los campos de catálisis, reconocimiento quiral, detección molecular, biodetección, administración de fármacos y obtención de imágenes biológicas (G. Li, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2013, 46, 1749; H. F. Qian, M. Z. Zhu, Z. K. Wu, R. C. Jin, Accounts of Chemical Research 2012, 45, 1470; J. F. Parker, C. A. Fields-Zinna, R. W. Murray, Accounts of Chemical Research 2010, 43, 1289; S. H. Yau, O. Varnavski, T. Goodson, Accounts of Chemical Research 2013, 46, 1506).
La presente invención investigó los efectos de las AuC sobre EA y/o EP, incluyendo al menos: en primer lugar, se usaron AuC de diferentes tamaños que contenían diferentes ligandos (no teniendo los ligandos un efecto inhibidor sobre la agregación de Ap) como objetos de investigación. A través de la investigación en tres niveles de experimentos, incluyendo experimentos in vitro para la inhibición de la agregación de Ap y la agregación de a-syn, experimentos de modelo celular de EA inducida por Ap y modelo celular de EP inducida por MPP+ y experimentos de modelo de ratón transgénico con EA y modelo de ratón con EP inducida por MPTP, y teniendo en cuenta la citotoxicidad de las AuC, un experimento de toxicidad aguda en ratones, un experimento de distribución in vivo en ratones, etc., se proporcionaron AuC modificadas con ligando, se halló su aplicación en la preparación de fármacos que tratan la EA y la EP y se compararon los resultados con los resultados experimentales de nanopartículas de oro, que indican que las nanopartículas de oro con un diámetro mayor de 3 nm no tienen un efecto deseable para este propósito, y no pueden usarse para preparar fármacos que tratan la EA o la EP, mientras que las AuC modificadas con ligando pueden usarse para preparar fármacos que tratan la EA y/o la EP.
A continuación, se detallará adicionalmente la presente invención en los ejemplos.
La pureza de las materias primas usadas en las siguientes realizaciones debe ser pureza química o superior. Todas ellas pueden adquirirse en el mercado.
Ejemplo 1 (no comprendido por la invención reivindicada): preparación de AuC modificadas con ligando para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la EA o la EP
Este ejemplo divulga un método para preparar las AuC modificadas con ligando para su uso en la invención reivindicada, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(1) disolver HAuCp en uno de metanol, agua, etanol, n-propanol y acetato de etilo para obtener una disolución A en la que la concentración de HAuCp es de 0,01~0,03 M;
(2) disolver ligando Y en un disolvente para obtener una disolución B en la que la concentración de ligando Y es de 0,01~0,18 M; el ligando Y incluye, pero sin limitarse a, L(D)-cisteína y otros derivados de cisteína tales como N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC), N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC), N-acetil-L-cisteína y N-acetil-D-cisteína, oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados incluyendo, pero sin limitarse a, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y otros péptidos que contienen cisteína, tales como dipéptido L-cisteína-L-arginina (CR), dipéptido L-arginina-L-cisteína (RC), dipéptido L-cisteína-L-histidina (CH), tripéptido glicina-L-cisteína-L-arginina (GCR), tripéptido L-prolina-L-cisteína-L-arginina (PCR), L-glutatión (GSH), tetrapéptido glicina-L-serina-L-cisteína-L-arginina (GSCR) y tetrapéptido glicina-L-cisteína-L-serina-L-arginina (GCSR), y otros compuestos que contienen tiol, tales como uno o más de 1-[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropil]-L-prolina, ácido tioglicólico, mercaptoetanol, tiofenol, D-3-trolovol y dodecilmercaptano; el disolvente es uno o más de metanol, acetato de etilo, agua, etanol, n-propanol, pentano, ácido fórmico, ácido acético, dietil éter, acetona, anisol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, pentanol, etanol, acetato de butilo, tributil metil éter, acetato de isopropilo, dimetilsulfóxido, acetato de etilo, formiato de etilo, acetato de isobutilo, acetato de metilo, 2-metil-1-propanol y acetato de propilo;
(3) mezclar la disolución A y la disolución B de modo que la razón molar entre HAuCU y ligando Y sea de 1:(0,01~100), agitarlos en un baño de hielo durante 0,1~48 h, añadir una disolución en agua, etanol o metanol de NaBH40,025~0,8 M, continuar agitando en un baño de agua helada y hacer reaccionar durante 0,1 ~12 h. La razón molar entre NaBH4 y ligando Y es de 1:(0,01~100);
(4) usar tubos de ultrafiltración con MWCO de 3 K~30 K para centrifugar la disolución de reacción a 8000~17500 rpm por gradiente durante 10~100 min después de que termine la reacción para obtener un precipitado de AuC modificadas con ligando de diferentes tamaños de partícula promedio (la centrifugación por gradiente específica es tal como se describe en el punto (4) del ejemplo 2. La apertura de las membranas de filtración para los tubos de ultrafiltración de diferentes MWCo determina directamente el tamaño de las AuC que pueden atravesar las membranas). Esta etapa puede omitirse. Dicho de otro modo, después de completarse la etapa (3), se inicia directamente la etapa (5) para obtener AuC mixtas de diferentes tamaños;
(5) disolver el precipitado de AuC de diferentes tamaños de partícula promedio obtenido en la etapa (4) en agua, colocarlo en una bolsa de diálisis y dializarlo en agua a temperatura ambiente durante 1~7 días;
(6) liofilizar las AuC durante 12~24 h después de la diálisis para obtener una sustancia pulverulenta o floculante, es decir, AuC modificadas con ligando.
Tal como se detecta (el método de detección específico se muestra en el ejemplo 2), el tamaño de partícula de la sustancia pulverulenta o floculante obtenida mediante el método anterior es menor de 3 nm (distribuido en 0,5-2,6 nm en general). El espectro de absorción UV-visible tiene uno o más picos de absorción por encima de 560 nm, y ningún pico de absorción obvio a 520 nm. Se determina que el polvo o flóculo obtenido son AuC.
Ejemplo 2 (no comprendido por la invención reivindicada): preparación y confirmación de AuC modificadas con diferentes ligandos
Tomando el ligando L-NIBC como ejemplo, se detallan la preparación y la confirmación de AuC modificadas con ligando L-NIBC:
(1) pesar 1,00 g de HAuCU y disolverlo en 100 ml de metanol para obtener una disolución A 0,03 M;
(2) pesar 0,57 g de L-NIBC y disolverlo en 100 ml de ácido acético glacial (ácido acético) para obtener una disolución B 0,03 M;
(3) medir 1 ml de disolución A, mezclarlo con 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml de disolución B, respectivamente (es decir, la razón molar entre HAuCUy L-NIBC es de 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, respectivamente), hacer reaccionaren un baño de hielo con agitación durante 2 h, añadir rápidamente 1 ml de disolución en agua de NaBH40,03 M recién preparada (preparada pesando 11,3 mg de NaBH4 y disolviéndolos en 10 ml de etanol) cuando la disolución cambia de amarillo brillante a incolora, continuar la reacción durante 30 min después de que la disolución se vuelva marrón oscura y añadir 10 ml de acetona para terminar la reacción;
(4) después de la reacción, se somete la disolución de reacción a centrifugación por gradiente para obtener polvo de AuC modificadas con L-NIBC con diferentes tamaños de partícula. Método específico: después de completarse la reacción, se transfiere la disolución de reacción a un tubo de ultrafiltración con MWCO de 30 K y un volumen de 50 ml y se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min, y se disuelve el retenido en el tubo interno en agua ultrapura para obtener un polvo con un tamaño de partícula de aproximadamente 2,6 nm. Luego, se transfiere la disolución mixta en el tubo externo a un tubo de ultrafiltración con un volumen de 50 ml y MWCO de 10 K y se centrifuga a 13.000 rpm durante 30 min. Se disuelve el retenido en el tubo interno en agua ultrapura para obtener un polvo con un tamaño de partícula de aproximadamente 1,8 nm. Luego, se transfiere la disolución mixta en el tubo externo a un tubo de ultrafiltración con un volumen de 50 ml y MWCO de 3 K y se centrifuga a 17.500 rpm durante 40 min. Se disuelve el retenido en el tubo interno en agua ultrapura para obtener polvo con un tamaño de partícula de aproximadamente 1,1 nm;
(5) precipitar el polvo en tres tamaños de partícula diferentes obtenido por centrifugación por gradiente, eliminar el disolvente respectivamente, soplar el producto en bruto hasta sequedad con N2, disolverlo en 5 ml de agua ultrapura, colocarlo en una bolsa de diálisis (el MWCO es de 3 KDa), colocarlo en 2 l de agua ultrapura, cambiar el agua cada dos días, dializarlo durante 7 días, liofilizarlo y guardarlo para su uso posterior.
El experimento de caracterización se llevó a cabo para el polvo obtenido anteriormente (AuC modificadas con ligando L-NIBc ). Mientras tanto, se usan nanopartículas de oro modificadas con ligando L-NIBC como control. El método para preparar nanopartículas de oro con ligando L-NIBC se refiere a la referencia (W. Yan, L. Xu, C. Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang y N. A. Kotov, Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 15114; X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan y J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, 4623).
1. Observar la morfología mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Se disolvieron los polvos de prueba (muestra de AuC modificadas con L-NIBC preparada en el ejemplo 2 y muestra de nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC) en agua ultrapura hasta 2 mg/l como muestras y luego se prepararon las muestras de prueba mediante el método de la gota colgante. Método específico: se añadieron gota a gota 5 |il de las muestras sobre una película de carbono ultradelgada, se volatilizaron de manera natural hasta que desapareció la gota de agua y luego se observó la morfología de las muestras mediante TEM de alta resolución de emisión de campo de STEM/EDS JEM-2100F.
Las cuatro imágenes de TEM de nanopartículas de oro modificadas con ligando L-NIBC se muestran en los paneles B, E, H y K de la figura 1; las tres imágenes de TEM de AuC modificadas con ligando L-NIBC se muestran en los paneles B, E y H de la figura 2.
Las imágenes en la figura 2 indican que las muestras de AuC modificadas con L-NIBC tienen un tamaño de partícula uniforme y una buena dispersibilidad, y el diámetro promedio de las AuC modificadas con L-NIBC (que se refiere al diámetro de núcleo de oro) es de 1,1 nm, 1,8 nm y 2,6 nm, respectivamente, en buena concordancia con los resultados en los paneles C, F e I de la figura 2. En comparación, las muestras de nanopartículas de oro modificadas con ligando L-NIBC tienen un tamaño de partícula más grande. Su diámetro promedio (que se refiere al diámetro de núcleo de oro) es de 3,6 nm, 6,0 nm, 10,1 nm y 18,2 nm, respectivamente, en buena concordancia con los resultados en los paneles C, F, I y L de la figura 1.
2. Espectro de absorción ultravioleta (UV)-visible (vis)
Se disolvió el polvo de prueba en agua ultrapura hasta que la concentración era de 10 mg l'1 y se midió mediante el espectro de absorción UV-vis a temperatura ambiente. El intervalo de barrido fue 190-1100 nm, la celda de muestra fue una cubeta de cuarzo convencional con una trayectoria óptica de 1 cm y la celda de referencia se llenó con agua ultrapura.
Los espectros de absorción UV-vis de las cuatro muestras de nanopartículas de oro modificadas con ligando L-NIBC con diferentes tamaños se muestran en los paneles A, D, G y J de la figura 1, y la distribución estadística del tamaño de partícula se muestra en los paneles C, F, I y L de la figura 1; los espectros de absorción UV-vis de tres muestras de AuC modificadas con ligando L-NIBC con diferentes tamaños se muestran en los paneles A, D y G de la figura 2, y la distribución estadística del tamaño de partícula se muestra en los paneles C, F e I de la figura 2.
La figura 1 indica que, debido al efecto de plasmón superficial, las nanopartículas de oro modificadas con ligando L-NIBC tenían un pico de absorción a aproximadamente 520 nm. La posición del pico de absorción es relevante con el tamaño de partícula. Cuando el tamaño de partícula es de 3,6 nm, el pico de absorción UV aparece a 516 nm; cuando el tamaño de partícula es de 6,0 nm, el pico de absorción UV aparece a 517 nm; cuando el tamaño de partícula es de 10,1 nm, el pico de absorción UV aparece a 520 nm; y cuando el tamaño de partícula es de 18,2 nm, el pico de absorción aparece a 523 nm. Ninguna de las cuatro muestras tiene ningún pico de absorción por encima de 560 nm.
La figura 2 indica que, en los espectros de absorción UV de tres muestras de AuC modificadas con ligando L-NIBC con diferentes tamaños de partícula en el ejemplo 2, desapareció el pico de absorción por efecto de plasmón superficial a 520 nm, y aparecieron dos picos de absorción obvios por encima de 560 nm y las posiciones de los picos de absorción variaron ligeramente con los tamaños de partícula de las AuC. Esto es porque las AuC presentan propiedades similares a una molécula debido al colapso de la estructura cúbica centrada en las caras, lo que conduce a la discontinuidad de la densidad de estados de las AuC, la división del nivel de energía, la desaparición del efecto de resonancia de plasmón y la aparición de un nuevo pico de absorción en la dirección de onda larga. Pudo concluirse que las tres muestras de polvo en diferentes tamaños de partícula obtenidas en el ejemplo 2 son todas ellas AuC modificadas con ligando.
3. Espectroscopía de infrarrojos con transformada de Fourier
Se midieron los espectros de infrarrojos en un espectrómetro de infrarrojos con transformada de Fourier VERTEX80V fabricado por Bruker en un modo de reflexión total a alto vacío de polvo sólido. El intervalo de barrido es 4000-400 cirr 1 y el número de barridos es 64. Tomando como ejemplo las muestras de AuC modificadas con L-NIBC preparadas en el ejemplo 2, las muestras de prueba eran polvo seco de AuC modificadas con L-NIBC con tres tamaños de partícula diferentes y la muestra de control era polvo de L-NIBC puro. Los resultados se muestran en la figura 3.
La figura 3 muestra el espectro de infrarrojos de AuC modificadas con L-NIBC con diferentes tamaños de partícula. En comparación con L-NIBC puro (la curva en la parte superior), todas las vibraciones de tensión S-H de las AuC modificadas con L-NIBC con diferentes tamaños de partícula desaparecieron por completo a 2500-2600 cirr1, mientras que todavía se observaban otros picos característicos de L-NIBC, lo que demuestra que las moléculas de L-NIBC se anclaron con éxito a la superficie de las AuC a través del enlace Au-S. La figura también muestra que el espectro de infrarrojos de las AuC modificadas con ligando es irrelevante con su tamaño.
Se prepararon AuC modificadas con otro ligando Y mediante un método similar al método anterior, excepto que se ajustaron ligeramente el disolvente de la disolución B, la razón de alimentación entre HAuCU y ligando Y, el tiempo de reacción y la cantidad de NaBH4 añadido. Por ejemplo: cuando se usa L-cisteína, D-cisteína, N-isobutiril-L-cisteína (L-NIBC) o N-isobutiril-D-cisteína (D-NIBC) como ligando Y, se selecciona el ácido acético como disolvente; cuando se usa dipéptido CR, dipéptido RC o 1-[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropil]-L-prolina como ligando Y, se selecciona el agua como disolvente, entre otros, y así sucesivamente; las demás etapas son similares, de modo que no se describirán con detalle en este caso.
Pueden prepararse las AuC y sustancias que contienen AuC para su uso en la presente invención para obtener una serie de AuC modificadas con ligando mediante el método anterior. Los ligandos y los parámetros del procedimiento de preparación se muestran en la tabla 1.
Tabla 1. Parámetros de preparación de AuC modificadas con diferentes ligandos en la presente invención
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Se confirman las muestras en las AuC enumeradas en la tabla 1 mediante el método anterior. La figura 7-figura 11 son espectros de UV (panel A en la figura 7-figura 11), espectros de infrarrojos (panel B en la figura 7-figura 11), imágenes de microscopio electrónico de transmisión (TEM) (panel C en la figura 7-figura 11) y distribución de tamaño de partícula (panel D en la figura 7-figura 11) de AuC modificadas con ligando CR, RC, 1 -[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropM]-L-prolina (abreviatura: Cap), GSH y D-NIBC.
Los resultados indican que los diámetros de las AuC modificadas con diferentes ligandos obtenidos a partir de la tabla 1 son todos menores de 3 nm. Los espectros de ultravioleta también muestran la desaparición del pico a 520+20 nm y la aparición de un pico de absorción por encima de 560 nm. Sólo la posición de este pico de absorción varía ligeramente con el ligando y el tamaño de partícula. Mientras tanto, el espectro de infrarrojos con transformada de Fourier también muestra la desaparición del pico de absorción de infrarrojos del ligando tiol (entre las líneas discontinuas en el panel B de la figura 7-figura 11), mientras que se conservan todos los demás picos característicos de infrarrojos, lo que sugiere que todas las moléculas de ligando se han anclado con éxito a la superficie de las AuC, y la presente divulgación ha obtenido con éxito AuC modificadas con los ligandos enumerados en la tabla 1.
Ejemplo 3 (no comprendido por la presente invención): experimento de cinética de agregación de Ap in vitro
Este ejemplo validó las funciones de AuC modificadas con ligando, que se evaluaron mediante un experimento in vitro de cinética de agregación de Ap, y comparó los efectos sobre la cinética de agregación de Ap con nanopartículas de oro modificadas con ligando y el uso independiente de moléculas de ligando para demostrar que la función proviene de las AuC en lugar del ligando. El experimento usó el método de marcaje con fluorescencia con ThT para caracterizar la cinética de agregación y fibrosis de Ap(1-40).
La tioflavina T (abreviatura: ThT) es un tinte específico para teñir fibras amiloides. Cuando se incuba junto con monómeros de polipéptidos o proteínas, su fluorescencia no cambia sustancialmente. Cuando encuentra polipéptidos o proteínas amiloides con una estructura de fibra, se acoplará inmediatamente con los polipéptidos o las proteínas amiloides y su intensidad de fluorescencia aumentará exponencialmente. Precisamente por esta propiedad, la ThT se usa ampliamente como marcador para monitorizar la amiloidosis de péptidos o proteínas. El proceso de fibrosis de Ap(1-40) también es un proceso de polimerización controlado por nucleación. Por tanto, la curva de crecimiento de la fibra de Ap(1-40) medida mediante el método de marcaje con fluorescencia con ThT se divide principalmente en tres fases: fase inicial, fase de crecimiento y fase estacionaria. La fase inicial es principalmente una fase en la que Ap(1-40) experimenta una transición conformacional para formar un plegamiento erróneo y luego experimenta agregación y nucleación. La fase de crecimiento es una fase en la que se acumulan monómeros de Ap(1-40) sobre los núcleos de oligómeros a lo largo de la dirección axial para formar fibras y crecen rápidamente. La fase estacionaria es una fase en la que todas las moléculas de Ap(1-40) forman fibras largas maduras, es decir, una fase en la que las fibras dejan de crecer. El método de marcaje con fluorescencia con ThT puede monitorizar de manera conveniente el proceso cinético de agregación fibrótica de moléculas de Ap(1-40).
1) Pretratamiento de monómeros de Ap(1-40)
Se disolvió polvo liofilizado de polipéptido amiloide Ap(1-40) (Invitrogen Corp.) en hexafluoroisopropanol (HFIP) para obtener una disolución de Ap(1-40) 1 g/l, y se incubó la disolución a temperatura ambiente durante 2-4 h después del sellado, luego se sopló para secar el HFIP (durante aproximadamente 1 h) con nitrógeno de alta pureza (N2, 99,9%) a una velocidad de flujo apropiada en una campana extractora. Por último, se disolvió el Ap(1-40) secado en 200 pl de DMSO y, después del sellado, se mantuvo la disolución en una nevera a -20°C durante no más de una semana para su uso posterior. Antes de su uso, la disolución en DMSO del polipéptido amiloide se diluyó con disolución de tampón fosfato abundante (PBS, 10 mM, pH = 7,4) hasta que la concentración de Ap(1-40) alcanzó 20 pM para obtener una disolución en PBS de Ap(1-40). Todas las disoluciones en PBS de Ap(1-40) para los experimentos eran recién preparadas.
2) Preparación y detección de muestras
Se añadieron las AuC y las nanopartículas de oro modificadas con ligando a una disolución en PBS de Ap(1-40) 20 pM, respectivamente, para formar muestras de AuC modificadas con diferentes ligandos a diferentes concentraciones y con diferentes tamaños de partícula y muestras de nanopartículas de oro modificadas con diferentes ligandos de manera correspondiente. Las muestras se incubaron de manera continua en una placa de 96 pocillos a 37°C mediante el método de mareaje con fluorescencia con ThT y se monitorizó la intensidad de fluorescencia mediante un lector de microplacas cada 10 minutos. El proceso cinético de agregación de Ap(1-40) se caracterizó a través del cambio en la intensidad de fluorescencia de ThT.
Se usaron tres tamaños de AuC modificadas con L-NIBC con tamaños de partícula de 2,6 nm, 1,8 nm y 1,1 nm, respectivamente, preparadas en el ejemplo 2 como grupos experimentales. Se usaron cuatro tamaños de nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC con tamaños de partícula de 18,2 nm, 10,1 nm, 6,0 nm y 3,6 nm, respectivamente, y moléculas de L-NIBC sin combinar con AuC ni nanopartículas de oro como grupos de control. Cada tamaño de AuC o nanopartículas de oro estaba en seis concentraciones, respectivamente, que fueron: 0 ppm (no contiene ni AuC, ni nanopartículas de oro ni L-NIBC, como control de blanco), 0,1 ppm, 1,0 ppm, 5,0 ppm, 10,0 ppm y 20,0 ppm, respectivamente. Se usaron moléculas de L-NIBC en dos concentraciones, que fueron: 1,0 ppm y 10,0 ppm, respectivamente.
Los resultados se muestran en la figura 4 y la figura 5.
La figura 4 muestra topografías de AFM de Ap(1-40) después de la incubación conjunta con cada grupo experimental y grupo de control durante 48 h. El panel A es la topografía de AFM después de incubar Ap(1-40) solo durante 48 h. El panel B es una topografía de AFM después de incubar conjuntamente Ap(1-40) con L-NIBC durante 48 h. El panel C y el panel D son topografías de AFM después de incubar conjuntamente Ap(1-40) con nanopartículas de oro con un tamaño de partícula promedio de 6,0 nm y 3,6 nm respectivamente (modificadas con L-NIBC) durante 48 h. Y el panel E es una topografía de AFM después de incubar conjuntamente Ap(1-40) con AuC con un tamaño de partícula promedio de 1,8 nm (modificadas con L-NIBC) durante 48 h.
En la figura 5, la curva de cinética de amiloidosis de Ap(1-40) a diferentes concentraciones de L-NIBC se muestra en el panel A. Las curvas de cinética de amiloidosis de Ap(1-40) a diferentes concentraciones de nanopartículas de oro con tamaños de 18,2 nm, 10,1 nm, 6,0 nm y 3,6 nm, respectivamente, se muestran en el panel B-E. Las curvas de cinética de amiloidosis de Ap(1-40) a diferentes concentraciones de AuC con tamaños de 2,6 nm, 1,8 nm y 1,1 nm, respectivamente, se muestran en el panel F-H. Las curvas de cinética de amiloidosis de Ap en los paneles A-H son curvas en las que Ap(1-40) se incubó conjuntamente con nanopartículas de oro o AuC a diferentes concentraciones, □ representaba 0 ppm (es decir, sin nanopartículas de oro ni AuC), o representaba 0,1 ppm, A representaba 1 ppm, V representaba 5 ppm, ^ representaba 10 ppm, ☆ representaba 20 ppm.
Pudo observarse a partir de la figura 4 que, como control, las fibras de Ap estaban rellenas en el panel A; al igual que en el panel B; aunque las fibras se redujeron en cierta medida, todavía podían observarse fibras largas en el panel C; aunque no había fibras largas, todavía existían muchas fibras cortas de Ap en el panel D. Se indicó que L-NIBC no tuvo ningún efecto obvio sobre la formación de fibras de Ap(1-40). La adición de nanopartículas de oro de tamaño pequeño modificadas con L-NIBC pudo retrasar el proceso de amiloidosis de Ap(1-40), pero no inhibirlo por completo porque las fibras cortas continuarían creciendo hasta convertirse en fibras largas después de más tiempo. El panel E de la figura 4 no tiene ni fibras largas ni fibras cortas, lo que sugirió que las AuC modificadas con L-NIBC podían inhibir por completo el proceso de amiloidosis de Ap(1-40).
La figura 4 es un experimento cualitativo, pero la figura 5 es un experimento cuantitativo. El resultado de la figura 5 indica que la adición de L-NIBC no tuvo ningún efecto obvio sobre la cinética de amiloidosis de Ap(1-40) (panel A de la figura 5); para las nanopartículas de oro, cuando el diámetro de partícula era superior o igual a 10,1 nm, la adición de nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC impulsó tanto la fase de crecimiento como la fase estacionaria de la cinética de agregación de Ap (cuando la concentración de nanopartículas de oro era de 20 ppm, la fase de crecimiento de la cinética de agregación de Ap se impulsó hasta la 12a h y la fase estacionaria se impulsó hasta la 16a h), lo que sugiere que las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC podían acelerar la agregación de Ap (paneles B y C de la figura 5); cuando el diámetro de las nanopartículas de oro era inferior o igual a 6,0 nm (paneles D y E de la figura 5), podía retrasarse el tiempo de inicio de la agregación de Ap (cuando la concentración de nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC era de 20 ppm, la fase de crecimiento de la cinética de agregación de Ap se retrasó hasta la 54a h), lo que sugiere que las nanopartículas de oro tenían un efecto inhibidor sobre la agregación de Ap. Sin embargo, la figura 5 indica que, incluso si la concentración era muy alta (20,0 ppm), la adición de nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC no pudo inhibir por completo (es decir, no apareció fase de crecimiento y la curva de fluorescencia era completamente plana). Por otro lado, después de la adición de nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC, puesto que el pico de emisión de fluorescencia de ThT se ubica a 515 nm, mientras que el pico de absorción de resonancia de plasmón de las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC se ubica cerca de 520 nm, la disminución en la intensidad de fluorescencia de ThT observada en este caso debe ser la extinción parcial del efecto de resonancia de plasmón de las nanopartículas de oro con respecto a la fluorescencia de ThT, pero no debe atribuirse al efecto inhibidor de las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC sobre la agregación de Ap(1-40).
Los paneles F-H de la figura 5 indican que todas las AuC modificadas con L-NIBC pudieron inhibir significativamente la agregación de Ap (se pospuso el tiempo de inicio de la fase de crecimiento. Cuando la concentración de AuC modificadas con L-NIBC era de 5 ppm, el tiempo de inicio de la fase de crecimiento en la cinética de agregación de Ap 20 |uM pudo retrasarse hasta más de 50 h). Cuando la concentración de AuC modificadas con L-NIBC era de 10 ppm o superior, pudo inhibirse por completo la agregación de Ap (no apareció fase de crecimiento y la curva de fluorescencia era completamente plana). La concentración mínima de AuC modificadas con L-NIBC necesaria para la inhibición completa es relevante para el tipo de ligando y el diámetro de las AuC. Las concentraciones mínimas de AuC modificadas con L-NIBC con tamaños de 1,1 nm, 1,8 nm y 2,6 nm fueron 5,0 ppm, 5,0 ppm y 10,0 ppm, respectivamente. Además, como las AuC modificadas con L-NIBC no tienen efecto de resonancia de plasmón, no tienen efecto de extinción sobre la fluorescencia de ThT. Por tanto, la disminución en la intensidad de fluorescencia observada en este caso se debía totalmente al efecto inhibidor de las AuC modificadas con L-NIBC sobre la agregación de Ap(1-40). Los resultados cuantitativos de la figura 5 concuerdan bien con los resultados cualitativos de la figura 4.
Este experimento indica que: cuando el tamaño de las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC es inferior o igual a 6,0 nm, tienen un determinado efecto inhibidor sobre la agregación y fibrosis de Ap, pero de manera limitada; las AuC modificadas con L-NIBC tienen la función de inhibir por completo la agregación y fibrosis de Ap. Como las propias moléculas de L-NIBC no pueden influir en la agregación y fibrosis de Ap (en vista del panel B de la figura 4 y el panel A de la figura 5), esta función proviene de las AuC, pero no del ligando L-NIBC. Esto sienta las bases para la formación de medicamentos para enfermedades relacionadas con la agregación y fibrosis de Ap, que pueden clasificarse como sustancias que contienen AuC para su uso en la presente invención.
Este ejemplo también valida las funciones de las AuC modificadas con otros ligandos enumerados en la tabla 1. Por ejemplo, los paneles A-H de la figura 12 muestran el efecto inhibidor de las AuC modificadas con CR, N-acetil-L-cisteína (L-NAC), GSH, 1-[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropil]-L-prolina (Cap), D-NIBC, RC o L-cisteína y D-cisteína (la dosis es de 10 ppm) sobre la agregación y fibrosis de Ap(1-40). Se observó un fenómeno similar para las AuC modificadas con diferentes ligandos y pudo llegarse a la misma conclusión: estos ligandos por sí mismos no pueden influir en la agregación y fibrosis de Ap, las nanopartículas de oro modificadas con ligando con un tamaño superior a 3 nm tienen un efecto inhibidor limitado sobre la agregación y fibrosis de Ap y las nanopartículas de oro más grandes incluso fomentan la agregación y fibrosis de Ap; pero las AuC modificadas con ligando tienen un excelente efecto inhibidor sobre la agregación y fibrosis de Ap, y cuando la concentración es superior a 5-10 ppm, puede lograrse un efecto de inhibición completa, mientras que la concentración mínima necesaria para la inhibición completa varía ligeramente con el ligando y el tamaño de partícula de las AuC. Del mismo modo, estas AuC modificadas con ligando se clasifican como sustancias que contienen AuC definidas en la presente invención.
Ejemplo 4 (no comprendido por la presente invención): experimento de modelo celular de EA inducida por Ap
Se usó la viabilidad celular como índice en el experimento de este ejemplo. El resultado de prueba del método de CCK-8 reflejó los efectos de las muestras de AuC o nanopartículas de oro modificadas con ligando sobre la toxicidad de Ap(1-40), y mostró si las AuC o nanopartículas de oro modificadas con ligando tenían un efecto neuroprotector sobre la patogenia del plegamiento erróneo de la proteína amiloide. Las células usadas en el experimento fueron la línea de células de neuroblastoma SH-SY5Y. Se estableció el modelo celular de EA inducida por Ap según la descripción en la bibliografía (R. Liu, H. Barkhordarian, S. Emadi, C. B. Park, M. R. Sierks, Neurobiology of Disease 2005, 20, 74). Método específico:
1) Se diluyeron células SH-sy5y (células que había pasado a la sexta generación) en fase de crecimiento logarítmico con medio completo (MEM FBS al 10% penicilina-estreptomicina al 1%) para obtener una suspensión celular a una densidad de 5x104/ml. Se inoculó la suspensión a 200 |ul por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivó en una incubadora con el 5% de CO2 a 37°C. Se añadió una muestra cuando las células se unieron a los pocillos.
2) Se añadieron 100 |ul de muestras de AuC modificadas con ligando o muestras de nanopartículas de oro modificadas con ligando, con diferentes tamaños de partícula y a concentraciones de 0,04 ppm, 0,4 ppm, 4 ppm, 20 ppm, 40 ppm y 80 ppm, respectivamente, que se disolvieron con medio de mantenimiento (MEM FBS al 2% penicilinaestreptomicina al 1%), a la suspensión incubada obtenida a partir de la etapa 1 ). Después de la incubación en la incubadora durante 2 h, se añadieron 100 |ul de Ap(1-40) 80 |uM, y luego se incubó la mezcla en la incubadora durante 24 h. De esta manera, las concentraciones finales de AuC modificadas con ligando o nanopartículas de oro modificadas con ligando fueron de 0,01 ppm, 0,1 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm y 20 ppm, respectivamente, mientras que la concentración final de Ap(1-40) fue de 20 |uM. Mientras tanto, hubo los grupos a continuación: el grupo de control de blanco no contenía células SH-sy5y, el grupo de control negativo contenía células SH-sy5y pero no contenía AuC modificadas con ligando o nanopartículas de oro modificadas con ligando ni Ap(1-40), el grupo de control de modelo celular contenía células SH-sy5y y Ap(1-40) (concentración final de 20 |uM) sólo, y el grupo de control de ligando contenía células SH-sy5y, Ap(1-40) (concentración final de 20 |uM) y L-NIBC (concentración final de 20 ppm). Se retiró el medio de cultivo, se añadió medio de mantenimiento (MEM) que contenía CCK-8 al 10% a 100 jul/pocillo y se incubó durante 4 h, se midió la absorbancia de cada pocillo a 450 nm para reflejar los efectos de prevención y tratamiento de las AuC modificadas con ligando sobre la lesión por Ap(1-40).
Se tomaron como ejemplo las AuC modificadas con L-NIBC en el ejemplo 2, se compararon las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC con las AuC y los resultados se muestran en la figura 6.
Los paneles A-C de la figura 6 muestran, respectivamente, los efectos de las AuC modificadas con L-NIBC con un tamaño de partícula de 1,1 nm, 1,8 nm o 2,6 nm a diferentes concentraciones sobre la viabilidad celular en el modelo celular de EA inducida por AP; los paneles D-F muestran, respectivamente, los efectos de las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC con un tamaño de partícula de 3,6 nm, 6,0 nm o 10,1 nm a diferentes concentraciones sobre la viabilidad celular del modelo celular de EA inducida por Ap.
Tal como se muestra en la figura 6, la adición de L-NIBC sólo no mejoró la viabilidad celular. Las AuC modificadas con L-NIBC con diferentes tamaños (los tamaños promedio fueron de 1,1, 1,8 y 2,6 nm, respectivamente) aumentaron la viabilidad celular desde casi el 60% hasta por encima del 95% en el modelo celular de EA inducida por Ap (todos los valores de P eran inferiores a 0,05, en los paneles A-C de la figura 6) incluso a una dosis muy baja (0,1-1 ppm, por ejemplo). Las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC con un diámetro promedio de 3,6 nm aumentaron la viabilidad celular en cierta medida al aumentar las concentraciones en el modelo celular de EA (panel D de la figura 6), pero no de manera obvia (P>0,05). Las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC con diámetros promedio de 6,0 nm y 10,1 nm, respectivamente, no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad celular (paneles E y F de la figura 6). Los resultados anteriores indicaron que las AuC modificadas con L-NIBC tuvieron una eficacia medicinal significativa en el modelo celular de EA inducida por Ap, mientras que las nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC no tuvieron ninguna eficacia obvia.
En esta realización se llevaron a cabo experimentos con AuC modificadas con otros ligandos enumerados en la tabla 1 con diversos tamaños. Los resultados también indicaron que las AuC modificadas con ligando mejoraron significativamente la viabilidad celular en un modelo celular de EA inducida por Ap. Se indicó que las AuC modificadas con diferentes ligandos tuvieron excelentes efectos terapéuticos sobre la Ea al menos a nivel de modelo celular, las cuales podrían clasificarse como sustancias que contienen AuC para su uso en la presente invención y usarse para el tratamiento de EA.
Ejemplo 5: experimento de modelo de ratón transgénico con EA
Experimento 1:
1) Se pesó respectivamente 1,0 g de AuC modificadas con ligandos enumerados en la tabla 1 y se disolvieron en 100 ml de agua como disoluciones madre, y se almacenaron a 4°C para su uso posterior. Se tomó un pequeño volumen de las disoluciones madre y se diluyó en agua antes de su uso.
2) Se dividieron aleatoriamente 180 ratones transgénicos de la raza B6/J-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo/MmNju (adquiridos del Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing) en tres grupos, 60 ratones por grupo, incluyendo un grupo de control, un grupo de dosis baja y un grupo de dosis alta. Cuando los ratones tenían 100 días de edad, los ratones en el grupo de control se alimentaron normalmente cada día, a los ratones en el grupo de dosis baja se les administró por vía oral 200 |il de AuC 0,5 g/l en agua al día y a los ratones en el grupo de dosis alta se les administró por vía oral 200 |il de AuC 2 g/l en agua al día.
3) Se dividieron aleatoriamente los ratones en el grupo de control, grupo de dosis baja y grupo de dosis alta en 7 lotes, respectivamente: cuando los ratones tenían 140 días, 160 días, 180 días, 200 días, 230 días, 260 días y 290 días de edad, respectivamente, se adoptaron el experimento del laberinto, el experimento de campo abierto y experimento de reconocimiento de objetos nuevos para investigar los cambios en los comportamientos de aprendizaje y memoria de los ratones. En los primeros cuatro lotes, 6 ratones en cada grupo; y en los últimos tres lotes, 6-8 ratones en cada grupo (considerando que hubo una determinada tasa de mortalidad en el proceso de alimentación de los ratones, lo mismo a continuación).
4) Después de las investigaciones del comportamiento de cada uno de los lotes de ratones anteriores, se detectó el contenido de Ap en la sangre: se extrajo sangre del plexo venoso orbital y se detectaron el contenido de Ap y la agregación de Ap mediante el método Elisa en suero.
5) Después de detectar el contenido de Ap en la sangre de cada uno de los lotes de ratones anteriores, se detectó la deposición de amiloide Ap que se distribuye en el hipocampo: se anestesió a los ratones después de la extracción de sangre ocular y se fijaron mediante perfusión cardiaca. Se recogieron los cerebros completos de los ratones y se sometieron a sedimentación por gradiente en sacarosa. Luego se congelaron y cortaron los cerebros. Se examinó la distribución de depósitos de amiloide Ap en el hipocampo mediante inmunohistoquímica.
Los resultados mostraron que las AuC modificadas con ligando para su uso en la presente invención podían mejorar significativamente el comportamiento cognitivo de los ratones transgénicos con EA e inhibir la formación de placas seniles en el cerebro y el desarrollo de la enfermedad, las cuales pueden usarse como sustancias que contienen AuC para tratar la EA.
Experimento 2:
1. Se pesó respectivamente 1,0 g de AuC modificadas con ligandos enumerados en la tabla 1, se disolvieron en 100 ml de agua como disoluciones madre, y se almacenaron a 4°C para su uso posterior. Se tomó un pequeño volumen de las disoluciones madre y se diluyó en agua antes de su uso. Las disoluciones madre se prepararon una vez cada dos semanas.
2. Se dividieron aleatoriamente 90 ratones transgénicos de la raza B6/J-Tg(APPswe,PSEN1de9)85Dbo/MmNju (adquiridos del Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing) en tres grupos: un grupo de control de modelo, un grupo de dosis baja y un grupo de dosis alta, 30 ratones por grupo (considerando que los ratones transgénicos de esta raza tuvieron una mortalidad de aproximadamente el 30% en el proceso de alimentación, con el fin de garantizar suficientes ratones en la parte final de este experimento, hubo más ratones en la parte inicial que en la parte final de este experimento). Cuando los ratones tenían 100 días de edad, los ratones en el grupo de control de modelo se alimentaron normalmente cada día, a los ratones en el grupo de dosis baja y en el grupo de dosis alta se les administró por vía oral disolución de AuC a una dosis de 5 mg/kg de peso corporal y 20 mg/kg de peso corporal, respectivamente, mediante inyección intraperitoneal una vez cada dos días.
3. Se sometió a prueba el comportamiento cognitivo de los ratones usando el experimento del laberinto acuático. El experimento del laberinto acuático de Morris (MWM) es uno que obliga al animal sometido a prueba a nadar y aprender a encontrar la plataforma oculta en el agua. El MWM se usa principalmente para someter a prueba las capacidades de aprendizaje y memoria del animal sometido a prueba de las posiciones espaciales y la percepción de dirección, el cual se adopta ampliamente en la investigación del desarrollo y la evaluación de medicamentos para la EA. Una latencia de escape más corta, cruzar más veces la plataforma después de su retirada, una mayor distancia de nado en el cuadrante objetivo y una permanencia más larga en el cuadrante objetivo de los ratones significa que los ratones tienen una mejor capacidad de memoria de la posición espacial y la percepción de dirección. Después de 150 días de administración, se sometió a prueba el comportamiento de cada ratón en el experimento del laberinto acuático de Morris. Este método experimental se refiere a la bibliografía (C. V. Vorhees, M. T. Williams, Nature Protocols 2006, 1, 848). Los detalles fueron los siguientes:
(1) Experimento de navegación de posicionamiento: el sistema de prueba del MWM consistía en una piscina circular y un sistema de vídeo y análisis automático. Las cámaras por encima de la piscina se conectaron a un ordenador (tal como se muestra en la figura 13). El laberinto acuático consistía en una piscina circular con un diámetro de 120 cm y una altura de 60 cm, y una plataforma con un diámetro de 9 cm. El nivel de líquido estaba 0,5 cm por encima de la plataforma y la temperatura del agua era de 22 0,5°C. Se usó pigmento blanco para teñir el agua de color blanco lechoso. Se usó el experimento de posicionamiento para medir las capacidades de aprendizaje y memoria de los ratones en el laberinto acuático, que duró 4 días. Tal como se muestra en la figura 13, el laberinto acuático se dividió como una cruz en cuatro cuadrantes en las cuatro direcciones de este (E), oeste (O), sur (S) y norte (N). La plataforma se colocó en el centro del cuadrante SO, cuya posición se mantuvo fija durante todo el experimento. Durante el adiestramiento, los ratones se colocaron suavemente en el agua desde 1/2 radianes en los diferentes cuadrantes, con las cabezas mirando hacia la pared de la piscina y cerca de la pared interna. Se registró el tiempo que tardaron los ratones en subir a la plataforma oculta (latencia de escape) mediante un sistema de seguimiento por cámara, o se detuvo el experimento cuando el tiempo registrado alcanzó los 60 s. Se permitió que los ratones estuvieran en la plataforma durante 30 s después de que subieran a la plataforma. Si los ratones no hallaban la plataforma en el plazo de 60 s (la latencia de escape se registró como 60 s en este caso), los investigadores guiarían a los ratones para subir a la plataforma y se les dejaría estar en la plataforma durante 30 s. Después del experimento, se sacó a cada ratón y se les secó suavemente. A cada ratón se les adiestró 4 veces al día durante cuatro días consecutivos, con intervalos de 15-20 min entre sesiones de adiestramiento.
(2) Prueba de exploración espacial: después de finalizar el adiestramiento al 4° día, se retiró la plataforma al 5° día, se colocaron suavemente los ratones en el agua desde el punto central del arco NE (el punto más alejado de la plataforma) mirando hacia la pared de la piscina, se registraron órbitas de movimiento de 60 s de los ratones mediante una cámara y se analizaron los tiempos de los ratones para cruzar la plataforma, el tiempo de permanencia en el cuadrante objetivo y la distancia de nado en el cuadrante objetivo mediante un software.
4. Se usa un experimento de inmunohistoquímica para detectar la distribución de deposición de amiloides en el hipocampo y la corteza cerebral, Ap(1-40) y Ap(1-42). La deposición patológica de Ap fuera de las neuronas en la corteza cerebral y el hipocampo es la principal característica patológica de la EA. Entre ellos, Ap(1-40) y Ap(1-42) son componentes importantes de las placas seniles en el cerebro, que son neurotóxicos y pueden provocar una disfunción cognitiva progresiva y la pérdida de memoria. En este experimento, se examinaron los cambios en la formación de placas de Ap(1-40) y Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral mediante inmunohistoquímica.
Método específico: después de que a los ratones se les administrara consecutivamente durante 100 días y 150 días, se tomaron 10-12 ratones de cada grupo para realizar una inmunohistoquímica del hipocampo y la corteza cerebral. En este caso, los ratones con 150 días de administración fueron aquellos que habían completado el experimento del MWM. Después de anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de hidrato de cloral al 5% (10 |il/g), se fijaron las extremidades en la mesa de experimentación y se abrieron los tórax para exponer por completo los corazones. Hay que prestar atención para no cortar los hígados durante la toracotomía. En primer lugar, se lavaron los ventrículos izquierdos con 50 ml de PBS 0,1 mol/l durante 5 min para retirar la sangre y luego se usó PBS 0,1 mol/l que contenía paraformaldehído al 4% para la perfusión y fijación durante 6 min. Después de la perfusión y fijación, se extirparon los cerebros y se colocaron en paraformaldehído al 4% a 4°C y se fijaron durante la noche. Se deshidrataron a su vez los tejidos con disolución de sacarosa al 10%, al 20% y al 30% por gradiente y se almacenaron a -80°C para su uso posterior. Se incrustaron los tejidos con parafina. Se realizaron cortes de la corteza cerebral y del hipocampo mesencefálico (8 |im de grosor) en referencia al mapa de cerebro de ratón y se usaron para la tinción inmunohistoquímica. Las etapas fueron las siguientes: se mantuvieron los cortes congelados de 8 |im de grosor a temperatura ambiente durante 30 min, se fijaron en acetona a 4°C durante 20 min, se lavaron con PBS tres veces (5 min cada vez) y luego se incubaron en H2O2 al 3% durante 10 min para eliminar la actividad peroxidasa. Después de lavar con PBS tres veces (5 min cada vez), se bloquearon los cortes con suero de cabra normal al 10% durante 40 min a temperatura ambiente (los cortes usados para la inmunohistoquímica de Ap(1-42) se incubaron en ácido fórmico al 10% durante 10 min antes del bloqueo para restablecer la actividad antigénica). Se vertió el suero, se añadió líquido de trabajo anti-Ap(1-40) (ab20068, dilución 1:20) o anti-Ap(1-42) (ab12267, dilución 1:200) a los cortes y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente, se lavaron con PBS tres veces (5 min cada vez). Se añadió gota a gota estreptavidina marcada con la enzima del rábano (diluida con PBS) a la disolución de trabajo de anticuerpo secundario y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar con PBS tres veces (5 min cada vez), se adoptó el método de reacción con DAB azul potenciada con sulfato de níquel para la coloración durante 10 min. Cuando el producto positivo era azul oscuro y el fondo era transparente, se enjuagó con agua destilada 3 veces para detener la coloración. Después de la contratinción con hematoxilina durante 1 min, se enjuagó con agua del grifo, se secó en un lugar ventilado y se selló con goma neutra. Se observó el número de placas de Ap en todo el hipocampo y toda la corteza cerebral y se contaron mediante un microscopio confocal. Cada muestra incluía dos cortes que contenían tanto el ventrículo izquierdo como el derecho como muestras paralelas. Se calculó el valor promedio para el análisis estadístico. Todos los datos se procesaron mediante el software SPSS (SPSS 21) y se sometieron a una prueba de la t o a un análisis de la varianza unilateral. P < 0,05 significó que la diferencia es estadísticamente significativa.
Se tomaron como ejemplo las AuC modificadas con L-NIBC con un tamaño promedio de 1,8 nm en el ejemplo 2, y se mostró el resultado del experimento del laberinto acuático después de 150 días de administración en la figura 14. El resultado indicó que no hubo ninguna diferencia estadística entre los ratones en el grupo de control de modelo y en los grupos de dosis alta y de dosis baja en la latencia de escape el día 1-2 de la prueba de navegación de posicionamiento (P>0,05, n=10-12/grupo) (panel A de la figura 14). Al aumentar el tiempo de adiestramiento, la latencia de escape de los ratones en el grupo de dosis alta fue obviamente más baja que en el grupo de modelo el día 3 y día 4 (P<0,01 y P<0,05), y la latencia de escape en el grupo de dosis baja fue más baja que en el grupo de modelo, pero sin ninguna diferencia estadística (P>0,05, véase el panel A de la figura 14). Después de completar el experimento de navegación de posicionamiento de los ratones, se retiró la plataforma y se inició el experimento de búsqueda espacial. Los resultados mostraron que, en comparación con los ratones en el grupo de control de modelo, los ratones en el grupo de dosis alta tuvieron un aumento significativo en las veces que cruzaron la plataforma y la distancia de nado en el cuadrante objetivo (P<0,05), y el tiempo de permanencia en el cuadrante objetivo también aumentó significativamente (P=0,05). En comparación con los ratones en el grupo de control de modelo, los ratones en el grupo de dosis baja mostraron un aumento en las veces que cruzaron la plataforma, la distancia de nado en el cuadrante objetivo y el tiempo de permanencia en el cuadrante objetivo, pero sin ninguna diferencia significativa (P>0,05) (paneles B-D de la figura 14). Los resultados anteriores indicaron que, después de la administración de AuC durante 150 días, las AuC mejoraron significativamente la capacidad de los ratones PPA/PS1 de aprender y recordar la posición espacial y el sentido de la dirección. Y este efecto era dependiente de la dosis.
Los resultados del experimento de inmunohistoquímica para detectar la distribución de deposición de amiloides de Ap(1-40) y Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral se muestran en la figura 15-figura 18.
Los paneles A, B y C de la figura 15 fueron los resultados de cortes inmunohistoquímicos típicos del hipocampo y la corteza cerebral de Ap(1-40) en el grupo de dosis alta, grupo de dosis baja y grupo de control de modelo el 100° día de administración. El panel D de la figura 15 fue el resultado estadístico. Los resultados experimentales indicaron que, en comparación con el grupo de control de modelo, los ratones en el grupo de dosis alta habían reducido significativamente las placas de Ap(1-40) en el hipocampo (44,6+12,2%, P<0,05) el 100° día de administración, pero no en la corteza cerebral (P>0,05). El grupo de dosis baja no tuvo ningún efecto significativo sobre la formación de placas de Ap(1-40) en el hipocampo y la corteza cerebral (P>0,05). La figura 16 mostró los resultados correspondientes de Ap(1-42). Indicó que la administración a una dosis alta podía reducir significativamente la formación de placas de Ap(1-42) en la corteza cerebral (reducción en un 61,5+11,4%, P<0,05), pero no en el hipocampo (P>0,05). La administración a una dosis baja no tiene ningún efecto significativo sobre la formación de placas de Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral (P>0,05). Estos resultados indicaron que, el 100° día de administración, las AuC habían mostrado un efecto inhibidor significativo sobre la formación de placas de Ap(1-40) y Ap(1-42), y este efecto mostró una obvia relación dependiente de la dosis.
Al aumentar el tiempo de administración y la edad de los ratones, la formación de placas de Ap(1-40) y Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral de los ratones aumentó significativamente en el grupo de control de modelo con 150 días de administración en comparación con 100 días de administración. Específicamente, Ap(1-40) aumentó en un 57,2+7,2% en el hipocampo (P<0,05) y un 49,1+19,6% en la corteza cerebral (P<0,05) y Ap(1-42) aumentó en un 74,4+7,0% en el hipocampo (P<0,05) y un 65+11,1% en la corteza cerebral (P<0,05). Se sugirió que cuanta más edad tuvieran los ratones del modelo, mayor podría ser la influencia en las funciones cognitivas y de memoria. Los paneles A, B y C de la figura 17 fueron los resultados de cortes inmunohistoquímicos típicos del hipocampo y la corteza cerebral de Ap(1-40) en el grupo de dosis alta, grupo de dosis baja y grupo de control de modelo el 150° día de administración, respectivamente. El panel D de la figura 17 fue el resultado estadístico. Los resultados indicaron que, en el grupo de dosis alta, Ap(1-40) disminuyó de manera obvia tanto en el hipocampo como en la corteza cerebral de los ratones (reducción en un 59,0+11,1%, P<0,05 en el hipocampo; y en un 36,4+4,5%, P<0,05 en la corteza cerebral), mientras que la administración a una dosis baja no tuvo ningún efecto significativo sobre la formación de placas de Ap(1-40) en el hipocampo (P>0,05), pero sí redujo significativamente las placas de Ap(1-40) en la corteza cerebral (reducción en un 26,9+2,1%, P<0,05). Se indicó que las AuC tuvieron un efecto inhibidor significativo sobre la formación de placas de Ap(1-40) el 150° día. Este efecto también mostró una relación dependiente de la dosis. Además, se usó el software SPSS para analizar la correlación entre el número de placas de Ap(1-40) y las veces que se cruza la plataforma en el experimento del laberinto acuático de 150 días. El análisis reveló que el número de placas de Ap(1-40) en el hipocampo y la corteza cerebral se correlacionaba de manera negativa significativamente con las veces que se cruza la plataforma (hipocampo: R=-0,848, P<0,01; corteza cerebral: R=-0,802, P<0,05). Este resultado respaldó adicionalmente la correlación entre la reducción de placas de Ap(1-40) en el hipocampo y la corteza cerebral inducida por la administración de AuC y la mejora de las capacidades de memoria y aprendizaje de los ratones inducida por la administración de AuC.
La figura 18 muestra los resultados correspondientes de Ap(1-42) tras la administración de AuC durante 150 días. Los resultados indicaron que la administración de AuC a una dosis alta inhibió de manera obvia la formación de placas de Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral (reducción en un 51,1+6,7%, P<0,05 en el hipocampo; y en un 62,8+4,6%, P<0,05 en la corteza cerebral). La administración a una dosis baja no tuvo ningún efecto obvio sobre la formación de placas de Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral de los ratones (P>0,05). Se indicó que las AuC tuvieron un efecto inhibidor significativo sobre la formación de placas de Ap(1-42) el 150° día. Este efecto mostró una relación dependiente de la dosis. El análisis estadístico de correlación mediante SPSS reveló que el número de placas de Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral se correlacionada de manera negativa significativamente con las veces que se cruza la plataforma (hipocampo: R=-0,794, P<0,05; corteza cerebral: R=-0,802, P<0,05). Este resultado respaldó adicionalmente la correlación entre la reducción de placas de Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral inducida por la administración de AuC y la mejora de las capacidades de memoria y aprendizaje de los ratones inducida por la administración de AuC.
En resumen, las AuC pudieron mejorar significativamente el comportamiento cognitivo de los ratones del modelo de EA e inhibir la formación de placas de Ap(1-40) y Ap(1-42) en el hipocampo y la corteza cerebral, por tanto, las AuC pudieron inhibir el desarrollo del estado patológico de ratones enfermos y usarse como sustancias que contienen AuC para prevenir y tratar la EA.
Las AuC modificadas con otros ligandos enumerados en la tabla 1 tuvieron efectos similares, de modo que no se describieron con detalle en este caso.
Ejemplo 6 (no comprendido por la presente invención): experimento de cinética de agregación de a-syn in vitro
Este ejemplo validó las funciones de las AuC modificadas con ligando a través de un experimento de cinética de agregación de a-syn in vitro, y lo comparó con el efecto de las moléculas de ligando sobre la cinética de agregación de a-syn cuando se usaron solas, para demostrar que esta función proviene de las AuC en lugar del ligando.
La tioflavina T (abreviatura: ThT) es un tinte específico para teñir fibras amiloides. Cuando se incuba junto con monómeros de polipéptidos o proteínas, su fluorescencia no cambia sustancialmente. Cuando encuentra polipéptidos o proteínas amiloides con una estructura de fibra, se acoplará inmediatamente con los polipéptidos o las proteínas amiloides y su intensidad de fluorescencia aumentará exponencialmente. Por este motivo, la ThT se usa ampliamente como marcador para monitorizar la amiloidosis de péptidos o proteínas. Este ejemplo utiliza el método de marcaje con fluorescencia con ThT para monitorizar el proceso cinético de la agregación por fibrosis de a-syn con la existencia de AuC. El método experimental específico fue el siguiente:
Pretratamiento de monómeros de a-syn: se disolvió polvo liofilizado (Bachem Corp.) de a-syn en HFIP para obtener una disolución de a-syn 1 g/l. Se incubó la disolución a temperatura ambiente durante 2-4 h después del sellado, luego se sopló para secar el HFIP con nitrógeno de alta pureza en una campana extractora. Por último, se disolvió la a-syn secada en 200 |i l de DMSO, después del sellado, se mantuvo la disolución en una nevera a -200C durante no más de una semana para su uso posterior. Antes de su uso, la disolución en DMSO de a-syn de diluyó con disolución de tampón fosfato abundante (PBS, 10 mM, pH = 7,4) hasta que la concentración de a-syn alcanzó 20 |iM para obtener una disolución en PBS de a-syn. Todas las disoluciones en PBS de a-syn en el experimento eran recién preparadas.
Preparación y detección de muestras: se añadieron las AuC modificadas con ligando a diferentes concentraciones enumeradas en la tabla 1 a disoluciones en PBS de a-syn 35 |iM, respectivamente, y se incubaron de manera continua en una placa de 96 pocillos a 37°C mediante el método de marcaje con fluorescencia con ThT, y se monitorizó la intensidad de fluorescencia mediante un lector de microplacas cada 10 minutos. El proceso cinético de agregación de a-syn se caracterizó a través del cambio en la intensidad de fluorescencia de ThT. Como grupos experimentales, se tomaron como ejemplo las AuC modificadas con L-NIBC con un tamaño de partícula de 1,8 nm preparadas en la realización 2. Se usaron moléculas de L-NIBC sin combinar con AuC como grupo de control de ligando. Se adoptaron cuatro concentraciones de AuNC, que fueron: 0 ppm (sólo contenía a-syn, no contenía AuC ni L-NIBC, como grupo de control de modelo), 1,0 ppm, 5,0 ppm y 10,0 ppm, respectivamente. Se usaron moléculas de L-NIBC en dos concentraciones, que fueron: 1,0 ppm y 10,0 ppm, respectivamente.
Los resultados se mostraron en la figura 19. Los resultados indicaron que, en el proceso de incubación de a-syn 35 |iM a 37°C, la intensidad de fluorescencia marcada con ThT aumentó rápidamente a partir de la 48a hora. Se demostró que se producían la agregación y fibrosis de a-syn. Esto fue compatible con el resultado notificado en la bibliografía (V. N. Uversky, J. Li, P. Souillac, I. S. Millett, S. Doniach, R. Jakes, M. Geodert, A. L. Fink, Journal of Biological Chemistry 2002, 277, 11970). El resultado del grupo de control de ligando indicó que usar sólo L-NIBC no tuvo ningún efecto obvio sobre la cinética de agregación de a-syn (panel A de la figura 19). En el grupo experimental con adición de AuC a baja concentración (tal como: 1,0 ppm y 5,0 ppm), la intensidad de fluorescencia marcada con ThT disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control de modelo y el grupo de control de ligando sin la adición de AuC, y el tiempo de inicio se retrasó de manera obvia (panel B de la figura 19). Se sugirió que la adición de AuC podía inhibir significativamente la agregación y fibrosis de a-syn. Cuando la concentración de AuC alcanzó los 10 ppm, la intensidad de fluorescencia marcada con ThT permaneció cerca de la línea base sin ningún aumento durante las 168 horas del experimento (panel B de la figura 19). Se sugirió que, cuando la concentración de AuC fuera lo suficientemente alta, podría inhibirse por completo la agregación y fibrosis de a-syn.
En este ejemplo, también se estudiaron las AuC modificadas con otros ligandos diferentes enumerados en la tabla 1. Por ejemplo, los paneles C-J de la figura 19 mostraron los efectos inhibidores de las AuC modificadas con D-NIBC, 1-[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropil]-L-prolina (Cap), GSH, N-acetil-L-cisteína (L-NAC), L-cisteína (L-Cys) y D-cisteína (D-Cys) (todas las dosis fueron de 10 ppm) sobre la agregación y fibrosis de a-syn. También se observó un fenómeno similar para las AuC modificadas con diferentes ligandos, y pudo llegarse a la misma conclusión: estos ligandos por sí mismos no pudieron influir en la agregación y fibrosis de a-syn, mientras que las AuC modificadas con ligando tuvieron un excelente efecto inhibidor sobre la agregación y fibrosis de a-syn. Cuando la concentración alcanzó los 10 ppm, pudo lograrse un efecto de inhibición completa. La concentración mínima necesaria para la inhibición completa varía ligeramente con ligandos diferentes. Del mismo modo, estas AuC modificadas con ligando se clasificaron como sustancias que contienen AuC para su uso en la presente invención. Otras AuC enumeradas en la tabla 1 tuvieron efectos similares. Sólo fueron diferentes las concentraciones de AuC necesarias para la inhibición completa de la agregación y fibrosis de a-syn. No se describirá con detalle.
Ejemplo 7 (no comprendido por la presente invención): experimento de modelo celular (SH-sy5y) de EP inducida por MPP+
Experimento 1:
El experimento usa la viabilidad celular como indicador; los resultados de prueba obtenidos a partir del método de CCK-8 reflejan la eficacia de resistencia de las AuC o nanopartículas de oro modificadas con ligando contra el efecto tóxico de MPP+ (una neurotoxina habitualmente usada) en un modelo de células nerviosas SH-sy5y de EP, para demostrar su efecto de neuroprotección sobre la EP. El modelo celular de EP inducida por MPP+ se establece según la descripción en la bibliografía (Cassarino, D S; Fall, C P; Swerdlow, R H; Smith, T S; Halvorsen, E M; Miller, S W; Parks, J P; Parker, W D Jr; Bennett, J P Jr. Elevated reactive oxygen species and antioxidant enzyme activities in animal and celular models of Parkinson's disease. Biochimica et biophysica acta. 1997, 1362, 77-86). El método específico fue el siguiente:
1) Se diluyeron células SH-sy5y en fase de crecimiento logarítmico con medio completo para obtener una suspensión celular a una densidad celular de 5x102 *4/ml. Se inoculó la suspensión a 200 |il por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivó en una incubadora con el 5% de CO2 a 37°C. Se añadió una muestra cuando las células se unieron a los pocillos.
2) Se disolvieron 100 |il de muestras de AuC modificadas con ligando (enumeradas en la tabla 1) o muestras de nanopartículas de oro modificadas con ligando con diferentes tamaños de partícula y a diferentes concentraciones en medio de mantenimiento, que se añadieron como primeros grupos para que las concentraciones finales fueran de 0,01 ppm, 0,1 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm y 20 ppm, respectivamente. Los primeros grupos fueron los grupos de administración. Después de 2 horas de pretratamiento con AuC o nanopartículas de oro modificadas con ligando, se añadió simultáneamente MPP+ (la concentración final era de 1 mM) a los grupos de administración y al grupo de control de células, respectivamente, un grupo de control de blanco era el que no contenía células SH-sy5y, un grupo de control negativo era el que contenía células SH-sy5y pero sin AuC o nanopartículas de oro ni MPP+, un grupo de control de células era el que contenía células SH-sy5y y MPP+ 1 mM sólo y un grupo de control de ligando era el que contenía células SH-sy5y y MPP+ 1 mM y moléculas de ligando correspondientes (la concentración final era de 20 ppm), luego se incubaron las muestras de cada uno de los grupos a 37°C durante 24 h, se centrifugaron para retirar el medio de cultivo, se añadieron a cada pocillo 100 |il de medio de mantenimiento que contenía CCK-8 al 10% y se continuó la incubación durante 4 h, y luego se midieron las absorbancias de cada pocillo a 450 nm para reflejar los efectos preprotectores y curativos de las AuC modificadas con ligando contra la lesión por MPP+.
Se adoptaron las mismas etapas para llevar a cabo los experimentos para las AuC y nanopartículas de oro modificadas con diferentes ligandos. Los resultados indicaron que las AuC modificadas con ligando para su uso en la presente invención tenían un efecto neuroprotector sobre la Ep . Este efecto también provenía de las AuC en lugar del ligando. Pueden usarse como sustancias que contienen AuC para resistir a la EP.
Experimento 2:
El experimento usa la viabilidad celular como indicador. Los resultados de prueba obtenidos a partir del método de CCK-8 reflejan la eficacia de resistencia de las AuC o nanopartículas de oro modificadas con ligando contra el efecto tóxico de MPP+ (una neurotoxina habitualmente usada) en un modelo de células nerviosas SH-sy5y de EP, para demostrar su efecto de neuroprotección sobre la EP. El modelo celular de EP inducida por MPP+ se establece según la descripción en la bibliografía (D. S. Cassarino, C. P. Fall, R. H. Swerdlow, T. S. Smith, E. M. Halvorsen, S. W. Miller, J. P. Parks, W. D. Jr. Parker, J. P. Jr. Bennett, Biochimica et Biophysica Acta 1997, 1362, 77). Método específico:
1) Se diluyeron células SH-sy5y en fase de crecimiento logarítmico con medio completo para obtener una suspensión celular a una densidad celular de 5x104/ml. Se inoculó la suspensión a 200 |il por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivó en una incubadora con el 5% de CO2 a 37°C. Se añadió una muestra cuando las células se unieron a los pocillos.
2) Se disolvieron 100 |il de muestras de AuC modificadas con ligando (enumeradas en la tabla 1) o muestras de nanopartículas de oro modificadas con ligando con diferentes tamaños de partícula y a diferentes concentraciones en medio de mantenimiento, que se añadieron como primeros grupos para que las concentraciones finales fueran de 0,01 ppm, 0,1 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm y 20 ppm, respectivamente. Los primeros grupos fueron los grupos de administración. Después de 2 horas de pretratamiento con AuC o nanopartículas de oro modificadas con ligando, se añadió simultáneamente MPP+ (la concentración final era de 1 mM) a los grupos de administración y al grupo de control de células, respectivamente, un grupo de control de blanco era el que no contenía células SH-sy5y, un grupo de control negativo era el que contenía células SH-sy5y pero sin AuC o nanopartículas de oro ni MPP+, un grupo de control de células era el que contenía células SH-sy5y y MPP+ 1 mM sólo, un grupo de control de AuC y un grupo de control de ligando era el que contenía células SH-sy5y y MPP+ 1 mM y moléculas de ligando correspondientes (la concentración final era de 20 ppm), luego se incubaron las muestras de cada uno de los grupos a 37°C durante 24 h, se centrifugaron para retirar el medio de cultivo, se añadieron a cada pocillo 100 |il de medio de mantenimiento que contenía CCK-8 al 10% y se continuó la incubación durante 4 h, y luego se midieron las absorbancias de cada pocillo a 450 nm para reflejar los efectos preprotectores y curativos de las AuC modificadas con ligando contra la lesión por MPP+.
Se tomaron como ejemplo los resultados experimentales de las AuC o nanopartículas de oro modificadas con L-NIBC, tal como se muestra en la figura 20. Los resultados indicaron que, después de 24 horas de cultivo, la viabilidad celular del grupo de control de AuC, con adición de AuC 100 mM sin MPP+, aumentó hasta el 108,5+7,1% en relación con el grupo de control de blanco (establecido como el 100%) (P<0,01), lo que sugiere que las AuC no eran tóxicas. La viabilidad celular del grupo de control de modelo, con adición de MPP+ 1 mM, pero sin AuC, disminuyó hasta el 65,1+4,0% (frente al grupo de control de blanco, P<0,01), la viabilidad celular del grupo de control de ligando fue del 61,5+3,8% (frente al grupo de control de blanco, P<0,01), lo que sugiere que el ligando sólo no aumentó la viabilidad del modelo celular con MPP+ introducido. Aunque la viabilidad celular del grupo de administración, con adición de 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm y 40 ppm de AuC, respectivamente, aumentó hasta el 97,9+2,8% (frente al grupo de control de modelo, P<0,01), el 99,7+4,0% (frente al grupo de control de modelo, P<0,001), el 95,3+1,7% (frente al grupo de control de modelo, P<0,01) y el 93,2+0,4% (frente al grupo de control de modelo, P<0,01), respectivamente, lo que sugiere que las AuC modificadas con ligando para su uso en la presente invención tenían un efecto protector sobre las células nerviosas en EP y que este efecto también provenía de las AuC en lugar del ligando. Por otro lado, las nanopartículas de oro correspondientes con el mismo ligando no ayudaron a mejorar la viabilidad de las células del modelo a ninguna de las concentraciones experimentales, lo que indica que las nanopartículas de oro no podrían usarse como medicamento para la prevención y el tratamiento de EP.
Se adoptaron las mismas etapas para llevar a cabo los experimentos para las AuC modificadas con diferentes ligandos enumerados en la tabla 1. Los efectos fueron similares, de modo que no se describirán con detalle en este caso.
Ejemplo 8 (no comprendido por la presente invención): experimento de modelo celular (PC12) de EP inducida por MPP+
En este experimento se usó el modelo de apoptosis inducida por MPP+ (100 mM) de células PC12, en combinación con la técnica de citometría de flujo, para observar el efecto protector de las AuC sobre la apoptosis y la lesión celular inducida por MPP+. Método específico: un grupo de control de blanco fue al que no se le añadió ni MPP+ ni AuC, un grupo de modelo de MPP+ fue al que se le añadió MPP+ sólo, un grupo de control de AuC fue al que se le añadió AuC sólo y un grupo experimental fue al que se le añadió tanto MPP+ como AuC. En un grupo experimental, se añadió la disolución de AuC modificadas con L-NIBC con un tamaño de partícula promedio de 1,8 nm a una suspensión de células PC12 (concentración final de AuC de 20 ppm) media hora más tarde, se añadió MPP+ y se incubó la mezcla durante 24 horas, se usaron el kit de detección de apoptosis celular anexina V-FITC/PI (adquirido de Roch) y el citómetro de flujo FACSCalibur para detectar la actividad de crecimiento y la apoptosis de las células, y los datos se adquirieron y analizaron mediante CellQuest Pro.
Los resultados del experimento se mostraron en la figura 21. Los resultados de detección por citometría de las células indicaron que, después de la incubación con MPP+ durante 24 h, tal como se indica en la detección por citometría de las células, el porcentaje de apoptosis celular del grupo de control de blanco, sin la adición de MPP+, fue del 23,5+2,8%. Cuando se incubaron conjuntamente 20 ppm de AuC solas con células PC12, el porcentaje de apoptosis celular fue del 28,47+3,2%, que no mostró ninguna diferencia significativa con respecto al grupo de control de blanco, lo que sugiere que las AuC no tenían ningún efecto citotóxico aparente. El porcentaje de apoptosis celular del grupo de modelo de MPP+ fue del 49,5+10,1%, que aumentó significativamente en comparación con el grupo de control de blanco (P<0,001). Cuando se incubaron células PC12 con AuC durante media hora antes de la adición de MPP+ y se incubaron conjuntamente durante 24 h, el porcentaje de apoptosis celular disminuyó hasta el 35,9+2,2%, en comparación con el grupo de modelo de MPP+, la apoptosis celular se redujo significativamente (P<0,05).
Se adoptaron las mismas etapas para llevar a cabo los experimentos para las AuC modificadas con diferentes ligandos enumerados en la tabla 1. Los efectos fueron similares, de modo que no se describirán con detalle en este caso.
Los resultados del ejemplo 7 y el ejemplo 8, en conjunto, indicaron que las AuC podían mejorar eficazmente la viabilidad celular e inhibir significativamente la apoptosis celular del modelo celular de EP inducida por MPP+.
Ejemplo 9: experimento de modelo de ratón con EP inducida por MPTP
Experimento 1:
Animales de experimentación: se criaron 80 ratones C57bl/6 macho, de 8 semanas de edad, con peso corporal de 25­ 30 g, 3 ratones en cada jaula, en un entorno de temperatura ambiente 22-27°C, 12 h de ritmos circadianos, con alimentación y bebida a voluntad y aclimatados durante 7 días.
Modelo de ratón con EP inducida por MPTP: se dividieron aleatoriamente los ratones en cuatro grupos, 20 ratones por grupo, incluyendo un grupo de control de blanco, un grupo de control normal de AuC, un grupo de modelo de MPTP y un grupo de tratamiento con AuC. En el grupo de modelo de MPTP y el grupo de tratamiento de AuC, se inyectaron por vía subcutánea 20 mg/kg (base libre) de MPTP una vez cada 2 h durante cuatro veces. En el grupo de control de blanco, se inyectaron por vía subcutánea 20 mg/kg de solución salina normal una vez cada 2 h durante cuatro veces.
8 h después de la última inyección, en el grupo de control de blanco y el grupo de modelo de MPTP, se inyectaron por vía intravenosa 10 |il de solución salina normal cada día, mientras que en el grupo de control normal de AuC y el grupo de tratamiento con AuC, se inyectaron por vía intraperitoneal 10 |il de las disoluciones en solución salina normal de AuC modificadas con ligando enumeradas en la tabla 1 (concentración de AuC de 10 g/l) respectivamente cada día. La inyección duró 7 días. Se colocaron los animales en cajas de alimentación con relleno limpio y agua y pienso a voluntad.
Prueba de comportamiento: prueba del cilindro giratorio, la prueba del cilindro giratorio requiere que los animales mantengan el equilibrio y se muevan de manera continua sobre un rodillo. Es una prueba ampliamente usada para someter a prueba la coordinación motora. El diámetro del rodillo es de 6 cm y la velocidad de rotación es de 20 rpm. Después de que los animales se adaptaran al rodillo durante cinco veces, se inició la prueba a un intervalo de 1 min. Se registró de manera consecutiva la latencia de caída del cilindro giratorio durante 5 veces y se calculó su valor promedio.
Determinación de neurotransmisores: después de la prueba de comportamiento, se sacrificaron los animales, y se extrajo el cuerpo estriado de los ratones y se almacenó a -80°C. Durante la medición, se trató el cuerpo estriado con 10 |il/mg (de cuerpo estriado) de homogeneizado (ácido perclórico 0,1 M, EDTA-2Na 0,1 mM), se rompió mediante ultrasonicación en un baño de hielo durante 30 min, se centrifugó en una centrífuga refrigerada a 10000 rpm durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y se filtró con un filtro de 0,25 |im, se inyectó en la columna de cromatografía de líquidos del dispositivo de HPLC. Se detectaron el nivel de transmisor de dopamina (DA) y sus metabolitos ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) y ácido homovanílico (HVA) en el cuerpo estriado mediante el sistema de fase líquida de alta resolución en el laboratorio. La columna de cromatografía debe mantenerse con una fase móvil recién preparada durante 2 h antes de cada prueba. Condiciones de HPLC: velocidad de flujo: 1 ml/min; temperatura de columna: 30°C; las longitudes de onda de excitación y absorción del detector de fluorescencia fueron de 280 nm y 330 nm, respectivamente.
Determinación de tirosina hidroxilasa: se extrajeron tejidos cerebrales y se fijaron en PFA al 4% en peso sacarosa al 2% en peso durante 4-6 h, luego se empaparon en una disolución de sacarosa al 30% en peso, se incrustaron con OCT después de que los tejidos se hundieran hasta el fondo, se realizaron cortes frontales continuos mediante una cortadora para productos congelados, se tiñeron con el método ABC (complejo avidibiotina-peroxidasa), se extrajeron los tejidos congelados de la sustancia negra y se cortaron, se tiñeron con TH y se colorearon en difenilamina, se observaron bajo un microscopio y se tomaron fotografías.
Los resultados indicaron que las AuC modificadas con ligando para su uso en la presente invención podían mejorar significativamente los comportamientos motores de los ratones del modelo de e P inducida por MPTP, aumentar el número de neuronas dopaminérgicas, mejorar el nivel intracerebral de neurotransmisores de dopamina. Podrían usarse como sustancias que contienen AuC para tratar la EP.
Experimento 2:
Animales de experimentación: se criaron 80 ratones C57bl/6 macho, de 8 semanas de edad, con peso corporal de 25­ 30 g, 3 ratones en cada jaula, en un entorno de temperatura ambiente 22-27°C, 12 h de ritmos circadianos, con alimentación y bebida a voluntad y aclimatados durante 7 días.
Modelo de ratón con EP inducida por MPTP: se dividieron aleatoriamente los ratones en cuatro grupos, 20 ratones por grupo, incluyendo un grupo de control de blanco, grupos de control de AuC (basándose en la dosis de AuC, se clasificaron en grupo de dosis baja y grupo de dosis alta), un grupo de modelo de MPTP, grupos de tratamiento con AuC (basándose en la dosis de AuC, se clasificaron en grupo de dosis baja y grupo de dosis alta). En el grupo de modelo de MPTP y los grupos experimentales de AuC, se inyectaron por vía intraperitoneal 30 mg/kg (base libre) de MPTP respectivamente una vez al día durante 7 días consecutivos. En el grupo de control de blanco, se inyectaron por vía subcutánea 30 mg/kg de solución salina normal una vez al día durante 7 días consecutivos. En el grupo de control de AUC de dosis baja y el grupo de tratamiento con AuC de dosis baja, se inyectaron por vía intraperitoneal 100 pl de disoluciones en solución salina normal de AuC modificadas con L-NIBC 1 g/l con un tamaño de partícula promedio de 1,8 nm respectivamente una vez al día, mientras que en el grupo de control de AUC de dosis alta y el grupo de tratamiento con AuC de dosis alta, se inyectaron por vía intraperitoneal 100 pl de disoluciones en solución salina normal de AuC modificadas con L-NIBC 4 g/l con un tamaño de partícula promedio de 1,8 nm respectivamente una vez al día, durante 7 días consecutivos. Se colocaron los animales en una caja de alimentación con relleno limpio y agua y pienso a voluntad.
1. Pruebas de comportamiento:
(1) Prueba de actividad locomotora espontánea: se transfirieron los animales desde las jaulas al detector de actividad autónoma. Después de que los animales se adaptaran al nuevo entorno durante 5 min, se registraron sus actividades espontáneas y los cambios en el plazo de 5 min. Se usaron la distancia de actividad y la velocidad de movimiento de los animales en el plazo de 5 min para medir la actividad de los animales.
(2) Prueba de nado: remítase al método de prueba de Donnan (G. A. Donnan, G. L. Willis, S. J. Kaczmarezyk, P. Rowe, Journal of the Neurological Science 1987, 77, 185), se colocaron los ratones de prueba en un tanque acuático de Morris. La profundidad del agua era de 60 cm y la temperatura era de 22°C. Se registraron la distancia de nado y el tiempo de nado de los animales en el plazo de 10 min para medir la actividad de los animales.
(3) Prueba del cilindro giratorio: la prueba del cilindro giratorio requiere que los animales mantengan el equilibrio y se muevan de manera continua sobre un rodillo. Es una prueba ampliamente usada para someter a prueba la coordinación motora. El diámetro del rodillo es de 6 cm y la velocidad de rotación es de 20 rpm. Después de que los animales se adaptaran al rodillo durante cinco veces, se realizó cada prueba a un intervalo de 1 min. Se registró la latencia de caída del cilindro giratorio. La prueba se llevó a cabo 5 veces y se calcularon sus valores promedio.
2. Detección inmunohistoquímica en el cuerpo estriado y la sustancia negra: después de las pruebas de comportamiento, se tomaron 5 ratones de cada grupo para llevar a cabo la detección inmunohistoquímica en la sustancia negra y el cuerpo estriado. Después de la anestesia abdominal con 1 ml de pentobarbital de sodio al 0,5%, se abrieron los tórax, se usaron en primer lugar 15 ml de solución salina normal al 0,9% para enjuagar la sangre de la aorta y luego se usaron 100 ml de disolución de tampón fosfato 0,1 mol/l (PBS, pH 7,2) que contenía paraformaldehído al 4% para la perfusión (en primer lugar rápido, luego lentamente) y fijación durante 1 h. Se extrajeron los cerebros después de la perfusión y fijación, se colocaron en paraformaldehído al 4%, se incrustaron con parafina en referencia al mapa de cerebro de ratón, se realizaron cortes frontales de la sustancia negra y el cuerpo estriado. El grosor de los cortes de cerebro fue de 3 pm/corte. Se usaron los cortes de cerebro obtenidos en inmunofluorescencia, inmunohistoquímica en dos etapas hipersensible y otros experimentos. Las etapas de la tinción inmunohistoquímica fueron las siguientes: los cortes de cerebro obtenidos estuvieron en disolución en metanol de H2O2 al 0,3% (1 ml de H2O2 al 30% 80 ml de metanol 19 ml de PBS) durante 30 min, en Triton X-100 al 0,3%-PBS durante 30 min, se empaparon en anticuerpo monoclonal de ratón anti-tirosina hidroxilasa (TH) (1:200) o Iba1 (razón de dilución 1:250) y se incubaron durante 48 h (4°C), se empaparon en anticuerpo secundario biotinilado de conejo anti-IgG de ratón (1:500) y se incubaron durante 2 h (temperatura ambiente). Se enjuagaron rápidamente con agua destilada y se colorearon mediante el método de reacción con DAB azul potenciada con sulfato de níquel-amonio durante 20 ~30 min. Cuando el producto positivo era azul oscuro y el fondo era transparente, se enjuagaron los cortes de cerebro con agua destilada 3 veces para detener la coloración. Después de cada una de las etapas anteriores, los cortes de cerebro deben enjuagarse con PBS 0,01 mol/l tres veces y durante 10 min cada vez. Y el anticuerpo primario usado en este caso se diluyó con PBS que contenía suero bovino al 1% y Triton X-100 al 0,3%, y se diluyó el complejo de anticuerpo secundario y ABC con PBS. Se llevaron a cabo la adherencia de los cortes de cerebro, la deshidratación y el sellado con goma neutra transparente.
3. Ensayo de inmunotransferencia (WB) de proteínas: la tirosina hidroxilasa (TH) es una enzima clave en la ruta biosintética de la dopamina (DA), y la inmunohistoquímica de la TH puede mostrar cambios en las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y el cuerpo estriado (D. Luo, J. Zhao, Y. Cheng, S. M. Lee, J. Rong, Molecular Neurobiology 2017, DOI: 10.1007/s12035-017-0486-6). Después de las pruebas de comportamiento, se tomaron cinco ratones de cada grupo para llevar a cabo la detección por WB en el cuerpo estriado, se extrajeron los tejidos de cerebro necesarios sobre hielo, se rompieron en lisado RIPA, se centrifugaron a 4°C y 12000 g durante 30 min para homogeneizar, se extrajeron las proteínas para preparar muestras, se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS a 55 V-60 V durante 4,5 h y se transfirieron las proteínas a la membrana mediante un método semiseco a corriente constante de 60 mA durante aproximadamente 1,5 h. Se bloqueó la membrana con leche desnatada al 5% a temperatura ambiente durante 1 h; se añadió anticuerpo de conejo anti-TH diluido con TBST (razón de dilución 1:300), se dejó reposar durante la noche a 4°C; se recuperó el anticuerpo, se lavó la membrana con TBST tres veces, 10 min cada vez; se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo IRDye R 680RD diluido con TBST (razón de dilución 1:3000); se lavó la membrana con TBST tres veces, 10 min cada vez; se examinaron las señales de proteínas mediante un sistema de obtención de imágenes por láser de infrarrojos de dos colores.
Los resultados de prueba de la actividad locomotora espontánea de los ratones se mostraron en la figura 22. De tres a cinco minutos después de la administración de MPTP, los ratones mostraron temblor, disminución del movimiento, lomo arqueado, apertura de las patas traseras, inestabilidad de la marcha, cola vertical y pelo vertical. Se produjeron crisis epilépticas individuales después de aproximadamente 30 a 60 minutos. Los síntomas anteriores se redujeron gradualmente, y los ratones volvieron a la normalidad después de 24 horas. Sin embargo, al aumentar el número de administraciones, se alivió la respuesta aguda, pero después de 24 horas, disminuyó el rendimiento de ejercicio, y la inestabilidad de la marcha y la respuesta lenta se volvieron más obvias. Después de la administración continua de MPTP durante siete días, la distancia de actividad espontánea y la velocidad de movimiento de los ratones eran significativamente menores que las del grupo de control de blanco (P<0,01), mostrando los síntomas de bradicinesia. La administración de AuC solas no tuvo ningún efecto significativo sobre la distancia de actividad espontánea ni sobre la velocidad de movimiento de ratones normales (paneles A y C de la figura 22). La administración combinada de AuC (dosis alta) en ratones del modelo de MPTP pudo aumentar significativamente la distancia de actividad espontánea y la velocidad de movimiento de los ratones (paneles B y D de la figura 22), lo que sugiere que las AuC desempeñan un papel significativo en la mejora de la actividad locomotora espontánea de los ratones del modelo de MPTP. En comparación con el grupo de modelo de MPTP, la diferencia fue significativa (distancia de actividad espontánea: P<0,05; velocidad de movimiento: P<0,01).
Los resultados de la prueba de nado de los ratones se mostraron en la figura 23. Después de siete días de inyección continua de MPTP, se colocaron los ratones en un tanque de agua para realizar la prueba de nado. Un mayor tiempo de nado y una mayor distancia de nado de los ratones indican que los ratones tenían una mejor coordinación motora de las extremidades. El grupo de control de blanco y los grupos de control de AuC no tuvieron ningún efecto significativo sobre el tiempo de nado ni la distancia de nado de los ratones (paneles A y C de la figura 23). En comparación con el grupo de control de blanco, el grupo de modelo de MPTP mostró una disminución significativa de la distancia de nado en 10 min (P<0,05) y una disminución significativa del tiempo de nado en el tanque de agua (P<0,05), lo que sugiere que MPTP redujo significativamente la capacidad motora de nado en los ratones. En comparación con el grupo de modelo de MPTP, el grupo de tratamiento con AuC con administración de AuC (dosis alta) y MPTP mostró un aumento de la distancia de nado (P<0,05) y un aumento significativo del tiempo de nado (P<0,05) (paneles B y D de la figura 23), lo que sugiere que las AuC mejoraron significativamente el trastorno de comportamiento motor inducido por MPTP de nado en los ratones.
Los resultados de la prueba del cilindro giratorio en ratones se mostraron en la figura 24. Después de que a los ratones se les inyectara MPTp de manera consecutiva durante 7 días, se sometieron a la prueba del cilindro giratorio. En el grupo de control de blanco al que se le administró solución salina normal, la latencia de caída del cilindro giratorio y el porcentaje de los ratones que se cayeron del cilindro giratorio fueron de 12,1+4,6 min y del 33,3+1,5% (paneles A y C de la figura 24). En comparación con el grupo de control de blanco, la latencia de caída del cilindro de los ratones en el grupo de modelo de MPTP se acortó significativamente hasta 5,5+3,7 min, y el porcentaje de caídas del cilindro aumentó significativamente hasta el 83,3+3,4%. Se indicó que, después de la administración de MPTP, disminuyó la coordinación motora de los ratones y los ratones no podían agarrarse al cilindro de manera estable y eran susceptibles de caerse del cilindro giratorio (paneles B y D de la figura 24). La administración de AuC solas no tuvo ningún efecto significativo sobre la latencia de caída de los ratones (imagen A de la figura 24), pero durante un movimiento prolongado en el rodillo, el porcentaje de los ratones que se cayeron del cilindro giratorio aumentó significativamente (P<0,001 frente al grupo de control de blanco). Se indicó que la autoadministración de AuC tuvo un determinado efecto sobre el comportamiento en el rodillo de los ratones (panel C de la figura 24). Sin embargo, en comparación con el grupo de modelo de MPTP, el grupo de tratamiento con AuC con administración tanto de MPTP como de AuC mostró un aumento obvio de la latencia de caída del cilindro giratorio (grupo de dosis baja: P<0,01; grupo de dosis alta: P<0,05) y una disminución significativa del porcentaje de caídas del cilindro giratorio (P<0,001 tanto para el grupo de dosis alta como para el grupo de dosis baja). Los resultados se mostraron en los paneles B y D de la figura 24. Esto indicó que las AuC tienen el efecto de mejorar la disfunción de coordinación motora inducida por MPTP.
Los resultados de la detección inmunohistoquímica en la sustancia negra y el cuerpo estriado y la detección por WB en el cuerpo estriado se mostraron en la figura 25. En comparación con el grupo de control de blanco, el grupo de modelo de MPTP mostró una disminución obvia en el número de neuronas inmunopositivas para TH (es decir, neuronas dopaminérgicas) en la sustancia negra con una contracción de las neuronas residuales y una reducción o desaparición de los axones, y una reducción de neuronas inmunopositivas para TH en el cuerpo estriado y una disminución de la densidad de fibras nerviosas. Los resultados del análisis por WB indicaron que las neuronas dopaminérgicas en el cuerpo estriado se redujeron hasta el 55,8+5,6% (grupo de control de blanco: 100%) (frente al grupo de control de blanco, P<0,01, véase el panel C de la figura 25). La administración de AuC solas no tuvo ningún efecto significativo sobre las neuronas inmunopositivas para TH ni sobre la densidad de fibras nerviosas en la sustancia negra y el cuerpo estriado (paneles A y B de la figura 25). La administración combinada de AuC y MPTP pudo inhibir significativamente la regulación por disminución inducida por MPTP de la expresión inmunopositiva para TH en células y neurofilamentos de la sustancia negra y el cuerpo estriado. Los resultados del análisis porWB indicaron que, cuando se adoptaron dosis bajas de AuC, la razón de neuronas dopaminérgicas en el cuerpo estriado fue el 65,6+6,3% del grupo de control de blanco (P<0,01, frente al grupo de modelo de MPTP, véase el panel C de la figura 25), y cuando se adoptaron dosis altas de AuC, la razón de neuronas dopaminérgicas en el cuerpo estriado alcanzó el 84,7+4,5% del grupo de control de blanco (P<0,001 frente al grupo de modelo de MPTP). Los resultados indican que las AuC tuvieron un efecto significativo sobre la resistencia a la citotoxicidad de MPTP y mostraron un efecto protector notable contra la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y el cuerpo estriado.
También se adoptó el mismo método para llevar a cabo experimentos usando las AuC modificadas con diferentes ligandos enumerados en la tabla 1. Los efectos fueron similares, de modo que no se describirán con detalle en este caso.
Los resultados anteriores indicaron que las AuC modificadas con ligando para su uso en la presente invención podían mejorar significativamente la actividad locomotora espontánea, la capacidad motora y la capacidad de coordinación corporal de los ratones del modelo de EP inducida por MPTP, y tenían un efecto protector significativo contra la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y el cuerpo estriado, lo que indica que las sustancias que contienen AuC pueden usarse para tratar la EP.
Ejemplo 10 (no comprendido por la presente invención): evaluación de la bioseguridad
1. Se adoptó la línea celular SH-sy5y para evaluar la bioseguridad de las sustancias que contienen AuC a nivel celular.
Método específico: se recogieron células SH-sy5y en la fase de crecimiento logarítmico de las células (células en el pase 6). Se ajustó la concentración de la suspensión celular y se añadieron 100 pl a cada pocillo. Se sembraron las células y se ajustó la densidad celular a 1000-10000 por pocillo. Se colocaron las placas de cultivo celular (los pocillos marginales de las placas de 96 pocillos se llenaron con medio de cultivo celular) en una incubadora celular y se incubaron en un entorno con el 5% de CO2, 37°C durante 24 h, de modo que las células se unieron a la pared. Se extrajeron las placas de 96 pocillos y luego se colocaron en una cabina de bioseguridad después de la desinfección con alcohol. Se extrajo por succión el medio de cultivo celular original y luego se añadieron disoluciones de AuC modificadas con ligando enumeradas en la tabla 1, que se diluyeron con medio de cultivo celular para obtener una concentración final de 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm y 500 ppm, respectivamente. Se añadió un mismo volumen de medio de cultivo celular nuevo al grupo de control (sin AuC). Y se colocó en una incubadora celular y se incubó durante 48 h. Se establecieron 6 pocillos duplicados para cada uno del grupo experimental y el grupo de control. Después de 48 h de incubación, se retiró el medio de cultivo mediante centrifugación, luego se lavó con PBS 2-3 veces. Se añadieron a cada pocillo 100 pl de medio de cultivo nuevo y 20 pl de disolución de metil-tiazolil-tetrazolio (MTT) (5 mg/ml, es decir, MTT al 0,5%) y se continuó el cultivo durante 4 h. Se terminó el cultivo, se extrajo la placa de 96 pocillos y se centrifugó (1000 rpm) durante 10 min. Se extrajo por succión el sobrenadante y se añadieron a cada pocillo 200 pl de DMSO, y se colocaron en una mesa con agitación y se hizo oscilar a baja velocidad durante 10 min hasta que el color en los pocillos era uniforme y el cristal se disolvió por completo. Se midió la absorbancia de cada pocillo a 490 nm mediante un lector de microplacas. Las operaciones anteriores deben llevarse a cabo en un entorno estéril. Excepto la detección, todas las etapas se completaron en una cabina de bioseguridad. Los materiales experimentales deben desinfectarse en un autoclave antes de su uso.
Se tomaron como ejemplo las AuC modificadas con L-NIBC en el ejemplo 2, cuyos resultados se mostraron en la figura 26, en la que los paneles A-C mostraron los efectos de las AuC con tamaños de partícula de 2,6 nm, 1,8 nm o 1,1 nm y a concentraciones finales de 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm o 500 ppm sobre la viabilidad de células SH-sy5y. Se indicó que, a una concentración bastante alta (tal como: 100 ppm), la adición de AuC modificadas con L-NIBC casi no tuvo ninguna influencia en la viabilidad celular. A una concentración más alta (tal como: 200 y 500 ppm), la adición de AuC modificadas con L-NIBC provocaría una ligera lesión celular (tasa de mortalidad celular menor del 20%). Puesto que 100 ppm era mucho mayor que la concentración con efecto más baja de las AuC (0,1 ~1 ppm o inferior), pudo concluirse que las AuC modificadas con L-NIBC tenían una alta seguridad a nivel celular.
Otras AuC modificadas con ligando con diferentes tamaños enumeradas en la tabla 1 también tuvieron efectos similares. No se describirán con detalle en este caso.
2. Se adoptó el estudio de toxicidad aguda en ratones para evaluar la toxicidad aguda de sustancias que contienen AuC.
Método específico: para las diferentes AuC modificadas con ligando enumeradas en la tabla 1 (se tomaron como ejemplo las AuC modificadas con L-NIBC con un diámetro promedio de 1,8 nm en el ejemplo 2), se tomaron 60 ratones adultos y se dividieron en cuatro grupos con 15 ratones en cada grupo, que fueron: un grupo de control y tres grupos experimentales. En el grupo de control, los ratones se alimentaron normalmente, mientras que, en los tres grupos experimentales, los ratones se alimentaron con AuC mediante administración oral (por sonda nasogástrica) a una dosis de 0,1 g/kg de peso corporal, 0,3 g/kg de peso corporal y 1 g/kg de peso corporal al día, respectivamente, durante una semana en la condición de dieta normal. Los ratones se alimentaron normalmente durante 30 días después de finalizar la administración de AuC. Se observaron respuestas anómalas de los ratones.
En el experimento con ratones, la ingesta de AuC con diferentes tamaños a tres concentraciones no tuvo ninguna influencia en la supervivencia ni en la actividad de los ratones. Incluso para la ingesta de dosis alta de 1 g/kg de peso corporal, los ratones seguían estando sanos.
Otras AuC modificadas con ligando enumeradas en la tabla 1 también tuvieron resultados similares. No se describirán con detalle en este caso. Basándose en los resultados anteriores, pudo concluirse que las AuC eran muy seguras.
Ejemplo 11: distribución tisular y distribución metabólica de las sustancias que contienen CuC en ratones
Experimento 1:
Etapas de operación: se dividieron aleatoriamente 80 ratones en cuatro grupos, 20 ratones en cada grupo, y se alimentaron con las AuC modificadas con ligando enumeradas en la tabla 1 mediante administración oral (por sonda nasogástrica) a dosis de 100 mg/kg, 20 mg/kg, 5 mg/kg y 1 mg/kg, respectivamente, en los grupos. Después de la alimentación con las AuC, se dividieron aleatoriamente los 20 ratones en cada grupo en 4 subgrupos con 5 ratones en cada subgrupo. Se sacrificaron en los puntos de tiempo de 2 h, 6 h, 24 h y 48 h, respectivamente, después de la alimentación. Se extrajeron por separado tejidos del corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y cerebro. Se pesó cada tejido y se añadieron 2 ml de agua para homogeneizar, y luego se añadieron 2 ml de agua regia y se mezclaron con vórtice, y se hicieron oscilar durante 72 h en un oscilador. Se añadió disolución de ácido nítrico al 2% en peso hasta un volumen final de 10 ml y se centrifugó a 15000 rpm durante 15 min. Se extrajeron por succión 4 ml de sobrenadante y se midió el contenido del elemento oro en el líquido tisular mediante espectrometría de absorción atómica.
Los resultados indicaron que las AuC pudieron atravesar la barrera hematoencefálica y llegar al cerebro. Pudieron excretarse fuera del cuerpo con el paso del tiempo, de modo que no tuvieron ninguna acumulación obvia en el cuerpo. Por tanto, las sustancias que contienen AuC para su uso en la presente invención tenía una buena perspectiva en la aplicación de preparación de medicamentos que tratan la EA o la EP.
Experimento 2:
Etapas de operación: se dividieron aleatoriamente 80 ratones en cuatro grupos con 20 ratones en cada grupo y se les inyectó por vía intraperitoneal las AuC modificadas con ligando enumeradas en la tabla 1. Las dosis de AuC (se tomaron como ejemplo las AuC modificadas con L-NIBC con un diámetro promedio de 1,8 nm) en cada grupo fueron de 100 ppm, 20 mg ppm, 5 ppm y 1 ppm de peso corporal de ratón, respectivamente. Después de la inyección de AuC, se dividieron aleatoriamente los 20 ratones en cada grupo en 4 grupos, 5 ratones en cada grupo. Se sacrificaron en los puntos de tiempo de 2 h, 6 h, 24 h y 48 h, respectivamente, después de la alimentación. Se extrajeron por separado tejidos del corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y cerebro. Se pesó cada tejido y se añadieron 2 ml de agua para homogeneizar, y luego se añadieron 2 ml de agua regia y se mezclaron con vórtice, y se hicieron oscilar durante 72 h en un oscilador. Se añadió disolución de ácido nítrico al 2% en peso hasta un volumen final de 5 ml y se centrifugó a 15000 rpm durante 15 min. Se extrajo por succión 1 ml de sobrenadante y se midió el contenido del elemento oro en el líquido tisular mediante espectrometría de absorción atómica.
Se adoptaron las etapas anteriores para llevar a cabo los experimentos para las AuC modificadas con otros ligandos enumerados en la tabla 1.
Los resultados indicaron que, después de 2 h, el contenido del elemento oro en el cerebro alcanzó el 1%-10% de la concentración inicial. Después de 6 h, el contenido en el cerebro pudo mantenerse a un nivel similar. Después de 24 h, el contenido en el cerebro disminuyó significativamente. A las 48 h, el contenido disminuyó hasta casi o por debajo del límite de detección excepto para las muestras a una dosis de 100 ppm. Los resultados anteriores indicaron que las sustancias que contienen AuC también presentaban una buena bioseguridad a nivel animal, las cuales pueden atravesar la barrera hematoencefálica, y no tuvieron ninguna acumulación obvia en el cuerpo.
En resumen, los resultados experimentales anteriores ilustraron los siguientes puntos (las “nanopartículas de oro” y las “AuC” mencionadas a continuación se refieren todas ellas a casos de modificación con ligando):
(1) En el experimento (ejemplo 3) para la agregación de Ap in vitro, se halló que el efecto de las nanopartículas de oro sobre la cinética de agregación de Ap estaba relacionado con el tamaño. Cuando el diámetro de partícula era superior o igual a 10,1 nm, la adición de nanopartículas de oro pudo acelerar la agregación de Ap, y cuando el tamaño de partícula era inferior o igual a 6,0 nm, se inhibió la agregación de Ap, pero no pudo lograrse la inhibición completa de la agregación de Ap. Sin embargo, cuando se usaron AuC (el diámetro promedio es menor de 3 nm), todas las AuC pudieron inhibir significativamente la agregación de Ap in vitro, y este efecto estaba relacionado con la concentración de AuC. Cuando la concentración de AuC alcanzó los 5-10 ppm, pudo inhibirse por completo la agregación de Ap, y la concentración mínima requerida para la inhibición completa estaba relacionada con el tipo de ligando y el diámetro de las AuC. En el experimento in vitro (ejemplo 6) para la inhibición de la agregación de asyn, también se halló que las AuC tenían el mismo efecto de inhibición completa de la agregación y fibrosis de asyn.
(2) En el experimento de modelo celular de EA inducida por Ap y modelo celular de EP inducida por MPP+ (ejemplo 4, ejemplo 7 y ejemplo 8), se halló que las nanopartículas de oro con pequeños tamaños de partícula (por ejemplo, nanopartículas de oro con un diámetro promedio de 3,6 nm o 6,0 nm) no tuvieron ningún efecto significativo sobre la mejora de la viabilidad celular del modelo celular de EA inducida por Ap y el modelo celular de EP inducida por MPP+, lo que sugiere que las nanopartículas de oro no mostraron eficacia medicinal obvia ni en EA ni en EP a nivel celular, de modo que no podían usarse directamente como principio activo para preparar medicamentos que tratan la EA o la EP. Sin embargo, para las AuC modificadas con ligandos diferentes con diferentes tamaños usadas en la presente invención (el diámetro promedio es menor de 3 nm), se halló que una dosis muy baja de AuC (tal como: 0,1-1 ppm) todavía podía aumentar la viabilidad celular de los dos modelos desde el 50%-65% hasta por encima del 95%. Esto indicó que, a nivel celular, la eficacia medicinal de las AuC era significativa. Como los ligandos no tuvieron ningún efecto sobre la agregación de Ap ni sobre ninguno de los dos modelos celulares (ejemplos 4, 7 y 8), pudo concluirse que la eficacia medicinal de las AuC provenía de las propias AuC. Esto ofreció un nuevo enfoque para la aplicación de AuC.
(3) Además, se usaron el modelo de ratón transgénico con EA y el modelo de ratón con EP inducida por MPTP (ejemplo 5 y ejemplo 9) en la presente invención y divulgación, respectivamente, para verificar adicionalmente la eficacia medicinal de las AuC, indicando que las AuC desempeñaban un papel significativo en la mejora de la capacidad de comportamiento cognitivo y la capacidad de comportamiento motor del ratón, inhibiendo la formación de placas seniles en el cerebro e inhibiendo la apoptosis específica de neuronas dopaminérgicas inducida por MPTP en la sustancia negra y el cuerpo estriado, y podían usarse como medicamento preventivo o terapéutico para enfermedades relacionadas.
(4) En el experimento para la evaluación adicional de la bioseguridad (ejemplo 10), cuando se cultivaron conjuntamente AuC a una concentración de 100 ppm (en peso) con células nerviosas, no tuvieron ninguna influencia obvia en la viabilidad celular; cuando la concentración superó los 100 ppm (mucho mayor que la concentración con efecto más baja de las AuC), la viabilidad celular disminuyó ligeramente. Como la concentración con efecto más baja de las AuC (0,1-1 ppm) era mucho más baja de 100 ppm, pudo concluirse que las AuC tenían una excelente bioseguridad a nivel celular. En la prueba de toxicidad aguda en ratones, se había hallado que una dosis de 1 g/kg de peso corporal (equivalente a 1000 ppm) de AuC administradas una vez al día durante siete días consecutivos no provocó ningún efecto adverso. En el estudio de distribución y farmacocinética in vivo en ratones (ejemplo 11), el contenido del elemento oro en el cerebro alcanzó el 1%-10% de la concentración inicial después de 2 h. Después de 6 h, el contenido en el cerebro se mantuvo a un nivel similar. Después de 24 h, el contenido en el cerebro disminuyó significativamente. A las 48 h, el contenido disminuyó hasta por debajo del límite de detección excepto para las muestras a una dosis de 100 ppm. Los resultados anteriores indican que una sustancia que contiene AuC también presenta una buena bioseguridad a nivel animal, pueda atravesar la barrera hematoencefálica y no tiene ninguna acumulación obvia en el cuerpo, de modo que tenía una buena perspectiva de aplicación en la preparación de medicamentos que tratan la EA o la EP.
(5) En comparación con la tecnología actual, los ligandos usados en la presente invención no se diseñaron específicamente para los comportamientos de agregación de Ap y a-syn, y el experimento de contraste indicó que los ligandos usados no tuvieron ningún efecto obvio sobre la agregación de Ap y a-syn (ejemplo 3). Sin embargo, puesto que el tamaño de las AuC era menor que el tamaño de la propia proteína pudo inhibirse en gran medida la agregación de Ap y a-syn mediante la combinación del efecto del tamaño y las débiles interacciones moleculares. Las excelentes eficacias en el modelo celular de EA inducida por Ap y el modelo de animal transgénico confirmaron adicionalmente la viabilidad de las sustancias que contienen AuC en la preparación de medicamentos para el tratamiento de EA. Además, las excelentes eficacias de las sustancias que contienen AuC en el modelo celular de EP inducida por MPP+ y el modelo animal de EP inducida por MPTP indicaron que las sustancias que contienen AuC también tenían amplias perspectivas de aplicación en la preparación de medicamentos que tratan otras enfermedades neurodegenerativas. Además, puesto que el modelo celular de EP inducida por m Pp+ y el modelo animal de EP inducida por MPTP no implicaban fibrosis de proteínas, pero sí actuaron sobre mecanismos más profundos incluyendo la función de transducción de señales relacionada con el metabolismo de energía y el metabolismo de neurotransmisores de las células nerviosas, pudo especularse que las sustancias que contienen AuC no sólo podían afectar a la fibrosis de proteínas sino también influir en el proceso de enfermedades neurodegenerativas a un nivel más profundo. Será de gran importancia para la investigación y el desarrollo de nuevos medicamentos para enfermedades neurodegenerativas.
Aplicabilidad industrial
Las sustancias que contienen AuC para su uso en la presente invención pueden mejorar el comportamiento cognitivo y las capacidades de comportamiento motor de los ratones e inhibir la formación de placas seniles en el cerebro en un modelo de ratón transgénico con EA y un modelo de ratón con EP inducida por MPTP, y presentan una buena bioseguridad a nivel animal. Son adecuadas para aplicaciones industriales.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Agrupaciones de oro (AuC) o sustancias que contienen las agrupaciones de oro (AuC) para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de enfermedad de Alzheimer (EA) o enfermedad de Parkinson (EP), en las que las AuC o sustancias comprenden AuC y ligando Y que recubre externamente las AuC, en las que el diámetro de núcleo de oro de las AuC es menor de 3 nm,
en las que el ligando Y incluye, sin limitación, uno o más de L(D)-cisteína y sus derivados, oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados, y otros compuestos que contienen tiol.
2. AuC o sustancias para su uso según la reivindicación 1, en las que la L(D)-cisteína y sus derivados son L(D)-cisteína, N-isobutiril-L(D)-cisteína (L(D)-NIBC) o N-acetil-L(D)-cisteína (L(D)-NAC).
3. AuC o sustancias para su uso según la reivindicación 1, en las que los oligopéptidos que contienen cisteína y sus derivados son dipéptidos que contienen cisteína, tripéptidos que contienen cisteína o tetrapéptidos que contienen cisteína.
4. AuC o sustancias para su uso según la reivindicación 3, en las que los dipéptidos que contienen cisteína son dipéptido L-cisteína-L-arginina (CR), dipéptido L-arginina-L-cisteína (RC), dipéptido L-histidina-L-cisteína (Hc ) o dipéptido L-cisteína-L-histidina (CH).
5. AuC o sustancias para su uso según la reivindicación 3, en las que los tripéptidos que contienen cisteína son tripéptido glicina-L-cisteína-L-arginina (GCR), tripéptido L-prolina-L-cisteína-L-arginina (PCR), tripéptido L-lisina-L-cisteína-L-prolina (KCP) o L-glutatión (GSH).
6. AuC o sustancias para su uso según la reivindicación 3, en las que los tetrapéptidos que contienen cisteína son tetrapéptido glicina-L-serina-L-cisteína-L-arginina (GSCR) o tetrapéptido glicina-L-cisteína-L-serina-L-arginina (g Cs R).
7. AuC o sustancias para su uso según la reivindicación 1, en las que otros compuestos que contienen tiol son 1-[(2S)-2-metil-3-tiol-1-oxopropil]-L-prolina, ácido tioglicólico, mercaptoetanol, tiofenol, D-3-trolovol, N-(2-mercaptopropionil)-glicina o dodecilmercaptano.
8. AuC o sustancias para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en las que el diámetro de núcleo de oro de las AuC es de 0,5-2,6 nm.
ES17836293T 2016-08-05 2017-07-20 Sustancia que contiene agrupación de oro y método de preparación y uso de la misma Active ES2908466T3 (es)

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