JP2021119784A - コンポジット単一細胞核酸分析のための液滴ベースの方法および機器 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年9月9日に出願された米国仮特許出願第62/048,227号明細書、2015年4月13日に出願された同第62/146,642号明細書の利益および優先権を主張する。
本発明は、National Institutes of Healthにより授与されたGrant No.HG006193のもとで政府支援により行われた。政府は本発明の一定の権利を有し得る。
このプロトコルにおいて、ユニークにバーコード化されたビーズを、逆転写のためのプライマーとして使用するために合成する。ビーズは、下流PCRのためのプライミング部位として使用される表面上で合成された固定配列(図2AのSMT A)を有するものから最初に開始する。次に、ビーズを4つの等しい反応容器中に合計12回スプリットおよびプールしてそれぞれのビーズにユニークである4^12個のユニークバーコード配列を生成する(図2B)。この12bp領域は、それがそれぞれビーズに特異的であるため、細胞バーコードとして機能する。次に、ビーズを、4つ全ての塩基との8ラウンドの縮重合成にわたり全て一緒にプールし;この8bp領域は「分子バーコード」であり、それぞれのmRNAをユニークにタグ付けし、その結果、細胞中のそれぞれのmRNA分子をデジタルカウントすることができる。最後に、mRNAのポリアデニル化テールのための捕捉領域として機能する30dT塩基を合成する(文献中では「オリゴdT」と称されることが多い)。
Toyopearl HW−65S樹脂を、Tosoh Biosciences,inc.から購入した。表面ヒドロキシルをPEG誘導体と反応させて18炭素長のフレキシブル鎖リンカーを生成した。次いで、10μmolサイクルスケールおよび3分間のカップリング時間のDNA合成を使用するExpedite 8909 DNA/RNA合成装置上での逆5’−>3’ホスホラミダイト合成のための固体担体として誘導体化ビーズを使用した。使用されるアミダイトは、以下のものであった:N6−ベンゾイル−3’−O−DMT−2’−デオキシアデノシン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−ホスホラミダイト(dA−N−Bz);N4−アセチル−3’−O−DMT−2’−デオキシ−シチジン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−ホスホラミダイト(dC−N−Ac);N2−DMF−3’−O−DMT−2’−デオキシグアノシン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト(dG−N−DMF);3’−O−DMT−2’−デオキシチミジン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト;および3’−O−DMT−2’−デオキシウリジン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホラミダイト。無水酢酸およびN−メチルイミダゾールをキャッピングステップにおいて使用し;エチルチオテトラゾールを活性化ステップにおいて使用し;ヨウ素を酸化ステップにおいて使用し、ジクロロ酢酸を脱ブロッキングステップにおいて使用した。ビーズ表面上で生成されたオリゴヌクレオチド配列を図2Aに示す。PCRハンドルとして使用される一定配列(図の「SMT A)を合成する。次いで、12サイクルのプールアンドスプリットホスホラミダイト合成を実施する(図2Aの細胞バーコードまたは「CBC」)。これらのサイクルの間、ビーズを合成カラムから取り出し、プールし、4つの質量が等しい部分にアリコート化し;次いで、それらのビーズアリコートを別個の合成カラム中に配置し、dG、dC、dT、またはdAホスホラミダイトのいずれかと反応させた。このプロセスを、合計で4^12=16,777,216個のユニークバーコード配列について12回繰り返した(図2B)。これらのサイクルの完了時、8サイクルの縮重オリゴヌクレオチド合成を全てのビーズに対して実施し(図2Aの分子バーコード「MBC」)、次いで30サイクルのdT添加を実施した。
1)ポリアデニル化RNAについてのビーズ結合キャパシティーの決定。飽和量(20,000個のビーズ当たり100pmol)のポリアデニル化合成RNAをバーコードビーズに2×SSC中で5分間アニールした。次いで、ビーズを200ulの1×TE+0.01%のTweenにより3回洗浄し、10ulのTE中で再懸濁させた。次いで、ビーズを65℃において5分間加熱し、1ulの上清をNanodrop Spectrophotometer上で260nmにおいて定量した。
ヒト293T細胞およびネズミNIH/3T3細胞を購入した。293Tおよび3T3細胞を、10%のFBSおよび1%のペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたDMEM中で増殖させた。
ラット網膜から網膜神経節細胞を精製する既に記載の方法(Barres et al.,1988)を適合させることにより、単一細胞懸濁液をP14マウス網膜から調製した。手短に述べると、マウス網膜をパパイン溶液(40Uのパパイン/10mLのDPBS)中で45分間消化した。次いで、パパインをトリプシン阻害剤溶液(DPBS中0.15%のオボムコイド)中で中和し、組織を粉砕して単一細胞懸濁液を生成した。粉砕後、細胞をペレット化し、再懸濁させ、細胞懸濁液を20μmのNitexメッシュフィルターに通して濾過していかなる塊状細胞も排除し、次いでこの懸濁液をDrop−Seqに使用した。次いで、細胞をDPBS+0.2%のBSA中で200個の細胞/μl(レプリケート1〜6)または30個の細胞/μl(レプリケート7)のいずれかに希釈した。
ビーズ(Barcoded Bead SeqAまたはBarcoded Bead SeqBのいずれか)を、30mLの100%のEtOHにより2回洗浄し、30mLのTE/TW(10mMのTris pH8.0、1mMのEDTA、0.01%のTween)により2回洗浄した。ビーズペレットを10mLのTE/TW中で再懸濁させ、100μmフィルターに通して4℃における長期保存のために50mLのFalconチューブ中に入れた。フックスローゼンタール細胞カウンターを使用してビーズの原液濃度(ビーズ/μL)を評価した。Drop−Seqのため、ビーズのアリコートを原液チューブから取り出し、500μLのDrop−Seq溶解緩衝液(DLB、200mMのTris pH7.5、6%のFicoll PM−400、0.2%のサルコシル、20mMのEDTA)中で洗浄し、次いで100個のビーズ/μLのビーズ濃度に適切な容量のDLB+50mMのDTT中で再懸濁させた。
ナノリットル液滴を使用する数千個の個々の細胞のゲノムワイド発現プロファイリング
疾患は、異なるタイプの細胞から構成される複合組織内で生じ、それ自体で作用する単一細胞を(ほとんど)含まず;細胞は、常に互いに相互作用し、集団的決定をなし、動的変化を連係し、一緒に機能する。正常組織において、この結果はホメオスタシスであり;疾患において、1つ以上の相互作用の機能不全が病変をもたらし、またはそれを悪化させ得る。
多数の個々の細胞を効率的にプロファイリングするため、本出願人らはDrop−Seqを開発し、それにおいて、本出願人らは細胞を小型の液滴中で封入し、それぞれの個々の液滴(封入された細胞)からの転写物をバーコード化してそれらの起源細胞を記憶させる。Drop−Seqは、以下のステップからなる(図7A):(1)組織から単一細胞懸濁液を調製する;(2)それぞれの個々の細胞を、1つの区別されてバーコード化されたマイクロ粒子、ビーズまたは粒子(例えば、マイクロビーズ、マクロビーズ、ナノ粒子など)とナノリットルスケール液滴中で同時封入する;(3)細胞を、それらが液滴中で単離された後にのみ溶解させる;(4)細胞のmRNAをその付随マイクロ粒子上で捕捉し、STAMP(マイクロ粒子に付着している単一細胞トランスクリプトーム)を形成する;(5)数千個のSTAMPを単一反応において逆転写させ、増幅させ、シーケンシングする;および(6)STAMPバーコードを使用してそれぞれの転写物の起源細胞を推定する。本出願人らは、このアプローチのキー構成要素およびそれらの検証を記載する。
ここで、本出願人らは、無制約数の個々の細胞のゲノムワイド発現を同時に分析するための新たな技術のDrop−Seqを記載してきた。本出願人らは、最初に、インタクトヒトおよびマウス細胞の混合物をプロファイリングすることによりDrop−Seqを検証した。次いで、本出願人らは、Drop−Seqを使用して名目上均一な細胞集団における細胞状態および複合組織中の細胞タイプを確認した。細胞状態を分析するため、本出願人らは、2つの種からの1,001個の非同調的に分裂する細胞にわたり準連続時間分解能において細胞周期をプロファイリングし、進化的に保存される発現振動を有する新規細胞周期調節遺伝子を明らかにした。細胞タイプを分析するため、本出願人らは、中枢神経系の利用可能な部分のマウス網膜からの44,808個の個々の細胞をプロファイリングした。本出願人らは、網膜において39個の転写的に区別される細胞集団を同定し、それらの細胞間の新規関係を明らかにし、新たな細胞タイプ特異的マーカーをノミネートし、そのうちの2つを本出願人らが免疫組織化学により検証した。
装置組立。マイクロ流体装置はAutoCADソフトウェア(Autodesk,Inc.)を使用して設計し、コンポーネントはCOMSOL Multiphysics(COMSOL Inc.)を使用して試験した。CADファイルも補足として利用可能である。
実施例2についての拡張実験手順
ビーズ合成。ビーズ官能化および逆方向ホスホラミダイト合成(5’から3’)は、Chemgenes Corpにより実施した。Toyopearl HW−65S樹脂(30ミクロン平均粒子直径)をTosoh Biosciences,inc.から購入し、表面アルコールをPEG誘導体により官能化して18炭素長のフレキシブル鎖リンカーを生成した。次いで、10マイクロモルサイクルスケールおよび3分間のカップリング時間におけるDNA合成を使用するExpedite 8909DNA/RNA合成装置上での逆方向ホスホラミダイト合成(5’→3’)のための固体担体として官能化ビーズを使用した。使用されるアミダイトは、以下のものであった:N6−ベンゾイル−3’−O−DMT−2’−デオキシアデノシン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−ホスホラミダイト(dA−N6−Bz−CEP);N4−アセチル−3’−O−DMT−2’−デオキシ−シチジン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−ホスホラミダイト(dC−N4−Ac−CEP);N2−DMF−3’−O−DMT−2’−デオキシグアノシン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−ホスホラミダイト(dG−N2−DMF−CEP);および3’−O−DMT−2’−デオキシチミジン−5’−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル−ホスホラミダイト(T−CEP)。無水酢酸およびN−メチルイミダゾールをキャッピングステップにおいて使用し;エチルチオ−テトラゾールを活性化ステップにおいて使用し;ヨウ素を酸化ステップにおいて使用し、ジクロロ酢酸を脱ブロッキングステップにおいて使用した。12回のスプリットアンドプールホスホラミダイト合成サイクルのそれぞれの後、ビーズを合成カラムから取り出し、プールし、手作業で混合し、4つの質量が等しい部分に分配し;次いでそれらのビーズアリコートを別個の合成カラム中で配置し、dG、dC、dT、またはdAホスホラミダイトのいずれかと反応させた。このプロセスを、合計で4^12=16,777,216個のユニークバーコード配列について12回繰り返した。使用されるバーコード化ビーズ配列に関する完全な詳細についてである。
ビーズの調製。ビーズ(Barcoded Bead SeqAまたはBarcoded Bead SeqBのいずれか;表9および拡張実験手順最後の注釈参照)を、30mLの100%のEtOHにより2回洗浄し、30mLのTE/TW(10mMのTris pH8.0、1mMのEDTA、0.01%のTween)により2回洗浄した。ビーズペレットを10mLのTE/TW中で再懸濁させ、100μmフィルターに通して4℃における長期保存のために50mLのFalconチューブ中に入れた。INCYTOから購入したフックスローゼンタール細胞カウンターを使用してビーズの原液濃度(ビーズ/μL)を評価した。Drop−Seqのため、ビーズのアリコートを原液チューブから取り出し、500μLのDrop−Seq溶解緩衝液(DLB、200mMのTris pH7.5、6%のFicoll PM−400、0.2%のサルコシル、20mMのEDTA)により洗浄し、次いで100個のビーズ/μLのビーズ濃度に適切な容量のDLB+50mMのDTT中で再懸濁させた。
(1)本出願人らは、それらの細胞を、トレーニングセットから同定された有意なPCにより定義された部分空間上に射影した。手短に述べると、本出願人らは、高変動性遺伝子のみを考慮して射影セットに対応する384×36,145個の発現行列をセンタリングおよびスケーリングし;トレーニングセットのスケーリングパラメータを使用してそれぞれの行をセンタリングおよびスケーリングした。次いで、本出願人らは、このスケーリングされた発現行列の転置行列に、トレーニングセットPCAから学習された384×32個の遺伝子スコア行列を乗じた。これは、トレーニングセット上で学習された32個の有意なPCに沿う射影セットにおける細胞についてのPC「ローディング」を生じさせた。
(2)このPCローディングに基づき、射影セットにおけるそれぞれの細胞を、元のtSNEアルゴリズム(Shekhar et al.,2014)と一致する数学的フレームワークを使用してより早期に導入されたトレーニングセットのtSNEマップ上に独立して埋め込んだ。本出願人らは、このアプローチがトレーニングセットから同定されたものの外側で新規クラスタを発見しない一方、完全データセットの統計的検出力を活用することにより異なるクラスタ間の区別を鮮明にすることに留意する。さらに、細胞を、未加工遺伝子発現値ではなくそれらのPCシグネチャーに基づき射影し、それにより本出願人らのアプローチは個々の遺伝子計測値における技術的ノイズに対してよりロバストになる。
である。
1.これはポストホック射影であり、p(u’|ui)は、それが常に合計1に制約されるという点でペアワイズ類似度の相対尺度にすぎないため、本出願人らは、新たな細胞が1または2つのトレーニング細胞とのそれらの高い相対類似性に関してtSNEマップ上に埋め込まれる可能性(「ショート回路形成」)を回避することを所望した。換言すると、本出願人らは、少なくとも数個の細胞によりトレーニングセットにおいて十分に表示されたPC部分空間の領域から抜き出されたそれらの細胞のみを射影することを選択した。したがって、本出願人らは、p(u’|ui)>Pthresがトレーニングセットにおける少なくともNmin個の細胞について真である場合(pthres=5×10−3、Nmin=10)にのみ、射影のための細胞u’を保持した。本出願人らは、射影セットがトレーニングセットと完全に異なることが既知であるケースに対して射影アルゴリズムを試験することによりpthresおよびNminについての値を較正してそのような細胞がこの制約により大部分射影されることを確保した。(セクション「「サンプル外」射影試験」参照)
2.ポイント1における制約をパスする細胞について、tSNE座標y’0の初期値は、
3.1における条件を充足する細胞は、KLダイバージェンスの最小値を最大数の反復内で見出すことができる場合、位置y’*に「良好に射影された」と言われる。しかしながら、プログラムは非凸であり、極小値のみを見出すことが保証されるため、本出願人らは、より良好な最小値を見出すことができるか否か探索することを所望した。手短に述べると、本出願人らは、y’*に対してセンタリングされた25×25格子からのポイントを均一にサンプリングしてKL−ダイバージェンスの値がy’*以下におけるその値の5%内である点を確認した。この条件がそのときの(<2%)で充足された場合は常に、本出願人らは、初期値として新たな点を設定することにより最適化を再実行した。
(1)上記セクションの条件1を充足せず(すなわち、少なくともNmin個のトレーニング細胞との高い相対類似度を有さなかった)、したがって、射影に「不成功」であった細胞。
(2)tSNE座標y’に良好に割り当てられたが、以下の条件に従って既存のクラスタのいずれにも割り当てることができなかった細胞。
(3)tSNE座標y’に良好に割り当てられ、既存のクラスタの1つに「間違って割り当てられた」細胞。細胞を、y’およびセントロイド間の距離がクラスタ半径(セントロイドから最も遠い点の距離)よりも小さい場合およびその場合に限りセントロイドがy’に最も近いクラスタに割り当てた。
細胞およびビーズ濃度。本出願人らの実験は、Drop−Seqにおいて使用される細胞濃度が、得られるライブラリーの純度およびダブレット割合に対して強力な線形関係を有することを示した(図9A、9B、および14D)。細胞濃度は、スループットにも線形的に影響する:細胞を100個の細胞/ulの最終濃度において使用する場合、1時間当たり約10,000個の単一細胞ライブラリーを処理することができ、細胞を12.5個の細胞/ulの最終濃度において使用する場合、約1,200個を処理することができる。スループットおよび純度間のトレードオフは、追求される具体的な科学的疑問に応じて使用者に異なって影響する可能性が高い。現在、標準的実験のため、本出願人らは、小さい割合の二重および細胞汚染物質を許容する50個の細胞/ulの最終濃度を使用して容易にかつ信頼性をもって10,000個の細胞を数時間の過程にわたり処理することができる。上記推奨のとおり、本出願人らは、現在、120個/ulの濃度(液滴中の最終濃度=60個/ul)におけるビーズのローディングを推薦し、それは実験的に<5%のビーズダブレット割合を生じさせる。
実施例2および3についての表
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Claims (97)
- ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズであって、
(a)リンカー;
(b)シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列;
(c)均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列;
(d)それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子;
(e)場合により、ポリアデニル化mRNAを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド冗長配列;および
(f)場合により、同定のための追加の基質を提供する少なくとも1つの他のオリゴヌクレオチドバーコード
を含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。 - 前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記バーコードが4〜1000ヌクレオチド長の範囲である、請求項2に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記ポリアデニル化mRNAを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド配列がオリゴdT配列である、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記リンカーが非開裂性直鎖ポリマーである、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記リンカーが化学開裂性直鎖ポリマーである、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記リンカーが、非開裂性の場合により置換されている炭化水素ポリマーである、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記リンカーが、感光性の場合により置換されている炭化水素ポリマーである、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記リンカーがポリエチレングリコールである、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 前記リンカーがPEG−C3〜PEG−24である、請求項1に記載のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズ。
- 複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを含む混合物であって、前記ビーズが、
(a)リンカー;
(b)シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列;
(c)均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列;
(d)それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子;
(e)ポリアデニル化mRNAを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド冗長配列;および
(f)場合により、下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも1つの追加のオリゴヌクレオチド配列
を含み、
前記均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が、任意の1つのビーズ上の全ての前記プライミング部位にわたり同一であるが、個々のビーズ上のオリゴヌクレオチド間で変動する、混合物。 - 前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項11に記載の混合物。
- 前記バーコードが4〜1000ヌクレオチド長の範囲である、請求項12に記載の混合物。
- 前記ポリアデニル化mRNAを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするためのオリゴヌクレオチド配列がオリゴdT配列である、請求項11に記載の混合物。
- 下流分子−生物学的反応のための基質を提供する少なくとも1つのオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項11に記載の混合物。
- 前記下流分子生物学的反応が、成熟mRNAの逆転写のため、トランスクリプトームの特異的部分を捕捉するため、DNAポリメラーゼおよび/もしくは類似の酵素をプライミングするため、または前記トランスクリプトームもしくはゲノム全体を通してプライミングするためのものである、請求項11に記載の混合物。
- 前記追加のオリゴヌクレオチド配列がオリジオ−dT配列を含む、請求項11に記載の混合物。
- 前記追加のオリゴヌクレオチド配列がプライマー配列を含む、請求項11に記載の混合物。
- 前記追加のオリゴヌクレオチド配列がオリジオ−dT配列およびプライマー配列を含む、請求項11に記載の混合物。
- エラー訂正バーコードビーズであって、
(a)リンカー;
(b)シーケンシングプライミング部位として使用される同一配列;
(c)少なくともヌクレオチド塩基のデュプリケートを含む均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列;
(d)それぞれのプライミング部位について異なるユニーク分子識別子;および
(e)ポリアデニル化mRNAを捕捉し、かつ逆転写をプライミングするための冗長オリゴヌクレオチド
を含む、エラー訂正バーコードビーズ。 - 請求項20に記載のバーコードビーズが前記mRNAにハイブリダイズし得ず、それにより逆転写を受け得ない方法。
- 請求項1に記載のオリゴヌクレオチド結合ビーズおよび請求項20に記載の自己訂正バーコードビーズの混合物を含むキット。
- コンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出する方法であって、
(a)1つのユニークにバーコード化されたRNA捕捉マイクロビーズを、50μm〜210μmの直径を有するエマルジョン液滴中で単一細胞と合流させること;
(b)前記細胞を溶解させ、それにより前記RNA捕捉マイクロビーズ上でRNAを捕捉すること;
(c)逆転写反応を実施して前記細胞のRNAを、前記RNA捕捉マイクロビーズに共有結合している第1のcDNA鎖に変換するか、または逆に液滴内で逆転写させ、およびその後に液滴を破壊し、かつcDNA付着ビーズを回収すること;
(d)それぞれのRNA起源細胞を記録する細胞バーコード、および同一細胞からのRNA間を区別する分子バーコードを含有する単一コンポジットRNA−Seqライブラリーを調製およびシーケンシングすること
を含む、方法。 - コンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出する方法であって、
(a)1つのユニークにバーコード化されたRNA捕捉マイクロビーズを、50μm〜210μmの直径を有するエマルジョン液滴中で単一細胞と合流させること;
(b)前記細胞を溶解させ、それにより前記RNA捕捉マイクロビーズ上でRNAを捕捉すること;
(c)液滴を破壊し、かつビーズを溶液中でプールすること;
(d)逆転写反応を実施して前記細胞のRNAを、前記RNA捕捉マイクロビーズに共有結合している第1のcDNA鎖に変換するか、または逆に液滴内で逆転写させ、およびその後に液滴を破壊し、かつcDNA付着ビーズを回収すること;
(e)それぞれのRNA起源細胞を記録する細胞バーコード、および同一細胞からのRNA間を区別する分子バーコードを含有する単一コンポジットRNA−Seqライブラリーを調製およびシーケンシングすること
を含む、方法。 - 前記cDNA付着ビーズを増幅させる方法がテンプレートスイッチ増幅である、請求項23または24に記載の方法。
- 前記cDNA付着ビーズを増幅させる方法がT7リニア適用である、請求項23または24に記載の方法。
- 前記cDNA付着ビーズを増幅させる方法が指数関数的等温増幅である、請求項23または24に記載の方法。
- RNA捕捉マイクロビーズおよびコンポジット単一細胞を含む同時封入を介して前記エマルジョン液滴が形成される、請求項23または24に記載の方法。
- 前記エマルジョン液滴が前記RNA捕捉マイクロビーズの容量よりも少なくとも1.25倍大きい、請求項25に記載の方法。
- 前記エマルジョン液滴が前記RNA捕捉マイクロビーズの容量の少なくとも1.5倍である、請求項29に記載の方法。
- 前記RNAがmRNAである、請求項23または24に記載の方法。
- 前記エマルジョン液滴の前記直径が125μmである、請求項23または24に記載の方法。
- 前記RNA捕捉マイクロビーズの直径が10μm〜95μmである、請求項23または24に記載の方法。
- ユニーク核酸配列を有する複数のビーズを調製する方法であって、
(a)合成のそれぞれのサイクルにおいて前記ビーズが複数のサブセットにスプリットされるように、プールアンドスプリット法で前記複数のビーズの表面上でポリヌクレオチド合成を実施することであって、それぞれのサブセットが異なる化学反応に供される、実施すること;
(b)前記プールアンドスプリット法を2サイクル〜200サイクルのいずれかで繰り返すこと
を含む、方法。 - 前記ポリヌクレオチド合成がホスホラミダイト合成である、請求項34に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド合成が逆方向ホスホラミダイト化学反応である、請求項34に記載の方法。
- それぞれのサブセットが異なるヌクレオチドに供される、請求項34に記載の方法。
- それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される、請求項34に記載の方法。
- 3回繰り返される、請求項34に記載の方法。
- 4回繰り返される、請求項34に記載の方法。
- 12回繰り返される、請求項34に記載の方法。
- 前記マイクロビーズを前記オリゴヌクレオチドに共有結合するリンカーがポリエチレングリコールである、請求項34に記載の方法。
- 前記RNA捕捉マイクロビーズの直径が10μm〜95μmである、請求項34〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 複数のステップが12回のステップである、請求項34〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 均一、準均一、またはパターニングヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が任意の個々のビーズ上で合成される一方、多数の異なるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が異なるビーズ上で同時に合成される、複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを同時に調製する方法であって、
(a)複数のビーズを含む混合物を形成すること;
(b)前記ビーズをサブセットに分離すること;
(c)化学合成を介して個々のヌクレオチドを添加することにより、前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列を伸長させること;
(d)(c)における前記ビーズのサブセットを単一の共通プール中でプールすること;
(e)ステップ(b)、(c)および(d)を複数回繰り返して1000個以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列をコンビナトリアルに産生すること;および
(f)前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを回収すること
を含む、方法。 - 前記ビーズの前記表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項45に記載の方法。
- プールアンドスプリット合成ステップが、サイクル毎ではなく、2〜10サイクル毎に行われる、請求項45に記載の方法。
- バーコードがビルトインエラー訂正を含有する、請求項45に記載の方法。
- バーコードが4〜1000ヌクレオチド長の範囲である、請求項45に記載の方法。
- ポリヌクレオチド合成がホスホラミダイト合成である、請求項45に記載の方法。
- ポリヌクレオチド合成が逆方向ホスホラミダイト化学反応である、請求項45に記載の方法。
- それぞれのサブセットが異なるヌクレオチドに供される、請求項45に記載の方法。
- 1つ以上のサブセットが2つのヌクレオチドのカクテルを受けることをさらに含む、請求項45に記載の方法。
- それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される、請求項45に記載の方法。
- 前記ビーズがマイクロビーズである、請求項45に記載の方法。
- 前記ビーズがナノ粒子である、請求項45に記載の方法。
- 前記ビーズがマクロビーズである、請求項45に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド配列がジヌクレオチドである、請求項45に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド配列がトリヌクレオチドである、請求項45に記載の方法。
- 均一または準均一ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が任意の個々のビーズ上で合成される一方、複数の異なるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が異なるビーズ上で同時に合成される、1000個以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを同時に調製する方法であって、
(a)複数のビーズを含む混合物を形成すること;
(b)前記ビーズをサブセットに分離すること;
(c)化学合成を介して個々のヌクレオチドを添加することにより、前記ビーズの表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列を伸長させること;
(d)(c)における前記ビーズのサブセットを単一の共通プール中でプールすること;
(e)ステップ(b)、(c)および(d)を複数回繰り返して多数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列をコンビナトリアルに産生すること;および
(f)前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド装飾ビーズを回収すること;
(g)合成のそれぞれのサイクルにおいて前記ビーズが複数のサブセットにスプリットされるように、プールアンドスプリット合成で前記複数のビーズの前記表面上でポリヌクレオチド合成を実施することであって、それぞれのサブセットが異なる化学反応に供される、実施すること;
(h)前記プールアンドスプリット合成を複数回繰り返すこと
を含む、方法。 - 前記ビーズの前記表面上の前記ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列が分子バーコードである、請求項60に記載の方法。
- 前記プールアンドスプリット合成ステップが、サイクル毎ではなく、2〜10サイクル毎に行われる、請求項60に記載の方法。
- 生成されたバーコードがビルトインエラー訂正を含有する、請求項60に記載の方法。
- バーコードが4〜1000ヌクレオチド長の範囲である、請求項60に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド合成がホスホラミダイト合成である、請求項60に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド合成が逆方向ホスホラミダイト化学反応である、請求項60に記載の方法。
- それぞれのサブセットをが異なるヌクレオチドに供される、請求項60に記載の方法。
- 1つ以上のサブセットが2つのヌクレオチドのカクテルを受けることをさらに含む、請求項60に記載の方法。
- それぞれのサブセットが異なるカノニカルヌクレオチドに供される、請求項60に記載の方法。
- 前記ビーズがマイクロビーズである、請求項60に記載の方法。
- 前記ビーズがナノ粒子である、請求項60に記載の方法。
- 前記ビーズがマクロビーズである、請求項60に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドバーコード化ビーズがジヌクレオチドである、請求項60に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドバーコード化ビーズがトリヌクレオチドである、請求項60に記載の方法。
- 前記プールアンドスプリット合成が12回繰り返される、請求項45または60に記載の方法。
- 前記複合ビーズの直径が10μm〜95μmである、請求項45または60に記載の方法。
- マイクロ流体系を介してコンポジット単一細胞シーケンシングライブラリーを作出するための機器であって、
フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む油−界面活性剤インレット;
フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む、分析物のためのインレット;
フィルターと、レジスターをさらに含む担体流体チャネルとを含む、mRNA捕捉マイクロビーズおよび溶解試薬のためのインレット
を含み、
前記担体流体チャネルが、調整可能または所定の流速においてその中を流動する担体流体を有し、
それぞれの前記担体流体チャネルがジャンクションにおいて合流し、および
前記ジャンクションが、ドロップのためのアウトレットを含有する混合器に接続されている、機器。 - 前記分析物が、化学試薬、タンパク質、薬物、抗体、酵素、核酸、オルガネラ、細胞またはそれらの任意の組合せを含む、請求項77に記載の機器。
- 前記ジャンクションが、液滴ピンチオフ用構造物を有する流体担体チャネルにより前記混合器に接続されている、請求項77に記載の機器。
- 前記分析物が細胞である、請求項77に記載の機器。
- 前記分析物が哺乳動物細胞である、請求項77に記載の機器。
- 前記分析物が複合組織である、請求項77に記載の機器。
- 前記細胞が脳細胞である、請求項81に記載の機器。
- 前記細胞が網膜細胞である、請求項81に記載の機器。
- 前記細胞がヒト骨髄細胞である、請求項81に記載の機器。
- 前記細胞が宿主−病原体細胞である、請求項81に記載の機器。
- 前記溶解試薬が、アニオン性界面活性剤、例えば、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、またはカオトロピック塩、例えば、チオシアン酸グアニジニウムを含む、請求項77に記載の機器。
- 前記フィルターが正方PDMSを含む、請求項77に記載の機器。
- 前記レジスターが、7000〜9000の長さと、50〜75μmの幅と、100〜150mmの深さとを有するサーペンタインである、請求項77に記載の機器。
- 50μmの直径を有する、請求項89に記載のレジスター。
- 前記チャネルが8000〜12,000μmの長さの長さと、125〜250mmの幅と、100〜150mmの深さとを有する、請求項77に記載の機器。
- 直径が125μmである、請求項89に記載のチャネル。
- 前記混合器が7000〜9000μmの長さと110〜140μmの幅とを有する、請求項77に記載の機器。
- 前記幅が125μmである、請求項93に記載の混合器。
- 前記油−界面活性剤がPEGブロックポリマーである、請求項77に記載の機器。
- 前記PEGブロックポリマーがBIORAD(商標)QX200 Droplet Generation Oilである、請求項95に記載の機器。
- 前記担体流体が水−グリセロール混合物である、請求項77に記載の機器。
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